CN1306032C

CN1306032C - 白细胞介素10的编码基因及其在大肠杆菌中的表达方法

Info

Publication number: CN1306032C
Application number: CNB2005100733840A
Authority: CN
Inventors: 田志刚; 张慰慈; 肖卫华; 魏海明
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2005-06-02
Filing date: 2005-06-02
Publication date: 2007-03-21
Anticipated expiration: 2025-06-02
Also published as: CN1687415A

Abstract

本发明公开了一种白细胞介素10基因及其在大肠杆菌中的表达方法。该基因是下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；2)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1或SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。一种白细胞介素10的表达方法，是构建含有序列表中SEQ ID №：1或SEQ ID №：2DNA序列的大肠杆菌表达载体，将构建的大肠杆菌表达载体导入大肠杆菌中，获得重组大肠杆菌，发酵重组大肠杆菌得到白细胞介素10。本发明为高效、大量、低成本生产白细胞介素10提供了一种有效方法，具有较高的实际应用价值。

Description

白细胞介素10的编码基因及其在大肠杆菌中的表达方法

技术领域

本发明涉及基因及其表达方法，特别是涉及一个白细胞介素10基因及其在大肠杆菌中的表达方法。

背景技术

基因工程的最终目的是在一个合适的系统中，使外源基因高效表达，从而生产出具有重要价值的蛋白质产品。大肠杆菌系统因具有如下特点：1)遗传背景清楚，可供选择的功能载体和宿主菌较多；2)生产成本低廉，可以发酵方式快速、高效合成基因产物；3)表达量高，表达的目的蛋白可超过菌体蛋白总量的30％以上，现已成为目前应用最为广泛的表达系统。在大肠杆菌中表达外源基因的方式分为融合型表达和非融合型表达。表达非融合型蛋白的优点在于它具有非常近似于真核生物体内的蛋白质结构，因此表达产物的生物学功能也就更接近于生物体内的天然蛋白质。

如何使外源基因在大肠杆菌中获得高效表达是基因工程重组DNA技术的重点。从翻译水平提高外源基因的表达策略主要有两种方法：一、优化密码子的使用；二、翻译起始区二级结构的改造。尽管大肠杆菌有超强的产生大量蛋白的能力，但由于重组外源基因的信使核糖核酸(mRNA)中的密码子与大肠杆菌宿主细胞使用的密码子不同而使蛋白的表达受到限制，一些稀有密码子的表达常常会导致翻译的中止或错误。1997年欧洲生物化学杂志和2000年美国的生物化学杂志分别报道了通过将外源基因中的稀有密码子优化为大肠杆菌偏爱密码子而成功表达了单纯疱疹病毒1蛋白酶(herpes simplex virus 1 protease)(H.Apeler，Eur.J.Biochem.247(3)，891-895)和人磷脂酰胆碱转移酶(human phosphatidylcholine transfer protein)(L.Feng，Biochemistry 39 15399-15409)。又有研究表明：将结核杆菌Ag85B基因中的5个密码子替换为大肠杆菌偏爱密码子后重组蛋白的产量增加了54倍(Infect Immun.2000 Jan；68(1)：233-8.)。1985年英国核酸研究杂志报道：改变5’端的二级结构使其在起始密码子附近形成的茎环结构打开可以使人胰岛素样生长因子的表达量提高24-46倍。(G.Buell，Nucleic Acids Res.13(6)1923-1928)。

外源基因在大肠杆菌中的表达水平受启动子强度、载体性质、表达类型、mRNA二级结构、稀有密码子、终止密码等多种因素影响。通常选用的高效表达载体已具有强的启动子、强的SD序列及合适的SD-AUG间隔，因此对于某一特定基因在大肠杆菌中的表达应主要从密码子的使用和翻译起始区二级结构的改造来进行优化。在用无细胞的大肠杆菌核糖体提取物进行的实验证实基因中稀有密码子的存在会导致核糖体在翻译过程中的停顿，特别是稀有密码子精氨酸(AGG，AGA，CGG，CGA)、亮氨酸(CUA)、异亮氨酸(AUA)、脯氨酸(CCC)常常导致读码错误并最终影响翻译的正常进行。而李伍举等(李伍举等，病毒学报1997，13(2)：126-133)的统计结果表明，外源基因5’端-30～39区的二级结构自由能与表达水平具有显著的相关性。翻译起始区存在着稳定、复杂的茎环结构将会阻碍核糖体与核糖体结合位点(RBS)的结合，影响蛋白质的翻译表达。

白细胞介素是一类介导白细胞间相互作用的细胞因子，目前已发现二十多种。白细胞介素10最初是Fiorentino在1989年发现由鼠辅助性T细胞Th2亚型细胞分泌的一种细胞因子，能抑制Thl亚型细胞分泌的肿瘤坏死因子γ(tumor necrosis factorγ，TNF-γ)等细胞因子，所以最初被命名为细胞因子合成抑制因子(cytokine synthesisinhibitory factor，CSIF)。白细胞介素10被认为是体内最重要的抗炎细胞因子，对炎症反应的调控起非常重要的作用。由于具有抗炎作用和免疫抑制效应，白细胞介素10潜在的临床应用前景得到了关注。重组人白细胞介素10对于急性肺损伤、炎性肠病、实验性脓毒败血症休克、银屑病、类风湿关节炎、多发性硬化、丙型肝炎、再灌注损伤等疾病的治疗作用已开展了广泛的研究，并取得了一定的进展，其中白细胞介素10在类风湿关节炎和炎性肠病中的应用已进入三期临床试验，对银屑病和炎性肠病中的溃疡性结肠炎的治疗已进入二期临床试验，对丙型肝炎、多发性硬化和再灌注损伤的治疗正在进行一期临床试验。

目前，国内外的人白细胞介素10基因工程产品主要是由大肠杆菌表达系统生产的，但仅通过单纯的密码子的优化，即使用以替换白细胞介素10基因序列中的稀有碱基为大肠杆菌偏爱密码子而增加人白细胞介素10的表达量，或者以融合蛋白的形式来表达，但这些方法都难以实现高效表达。目前，其表达产率一般在10mg/L以下。因此，人白细胞介素10至今都是一种难以获得低成本、高表达的基因工程产品，致使重组人白细胞介素10的市场价格仍高达30-100美元/微克。鉴于人白细胞介素10潜在而巨大的市场应用前景，开发一种促进白细胞介素10在大肠杆菌系统高效，低成本表达的方法将极大地促进这一细胞因子药物在临床中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一个白细胞介素10基因及其在大肠杆菌中的表达的方法。

本发明所提供的白细胞介素10基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1或SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

具有序列表中SEQ ID №：1 DNA序列的白细胞介素10基因，命名为ILRP，由486个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-486位碱基，编码具有序列表中SEQ ID№：3的氨基酸残基序列的蛋白质；具有序列表中SEQ ID №：2 DNA序列的白细胞介素10基因，命名为ILRP5’，由486个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-486位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增ILRP或ILRP5’中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的第二个目的是提供一种白细胞介素10的表达方法。

本发明所提供的白细胞介素10的表达方法，是构建含有白细胞介素10基因的大肠杆菌表达载体，将构建的大肠杆菌表达载体导入大肠杆菌中，获得重组大肠杆菌，发酵重组大肠杆菌得到白细胞介素10。

用于构建大肠杆菌表达载体的出发载体可为任意一种可在大肠杆菌中表达外源基因的原核表达载体，如pCRT7/CT-TOPO、pET101/D-TOPO、pQE30或pBV220，优选为含有T7启动子的原核表达载体，如pCRT7/CT-TOPO或pETI01/D-TOPO，尤其优选为pCRT7/CT-TOPO。

以pCRT7/CT-TOPO为出发载体构建的重组大肠杆菌表达载体为pCRT7/CT-TOPO/ILRP或pCRT7/CT-TOPO/ILRP5’。

上述重组大肠杆菌表达载体均可按照常规方法构建。

所述大肠杆菌为适于蛋白表达的大肠杆菌菌株，如E.coli BL21-Gold(DE3)、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21 Codon plus-RP、E.coli BL21 Codon plus-RIL或E.coli DH5α。

将大肠杆菌表达载体转化大肠杆菌的方法可为生物工程领域中常用的转化方法，如热激法、电转化法、接合转化法PEG介导的原生质体转化法等。

发酵重组大肠杆菌时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0.8-1.2mM，诱导温度为30-37℃，诱导时间为2-4小时。

本发明提供了一种提高白细胞介素10基因在大肠杆菌非融合表达的方法，通过将白细胞介素10基因中编码精氨酸(AGG，AGA，CGG，CGA)、亮氨酸(CUA)、异亮氨酸(AUA)和脯氨酸(CCC)的稀有密码子及终止密码子(TGA)替换为大肠杆菌偏爱密码子的同时，将核糖体结合位点区至5’端编码区的前50个碱基的mRNA二级结构进行优化改造而获得改型白细胞介素10。经过改型后的白细胞介素10可以在大肠杆菌中得到高效表达，表达率可达20-30mg/L。本发明主要应用于白细胞介素10基因在大肠杆菌系统中的表达。本发明的特征在于：

本发明所提供的经密码子优化的白细胞介素10基因，是将从翻译水平提高外源基因表达的两种主要方法，即优化密码子的使用和翻译起始区二级结构的改造结合使用的产物，但这种结合并非是简单的相加，而是在前两者基础上通过改造及简化而形成一种新的技术方案。首先将原有白细胞介素10基因中的稀有密码子，尤其是精氨酸(AGG，AGA，CGG，CGA)、亮氨酸(CUA)、异亮氨酸(AUA)、脯氨酸(CCC)替换为大肠杆菌偏爱密码子作为确保蛋白翻译的基础。在此基础上利用计算机软件模拟四种密码子经优化的白细胞介素10基因5’编码区的二级结构，并在不改变氨基酸序列的前提下根据密码子的简并性来优化5’编码区前40-60个碱基的二级结构，减少翻译起始区mRNA的二级结构的复杂性，降低翻译起始区mRNA的稳定性，取消其对核糖体结合位点的空间位阻效应，利于蛋白质的表达。从而可使翻译效率提高又可以避免稀有密码子大量存在而导致的错误翻译，使难以在大肠杆菌表达的白细胞介素10基因得到高效非融合表达。选择对5’端编码区前40-60个碱基中的密码子进行优化改造的策略能使翻译起始区mRNA的稳定性降低，但不影响mRNA整体的稳定性。只选择前40-60个碱基中的密码子进行优化还能减少改造基因的难度和复杂性。本发明为高效、大量、低成本生产白细胞介素10提供了一种有效方法，具有较高的实际应用价值。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1为从核糖体结合位点至基因5’编码序列中前50个碱基的mRNA二级结构模拟图

图2为从核糖体结合位点至基因5’编码序列中前50个碱基的mRNA二级结构模拟图

图3为含有经改型的白细胞介素10基因的重组表达载体的物理图谱

图4为改型的人白细胞介素10基因在大肠杆菌中诱导表达后的SDS-PAGE电泳图谱

图5为三种人白细胞介素10基因表达产物的Western Blot免疫印迹图

图6为ELISA法检测ILRP、ILRP5’与白细胞介素10标准品抑制经LPS刺激后的巨噬细胞分泌IL-6的功能的结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物及核苷酸序列均由上海生工合成。

实施例1、人白细胞介素10改型基因的获得

1、根据密码子的简并性，通过引物重叠延伸法，在不改变氨基酸序列的前提下将野生型的人白细胞介素10基因(命名为wt，序列表中的SEQ ID №：4)中异亮氨酸I(AUA)、亮氨酸L(CUA)、精氨酸R(AGG，AGA，CGG，CGA)、脯氨酸P(CCC)的密码子以及终止密码子(TGA)替换为大肠杆菌的偏爱密码子，得到的人白细胞介素10基因序列，它具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列，由486个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-486位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列的蛋白质，将该经过改型的人白细胞介素10基因命名为ILRP，用核酸分析软件(如mfold 3.1版)模拟其核糖体结合位点区至5’端编码区前50个碱基的mRNA的二级结构并作自由能分析，结果如图1所示，自由能为-15.62kJ·mol^-1(原先为-18.7kJ·mol^-1)，表明ILRP密码子的优化对翻译起始区的二级结构及其稳定性无影响。

2、根据步骤1所模拟的ILRP的核糖体结合位点区至5’端编码区前50个碱基的mRNA二级结构和自由能分析结果设计引物，按照密码子的简并性通过引物重叠延伸法使其核糖体结合位点区域至5’端编码区前40-60个碱基中的密码子得到无义诱变，将在40-60个碱基中的稀有密码子部分替换为大肠杆菌偏爱密码子，从而使其在不改变氨基酸序列的前提下减少二级结构的复杂性，提高自由能，降低mRNA的稳定性，利于核糖体与核糖体结合位点的结合。将在ILRP基础上用上述方法进行5’端编码区改造后获得的人白细胞介素10基因命名为ILRP5’，该基因具有序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列，由486个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-486位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列的蛋白质。用核酸分析软件(如mfold 3.1版)模拟其核糖体结合位点区至5’端编码区前50个碱基的mRNA的二级结构并作自由能分析，结果如图2所示，经改造后ILRP5’的翻译起始区mRNA的自由能由改造前的ΔG＝-15.62kJ·mol^-1，升高到ΔG＝-4.27kJ·mol^-1。

实施例2、含有人白细胞介素10改型基因的重组表达载体的构建

选用Invitrogen公司的pCR^T7 TOPO^TA表达试剂盒并参照说明书进行含有人白细胞介素10改型基因的重组表达载体的构建，具体方法为：

1、人白细胞介素10改型基因的扩增

以实施例1获得的人白细胞介素10改型基因ILRP为模版，在引物5和引物6(引物5：ATGAGCCCAGGCCAGGGCAC，引物6：TTAGTTTCGGATCTTCATTG)的引导下，进行PCR扩增；以实施例1获得的人白细胞介素10改型基因ILRP5’为模版，在引物6和引物7(引物7：ATGAGTCCAGGACAAGGTAC)的引导下，进行PCR扩增。上述PCR扩增的条件为：先95℃3分钟；再94℃30秒，58℃45秒，72℃45秒，共33个循环；最后72℃7分钟。

2、连接

将步骤1获得两种PCR产物分别与载体pCRT7/CT-TOPO连接，方法为：PCR反应结束后，取3微升PCR产物，加入1微升的盐溶液(试剂盒自带)，用三蒸水将反应体系补至5微升，再加入1微升的载体pCRT7/CT-TOPO(美国，Invitrogen公司)后轻轻混匀，室温22-23℃下孵育5分钟，将克隆反应物置于冰上，转化备用。

3、转化

上述两种克隆反应物分别进行转化，方法为：取步骤2获得克隆反应物2微升，加入30微升的One Shot TOP10F’感受态细胞(美国，Invitrogen公司)(化学法)中，轻轻混匀后冰浴20分钟；再在42℃水中静置60秒，热休克后立即置于冰上；4分钟后加入室温的SOC培养基(美国，Invitrogen公司)250微升，在37℃、200转/分钟空气浴摇床上水平震荡40分钟；取30微升转化物涂于含100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂培养板上，37℃培养12-24小时。

4、质粒的提取及鉴定

长出菌落后，按下述方法提取上述两种转化物的质粒，方法为：挑取10-15个单菌落分别接种于含75微克/毫升氨苄青霉素的LB液体培养基中培养12-24小时。用维特洁生物技术公司的超纯质粒DNA纯化试剂盒分离质粒DNA，步骤如下：

1)用2毫升Microfuge Tube(试剂盒自带)收集3毫升步骤3的培养菌液，12000g离心30秒，弃尽上清。

2)用250微升已加入RNase A1的缓冲液S1(试剂盒自带)充分悬浮细菌沉淀。

3)加入250微升缓冲液S2(试剂盒自带)，温和但充分地上下翻转混合4-6次，此步骤不宜超过5分钟。

4)加入450微升4℃预冷的缓冲液N(试剂盒自带)，上下翻转，使溶液形成混浊的乳浊液，12000g离心1分钟。

5)吸弃蓝色上相，将无色下相转移至Filter(置于1.5毫升离心管中)，12000g离心1分钟，弃Filter，在滤液中加入450微升缓冲液B(试剂盒自带)，混合均匀。

6)将DNA-prep Tube(试剂盒自带)置于2毫升Microfuge Tube中，将步骤中的混合液加DNA-prep Tube弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2毫升Microfuge Tube中，加入500微升缓冲液W1，1000g离心1分钟。

7)弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2毫升Microfuge Tube中，加入700微升已添加无水乙醇的缓冲液W2(试剂盒自带)，1000g离心1分钟，以同样的方法再用700微升缓冲液W2洗涤一次。

8)将DNA-prep Tube置于1.5毫升离心管中，12000g离心1分钟。

9)将DNA-prep Tube置于另一洁净的1.5毫升离心管中，在silia膜(试剂盒自带)中央加60微升去离子水，室温静置1分钟，12000g离心1分钟洗脱DNA，得到的沉淀即为质粒。

5、ILRP和ILRP5’的重组表达载体的鉴定

1、用限制性内切酶XbaI和HindIII对步骤4提取的ILRP的重组表达载体的转化物的质粒进行酶切鉴定，对酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，出现2649bp和539bp条带的可初步鉴定为阳性克隆重组子，再以其为模板，在引物5和引物6的引导下，进行进一步的PCR鉴定，可扩增出486bp条带的为阳性克隆重组子，最后对其进行测序，表明获得了插入位置及序列正确的含ILRP的重组表达载体，命名为pCRT7/CT-TOPO/ILRP，pCRT7/CT-TOPO的物理图谱及ILRP在载体中的位置如图3所示。

2、用限制性内切酶Xba I和HindIII对步骤4提取的ILRP5’的重组表达载体的转化物的质粒进行酶切鉴定，对酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，出现2649bp和539bp条带的可初步鉴定为阳性克隆重组子，再以其为模板，在引物7和引物6的引导下，进行进一步的PCR鉴定，可扩增出486bp条带的为阳性克隆重组子，最后对其进行测序，表明获得了插入位置及序列正确的含ILRP5’的重组表达载体，命名为pCRT7/CT-TOPO/ILRP5’，pCRT7/CT-TOPO的物理图谱及ILRP5’在载体中的位置如图3所示。

实施例3、重组人白细胞介素10的表达及检测

1、重组人白细胞介素10的表达

参照Stratagene公司的大肠杆菌BL21-Gold(DE3)感受态细胞转化说明书所提供的方法，将质粒pCRT7/CT-TOPO/ILRP和pCRT7/CT-TOPO/ILRP5’分别转化大肠杆菌BL21-Gold(DE3)感受态细胞，37℃孵育12-24小时，经筛选得到分别含有pCRT7/CT-TOPO/ILRP和pCRT7/CT-TOPO/ILRP5’的阳性克隆转化子。利用IPTG诱导两种重组人白细胞介素10进行表达，具体过程包括以下步骤：

1)挑取阳性克隆转化子接种至1毫升含有50微克氨苄青霉素的LB培养基中，220-250转/分、37℃震荡培养12-24小时。

2)吸取50微升培养物加至1毫升LB培养基中，220-250转/分37℃震荡培养2小时。

3)吸取100微升培养物置于1.5毫升离心管中，置于冰上，SDS-PAGE电泳分析备用。

4)其余的培养物中加入终浓度为1mM的IPTG，220-250转/分、37℃震荡培养2-4小时，培养结束后立即置于冰上。

2、SDS-PAGE电泳检测及Western Blot鉴定

1、SDS-PAGE电泳检测

吸取20微升经诱导后的培养物加至1.5毫升洁净的离心管中，加入20微升2×SDS上样缓冲液。以诱导前的培养物为对照，并用同样方法处理。95-100℃煮沸5分钟后进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳结果如图4所示(泳道M为低分子量蛋白标准，泳道1为未改型人白细胞介素10基因wt的表达产物，泳道2为四种密码子经优化的人白细胞介素10改型基因ILRP的表达产物，泳道3为四种密码子优化同时进行5’编码序列中前50个碱基的mRNA二级结构改造的人白细胞介素10改型基因ILRP5’的表达产物)，用Glyko BandScan 4.5软件分析经IPTG诱导表达后的重组人白细胞介素10的表达条带。由未改造的野生型人白细胞介素10基因wt表达的蛋白条带占全菌总蛋白的5.1％。异亮氨酸I、亮氨酸L、精氨酸R、脯氨酸P的密码子以及终止密码子(TGA)经优化后的人白细胞介素10改型基因ILRP表达的蛋白条带占全菌总蛋白的5.4％。在ILRP基础上进行的5’端编码区二级结构优化后获得的基因ILRP5’的蛋白表达量占全菌总蛋白的31.3％，表达量是未经优化的人白细胞介素10基因表达量的6倍。

2、Western Blot鉴定

按常规方法对表达产物作进一步的Western Blot鉴定，浓缩胶选用5％聚丙

烯胺凝胶，分离胶选用15％聚丙烯胺凝胶，人白细胞介素10抗体选用Santa Cruz公司的多克隆抗体，结果如图5所示(泳道1为人白细胞介素10，泳道2为ILRP，泳道3为ILRP5’)，表明经改型的人白细胞介素10基因的蛋白表达量得到显著提高。

3、活性鉴定

对用上述方法表达得到的ILRP和ILRP5’进行活性检测，通过其抑制经LPS刺激后的巨噬细胞分泌IL-6的功能确定其活性高低，白细胞介素10(IL-10)标准品为参照。具体方法如下：

1)在24孔板的每孔中加入0.5毫升含10％马血清以及终浓度均为100U的青霉素和链霉素的完全DMEM培养基。

2)将白细胞介素10标准品(UPSTATE公司)和按照常规方法复性后的样品进行倍比稀释。

3)用无血清的DMEM培养基洗涤PU5-1.8细胞3次，并重悬于完全DMEM培养基中，调细胞密度为1×10⁶个/mL。每孔接种0.5毫升细胞悬液。

4)在37℃、5％CO₂和饱和湿度的培养箱中培养24小时。

5)每孔再加入10微克/毫升的LPS，继续培养24小时。

6)收集上清用ELISA法(IL-6ELISA试剂盒购自美国BenderMedsystems公司)检测上清中IL-6的浓度。

结果如图6所示，ILRP、ILRP5’与白细胞介素10标准品抑制经LPS刺激后的巨噬细胞分泌IL-6的功能相当，表明ILRP和ILRP5’的活性与白细胞介素10标准品活性相同。

序列表

<160>4

<210>1

<211>486

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atgagcccag gccagggcac ccagtctgag aacagctgca cccacttccc aggcaacctg 60

cctaacatgc ttcgagatct ccgagatgcc ttcagccgag tgaagacttt ctttcaaatg 120

aaggatcagc tggacaactt gttgttaaag gagtccttgc tggaggactt taagggttac 180

ctgggttgcc aagccttgtc tgagatgatc cagttttacc tggaggaggt gatgccacaa 240

gctgagaacc aagacccaga catcaaggcg catgtgaact ccctggggga gaacctgaag 300

accctccggc tgcggctgcg gcgctgtcat cgatttcttc catgtgaaaa caagagcaag 360

gccgtggagc aggtgaagaa tgcctttaat aagctccaag agaaaggcat ctacaaagcc 420

atgagtgagt ttgacatctt catcaactac atcgaagcct acatgacaat gaagatccga 480

aactaa 486

<210>2

<211>486

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

atgagtccag gacaaggtac acaatctgag aacagctgca cccacttccc aggcaacctg 60

cctaacatgc ttcgagatct ccgagatgcc ttcagccgag tgaagacttt ctttcaaatg 120

aaggatcagc tggacaactt gttgttaaag gagtccttgc tggaggactt taagggttac 180

ctgggttgcc aagccttgtc tgagatgatc cagttttacc tggaggaggt gatgccacaa 240

gctgagaacc aagacccaga catcaaggcg catgtgaact ccctggggga gaacctgaag 300

accctccggc tgcggctgcg gcgctgtcat cgatttcttc catgtgaaaa caagagcaag 360

gccgtggagc aggtgaagaa tgcctttaat aagctccaag agaaaggcat ctacaaagcc 420

atgagtgagt ttgacatctt catcaactac atcgaagcct acatgacaat gaagatccga 480

aactaa 486

<210>3

<211>161

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>3

Met Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe

1 5 10 15

Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser

20 25 30

Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu

35 40 45

Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln

50 55 60

Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly

85 90 95

Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe

100 105 110

Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Ash Ala

115 120 125

Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe

130 135 140

Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg

145 150 155 160

Asn

<210>4

<211>486

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<220>

<223>

<400>4

atgagcccag gccagggcac ccagtctgag aacagctgca cccacttccc aggcaacctg 60

cctaacatgc ttcgagatct ccgagatgcc ttcagcagag tgaagacttt ctttcaaatg 120

aaggatcagc tggacaactt gttgttaaag gagtccttgc tggaggactt taagggttac 180

ctgggttgcc aagccttgtc tgagatgatc cagttttacc tggaggaggt gatgccccaa 240

gctgagaacc aagacccaga catcaaggcg catgtgaact ccctggggga gaacctgaag 300

accctcaggc tgaggctacg gcgctgtcat cgatttcttc cctgtgaaaa caagagcaag 360

gccgtggagc aggtgaagaa tgcctttaat aagctccaag agaaaggcat ctacaaagcc 420

atgagtgagt ttgacatctt catcaactac atagaagcct acatgacaat gaagatacga 480

aactga 486

Claims

1、白细胞介素10基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的白细胞介素10基因，其特征在于：所述基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

3、根据权利要求1所述的白细胞介素10基因，其特征在于：所述基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

4、含有权利要求1或2或3所述基因的表达载体。

5、含有权利要求1或2或3所述基因的重组大肠杆菌。

6、一种白细胞介素10的表达方法，是构建含有序列表中SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2 DNA序列的大肠杆菌表达载体，将构建的大肠杆菌表达载体导入大肠杆菌中，获得重组大肠杆菌，发酵重组大肠杆菌得到白细胞介素10。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述用于构建大肠杆菌表达载体的出发载体为pCRT7/CT-TOPO。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述构建的重组大肠杆菌表达载体为pCRT7/CT-TOPO/ILRP或pCRT7/CT-TOPO/ILRP5’。

9、根据权利要求6或7或8所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coliBL21-Gold(DE3)或E.coli DH5α。

10、根据权利要求6或7或8所述的方法，其特征在于：所述发酵重组大肠杆菌时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0.5-2.0mM，诱导温度为30-37℃，诱导时间为2-4小时。