CN1676166A

CN1676166A - 与人表皮生长因子受体egfr特异性结合的配体寡肽

Info

Publication number: CN1676166A
Application number: CN200410017334.6A
Authority: CN
Inventors: 顾健人; 李宗海; 徐宇虹; 吴向华
Original assignee: SHANGHAI XINSHIJIE GENE TECHN DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: LANGSHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd GUANGZHOU CITY
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2004-03-31
Publication date: 2005-10-05
Anticipated expiration: 2024-03-31
Also published as: CN100356981C

Abstract

本发明提供了一种由表皮生长因子受体EGFR介导的基因转移系统，它包括它包含(a)特异性结合于EGFR受体的配体寡肽、(b)多聚阳离子多肽或蛋白和任选的(c)内吞小体释放寡肽和(d)外源DNA。所述基因转移系统能有效地在体内外将外源基因靶向性地导入表达EGFR受体的肿瘤细胞，从而抑制肿瘤的生长。

Description

与人表皮生长因子受体EGFR特异性结合的配体寡肽

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。具体地说，本发明涉及一类高效特异结合人表皮生长因子受体EGFR的配体寡肽以及编码该多肽的DNA序列。本发明还涉及该DNA和配体寡肽的用途。

背景技术

肿瘤发生发展的机理主要源于瘤基因(oncogene)的激活或抑瘤基因的失活。EGFR作为一个广泛表达的原瘤基因，其改变(缺失、高表达等)在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。

EGFR是个单一跨膜受体，由1186个氨基酸残基组成，分子量为170kD，具有一胞外区、跨膜区和一个胞内区。胞外区是受体与天然配体(包括EGF、TGF-α和双调蛋白(Amphiregulin))结合的区域。胞内区具有酪氨酸激酶区和羧基末端区。羧基末端区可以与下游接头蛋白结合，激活下游信号传导通路。

EGFR家族除了EGFR外，还有erbB2，erbB3及erbB4。这四个受体的酪氨酸激酶区非常保守，但羧基末端区序列保守性低，所以EGFR家族激活的下游信号通路十分复杂。当EGFR受体与天然配体结合后可以使受体构象改变，出现同源二聚体化或与其家族成员形成异源二聚体化，进而激活胞内区酪氨酸激酶活性后者磷酸化羧基末端区，通过接头蛋白及下游因子产生信号传导，使基因活化，表达促使细胞生长和有丝分裂的蛋白，从而使细胞生长、增殖。由于在正常细胞，EGFR的表达量受到控制，因此并不会对细胞产生不良影响。在某些情况下、EGFR表达异常，如胞外区部分缺失、就会使EGFR激酶活性不依赖于配体持久激活，从而导致细胞出现恶性增殖。

除了缺失体外，EGFR在颈部肿瘤、非小细胞肺癌等肿瘤中有高表达。因此，已经有很多研究把EGFR作为肿瘤的治疗靶点。包括抗EGFR抗体、以EGFR为受体介导的基因治疗载体系统。

PCT申请PCT/CN97/00106(WO98/18951)公开了用于靶向性肿瘤基因治疗的新型的受体介导基因转移系统，其中公开了包括针对EGFR、IGF I/II R及VEGFR三种受体介导的基因转移系统用于肿瘤治疗。

然而，目前以EGFR为受体的基因治疗大多采用天然配体如EGF作为载体系统的弹头。由于EGF具有较强的丝裂源活性，可以促进细胞有丝分裂和血管新生，而且分子量大，可对载体系统其他元件活性产生较大影响，因此寻找EGFR的配体寡肽显得尤为重要。此外，一种已知的GE7配体寡肽虽然与EGFR也有一定的亲和力，但碘结合实验表明该多肽与EGFR受体的亲和力不高。

因此，本领域迫切需要开发新的靶向EGFR的配体寡肽和基于EGFR配体寡肽的靶向性肿瘤基因治疗的基因转移系。通过靶向EGFR的基因治疗和其他靶向治疗措施达到治疗疾病的目的。

发明内容

本发明的目的是就是提供一种EGFR的配体寡肽，本发明的配体寡肽能与EGFR特异性结合，通过受体介导的内吞作用，一方面可作为靶向肽用于靶向性基因转移系统；另一方面可联接放射性核素、化学药物及生物毒素直接靶向EGFR受体高表达的肿瘤细胞，从而达到靶向治疗肿瘤的目的。

本发明的另一目的是提供了基于与表皮生长因子受体EGFR结合的配体寡肽的基因转移系统。该转移系统通过受体介导的内吞作用，将外源DNA靶向地导入表达EGFR受体的肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。

在本发明的第一方面，提供了一种表皮生长因子受体EGFR介导的靶向性基因治疗的基因转移系统，包含(a)特异性结合于EGFR受体的配体寡肽，其中所述的配体寡肽含有SEQ ID NO：1、2或3的氨基酸序列；和(b)多聚阳离子多肽或蛋白。

在另一优选例中，所述的基因转移系统还含有(c)内吞小体释放寡肽。

在另一优选例中，所述的基因转移系统还含有(d)外源DNA。

在另一优选例中，所述的配体寡肽的氨基酸序列是SEQ ID NO：1、2或3。

在另一优选例中，多聚阳离子多肽选自下组：多聚赖氨酸、聚乙酰亚胺、鱼精蛋白、组蛋白、腺病毒pV蛋白、腺病毒pVII蛋白、mμ蛋白，经聚乙二醇修饰的上述蛋白及其混合物。

在另一优选例中，所述的外源DNA选自下组：抗癌基因、细胞凋亡基因、细胞因子基因、癌基因反义序列的真核重组表达载体DNA，及其混合物。

在另一优选例中，所述的外源DNA选自下组：

(i)抗癌基因：p53、Rb；

(ii)细胞凋亡基因：Caspase、p15、p16及p21^WAF-1；

(iii)细胞因子基因：GM-CSF基因、TNFα基因、INFα、γ基因、IL2、IL3、IL4、IL12、IL15、IL18基因；

(iv)癌基因的反义序列：癌基因ras、c-myc、Akt的反义序列；

(v)真核重组表达载体：病毒性真核重组表达载体以及以SV40、CMV启动子为顺式调控元件的非病毒真核重组表达载体。

在另一优选例中，所述的组分(a)配体寡肽、(b)多聚阳离子多肽和(c)内吞小体释放寡肽中的两者或三者以融合蛋白形式存在。

在另一优选例中，所述的内吞小体释放寡肽元件选自下组：HA20或VP-1。

在本发明的第二方面，提供了一种寡肽(长度小于20个氨基酸)，它结合于EGFR受体，含有以下氨基酸序列：SEQ ID NO：1、2或3。

在本发明的第三方面，提供了一种制备表皮生长因子受体EGFR介导的靶向性基因治疗的基因转移系统的方法，包括步骤：将(a)特异性结合于EGFR受体的配体寡肽、(b)多聚阳离子多肽或蛋白和任选的(c)内吞小体释放寡肽混合在一起，形成混合物。较佳地，对于组分(a)、(b)、(c)而言，可以使用任何二者形成二元复合物。

在本发明的第四方面，提供了一种偶联物，它含有本发明上述的配体寡肽以及与所述配体寡肽偶联的放射性核素、化学药物及生物毒素。这些偶联物可直接应用于治疗与EGFR过度表达有关的恶性肿瘤，如非小细胞肺癌、头颈部肿瘤。

在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效剂量的本发明配体寡肽，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。本发明的药物组合物可用于治疗与EGFR过度表达有关的恶性肿瘤，如非小细胞肺癌、头颈部肿瘤。

在本发明的第六方面，提供了本发明所述寡肽的用途，它们用于制备检测EGFR的检测试剂或用于制备药物。

附图说明

图1为多肽GE9质谱分析图。

图2为¹²⁵I标记GE9与SMMC7721细胞表面EGFR受体特异性结合试验结果示意图。

图3为¹²⁵I标记GE9与EGFR蛋白特异性结合试验结果示意图。

图4为¹²⁵I标记GE9与EGFR受体特异结合解离常数曲线。

图5为噬菌体克隆与细胞表面EGFR受体特异结合免疫组化结果。

图6显示了¹²⁵I标记GE11与EGFR蛋白特异性结合实验结果。

图7显示了噬菌体回收试验结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，制备了特异性结合于EGFR受体的配体寡肽以及基于该配体寡肽的基因转移系统。GE9(SEQ ID NO：1)、GE10(SEQ IDNO：2)和GE11(SEQ ID NO：3)是通过噬菌体肽库筛选技术，从肽库中直接获取与EGFR受体分子结合的多肽。这些多肽的特定氨基酸的特定位置是多肽配体与EGFR受体结合的活性位点，也就是EGFR受体分子多肽配体基序，决定了与EGFR结合多肽的活性特征。

利用本发明配体寡肽识别EGFR受体的特性，经细胞的内吞作用，通过该载体系统将外源DNA选择性地导入表达EGFR受体的肿瘤细胞，从而可以抑制肿瘤细胞生长或杀死肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。

配体寡肽

配体寡肽是本发明靶向性非病毒载体的关键组分。如本文所用，“配体寡肽(Ligand oligopeptide，LOP)”和“受体识别寡肽”可互换使用，指任何识别并结合于表面含EGFR受体的靶细胞的寡肽。如上所述，本发明的配体寡肽可特异性识别并结合于EGFR受体。具体地，本发明配体寡肽是指与细胞膜表面蛋白受体EGFR胞外区结合的多肽，或者与可溶性EGFR分子结合的多肽，包括融合型多肽和游离型多肽。

本发明的配体多肽还包括具有与EGFR受体结合的相同功能的、SEQ IDNO.1-3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-5个，较佳地1-3个，更佳地1-2个，最佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。

本领域技术人员知道，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。碱性氨基酸包括赖氨酸、组氨酸和精氨酸。酸性氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变多肽的功能。此外，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。

如本文所用，术语“配体寡肽”包括能与EGFR结合的GE9、GE10和GE11的活性片段和活性衍生物。还包括与功能或性质已知的蛋白形成的融合蛋白或嵌合蛋白。

如本文所用，术语“配体寡肽”还包括酰胺或酯或其盐形式的多肽。既包括游离型多肽、融合型多肽和嵌合型多肽，也包括以多肽为单体的各种聚合体。例如，含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中一种、二种或三种氨基酸序列的蛋白质分子、嵌合蛋白质分子或聚合体。

在本申请的说明书和附图中，用于表示碱基、氨基酸的缩写是由生化命名IUPCA-IUB委员会推荐。其中氨基酸一般为L型，除非有其它说明。本说明书中所描述的多肽，按照惯例，左侧末端是氨基末端(N-末端)，右侧末端是羧基末端(C-末端)。通常当C-末端是羧基(-COOH)或羧酸盐(-COO-)时，它可以是酰胺(-COONH2)或酯(-COOR)形式。酯残基R包括C1-6烷基(如甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基等)、C3-8环烷基(如环戊基、环己基等)、C6-12芳基(如苯基、a-萘基等)、C7-14烷基(如苄基、苯乙基等)。

一类特别优选的配体寡肽是长度为9-20个氨基酸，且含有选自下组的基本单元序列的寡肽：

CKSPEPQHC(SEQ ID NO：1)；

LHLWVPEPWTQT(SEQ ID NO：2)；

YHWYGYTPQNVI(SEQ ID NO：3)。

特别优选的例子是以下寡肽：

寡肽GE9，其氨基酸序列为CKSPEPQHC(SEQ ID NO：1)；

寡肽GE10，其氨基酸序列为LHLWVPEPWTQT(SEQ ID NO：2)；

寡肽GE11，其氨基酸序列为YHWYGYTPQNVI(SEQ ID NO：3)；

此外，本发明的配体寡肽还包括一个或几个(通常1-8个，较佳地1-5个)位点的氨基酸可以用类似性能的氨基酸代替所形成的配体寡肽。

本发明的配体寡肽可以含有单个基本单元序列，或多个(如2-10个)基本单元序列。

本发明的配体寡肽可方便地用人工合成或基因工程重组方法制备。关于这些合成寡肽制法，可参见诸如WO98/18951(PCT/CN97/00106)等诸多文献。

本发明还提供了GE9、GE10、GE11等EGFR配体寡肽的编码序列，它们分别含有SEQ ID NO：5、6和7所示的核苷酸序列。这些编码序列可用常规的人工合成方法或重组法获得。

本发明还提供了一种偶联物，它含有本发明上述的配体寡肽以及与所述配体寡肽偶联的放射性核素、化学药物及生物毒素。这些偶联物可直接应用于治疗与EGFR过度表达有关的恶性肿瘤，如非小细胞肺癌、头颈部肿瘤。

多聚阳离子多肽

多聚阳离子多肽是本发明靶向性非病毒载体的的另一关键组分。

如本文所用，“多聚阳离子多肽”指一类富含碱性氨基酸的多肽，其碱性氨基酸(赖氨酸、组氨酸和精氨酸)比例约20％以上，因而带正电荷，能与带负电荷的DNA藉静电引力结合，使DNA更稳定。

可用于本发明的多聚阳离子多肽没有特别限制，只要其碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)比例约20％以上，较佳地30％，更佳地40％以上，因而带正电荷即可。代表性的例子包括：多聚赖氨酸、聚乙酰亚胺、鱼精蛋白、组蛋白、腺病毒pV蛋白、腺病毒pVII蛋白、Mμ蛋白，经聚乙二醇(PEG)修饰的上述蛋白及其混合物。

内吞小体释放寡肽元件

本发明的靶向性非病毒载体还可含有内吞小体释放寡肽元件，它起到防止内吞入细胞的DNA被降解的作用。

任何内吞小体释放寡肽都可用于本发明，代表性的例子包括(但并不限于)：HA20、VP-1。

靶向性非病毒载体

如本文所用，本发明的“靶向性非病毒载体”指含有以下组分(a)和(b)、或者含有组分(a)、(b)和(c)的混合物或复合物：(a)特异性结合于EGFR受体的配体寡肽、(b)多聚阳离子多肽、(c)内吞小体释放寡肽。

在本发明中，组分(a)、(b)、(c)可以是非连接形式，也可以任何两者或三者通过共价或非共价方式连接在一起。特别优选的形式包括：配体寡肽-多聚阳离子多肽二元复合物、多聚阳离子多肽-内吞小体释放寡肽二元复合物、配体寡肽-多聚阳离子多肽-内吞小体释放寡肽三元复合物。例如HA20-多聚赖氨酸、HA20-鱼精蛋白、HA20-组蛋白共价连接物等。

连接可以通过化学法(如使用SPDP等偶联剂)，也可以通过重组法，例如形成融合蛋白。

对于融合蛋白而言，在(a)配体寡肽、(b)多聚阳离子多肽，和(c)内吞小体释放寡肽元件之间，可任选地含有连接肽，以便增加复合多肽空间结构的柔性和舒展性，让各元件发挥各自的功能。可用于本发明的连接肽没有特别限制，只要起连接作用即可。一类连接肽例子是(Gly)_2-6Ser，例如(Gly)₄Ser。连接肽可多个串联使用。

本发明的(a)配体寡肽，(b)多聚阳离子多肽，和(c)内吞小体释放寡肽元件都可以用类似性能的氨基酸替代，只要仍保留各自类似的生物功能。

靶向性非病毒载体的制备方法

通常，将上述(a)、(b)、(c)组分或其复合物混合在一起，即可获得本发明的靶向性非病毒载体。其中，(a)、(b)、(c)组分的混合比例通常为0.5-1∶1-2∶0-1，较佳地为0.8-1∶1-1.5∶0.5-1。

此外，当以(a)-(b)复合物和(b)-(c)复合物的形式施用时，(a)-(b)复合物：(b)-(c)复合物的混合比例通常为0.8-1.2∶0.8-1.2，较佳地为0.9-1.1∶0.9∶1.1。

外源DNA

可用于本发明的外源DNA没有特别限制，可以是各种治疗性或预防性的DNA，例如目的基因、反义癌基因、抗癌基因、自杀基因、细胞调亡基因、细胞因子基因、或其组合，或者含有上述基因的真核表达载体DNA。原癌基因反义序列包括原癌基因(ras^H、ras^K、ras^N、c-myc、bcl-2、Akt)、生长因子及其受体基因的反义DNA序列、反义寡核苷酸及反义寡脱氧核苷酸；抑癌基因包括p53、Rb、PTEN，自杀基因包括HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)基因及CD(大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶)基因；细胞凋亡基因包括p15、p16、p21^WAF-1；细胞因子基因包括GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)基因，TNFα(肿瘤坏死因子)基因，INF(干扰素)α、γ基因，IL(白细胞介素)2、3、4、12、15、18基因等。

靶向性基因导入系统

将本发明的靶向性非病毒载体与外源DNA混合，就构成EGFR受体介导的靶向性肿瘤基因治疗的基因导入系统。取决于所用的外源DNA，本发明的基因导入系统可用于治疗遗传疾病或肿瘤等疾病，尤其是用于基因治疗。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的一种或多种本发明的靶向性非病毒载体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。

施用时，药物组合物中还含有一种或多种上述的外源DNA。

配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的靶向性基因导入系统(有效成分为本发明的靶向性非病毒载体与外源DNA)施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明从蛋白分子相互作用的机理出发，以小分子多肽模拟人天然EGFR配体与EGFR的结合位点对EGFR进行结合。与单抗比较，小分子多肽结构清楚，与EGFR结合位点局限，不易发生多肽与多肽之间的空间位阻效应，也没有Fc段的干扰。

(2)小分子多肽几乎没有抗原性，副作用小，容易制备和大规模生产以及使用方便等特点。

(3)本发明有关的多肽由于能够与细胞表面EGFR受体蛋白结合可能通过激活或阻断EGFR信号传导通路达到调节肿瘤细胞生长的功能，因而可作为临床药物研制的前体或药物组合物，它包含编码本发明有关多肽的DNA及本发明有关多肽的抗体。

(4)本发明有关的多肽可以作为靶向肽用于基因转移系统，进行针对EGFR受体高表达的肿瘤细胞的靶向基因治疗。

(5)本发明有关的多肽可以作为靶向肽联接放射性核素、化学药物、生物毒素用于恶性肿瘤及EGFR系统功能失调性疾病的靶向治疗作用。

(6)本发明有关的多肽及其编码该多肽的DNA序列还可作为检测或诊断试剂。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1化学合成多肽及其质谱分析

在本实施例中，用人工合成方法制备GE9、GE10和GE11。

以多肽GE9[SEQ ID NO：1]为例，其合成采用固相合成法，在多肽合成仪(Applied biosystems Inc.)上进行。

1).多肽固相合成

选择树脂：Fmoc-Lys(Boc)Wang树脂，用量为：0.46mmol/g

a.脱保护基(Fmoc)：用20％哌啶的DMF溶液脱两次(5’和15’)；树脂分别用DMF洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次。

b.接Fmoc-氨基酸

Fmoc-AA/Bop/HoBt/DIEA＝1∶1∶1∶2(对应于树脂的摩尔数过量5倍)

缩合1小时，树脂分别用DMF洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次。

c.Kaiser测试

如树脂呈蓝色则重接，到无色为止。重复以上a、b、c步骤，按照多肽GE9[SEQ ID NO：1]氨基酸序列，依次将各氨基酸接上。

2).切割树脂

用TFA∶H2O∶苯酚∶EDT＝92.5∶2.5∶2.5∶2.5，10ml/g，切树脂室温反应2小时。过滤，滤液浓缩去除TFA，加乙醚沉淀，乙醚洗涤，得粗品。

3).氧化

制成1mmol/L的水溶液，用NH₄Ac调pH至7-8，空气氧化过夜，经HPLC跟踪。

4).纯化

浓缩去盐，经HPLC纯化，浓缩、冻干、干燥得产品。

5).质谱分析

进行质谱分析，用电喷雾电离ESI簇测定分子量，所得多肽的分子量大小与理论值相近，为1504.6，表明此多肽正是GE9[SEQ ID NO：1](羧基端有接头序列GGGGSY)。实验结果见图1。

用相同方法制的GE10(羧基端有接头序列GGGGSY)，测定的分子量为1985.5，与理论值相近，表明此多肽正是GE10[SEQ ID NO：2]。

用相同方法制的GE11，测定的分子量为1541.2，与理论值相近，表明此多肽正是GE11[SEQ ID NO：3]。

实施例2 GE9与SMMC7721细胞表面EGFR受体特异性结合试验

将常用的SMMC7721细胞接种于96孔板，5×10³细胞/孔，培养过夜待细胞贴壁，用PBST(PBS+0.1％Tween20)洗3次，竞争组加入预冷的用结合缓冲液(PBS+20mM HEPES+2.5mg/ml BSA，pH7.4)稀释的GE9或EGF每孔20μl(含有GE9或EGF 20pmol)，非竞争组加20μl结合缓冲液，每组平行三孔；同时碘标GE9，用结合缓冲液稀释到1毫升，每孔加20μl(含有的¹²⁵I GE9 0.02pmol)。4℃结合3小时。PBST洗3次，加入100μl 0.25％的胰酶，消化10分钟，转移到测定管中，用100μl PBST洗，同样将洗液加到相应的测定管中，伽马计数。

实验结果见图2。表明GE9可与SMMC7721细胞表面EGFR受体发生特异性结合。

实施例3 ¹²⁵I标记GE9与EGFR蛋白特异性结合

每孔用0.1M NaHCO₃(PH8.6)50μl包被1μg EGFR蛋白(SIGMA公司)于96孔板，4℃过夜，PBST洗3次，竞争组加入预冷的用结合缓冲液(PBS+20mMHEPES+2.5mg/ml BSA pH7.4)稀释的GE9每孔20μl(含有GE9 20pmol)，非竞争组加20μl缓冲液，每组平行三孔；同时把¹²⁵I GE9，用结合缓冲液稀释到1毫升，每孔加20μl(含有的¹²⁵I GE9 0.02pmol)。室温下结合1小时。PBST洗3次，加入100μl Glycine-HCl(PH2.2)洗脱15分钟，转移到测定管中，再用100μl Glycine-HCl洗，同样将洗液加到相应的测定管中，伽马计数。

结果见图3。表明GE9可与EGFR蛋白发生特异性结合。

实施例4 GE9与EGFR受体亲和力检测

接种SMMC7721细胞于96孔板，5×10³细胞/孔，培养过夜待细胞贴壁，用PBST(PBS+0.1％Tween20)洗3次，用封闭缓冲液(Blocking Buffer)(0.05mM PB+5mg/ml BSA)100μl，4℃封闭1小时，PBST洗3次，按照如下浓度梯度每孔加入相应的¹²⁵I标记的GE9，每个浓度组设三个平行孔，每孔反应体系为100μl。4℃结合3小时，PBST洗3次，加入100μl 0.25％的胰酶，消化10分钟，转移到测定管中，用100μl PBST洗，同样将洗液加到相应的测定管中，伽马计数。根据实验结果，应用Scatchard plot计算出反应GE9与EGFR受体亲和力大小的解离常数Kd[浓度梯度为：0.2nM，0.39nM，0.78nM，1.56nM，3.13nM，6.25nM，12.5nM，25nM，50nM]。

结果见图4。测定的6E9与EGFR受体结合的Kd为1.33×10^-8M，远高于目前现有的EGFR配体寡肽。

实施例5噬菌体克隆与细胞表面EGFR受体特异结合

取对数生长期的SMMC7721细胞接种到96孔板，1×10⁴细胞/孔，培养过夜待细胞贴壁，PBST洗3次，10％甲醛固定37℃30分钟，PBST洗3次，5分钟/次，加入0.03％的过氧化氢(甲醇配制)37℃30分钟，PBST洗3次，加10¹¹pfu展示GE9和GE10的噬菌体(含0.1％BSA)37℃温浴1小时。PBST洗6次，加入HRP-鼠抗M13多克隆抗体100μl/孔，37℃1小时。PBST漂洗后，加入DAB工作液避光显色，待显色适当时终止反应。

结果见附图5，表明展示GE9和G10的噬菌体与表达EGFR的SMMC7721细胞结合。

实施例6 ¹²⁵I标记GE11与EGFR蛋白特异性结合

用实施例3相同方法，测定¹²⁵I标记GE11与EGFR蛋白特异性结合。

结果见图6，表明GE11可与EGFR蛋白发生特异性结合。

实施例7噬菌体回收试验(Phage recovery)

1)挑取常规的商业化的M13宿主菌大肠杆菌ER2738，接种于含2ml LB培基的5ml离心管。300rpm/min，至对数生长期。

2)包被EGFR和BSA(牛血清白蛋白)各1ug(溶解于50ul 0.1MNaHCO3，pH8.6)与96孔板，4℃过夜。

3)倒掉包被液，加250ul BSA(5mg/ml，溶解于0.1M NaHCO₃，pH8.6)，4℃2小时。倒掉液体，用TBST(0.5％Tween-20，50mM Tris-HCl，pH7.5，150mMNaCl)，洗涤3次。

4)每孔加1×10⁹噬菌体(溶于100ul TBST)，室温，轻摇30分钟。

5)去掉液体，用TBST洗涤10次。

6)每孔用100ul 0.2m Glycine-HCl(pH2.2)洗脱10分钟，各添加15ul Tris-HCl(pH9.1)中和。

7)噬菌体滴定：各取1ul洗脱液进行滴定。首先10倍梯度稀释洗脱液。加200ul ER2738培养液于5ml离心管，每管添加10ul稀释液，混匀，然后加3ml 45℃上层胶(每升：10g细菌蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，1g MgCl₂·6H₂O，7g琼脂糖)，另加30ul IPTG/Xgal(混合1.25g IPTG和1g Xgal于25ml二甲基甲酰氨)。振荡混匀。立即铺于90mm LB琼脂平皿。倒置平皿于37℃温箱，避光过夜。第二天计算克隆数(蓝斑数)。

结果图7，其中GE31为对照噬菌体。说明展示GE9、GE10和GE11的噬菌体都可以EGFR特异性结合。

实施例8非病毒载体的构建

A.各组分的获得

(1)配体寡肽GE的合成：

按实施例1相同的方法，采用美国ABI公司的多肽合成仪并按照其多肽合成操作手册进行合成，柱层析分离得到寡肽GE9、GE10和GE11，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、2和3。

(2)聚L-赖氨酸(Poly-L-lysine，简写为P.L.)

购自美国SIGMA公司，分子量分布为15000-30000道尔顿。

(3)HA20

采用美国ABI公司的多肽合成仪并按照其多肽合成操作手册进行合成，柱层析分离得到寡肽HA20，其氨基酸序列为GLFEA IAEFI EGGWE ELIEG(SEQ IDNO：4)。

B.二元复合物的制备

首先，将GE(GE9或GE10或GE11)、HA20和聚L-赖氨酸(Poly-L-lysine，简写为P.L.)溶于PSB(0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.4，含0.1M NaCl)中，然后，按下列步骤进行反应。

(1)P.L.+SPDP→P.L.-PDP

注：SPDP是N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯。

P.L.与SPDP(N-)的摩尔比为1∶5，反应时间为2小时，温度为25℃。反应完毕后通过透析去除未反应的SPDP。P.L.-PDP冷冻干燥。

(2)P.L.-PDP干粉溶于PSB中

P.L.-PDP+DTT→P.L.-SH

注：DTT是二硫苏糖醇。

反应中DTT过量，反应时间为1小时，温度为25℃。反应完毕后通过透析去除未反应的DTT。产物冷冻干燥。

(3)GE+SPDP→GE-PDP

HA20+SPDP→HA20-PDP

GE、HA20与SPDP的摩尔比均为1∶5，反应时间为2小时，温度为25℃。反应完毕后通过MWCO1000的透析袋透析去除未反应的SPDP。产物冷冻干燥。

(4)GE-PDP、HA20-PDP和P.L.-SH干粉均溶于PSB中。

GE-PDP+P.L.-SH→P.L.-GE

HA20-PDP+P.L.-SH→P.L.-HA20

GE-PDP、HA20-PDP与P.L.-SH的摩尔比为3∶1，反应时间为24小时，温度为25℃。反应完毕后通过透析去除未反应的GE-PDP和HA20-PDP。

C.靶向性非病毒载体的制备

分别以质量比1∶1、0.8∶1.2、1.2∶0.8混合P.L.-GE与P.L.-HA20，即得所需的非病毒载体。

或者，按质量比1∶1.5∶1将GE、聚赖氨酸和HA20混合在一起，形成所需的非病毒载体。

实施例9质粒DNA的抽提与纯化

本实施例中所用重组真核表达载体质粒DNA的分离与纯化均利用QIAGEN公司的Maxi plasmid kit而得到的DNA纯品。

从LB平板上挑选单克隆接种于含氨苄青霉素的5ml LB培养基中，37℃，250rpm振摇过夜。1∶1000转接于含氨苄青霉素的200ml LB培养基中，37℃，250rpm振摇16小时。转移菌液于500ml离心管中，4,000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，收集菌体。沉淀重悬于10ml缓冲液P1(50mM Tris·Cl，pH8.0，10mM EDTA pH8.0，100μg/ml Rnase A)。加入10ml缓冲液P2(200mM NaOH，1％SDS)后轻轻颠倒4-6次，混匀，室温下静置5分钟。加10ml缓冲液P3(3.0M NaAc，pH5.5)，颠倒混匀后，转移至50ml离心管，10,000rpm，4℃离心30分钟，取上清。上清经四层无菌过滤到QIAGEN Maxi质粒抽提柱中(预先用10ml缓冲液QBT平衡)，让其自然流下，等上清完全进入柱中，再加缓冲液QC 30ml洗涤二次，最后加入缓冲液QF15ml，收集流出液，加入0.7倍体积异丙醇，10,000rpm，4℃离心30分钟，弃上清，75％乙醇洗涤沉淀1次，室温下自然干燥，溶于适量体积的TE(pH8.0)中，1％琼脂糖凝胶电泳坚定DNA的质量，紫外分光光度计检测其纯度并定量，-20℃保存。

实施例10四元复合体基因导入系统的构建

1).GE-P.L.和HA20-P.L.溶解于水后，经0.22μm滤器过滤除菌，-20℃储存备用。所有质粒经QIAGEN柱提取和纯化，再用2倍体积的酒精和1/3体积的3M NaAc沉淀，75％酒精洗一次后，空气中干燥。用适量MilliQ水溶解，使浓度成为0.2μg/μl。

2).非病毒载体与DNA形成复合物时二者之间的最佳质量比。

0.2μg CMV-β-gal质粒DNA与非病毒载体以质量比1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2混合，25℃静置30分钟，以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的阻滞情况，确定最佳质量比。

3).按上述确定的配比制备四元复合体基因转移系统。

实施例11 GE基因导入系统转导CMV-β-gal基因的体外导入实验

1).细胞培养

SMMC7721细胞传代培养：SMMC7721细胞用0.25％胰酶消化后，接种于细胞培养瓶中，加入含10％小牛血清的DMEM完全培养液，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2).体外导入实验

培养细胞用0.25％胰酶消化后，接种于六孔板中，每孔1.5×10⁵，第二天细胞满度约60％时，于1ml培养液中加入相当于2μg DNA的四元复合体基因转移系统(即分别基于GE9、GE10、GE11的三种四元复合体基因转移系统)。转染24小时后，换新鲜的含10％小牛血清的DMEM完全培养液，继续培养24小时。然后细胞用PBS洗2次，加入新鲜配制的固定液于室温固定10分钟，再用PBS漂洗3次，每次15分钟，以彻底去除固定液，用滤纸吸干瘤块和脏器上的PBS，加入新鲜配制的染色液于37℃保温24小时后，观察外源基因导入的情况(染色液组成是：1mg/ml X-gal，5mM K₄[Fe(CN)₆]，5mMK₃[Fe(CN)₆]，2mM MgCl₂)。

结果表明，本发明的转导β-gal基因的细胞呈蓝色，而分别加入生理盐水和单纯质粒的对照组则未见外源基因的导入。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海新世界基因技术开发有限公司

<120>与人表皮生长因子受体EGFR特异性结合的配体寡肽

<130>037800

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>结合于EGFR受体的配体寡肽GE9

<400>1

Cys Lys Ser Pro Glu Pro Gln His Cys

1 5

<210>2

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>结合于EGFR受体的配体寡肽GE10

<400>2

Leu His Leu Trp Val Pro Glu Pro Trp Thr Gln Thr

1 5 10

<210>3

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>结合于EGFR受体的配体寡肽GE11

<400>3

Tyr His Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Gln Asn Val Ile

1 5 10

<210>4

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(20)

<223>内吞小体释放寡肽HA20

<400>4

Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Glu Phe Ile Glu Gly Gly Trp Glu Glu

1 5 10 15

Leu Ile Glu Gly

20

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>配体寡肽GE9的编码序列

<400>5

tgcaaaagcc cggaaccgca acattgc 27

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>配体寡肽GE10的编码序列

<400>6

ctgcatctgt gggttccgga accgtggacc cagacc 36

<210>7

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>配体寡肽GE11的编码序列

<400>7

aatcacattc taaggcgtat acccatacca atgata 36

Claims

1.一种表皮生长因子受体EGFR介导的靶向性基因治疗的基因转移系统，其特征在于，它包含(a)特异性结合于EGFR受体的配体寡肽，其中所述的配体寡肽含有SEQ ID NO：1、2或3的氨基酸序列；和(b)多聚阳离子多肽或蛋白。

2.如权利要求1所述的基因转移系统，其特征在于，它还含有(c)内吞小体释放寡肽。

3.如权利要求1或2所述的基因转移系统，其特征在于，它还含有(d)外源DNA。

4.如权利要求1所述的基因转移系统，其特征在于，所述的配体寡肽的氨基酸序列是SEQ ID NO：1、2或3。

5.如权利要求1所述的基因转移系统，其特征在于，多聚阳离子多肽选自下组：多聚赖氨酸、聚乙酰亚胺、鱼精蛋白、组蛋白、腺病毒pV蛋白、腺病毒pVII蛋白、mμ蛋白，经聚乙二醇修饰的上述蛋白及其混合物。

6.如权利要求3所述的基因转移系统，其特征在于，所述的外源DNA选自下组：抗癌基因、细胞凋亡基因、细胞因子基因、癌基因反义序列的真核重组表达载体DNA，及其混合物。

7.如权利要求3所述的基因转移系统，其特征在于，所述的外源DNA选自下组：

(i)抗癌基因：p53、Rb；

(ii)细胞凋亡基因：Caspase、p15、p16及p21^WAF-1；

(iv)癌基因的反义序列：癌基因ras、c-myc、Akt的反义序列；

8.如权利要求3所述的基因转移系统，其特征在于，所述的组分(a)配体寡肽、(b)多聚阳离子多肽和(c)内吞小体释放寡肽中的两者或三者以融合蛋白形式存在。

9.如权利要求2所述的基因转移系统，其特征在于，所述的内吞小体释放寡肽元件选自下组：HA20或VP-1。

10.一种寡肽，其特征在于，它结合于EGFR受体，且含有以下氨基酸序列：SEQ ID NO：1、2或3。