CN1190437A - 骨刺激因子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及刺激骨生长的多肽Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile lys Pro Asn Thr LeuHis Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn GlnPro和亚序列,特别是亚序列Arg Thr Asn Glu His Thr Ala AspCys Lys及相关核苷酸序列;本发明还涉及制备方法和应用,以及抗体和试剂盒。

Description

骨刺激因子
本发明涉及刺激骨生长的多肽。
在过去的几年中，人们对有关骨生长和强度问题的理解有了进展。1994年9月15日以国际公开号WO 94/20615公开的国际专利申请PCT/CA94/00144概述了有关内容。
所述专利文献举证说明了治疗骨物质减少相关性疾病和并发病的多种方法。例如，1989年10月31日公开的美国专利4,877,864描述了人和牛的“骨诱导因子”。1992年9月17日公开的国际专利申请WO 92/15615描述了一种源于猪胰腺的蛋白质，它具有降低血清钙水平的功能，可以治疗导致血清钙水平升高的骨疾病。1992年9月23日公开的欧洲专利申请EP 504938描述了用抑制半胱氨酸蛋白酶的二肽或三肽治疗骨疾病。1992年9月3日公开的国际专利申请WO92/14481公开了一种诱导骨生长的组合物，所述组合物含有活化素和骨成形蛋白。1992年8月19日公开的欧洲专利申请EP 499242描述了细胞生长因子组合物的应用，所述组合物被认为可以用于治疗与骨物质减少相关的骨疾病，因为它们能够引起成骨细胞增殖。1992年6月25日公开的国际专利申请WO 92/10515描述了一种含有人N-末端甲状旁腺素(PTH)片段1-37的药物。1991年9月16日公开的欧洲专利申请EP 451867描述了甲状旁腺素肽拮抗物用于治疗与钙和磷酸有关的代谢障碍，如骨质疏松症。1995年10月24日授权给耶路撒冷希伯鲁大学的Yissum研究开发公司的美国专利US 5,461,034描述了从再生骨髓中鉴定出来的生骨生长肽。
研究人员根据PTH在血清中的半衰期较短和间歇性注射PTH能对骨容量产生正性作用的结果得出一个假说，即PTH可以某种途径诱导第二种因子进入循环系统。因此，人们一直在研究这种第二因子在大鼠和人血清中的存在。
根据给不能产生PTH的大鼠(甲状旁腺切除的大鼠)施用一种多肽的情况，研究人员已经发现有可能从大鼠血清中分离出一种能够引起可观察到的骨矿物质添附率增加的多肽物质。已经以所述大鼠肽的氨基酸序列为基础合成了核酸探针，并用于筛选人胎肝cDNA文库，以分离编码人的骨添附多肽的核酸序列。根据所衍生的序列Gly Ile Gly Lys ArgThr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro AsnThr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met ValLeu Asp Gln Asn Gln Pro(SEQ ID NO：1)用化学方法合成了源于所述核酸序列的多肽。已经观察到完整的大鼠在施用所述的化学合成的化合物后，其骨添附率以剂量依赖性方式增加。正常的在切除了卵巢的大鼠中所观察到的骨生长减弱情况在大鼠卵巢切除二周后开始施用4周所述多肽时已不复存在。在大鼠卵巢切除8周后开始施用8周时间的所述多肽时，发现卵巢切除的大鼠维持了骨钙密度。
认为所述活性多肽有可能是前述序列的二聚体形式，大概由于具有所示序列的两多肽间存在二硫键，所以有明显的二体形成的证据。
因此还合成了含有cys→ala取代的所示多肽的修饰形式：GlyIle Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp AlaLys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala GluThr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Pro(SEQ IDNO：3)。发现经修饰的多肽也具有一些“正常多肽”(SEQ ID NO：1)的骨刺激作用。
在其他的实验中，已发现骨添附率在被施用了抗所述正常多肽(SEQ ID NO：1)的兔抗体的大鼠中受到抑制。所述抑制作用在同时施用了所述正常多肽及其抗体的大鼠中则受到减弱。
而且，也已合成了所述正常多肽(SEQ ID NO：1)的一些肽片段，每种片段都具有骨刺激作用：SEQ ID NO：4：Gly lle Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys lle Lys Pro Asn Thr Leu His Lys LysAla Ala Glu Thr Leu Met ValSEQ ID NO：5：Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys LysAla AlaSEQ ID NO：6：Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr LeuSEQ ID NO：7：Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys IleSEQ ID NO：8：Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys LysSEQ ID NO：9：Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys
而且，已发现SEQ ID NO：7所示的多肽在施用8周或12周的时间后能够增加切除卵巢大鼠的骨钙含量。
还合成了所述正常多肽(SEQ ID NO：1)的其他一些肽片段，但发现它们缺乏正常多肽所具有的骨刺激作用：SEQ ID NO：10：Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn GlnSEQ ID NO：11：Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln AsnSEQ ID NO：12：Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp GlnSEQ ID NO：13：Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu AspSEQ ID NO：14：Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val LeuAspSEQ ID NO：15：Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu ThrLeu Met Val Leu Asp Gln AsnSEQ ID NO：16：Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile
因此，本发明包括一种其氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1的多肽或功能等同类似物，所述多肽(a)缺失了SEQ ID NO：1N-末端的1-约4个氨基酸，或(b)缺失了SEQ ID NO：1C-末端的1-约22个氨基酸，或者同时具有(a)和(b)。相应地，本发明还包括一种其氨基酸序列对应于SEQ ID NO：3的多肽或功能等同类似物，所述多肽(a)缺失了SEQ ID NO：3N-末端的1-约4个氨基酸，或(b)缺失了SEQ ID NO：3C-末端的1-约22个氨基酸，或者同时具有(a)和(b)。本领域的专业人员应该理解多肽和蛋白质中的序列同源性问题，例如如<分子细胞生物学>一书(H.Lodish，D.Baltimore，A.Berk，S.L.Zipursky，P.Matsudaira and J.Dar-nell，Scientific American Book，New york City，Third Edition，1995)中所讨论的。同样，本发明还包括一种其氨基酸序列的对应于SEQID NO：4多肽或功能等同类似物，所述多肽(a)缺失了SEQ IDNO：4N-末端的多至约4个氨基酸，或(b)缺失了SEQ ID NO：4C-末端的多至约16个氨基酸，或者同时具有(a)和(b)。本发明还包括一种其氨基酸序列对应于SEQ ID NO：5的多肽或功能等同类似物，所述多肽(a)缺失了SEQ ID NO：5N-末端的多至约4个氨基酸，或(b)缺失了SEQ ID NO：5C-末端的多至约11个氨基酸，或者同时具有(a)和(b)。本发明还包括一种氨基酸序列对应于SEQ IDNO：6的多肽或功能等同类似物，所述多肽(a)缺失了SEQ ID NO：6N-末端的多至约4个氨基酸，或(b)缺失了SEQ ID NO：6C-末端的多至约5个氨基酸，或者同时具有(a)和(b)。本发明还包括一种其氨基酸序列对应于SEQ ID NO：7的多肽或功能等同类似物，所述多肽(a)缺失了SEQ ID NO：7N-末端的多至约4个氨基酸，或(b)缺失了SEQ ID NO：4C-末端的多至约1个氨基酸，或者同时具有(a)和(b)。本发明还包括一种具有对应于SEQ ID NO：8的氨基酸序列并缺失了N-末端多至约4个氨基酸的多肽或功能等同类似物。本发明还包括一种具有对应于SEQ ID NO：9的氨基酸序列的多肽或其功能等同类似物。
本发明的多肽可以是合成的，并且氨基酸序列的分子量约为1000-4000。
本发明包括具有足以复制另一个多肽即第二多肽的氨基酸序列的多肽或其功能等同类似物，所述第二多肽具有对应于SEQ ID NO：1(或SEQ ID NO：3)的氨基酸序列，并且(a)缺失了SEQ ID NO：1(或SEQ ID NO：3)N-末端的1-约4个氨基酸，或(b)缺失了SEQID NO：1(或SEQ ID NO：3)C-末端的1-约22个氨基酸，或者同时具有(a)和(b)，使得第一多肽由在严谨条件下能够与编码第二多肽的DNA杂交的DNA编码。
本发明的另一方面包括一种对哺乳动物具有在体骨刺激活性并能增加骨矿物质含量(即钙)的合成多肽或功能等同类似物，所述多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少大约19％的保守性，并从中缺失了至少一个氨基酸。
本发明还包括一种对哺乳动物具有在体骨刺激活性并能增加骨矿物质含量的合成多肽，所述多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少大约22％的保守性，并从中缺失了至少一个氨基酸。
本发明还包括一种对哺乳动物具有在体骨刺激活性并能增加骨矿物质含量的合成多肽，所述多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少大约25％的保守性，并从中缺失了至少一个氨基酸。
本发明还包括一种对哺乳动物具有在体骨刺激活性并能增加骨矿物质含量的合成多肽，所述多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少大约28％的保守性，并从中缺失了至少一个氨基酸。
本发明还包括从前述任一合成多肽序列中缺失至少6个氨基酸的多肽；或从所述多肽序列中缺失至少11个氨基酸的多肽；或从所述多肽序列中缺失至少16个氨基酸的多肽；或从所述多肽序列中缺失至少21个氨基酸的多肽；或从所述多肽序列中缺失至少26个氨基酸的多肽。
本发明还包括具有足以复制前述合成多肽之一的氨基酸序列的多肽，以使所述多肽由能够在严谨条件下与编码所述合成多肽的DNA杂交的DNA编码。
本发明的另一方面包括在哺乳动物中具有骨刺激活性的多肽、其类似物以及所述各多肽或类似物的共轭物，所述多肽具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQID NO：9一致的氨基酸序列；所述类似物其氨基酸序列中的氨基酸可以被取代、缺失或增加，只要源于所述序列三维结构的哺乳动物骨刺激活性能够保留；在所述的共轭物中，如果所述多肽序列与SEQ ID NO：1一致，则至少有一个氨基酸缺失。本发明包括具有足以复制这类骨刺激活性多肽(或其功能等同类似物)的氨基酸序列的多肽，使得该多肽由在严谨条件下能够与编码所述骨刺激性多肽的DNA杂交的DNA编码。
另一方面，本发明的多肽包括那些其氨基酸序列相对于SEQ IDNO：1的氨基酸序列具有19％-90％保守性的多肽；或者其氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有19％-86％保守性的多肽；或者其氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有19％-69％保守性的多肽；或者其氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有19％-56％保守性的多肽；或者其氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有19％-42％保守性的多肽；或者其氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有19％-39％保守性的多肽；或者其氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有19％-28％保守性的多肽；或者其氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有28％-90％保守性的多肽；或者其氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有28％-86％保守性的多肽；或者其氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有28％-69％保守性的多肽；或者其氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有28％-56％保守性的多肽；或者其氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有28％-42％保守性的多肽；或者其氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有28％-39％保守性的多肽；或者在哺乳动物中具有骨刺激活性的功能等同类似物。
所述多肽可以是包括作为本发明一部分的上述任一氨基酸序列的嵌合性骨刺激因子。
本发明还包括用于预防和治疗骨减少相关性疾病的药物，含有包括嵌合性多肽在内的作为本发明一部分的上述任一多肽作为活性成分。
本发明因此还包括一种促进骨生长的药物组合物，含有治疗有效量的作为本发明一部分的上述任一多肽。
本发明包括一种促进哺乳动物骨生长的方法，包括施用治疗有效量的作为本发明一部分的上述一种多肽(或含有所述多肽的药物组合物)。
本发明包括对骨质疏松症、促进哺乳动物的骨生长或治疗人的骨减少相关性疾病的治疗。
本发明包括具有本发明任一多肽序列的多肽用于制备促进骨生长或治疗骨质疏松症等的药物的应用。
本发明包括一种用于检测本发明多肽的诊断试剂盒，含有针对所述一种(或多种)多肽并与报告系统相连的抗体，其中的报告系统在预定量的所述多肽与抗体结合在一起时产生可检测的反应。
本发明包括一种能够结合所述多肽的抗体。本发明特别包括的一种能够与这类多肽结合的所述抗体是利用所述多肽来合成的。
本发明包括与所述多肽相关的分子，诸如与所述多肽相关的分离的核苷酸序列。例如，本发明包括编码所述任一多肽表达的分离的DNA片段。应该理解，这类片段可以由于遗传密码的简并性而彼此不同。而且，本发明还包括掺入了任一这类DNA序列的载体。
本发明包括一种编码本发明任一所述氨基酸序列的分离的DNA序列或其类似物，其中所述序列中的氨基酸可以被取代、缺失或增加，只要能够在含有所述氨基酸序列的多肽中保留源于所述序列三维构象的哺乳动物骨刺激活性；能够与所述DNA杂交并且编码具有哺乳动物骨刺激活性多肽氨基酸序列的序列；以及由于遗传密码的简并性而不同于所述序列的DNA。
本发明还包括生产本发明任一多肽的方法，包括：a)制备含有编码所述多肽的核苷酸序列的DNA片段；b)将所述DNA片段掺入表达载体中，以获得含有所述DNA片段并能够进行复制的重组DNA片段；c)用所述的重组DNA片段转化宿主细胞，分离能够表达所述多肽的转化体；以及d)培养所述转化体，使之产生所述多肽，再从所得培养混合物中回收所述的多肽。
附图的简要描述
下文的描述是结合附图进行的，其中：
图1说明将化学合成的人N-乙酰(N-末端)多肽(SEQ IDNO：2)植入切除了甲状旁腺的大鼠后大鼠中的骨矿物质添附率(μm/天)。误差棒表示±1标准离差(S.D.)。p值＜0.001。
图2说明经处理4周的大鼠右侧股骨的钙密度。A组大鼠为切除了卵巢并每天注射化学合成的正常多肽(SEQ ID NO：1)。B组大鼠为切除了卵巢并每天注射对照溶液。C组大鼠为进行了假性(sham)卵巢切除并每天注射对照溶液。D组大鼠为完整的大鼠并每天注射对照溶液。误差棒表示±1标准离差(S.D.)。
图3说明在经结合图2所述的处理后经四环素标记测定的大鼠骨矿物质添附率。误差棒表示±1标准离差。
图4说明经过8周处理的大鼠的股骨钙浓度。A组大鼠为切除了卵巢并在术后8周开始每天注射化学合成的正常多肽(SEQ ID NO：1)的组。B组大鼠为进行了类似的卵巢切除术并每天注射对照溶液的组。C组大鼠为进行了假性卵巢切除术并每天注射对照溶液的组。D组大鼠为完整的大鼠并每天注射对照溶液的组。误差棒表示±1标准离差(S.D.)。
图5说明经四环素标记测定的完整大鼠的骨矿物质添附率。A组大鼠用抗化学合成的正常多肽(SEQ ID NO：1)的兔抗体进行处理。B组大鼠用相同的兔抗体和所述多肽本身进行处理。C组是对照组。误差棒表示±1标准离差(S.D.)。
图6说明人类的化学合成的正常多肽(SEQ ID NO：1)和含有一个cys→ala取代的相同多肽(SEQ ID NO：3)的麦黄酮SDS电泳凝胶图谱。
图7说明大鼠中的骨矿物质添附率(μm/天)，A组为注射化学合成的人多肽(SEQ ID NO：1)的组，B组为注射经修饰的化学合成人多肽(SEQ ID NO：3)的组，C组为对照组。所有组的动物数都为6。误差棒表示±1标准离差(S.D.)。
图8说明注射了N-末端合成的多肽的大鼠中的骨矿物质添附率(μm/天)：SEQ ID NO：1(A组)；SEQ ID NO：2(B组)；SEQ IDNO：3(C组)；SEQ ID NO：4(D组)和SEQ ID NO：5(E组)。所有组的动物数都为6。误差棒表示±1标准离差(S.D.)。
图9说明注射了化学合成的人多肽的大鼠中的骨矿物质添附率(μm/天)：SEQ ID NO：8(G组)；SEQ ID NO：9(H组).
图10为大鼠右侧股骨所扫描区域的DEXA图象：A：近端；B：骨干；C：远端。
图11为大鼠右侧股骨所扫描颈部区域的DEXA图象。
图12说明注射了无N-末端的合成的多肽片段的大鼠中的骨矿物质添附率(μm/天)：SEQ ID NO：1(H组)；SEQ ID NO：16(I组)；SEQ ID NO：15(J组)；SEQ ID NO：14(K组)和SEQ IDNO：10、11、12和13(L组)。所有组的动物数都为6。误差棒表示±1标准离差(S.D.)。
图13表示各种被测试多肽的氨基酸序列，中线以上为活性多肽，中线以下为尚未发现存在骨生长刺激活性的序列。
方法学
本发明采用了国际专利申请PCT/CA94/00144在一般方法学部分所描述的实用方法。化学合成的人N-乙酰(N-末端)多肽(SEQ ID NO：2)的毒性实验
将溶于0.1％乙酸中的大约1.5ml具有N-末端乙酰基的化学合成肽装载到微型渗透泵(Alzet)中，以得到每天大约25μg的释放量。切除大鼠的甲状旁腺，将泵植入5只术后7天大鼠喉部左侧皮下筋膜的背侧。5只行类似手术的大鼠接收仅含有0.1％乙酸的类似植入物。5只完整的大鼠用作对照。
28天后，给每只如前所述被植入的大鼠经右侧臀肌最高点肌肉注射0.5ml盐酸四环素的水溶液。过48小时之后，再行第二次盐酸四环素溶液注射。24小时后处死大鼠。
通过检测放入植入物的10只大鼠右侧股骨较低的干骺端的横切面来决定骨矿物质添附率。结果总结于表1中，并以图1进行图示说明。
             表1：组间算术平均值的比较
    试验组     对照组
    平均值     1.27μm/天     0.67μm/天
    标准离差     0.18μm/天     0.08μm/天
    动物数     5     5
    t     d.f
  试验组对对照组     7.14     8
对表1所示各组中的5只大鼠的所选组织用显微镜进行组织学评估。没有发现毒性损伤。进行卵巢切除术并给予化学合成的正常多肽(SEQ ID NO：1)处理4周时间的大鼠实验
给6只雌性Sprague-Dawley大鼠进行卵巢切除术，每只都用1mg巴比妥酸钠腹膜内注射镇静。给第二组的6只大鼠进行假性手术(Sham)。大鼠在术后恢复2周。
给6只切除卵巢的大鼠经皮下注射100μl含有100μg化学合成多肽(SEQ ID NO：1)的0.1％乙酸溶液，每24小时注射一次，共注射28天。在第25天，如前所述按24mg/kg体重给每只大鼠肌注盐酸四环素溶液。在第27天，第二次注射盐酸四环素溶液。第28天处死大鼠。
用不含肽的0.1％乙酸溶液在相同的28天期间对第二组进行卵巢切除的6只大鼠进行类似的处理。用不含肽的0.1％乙酸溶液在相同的28天期间对第三组进行假性卵巢切除术的6只大鼠进行类似的处理。用不含肽的0.1％乙酸溶液在相同的28天期间对第四组6只完整的大鼠进行类似的处理。
经心脏穿刺采集尸体血，并冻存血清以备分析之用。对每只大鼠进行完全尸检。用多肽处理过的大鼠中没有观察到有不良作用。
从软组织中剥离每一根右侧股骨，固定2天，然后于70kV分别照X光1分钟、2分钟和3分钟。在X光中暴露3分钟的结果最为理想。第二组进行了卵巢切除但没有用肽处理的大鼠之股骨骨密度明显较低。
使每一只大鼠的右侧股骨分别脱钙。脱钙液含有10％甲酸(v/v)和5％柠檬酸钠(w/v)(pH3.0)。将每根股骨置于6ml脱钙液中。分别在第4天、8天、10天和13天换液。2天后除去脱钙液，换成去离子水，并将样品搅拌2天。在此后的第2天和3天换水。1天后，将所有的液体样品合并，并用去离子水将各终体积调整为50ml。
通过检测股骨浸入水中时所置换的水的体积来确定每根右侧股骨的体积。按照标准方法测定每一样品的钙浓度，并计算每一股骨的钙密度。所得结果以列表形式显示于表2中，并以图2进行图示说明。从中可见，对用所述肽(SEQ ID NO：1)进行处理的卵巢切除大鼠检测所得的钙浓度看来是正常的，而未经处理的卵巢切除大鼠的钙浓度受到抑制。
       表2：行卵巢切除术的大鼠右侧股骨的钙浓度
    A组     B组     C组     D组
平均值(μmol/ml)     7.57     6.61     7.45     7.69
动物数     6     6     6     6
标准离差     0.38     0.29     0.28     0.31
组别     t     d.f.     p
A对B     4.90     10    ＜0.001
A对C     0.62     10    ＞0.5
A对D     0.60     10    ＞0.5
B对C     5.08     10    ＜0.001
B对D     6.20     10    ＜0.001
C对D     1.40     10    ＞0.1
如前所述，通过检测左侧股骨较低的干骺短来确定骨矿物质添附率。所得结果以列表形式显示于表3中，并以图3进行图示说明。
          表3：行卵巢切除术的大鼠的骨矿物质添附率
    A组    B组    C组    D组
平均值(μm/天)     0.90     0.59     0.85     0.86
动物数     6     6     6     6
标准离差     0.12     0.07     0.07     0.09
组别     t     d.f.     p
A对B     5.39     10     ＜0.001
A对C     0.87     10     ＞0.5
A对D     0.21     10     ＞0.5
B对C     6.29     10     ＜0.001
B对D     5.93     10     ＜0.001
C对D     0.21     10     ＞0.5
进行卵巢切除术并给予化学合成的正常多肽(SEQ ID NO：1)处理8周时间的大鼠实验
进行卵巢切除术8周后，给5只切除卵巢的大鼠经皮下注射100μl含有100μgN-末端氨基经乙酰基修饰的化学合成多肽(SEQ IDNO：2)的0.1％乙酸溶液，每24小时注射一次，共注射8周。在第54天，如前所述按24mg/kg体重给每只大鼠经臀肌最高点肌注盐酸四环素溶液。在第56天注射第二剂盐酸四环素溶液，并于第57天处死大鼠。
用不含肽的0.1％乙酸溶液在相同的期间对第二组进行卵巢切除的7只大鼠进行类似的处理。用不含肽的0.1％乙酸溶液在相同的期间对第三组进行假性卵巢切除术的5只大鼠进行类似的处理。用不含肽的0.1％乙酸溶液在相同的8周期间对第四组5只完整的大鼠进行类似的处理。第二组中的2只大鼠在8周期间因患病而被过早处死。
经心脏穿刺采集尸体血，并冻存血清以备分析之用。对每只大鼠进行尸体检查，除了外科手术的痕迹和切除卵巢的大鼠子宫与阴道萎缩以外，在大鼠中未观察到明显的病理学变化。
如前所述，使右侧股骨脱钙并测定钙密度。结果在表4和图4中显示。
           表4：行卵巢切除术的大鼠右侧股骨的钙浓度
    A组     B组     C组    D组
平均值(μmol/ml)     7.37     6.89     7.69     7.87
动物数     5     5     5     5
标准离差     0.15     0.32     0.30     0.24
组别     t     d.f.     p
A对B     3.85     6     ＜0.005
A对C     1.17     6     ＞0.2
A对D     3.01     6     ＜0.01
B对C     4.03     6     ＜0.005
B对D     5.41     6     ＜0.001
C对D     1.60     6     ＞0.1
抗化学合成的蛋白质(SEQ ID NO：1)的抗体的合成
如下所述，用3种不同的交联剂使化学合成的蛋白质(SEQ IDNO：1)与KLH(keyhole Limpet血蓝蛋白)偶联。
戊二醛偶联
在2.5ml由2.7M KCl，1.2mMKH2PO4、138mMNaCl和8.1mM Na2HPO4组成的PBS溶液中稀释5mg肽(SEQID NO：1)，以使肽的终浓度为2mg/ml。用5.0ml PBS稀释10mg KLH，得到2mg/ml的终浓度。向1.25ml KLH溶液中加入1.25ml肽溶液。加入终浓度至0.25％的戊二醛。于室温下将所得溶液搅拌1小时。搅拌后，将溶液对1升PBS透析。更换PBS三次。
碳化二亚胺(EDC)偶联
如前所述制备肽溶液和KLH溶液。向1.25ml KLH溶液中加入1.25ml肽溶液。向所得溶液中加入2.5mg的EDC。于室温下将所得溶液不断地搅拌4小时。然后将溶液对1升PBS透析。更换PBS三次。
M-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)偶联
向500μl水中加入5mg肽，并用NaOH将pH调整到8.5，使终浓度为10mg/ml。用水稀释柠康酐至浓度为10mg/ml。向100μl肽溶液加入500μl柠康酐溶液，同时在每次加液之前调pH至8.5。然后在室温下不断地搅拌所得溶液1小时。随后加入100μl 1M磷酸钠缓冲液(pH7.2)，继而加入900μl 100mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)。用水稀释硫代-MBS(Sμl fo-MBS)至浓度为25mg/ml，再将400μl的该溶液加入所述肽溶液中，使MBS浓度为大约5mg/ml。所得溶液在室温下不断地搅拌30分钟。加入6μlβ-巯基乙醇，使巯基乙醇的终浓度达到35mM。再将所得溶液在室温下不断搅拌1小时。KLH以3mg/ml溶于PBS中，并取2.5ml加入所述肽溶液中。于室温下将所得溶液不断地搅拌3小时。然后将溶液对l升PBS透析。更换PBS三次。最终的肽浓度大约为1mg/ml，而KLH的终浓度大约为1.5mg/ml。
抗体的生产
如下所述给兔子注射合成肽的溶液。将戊二醛偶联的和EDC偶联的肽溶液各250μl一起与500μl福氏佐剂混合。该溶液经肌肉注入兔子的后腿，每条腿注射500μl。被注射肽的总量为0.5mg。将500μl用MBS与KLH偶联的合成肽和500μl福氏佐剂混合。该溶液经肌肉注入另一兔子的后腿，每条腿注射500μl。被注射肽的总量为0.5mg。
将合成肽以1.5ug和4ug上样到凝胶的两条泳道(18％分离胶，5％浓缩胶)。该凝胶于30V进行电泳过夜，并以溶于PBS中的3％牛奶进行封闭。将所得凝胶与用1％牛奶/PBS按1∶250稀释的兔血清温育过夜，再与1∶1000稀释的羊抗兔碱性磷酸酶温育1小时。然后将凝胶用底物显色。合成肽经考马斯亮兰染色后进行观察。每只兔子的第二次血样可检测到所述肽，用8只兔子的免前疫血清却不能检测到所述肽。
利用BIAcoreTM通过表面细胞质基因组共振(surfaceplasmon resonance)对固定肽和血清肽之间的相互作用进行了深入的研究。合成肽通过胺耦合物共价固定于葡聚糖基质上。将不同稀释度的兔血清在5分钟内加至所述基质表面，测定与固定肽结合的抗体量。滴度定义为产生阳性反应的最小稀释度，即大于50共振单位。利用所述方法发现在两种兔子的血清中都存在抗体，而其相互作用可以被与所述肽预先温育的血清所阻断。发现兔血清中的抗体不与所固定的非相关肽发生相互作用。大鼠和抗化学合成肽的抗体的有关实验
在10mM Tris.Cl(pH7.4)中制备抗血清。经左侧臀肌最高点给5只大鼠注射100μl所述溶液。第2组的5只大鼠接受类似的处理，但还要在右侧臀肌最高点注射含有45ug所述多肽(SEQ ID NO：1)的溶液。第3组的5只大鼠接受100μl 10mM Tris.Cl(pH 7.0)的注射。
然后给15只大鼠以24mg/Kg注射如前所述的盐酸四环素。大约在48小时后注射第二剂盐酸四环素。再过约24小时处死大鼠。
根据如前所述的方法检测右侧股骨较低的干骺端来确定骨矿物质添附率。结果如表5和图5所示。
    表5：注射抗化学合成肽抗体的大鼠的骨矿物质添附率
    A组     B组     C组
平均值(μm/天)     0.86     1.22     1.30
标准离差     0.02     0.08     0.11
动物数     5     5     5
    t     d.f.     p
组A对组B     8.06     8     ＞0.2
组A对组C     7.57     8     ＜0.001
组B对组C     1.24     8     ＞0.2
因此，利用抗所述多肽的抗体可以开发用于检测能够与所述抗体相结合之多肽的方法和产品。例如，抗体可以与几种熟知的报告系统之一连接或形成共轭物，所建立的报告系统用于指示所述多肽与抗体的阳性结合。熟知的报告系统包括放射免疫测定(RIAs)或免疫放射测定(IRM-As)。可以选择的是，酶联免疫吸附测定(ELISA)具有相对于RIAs和IRMAs一样的相对高的敏感性，但是它一般不依赖于放射性同位素的应用。可以产生可见的检测物质，或至少是用分光光度计可以检测的物质。也可以应用依赖于与被检测酶结合的底物之荧光的测定法。可以理解，许多的报告系统都可以用于本发明以检测是否存在特定的多肽。随着样品收集和处理过程的标准化，可以很好地测定高于血清中阈值的多肽含量。
可以开发基于针对化学合成的人多肽(SEQ ID NO：1)的抗原反应的一类方法，并对如上所述进行氨基酸取代、缺失和增加所得的多肽变异体(和共轭物)进行预筛以作为有效的骨刺激因子。然后，用本文对于例如大鼠所述的系统，测试那些与抗已知肽的抗体发生阳性反应的肽的在体骨刺激作用。
这类抗体结合的报告系统可用于检测受试者血清中是否含有不足量的所述多肽的方法中。给特定类型的受试者确定一个某多肽在血清中的正常阈浓度，因此即可开发检测试剂盒。含有cys→ala取代的化学合成的人多肽实验
利用标准的化学方法制备用丙氨酸取代31位半胱氨酸残基得化学合成肽(SEQ ID NO：1)的修饰序列(SEQ ID NO：3)。丙氨酸残基在立体结构上类似于还原的半胱氨酸残基，然而它使得所述多肽不能自发形成二聚体。经修饰的肽和未修饰肽的麦黄酮SDS电泳凝胶图谱如图6所示。
实验在三组动物中进行，每组有6只大鼠，体重为295-320g。用0.1％乙酸将修饰的肽(SEQ ID NO：3)制备成1mg/ml的溶液。用0.1％乙酸将正常肽(SEQ ID NO：1)制备成1mg/ml的溶液。给第一组的每只大鼠右侧大腿经皮下注射0.1ml被修饰肽的溶液。类似地，给第二组的每只大鼠注射0.1ml正常肽的溶液。给对照组第三组的每只大鼠注射0.1ml 0.1％乙酸溶液。紧接这些注射，对每只大鼠以24mg/ml体重的剂量肌注溶于0.5ml水中的盐酸四环素。第二剂盐酸四环素在48小时后给予。第二次注射24小时后经CO2麻醉处死大鼠。剥离出右侧股骨的下干骺端，并置于10％甲醛水溶液中固定，该甲醛溶液经乙酸盐缓冲液缓冲至pH7.2。如上所述制备用于检测的骨样品切片。
检测结果显示于表6和图7中。从中可见，注射了被修饰肽的大鼠其骨添附率高于对照组的，但低于注射了正常肽的大鼠的骨添附率。
  表6：注射了修饰肽、未修饰肽和对照的各组间算术平均值的比较
    A组     B组     对照组
平均值(μm/天) 1.67(μm/天) 1.35(μm/天) 1.02(μm/天)
标准离差 0.11(μm/天) 0.16(μm/天) 0.010(μm/天)
动物数     6     ＜6     6
    t     d.f.     p
A组对对照组(C)组     12.2     10     ＜0.001
B组对对照组(C)组     4.69     10     ＜0.001
A组对B组     3.97     10     ＜0.005
36个氨基酸的人多肽活性片段实验
根据熟知的化学方法合成具有与SEQ ID NO：4、5、6、7、8和9一致的氨基酸序列的多肽。
如上所述，用Sprague-Dawley大鼠作为实验动物以检测骨矿物质添附率。在进行1周的驯化后给体重为280-380g的雄性大鼠进行皮下注射。每只动物注射200μl 0.1％乙酸试验溶液，所述溶液已经按照每只动物获得大约25nmol多肽的剂量制备。紧接每一试验剂后，对每只大鼠以24mg/ml体重的剂量肌注盐酸四环素。第二剂盐酸四环素注射在48小时后给予。
对照组：0.1％乙酸溶液
A组：SEQ ID NO：1
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys
Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Pro
E组：SEQ ID NO：4
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys
Ala Ala Glu Thr Leu Met Val
D组：SEQ ID NO：5
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys
Ala Ala
C组：SEQ ID NO：6
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu
B组：SEQ ID NO：7
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile
在类似的但另外一套实验中，用下列化学合成的多肽测试骨矿物质添附率：
F组：SEQ ID NO：8
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys
G组：SEQ ID NO：9
Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys
根据如前所述的方法检测右侧股骨较低的于骺端来确定骨矿物质添附率。两组实验所得的结果如表7、8和图8、9所示。从中可见，所有的测试多肽都对骨添附率有阳性作用，即显示了骨刺激活性。
             表7：注射了活性变异体的第一组组间算术平均值的比较
    A组   B组   C组   D组     E组     F组
平均值     1.40  1.41   1.37   1.35     1.31     1.03
标准离差     0.05  0.08   0.09   0.10     0.06     0.06
动物数     6     6     6     6     6     6
    t     d.f.     p
A组对对照组     5.18     10     ＜0.001
B组对对照组     9.67     10     ＜0.001
C组对对照组     7.64     10     ＜0.001
D组对对照组     6.92     10     ＜0.001
E组对对照组     7.99     10     ＜0.001
A组对B组     0.14     10     ＞0.5
A组对C组     0.40     10     ＞0.5
A组对D组     0.66     10     ＞0.5
A组对E组     1.30     10     ＞0.2
B组对C组     0.82     10     ＞0.4
B组对D组     1.19     10     ＞0.2
B组对E组     2.49     10     ＜0.05
    表8：注射了活性变异体的第二组组间算术平均值的比较
    F组     G组     对照组
平均值 2.09μm/天   2.83μm/天  1.63μm/天
标准离差 0.34μm/天   0.19μm/天  0.13μm/天
动物数     4     3     4
    t     d.f.     p
F组对对照组     6     0.0470
G组对对照组     5     0.0002
F组对对G组     5     0.215
与SEQ ID NO：7有关的骨钙含量实验
利用与SEQ ID NO：7一致的多肽进行另一组实验，以检测将所述多肽施用于大鼠时对骨钙含量的影响。
如上所述，对大鼠进行卵巢切除术。在实验期间每天给每只大鼠皮下施用含有25nmol所述多肽的0.1％乙酸溶液。一组大鼠在术后100天开始接受12周的处理。另一组大鼠在卵巢切除术后8周开始接受8周的处理。在处理末期处死大鼠，并进行剥离。对骨矿物质含量进行死后评估。
用强力尼龙刷清洁腰椎L1-L4以除去附着的肌肉。将椎骨腹侧向下置于装有蒸馏水的聚丙烯容器中，使该椎骨在水面下3cm，并用双能量x-线吸附检测仪(DEXA)-Hologic100进行扫描，以测定骨钙含量的克数。每只大鼠的右侧股骨也被完整地剥离出来，并用强力尼龙刷清除附着的肌肉。将其背侧朝下置于蒸馏水中3cm，用DEXA进行扫描。被扫描的股骨的4个区域如图10和11所示：A，近端；B，骨干；C，远端；D，颈部。根据吸附率和利用机器的内部标准确定股骨4个区域的骨矿物质(即，钙)的克数。
检测结果列表显示于表9-18中。
  表9：给行卵巢切除术大鼠注射SEQ ID NO：7多肽100天后于股骨近端测得的骨矿物质含量组间算术平均值的比较
对照组   A-切除卵巢的(无多肽)  B-切除卵巢的(有多肽)
平均值(g.) 0.1503     0.1351     0.1411
标准离差 0.0159     0.0105     0.0155
动物数 14     14     11
t     d.f.     p
对照组对A组 2.9772     26     ＜0.025
对照组对B组 1.4400     23     N.S.
A组对B组 1.1634     23     N.S.
  表10：给行卵巢切除术大鼠注射SEQ ID NO：7多肽56天后于股骨近端测得的骨矿物质含量组间算术平均值的比较
  对照组  Sham组  A-切除卵巢的(无多肽)  B-切除卵巢的(有多肽)
平均值(g.)   0.1451   0.1387     0.1368     0.1328
标准离差   0.0183   0.0166     0.0280     0.0141
动物数   5   5     6     6
      t     d.f.     p
组照组对Sham组     0.7372     8     N.S.
对照组对A组     0.6261     9     N.S.
对照组对B组     1.6223     9     N.S.
Sham组对A组     0.1330     9     N.S.
Sham组对B组     1.6229     9     N.S.
组A对B组     0.3116     10     N.S.
表11：给行卵巢切除术大鼠注射SEQ ID NO：7多肽100天后于腰椎(L1-L4)测得的骨矿物质含量组间算术平均值的比较
对照组   A-切除卵巢的(无多肽)   B-切除卵巢的(有多肽)
平均值(g.) 0.5437     0.4364     0.4758
标准离差 0.0161     0.0089     0.0188
动物数 14     14     10
t     d.f.     p
对照组对A组 5.8384     26     ＜0.001
对照组对B组 2.7434     22     ＜0.0025
A组对对B组 2.0756     22     0.05
  表12：给行卵巢切除术大鼠注射SEQ ID NO：7多肽56天后于腰椎(L1-L4)测得的骨矿物质含量组间算术平均值的比较
  对照组   Sham组  A-切除卵巢的(无多肽)  B-切除卵巢的(有多肽)
平均值(g.)   0.5542   0.5321     0.4322     0.4606
标准离差   0.0275   0.0172     0.0226     0.0234
动物数     5     5     6     6
      t     d.f.     p
对照组对Sham组     0.6805     8     N.S.
对照组对A组     4.4196     9     ＜0.005
对照组对B组     3.1042     9     ＜0.025
Sham组对A组     2.8382     9     ＜0.025
Sham组对B组     1.9951     9     N.S.
组A对B组     0.8759     10     N.S.
表13：给行卵巢切除术大鼠注射SEQ ID NO：7多肽100天后于股骨干测得的骨矿物质含量组间算术平均值的比较
  对照组   A-切除卵巢的(无多肽)   B-切除卵巢的(有多肽)
平均值(g.)   0.2258     0.2146     0.2347
标准离差   0.0261     0.0106     0.0215
动物数   14     14     11
  t     d.f.     p
对照组对A组   0.8301     26     N.S.
对照组对B组   0.9078     23     N.S.
A组对对B组   2.3079     23     ＜0.05
表14：给行卵巢切除术的大鼠注射SEQ ID NO：7多肽56天后于股骨干测得的骨矿物含量组间算术平均值的比较
对照组 Sham  A-切除卵巢的(无多肽)  B-切除卵巢的(有多肽)
平均值(g) 0.2179 0.1918     0.1716     0.2091
标准离差 0.0156 0.0162     0.0272     0.0121
动物数 5 5     6     6
      t     d.f.     p
对照组对Sham组     2.2590     8     ＜0.05
对照组对A组     3.3549     9     ＜0.025
对照组对B组     1.9209     9     N.S.
Sham组对A组     1.4571     9     N.S.
Sham组对B组     1.1778     9     N.S.
A组对B组     2.4926     10     ＜0.05
  表15：给行卵巢切除术的大鼠注射SEQ ID NO：7多肽100天后于股骨远端测得的骨矿物质含量组间算术平均值的比较
    对照组  A-卵巢切除的(无多肽)  B-卵巢切除的(有多肽)
平均值(g)     0.1597     0.1396     0.1424
标准离差     0.0185     0.0068     0.0132
动物数     14     14     11
    t     d.f.     p
对照组对A组     3.8255     26     ＜0.001
对照组对B组     2.6160     23     ＜0.025
A组对B组     0.6984     23     N.S.
表16：给行卵巢切除术的大鼠注射SEQ ID NO：7多肽56天后于股骨远端测得的骨矿物质含量组间算术平均值的比较
 对照   Sham  A-切除卵巢的(无多肽)  B-切除卵巢的(有多肽)
平均值(g) 0.1826  0.1540     0.1304     0.1347
标准离差 0.0122  0.0118     0.0094     0.0039
动物数 5  5     6     6
      t     d.f.     p
对照组对Sham组     3.7549     8     ＜0.025
对照组对A组     8.0183     9     ＜0.001
对照组对B组     9.1462     9     ＜0.001
Sham组对A组     3.7046     9     ＜0.005
Sham组对B组     3.8149     9     ＜0.005
A组对B组     1.0274     10     N.S.
  表17：给行卵巢切除术的大鼠注射SEQ ID NO：7多肽100天后于股骨颈测得的骨矿物质含量组间算术平均值的比较
    对照组  A-卵巢切除的(无多肽)  B-卵巢切除的(有多肽)
平均值(g)     0.0334     0.0303     0.0351
标准离差     0.0049     0.0040     0.0031
动物数     14     14     10
    t     d.f.     p
对照组对A组     1.3978     26     N.S.
对照组对B组     1.0326     21     N.S.
A组对B组     2.2590     21     p＜0.005
表18：给行卵巢切除术的大鼠注射SEQ ID NO：7多肽56天后于股骨颈测得的骨矿物质含量组间算术平均值的比较
对照组  Sham  A-切除卵巢的(无多肽)  B-卵巢切除的(有多肽)
平均值(g) 0.0277  0.0255     0.0202     0.0274
标准离差 0.0020  0.0038     0.0028     0.0013
动物数 5  5     6     6
      t     d.f.     p
对照组对Sham组     1.1534     8     N.S.
对照组对A组     4.9809     9     ＜0.001
对照组对B组     0.3342     9     N.S.
Sham组对A组     2.6620     9     ＜0.05
Sham组对B组     1.1462     9     N.S.
A组对B组     5.6713     10     ＜0.005
从表中所列数据可知，股骨颈和股骨骨干的活体骨钙含量明显增加，这表明所用肽的作用具有部位特异性，可能对处于机械张力之下的骨骼部位作用更大。36个氨基酸的人多肽其它片段的实验
合成正常多肽(SEQ ID NO：1)的多肽片段，并以C-末端片段测试骨刺激活性。
对照组：0.1％乙酸
H组：SEQ ID NO：1Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys LysAla Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln Pro
I组：SEQ ID NO：16Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile
J组：SEQ ID NO：15Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu ThrLeu Met Val Leu Asp Gln Asn
K组：SEQ ID NO：14Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp
L组：SEQ ID NO：10、11、12和13(混合物)：
Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln
Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn
Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln
Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp
根据如前所述的方法检测右侧股骨较低的干骺端来确定骨矿物质添附率。所得的结果如表9和图12所示。从中可见，相对于对照组，如SEQID NO：10、11、12或13所示的无N-末端的变异体都不具有增加骨添附率的作用。
  表19：注射了非N末端变异体的大鼠的骨添附率组算术平均值一览表
  H组   I组   J组   K组   L组    对照组
平均值(μm/天)   1.50   1.02   0.92   0.92   0.98     1.02
标准离差   0.09   0.12   0.09   0.04   0.09     0.06
动物数     6     6     6     6     6      6
有关被测试的特定多肽序列所得的结果如图13所示。
从中可见，SEQ ID NO：9所示多肽具有SEQ ID NO：1所示多肽所含36个氨基酸序列的10个氨基酸序列，即与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有少至28％保守性的多肽能够维持在体骨刺激活性。也可以预料，如SEQ ID NO：9所示多肽的类似物可观察到骨刺激作用。甚至发现在SEQ ID NO：9中存在的一个或多个氨基酸缺失时，所述多肽(或类似物)的活性仍可维持。
本领域的技术人员应该理解，提供相似活性的多肽一般与具有相同或相似三维结构部分相关，所述三维结构部分与其它分子(例如以某种途径与多肽结合的受体)发生相互作用。这就是为什么有可能存在几种彼此相关的多肽都显示类似的骨刺激活性的原因。
本发明提供了一种对哺乳动物具有在体骨刺激活性并能增加哺乳动物骨钙密度或含量的合成多肽或其类似物，所述多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少大约19％的保守性，并且从中缺失至少1个氨基酸。在本文的描述中，如果肽含有能够与SEQ IDNO：1的序列匹配以致原始序列的至少30％的氨基酸残基存在其中，就认为该肽与SEQ ID NO：1所述氨基酸序列具有30％的保守性，允许在匹配的序列间存在同源性取代或有限数目的插入或缺失。在匹配的序列中，具有SEQ ID NO：1中36个氨基酸残基的7个的氨基酸序列将有19％的保守性。在匹配的序列中，具有SEQ ID NO：1中36个氨基酸残基的8个的氨基酸序列将有22％的保守性。在匹配的序列中，具有SEQ ID NO：1中36个氨基酸残基的9个的氨基酸序列将有25％的保守性。在匹配的序列中，具有SEQ ID NO：1中36个氨基酸残基的10个的氨基酸序列将有28％的保守性。
如果以略有不同的方式进行描述的话，本发明的多肽是对应于SEQID NO：1氨基酸序列的多肽或功能等同类似物，其中所述多肽(a)缺失了SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3N-末端的1-4个氨基酸，或(b)缺失了SEQ ID NO：1C-末端的1-22个氨基酸，或者同时具有(a)和(b)。有可能发现可从SEQ ID NO：1的N-末端缺失5或6或更多个氨基酸，或可从其C-末端缺失多于22个的氨基酸。
从另一方面讲，本发明的多肽可以描述为一种具有哺乳动物骨刺激活性的多肽、其类似物以及各多肽或类似物的共轭物，所述多肽具有与SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9一致的氨基酸序列；在所述类似物中，其序列中的氨基酸可以被取代、缺失或增加，只要源于所述序列三维结构的哺乳动物骨刺激活性能够保留；在所述的共轭物中，如果所述多肽序列与SEQID NO：1一致，则至少有一个氨基酸缺失。
本发明的多肽将包括分子量为约1000-4000的这类序列。然而应该理解，所述序列可以借助形成共轭物或其它技术而增加，这将使得整个化合物的分子量超过4000。
应该理解但无意进行限定，在“保留”提供本文所公开多肽的骨刺激活性的三维结构的同时，有可能存在多种氨基酸取代。因此可以预料，例如非极性脂肪中性氨基酸甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸和异亮氨酸之间的互换都有可能。同样，极性脂肪中性氨基酸丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸和天冬酰胺和谷氨酰胺之间的取代都有可能发生。这就是说，通过二硫键将肽连接在一起似乎具有一定的重要性，所以，稀少的半胱氨酸残基有可能保持完整，并且其它能够形成二硫键的氨基酸在所述序列的其它位置不被取代，尽管如上所述成功进行的cys→ala取代是有效的(SEQ ID NO：3)。带电的酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸之间有可能进行取代，如同带电的碱性氨基酸赖氨酸和精氨酸之间有可能进行取代一样。在包括苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸的芳香族氨基酸之间也可能进行取代。取代可以单独或联合进行。这类取代和互换是本领域技术人员熟知的。例如，美国专利US 5,487,983和US 5,512,548描述了其它可能的取代，包括涉及不由所述基因编码的氨基酸的取代。其它的取代也是很有可能的。
由本文所描述的结果可以看到所述N-末端部分重要性的证据。具有SEQ ID NO：1的5-14氨基酸的多肽(SEQ ID NO：9)显示出骨刺激活性，而具有氨基酸10-32(SEQ ID NO：14)或氨基酸20-35(SEQ ID NO：10)的序列则没有骨刺激活性。SEQ IDNO：9所述多肽的任一末端有可能缺失更多的氨基酸而维持提供多肽骨刺激活性的亚序列的三维构象。内部缺失尽管在一定程度上有可能，但非常少见。特别值得注意的是具有SEQ ID NO：16所述序列的多肽，它与SEQ ID NO：9所述氨基酸序列只有一个氨基酸残基不同。前者没有显示活性，而后者确实具有骨刺激活性。利用本文所公开的实验方法有可能区分能够和不能刺激骨生长以及能够和不能增加骨钙含量的序列。
还有可能在所述序列的末端进行较少的氨基酸增加，而羧基末端和氨基末端的对称性或近乎对称性增加也有可能。内部的增加尽管在有限的程度上可能发生，但应很少发生。
在上述列举的序列修饰作用中，末端增加、缺失或取代很可能是极有用的，因为这类修饰能够发挥多种功能：作为放射免疫测定中所用的鉴定基团；或例如作为一个连接基团。
与所述正常肽(SEQ ID NO：1)一样，含有半光氨酸的活性亚序列(即SEQ ID NO：4、5、6、7、8或9)有可能自发地二聚体化，并以二聚体形式存在。
如本领域所知道的，通过蛋白质的嵌合形式可以得到进一步的优点。编码完整蛋白质或蛋白质一部分的DNA序列因此能够与编码E.coliβ-半乳糖苷酶的C-末端部分的序列连接，以产生例如融合蛋白。1994年2月22日公开的美国专利US5,288,630描述了用于人类呼吸合胞病毒糖蛋白F和G的表达系统，该文献引入本文作为参考。
本发明的多肽通常是合成的，无论是利用常规的“化学”技术或遗传工程技术制备的。在本文中，如此产生的多肽被认为是基本纯的，或是生物化学意义上纯的，它通常不含在自然状态直接存在(例如在动物的血清中)的多肽或蛋白质。编码正常多肽活性部分的核酸(DNA)序列如下：
SEQ ID NO：17(对应于SEQ ID NO：4)：GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AACACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC
SEQ ID NO：18(对应于SEQ ID NO：5)：GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AACACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA
SEQ ID NO：19(对应于SEQ ID NO：6)：GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA CCG AACACC TTG
SEQ ID NO：20(对应于SEQ ID NO：7)：GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT
SEQ ID NO：21(对应于SEQ ID NO：8)：GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA
SEQ ID NO：22(对应于SEQ ID NO：9)：CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA
因此，如前所述，特别是如国际专利申请PCT/CA 94/00144所述，可以构建掺入了所述DNA序列的载体用于合成多肽编码SEQ IDNO：1所述多肽的DNA序列在本申请说明书序列表的SEQ IDNO：23中给出。
本发明的DNA片段可以是含有编码本发明多肽的核苷酸序列的任何片段。除了上述任一编码序列外，所述DNA片段可以在5′末端具有合适的启动子和一段SD序列(或合适的核糖体结合位点)，并且如果需要的话，还包括在5′末端含有翻译起始密码子的核苷酸序列和3′末端含有终止密码子的核苷酸序列。
如本领域技术人员所知，遗传密码是具有简并性的。基因中的核苷酸因此可以被与特定密码子的简并性(三联体密码)一致的另一核苷酸取代，而不会改变由所述基因编码的多肽的氨基酸序列。本发明的DNA片段可以衍生于上述序列(和对应于被取代多肽的DNA片段或其它没有详述的类似物)，而且这类取代可以以这样一种方式进行：在利用遗传工程技术生产本发明的多肽时，所得密码子显示出在特定宿主细胞中有较高的利用频率。
应该理解，可以生产针对本文所公开任一多肽的抗体，正如有关正常多肽(SEQ ID NO：1)所述。
本发明的多肽可以制备成适于需要进行相应治疗患者的药物组合物，所述患者例如患有骨形成减少。预防性治疗是另一种可能性。注射似乎是作为常规施用途径的可能选择。药物制剂可以包括适当的载体或介质，如无菌水、生理盐水、植物油、非毒性有机溶剂等通常用于药剂中的物质。填充剂、着色剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂等也可使用。其它可能的施药途径包括直肠、局部胃肠道、眼睛、鼻子、舌下、口腔静脉内等。药物剂型可以是分散剂、溶液、悬浮液、片剂、锭剂等，并可采用缓释或定时释放形式或手段。
所用剂量有可能根据患者的类型、年龄、性别等和所治疗疾病的性质及严重程度的不同而变化。总之，治疗骨形成减少相关性疾病的剂量范围为大约.001pmol-100nmol/kg体重。
                 序列表(1)总信息：(i)申请人：
(A)姓名：OSTEOPHARM LIMITED
(B)街道：2395 Speakman Drive
(C)城市：Mississauga
(D)省：安大略
(E)国家：加拿大
(F)邮编：L5K IB3
(A)姓名：TAM，Cherk Shing
(B)街道：1072 Rectory Lane
(C)城市：Dakville
(D)省：安大略
(E)国家：加拿大
(F)邮编：L 6M 2B7(ii)发明名称：骨刺激因子(iii)序列数：22(iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：Diskette，3 1/2英寸，14Mb容量
(B)计算机：COMPAQ，IBM PC兼容机
(C)操作系统：MS-DOS 5.1
(D)软件：WORD PERFECT(v)本申请数据：
申请号：(vi)在先申请数据：(A)申请号：US 08/487,074(B)申请日：1993年6月7日(2)SEQ ID NO：1信息(i)序列特征：
(A)长度：36个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线形(xi)序列描述：SEQ ID NO：1Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys1                5                 10                  15Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp
         20              25                      30Gln Asn Gln Pro
    35(2)SEQ ID NO：2信息(i)序列特征：
(A)长度：36个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线形(ix)特征
(A)名称/关键词：修饰位点
(B)位置：…2
(D)其它信息：/注＝“Xaa是N-乙酰基甘氨酸”(xi)序列描述：SEQ ID NO：2
Xaa Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys
 1               5                  10                  15
Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp
            20              25                      30
Gln Asn Gln Pro
        35(2)SEQ ID NO：3信息(i)序列特征：
(A)长度：36个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线形(xi)序列描述：SEQ ID NO：3
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Ala Lys Ile Lys
 1               5                  10                  15
Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp
            20                  25                  30
Gln Asn Gln Pro
        35(2)SEQ ID NO：4信息(i)序列特征：
(A)长度：30个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线形(xi)序列描述：SEQ ID NO：4Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys1               5                  10                  15Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val
        20                  25                  30(2)SEQ ID NO：5信息(i)序列特征：
(A)长度：25个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线形(xi)序列描述：SEQ ID NO：5
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys
 1               5                  10                  15
Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala
            20                  25(2)SEQ ID NO：6信息(i)序列特征：
(A)长度：20个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线形(XI)序列描述：SEQ ID NO：6
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys
 1               5                  10                  15
Pro Asn Thr Leu
             20(2)SEQ ID NO：7信息(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氯基酸
(D)拓扑学：线形(xi)序列描述：SEQ ID NO：7
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile
  1               5                  10                  15(2)SEQ ID NO：8信息(i)序列特征：
(A)长度：14个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线形(xi)序列描述：SEQ ID NO：8Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys1               5                  10(2)SEQ ID NO：9信息(i)序列特征：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线形(xi)序列描述：SEQ ID NO：9Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys1               5                  10(2)SEQ ID NO：10信息
(i)序列特征：
  (A)长度：16个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn Gln1               5                  10                  15(2)SEQ ID NO：11信息
(i)序列特征：
  (A)长度：15个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  D)拓扑学：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn1               5                  10                  15(2)SEQ ID NO：12信息
(i)序列特征：
  (A)长度：14个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线形(xi)序列描述：SEQ ID NO：12
Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln
 1               5                  10(2)SEQ ID NO：13信息
(i)序列特征：
  (A)长度：13个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  D)拓扑学：线形(xi)序列描述：SEQ ID NO：13
Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp
 1               5                  10(2)SEQ ID NO：14信息
(i)序列特征：
  (A)长度：23个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14
Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala
 1               5                  10                  15
Glu Thr Leu Met Val Leu Asp
            20(2)SEQ ID NO：15信息
(i)序列特征：
  (A)长度：30个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线形(xi)序列描述：SEQ ID NO：15
Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu
 1               5                  10                  15
His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gln Asn
            20                  25                  30(2)SEQ ID NO：16信息
(i)序列特征：
  (A)长度：11个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16
Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile
 1               5                  10(2)SEQ ID NO：17信息
(i)序列特征：
  (A)长度：90个碱基对
  (B)类型：核苷酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑学：线形(xi)序列描述：SEQ ID NO：17
GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA    48
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys
 1               5                  10                  15
CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC            90
Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val
            20                  25                  30(2)SEQ ID NO：18信息
(i)序列特征：
  (A)长度：75个碱基对
  (B)类型：核苷酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑学：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18
GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA    48
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys
 1               5                  10                  15
CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA                                75
Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala
            20                  25(2)SEQ ID NO：19信息
(i)序列特征：
  (A)长度：60个碱基对
  (B)类型：核苷酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑学：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19
GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA    48
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys
 1               5                  10                  15
CCG AAC ACC TTG                                                    60
Pro Asn Thr Leu
             20
(2)SEQ ID NO：20信息
(i)序列特征：
  (A)长度：45个碱基对
  (B)类型：核苷酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑学：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20
GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT        45
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile
 1               5                  10                  15(2)SEQ ID NO：21信息
(i)序列特征：
  (A)长度：42个碱基对
  (B)类型：核苷酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑学：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21
GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA            42
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys
 1               5                  10(2)SEQ ID NO：22信息
(i)序列特征：
  (A)长度：30个碱基对
  (B)类型：核苷酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑学：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22
CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA                            30
Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys
 1               5                  10(2)SEQ ID NO：23信息
(i)序列特征：
  (A)长度：个碱基对
  (B)类型：核苷酸
  (C)链数：单链
  (D)拓扑学：线形
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23
GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA    48
Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys
 1               5                  10                  15
CCG AAC ACC TTG CAT AAA AAA GCT GCA GAG ACT TTA ATG GTC AAA ATT    96
Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Lys Ile
            20                  25                  30
AAA CCG AAC ACC                                                    108
Lys Pro Asn Thr
        35

Claims (61)

1.一种含有对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽或功能等同类似物，其中所述多肽具有(a)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3 N-末端的1-约4个氨基酸的缺失，或(b)SEQID NO：1或SEQ ID NO：3C-末端的1-约22个氨基酸的缺失，或者同时具有(a)和(b)。
2.一种含有对应于SEQ ID NO：4氨基酸序列的多肽或功能等同类似物，其中所述多肽具有(a)SEQ ID NO：4N-末端的多至约4个氨基酸的缺失，或(b)SEQ ID NO：4C-末端的多至约16个氨基酸的缺失，或者同时具有(a)和(b)。
3.一种含有对应于SEQ ID NO：5氨基酸序列的多肽或功能等同类似物，其中所述多肽具有(a)SEQ ID NO：5N-末端的多至约4个氨基酸的缺失，或(b)SEQ ID NO：5C-末端的多至约11个氨基酸的缺失，或者同时具有(a)和(b)。
4.一种含有对应于SEQ ID NO：6氨基酸序列的多肽或功能等同类似物，其中所述多肽具有(a)SEQ ID NO：6N-末端的多至约4个氨基酸的缺失，或(b)SEQ ID NO：6C-末端的多至约5个氨基酸的缺失，或者同时具有(a)和(b)。
5.一种含有对应于SEQ ID NO：7氨基酸序列的多肽或功能等同类似物，其中所述多肽具有(a)SEQ ID NO：7N-末端的多至约4个氨基酸的缺失，或(b)SEQ ID NO：4C-末端的多至约1个氨基酸的缺失，或者同时具有(a)和(b)。
6.一种含有对应于SEQ ID NO：8氨基酸序列的多肽或功能等同类似物，其中所述多肽缺失了SEQ ID NO：8N-末端的多至约4个氨基酸。
7.一种含有对应于SEQ ID NO：9氨基酸序列的多肽或其功能等同类似物。
8.根据权利要求1-7任一权利要求所述的多肽，其中的多肽是合成的，并且该氨基酸序列的分子量在约1000-4000的范围内。
9.含有足以复制第二多肽的氨基酸序列的第一多肽或其功能等同类似物，所述第二多肽具有对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且(a)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3N-末端的1-约4个氨基酸缺失，或(b)SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3C-末端的1-约22个氨基酸缺失，或者同时具有(a)和(b)，使得第一多肽由在严谨条件下能够与编码第二多肽的DNA杂交的DNA编码。
10.一种嵌合性骨刺激因子，含有权利要求1-7任一权利要求或9所述的氨基酸序列。
11.用于预防和治疗骨减少相关性疾病的药物，含有权利要求1-7任一权利要求或9所述的多肽作为活性成分。
12.一种促进骨生长的药物组合物，含有治疗有效量的权利要求1-7任一权利要求或9所述的多肽。
13.一种促进哺乳动物骨生长的方法，包括施用治疗有效量的多肽，所述多肽具有权利要求1-7任一权利要求或9所定义的多肽氨基酸序列。
14.权利要求1-7任一权利要求或9所述的多肽用于治疗骨质疏松症。
15.权利要求1-7任一权利要求或9所述的多肽用于促进哺乳动物的骨生长。
16.具有权利要求1-7任一权利要求或9所述序列的多肽用于制备促进骨生长或治疗骨质疏松症的药物。
17.一种用于检测权利要求1-7任一权利要求或9所述多肽的诊断试剂盒，含有抗所述多肽并与报告系统相连的抗体，其中的报告系统在预定量的所述多肽与抗体结合在一起时产生可检测的反应。
18.一种能够结合多肽的抗体，所述多肽具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQID NO：9一致的氨基酸序列，所述抗体是利用所述多肽中的一种来合成的。
19.一种能够结合权利要求1-7任一权利要求或9所定义多肽的抗体，是利用所述多肽合成的。
20.一种编码权利要求1-7任一权利要求或9的多肽表达的分离的DNA片段和由于遗传密码的简并性而不同于所述片段的DNA。
21.一种含有编码权利要求1-7任一权利要求或9的多肽表达的DNA序列的载体。
22.一种制备权利要求1-7任一权利要求或9的多肽的方法，包括：
a)制备含有编码所述多肽的核苷酸序列的DNA片段；
b)将所述DNA片段掺入表达载体中，以获得含有所述DNA片段并能够进行复制的重组DNA片段；
c)用所述的重组DNA片段转化宿主细胞，分离能够表达所述多肽的转化体；以及
d)培养所述转化体，使该转化体产生所述多肽，再从所得培养混合物中回收所述的多肽。
23.一种对哺乳动物具有在体骨刺激活性并能增加骨矿物质含量的合成多肽或功能等同类似物，所述多肽的氨基酸序列相对于SEQ IDNO：1的氨基酸序列具有至少约19％的保守性，并具有至少一个氨基酸的缺失。
24.一种对哺乳动物具有在体骨刺激活性并能增加骨矿物质含量的合成多肽，所述多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少约22％的保守性，并具有至少一个氨基酸的缺失。
25.一种对哺乳动物具有在体骨刺激活性并能增加骨矿物质含量的合成多肽，所述多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少约25％的保守性，并具有至少一个氨基酸的缺失。
26.一种对哺乳动物具有在体骨刺激活性并能增加骨矿物质含量的合成多肽，所述多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少大28％的保守性，并具有至少一个氨基酸的缺失。
27.权利要求23、24、25或26的多肽，从所述序列中缺失至少6个氨基酸。
28.权利要求23、24、25或26的多肽，从所述序列中缺失至少11个氨基酸。
29.权利要求23、24、25或26的多肽，从所述序列中缺失至少16个氨基酸。
30.权利要求23、24、25或26的多肽，从所述序列中缺失至少21个氨基酸。
31.权利要求23、24、25或26的多肽，从所述序列中缺失至少26个氨基酸。
32.权利要求23、24、25或26的多肽，其分子量在约1000-4000的范围内。
33.含有足以复制第二多肽的氨基酸序列的第一多肽，所述第二多肽具有权利要求23、24、25或26的氨基酸序列，使得第一多肽由在严谨条件下能够与编码第二多肽的DNA杂交的DNA编码。
34.一种嵌合性骨刺激因子，含有权利要求23、24、25或26的氨基酸序列。
35.用于预防和治疗骨减少相关性疾病的药物，含有权利要求23、24、25或26所述的多肽。
36.一种促进骨生长的药物组合物，含有治疗有效量的权利要求23、24、25或26所述的多肽。
37.一种促进哺乳动物骨生长的方法，包括施用治疗有效量的多肽，所述多肽具有权利要求23、24、25或26所定义多肽的氨基酸序列。
38.权利要求23、24、25或26的多肽用于治疗骨质疏松症。
39.权利要求23、24、25或26的多肽用于促进哺乳动物的骨生长。
40.具有根据权利要求23、24、25或26的序列的多肽用于制备促进骨生长或治疗骨质疏松症的药物。
41.一种用于检测权利要求23、24、25或26的多肽的诊断试剂盒，含有抗所述多肽并与报告系统相连的抗体，其中的报告系统在预定量的所述多肽与抗体结合在一起时产生可检测的反应。
42.一种能够结合权利要求23、24、25或26所定义多肽的抗体，是利用所述多肽合成的。
43.一种编码权利要求23、24、25或26的多肽表达的分离的DNA片段和由于遗传密码的简并性而不同于所述片段的DNA。
44.一种含有编码权利要求23、24、25或26的多肽表达的DNA序列的载体。
45.一种制备权利要求23、24、25或26多肽的方法，包括：
a)制备含有编码所述多肽的核苷酸序列的DNA片段；
b)将所述DNA片段掺入表达载体中，以获得含有所述DNA片段并能够进行复制的重组DNA片段；
c)用所述的重组DNA片段转化宿主细胞，分离能够表达所述多肽的转化体；以及
d)培养所述的转化体，使之产生所述的多肽，再从所得培养混合物中回收所述的多肽。
46.一种具有哺乳动物骨刺激活性的多肽、其类似物以及各多肽或类似物的轭合物，所述多肽具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9一致的氨基酸序列；所述类似物序列中的氨基酸可以被取代、缺失或增加，只要源于所述序列三维结构的哺乳动物骨刺激活性能够保留；在所述的轭合物中，如果所述多肽序列与SEQ ID NO：1一致，则至少有一个氨基酸从该序列中缺失。
47.权利要求46的任一多肽，所述多肽基本上是纯的，并且氨基酸序列的分子量为约1000-4000。
48.含有足以复制第二多肽的氨基酸序列的第一多肽或其功能等同类似物，所述第二多肽具有对应于权利要求45或46的氨基酸序列，使得第一多肽由在严谨条件下能够与编码第二多肽的DNA杂交的DNA编码。
49.一种嵌合性骨刺激因子，含有权利要求46或47的氨基酸序列。
50.用于预防和治疗骨减少相关性疾病的药物，含有权利要求46或47所述的多肽作为活性成分。
51.一种促进骨生长的药物组合物，含有治疗有效量的权利要求46或47所述的多肽。
52.一种促进哺乳动物骨生长的方法，包括施用治疗有效量的多肽，所述多肽具有权利要求46或47所定义多肽的氨基酸序列。
53.权利要求46或47的多肽用于治疗骨质疏松症。
54.权利要求46或47的多肽用于促进哺乳动物的骨生长。
55.具有根据权利要求46或47的序列的多肽用于制备促进骨生长或治疗骨质疏松症的药物。
56.一种用于检测权利要求46或47的多肽的诊断试剂盒，含有抗所述多肽并与报告系统相连的抗体，其中的报告系统在预定量的所述多肽与抗体结合在一起时产生可检测的反应。
57.一种能够结合权利要求46或47所定义多肽的抗体，是利用所述多肽合成的。
58.一种编码权利要求46或47的多肽表达的分离的DNA片段和由于遗传密码的简并性而不同于所述片段的DNA。
59.一种含有编码权利要求46或47所述多肽表达的DNA序列的载体。
60.一种制备权利要求46或47所述多肽的方法，包括：
a)制备含有编码所述多肽的核苷酸序列的DNA片段；
b)将所述DNA片段掺入表达载体中，以获得含有所述DNA片段并能够进行复制的重组DNA片段；
c)用所述的重组DNA片段转化宿主细胞，分离能够表达所述多肽的转化体；以及
d)培养所述的转化体，使该转化体产生所述多肽，再从所得培养混合物中回收所述的多肽。
37.一种编码权利要求1-7中任一权利要求或权利要求9、23、24、25、26、46或47所述氨基酸序列的分离的DNA序列或其类似物，其中所述氨基酸序列中的氨基酸可以被取代、缺失或增加，只要能够在含有所述氨基酸序列的多肽中保留源于所述序列三维构象的哺乳动物骨刺激活性；能够与所述DNA杂交并且编码具有哺乳动物骨刺激活性多肽的氨基酸序列的序列；以及由于遗传密码的简并性而不同于该序列的DNA。
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