CZ389397A3 - Stimulační faktor kostí - Google Patents

Description

Stimulační faktor kostí

Oblast techniky

Předložený vynález se týká polypetidů, které stimulují růst kostí.

Dosavadní stav techniky

V posledních letech pokročilo porozumění problémům, které souvisejí s růstem kostí a pevností kostí. Souhrn je uveden v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/CA 94/00144, publikované jako mezinárodní spis č. WO 94/20615 15. září 1994.

V patentové literatuře jsou uvedeny příklady různých přístupů k léčení onemocnění, která zahrnují snížení hmotnosti kostí, a doprovázejících poruch. Například USA patent číslo

877 864, vydaný 31. října 1989, popisuje lidské a hovězí faktory indukující kost. Mezinárodní patentová přihláška, publikovaná 17. září 1992 pod číslem 92/15615, popisuje protein z vepřové slinivky břišní, který působí tak, že snižuje hladiny sérového vápníku při léčení poruch kosti, které způsobují zvýšení hladin vápníku v séru. Evropská patentová přihláška číslo 504 938, publikovaná 23. září 1992, popisuje použití di- nebo tri-peptidů, které inhibují cysteinovou proteázu při léčení onemocnění kostí. Mezinárodní patentová přihláška, publikovaná

3. září 1992 pod č. 92/14481, popisuje prostředek pro indukování růstu kostí, prostředek obsahující aktivin a kostní morfogenní protein. Evropská patentová přihláška č. 499 242, publikovaná 19. srpna 1992, popisuje použití prostředků s růstovým faktorem buněk, o nichž se předpokládá, že jsou užitečné při onemocněních kostí zahrnujících snížení hmotnosti kostí, protože způsobují proliferaci osteoblastů. Mezinárodní patentová přihláška, publikovaná 25. června 1992 pod číslem 92/10515, popisuje léčivou látku, která obsahuje N-koncový fragment 1 až 37 lidského hormonu příštitného tělíska (parathyroidního hormonu, PTH). Evropská patentová přihláška č. 451 867, publikovaná 16. září 1991, popisuje peptidové antagonisty parathyroidního hormonu pro léčení dysbolismu souvisejícího s vápníkem nebo kyselinou fosforečnou, jako je osteoporosa. USA patent č.

461 034 Yissum Research Development Company z Hebrejské university v Jeruzalému, vydaný 24. října 1995, popisuje polypeptidy osteogenního růstu identifikované z regenerující se kostní dřeně.

Podstata vynálezu

Relativně krátký poločas PTH v krevním séru a positivní účinek občasné PTH injekce na objem kosuí vedl autora tohoto vynálezu k hypotéze, že PTH může v některých směrech vést k indukci sekundárního faktoru v oběhovém systému. Byla tedy zkoumána přítomnost takového druhého faktoru v krevním séru krys a lidí.

Bylo zjištěno, že je možné z krysího krevního séra isolovat polypeptidovou látku, která při podávání krysám neschopných produkovat PTH (krysy s odňatými příštitnými tělísky) produkuje pozorované zvýšení rychlosti přírůstku minerálů kostí. Byla syntetizována sonda nukleové kyseliny, na bázi aminokyselinové sekvence krysího peptidu, a tato sonda byla použita k prohledávání plodové knihovny lidské jaterní cDNA, aby se isolovala sekvence lidské nukleové kyseliny kódující lidský polypeptid pro přírůstek kostí. Byl tedy chemicky syntetizován polypeptid odvozený od sekvence nukleové kyseliny podle odvozené sekvence Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gin Asn Gin Pro (sekv. id. č. 1). Bylo pozorováno, že rychlost přírůstku kostí se u neporušených krys zvyšuje v závislosti na dávce po podání této chemicky syntetizované sloučeniny. Bylo pozorováno, že u krys nedochází ke sníženému růstu kostí, normálně pozorovanému u krys s odstraněnými vaječníky, po podávání tohoto polypeptidu po dobu čtyř týdnů počínaje dva týdny po odstranění vaječníků, Bylo zjištěno, že hustota kostního vápníku se u krys s odstraněnými vaječníky udržuje po podávání tohoto polypeptidu po dobu osmi týdnů počínaje osmým týdnem po odstranění vaječníků.

Předpokládá se, že je možné, že aktivní polypeptid je dimerem předchozí sekvence. Existuje důkaz významné tvorby dimeru, pravděpodobně díky disulfidovému můstku mezi dvěma polypeptidy, které mají uvedenou sekvenci.

Byla tedy syntetizována modifikovaná forma polypeptidu ob··· · · · ···· ·· · · · · · · ···· · ······ · · · ···· ·· ·· ···· ·· ·· sáhující cys-ala substituci: Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Ala Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gin Asn Gin Pro (sekv. id. č.

3). U módifkovaného polypeptidu byly nalezeny některé účinky normálního” polypeptidu (sekv. id. č. 1) stimulující kost.

V jiných pokusech bylo zjištěno, že rychlost přírůstku minerálů kostí u krys, kterým byly podávány králičí protilátky na normální polypeptid (sekv. id. č. 1), je potlačena. Bylo zjištěno, že potlačení je zesíleno u krys, kterým se podává jak normální polypeptid tak protilátky na tento polypeptid.

Dále byly syntetizovány některé polypeptidové fragmenty normálního polypeptidu (sekv. id. č. 1) au každého bylo zjištěno, že má stimulační účinky na kosti:

sekv. id. č. 4:

Gly Ile Gly Lys Arg

Pro Asn Thr Leu His sekv. id. č. 5:

Gly Ile Gly Lys Arg

Pro Asn Thr Leu His sekv. id. č. 6:

Gly Ile Gly Lys Arg

Pro Asn Thr Leu,

Thr Asn Glu His Thr

Lys Lys Ala Ala Glu

Thr Asn Glu His Thr

Lys Lys Ala Ala,

Thr Asn Glu His Thr

Ala Asp Cys Lys Ile Lys

Thr Leu Met Val,

Ala Asp Cys Lys Ile Lys

Ala Asp Cys Lys Ile Lys sekv. id. č. 7:

Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile, sekv. id. č. 8:

Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys a sekv. id. č. 9:

•x

Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys.

Dále bylo zjištěno, že polypeptid identifikovaný jako sekv.

id. č. 7 zvyšuje obsah vápníku kostí u krys s odstraněnými va4

ječníky po dobu osmi nebo dvanácti týdnů.

Byly syntetizovány další polypeptidové fragmenty normálního polypeptidů (sekv. id. č. 1) a bylo zjištěno, že jim chybí stimulační účinek na kosti, který byl nalezen u normálního polypeptidu:

sekv. id. č. 10:

Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gin Asn Gin, sekv. id. č. 11:

Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gin Asn, sekv. id. č. 12:

Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gin, sekv. id. č. 13:

Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp, sekv. id. č. 14:

Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp, sekv. id. č. 15:

Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gin Asn a sekv. id. č. 16:

Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile.

Předložený vynález tedy zahrnuje polypeptid s aminokyselinovou sekvencí odpovídající sekv. id. č. 1 s a) od jedné do asi aminokyselin deletovaných z N-konce sekv. id. č. 1, b) jednou až asi 22 aminokyselinami deletovanými z C-konce sekv. id. č.

nebo jak ad a) tak ad b), nebo funkčně ekvivalentní homolog.

Tento vynález tedy zahrnuje polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci odpovídající sekv. id. č. 3 s a) od jedné do asi • · • · · ·· · · · · · • · ··· 9 9 · ···· · ······ ··· ···· ·· ·· ···· ·· ·· aminokyselin deletovaných z N-konce sekv. id. č. 3, b) jednou až asi 22 aminokyselinami deletovanými z C-konce sekv. id. č.

nebo jak ad a) tak ad b), nebo funkčně ekvivalentní homolog. Sekvenční homologie v polypeptidech a proteinech je chápana odborníky z oblasti techniky tak, jak je to diskutováno například v Molecular Cell Biology (H. Lodish, D. Baltimore, A. Berk, S. L. Zipursky, P. Matsudaira a J. Darnell, Scientific Američan Books, New York City, třetí vydání, 1995.). Podobně tento vynález zahrnuje polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci odpovídající sekv. id. č. 4 s a) od jedné do asi 4 aminokyselin deletovaných z N-konce sekv. id. č. 4, b) až asi 16 aminokyselinami deletovanými z C-konce sekv. id. č. 4 nebo jak ad a) tak ad b), nebo funkčně ekvivalentní homolog. Tento vynález zahrnuje polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci odpovídající sekv. id. č. 5 s a) od jedné do asi 4 aminokyselin deletovaných z N-konce sekv. id. č. 5, b) až asi 11 aminokyselinami deletovanými z C-konce sekv. id. č. 5 nebo jak ad a) tak ad b), nebo funkčně ekvivalentní homolog. Tento vynález zahrnuje polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci odpovídající sekv. id. č. 6 s a) od jedné do asi 4 aminokyselin deletovaných z N-konce sekv. id. č. 6, b) až asi 5 aminokyselinami deletovanými z C-konce sekv. id. č. 6 nebo jak ad a) tak ad b), nebo funkčně ekvivalentní homolog. Tento vynález zahrnuje polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci odpovídající sekv. id. č. 7 s a) od jedné do asi 4 aminokyselin deletovaných z N-konce sekv. id. č. 7, b) až asi 1 aminokyselinu deletovanou z C-konce sekv. id. č. 4 nebo jak ad a) tak ad b), nebo funkčně ekvivalentní homolog. Tento vynález zahrnuje polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci odpovídající sekv. id. č. 8 s až asi 4 aminokyselinami deletovanými z N-konce nebo funkčně ekvivalentní homolog. Tento vynález zahrnuje také polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci odpovídající sekv. id. č. 9 nebo jeho funkčně ekvivalentní homolog.

Polypeptid podle vynálezu může být syntetický a aminokyselinová sekvence může mít molekulovou hmotnost v rozmezí od 1000 do 4000.

Tento vynález zahrnuje polypeptid, který má sekvenci ami* · ·

nokyselin dostatečně duplikativní s jinou, tj. druhý polypeptid má aminokyselinou sekvenci odpovídající sekv. id. č. 1 (nebo sekv. id. č. 3) s a) od jedné do asi 4 aminokyselin deletovaných z N-konce sekv. id. č. 1 (nebo sekv. id. č. 3), b) jednou až asi 22 aminokyselinami deletovanými z C-konce sekv. id. č. 1 (nebo sekv. id. č. 3) nebo jak ad a) tak ad b), nebo jeho funkčně ekvivalentní homolog, takže tento polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.

V jiném aspektu tento vynález znamená syntetický polypeptid, který má in vivo aktivitu stimulující kosti u savců, který zvyšuje minerální obsah (tj. vápník) v kostech savců, který má aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň asi z 19 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 1 a která má alespoň jednu aminokyselinu z této sekvence deletovánu, nebo funkčně ekvivalentní homolog.

Tento vynález zahrnuje syntetický polypeptid, který má in vivo aktivitu stimulace kostí u savců, který zvyšuje minerální obsah v kostech savců a který má aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z asi 22 % zachována při srovnání s aminokyselinovou sekvencí identifikovanou jako sekv. id. č. 1 a která má alespoň jednu aminokyselinu z této sekvence deletovánu.

Tento vynález zahrnuje syntetický polypeptid, který má in vivo aktivitu stimulace kostí u savců, který zvyšuje minerální obsah v kostech savců a který má aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z asi 25 % zachována při srovnání s aminokyselinovou sekvencí identifikovanou jako sekv. id. č. 1 a která má alespoň jednu aminokyselinu z této sekvence deletovánu.

Tento vynález zahrnuje syntetický polypeptid, který má in vivo aktivitu stimualce kostí u savců, který zvyšuje minerální obsah v kostech savců a který má aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z asi 28 % zachována při srovnání s aminokyselinovou sekvencí identifikovanou jako sekv. id. č. 1 a která má alespoň jednu aminokyselinu z této sekvence deletovánu.

Tento vynález zahrnuje kterýkoliv z předcházejících syntetických polypeptidú, který má alespoň šest aminokyselin z této polypeptidové sekvence deletováno nebo který má alespoň je······ · · · «··· «· «·«· «« «· denáct aminokyselin z této sekvence deletováno, který má alespoň šestnást aminokyselin z této sekvence deletováno, který má alespoň jednadvacet aminokyselin z této sekvence deletováno nebo který má alespoň dvacet šest aminokyselin z této sekvence deletováno.

Tento vynález zahrnuje polypeptid, který má sekvenci aminokyselin dostatečně duplikativní s jedním z předcházejících syntetických polypeptidů, takže tento polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující syntetický polypeptid.

Podle jiného aspektu tento vynález znamená polypeptid vykazující aktivitu stimulace kostí u savců, při čemž tento polypeptid má sekvenci identifikovanou jako sekv. id. č. 1, sekv. id. č. 3, sekv. id. č. 4, sekv. id. č. 5, sekv. id. č. 4, sekv. id. č. 6, sekv. id. č. 7, sekv. id. č. 8 nebo sekv. id. č. 9, jejich analogy, přičemž aminokyseliny v této sekvenci mohou být substituovány, deletovány nebo přidány, pokud aktivita stimulující kosti u savců odvozená od trojrozměrné struktury sekvence je zachována, a konjugáty každého z těchto polypeptidů nebo jejich analogy, při čemž jestliže polypeptidová sekvence je sekvence identifikovaná jako sekv. id. č. 1, pak je z ní deletována alespoň jedna aminokyselina. Tento vynález zahrnuje polypeptid, který má sekvenci aminokyselin dostatečně duplikativní s takovým polypeptidem stimulujícím růst kostí (nebo jeho funkčně ekvivalentním homologem), který je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující polypeptid stimulující růst kostí.

Podle jiného aspektu tento vynález znamená polypeptid, který zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která je z 19 až 90 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 1, nebo aminokyselinovou sekvenci, která je z 19 až 86 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 1, nebo aminokyselinovou sekvenci, která je z 19 až 69 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 1, nebo aminokyselinovou sekvenci, která je z 19 až 56 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 1, nebo aminokyselinovou sekvenci, která je z 19 až 42 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 1, nebo aminokyselinovou sekvenci, která je z 19 až 39 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 1, nebo aminokyselinovou sekvenci, která je z 19 až 28 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 1, nebo aminokyselinovou sekvenci, která je z 28 až 90 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 1, nebo aminokyselinovou sekvenci, která je z 28 až 86 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 1, nebo aminokyselinovou sekvenci, která je z 28 až 69 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 1, nebo aminokyselinovou sekvenci, která je z 28 až 56 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 1, nebo aminokyselinovou sekvenci, která je z 28 až 42 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 1, nebo aminokyselinovou sekvenci, která je z 28 až 39 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 1, nebo funkčně ekvivalentní homolog, který má aktivitu stimulující růst kostí u savce.

Polypeptid může znamenat chimerní stimulační faktor kostí, který obsahuje kterékoliv aminokyselinové sekvence popsané shora jako část tohoto vynálezu.

Tento vynález zahrnuje činidlo pro použití při prevenci a léčení onemocnění souvisejícího s redukcí kostí, které jako účinnou složku obsahuje kterýkoliv polypeptid popsaný shora jako část tohoto vynálezu, včetně chimerního polypeptidu.

Tento vynález znamená tedy také farmaceutický přípravek pro podporu růstu kostí, který obsahuje účinné množství kteréhokoliv polypeptidu popsaného shora jako část tohoot vynálezu.

Tento vynález zahrnuje způsob zvýšení růstu kostí u savce podáváním terapeuticky účinného množství polypeptidu (nebo farmaceutického přípravku obsahujícího tento polypeptid) popsaného shora jako část tohoto vynálezu.

Tento vynález zahrnuje léčení osteoporosy, podporu růstu kostí u savce nebo léčení člověka s onemocněním týkajícím se redukce kostí.

Tento vynález zahrnuje použití polypeptidu, který má sekvenci podle kteréhokoliv polypeptidu podle vynálezu, pro přípravu léčivého přípravku pro použití při podpoře růstu kostí nebo pro léčení osteoporosy atd.

Tento vynález zahrnuje také diagnostickou sestavu pro stanovení přítomnosti polypeptidu podle vynálezu, která obsahuje protilátku proti polypeptidu (nebo polypeptidům) navázanou na reporterový systém, při čemž tento reporterový systém produkuje detegovatelnou odpověď, jestliže se spolu naváže předem stanovené množství polypeptidu (nebo polypeptidů) s protilátkou.

Tento vynález zahrnuje také protilátku, která se váže na polypeptid podle vynálezu. Zvláště tento vynález zahrnuje protilátku, která se váže na tento polypeptid, při čemž tato protilátka je syntetizována použitím tohoto polypeptidu.

Tento vynález zahrnuje molekuly, jako jsou isolované nukleotidové sekvence související s polypeptidy podle vynálezu. Například tento vynález zahrnuje isolovaný DNA fragment, který kóduje expresi kteréhokoliv z polypeptidů podle vynálezu. Tomu je ovšem třeba rozumět tak, že tyto fragmenty se mohou navzájem lišit díky degeneraci genetického kódu. Tento vynález dále zahrnuje vektor, který má inkoporovánu jakoukoliv takovou DNA sekvenci.

Tento vynález zahrnuje isolovanou DNA sekvenci, která kóduje jakoukoliv aminokyselinovou sekvenci podle vynálezu, nebo její analog, při čemž aminokyseliny v této sekvenci mohou být substituovány, deletovány nebo přidány, pokud aktivita stimulující kosti u savců odvozená od trojrozměrné konformace této sekvence je v polypeptidu s touto aminokyselinovou sekvencí zachována, sekvence, které hybridizují na DNA a kódují aminokyselinovou sekvenci polypeptidu, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců, a DNA, která se odlišuje od této sekvence díky degeneraci genetického kódu.

Tento vynález tedy zahrnuje způsob výroby kteréhokoliv polypeptidu podle vynálezu, který zahrnuje: a) přípravu DNA fragmentu obsahujícího nukleotidovou sekvenci, která kóduje ······ · · · ···· ·· ·· ···· ·· ·· také polypeptid, b) zahrnutí tohoto DNA fragmentu do expresního vektoru, aby se získal rekombinantní DNA fragment, který obsahuje tento DNA fragment a je schopen podléhat replikaci, c) transformování hostitelské buňky tímto rekombinantním DNA fragmentem, aby se isoloval transformant, který může exprimovat uvedený polypeptid, d) kultivování tohoto transformantu, kterým se umožní, aby transformant produkoval polypeptid, a isolování tohoto polypeptidu z výsledné kultivační směsi.

Stručný popis výkresů

V následujícím popisu jsou odkazy na přiložené obrázky.

Obrázek 1 graficky popisuje rychlost přírůstku minerálů kostí (pm za den) u krys s tím, že implantací byl krysám s odstraněnými příštitnými tělísky podán chemicky syntetizovaný lidský N-acetyl(N-koncový)-polypeptid (sekv. id. č. 2). Čárky označující chyby znamenají ± 1 standardní odchylku (S.D.) Hodnota p byla menší než 0,001.

Obrázek 2 graficky popisuje hustotu vápníku pravé femorální kosti krys léčených po dobu čtyř týdnů. Skupině A krys byly odňaty vaječníky a byla jim denně podávána injekce chemicky syntetizovaného normálního peptidů (sekv. id. č. 1). Skupině B krys byly odňaty vaječníky a byl jim denně podáván kontrolní roztok. Skupina C krys byla podrobena předstírané operaci odnětí vaječníků a byl jim denně injekčně podáván kontrolní roztok. Skupinou D byly netknuté krysy, kterým byl denně injekčně podáván kontrolní roztok. Čárky označující chyby znamenají ± 1 standardní odchylku (S.D.).

Obrázek 3 graficky popisuje rychlost přírůstku minerálů kostí krys, jak byla stanovena označením tetracyklinem po ošetření, které je popsáno v souvislosti s obrázkem 2. Čárky označující chyby znamenají ± 1 standardní odchylku (S.D.).

Obrázek 4 graficky popisuje koncentraci vápníku femorální kosti krys, které byly ošetřovány po dobu osmi týdnů. Skupin^

A krys byly odňaty vaječníky a byl jim denně injekčně podává^ chemicky syntetizovaný normální peptid (sekv. id. č. 1) počínaje osm týdnů po operaci. Skupině B krys byly podobně odňaty vaječníky a byl jim denně podáván kontrolní roztok. Skupina C • · ······ · · · ···· ·· ···< ·· krys byla podrobena předstíranému odnětí vaječníků a byl jim denně injekčně podáván kontrolní roztok. Skupinou D byly netknuté krysy, kterým byl denně injekčně podáván kontrolní roztok. Čárky označující chyby znamenají ± 1 standardní odchylku (S.D.).

Obrázek 5 graficky popisuje rychlost přírůstku minerálů kostí neporušených krys, jak byla stanovena označením tetracyklinem. Skupina A krys byla ošetřena králičími protilátkami na chemicky syntetizovaný normální polypeptid (sekv. id. č. 1). Skupina B krys byla ošetřena stejnými protilátkami a polypeptidem samotným. Skupina C byla kontrolní skupina. Čárky označující chyby znamenají ± 1 standardní odchylku (S.D.).

Obrázek 6 ukazuje tricinový SDS elektroforetický gel lidského chemicky syntetizovaného polypeptidu (sekv. id. č. 1) a stejného polypeptidu obsahujícího cys-ala substituci (sekv. id. č. 3).

Obrázek 7 graficky ukazuje rychlost přírůstku minerálů kostí (^m za den) u krys, kterým byl injekčně podán chemicky syntetizovaný lidský polypeptid (sekv. id. č. 1), skupina A; modifikovaný chemicky syntetizovaný lidský polypeptid (sekv. id. č. 3), skupina B; a kontrola, skupina C (N = 6 pro všechny skupiny). Čárky označující chyby znamenají ± 1 standardní odchylku (S. D.).

Obrázek 8 graficky ukazuje rychlost přírůstku minerálů kostí (Mm za den) u krys, kterým byly injekčně podány N-koncové chemicky syntetizované polypeptidy: sekv. id. č. 1 (skupina A), sekv. id. č. 7 (skupina B), sekv. id. č. 6 (skupina C), sekv. id. č. 5 (skupina D) a sekv. id. č. 4 (skupina E) (N = 6 pro všechny skupiny). Čárky označující chyby znamenají ± 1 standardní odchylku (S.D.).

Obrázek 9 graficky ukazuje rychlost přírůstku minerálů kostí (Mm za den) u krys, kterým byly injekčně podány chemicky syntetizované polypeptidy: sekv. id. č. 8 (skupina G) a sekv.

id. č. 9 (skupina H).

Obrázek 10 je DEXA obraz pravého femuru krysy ukazující zobrazené plochy: A znamená proximální konec, B znamená střední část dlouhé kosti a C znamená distální konec.

• · · ······ · · · ···· ·· ·· ···· ·· ··

Obrázek 11 je DEXA obraz pravého femuru krysy ukazující zobrazenou plochu krčku.

Obrázek 12 graficky popisuje rychlost přírůstku minerálů kostí (Mm za den) u krys, který byly injekčně podány ne-N-koncové chemicky syntetizované polypeptidové fragmenty: sekv. id. č. 1 (skupina Η), sekv. id. č. 16 (skupina I), sekv. id. č. 15 (skupina J), sekv. id. č. 14 (skupina K) a sekv. id. č. 10, 11, 12 a 13 (skupina L) (N ~ 6 pro všechny skupiny). Čárky označující chyby znamenají ± 1 standardní odchylku (S.D.).

Obrázek 13 ilustruje aminokyselinové sekvence různých testovaných polypeptidů, aktivní polypeptidy jsou uvedeny nad střední čarou a sekvence, u kterých nebylo zjištěno, že stimulují růst kostí, jsou pod střední čarou.

Příklady provedení vynálezu

METODOLGIE

Byla použita aplikovatelná metodologie, jak je popsána v části Obecná metodologie mezinárodní patentové přihlášky č. PCT/CA 94/00144.

POKUSY TOXICITY ZAHRNUJÍCÍ N-KONCOVÝ ACETYLOVÝ CHEMICKY SYNTETIZOVANÝ POLYPEPTID (sekv. id. č. 2)

Miniosmotická pumpa (Alzet) byla naplněna asi 1,5 ml chemicky syntetizovaného peptidů, který má N-koncovou acetylovou skupinu (sekv. id. č. 2), v 0,1% kyselině octové tak, aby se dosáhlo vypočtené denní dávky asi 25 μg za den. Pumpy byly implantovány pod subkutánní fascii dorsální strany na levé straně thoraxu pěti krys, kterým byla o sedm dnů dříve odstraněna příštitná tělíska. Pět krys s podobně odstraněnými příštitnými tělísky dostalo podobné implanty obsahující pouze 0,1% kyselinu octovou. Jako kontroly bylo použito také pět neporušených krys.

dvacet osm dnů později bylo intramuskulární injekcí do pravého velkého hýžďového svalu každé z implantovaných krys, jak shora popsáno, podáno 0,5 ml vodného roztoku hydrochloridu tetracyklinu. Po 48 hodinách byla injekčně podána druhá injekce roztoku hydrochloridu tetracyklinu. Krysy byly usmrceny o 24 • ·· ······ ··· ···· ·· ·· ···· ·· ·· hodin později.

Rychlost přírůstku minerálů krys byla stanovena zkoumáním zkřížených sekcí dolní růstové části kosti pravého femuru každé z deseti krys, kterým byly dány implanty. Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce 1 a graficky znázorněny na obrázku 1.

Tabulka 1

Srovnání skupin aritmetických středů mezi skupinami

	testovaná skupina	kontrolní skupina
střed	1,27 Mm/d	0,67 μχη/d
S.D.	0,18 μιη/d	0,08 μιη/d
N	5	5
	t	d,f
testovaná versus
kontrolní	skupina 7,14	8

Histologické vyhodnocení vybraných tkání pěti krys každé z těchto skupin uvedených v tabulce 1 byla prováděna mikroskopicky. Nebyl nalezen žádný důkaz toxických poranění.

POKUSY ZAHRNUJÍCÍ KRYSY S ODŇATÝMI VAJEČNÍKY A NORMÁLNĚ CHEMICKY SYNTETIZOVANÝ POLYPEPTID (sekv. id. č. 1), PODÁVÁNÍ PO DOBU ČTYŘ TÝDNŮ

Odnětí vaječníků bylo provedeno u šesti samiček krys Sprague-Dawley, každé uklidněné 1 mg barbiturátu sodného i.p. Předstírané operace byly provedeny na druhé skupině šesti krys. Krysám byly dány dva týdny, aby se mohly po operacích zotavit.

Šesti krysám s odstraněnými vaječníky bylo subkutánní injekcí podáváno 100 μΐ roztoku 0,1% kyseliny octové obsahujícího

100 Mg chemicky syntetizovaného peptidu (sekv. id. č. 1) každých 24 hodin po dobu 28 dnů. 25. den byl intramuskulární injekcí každé kryse podán roztok hydrochloridu tetracyklinu tak, aby se dosáhlo množství 24 mg na kg tělesné hmotnosti, jak bylo • · ♦· · · · · · · »· ···· ···· ···© • · · · · * · · ·> · • · · · · · · · ···· · ······ · · · ···· ·· ·· ···· ·· ·· shora popsáno. 27. den byla injekčně podána druhá dávka hydrochloridu tetracyklinu a krysy byly 28. den usmrceny.

Druhá skupina šesti krys s odstraněnými vaječníky byla ošetřována podobným způsobem roztokem 0,1% kyseliny octové neobsahujícím žádný peptid po stejnou dobu 28 dnů. Třetí skupina šesti krys, z nichž každá byla podrobena předstírané operaci, byla podobně ošetřována roztokem 0,1% kyseliny octové neobsahujícím žádný peptid po stejnou dobu 28 dnů. Čtvrtá skupina šesti neporušených krys byla podobně ošetřována roztokem 0,1% kyseliny octové neobsahujícím žádný peptid po stejnou dobu 28 dnů.

Posmrtná krev byla odebrána kardiopunkcí a sérum bylo zmraženo do té doby, než bylo analyzováno. Každá krysa byla podrobena úplné pitvě. U krys ošetřených polypeptidem nebyly pozorovány žádné projevy onemocnění.

Každý z osmi femurů byl odříznut od měkké tkáně, fixován dva dny a byl proveden rentgenový snímek při 70 kV a při exposici 1 minuta, 2 minuty a 3 minuty. Nejuspokojivější výsledky poskytly tříminutové exposice. Hustoty kostí femurů u druhé skupiny krys, krys s odňatými vaječníky neošetřenými peptidem, vykazovaly viditelně nižší hustotu kostí.

Pravý femur každé krysy byl odděleně odvápněn. Dekalcifikační kapalina sestávala z 10% (obj.) kyseliny mravenčí a 5% (hmotn. k obj.) citrátu sodného při pH 3,0. Každá kost byla umístěna do 6 ml dekalcifikační kapaliny. Kapalina byla po 4 dnech nahrazena, znovu opět po dalších 4 dnech, opět po dalších 2 dnech a opět po dalších 3 dnech. Po dalších dvou dnech byla dekalcifikační kapalina odstraněna a nahrazena deionizovanou vodou a vzorek byl míchán 2 dny. Voda byla po dvou dnech vyměněna a znovu byla vyměněna po dalším dnu. Po dalším dnu byly všechny vzorky kapalin od každé krysy spojeny a všechny konečné objemy byly deionizovanou vodou upraveny na 50 ml.

Objem každého pravého femuru byl stanoven stanovením objemu vody, která byla vytlačena, když se kost ponoří do vody.

Koncentrace vápníku každého vzorku byla stanovena standardními způsoby. Byla vypočtena hustota vápníku každé kosti. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 a graficky znázorněny na obrázku 2.

Jak lze vidět, koncentrace vápníku kostí měřená u krys s odňa15 • · tými vaječníky, které byly ošetřeny peptidem (sekv. id. č. 1), byla normální, zatímco koncentrace vápníku neošetřených krys s odňatými vaječníky byla snížena.

Tabulka 2

Koncentrace vápníku pravého femuru u krys s odňatými vaječníky

	skupina A	skupina B	skupina C	skupina D
střed (gmolů/ml)	7,57	6,61	7,45	7,69
N		6	6	6	6
S.D.		0,38	0,29	0,28	0,31
skupina			t	d. f.	P
A proti	B		4,90	10	<0,001
A proti	C		0,62	10	>0,5
A proti	D		0,60	10	>0,5
B proti	C		5,08	10	<0,001
B proti	D		6,20	10	<0,001
C proti	D		1,40	10	>0,1

Rychlost přírůstku minerálů kostí byla stanovena, jak shora popsáno, měřením dolní růstové části kosti levého femuru. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3 a graficky znázorněny na obrázku 3.

• · · · 9999 ·· • · ···<

Tabulka 3

Rychlost přírůstku minerálů kostí u krys s odňatými vaječníky

	skupina A	skupina B	skupina C	skupina D
střed (/xm/den)	0,90	0,59	0,85	0,86
N	6	6	6	6
S.D.	0,12	0,07	0,07	0,09
skupina		t	d.f.	P
A proti B		5,39	10	<0,001
A proti C		0,87	10	>0,5
A proti D		0,21	10	>0,5
B proti C		6,29	10	<0,001
B proti D		5,93	10	<0,001
C proti D		0,21	10	>0,5

POKUSY ZAHRNUJÍCÍ KRYSY S ODŇATÝMI VAJEČNÍKY A NORMÁ1NÍ CHEMICKY SYNTETIZOVANÝ POLYPEPTID, PODÁVÁNÍ PO DOBU OSMI TÝDNŮ

Osm měsíců po odnětí vaječníků bylo pěti krysám s odňatými vaječníky subkutánní injekcí podáno 100 μΐ roztoku 0,1% kyseliny octové obsahujícího chemicky syntetizovaný peptid, v němž byla N-koncová aminová skupina modifikována acetylovou skupinou (sekv. id. č. 2). To bylo prováděno každých 24 hodin po dobu osmi týdnů. Padesátý čtvrtý den byl podán roztok hydrochloridu tetracyklinu intramuskulární injekcí do pravého velkého hýžďového svalu každé krysy tak, aby se dosáhlo 24 mg na kg tělesné hmotnosti, jak shora popsáno. Padesátý šestý den byla injekčně podána druhá dávka hydrochloridu tetracyklinu a krysy byly 57. den usmrceny.

Druhá skupina šesti krys s odstraněnými vaječníky byla ošetřována podobným způsobem roztokem 0,1% kyseliny octové neobsahujícím žádný peptid po stejnou dobu. Třetí skupina pěti krys, z nichž každá byla podrobena předstírané operaci, byla podobně testována roztokem 0,1% kyseliny octové neobsahujícím žádný peptid po stejnou dobu. Čtvrtá skupina pěti neporušených ·· ·· ·♦ ·· ·· »· • * · · · · · ♦ * · · · • 9 · ·· · ···· *····« «· ··· « © ······ ··· ···« ·· ·« ···· «φ ·· krys byla podobně testována roztokem 0,1% kyseliny octové neobsahujícím žádný peptid po stejnou dobu osmi týdnů. Dvě krysy z druhé skupiny během těchto osmi týdnů onemocněly a byly před dospěním usrmceny.

Posmrtná krev byla odebrána kardiopunkcí a sérum bylo zmraženo do doby, než bylo analyzováno. Každá krysa byla podrobena pitvě. U krys nebyly pozorovány žádné pathologické změny vyjma chirurgických poranění a atrofie utery a vagíny u krys s odňatými vaječníky.

Pravé femury byly odvápněny a hustota vápníku byla stanovena jak shora uvedeno. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4 a na obrázku 4.

Tabulka 4

Koncentrace vápníku pravého femuru u krys s odňatými vaječníky

	skupina A	skupina B	skupina C	skupina D
střed (jumolů/ml)	7,37	6,89	7,69	7,87
N	5	5	5	5
S.D.	0,15	0,32	0,30	0,24
skupina		t	d.f.	P
A proti B		3,85	6	<0,005
A proti C		1,17	6	>0,2
A proti D		3,01	6	<0,01
B proti C		4,03	6	<0,005
B proti D		5,41	6	<0,001
C proti D		1,60	6	>0,1

SYNTÉZA PROTILÁTEK PROTI CHEMICKY SYNTETIZOVANÉMU PROTEINU (sekv. id. č. 1)

Chemicky syntetizovaný protein (sekv. id. č. 1) se napojí na KLH (keyhole limpet hemocyanin) třemi různými cross-linkery, jak níže popsáno.

PŘIPOJENÍ GLUTARALDEHYDU

Ve 2,5 ml roztoku PBS připraveného z 2,7 mM KC1, 1,2 mM KH₂PO₄, 138 nM NaCl a 8,1 mM Na_HPO₄ se rozpustí 5 mg peptidu (sekv. id. č. 1), aby se získala konečná koncentrace peptidu 2 mg/ml. V 5,0 ml PBS se rozpustí 10 mg KHL, aby se získala konečná koncentrace 2 mg/ml. K 1,25 ml roztoku KLH se přidá 1,25 ml roztoku peptidu. Přidá se glutaraldehyd na konečnou koncentraci 0,25 %. Výsledný roztok se míchá jednu hodinu za teploty místnosti. Po míchání se roztok dialyzuje proti 1 litru PBS. PBS se třikrát vymění.

PŘIPOJENÍ KARBODIIMIDU (EDC)

Roztoky peptidu a KLH se připraví tak, jak je to popsáno v předcházející části. K 1,25 ml roztoku KLH se přidá 1,25 ml roztoku peptidu. K výslednému roztoku se přidá 2,5 mg EDC. Roztok se stále míchá za teploty místnosti 4 hodiny a potom se dialyzuje proti 1 litru PBS. PBS se třikrát vymění.

PŘIPOJENÍ M-MALEIMIDOBENZOYL-N-HYDROXYSUKCINIMIDOVÉHO ESTERU (MBS)

K 500 μΐ vody se přidá 5 mg peptidu a pH se hydroxidem sodným upraví na hodnotu 8,5, aby se získala konečná koncentrace 10 ng/ml. Anhydrid kyseliny citrakonové se vodou zředí na koncentraci 10 mg/ml. Ke 100 μΐ roztoku peptidu se přidá 500 μΐ roztoku anydridu s tím, že se mezi každým přidáním upraví pH na 8,5. Roztok se pak 1 hodinu míchá při teplotě místnosti. Následuje přidání 100 μΐ 1M pufru fosforečnanu sodného (pH 7,2) a 900 μΐ lOOmM pufru fosforečnanu sodného (pH 7,2). Sulfo-MBS se zředí ve vodě na koncentraci 25 mg/ml. 400 μΐ tohoto roztoku se přidá k roztoku peptidu, aby se dosáhla koncentrace MBS asi 5 mg/ml. Roztok se stále míchá při teplotě místnosti po dobu 30 minut, přidá se 6 μΐ β-merkaptoethanolu na konečnou koncentraci B-merkaptoethanolu 35 mM a roztok se stále míchá za teploty místnosti 1 hodinu. KLH se v PBS rozpustil v množství 3 mg/ml. K roztoku peptidu se přidá 2,5 ml tohoto roztoku. Roztok se stále míchá za teploty místnosti 3 hodiny, načež se dialyzuje proti 1 litru PBS se třemi výměnami PBS. Konečná koncentrace ······ ··· ···· ·· ·· ···· ·· ·· peptidu byla asi 1 mg/ml a konečná koncentrace KLH byla asi 1,5 mg/ml.

GENERACE PROTILÁTEK

Králíkům byly injekčně podány roztoky syntetického peptidu, jak je uvedeno dále. 250 μΐ každého z roztoků peptidu s napojeným glutaraldehydem a napojeným EDC se smíchá spolu s 500 μΐ Freundova adjuvans. Tento roztok se intramuskulární injekcí podá do zadních tlapek králíka, 500 μΐ na tlapku. Celkové množství injekčně podaného peptidu bylo 0,5 mg. S 500 μΐ Freundova adjuvans se smíchá 500 μΐ syntetického peptidu připojeného na KLH s MBS. Tento roztok se intramuskulární injekcí podá do zadních tlapek jiného králíka, 500 μΐ na jednu tlapku. Celkové množství injekčně podaného peptidu bylo 0,5 mg.

Syntetický peptid, 1 gg a 4 /xg, se nanesl na dva pásy gelu (18% dělící, 5% vrstvenný). Gel se blotuje přes noc při 30 V a zablokuje se 3% mlékem v PBS. Gel se inkubuje přes noc s králičím sérem zředěným 1:250 1% mlékem v PBS. Následuje jednohodinová inkubace s kozí anti-králičí-alkalickou fosfatázou zředěnou 1:1000. Gel se pak vyvolá substrátem. Obarvením komasinovou modří se objeví syntetický peptid. Peptid byl detegován druhou krví každého králíka a nebyl detegován sérem před imunizací u žádného králíka.

Interakce mezi imobilizovaným peptidem a sérovými protilátkami byla dále studována povrchovou plasmonovou resonancí použitím zařízení BIAcore™. Syntetický peptid byl kovalentně imobilizován na dextranové matrici kondenzací s aminem. Králičí séra různých zředění byla injekčně podávána povrchem pět minut. Bylo stanoveno množství protilátky navázané na imobilizovaný peptid. Titr je definován jako poslední zředění séra poskytující positivní odpověď, to jest větší než 50 resonančních jednotek. Tímto přístupem bylo zjištěno, že protilátky jsou přítomny v séru obou králíků a že interakce může být blokována preinkubací séra s peptidem. Bylo zjištěno, že protilátky v séru králíků neinteragují s imobilizovaným nepříbuzným peptidem.

POKUSY ZAHRNUJÍCÍ KRYSY A PROTILÁTKY PROTI CHEMICKY SYNTETIZOVANÉMU PEPTIDU

Připraví se sérum protilátky v lOmM Tris.Cl, pH 7,4. Každá z pěti krys dostane 100 μΐ tohoto roztoku injekcí do levého velkého hýžďového svalu. Každá krysa z druhé skupiny pěti krys byla ošetřena podobně, ale další injekcí roztoku, který obsahoval 45 μg polypeptidu (sekv. id. č.l), do pravého velkého hýžďového svalu. Každá krysa ze třetí skupiny pěti krys dostala injekci 100 μΐ lOmM Tris.Cl O pH 7,0.

Každé z těchto patnácti krys pak byl injekčně podán hydrochlorid tetracyklinu, jak shora uvedeno, v množství 24 mg na kg tělesné hmotnosti. Druhá dávka hydrochloridu tetracyklinu byla injekčně podána o 48 hodin později. Krysy byly usmrceny po dalších 24 hodinách.

Rychlost přírůstku minerálů kostí byla stanovena shora popsanými měřeními dolní pravé femorální růstové části kosti. Výsledky jsou uvedeny v tabulce pět a na obrázku 5.

Tabulka 5

Rychlost přírůstku minerálů kostí u krys, kterým byla injekčně podána protilátka na chemicky syntetizovaný peptid

	skupina A	skupina B	skupina C
střed (μιηοΐύ/πιΐ)	0,86	1,22	1,30
S.D.	0,02	0,08	0,11
N	5	5	5
skupina	t	d.f.	P
A proti B	8,06	8	>0,2
A proti C	7,57	8	<0,001
B proti C	1,24	8	>0,2

Použitím protilátky na polypeptid lze tedy vyvinout metodologii a produkty pro použití při detegování polypeptidu, se kterým se váže protilátka. Například protilátka se může navázat • · · • · ······ ··· ···· ·· ·· ···· ·· ·· na nebo konjugovat s kterýmkoliv z několika dobře známých reportérových systémů nastavených tak, aby indikovaly positivní navázání polypeptidu na protilátku. Mezi dobře známé reportérové systémy patří radioimunoanalýzy (RIA) nebo imunoradiometrické analýzy (IRMA). Také ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) by měla obvykle s RIA a IRMA relativně vysoký stupeň citlivosti, obvykle se ale nespoléhá na použití radioisotopů. Mohou se vyrobit vizuálně detegovatelné látky nebo alespoň jedna detegovatelná spektrofotometrem. Lze použít analýzu spoléhající se na fluorescenci látky navázané enzymem, který se testuje. Je třeba ocenit, že existují četné reportérové systémy, které se mohou používat, podle předloženého vynálezu pro detegování přítomnosti příslušného polypeptidu. Sbírkou standardních vzorků a postupů lze dobře stanovit přítomnost polypeptidu nad prahovým množstvím v krevním séru.

Mohla by být vyvinuta metoda založená na antigenní odpovědi na chemicky syntetizovaný polypeptid (sekv. id. č.l) a mohly by tak být předtestovány varianty získaného polypeptidu, jak je shora popsáno, substitucí, delecí a adicí aminokyselin, (a konjugáty) jako potenciální faktory stimulující kosti. Například ty, které positivně reagují s protilátkou na již známý peptid, by pak mohly být testovány na účinky stimulace kostí in vivo použitím zde popsaného systému u krys.

Tento reporterový systém s navázanou protilátkou by mohl být použit při postupu stanovení toho, jestli krevní sérum subjektu obsahuje deficitní množství polypeptidu. Mohly by tak být vyvinuty testovací soupravy na základě normální prahové koncentrace tohoto polypeptidu v krevním séru daného typu subjektu. POKUSY ZAHRNUJÍCÍ CHEMICKY SYNTETIZOVANÝ LIDSKÝ POLYPEPTID OBSAHUJÍCÍ SUBSTITUCI CYSTEIN-ALANIN

Standardními chemickými postupy byla připravena modifikovaná sekvence (sekv. id. č. 3) chemicky syntetizovaného peptidu (sekv. id. č. 1) získaná substitucí cysteinového zbytku v poloze 13 alaninem. Alaninový zbytek je stericky podobný redukovanému cysteinovému zbytku, při čemž způsobuje, že polypeptid není schopen spontánně dimerizovat. Tricin SDS elektroforetický • · • · ·

gel modifikovaného a nemodifikovaného (normálního) peptidu je uveden na obrázku 6.

Byly provedeny pokusy na třech skupinách po šesti krysách vážících mezi 295 a 320 g. Byl připraven 1 mg na ml roztoku modifikovaného peptidu (sekv. id. č. 3) v 0,1% kyselině octové. Byl připraven roztok 1 mg normálního peptidu (sekv. id. č. 1) na ml roztoku v 0,1% kyselině octové. Každé kryse z první skupiny byla podána subkutánní injekcí do pravého stehna 0,1 ml roztoku modifikovaného peptidu. Podobně byla každé kryse z druhé skupiny podána 0,1 ml roztoku normálního peptidu. Každé kryse ze třetí skupiny, kontrolní skupiny, byla injekčně podána 0,1 ml 1% roztoku kyseliny octové. Bezprostředně po těchto injekcích bylo každé kryse intramuskulární injekcí podáno 24 mg na kg tělesné hmotnosti hydrochloridu tetracyklinu rozpuštěného v 0,5 ml vody. Druhá dávka hydrochloridu tetracyklinu byla podána o 48 hodin později. Zvířata byla usmrcena 24 hodin po druhé dávce narkosou oxidu uhličitého. Dolní růstová část kosti pravého femuru byla vyříznuta a fixována v 10% vodném roztoku formaldehydu pufrovaného acetátovým pufrem na hodnotu pH 7,2. Pro měření, jak shora popsáno, byly připraveny řezy kostí.

Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce šest a graficky na obrázku 7. Jak lze vidět, rychlost přírůstku kostí u krys, kterým byl injekčně podán modifikovaný polypeptid, je významně vyšší než rychlost přírůstku kostí u kontrolní skupiny, ale pod rychlostí přírůstku kostí uvedených pro krysy, kterým byl injekčně podán normální peptid.

Tabulka 6

Srovnání skupiny aritmetických středů se skupinami, kterým byl injekčně podán modifikovaný peptid, kterým byl injekčně podán nemodifikovaný peptid a s kontrolou

	skupina A	skupina B	kontrolní skupina
střed (μιη/d)	1,67	1,35	1,02
S.D.	0,11	0,16	0,010
N	6	6	6
skupina	t	d. f.	P
A proti kontrole	12,2	10	<0,001
B proti kontrole	4,69	10	<0,001
A proti B	3,97	10	<0,005

POKUSY ZAHRNUJÍCÍ AKTIVNÍ FRAGMENTY LIDSKÉHO POLYPETIDU 0 36 AMINOKYSELINÁCH

Podle dobře známých chemických postupů byly syntetizovány polypeptidy, které mají aminokyselinové sekvence identifikovány jako sekv. id. č. 4, 5, 6, 7, 8 a 9.

Jako testovací zvířata pro stanovení shora popsané rychlosti přírůstku minerálů kostí byly použity krysy Sprague-Dawley. Krysím samečkům o hmotnosti mezi 280 g a 380 g byla podána subkutánní injekce jeden týden po aklimatizaci. Každému zvířeti bylo injekčně podáno 200 μΐ testovaného roztoku 0,1% kyseliny octové. Byly připraveny roztoky v takových koncentracích, aby se dosáhla dávka asi 25 nmolů polypeptidu na zvíře. Po každé testované dávce bezprostředně následovala intramuskulární injekce 24 mg na kg tělesné hmotnosti hydrochloridu tetracyklinu. Druhá injekce tetracyklinu byla podána o 48 hodin později.

Kontrolní skupina: 0,1% roztok kyseliny octové.

• · ·· ·· · · ·· · ·

	24 . • • · ·	• · · • · • · • · ·	• · • · · • · • ·	• • • • · · ·	• · · · • · · · · ·
• • ·	• · • ·
Skupina	A: sekv. id. č.	1:
Gly Ile	Gly Lys Arg Thr	Asn	Glu	His	Thr	Ala	Asp	Cys	Lys	Ile	Lys
Pro Asn	Thr Leu His Lys	Lys	Ala	Ala	Glu	Thr	Leu	Met	Val	Leu	Asp
Gin Asn	Gin Pro.
Skupina	E: sekv. id. č.	4:
Gly Ile	Gly Lys Arg Thr	Asn	Glu	His	Thr	Ala	Asp	Cys	Lys	Ile	Lys
Pro Asn	Thr Leu His Lys	Lys	Ala	Ala	Glu	Thr	Leu	Met	Val.
Skupina	D: sekv. id. č.	5:
Gly Ile	Gly Lys Arg Thr	Asn	Glu	His	Thr	Ala	Asp	Cys	Lys	Ile	Lys
Pro Asn	Thr Leu His Lys	Lys	Ala	Ala	•
Skupina	C: sekv. id. č.	6:
Gly Ile	Gly Lys Arg Thr	Asn	Glu	His	Thr	Ala	Asp	Cys	Lys	Ile	Lys
Pro Asn	Thr Leu.
Skupina	B: sekv. id. č.	7:
Gly Ile	Gly Lys Arg Thr	Asn	Glu	His	Thr	Ala	Asp	Cys	Lys	Ile	•

Podobně, ale v oddělené řadě pokusů, byly testovány rychlosti přírůstku minerálů kostí použitím následujících chemicky syntetizovaných polypeptidů:

Skupina F: sekv. id. č. 8: Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys.

Skupina G: sekv. id. č. 9: Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys.

Rychlosti přírůstku minerálů kostí byly stanoveny měřeními dolní růstové části kosti pravého femuru, jak shora popsáno.

Výsledky, které byly získány v těchto dvou řadách pokusů, jsou souhrnně uvedeny v tabulkách sedm a osm a graficky znázorněny na obrázku 8 a 9. Jak lze vidět, všechny testované polypeptidy měly positivní účinek na rychlost přírůstku kostí, tj. vykazovaly aktivitu stimulace kostí.

• ·

Tabulka 7

Srovnání skupiny aritmetických středů s prvními skupinami, kterým byly injekčně podány aktivní varianty ··

	skupina
A	B	C	D	E kontrola
střed (μπι/dl) 1,40	1,41	1,37	1,35	1,31 1,03
S.D.	0,05	0,08	0,09	0,10	0,06 0,06
1 1 1 1 1 1 1 2 1	6	6	6	6	6 6
skupina		t	d. f.		P
A proti	kontrole	5,18	10		<0,001
B proti	kontrole	9,67	10		<0,001
C proti	kontrole	7,64	10		<0,001
D proti	kontrole	6,92	10		<0,001
E proti	kontrole	7,99	10		<0,001
A proti	B	0,14	10		>0,5
A proti	C	0,40	10		>0,5
A proti	D	0,66	10		>0,5
A proti	E	1,30	10		>0,2
B proti	C	0,82	10		>0,4
B proti	D	1,19	10		>0,2
B proti	E	2,49	10		>0,05

• · · ·

Tabulka 8

Srovnání skupiny aritmetických středů s druhými skupinami, kterým byly injekčně podány aktivní varianty

	skupina F	skupina G	kontrolní skupina
střed (μπι/d)	2,09	2,83	1,63
S. D. (μπι/d)	0,34	0,19	0,13
N	4	3	4
skupina	t	d.f.	P
F proti kontrole		6	0,0470
G proti kontrole		5	0,0002
F proti G		5	0,215

POKUSY, KTERÉ ZAHRNUJÍ SEKV. ID. Č. 7, TÝKAJÍCÍ SE OBSAHU VÁPNÍKU V KOSTECH

Další řada pokusů byla provedena použitím polypeptidů identifikovaného jako sekv. id. č. 7, aby se stanovil účinek polypeptidu na obsah vápníku v kostech, když se tento polypeptid podává krysám.

Odnětí vaječníků krys bylo provedeno jak shora popsáno. Každé kryse byl každý den po dobu trvání pokusu subkutánně podáván 0,1% roztok kyseliny octové obsahující 25 nmolů polypeptidu. Jedna skupina krys byla ošetřována po dobu 12 týdnů počínaje stým dnem po odnětí vaječníků. Jiná skupina krys byla ošetřována osm týdnů počínaje osmým týdnem po odnětí vaječníků. Krysy byly na konci období ošetřování usmrceny a pitvány. Bylo provedeno posmrtné vyhodnocení obsahu minerálů kostí.

Lumbální obratle LI až L4 byly vyčištěny pevným nylonovým kartáčkem, aby se odstranil připojený sval. Potom byly umístěny ventrální stranou dolů pod 3 cm destilované vody v polypropylenové nádobě a sleduje se DEXA (duál energy X-ray) spektrofotometrem Hologic 100, kterým se stanoví obsah vápníku v gramech.

Pravý femur každé krysy byl pitván také neporušený a vyčištěný od připojených svalů pevným nylonovým kartáčem. Byl snímán za• 9

• · · · 9 9 9 99999

99999999

99 9999 9999 řízením DEXA dorsální stranou dolů pod 3 cm destilované vody. Byly sejmuty čtyři oblasti femuru, jak je vidět na obrázcích 10 a 11: A: proximální konec, B: střední část dlouhé kosti, C: distální konec a D: krček. Obsah minerálů kostí (mj. vápníku) v gramech byl hodnocen ve čtyřech zónách femuru na základě absorpce použitím vnitřního standardu zařízení.

Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulkách devět až osmnáct.

Tabulka 9

Srovnání skupiny aritmetických středů se skupinami krys s odňatými vaječníky, kterým byl 100 dnů injekčně podáván polypeptid sekv. id. č. 7 - obsah minerálů kostí měřený na proximálním konci femuru

	kontrola	A: s odňatými vaječníky (bez polypeptidu)	B: s odňatými vaječníky (s polypeptidem)
střed (g)	0,1503	0,1351	0,1411
S.D.	0,0159	0,0105	0,0155
N	14	14	14
	t	d.f.	P
kontrola proti A	2,9722	26	<0,025
kontrola proti B	1,4400	23	N.S.
A proti B	1,1634	23	N.S.

• · • · · ·

Tabulka 10

Srovnání skupiny aritmetických středů se skupinami krys s odňatými vaječníky, kterým byl 56 dnů injekčně podáván polypeptid sekv. id. č. 7 - obsah minerálů kostí měřený na proximálním konci femuru • · · · · · ···· ·· ·· ····

kontrola před-	A: s odňatými	B: s odňatými
	stí-	vaječníky	vaječníky
	ráno	(bez polypeptidu)	(s polypeptidem)
střed (g) 0,	1451 0,1387	0,1368	0,1328
S.D. 0,	0183 0,0166	0,0280	0,0141
N	5 5	6	6
	t	d.f.	P
kontrola	0,7372	8	N.S.
proti před-
stíráno
kontrola	0,6261	9	N.S.
proti A
kontrola	1,6223	9	N.S.
proti B
předstíráno	0,1330	9	N.S.
proti A
předstíráno	1,6229	9	N.S.
proti B
skupina A	0,3116	10	N.S.
proti B

* ·

• · « · · ·

Tabulka 11

Srovnání skupiny aritmetických středů se skupinami krys s odňatými vaječníky, kterým byl 100 dnů injekčně podáván polypeptid sekv. id. č. 7 - obsah minerálů kostí měřený na páteři (LI až L4)

	kontrola	A: s odňatými vaječníky (bez polypeptidu)	B: s odňatými vaječníky (s polypeptidem)
střed (g)	0,5437	0,4364	0,4758
S.D.	0,0161	0,0089	0,0188
N	14	14	10
	t	d.f.	P
kontrola proti A	5,8384	26	<0,001
kontrola proti B	2,7434	22	<0,0025
A proti B	2,0756	22	0,05

Tabulka 12

Srovnání skupiny aritmetických středů se skupinami krys s odňatými vaječníky, kterým byl 56 dnů injekčně podáván polypeptid sekv. id. č. 7 - obsah minerálů kostí měřený na páteři (LI až

L4)

kontrola před-	A: s odňatými	B: s odňatými
	stí-	vaječníky	vaječníky
	ráno	(bez polypeptidu)	(s polypeptidem)
střed (g) 0,	5542 0,5321	0,4322	0,4606
S.D. 0,	0275 0,0172	0,0226	0,0234
N	5 5	6	6
	t	d.f.	P
kontrola	0,6805	8	N.S.
proti před-
stíráno
kontrola	4,4196	9	<0,005
proti A
kontrola	3,1042	9	<0,025
proti B
předstíráno	2,8382	9	<0,025
proti A
předstíráno	1,9951	9	N.S.
proti B
skupina A	0,8759	10	N.S.
proti B

Tabulka 13

Srovnání skupiny aritmetických středů se skupinami krys s odňatými vaječníky, kterým byl 100 dnů injekčně podáván polypeptid sekv. id. č. 7 - obsah minerálů kostí měřený ve střední části dlouhé kosti femuru

	kontrola	A: s odňatými vaječníky (bez polypeptidu)	B: s odňatými vaječníky (s polypeptidem)
střed (g)	0,2258	0,2146	0,2347
S.D.	0,0261	0,0106	0,0215
N	14	14	11
	t	d.f.	P
kontrola proti A	0,8301	26	N.S.
kontrola proti B	0,9078	23	N.S.
A proti B	2,3079	23	<0,05

Tabulka 14

Srovnání skupiny aritmetických středů se skupinami krys s odňa tými vaječníky, kterým byl 56 dnů injekčně podáván polypeptid

sekv. id. č. 7 - obsah minerálů kostí měřený ve střední části
dlouhé	kosti femuru
		kontrola	před- A:	s odňatými	B	: s odňatými
			stí-	vaječníky		vaječníky
			ráno (bez	polypeptidu)	(s	polypeptidem)
střed	(g)	0,2179	0,1918	0,1716		0,2091
S.D.		0,0156	0,0162	0,0272		0,0121
N		5	5	6		6
			t	d. f.		P
kontrola	2,2590	8		<0,05

proti před-

stíráno
kontrola proti A	3,3549	9	<0,025
kontrola proti B	1,9209	9	N.S.
předstíráno proti A	1,4571	9	N.S.
předstíráno proti B	1,1778	9	N.S.
skupina A proti B	2,4926	10	<0,05

Tabulka 15

Srovnání skupiny aritmetických středů se skupinami krys s odňatými vaječníky, kterým byl 100 dnů injekčně podáván polypeptid sekv. id. č. 7 - obsah minerálů kostí měřený na distálním konci femuru

	kontrola	A: s odňatými vaječníky (bez polypeptidů)	B: s odňatými vaječníky (s polypeptidem)
střed (g)	0,1597	0,1396		0,1424
S.D.	0,0185	0,0068		0,0132
N	14	14		11
	t	d.f.		P
kontrola proti A	3,8255	26		<0,001
kontrola proti B	2,6160	23		<0,025
A proti B	0,6984	23		N.S.

Tabulka 16

Srovnání skupiny aritmetických středů se skupinami krys s odňatými vaječníky, kterým byl 56 dnů injekčně podáván polypeptid sekv. id. č. 7 - obsah minerálů kostí měřený na distálním konci femuru

kontrola před-	A: s odňatými	B: s odňatými
	stí-	vaječníky	vaječníky
	ráno	(bez polypeptidu)	(s polypeptidem)
střed (g) 0,	1826 0,1540	0,1304	0,1347
S.D. 0,	0122 0,0118	0,0094	0,0039
N	5 5	6	6
	t	d.f.	P
kontrola	3,7549	8	<0,025
proti před-
stíráno
kontrola	8,0183	9	<0,001
proti A
kontrola	9,1462	9	<0,001
proti B
předstíráno	3,7046	9	<0,005
proti A
předstíráno	3,8149	9	<0,005
proti B
skupina A	1,0274	10	N.S.
proti B

% • · • · • · ·«

Tabulka 17

Srovnání skupiny aritmetických středů se skupinami krys s odňatými vaječníky, kterým byl 100 dnů injekčně podáván polypeptid sekv. id. č. 7 - obsah minerálů kostí měřený na krčku femuru

	kontrola	A: s odňatými vaječníky (bez polypeptidu)	B: s odňatými vaječníky (s polypeptidem)
střed (g)	0,0334	0,0303	0,0351
S.D.	0,0049	0,0040	0,0031
N	14	14	10
	t	d.f.	P
kontrola proti A	1,3978	26	N.S.
kontrola proti B	1,0326	21	N.S.
A proti B	2,2590	21	P<0,005

%

Tabulka 18

Srovnání skupiny aritmetických středů se skupinami krys s odňatými vaječníky, kterým byl 56 dnů injekčně podáván polypeptid sekv. id. č. 7 - obsah minerálů kostí měřený na krčku femuru

kontrola před-	A: s odňatými	B: s odňatými
	stí-	vaječníky	vaječníky
	ráno	(bez polypeptidu)	(s polypeptidem)
střed (g) 0,	0277 0,0255	0,0202	0,0274
S . D. 0 ,	0020 0,0038	0,0028	0,0013
N	5 5	6	6
	t	d.f.	P
kontrola	1,1534	8	N.S.
proti před-
stíráno
kontrola	4,9809	9	<0,001
proti A
kontrola	0,3342	9	N.S.
proti B
předstíráno	2,6620	9	<0,05
proti A
předstíráno	1,1462	9	N.S.
proti B
skupina A	5,6713	10	<0,005
proti B

Jak lze vidět z dat v tabulce, zvýšení in vivo obsahu vápníku v kosti je nejzřetelnější na krčku femuru a ve střední části dlouhé kosti femuru, což znamená, že účinek podávaného peptidu může být místně specifický, možná větší na těch místech kostry, která jsou vystavena mechanickému stresu.

• » • · • ·

POKUSY ZAHRNUJÍCÍ JINÉ FRAGMENTY LIDSKÉHO POLYPEPTIDU O 36 AMINOKYSELINÁCH

Byly syntetizovány také polypeptidové fragmenty normálního polypeptidu (sekv. id. č. 1) a tyto fragmenty byly testovány na aktivitu stimulace kostí stejně jako fragmenty z C-konce.

Kontrolní skupina: 0,1% kyselina octová.

Skupina Gly Ile Pro Asn Gin Asn

H: sekv. id. Gly Lys Arg Thr Leu His Gin Pro.

č. Thr Lys

1:

Asn Lys

Glu His Thr Ala Asp Cys Lys

Ile Lys Leu Asp

Ala Ala Glu

Thr

Leu

Met Val

Skupina

I: i

sekv

. id.

č.

16:

Arg Thr

Asn

Glu

His

Thr

Ala

Asp

Cys

Lys

Ile.

Skupina

J: :

sekv

. id.

č.

15:

Arg Thr

Asn

Glu

His

Thr

Ala

Asp

Cys

Lys

Ile

Lys

Pro

Asn

Thr

Leu

His Lys

Lys

Ala

Ala

Glu

Thr

Leu

Met

Val

Leu

Asp

Gin

Asn.

Skupina

K: !

sekv

. id.

č.

14:

Thr Ala

Asp

Cys

Lys

Ile

Lys

Pro

Asn

Thr

Leu

His

Lys

Lys

Ala

Ala

Glu Thr

Leu

Met

Val

Leu

Asp.

Skupina

L: ;

sekv

. id.

č.

10,

li.

12 a 13

(směs):

Leu His

Lys

Lys

Ala

Ala

Glu

Thr

Leu

Met

Val

Leu

Asp

Gin

Asn

Gin,

Leu His

Lys

Lys

Ala

Ala

Glu

Thr

Leu

Met

Val

Leu

Asp

Gin

Asn

Leu His

Lys

Lys

Ala

Ala

Glu

Thr

Leu

Met

Val

Leu

Asp

Gin

a

Leu His

Lys

Lys

Ala

Ala

Glu

Thr

Leu

Met

Val

Leu

Asp.

Rychlosti přírůstku minerálu kostí byly opět stanoveny měřením dolní růstové části kostí pravého femuru. Získané výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce devatenáct a graficky znázorněny na obrázku 12. Jak lze na obrázku 12 vidět, bylo zjištěno, že žádná z ne-N-koncových variant identifikovaných jako sekv.

id. č. 10, 11, 12, 13, 14, 15 nebo 16 nezvyšuje rychlost pří38 to · to · · růstku kostí vzhledem ke kontrole.

Tabulka 19

Shrnutí skupiny aritmetických středů rychlostí přírůstku kostí u krys, který byly injekčně podány ne-N-koncové varianty

	skupina
H	I	J	K	L	kontrola
střed (μιπ/den)	1,50	1,02	0,92	0,92	0,98	1,02
S.D.	0,09	0,12	0,09	0,04	0,09	0,06
N	6	6	6	6	6	6

Souhrn výsledků získaných vzhledem k příslušným testovaným polypetidovým sekvencím je uveden na obrázku 13.

Jak lze vidět, polypeptid identikovaný jako sekv. id. č. 9 má sekvenci 10 aminokyselin obsaženu v sekvenci polypeptidu o 36 aminokyselinách identifikované jako sekv. id. č. 1, tj. in vivo aktivita stimulace kostí může být zachována u polypeptidu, u kterého je zachováno jenom 28 % z aminokyselinové sekvence sekv. id. č. 1. Účinky stimulace kostí by také měly být pozorovány pro homology polypeptidu identifikovaného jako sekv. id. č. 9. Lze dokonce zjistit, že by mohla být deletována jedna nebo více z aminokyselin přítomných v sekv. id. č. 9a aktivita polypeptidu (nebo homologu) bude zachována.

Odborníkům z oblasti techniky je ovšem známo, že polypeptidy, které mají podobnou aktivitu, jsou obecně příbuzné tím, že mají stejnou nebo podobnou trojrozměrnou část (trojrozměrné části), které interagují s jiným činidlem, jako je receptor, s nímž se polypeptid nějakým způsobem váže. To je důvod, proč je možné mít některé polypeptidy, které jsou navzájem podobné a které vykazují podobnou aktivitu spočívající ve stimulaci kostí.

Předložený vynález poskytuje syntetický polypeptid, který má in vivo aktivitu stimulující kosti savců, zvyšuje hustotu • · • · · ···«·· · · · «··· «· *· ···· ·· ·· vápníku nebo jeho obsah v kostech savců, má aminokyselinovou sekvenci alespoň z asi 19 % zachovánu vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 1 a má z ní deletovánu alespoň jednu aminokyselinu, nebo jeho homolog. V souvislosti s tímto vynálezem se o peptidu, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, kterou lze seřadit se sekv. id. č. 1 tak, aby alespoň asi 30 % jednotlivých zbytků aminokyselin původní sekvence bylo v peptidu přítomno, mluví jako o peptidu, který má asi 30 % zachovaných aminokyselin při srovnání s aminokyselinovou sekvencí identifikovanou jako sekv. id. č. 1, při čemž se umožňují homologní substituce a omezený počet insercí nebo delecí mezi seřazenými sekvencemi. Aminokyselinová sekvence, která má sedm ze 36 aminokyselinových zbytků sekv. id. č. Iv seřazené sekvenci, by byla zachována z 19 %. Aminokyselinová sekvence, která má osm ze 36 aminokyselinových zbytků sekv. id. č. Iv seřazené sekvenci, by byla zachována z 22 %. Aminokyselinová sekvence, která má devět ze 36 aminokyselinových zbytků sekv. id. č. Iv seřazené sekvenci, by byla zachována z 25 %. Aminokyselinová sekvence, která má deset ze 36 aminokyselinových zbytků sekv. id. č. Iv seřazené sekvenci, by byla zachována z 28 %.

Popsáno poněkud jiným způsobem - polypeptid podle předloženého vynálezu znamená aminokyselinovou sekvenci odpovídající sekv. id. č. 1 s a) jednou aminokyselinou až 4 aminokyselinami deletovanými z N-konce sekv. id. č. 1, b) jednou až 22 aminokyselinami deletovanými z C-konce sekv. id. č. 1 nebo jak ad a) tak b) nebo funkčně ekvivalentní homolog. Bylo zjištěno, že je možné deletovat 5, 6 nebo více aminokyselin z N-konce nebo deletovat více než 22 aminokyselin z C-konce sekv. id. č. 1.

V jiném smyslu lze polypeptid podle předloženého vynálezu popsat jako polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulující kosti u savců, který má sekvenci identifikovanou jako sekv. id. č. 1, sekv. id. č. 3, sekv. id. č. 4, sekv. id. č. 5, sekv. id. č. 4, sekv. id. č. 6, sekv. id. č. 7, sekv. id. č. 8 nebo sekv. id. č. 9, jejich analogy, při čemž aminokyseliny v této sekvenci mohou být substituovány, deletovány nebo přidány, pokud aktivita stimulující kosti u savců odvozená od trojrozměrné • · *

struktury této sekvence je zachována, a konjugáty každého z polypeptidů nebo jejich analogů, při čemž jestliže polypeptidová sekvence je sekvence identifikovaná jako sekv. id. č. 1, potom je z ní deletována alespoň jedna aminokyselina.

Polypeptid podle předloženého vynálezu by zahrnoval takovou sekvenci, která by měla molekulovou hmotnost v rozmezí od asi 1000 do 4900. Tomu je však třeba rozumět tak, že tato sekvence by mohla být přidána konjugací nebo jiným způsobem, který by mohl zvýšit molekulovou hmotnost celé sloučeniny nad 4000.

Tomu je třeba rozumět tak, bez záměru být tím omezen, že jsou možné rozmanité substituce aminokyselin za zachování trojrozměrné struktury zodpovědné za účinek zde popsaných polypeptidů stimulovat kosti. Očekává se tedy, že by například byla možná výměna mezi nepolárními alifatickými neutrálními aminokyselinami, glycinem, alaninem, prolinem, valinem a isoleucinem. Pravděpodobně by bylo možné provést také substituce mezi polárními alifatickými neutrálními aminokyselinami, serinem, threoninem, methioninem, cysteinem, asparaginem a glutaminem. To znamená, že svázaní peptidů disulfidovým můstkem má jistou důležitost a tak by měl být možná samotný cysteinový zbytek zachován neporušen a ostatní aminokyseliny schopny tvořit disulfidovou vazbu, která by jinak neměla být v této sekvenci substituována, i když byla uskutečněna úspěšná cys-ala substituce, jak bylo shora uvedeno (sekv. id. č. 3). Mohly by se provést substituce mezi nabitými kyselými aminokyselinami, kyselinou aspartovou a kyselinou glutamovou, stejně jako substituce mezi nabitými bazickými aminokyselinami, lysinem a argininem. Možné by mohly být také substituce mezi aromatickými aminokyselinami, které zahrnují fenylalanin, histidin, tryptofan a tyrosin. Mohou se provádět substituce samotné nebo se mohou provádět jejich kombinace. Tyto druhy substitucí a vzájemných záměn jsou dobře známy odborníkům z oblasti techniky. Například USA patenty č. 5 487 083 a 5 512 548 popisují jiné možné substituce včetně substitucí zahrnujících aminokyseliny, které nejsou tímto genem kódovány. Dobře možné jsou také jiné substituce.

Důležitost N-koncové části této sekvence je zřejmá ze zde popsaných výsledků. Polypeptid (sekv. id. č. 9), který má ami41 ···«·· · · » ··«· «· *· ···· ·· «· nokyseliny 5 až 14 ze sekv. id. č. 1, vykazuje aktivitu stimulace kostí, zatímco polypeptidy, kterým chybí prvních pět aminokyselin z N-konce, ale které mají aminokyseliny 10 až 32 (sekv. id. č. 14) nebo aminokyseliny 20 až 35 (sekv. id. č.

10), nevykazují aktivitu stimulace kostí. Může být, že je možné deletovat více aminokyselin z kteréhokoliv konce polypeptidu identifikovaného jako sekv. id. č. 9 za zachování trojrozměrné konfigurace subsekvence polypeptidu odpovědné za aktivitu stimulace kostí. Vntřních delecí, i když mohou být v jistém omezeném limitu možné, by mělo být jen několik. Zvláště je třeba si všimnout polypeptidu, který má sekvenci identifikovanou jako sekv. id. č. 16, která se odlišuje od aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 9 pouze jedním aminokyselinovým zbytkem. První nevykazuje aktivitu, zatímco druhý vykazuje aktivitu stimulace kostí. Je možné použít zde popsaných experimentálních způsobů pro rozlišení mezi sekvencemi, které stimulují a které nestimulují růst kostí a které zvyšují a které nezvyšují obsah vápníku v kostech.

Ještě by bylo možné na koncích sekvence provést menší přidání aminokyselin a pravděpodobně by byla možná symetrická nebo téměř symetrická přidání na karboxylovém a aminovém konci. Vnitřních přidání, i když pravděpodobně jsou v jistých omezených mezích možná, by mělo být jen několik.

Ze shora uvedeného seznamu modifikací sekvencí, koncových přidání, delecí nebo substitucí jsou pravděpodobně nejužitečnějšími takové modifikace, které slouží v různých funkcích, například jako identifikující skupina pro použití v radioimunoanalýze nebo jako vazebná skupina.

Jako u normálního peptidu (sekv. id. č. 1) se aktivní podsekvence obsahující cysteinový zbytek (tj. sekv. id. č. 4, 5, 6, 7, 8 nebo 9) pravděpodobně spontánně dimerizují a existují v dimerní formě.

Další výhodu lze získat chimerními formami proteinu, jak je známo v oblasti techniky. DNA sekvence kódující celý protein nebo část tohoto proteinu, by tedy mohla být navázána na sekvenci kódující C-koncovou část E. coli B-galaktosidázy, aby například produkovala napojený protein. Expresní systém lidských

respiračních syncyciálních virových glykoproteinů F a G je popsán například v USA patentu č. 5 288 630, vydaném 22. února 1994, a v odkazech tam uvedených.

Polypeptid podle předloženého vynálezu by byl obvykle syntetický, ať už by byl připraven způsoby konvenční chemie nebo rekombinantními technikami. Zde se na takto vyrobený polypeptid odkazuje jako na v podstatě čistý nebo biochemicky čistý, když obecně neobsahuje polypeptidy nebo proteiny, s nimiž by se vyskytoval, i kdyby se nacházel přímo v přírodě, jako například v séru krve živočicha.

Sekvence nukleových kyselin (DNA) kódujících účinné části normálního polypeptidu jsou následující:

sekv. id. č. 17 (odpovídající sekv id

č. 4)

GGG ATC GGA AAA

CGA ACA AAT GAA CAT

ACG

GCA GAT

TGT

AAA ATT

AAA

CCG AAC ACC TTG

CAT AAA AAA GCT GCA

GAG

ACT TTA

ATG

GTC, sekv. id. č. 18 (odpovídající sekv id

Č. 5)

GGG ATC GGA AAA

CGA ACA AAT GAA CAT

ACG

GCA GAT

TGT

AAA

ATT

AAA

CCG AAC ACC TTG

CAT AAA AAA GCT GCA, sekv. id. č. 19 (odpovídající sekv id

č. 6)

GGG ATC GGA AAA

CGA ACA AAT GAA CAT

ACG

GCA GAT

TGT

AAA

ATT

AAA

CCG AAC ACC TTG, sekv. id. č. 20 (odpovídající sekv id

č. 7)

GGG ATC GGA AAA

CGA ACA AAT GAA CAT

ACG

GCA GAT

TGT

AAA

ATT, sekv. id. č. 21 (odpovídá jící sekv id

č. 8)

GGG ATC GGA AAA

CGA ACA AAT GAA CAT

ACG

GCA GAT

TGT

AAA sekv. id. č. 22 (odpovídající sekv id

Č. 9)

CGA ACA AAT GAA

CAT ACG GCA GAT TGT

AAA

Vektor, který obsahuje takovou DNA sekvenci, by tedy mohl být zkonstruován pro použití při syntéze polypeptidu, jak shora popsáno a zvláště v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/CA • · • · ······ · · 9 «··· ·* ·· 9999 99 9 9

94/00144. DNA sekvence kódující tento polypeptid, identifikovaný jako sekv. id. č. 1, je uvedena jako sekv. id. č. 23 v seznamu sekvencí tohoto spisu.

DNA sekvence nebo fragment podle předloženého vynálezu mohou znamenat jakýkoliv fragment, který obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid podle předloženého vynálezu. Vedle kterékoliv ze shora kódujících sekvencí, může tento DNA fragment mít příslušný promotor a SD sekvenci (nebo vhodné ribosomové vazebné místo) na svém 5'-konci a, jestliže je to nutné, nukleotidovou sekvenci obsahující kodón iniciace translace na 5'-konci a nukleotidovou sekvenci obsahující terminační kodón na 3'-konci.

Jak je známo odborníkům z oblasti techniky, genetický kód je degenerovaný”. Nukleotid v genové sekvenci může být tedy nahrazen jiným nukleotidem podle degenerace příslušného kodonu (kódující triplet) beze změny aminokyselinové sekvence polypeptidu kódovaného tímto genem. DNA fragment podle předloženého vynálezu může být tedy odvozen od kterékoliv ze shora uvedených sekvencí (a DNA sekvencí odpovídajících substituovanému polypeptidu nebo jiným analogům, které nejsou explicitně ilustrovány) . Toto nahrazení se může provést takovým způsobem, že výsledný kodón (výsledné kodóny) vykazuje (vykazují) vysokou frekvenci užitečnosti ve specifické hostitelské buňce, jestliže produkují polypeptid podle předloženého vynálezu využitím technik genetického inženýrství.

Tomu je ovšem třeba rozumět tak, že by mohly být generovány protilátky proti kterýmkoliv polypeptidům, které jsou zde popsány, jak je popsáno v souvislosti s normálním polypeptidem (sekv. id. č. 1).

Polypeptid podle předloženého vynálezu může být vyráběn ve formě farmaceutického přípravku, který je vhodný pro účinné podávání pacientovi, který takové podávání potřebuje, jako je osoba, která trpí například sníženou tvorbou kostí. Jinou možností je profylaktické ošetření. Pravděpodobnými kandidáty způsobu podávání se zdají být injekce. Farmaceutický přípravek by mohl obsahovat příslušný nosič nebo příslušné medium, jako je sterilní voda, fysiologický solný roztok, rostlinný olej, neto44 ···· ·« xické organické rozpouštědlo nebo podobná, obecně užívaná při přípravě léčivých přípravků. Mohlo by se používat také plnidlo, barvící činidlo, emulgační činidlo, suspendační činidlo, stabilizátor, ochranné činidlo nebo podobná činidla atd. Mezi jiné možné cesty podávání patří rektální, místní, parenterální, oční, nazální, sublingvální, bukální, intravenózní atd. Farmaceutický přípravek může být ve formě disperze, roztoku, suspenze, tablety, pilulky atd. a může být ve formě nebo v zařízení s pomalým nebo časovým uvolňováním.

Dávkování bude pravděpodobně rozmanité, podle typu pacienta, podle věku, pohlaví atd. a podle povahy a průběhu stavu, který je ošetřován. Obecně platí, že rozmezí dávky pro ošetření stavu souvisejícího se snižováním kostí by mělo být v rozmezí od asi 0,001 pmolu do až 100 nmolů na kg tělesné hmotnosti pacienta .

• · • · • ·

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) Přihlašovatel:

(A) Jméno: Osteopharm Limited (B) Ulice: 2395 Speakman Drive (C) Město: Misssissauga (D) Stát: Ontario (E) Země: Kanada (F) Poštovní směrovací číslo (ZIP): L5K 1B3 (A) Jméno: TAM, Cherk Shing (B) Ulice: 1072 Rectory Lané (C) Město: Oakville (D) Stát: Ontario (E) Země: Kanada (F) Poštovní směrovací číslo (ZIP): L6M 2B7 (ii) Název přihlášky: Stimulační faktor kostí (iii) Počet sekvencí: 22 (iv) Forma pro čtení počítačem:

(A) Nosič dat: disketa 3,5, paměť 1,4Mb (B) Počítač: Compaq, IBP PC kompatibilní (C) Operační systém: MS-DOS 5.1 (D) Sofware: Word Perfect (v) Data týkající se přihláška: Přihláška číslo:

(vi) Data priority přihlášky:

(a) Přihláška číslo: US 08/487 074 (B) Datum podání: 7. června 1995 (2) INFORMACE O SEKVENCI id. č. 1:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 36 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 1:

Gly 1

Ile

Gly

Lys

Arg 5

Thr

Asn

Glu

His

Thr 10

Ala

Asp

Cys

Lys

Ile 15

Lys

Pro

Asn

Thr

Leu 20

His

Lys

Lys

Ala

Ala 25

Glu

Thr

Leu

Met

Val 30

Leu

Asp

Gin Asn Gin Pro (2) INFORMACE O SEKVENCI id. Č. 2:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 36 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ix) Rysy:

(A) Název/klíč: modifikované místo (B) Umístění: ...2 (D) Jiné informace: (poznámka: Xaa znamená N-acetyl-glycin (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 2:

Xaa 1

Ile

Gly

Lys

Arg 5

Thr

Asn

Glu

His

Thr 10

Ala

Asp

Cys

Lys

Ile 15

Lys

Pro

Asn

Thr

Leu 20

His

Lys

Lys

Ala

Ala 25

Glu

Thr

Leu

Met

Val 30

Leu

Asp

Gin Asn Gin Pro (2) INFORMACE 0 SEKVENCI id. Č. 3:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 36 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 3:

Gly 1

Ile

Gly

Lys

Arg 5

Thr

Asn

Glu

His

Thr 10

Ala

Asp

Ala

Lys

Ile 15

Lys

Pro

Asn

Thr

Leu 20

His

Lys

Lys

Ala

Ala 25

Glu

Thr

Leu

Met

Val 30

Leu

Asp

Gin Asn Gin Pro • 9 9 · · 9 9 0 0 0 00 • 00 00 0 · 0 ·♦ 90 000 0 00 009 90

000099909

9999 90 0· 0000 ···♦ (2) INFORMACE O SEKVENCI id. Č. 4:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 30 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 4:

Gly 1

Ile

Gly

Lys

Arg 5

Thr

Asn

Glu

His

Thr 10

Ala

Asp

Cys

Lys

Pro

Asn

Thr

Leu 20

His

Lys

Lys

Ala

Ala 25

Glu

Thr

Leu

Met

Val 30

(2)

INFORMACE 0

SEKVENCI

: id

. č.

5:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 25 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 5:

Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys	Ile Lys 15
1	5	10
Pro	Asn Thr Leu His	Lys Lys Ala Ala
	20	25
(2)	INFORMACE 0 SEKVENCI id. Č. 6:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 20 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 6:

Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys

10 15

Pro Asn Thr Leu (2) INFORMACE O SEKVENCI id. č. 7:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 7:

Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile 15 10 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI id. Č. 8:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 36 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 8:

Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys

10 (2) INFORMACE O SEKVENCI id. č. 9:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 10 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 1:

Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys

10 (2) INFORMACE O SEKVENCI id. Č. 10:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 10:

Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gin Asn

10 15

Gin • · (2) INFORMACE O SEKVENCI id. č. 11:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 11:

Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gin Asn 15 10 15 (2) INFORMACE 0 SEKVENCI id. č. 12:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 12:

Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp Gin

10 (2) INFORMACE O SEKVENCI id. č. 13:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 13 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 13:

Leu His Lys Lys Ala Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp 15 10 (2) INFORMACE O SEKVENCI id. Č. 14:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 23 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 14:

Thr Ala Asp Cys Lys Ile Lys Pro Asn Thr Leu His Lys Lys Ala

10 15

Ala Glu Thr Leu Met Val Leu Asp 20 • · • · (2) INFORMACE O SEKVENCI id. č. 15:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 30 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 15:

Arg 1

Thr

Asn

Glu

His 5

Thr

Ala

Asp

Cys

Lys 10

Ile

Lys

Pro

Asn

Thr 15

Leu

His

Lys

Lys

Ala 20

Ala

Glu

Thr

Leu

Met 25

Val

Leu

Asp

Gin

Asn 30

(2) INFORMACE 0 SEKVENCI id. č. 16:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 16:

Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile

10 (2) INFORMACE 0 SEKVENCI id. č. 17:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 90 párů nukleotidů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jednovláknová (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 17:

GGG ATC GGA AAA CGA

ACA Thr

AAT GAA CAT

ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA

Gly 1

Ile

Gly Lys

Arg 5

Asn

Glu His

Thr 10

Ala Asp Cys

Lys

Ile 15

Lys

CCG

AAC

ACC

TTG

CAT

AAA

AAA

GCT

GCA

GAG

ACT

TTA

ATG

GTC

Pro

Asn

Thr

Leu

His

Lys

Lys

Ala

Ala

Glu

Thr

Leu

Met

Val

20

25

30

• · • · (2) INFORMACE O SEKVENCI id. č. 18:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 75 párů nukleotidů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jednovláknová (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 18:

GGG ATC

GGA AAA CGA

ACA Thr

AAT GAA CAT ACG GCA GAT

TGT AAA ATT

AAA Lys

Gly 1

Ile

Gly Lys

Arg 5

Asn Glu His

Thr Ala 10

Asp

Cys

Lys

Ile 15

CCG

AAC

ACC

TTG

CAT

AAA

AAA

GCT

GCA

Pro

Asn

Thr

Leu

His

Lys

Lys

Ala

Ala

25 (2) INFORMACE 0 SEKVENCI id. č. 19:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 60 párů nukleotidů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jednovláknová (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 19:

GGG Gly 1

ATC GGA AAA

CGA Arg 5

ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT AAA

Ile Gly

Lys

Thr

Asn Glu

His

Thr 10

Ala

Asp

Cys

Lys

Ile 15

Lys

CCG

AAC

ACC

TTG

Pro

Asn

Thr

Leu

20

(2) INFORMACE O SEKVENCI id. Č. 20:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 45 párů nukleotidů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jednovláknová (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 20:

GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA ATT

Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys Ile

10 15 • ·

(2) INFORMACE O SEKVENCI id. Č. 21:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 42 párů nukleotidů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jednovláknová (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 21:

GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA

Gly Ile Gly Lys Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys 15 10 (2) INFORMACE O SEKVENCI id. č. 22:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: 30 párů nukleotidů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jednovláknová (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 22:

CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT TGT AAA Arg Thr Asn Glu His Thr Ala Asp Cys Lys 15 10 (2) INFORMACE O SEKVENCI id. Č. 23:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) Délka: párů nukleotidů (B) Typ: nukleová kyselina (C) Typ vlákna: jednovláknová (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 23:

GGG ATC GGA AAA CGA ACA AAT GAA CAT ACG GCA GAT

TGT AAA ATT AAA

Gly 1

Ile

Gly

Lys Arg Thr 5

Asn Glu

His

Thr 10

Ala Asp

Cys

Lys

Ile 15

Lys

CCG

AAC

ACC

TTG

CAT

AAA

AAA

GCT

GCA

GAG

ACT

TTA

ATG

GTC

AAA

ATT

Pro

Asn

Thr

Leu

His

Lys

Lys

Ala

Ala

Glu

Thr

Leu

Met

Val

Lys

Ile

25 30

AAA CCG AAC ACC

Lys Pro Asn Thr

Claims (87)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polypeptid, který obsahuje až 30 po sobě jdoucích aminokyselin z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 4a který má aktivitu stimulace kostí, nebo funkčně ekvivalentní homolog.
2. 2. Polypeptid, který obsahuje až 25 po sobě jdoucích aminokyselin z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 5a který má aktivitu stimulace kostí, nebo funkčně ekvivalentní homolog.
3. 3. Polypeptid, který obsahuje až 20 po sobě jdoucích aminokyselin z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 6a který má aktivitu stimulace kostí, nebo funkčně ekvivalentní homolog.
4. 4. Polypeptid, který obsahuje až 15 po sobě jdoucích aminokyselin z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 7 a který má aktivitu stimulace kostí, nebo funkčně ekvivalentní homolog.
5. 5. Polypeptid, který obsahuje až 14 po sobě jdoucích aminokyselin z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 8a který má aktivitu stimulace kostí, nebo funkčně ekvivalentní homolog.
6. 6. Polypeptid, který obsahuje až 10 po sobě jdoucích aminokyselin z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 9a který má aktivitu stimulace kostí, nebo funkčně ekvivalentní homolog.
7. 8. Polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, v nichž po7. Konzervativně substituovaná varianta polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.

   ··· φ φ φ φ φ φφ φ ·φ*· φ φφ • ·Φ φφ • φφ •9 ·Φ nároky změněné lypeptid znamená syntetický polypeptid a aminokyselinová sekvence má molekulovou hmotnost v rozmezí od asi 1000 do 4000.
8. 9. První polypeptid, který obsahuje až 30 po sobě jdoucích aminokyselin, dostatečně duplikativní s druhým polypeptidem, který odpovídá polypeptidu podle nároku 1, takže tento první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.
9. 10. První polypeptid, který obsahuje až 25 po sobě jdoucích aminokyselin, dostatečně duplikativní s druhým polypeptidem, který odpovídá polypeptidu podle nároku 2, takže tento první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.
10. 11. První polypeptid, který obsahuje až 20 po sobě jdoucích aminokyselin, dostatečně duplikativní s druhým polypeptidem, který odpovídá polypeptidu podle nároku 3, takže tento první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.
11. 12. První polypeptid, který obsahuje až 15 po sobě jdoucích aminokyselin, dostatečně duplikativní s druhým polypeptidem, který odpovídá polypeptidu podle nároku 4, takže tento první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.
12. 13. První polypeptid, který obsahuje až 14 po sobě jdoucích aminokyselin, dostatečně duplikativní s druhým polypeptidem, který odpovídá polypeptidu podle nároku 5, takže tento první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.
13. 14. První polypeptid, který obsahuje až 10 po sobě jdoucích aminokyselin, dostatečně duplikativní s druhým polypeptidem, který odpovídá polypeptidu podle nároku 6, takže tento první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních ·· ·· ·· ♦ · ·· ·· ···· · · · · ···· • · · ·· · ···· ······ ·· ··· · · ······ ··· ···« ·· ·· ···· ·· ·· nároky změněné podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.
14. 15. Konzervativně substituovaná varianta polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 9 až 14.
15. 16. Chimerní stimulační faktor kostí, který obsahuje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15.
16. 17. Činidlo pro použití při prevenci a léčení onemocnění souvisejícího s redukcí kostí, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15.
17. 18. Farmaceutický přípravek pro podporu růstu kostí, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15.
18. 19. Způsob zvýšení růstu kostí u savce, vyznačující se tím, že se podává terapeuticky účinné množství polypeptidu, který má aminokyselinovou sekvenci polypeptidu definovaného podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15.
19. 20. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15 pro léčení osteoporosy.
20. 21. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15 pro podporu růstu kostí u savce.
21. 22. Použití polypeptidu, který má sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, pro přípravu léčiva pro použití k podpoře růstu kostí nebo pro léčení osteoporosy.
22. 23. Diagnostická sestava pro stanovení přítomnosti polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, vyznačující se t í m, že obsahuje protilátku proti uvedenému polypeptidu navázanou na reporterový systém, při čemž tento reporterový systém produkuje detegovatelnou odpověď, jestliže se spolu na- nároky změněné váže předem stanovené množství polypeptidů a protilátka.
23. 24. Protilátka, vyznačující se tím, že se váže na polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15 syntetizovaná použitím jednoho z uvedených polypeptidů.
24. 25. Isolovaný DNA fragment, který kóduje expresi kteréhokoliv polypeptidů podle nároků 1 až 15, a DNA, která se liší od tohoto fragmentu díky degeneraci genetického kódu.
25. 26. Vektor, který obsahuje DNA sekvenci, která kóduje expresi kteréhokoliv polypeptidů podle nároků 1 až 15.
26. 27. Způsob výroby polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    a) přípravu DNA fragmentu obsahujícího nukleotidovou sekvenci, která kóduje uvedený polypeptid,

    b) zahrnutí tohoto DNA fragmentu do expresního vektoru, aby se získal rekombinantní DNA fragment, který obsahuje tento DNA fragment a je schopen podléhat replikaci,

    c) transformování hostitelské buňky tímto rekombinantním DNA fragmentem, aby se isoloval transformant, který může exprimovat uvedený polypeptid, a

    d) kultivování tohoto transformantu, kterým se umožní, aby transformant produkoval uvedený polypeptid, a isolování tohoto polypeptidů z výsledné kultivační směsi.
27. 28. Syntetický polypeptid, který má in vivo aktivitu stimulace kostí u savců, který zvyšuje minerální obsah v kostech savců a který má aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z asi

    19 % zachována a až do 83 % zachována při srovnání s aminokyselinovou sekvencí identifikovanou jako sekv. id. č. 1, nebo funkčně ekvivalentní homolog.
28. 29. Syntetický polypeptid, který má in vivo aktivitu stimulace kostí u savců, který zvyšuje minerální obsah v kostech savců a který má aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z asi • · · · nároky změněné

    22 % zachována a až do 69 % zachována při srovnání s aminokyselinovou sekvencí identifikovanou jako sekv. id. č. 1, nebo funkčně ekvivalentní homolog.
29. 30. Syntetický polypeptid, který má in vivo aktivitu stimulace kostí u savců, který zvyšuje minerální obsah v kostech savců a který má aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z asi

    25 % zachována a až do 56 % zachována při srovnání s aminokyselinovou sekvencí identifikovanou jako sekv. id. č. 1, nebo funkčně ekvivalentní homolog.
30. 31. Syntetický polypeptid, který má in vivo aktivitu stimulace kostí u savců, který zvyšuje minerální obsah v kostech savců a který má aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z asi

    28 % zachována a až do 42 % zachována při srovnání s aminokyselinovou sekvencí identifikovanou jako sekv. id. č. 1, nebo funkčně ekvivalentní homolog.
31. 32. Polypeptid podle nároku 28, 29, 30, 31 nebo 32, který má alespoň šest aminokyselin z uvedené sekvence deletováno.
32. 33. Polypeptid podle nároku 28, 29, 30, 31 nebo 32, který má alespoň jedenáct aminokyselin z uvedené sekvence deletováno.
33. 34. Polypeptid podle nároku 28, 29, 30, 31 nebo 32, který má alespoň šestnáct aminokyselin z uvedené sekvence deletováno.
34. 35. Polypeptid podle nároku 28, 29, 30, 31 nebo 32, který má alespoň jednadvacet aminokyselin z uvedené sekvence deletováno.
35. 36. Polypeptid podle nároku 28, 29, 30, 31 nebo 32, který má alespoň dvacet šest aminokyselin z uvedené sekvence deletováno.
36. 37. Polypeptid podle nároku 28, 29, 30, 31 nebo 32, který má molekulovou hmotnost v rozmezí od asi 1000 do 4000.
37. 38. První polypeptid, který obsahuje až 30 po sobě jdoucích nároky změněné aminokyselin, které jsou dostatečně duplikativní s druhým polypeptidem odpovídajícím polypeptidu podle nároku 28, takže tento první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.
38. 39. První polypeptid, který obsahuje až 25 po sobě jdoucích aminokyselin, které jsou dostatečně duplikativní s druhým polypeptidem odpovídajícím polypeptidu podle nároku 29, takže tento první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.
39. 40. První polypeptid, který obsahuje až 20 po sobě jdoucích aminokyselin, které jsou dostatečně duplikativní s druhým polypeptidem odpovídajícím polypeptidu podle nároku 30, takže tento první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.
40. 41. První polypeptid, který obsahuje až 15 po sobě jdoucích aminokyselin, které jsou dostatečně duplikativní s druhým polypeptidem odpovídajícím polypeptidu podle nároku 31, takže tento první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.
41. 42. První polypeptid, který obsahuje až 10 po sobě jdoucích aminokyselin, které jsou dostatečně duplikativní s druhým polypeptidem odpovídajícím polypeptidu podle nároku 32, takže tento první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.
42. 43. Chimerní stimulační faktor kostí, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 28, 29, 30, 31 nebo 3 2.
43. 44. Činidlo pro použití při prevenci a léčení onemocnění souvisejícího s redukcí kostí, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 28, 29, 30, 31 nebo

    32.

    nároky změněné
44. 45. Farmaceutický přípravek pro podporu růstu kostí, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství polypeptidu podle nároku 28, 29, 30, 31 nebo 32.
45. 46. Způsob zvýšení růstu kostí u savce, vyznačující se tím, že se podává terapeuticky účinné množství polypeptidu, který má aminokyselinovou sekvenci polypeptidu definovaného podle nároku 28, 29, 30, 31 nebo 32.
46. 47. Použití polypeptidu podle nároku 28, 29, 30, 31 nebo 32 pro léčení osteoporosy.
47. 48. Použití polypeptidu podle nároku 28, 29, 30, 31 nebo 32 pro podporu růstu kostí u savce.
48. 49. Použití polypeptidu, který má sekvenci podle nároku 28,

    29, 30, 31 nebo 32 pro přípravu léčiva pro použití při podpoře růstu kostí nebo pro léčení osteoporosy.
49. 50. Diagnostická sestava pro stanovení přítomnosti polypeptidu podle nároku 28, 29, 30, 31 nebo 32, vyznačující se t í m, že obsahuje protilátku proti uvedenému polypeptidu navázanou na reporterový systém, při čemž tento reporterový systém produkuje detegovatelnou odpověď, jestliže se spolu naváže předem stanovené množství polypeptidu a protilátka.
50. 51. Protilátka, vyznačující se tím, že se váže na polypeptid definovaný podle nároku 28, 29, 30, 31 nebo 32 a že se syntetizuje použitím tohoto polypeptidu.
51. 52. Isolovaný DNA fragemnt, který kóduje expresi kteréhokoliv polypeptidu podle nároku 28, 29, 30, 31 nebo 32, a DNA, která se liší od tohoto fragmentu díky degeneraci genetického kódu.
52. 53. Vektor, který obsahuje DNA sekvenci, která kóduje expresi kteréhokoliv polypeptidu podle nároku 28, 29, 30, 31 nebo 32.

    nároky změněné
53. 54. Způsob výroby polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 28,

    29, 30, 31 nebo 32, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    a) přípravu DNA fragmentu obsahujícího nukleotidovou sekvenci, která kóduje uvedený polypeptid,

    b) zahrnutí tohoto DNA fragmentu do expresního vektoru, aby se získal rekombinantní DNA fragment, který obsahuje tento DNA fragment a je schopen podléhat replikaci,

    c) transformování hostitelské buňky tímto rekombinantním DNA fragmentem, aby se isoloval transformant, který může exprimovat uvedený polypeptid, a

    d) kultivování tohoto transformantu, kterým se umožní, aby transformant produkoval uvedený polypeptid, a isolování tohoto polypeptidu z výsledné kultivační směsi.
54. 55. Polypeptid vykazující aktivitu stimulace kostí u savců, který obsahuje až 30 po sobě jdoucích aminokyselin vybraný ze sekvence identifikované jako sekv. id. č. 4, sekv. id. č. 5, sekv. id. č. 6, sekv. id. č. 7, sekv. id. č. 8 nebo sekv. id. č. 9, jejich analogy, přičemž aminokyseliny v této sekvenci mohou být substituovány, deletovány nebo přidány, pokud aktivita stimulace kostí u savců odvozená od trojrozměrné struktury sekvence je zachována, a konjugáty každého z těchto polypeptidů nebo jejich analogy.
55. 56. Polypeptid podle nároku 55, při čemž tento polypeptid je v podstatě čistý a aminokyselinová sekvence má molekulovou hmotnost v rozmezí od asi 1000 do 4000.
56. 57. První polypeptid, který obsahuje až 30 po sobě jdoucích aminokyselin, které jsou dostatečně duplikativní s druhým polypeptidem, který odpovídá polypeptidu podle nároku 55 nebo 56, nebo jeho funkčně ekvivalentní homolog, takže tento první polypeptid je kódován DNA, která hybridizuje za selektivních podmínek s DNA kódující druhý polypeptid.
57. 58. Chimerní stimulační faktor kostí, který obsahuje aminoky • · · • · • · · · nároky změněné selinovou sekvenci podle nároku 55 nebo 56.
58. 59. Činidlo pro použití při prevenci a léčení onemocnění souvisejícího s redukcí kostí, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje polypeptid podle nároku

    55, 56, 57 nebo 58.
59. 60. Farmaceutický přípravek pro podporu růstu kostí, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství polypeptidu podle nároku 55, 56, 57 nebo 58.
60. 61. Způsob zvýšení růstu kostí u savce, vyznačující se tím, že se podává terapeuticky účinné množství polypeptidu, který má aminokyselinovou sekvenci polypeptidu definovaného v nároku 55, 56, 57 nebo 58.
61. 62. Použití polypeptidu podle nároku 55, 56, 57 nebo 58 pro léčení osteoporosy.
62. 63. Použití polypeptidu podle nároku 55, 56, 57 nebo 58 pro podporu růstu kostí u savce.
63. 64. Použití polypeptidu, který má sekvenci podle nároku 55,

    56, 57 nebo 58 pro přípravu léčiva pro použití při podpoře růstu kostí nebo pro léčení osteoporosy.
64. 65. Diagnostická sestava pro stanovení přítomnosti polypeptidu podle nároku 55, 56, 57 nebo 58, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku proti uvedenému polypeptidu navázanou na reporterový systém, při čemž tento reporterový systém produkuje detegovatelnou odpověď, jestliže se spolu naváže předem stanovené množství polypeptidu a protilátka.
65. 66. Protilátka, vyznačující se tím, že se váže na polypeptid definovaný v nároku 55, 56, 57 nebo 58 a že se syntetizuje použitím tohoto polypeptidu.

    nároky změněné
66. 67. Isolovaný DNA fragemnt, který kóduje expresi kteréhokoliv polypeptidu podle nároku 55, 56, 57 nebo 58, a DNA, která se liší od tohoto fragmentu díky degeneraci genetického kódu.
67. 68. Vektor, který obsahuje DNA sekvenci, která kóduje expresi kteréhokoliv polypeptidu podle nároku 55, 56, 57 nebo 58.
68. 69. Způsob výroby polypeptidu podle nároku 55, 56, 57 nebo 58, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    a) přípravu DNA fragmentu obsahujícího nukleotidovou sekvenci, která kóduje uvedený polypeptid,

    b) zahrnutí tohoto DNA fragmentu do expresního vektoru, aby se získal rekombinantní DNA fragment, který obsahuje tento DNA fragment a je schopen podléhat replikaci,

    c) transformování hostitelské buňky tímto rekombinantním DNA fragmentem, aby se isoloval transformant, který může exprimovat uvedený polypeptid, a

    d) kultivování tohoto transformantu, kterým se umožní, aby transformant produkoval uvedený polypeptid, a isolování tohoto polypeptidu z výsledné kultivační směsi.
69. 70. Isolovaná DNA sekvence, která kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v kterémkoliv z nároků 1 až 15, 28 až 42 nebo

    55 až 58, nebo její analog, při čemž aminokyseliny v této sekvenci mohou být substituovány, deletovány nebo přidány, pokud aktivita stimulace kostí u savců odvozená od trojrozměrné konformace této sekvence je zachována v polypeptidu obsahujícím tuto aminokyselinovou sekvenci, sekvence, které hybridizují na tuto DNA a kódují aminokyselinovou sekvenci polypeptidu, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců, a DNA, která se odlišuje od této sekvence díky degeneraci genetického kódu.
70. 71. Polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který obsahuje až 30 po sobě následujících aminokyselin ze sekvence identifikované jako sekv. id. č. 4, a jeho konzervativně substituované varianty.

    • · · 9 · · • · · · • · nároky změněné
71. 72. Polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který obsahuje až 25 po sobě následujících aminokyselin ze sekvence identifikované jako sekv. id. č. 5, a jeho konzervativně substituované varianty.
72. 73. Polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který obsahuje až 20 po sobě následujících aminokyselin ze sekvence identifikované jako sekv. id. č. 6, a jeho konzervativně substituované varianty.
73. 74. Polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který obsahuje až 15 po sobě následujících aminokyselin ze sekvence identifikované jako sekv. id. č. 7, a jeho konzervativně substituované varianty.
74. 75. Polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který obsahuje až 14 po sobě následujících aminokyselin ze sekvence identifikované jako sekv. id. č. 8, a jeho konzervativně substituované varianty.
75. 76. Polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který obsahuje až 10 po sobě následujících aminokyselin ze sekvence identifikované jako sekv. id. č. 9, a jeho konzervativně substituované varianty.
76. 77. Isolovaný polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 4, a jeho konzervativně substituované varianty.
77. 78. Isolovaný polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 5, a jeho konzervativně substituované varianty.
78. 79. Isolovaný polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který sestává v podstatě z aminokyselinové sek-

    9 99 9 • · · · nároky kon z ervat ivně jeho vence identifikované jako sekv. id. č. 6, a substituované varianty.
79. 80. Isolovaný polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 7, a jeho konzervativně substituované varianty.
80. 81. Isolovaný polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 8, a jeho konzervativně substituované varianty.
81. 82. Isolovaný polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 9, a jeho konzervativně substituované varianty.
82. 83. Isolovaný polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 4.
83. 84. Isolovaný polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 5.
84. 85. Isolovaný polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 6.
85. 86. Isolovaný polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 7.
86. 87. Isolovaný polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 8.

    · · · · · ·····

    03 · · · · · · · · ···· · ···«·· · · · «·· ·· ·· ···· ·· ·· nároky změněné
87. 88. Isolovaný polypeptid, který vykazuje aktivitu stimulace kostí u savců a který sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence identifikované jako sekv. id. č. 9.