JP3445269B2 - インスリン様成長因子およびアナログの適用による網膜ニューロン障害の治療 - Google Patents

インスリン様成長因子およびアナログの適用による網膜ニューロン障害の治療

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明の分野は網膜ニューロン障害に関する。
インスリン様成長因子（IGF）は、特に発育の間にお
いて（デルコール（D'Ercole）、1987、ジャーナル・オ
ブ・ディベロップメンタル・フィジオロジー（J.Devel.
Physiol.）、9:481−495）、種々の組織における細胞の
増殖を刺激するように作用するポリペプチドとして種々
の動物種で同定されてきた（バクスター（Baxter）ら、
1988、コンパラティブ・バイオケミストリー・アンド・
フィジオロジー（Comp.Biochem.Physiol.）91B:229−23
5;ダウガデイ（Daughaday）ら、1989、エンドクリン・
レビューズ（Endocrine Rev.）10:68−91）。その各々
が約7500ダルトンの分子量を有するIGFはヒト・プロイ
ンスリンに化学的に関連する；すなわち、それらは、
（１）プロインスリンの対応するドメインに高度に相同
であり、（２）より小さくかつ非関連のＣドメインによ
って結合されているＡおよびＢドメインを保有する。カ
ルボキシ末端伸長であるＤドメインもIGFに存在する
が、プロインスリンには見い出されていない。IGFおよ
びインスリン間の機能的相同性も存在する。インスリン
と同様、IGFは、それらが結合する受容体の細胞質ドメ
イン内の特異的チロシン残基のリン酸化を刺激する。
ペプチド特異的抗体をプローブとして用いて、IGF−
ＩおよびIGF−II（時々、「ソマトメジンＣ」および
「ソマトメジンＡ」と呼ばれる）が、哺乳動物中枢神経
系（CNS）を含めた種々の組織に見い出されており;CNS
におけるこれらのポリペプチドをコードするmRNAの存在
はCNSにおける局所的合成を示唆する（バスキン（Baski
n）ら、1988、TINS 11:107−111）。加えて、IGF−III
［または「脳IGF」、またはIGF−Ｉ（４−70）］、後者
の蛋白の３種のＮ−末端アミノ酸残基を欠くIGF−Ｉの
切形形態は、胎児および成人ヒト脳（サラ（Sara）ら、
1986、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acd.Sci.）USA
83:4904−4907）ならびに初乳（フランシス（Franci
s）ら、1988、バイオケミカル・ジャーナル（Biochem.
J.）251−95−103）で見い出されている。
IGF受容体が末梢組織ならびに脳組織から単離されて
いる（ヴァルトビリッヒ・エル・ヤー（Waldbillig,R.
J.）ら、1988、イクスペリメンタル・アイ・リサーチ
（Exp.Eye Res.）47:587−607;マッサーグ・ジェイ（Ma
ssague,J.）およびエム・ピイ・チェク（M.P.Czech.）1
982、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J.Biol.Chem.）257:5038−5045;レチュラー・エム
・エム（Rechler,M.M.）およびエス・ピイ・ニスレイ
（S.P.Nissley）、1985、エヌ・レブ・バイオロ（Ann.R
ev.Biol.）47:425−442）。細胞膜で見い出されている
受容体は、１のアルファおよび１のベータサブユニット
からなるダイマー、または２つのアルファ／ベータサブ
ユニット対からなるヘテロテトラマーである。IGFは受
容体のダイマー形態に結合するが、機能の活性化はヘテ
ロテトラマー種に結合する際にのみ起こる（トレフソン
・エス・イー（Tollesfsen,S.E.）ら、1991、バイオケ
ミストリー（Biochemistry）30−48−54）。末梢および
脳組織から単離されているIGF受容体は、そのアルファ
サブユニットの分子量が異なり（ヴァルトビリッヒ・エ
ル・ヤー（Waldbillig,R.J.）ら、1988、イクスペリメ
ンタル・アイ・リサーチ（Exp.Eye Res.）47:587−60
7）、脳組織内においてさえ、ニューロン細胞から単離
されたIGF受容体はグリア細胞から単離されたものとは
異なる（バーゲス・エイ・ケイ（Burgess,S.K.）ら、19
87、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem.）262:1618−1622）。これらの相違が機
能または結合特異性の変化に関連するか否かは知られて
いない。最後に、欧州特許出願第86850417.6号はヒト胎
児膜に存在するIGF受容体のもう１つのタイプの証拠を
記載している。
IGF−ＩおよびIGF−IIは、広範囲の罹患細胞タイプの
発育または増殖に対して刺激的影響を与えるようである
（ダウガデイ（Daughaday）ら、前掲）。IGF、またはそ
のある種のポリペプチド断片での処理は、骨の修復およ
び置換療法として（欧州特許出願第88303855.6号）、制
癌性薬剤のある種の有害な副作用に抗する手段として
（特願昭63−196524号）、およびウシおよび他の農業動
物における乳生産および肉生産を増加させる手段として
（ラルソン（Larson）ら、米国特許第4,783,524号）種
々に示唆されている。CNSの種々の部分から、および末
梢神経系から得られた細胞に対するIGFの効果が研究さ
れている（アイゼンマン（Aizenman）ら、1987、ブレイ
ン・リサーチ（Brain Research）406:32−42;フェロウ
ズ（Fellows）ら、1987、ソサイェティ・オブ・ニュー
ロサイエンシズ（Soc.Neurosci.）アブストラクト13:16
15;オニファー（Onifer）ら、1987、ソサイェティ・オ
ブ・ニューロサイエンシズ（Soc.Neurosci.）アブスト
ラクト13:1615;欧州特許出願第86850417.6号；ボスウェ
ル（Bothwell）、1982、ジャーナル・オブ・ニューロサ
イエンス・リサーチ（J.Neurosci.Res.）8:225−231;レ
チオ−ピント（Recio−Pinto）ら、1986、ジャーナル・
オブ・ニューロサイエンス（J.Neurosci.）6:1211−121
9）。加えて、IGFは未分化ニューロン様細胞の発育に影
響することが示されている。IGFをヒト・神経芽細胞腫
細胞の増殖培地に添加すると、これらの細胞は神経突起
を延ばし、細胞分裂を受けることが観察されている（レ
チオ−ピント（Recio−Pinto）およびイシイ（Ishi
i）、1988、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・
リサーチ（J.Neurosci.Res.）19:312−320;マットソン
（Mattson）ら、1986、ジャーナル・オブ・セル・バイ
オロジー（J.Cell Biol.）102:1949−1954）。
神経組織内において、IGFは神経節細胞の酵素活性を
誘導し（マックモリス（MacMorris）ら、1985、ジャー
ナル・オブ・ニューロケミストリー（J.Neurochem.）4
4:1242−1251）、乏突起膠細胞の分化および発育を誘導
し（マックモリスおよびドゥボイス−ダルク（McMorris
and Dubois−Dalcq）、1988、ニューロサイエンス・リ
サーチ（Neurocsi.Res.）21:199−209）、胚性脳細胞の
増殖、発育および神経突起の外植を支持する（ネイルセ
ン・エフおよびエス・ガメルトフト（Neilsen,F.and S.
Gammeltoft）、1990、FEBSレターズ（Letters）262:142
−144;スブルジックおよびシューベルト（Svrzic and S
chubert）、1990、バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジカル・リサーチ・コミューニケーションズ（Bioche
m.Biophys.Res.Comm.）172:54−60;トレス−アルウァン
（Torres−Alwman）ら、1990、ニューロサイエンス（Ne
uroscience）35:601−608;レチオ−ピント（Recio−Pin
to）ら、1986、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンシ
ズ（J.Neurosci.）6:1211−1219）ことが示されてい
る。
IGFは、水性（トリパシィ（Tripathi）ら、1991、デ
ブ・ドラッグ・レス（Dev.Drug.Res.）22:1−23）およ
びガラス状体液（グラント（Grant）ら、1991、ダイア
ベーテス（Diabetes）35:416−420）中における成人眼
の発育で共に見い出されている。ヨウ素標識ペプチドを
用いるラジオオートグラフィーの研究により、ブドウ膜
管、脈絡膜、水晶体、強膜および網膜内のIGF結合部位
が明らかにされた（バッサス（Bassas）ら、1989、エン
ドクリノロジー（Endocrinology）125:1255−2320;バス
ネットおよびビーベ（Bassnett and Beebe）、1990、イ
ンベスト・オフサルモル・ビス・サイ（Invest.Ophthal
mol.Vis.Sci.）31:1637−1643;ウァルドビリッヒ（Wald
billig）ら、1990、インベスト・オフサルモル・ビス・
サイ（Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.）31:1015−102
2）。成人の網膜において、IGF−Ｉ結合部位は、棹状体
外部セグメントを含めた、核層、および光受容体領域に
特異的に位置しているらしいが（オクラント（Ocrant）
ら、1989、エンドクリノロジー（Endocrinology）125:2
407−2413;ウァルドビリッヒ（Waldbillig）ら、1989、
エクスプ・アイ・レス（Exp.Eye.Res.）47:587−607;ジ
ック（Zick）ら、1987、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）262:10259−1026
4）、IGF−II受容体に免疫学的に関連する蛋白は網膜色
素上皮細胞で証明されている（オクラント（Ocrant）
ら、1989、エンドクリノロジー（Endocrinology）125:2
407−2413）。IGF−ＩおよびIGF−II mRNAレベルは、眼
の網膜内で最高である（ダニアスおよびスチリアノポウ
ロウ（Danias and Stylianopoulou）、1990、カル・ア
イ・レス（Curr.Eye Res.）9:379−386）。しかしなが
ら、眼におけるIGFの機能は未知であり、網膜におけるI
GF結合部位は十分に特徴付けされていない。従って、こ
れらの部位が現実にIGF受容体として機能するか否か、
すなわち、それらが生物学的応答を媒介するか否かはま
だ知られていない。
IGF−Ｉがカリウムについての膜の透過性に影響し
（ビーベ（Beebe）ら、1986、プログ・デブ・バイオル
（Prog.Dev.Biol.）パートA:365−369;パルメーレおよ
びビーベ（Parmelee and Beebe）、1986、ジャーナル・
オブ・セリュラー・フィジオロジー（J.Cell Phys.）13
4;491−496）、外部および内部棹状体セグメントはIGF
結合部位を含有すること（ヴァルトビリッヒ（Walbilli
g）ら、1988、エクスペンメンタル・アイ・リサーチ（E
xp.Eye Res.）47:587−607;ジック（Zick）ら、1987、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol.Chem.）262:10259−10264）を確立する結果に基づ
き、IGF−Ｉは光伝達に関与するかも知れないと推測さ
れている。
眼における主要な病理学的発見が新生血管緑内障であ
る糖尿病網膜症に関し、キングら（1985、ジャーナル・
オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J.Clin.I
nvest.）75:1028−1036）は、「現在の研究において、
我々は、受容体、ならびにウシ網膜毛細血管からの内皮
細胞および血管周囲細胞に対する、およびウシ動脈から
の内皮細胞および平滑筋細胞に対するインスリン様成長
因子（IGF−Ｉ）の成長促進効果および増殖刺激効果（M
SA、およびIGF−II）を特徴付け」、「これらのデータ
は、血管細胞はインスリンおよびIGF受容体を有する
が、これらのホルモンに対する異なる応答を有する。網
膜毛細血管と大きな動脈の間の生物学的応答におけるこ
れらの相違は、糖尿病性ミクロ−およびマクロ血管障害
の病因を理解する手掛かりを提供し得る。」と述べてい
る。加えて、グラント（Grant）ら（1986、ダイアベー
テス（Diabetes）35:416−420）は、「重症の血管新生
を持つほとんどの糖尿病患者のガラス体中のIGF−Ｉの
濃度は、かくして、いくつかの系における細胞の分化お
よび増殖を刺激することが知られている範囲にある。そ
れらが、眼においてそうであるか否か、かくして、網膜
障害に寄与するか否かは解決されるべく残っている。」
と述べている。
発明の概要 １の態様において、本発明は、以下の物質:IGF−I;IG
F−Ｉの機能的誘導体;IGF−II;またはIGF−IIの機能的
誘導体のうちの少なくとも１つの有効量を哺乳動物に投
与することにより、該哺乳動物において死滅する危険の
ある網膜ニューロン細胞の生存を促進するする方法をそ
の要旨とする。
IGF−Ｉ、IGF−II、またはIGF−ＩもしくはIGF−IIの
機能的誘導体を投与する好ましい具体例において、該方
法は、さらに、付加的および／または相乗的効果を生じ
る物質の有効量を哺乳動物に投与することよりなる。相
乗的に作用する物質の２またはそれ以上の組合せを哺乳
動物に投与することができるか、あるいは付加的に作用
する物質の２またはそれ以上の組合せを哺乳動物に投与
することができる。
他の好ましい具体例において、網膜ニューロン細胞は
光受容体細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極性細
胞、または神経節細胞である。
さらに他の好ましい具体例において、該方法は、損
傷、加齢および／または病気の影響を受けている網膜ニ
ューロン組織の治療についての療法の意味で用いられ、
ここに損傷なる語は、その結果、光退化、外傷、軸索切
断、神経毒−興奮性退化または虚血性ニューロン退化の
ごとき網膜退化となる損傷を含むが、それらに限定され
るものではなく、また、病気なる語は遺伝性網膜ジスト
ロフィー、糖尿病網膜障害、アルツハイマー病、小児悪
性大理石骨病、セロイド脂褐素症または胆嚢うっ滞のご
ときいずれかの感染性または非感染性病を包含する広い
語であるが、それらに限定されるものではない。
IGF−Ｉの機能的誘導体を投与する好ましい具体例に
おいて、IGF−IIIまたは脳IGFとしても知られているIGF
−Ｉ（４−70）（配列番号２）が好ましいIGF−Ｉ誘導
体である。IGF−IIの機能的誘導体を投与する場合、IGF
−II（54−67）（配列番号13）が好ましいIGF−II誘導
体である。該物質を神経伝達物質促進剤および／または
その誘導体と組み合わせて投与することもできる。
本発明の方法で投与されるIGF−Ｉ、IGF−II、または
その機能的誘導体を化学的に修飾し、血液−網膜関門を
横切ってのこれらのポリペプチドの輸送を増加させるこ
とによって、例えば、脂質親和性を増加させ、糖鎖付加
を変更し、あるいは正味の正電荷を増加させるポリペプ
チドの修飾によってその効果を増大させることができ
る。
また、本発明は、滴びんでその一端を閉じた化学的に
不活性な容器または溶液の受容者の眼に当該容器からの
溶液の液滴を移す他の器具内に含有された、眼内投与用
の添加剤と共に、IGF−ＩまたはIGF−II、またはその機
能的誘導体、例えばIGF−Ｉ（４−70）（配列番号
２）、またはIGF−II（54−67）（配列番号13）を含有
する溶液からなる組成物をその要旨とする。また、本発
明は、当該インプラントからの溶液を受容者の眼へ移行
させるために受容者に移植される化学的に不活性な容
器、例えば、インプラント、例えば、移植されたディス
ク内に含有された、眼内投与用の添加剤と共に、IGF−
ＩまたはIGF−II、またはその機能的誘導体、例えば、I
GF−Ｉ（４−70）（配列番号２）、またはIGF−II（54
−67）（配列番号13）を含有する溶液からなる組成物を
その要旨とする。
本発明は、眼内投与用の添加剤と共に、IGF−Ｉまた
はIGF−II、またはその機能的誘導体、例えば、IGF−Ｉ
（４−70）（配列番号２）、またはIGF−II（54−67）
（配列番号13）を含有する軟膏からなる組成物をその要
旨とする。
本発明の方法の好ましい具体例として、機能的誘導体
は、アミノ酸配列CALLETYCATPAKSEC（配列番号17）、ア
ミノ酸配列CTYCATPAKSEC（配列番号57）、アミノ酸配列
CEPYCAPPAKSEC（配列番号58）、およびアミノ酸配列CTY
CAPAKSEC（配列番号59）よりなる群から選択される配列
からなる実質的に純粋なペプチドであり、ここに、Ｎ−
末端システインは共有結合によってＣ−末端システイン
に結合している。
本発明の方法の好ましい具体例として、機能的誘導体
はアミノ酸配列CALLETDYCATPAKSEC（配列番号47）、ア
ミノ酸配列CTDYCATPAKSEC（配列番号48）、およびアミ
ノ酸配列CTDYCAPAKSEC（配列番号49）よりなる群から選
択される配列からなる実質的に純粋なペプチドであり、
ここに、Ｎ−末端システインは共有結合によってＣ−末
端システインに結合している。
本発明の方法の好ましい具体例として、機能的誘導体
は、アミノ酸配列CTYTAPAKSEC（配列番号60）、アミノ
酸配列CALLETYATPAKSEC（配列番号61）、アミノ酸配列C
RRLEMYCAPLKPAKSAC（配列番号62）、アミノ酸配列CGYGS
SSRRAPQTC（配列番号63）、アミノ酸配列CYFNKPTGYGC
（配列番号64）、およびアミノ酸配列CYFNKPTGYGSSSRRA
PQTC（配列番号65）、およびアミノ酸配列CKPTGYGSSSRC
（配列番号66）よりなる群から選択される配列からなる
実質的に純粋なペプチドであり、ここに、Ｎ−末端シス
テインは共有結合によってＣ−末端システインに結合し
ている。
本発明の方法の好ましい具体例として、機能的誘導体
は、アミノ酸配列CDLRRLEMYC（配列番号19）、アミノ酸
配列CCFRSCDLRRLEMYC（配列番号20）、アミノ酸配列CCF
RSC（配列番号22）よりなる群から選択される配列から
なる実質的に純粋なペプチドであり、ここに、該ペプチ
ドは該ペプチドの２つの残基の間の共有結合によって環
化されている。
本発明の方法の好ましい具体例として、機能的誘導体
は、アミノ酸配列TYCATPAKSE（配列番号68）、およびア
ミノ酸配列RRLEMYCAPLKPAKSA（配列番号67）よりなる群
から選択される実質的に純粋なペプチドである。該アミ
ノ酸配列を挟む残基は、IGF−Ｉの天然に存在する配列
に相同、あるいはIGF−IIの天然に存在する配列に相同
であり得る。
本発明の方法の好ましい具体例として、機能的誘導体
は、アミノ酸配列CGCELVDALQFVC（配列番号18）およびC
CFRSCDLRRLEMYC（配列番号20）より実質的になる実質的
に純粋な環化ペプチドであり、ここに該環化ペプチドは
該環化ペプチドの２つの残基の間の少なくとも１つの共
有結合からなる。
本発明の方法の好ましい具体例として、機能的誘導体
は、アミノ酸配列CGCELVDALQFVC（配列番号18）、アミ
ノ酸配列CDLRRLEMYCCPLKPAKSE（配列番号21）、アミノ
酸配列CGPETLC（配列26）、アミノ酸配列CGYGSSSRRCPQT
GIVDEC（配列番号27）、アミノ酸配列CGDRGFYNKPTC（配
列番号28）、およびアミノ酸配列CCPLKPAKSAC（配列番
号29）、およびアミノ酸配列CDLRRLEMYAPLKPAKSAC（配
列番号30）よりなる群から選択される配列からなる実質
的に純粋なペプチドであり、ここに、Ｎ−末端システイ
ンは共有結合によってＣ−末端システインに結合してい
る。
本発明の方法の好ましい具体例として、機能的誘導体
は、アミノ酸配列CGGELVDTLQFVC（配列番号32）、アミ
ノ酸配列CCFRSCDDLALLETYC（配列番号34）よりなる群か
ら選択される実質的に純粋なペプチドであり、ここに、
該ペプチドは該ペプチドの２つの残基の間の共有結合に
よって環化されている。好ましくは、アミノ酸配列を挟
む残基はIGF−Ｉの天然に存在する配列、またはIGF−II
の天然に存在する配列に相同である。
本発明の方法の好ましい具体例として、機能的誘導体
は、アミノ酸配列CGGELVDTLQFVC（配列番号32）およびC
CFRSCDLCLLETYC（配列番号39）より実質的になる実質的
に純粋な環化ペプチドであり、ここに該環化ペプチドは
該環化ペプチドの２つの残基の間の少なくとも１つの共
有結合からなる。
本発明の方法の好ましい具体例として、機能的誘導体
は、アミノ酸配列CDLCLLETYC（配列番号33）、アミノ酸
配列CDLCLLETYCATPAKSE（配列番号35）、アミノ酸配列C
CYRPSETLC（配列番号40）、CRPCSRVSRRSRGIVEEC（配列
番号41）、CGDRGFYFSRPC（配列番号42）、CCTPAKSEC
（配列番号43）およびCDLCLLETATPAKSEC（配列番号44）
よりなる群から選択される配列からなる実質的に純粋な
ペプチドであり、ここに、Ｎ−末端システインは共有結
合によってＣ−末端システインに結合している。
本発明の方法の好ましい具体例として、機能的誘導体
は、アミノ酸配列CATPAKSE（配列番号53）、YCAPAKSE
（配列番号54）、YCAPA（配列番号55）、TYCAPA（配列
番号56）、CAPAKSE（配列番号24）、EALLETYCATPAKSE
（配列番号36）、およびAPSTCEYKA（配列番号38）より
なる群から選択される配列からなる実質的に純粋なペプ
チドからなる。
本発明の方法の好ましい具体例として、機能的誘導体
は、アミノ酸配列YFNKPTGYGSSSRRAPQT（配列番号３）、
アミノ酸配列GYGSSSRRAPQT（配列番号４）、アミノ酸配
列APLKPAKSA（配列番号５）、アミノ酸配列YFNKPTGYG
（配列番号６）、アミノ酸配列SSSRRAPQT（配列番号1
0）、アミノ酸配列PTGYGSSSRRAPQT（配列番号11）、お
よびアミノ酸配列KPTGYGSSSR（配列番号12）よりなる群
から選択される実質的に純粋なペプチドである。好まし
くは、アミノ酸配列を挟む残基はIGF−Ｉの天然に存在
する配列、またはIGF−IIの天然に存在する配列に相同
である。
本発明の方法の好ましい具体例として、機能的誘導体
は、アミノ酸配列YFNKPTGYGSSSRRAPQT−NH2（配列番号
７）、アミノ酸配列SSSRRAPQT−NH2、アミノ酸配列GIVD
ECC（Acm）FRSCLDRRL−NH2（配列番号９）、アミノ酸配
列EPYCAPPAKSE（配列番号69）、アミノ酸配列TYCAPAKSE
（配列番号70）、アミノ酸配列ALLETYSATPAKSE（配列番
号71）、アミノ酸配列ETQCATPAKSE（配列番号72）、お
よびアミノ酸配列GAELVDALQFYSGDRGFYFNKPTG（配列番号
73）よりなる群から選択される配列からなる実質的に純
粋なペプチドである。
本発明の方法の好ましい具体例として、機能的誘導体
は、アミノ酸配列ALLETDYCATPAKSE（配列番号45）、ア
ミノ酸配列TDYCATPAKSE（配列番号46）、およびアミノ
酸配列TDYCAPAKSE（配列番号50）よりなる群から選択さ
れる配列からなる実質的に純粋なペプチドである。
本発明の方法の好ましい具体例として、機能的誘導体
は、アミノ酸配列ALLETYCATPAKSE（配列番号13）、アミ
ノ酸配列TPAKSE（配列番号14）、およびアミノ酸配列SR
VSRRSR（配列番号15）よりなる群から選択される実質的
に純粋なペプチドである。
さらなる具体例として、機能的誘導体は、５および40
個の間のアミノ酸、好ましくは６−25個のアミノ酸を含
有する。機能的誘導体はヨウ素化することができる。
また、機能的誘導体は環状ペプチド、すなわち、５−
40個のアミノ酸残基、または６−25個のアミノ酸残基よ
り実質的になる環状ペプチドである。好ましくは、環状
ペプチドは、そのアミノ酸配列の少なくとも一部として
各IGF−Ｉ、IGF−II、またはIGF−IIIの断片を包含す
る。該環状ペプチドは、当該ペプチドの２つのシステイ
ンの間のジスルフィド結合を包含することができ、該シ
ステインは当該ペプチドの末端または内部いずれかに位
置する。それとは別に、あるいはジスルフィド結合に加
え、該環状ペプチドは、当該ペプチドのアミノおよびカ
ルボキシ末端に間にアミド結合を包含する。好ましい環
状ペプチドは、環化によって誘導されたもの、例えば、
ジスルフィド結合の形成またはアミドの形成によって誘
導されたものを包含するが、それらに限定されるもので
はない。
本発明の方法の好ましい具体例として、機能的誘導体
はレトロ−インベルソ・ペプチド、好ましくは、IGF−
Ｉに相同なレトロインベルソ・ペプチド、もしくはその
断片、またはIGF−IIに相同なレトロインベルソ・ペプ
チド、もしくはその断片である。本明細書中で用いる
「レトロ−インベルソ・ペプチド」とは、少なくとも１
つの位置におけるペプチド結合の方向が逆のもの、すな
わち、当該アミノ酸の側鎖に関してアミノ−およびカル
ボキシ−末端が逆のペプチドをいう。レトロ−インベル
ソ・ペプチドは、Ｌ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸、
またはＬ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸の混合物を含
有できる。
また、機能的誘導体はスクランブルド（scrambled）
ペプチドであり得る。本明細書中で用いる「スクランブ
ルド・ペプチド」は、天然に存在するペプチドまたはそ
の機能的誘導体の同一の残基を含有するが、該残基の配
列が再配列されているペプチドである。
本明細書中に掲げるいずれのIGF−ＩまたはIGF−IIペ
プチドに対しても、最も好ましいのは、ジスルフィド結
合形成に関与しない少なくとも１つのシステイン残基を
含有する線状および環状ペプチドである。天然に存在す
るアラニンがシステインに変化されたいくつかの場合に
おいて、本発明は、少なくとも部分的な活性を有する天
然に存在するアラニンを含有するペプチド、ならびに好
ましい活性を有する置換されたシステインを含有するペ
プチドの双方をその具体例とする。
「相同」とは、２つのポリペプチド分子の間、または
２つの核酸分子の間の配列の同様性をいう。２つの比較
される配列の双方における位置が、同一の塩基またはア
ミノ酸単量体サブユニットによって占められている場
合、例えば、２つのポリペプチド分子の各々における位
置がロイシンによって占められていれば、当該分子はそ
の位置において相同である。２つの配列の間の相同性
は、２つの配列によって占められる一致するまたは相同
の位置の数の関数である。例えば、２つの配列の位置の
10のうち６つが一致または相同であれば、２つの配列は
60％相同である。例えば、アミノ酸配列Leu−gly−val
−ala−gly−proおよびLeu−his−tyr−ala−gly−leu
は50％相同を有する。
実質的に全長のポリペプチドに加えて、本発明はIGF
−Ｉ、IGF−II、またはIGF−IIIポリペプチドの断片も
包含する。本明細書で用いるごとく、ポリペプチドに適
用される「断片」なる語は、通常、少なくとも約５個の
隣接アミノ酸、典型的には、少なくとも約20個の隣接ア
ミノ酸、通常約40個の隣接アミノ酸、好ましくは少なく
とも約60個またはそれ以上の隣接アミノ酸の長さであ
る。IGF Ｉ、II、またはIIIの断片は当業者に公知の方
法によって生成させることができる。
最後の態様において、本発明は実質的に純粋なペプチ
ドを包含し、該ペプチドは、アミノ酸配列ALLETYSATPAK
SE（配列番号71）、アミノ酸配列ETQCATPAKSE（配列番
号72）、およびアミノ酸配列GAELVDALQFYSGDRGFYFNKPTG
（配列番号73）よりなる群から選択される配列からな
る。本発明のいずれのペプチドもヨウ素化され得る。
本明細書中に記載するペプチドは例示するものであっ
て、本発明の方法に有用なペプチドの範囲を限定するも
のと解釈されるべきでない。
処理した網膜ニューロン細胞の生存は、未処理対照の
それよりも大きい程度までの細胞の生存の維持を示す。
網膜ニューロン細胞の優勢は、通常細胞分裂できないと
信じられているので、かかる細胞の生存を促進する薬剤
の能力は、生きた細胞として染色する、または生きたニ
ューロンの他の特性を保有する細胞の直接的計数のごと
き、細胞の相対数を再現性よく示すアッセイによって測
定できる。本発明の方法および組成物は、網膜ニューロ
ン細胞の加齢の病気、または損傷に起因する障害を含め
た、かかる網膜ニューロン細胞の死滅および／または機
能不全によって特徴付けられるヒトまたは他の哺乳動物
の障害を治療するのに有用である。
本発明の他の特徴および利点は、その好ましい具体例
および請求の範囲の記載によって明らかになるであろ
う。
詳細な記載 まず、図面を記載する。
図面 図１は、カルセイン生存アッセイの直線性を示すグラ
フである。
図２は、種々の胚齢における網膜ニューロン培養の集
団に対するIGF−Ｉの生存促進効果を示すヒストグラム
である。
図３は、IGF−Ｉの濃度と胚性網膜からの網膜ニュー
ロン培養の集団の生存との間の関係を示すグラフであ
る。
図４は、IGF−Ｉの濃度と生後網膜からの網膜ニュー
ロン培養の集団の生存との間の関係を示すグラフであ
る。
図５は、網膜ニューロンの培養に対するIGF−Ｉの軸
索再生効果を示す顕微鏡写真を含有する。
図６は、IGF−Ｉが、およびIGF−IIのペプチド断片
（アミノ酸54−67）が網膜ニューロンの集団の生存に与
える効果を示すヒストグラムである。
図７は、Rho42抗体で染色した、IGF−Ｉ処理したまた
は未処理の生後ラット網膜ニューロン培養の写真であ
る。
図８は、細胞−ベースRho42エライサの直線性を示す
グラフである。
図９は、IGF−ＩおよびIGF−II（54−67）が、ラット
網膜ニューロン細胞培養の光受容体サブ集団に与える効
果を示すヒストグラムである。
図10は、網膜ニューロン細胞の生存に対するIGF−
Ｉ、IGF−II、およびIGF−IIIの効果を示すグラフであ
る。
図11は、網膜ニューロンの生存に対するIGFについて
の線状ペプチド誘導体の効果を示すグラフである。
IGF−Ｉ、IGF−IIおよび眼 本発明者らは、出生前および生後網膜ニューロン組織
双方から得られる分離した網膜から調製した細胞の生存
を促進するようIGFが機能することを見い出した。この
知見は、他の成長因子は、出生前または生後双方で、広
いクラスの網膜ニューロン細胞の生存を促進することが
示されていない点で、重要かつ予期せぬことであった。
ペプチド ポリペプチドの「機能的誘導体」は、その分子の断片
またはアナログであって、本明細書中で網膜ニューロン
細胞の生存を促進する能力と定義した所望の生物学的活
性を保有する化合物である。ポリペプチドの「断片」と
は、そのポリペプチドのいずれかのポリペプチドサブセ
ットをいう。ポリペプチドの「アナログ」とは、生物学
的活性を有するが、当該ポリペプチドと比較していくつ
かの構造的相違を有する分子をいう。該アナログは、好
ましくは、親分子と50％を超えるまたはそれと同等の相
同性を持ち、より好ましくは、親分子と75％を超えるま
たはそれと同等の相同性を持つ。ポリペプチドのアナロ
グは、変更されたアミノ酸配列を有し、あるいは通常は
分子の一部でないさらなる化学部位の存在を含有する。
（アシル化、アルキル化、カチオン化、または糖鎖付加
によって導入された）かかる部位は、分子の溶解性、吸
着、輸送、生物学的半減期等を変化させ得る。それとは
別に、あるいはそれに加えて、いくつかの部位は当該分
子の毒性を減じ、当該分子のいずれの望まない副作用も
解消しまたは減少させ得る。かかる効果を媒介できる部
位は、レミントンズ・ファルマシューティカル・サイエ
ンシズ（Remington's Pharmaceutical Sciences）マッ
ク・パブ・カンパニー（Mack Pub.Co.,）、イートン（E
aton）、ペンシルベニア州、1980）。IGF−ＩおよびIGF
−IIのいくつかの誘導体は単独または組み合わせて作用
しないかも知れないが、開示分野の当業者は、後記にて
詳細に説明するごとく、いずれが作用し、いずれが作用
しないかを認識できる。
本発明の範囲内にあるいくつかの化合物は表１に記載
されており、そこでは、IGF−Ｉ、IGF−IIならびにIGF
−ＩおよびIGF−IIの多数の機能的誘導体のアミノ酸配
列（表２で定義する一文字省略で表示）をリストする。
表１のリストは例示するものであり、本発明はそれらの
誘導体に限定されるものではない。これらの誘導体は、
IGF−ＩまたはIGF−II受容体に結合する能力に関し、か
くして本発明のさらなる誘導体の確認に有用な以下の１
またはそれを超える基準に基づいて研究用に選択した：
（１）種間のアミノ酸配列の保存；（２）種間の「保存
的」アミノ酸置換（例えば、同様の形状、電荷または他
の顕著な特性を持つアミノ酸）の存在；（３）放射性ヨ
ウ素化からのチロシン残基の受容体保護（マリおよびル
シ（Maly and Luthi）、1988、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）263:706
8）；（４）当該ポリペプチドの表面における受容体結
合ドメインの位置を示唆する親水性残基の優勢、受容体
相互反応の推定要件；および（５）３次元モデル（例え
ば、ブルンデル（Blundell）ら、1983、フェデレーショ
ン・プロシーディングズ（Fed.Proc.）42:2592−2597）
の疎水性および極性領域の考慮およびそれから可能な結
合部位である領域を確認すること。
ペプチドの生物学的利用性はその脂質親和性またはそ
の正味のイオン電荷に関し得るので、例えば、フェニル
アラニンをペンタフルオロフェニルアラニンで置き換え
る、あるいはカチオン化アルブミンへの接合によるこれ
らのペプチドの適当な修飾（カスティン（Kastin）ら、
1979、バイオケム・ビハブ（Biochem.Behav.）11:713−
716;ラポポルト（Rapoport）ら、1980、サイエンス（Sc
ience）207:84−86;パードリッジ（Pardridge）ら、198
7、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサ
ーチ・コミュニケーションズ（Biochem.Biopys.Res.Com
un.）146:307−313;リーキニン（Riekkinen）ら、198
7、ペブタイズ（Peptides）8:261−265）は、その生物
学的利用性に重要であり得、これらの修飾は本発明の範
囲内のものである。加えて、ペプチドの生物学的利用性
は、プロテアーゼおよびペプチダーゼによる分解の受け
易さ（リトルウッド（Littlewood）ら、1988、ニューロ
ケム・イント（Neurochem.Int,）12:383−389）、これ
らのペプチドの修飾、例えば、その代謝安定性を増加さ
せるためのＤ−アミノ酸でのＬ−アミノ酸の置換もその
治療効果に重要であり、これらの修飾されたペプチドも
本発明の範囲内のものである。
本発明の機能的誘導体は、とりわけ、以下の方法のう
ち１つまたはそれ以上により天然のIGF分子から変化さ
せたペプタドを包含する。
1.当該ペプチドの各末端に存在するアミノおよびカルボ
キシル基の化学的修飾。
2.生物学的に適合する他のアミノ酸残基での天然配列中
のアミノ酸残基の１またはそれ以上のアミノ酸残基の置
換。
3.化学的に修飾され、生物学的に適合する他のアミノ酸
残基での、天然の配列中の１またはそれ以上のアミノ酸
残基の置換。
4.天然配列中の１またはそれ以上のアミノ酸残基の欠
失。
5.化学的修飾を伴うあるいは伴わない、天然配列中の１
または好ましくは一連の数個のアミノ酸残基の反復、ま
たは当該配列の１またはそれ以上のメンバーの置換また
は欠失。
6.環化、アミノ酸の、線状ペプチドのカルボキシル末端
への結合。
7.ジスルフィド、ペプチド、エステルまたは他の共有結
合による、IGF−ＩまたはIGF−II、またはIGF−Ｉもし
くはIGF−IIのいずれかの誘導体と、ポリペプチドまた
は炭水化物のごとき他の分子（例えば、IGF−ＩまたはI
GF−IIのもう１つの断片）との連結。
8.レトロ−インベルソペプチド。
9.「スクランブルド」ペプチド。
また、本発明は、好ましいサブグループとして、配
列:R1−AA1−AA2−AA3−AA4...AAn−R2（式中、AA1、AA
2、AA3、AA4...AAnはIGFまたはIGFサブセットのアミノ
酸残基であるか、あるいは表２で定義したに同じ保存的
置換であり、ｎはIGF−Ｉ機能的誘導体については５な
いし70のいずれかの整数であってIGF−II機能的誘導体
については５−67）を有するIGF機能的誘導体内のもの
を利用する。R1はAA1のアミノ基に付着しており、水
素、低級（C1-6）アルキル、低級カルキルカルボニル、
低級アルケニル、低級アルキニル、ホルミル、低級（C
6-10）アリール、アロイル、アリールオキシカルボニ
ル、アラルキルオキシ−カルボニル、低級アルキルオキ
シカルボニル、ベンゾイル、１−もしくは２−テノイ
ル、ニコチノイル、ジヒドロニコチノイル、Ｎ−アルキ
ルジヒドロイソニコトノイル、イソニイチノイル、およ
びＮ−アルキルジヒドロイソニコチノイルよりなる群か
ら選択される。ペプチドのカルボキシ−末端置換基
（R2）は以下の:OH;NH2、OR3（ここに、R3は低級アルキ
ルまたは低級アリール）;OR3OH（ここに、R3は前記定義
に同じ）；およびNH−R3またはＮ（CH3）R3（ここに、R
3は前記定義に同じ）から選択される。別法として、該
カルボキシル−末端アミノ酸のカルボキシル基は−PO3H
2、−Ｂ（OH）２、−CH2OH、−SO3Hまたは５−テトラゾ
ール基のうちいずれか１つで置換されていてもよい。
当該ペプチド内で出現するアミノ末端アミノ基および
／またはリシン、セリンまたはトレオニン側鎖は、所望
により、ホルミル、アセチル、プロピオニル、および同
様の低級アルキルアシル残基によって、あるいはアリー
ル、またはベンゾイル、テノイル、ニコチノイル、イソ
ニコチノイル、Ｎ−アルキルニコチノイルおよびそのジ
ヒドロおよびテトラヒド誘導体のごとき複素環アシル残
基によってアシル化されていてもよい。かかる修飾は、
当該治療剤の血液−脳関門浸透性を促進することが期待
される（クレベリング（Creveling）ら、1969、エクス
ペリエンシア（Experientia）25:26−27;ボーダー（Bod
or）ら、1981、サイエンス（Science）214:1370−137
2）。
アミノ末端にプロリン、グルタミン酸、アスバラギン
酸を含有するペプチド配列において、該アミノ末端アミ
ノ酸は、所望により、Ｌ−ピログルタミン酸によって置
換されていてもよい。
IGF−ＩまたはIGF−IIの断片ポリペプチドは、各々、
天然の分子よりも少ないアミノ酸残基を含有するIGF−
ＩまたはIGF−II分子のサブセットである。該断片のア
ミノ酸の一部は、生成物ポリペプチドの化学的もしくは
生物学的安定性を改良する、あるいは血液−脳関門を横
切ってその輸送を改良する保存的置換または欠失で置き
換えられていてもよい。好ましくは、30％以下の、より
好ましくは、20％以下のアミノ酸残基が置換または欠失
されている。適当な保存的置換のリストは、蛋白中に見
い出される通常の天然に存在するアミノ酸残基について
の一文字省略に対するキィと共に表２に掲げる。表２で
用いるある種の他の省略をここに定義する;Nleはノルロ
イシンを意味し、Aibはアミノイソ酪酸を意味し、AdaA
はβ−アダマンチルアラニンを意味し、AdaGはα−アダ
マルチングリシンを意味し、homo−ArgはＬ−ホモアル
ギニンを意味し、Ｄ−homo−ArgはＤ−ホモアルギニン
を意味し、Acpはε−アミノカプロン酸を意味し、Chgは
Ｌ−α−シクロヘキシルグリシンを意味し、alla−Thr
はＬ−アロスレオニンを意味する。さらに、Chaはβシ
クロヘキシル−アラニンを意味し、Meはメチル（CH3）
を意味し、Ornはオルニチンを意味し、pyro−Gluはピロ
グルタミル基を意味し、Met（Ｏ）およびＤ−Met（Ｏ）
は、各々、Ｌ−およびＤ−メチオニンから誘導されるス
ルホキシドを意味し、Ｌ−Dopaは３−（3,4−ジヒドロ
キシフェニル）−Ｌ−アラニンを意味し、およびBpaは
４−ベンゾイル−フェニルアラニンを意味する。
用いる記号および省略は、その他は、IUPAC−IUBジョ
イント・コミッション生物化学命名法によって推奨され
ものである（「Nomenclature and Symbolism for Amino
Acids and Peptides）260:14−42）。通常におけるご
とく、これらがペプチド鎖に連結している場合には、こ
れらの同一の記号を用いてアミノ酸の対応する残基を定
義する。アミノ酸残基が異性体形を有する場合は、特に
断りのない限り、表示されているアミノ酸のＬ−形であ
る。通常の表示において、各ペプチドのＮ−末端のアミ
ノ基は左側に出現し、Ｃ−末端のアルボキシ基は右側に
出現する。
前記したアミノ酸置換基以外に、当該ポリペプチドの
化学修飾のごとき、血液−脳関門を横切ってのポリペプ
チドの輸送を改良する他の方法を使用することができ
る。いずれの化学的修飾法においても、例えば、カチオ
ン化または糖鎖付加よりなり得る化学的修飾工程の間
に、受容体結合部位構造を保護し維持するために、ポリ
ペプチドをまずその受容体に付着させる。
環状ペプチド また、本発明は、前記したIGF機能的誘導体内にある
好ましいサブグループとして、好ましくは５〜40個のア
ミノ酸残基の、最も好ましくは６〜25個のアミノ酸残基
の環状ペプチドを利用する。かかるペプチドは、好まし
くは、IGF分子のループドメインの後に形成する。かか
るループは天然のジスルフィド結合形成の結果であって
もよく、一方、他のものは、それが結合を可能とするた
めに、最小のエネルギーのコンフォメーションまた受容
体−誘導コンフォメーションを達成する場合の、蛋白の
折り畳みの結果である。前記したごとく、環化は、線状
ペプチドのアミノおよびカルボキシル末端を結合させ
て、直接的にアミド（ラクタム）結合（実施例14）を形
成させるか、あるいは末端システイン基を使用するジス
ルフィド結合形成によって行うことができる。存在する
いずれの内部システイン基も、好ましくは、環化の前に
選択的にブロックし、よく確立された手法を用いて後に
ブロックを解くことができる（実施例13）。別法とし
て、内部システインは、ペプチドのコンフォメーション
に対して最小の影響を有すると予測されるアミノ酸、例
えば、突然変異誘発走査研究でしばしば用いられるアラ
ニンによって置き換えることができる。
好ましい環状ペプチドの例は、末端システイン基のジ
スルフィド結合を介して以下の単量体ペプチドの環化に
よって誘導されたものを包含する。
アミド結合形成によって形成された環状ペプチドの例
は以下の環状（TYCAPAKSE）（配列番号70）である。
IGF−ＩおよびIGF−II分子のループドメインに基づく
好ましい環状ペプチドの例は以下のものである： 提案されているループペプチド： 1.IGF−Ｉに存在するCysを使用 （１数字は対応する天然に存在するIGF−Ｉにおけるア
ミノ酸の位置を指す） 2.余分なCysの使用 （２＊は天然に存在するIGF−ＩまたはIGF−IIの対応す
る位置からのアミノ酸の欠失を示す） 提案されているループペプチド３ 1.IGF−IIに存在するCysを使用 （３以下のペプチドのいくつかはAla−−−＞Cys置換を
含有する） （４数字は対応する天然に存在するIGF−IIにおけるア
ミノ酸の位置を指す） 2.余分なCysの使用 レトロ−インベルソペプチド ペプチドのレトロ異性体は、側鎖のトポケミストリー
（topochemistry）を維持しつつ当該ペプチドの方向を
逆にしたものと定義される。レトロ−インベルソペプチ
ドにおいて、Ｄ−アミノ酸はＬ−アミノ酸に代えて置き
換えて、天然のペプチドと同様の生物学的応答および受
容体結合についての総じてのコンフォメーションを保持
する（ハイワード（Hayward）ら、ペプタイズ（Peptide
s）1974;第13回欧州ペプチドシンポジウム、ワイ・ウォ
ルマン（Y.Wolman）編、287−297頁；グッドマン（Good
man）ら、アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ（Ac
c.Chem.Res.）12:1−７（1979））。レトロ−インベル
ソペプチドは、はっきりとしたコンフォメーションの制
約を導入し、エンドペプチダーゼによる限定された生分
解を示すことがで示されている。
レトロ Ｄ−ペプチドにおけるアミノ−およびカルボキ
シル末端を逆にすることは、末端基が活性に関与してい
る場合に当該活性を減じる。アミノ−末端に２−アルキ
ルマロナート誘導体および２−アルキル置換gem−ジア
ミンを導入することによってカルボキシ−末端にて修飾
を行うことができる。また、これらの基は、一部のまた
は単一のアミド修飾レトロ−インベルソセグメントを天
然配列に取り込む場合に架橋残基として使用することも
できる。部分的かつ選択された単一のアミド修飾レトロ
ペプチドを用いて生物学的活性を修飾することもでき
る。異なるレトロ−インベルソペプチドの例をここで一
般的配列にて示す。
gAA＝２−置換gem−ジアミンアミノ酸の代わり（surr
ogate） mAA＝２−アルキルマロナートアミノ酸の代わり AA＝設計に基づくＬ−、Ｄ−または通常のアミノ酸 レトロ−インベルソペプチドは、液相セグメント縮合
方法および固相法の双方によって合成される。アラニン
のgem−ジアミノおよびマロニル誘導体を調製する一般
的手法を以下に掲げる。
gAlaの合成： mAlaの合成 提案された配列:IGF−ＩおよびIGF−IIの以下の断片
のレトロ−インベルソペプチドは一般に公知のペプチド
手法によって作製できる。数字は、各々、全長IGF−Ｉ
（配列番号１）、または全長IGF−II（配列番号16）の
対応するアミノ酸位置を示す。
IGF−I: IGF−II ペプチドの使用 後記にて詳細に記載するごとく、本発明は、IGF−Ｉ
およびIGF−IIおよびその機能的誘導体の使用、網膜ニ
ューロン細胞の死滅の増大した危険によって特徴付けら
れる病気または障害の治療用の薬剤として追加的または
相乗的効果を提供し得る他の物質と組み合わせたIGG−
Ｉ、IGF−IIおよびその機能的誘導体の新規な使用を提
供する。本発明の各ポリペプチド（またはポリペプチド
の組合せ）の生物活性は、都合よくは、後記にて詳細に
記載する培養した網膜細胞のアッセイによって検定され
る。このアッセイは、IHG−Ｉ、およびIGF−IIの機能的
誘導体の知られていない生物活性を従前に開示してい
る。当業者によるこのアッセイのルーチン的適用は、IG
F−Ｉのそれに追加的または相乗的な活性を有する他の
分子、ならびにIGF−ＩおよびIGF−IIの治療的に有用な
機能的誘導体を発見するのに使用できる。かくして、本
発明のペプチドは、網膜ニューロン細胞の死滅の増大し
た危険によって特徴付けられる網膜の病気または障害に
悩むヒトおよび他の哺乳動物に投与するのに有用であ
る。
本発明の処方は、非経口投与、例えば、静脈内、皮
下、筋肉内、眼窩内、眼内、点眼、局所、鼻孔内、およ
びエアロゾ投与に有用である。組成物は、前記した網膜
病の治療を提供するために、治療上有効量（例えば、患
者の病理状態を解消または低下させる量）にて、ヒトま
たは他の哺乳動物に投与される。
本明細書中にて提供する化合物は、医薬上許容される
非毒性添加剤および担体と混合することによって医薬組
成物に処方できる。前記したごとく、かかる組成物は、
特に、液体の溶液または懸濁液の形態で非経口投与に；
特に、点眼剤または軟膏の形態で眼への投与用に調製で
きる。
該組成物は、都合よくは、単位投与形態で投与でき、
例えば、レミントンズ・ファルマシューティカル・サイ
エンシズ（Remigton's Pharmaceutical Sciences）に記
載されているごとく、医薬分野でよく知られた方法によ
って調製できる。投与用の処方は、通常の添加剤とし
て、滅菌水またはセーライン、シクロデキストリン、ポ
リエチレングリコールのごときポリアルキレングリコー
ル、植物起源の油、水素化ナフタレン等を含有させるこ
とができる。特に、生体適合性は、生分解性のラクチド
ポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポ
リオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは
ペプチドの徐放を制御するのに有用な添加剤であり得
る。これらのペプチドの他の可能な有用なデリバリ系
は、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポン
プ、インプラント可能な注入系、およびリポソームを包
含する。投与用の処方は、ヒト血清アルブミンのごとき
安定化剤、グリココレートのごとき浸透促進剤を包含す
る。加えて、当該化合物は、プロピルパラベン、無水液
体ラノリン、鉱物油、および白色ペテロラタムのごとき
通常の添加剤と共に活性化合物を含有する軟膏形態の眼
投与に供することができる。
治療用組成物中の当該化合物の濃度は、投与すべき薬
物の用量、使用する化合物の化学的特性（例えば、疎水
性）、および投与経路を含めた多数の因子に依存して変
化する。一般に、本発明の化合物は、非経口または眼投
与のためには、約0.1ないし10％w/v化合物を含有する水
性生理学的緩衝液または軟膏にて供することができる。
典型的な用量範囲は、１日当たり約１μg/kgないし約1g
/kg体重の範囲であり；好ましい用量範囲は１日当たり
約0.01mg/kgないし100mg/kgの範囲である。投与すべき
薬物の好ましい用量は、網膜病の進行のタイプおよび程
度、個々の患者の総じての健康状態、選択した化合物の
相対的生物学的効果、当該化合物の添加剤の処方、およ
びその投与経路のような変数に依存するようである。
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。これら
の実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されるべ
きでなく、それは添付の請求の範囲によってのみ決定さ
れるべきである。
実施例 組換えヒトIGF−ＩおよびIGF−II、ならびにIGF−Ｉ
およびIGF−IIの部分配列からなるいくつかの化学的に
合成したペプチドは、表１に示した商業的な起源から購
入するか、もしくは直接的な、化学合成から得ることが
できる（脚注５−７を参照せよ）。
実施例 1:IGF−Ｉが、網膜ニューロン細胞の生存を促
進するよう作用するかどうかを確認するために、鳥類の
網膜分培養を種々の発育年令の動物から調製し、IGF−
Ｉの存在または不在下で48時間インキュベート後、培養
中に存在する細胞数を測定した。
網膜を、胚芽期のヒナから切開し、酵素消化によって
分解し、サト（Sato）ら、（1979、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ・イン・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、
76:514−517頁）に準じて、成分のはっきりとしたイン
スリン／血清−フリー培地で、in vitro培養した。培養
中の細胞数は、生染色カルセイン−AM（vital stain ca
lcein−AM）を用いて測定した。全ての細胞は、カルセ
イン−AM透過性であるが、生細胞だけがこの化合物を常
法により検知できる蛍光性誘導体に変換できる。最初の
実験において、カルセイン−AM（６μＭ）を異なった網
膜細胞培養に添加し、蛍光レベルと細胞数との間の関係
を測定した。この関係は、図１に示すように直線になる
ことが見い出され、このアッセイが、培養中の細胞の生
存に対する化合物の効果を試験するのに有用であること
を証明している。
次の実験において、IGF−Ｉを最終濃度100nMで、培養
の半分に添加し、処理後48時間における残存細胞数を、
前記カルセイン−AMアッセイを用いて測定した。結果を
図２に示す。IGF−Ｉは、対照の未処理培養に比して、
８、10、12および14日齢の胚から得た網膜ニューロン培
養中の細胞生存を一様に（20−60％だけ）向上させた。
実施例 2:培養中の出生前または出生後の網膜ニューロ
ン細胞の生存を促進するのに要するIGF−Ｉの濃度を測
定するために、以下の実験を行った：網膜ニューロン
は、10日齢のニワトリヒナの胚、あるいは、前記の出生
後の成人期のラット６匹から得た分離した網膜から調製
した。培養を、濃度を増加させる一連のIGF−Ｉの存在
下でインキュベートし、処理後48時間に生存する細胞数
をカルセイン−AMアッセイで測定した。データを図３お
よび図４に示し、IGF−Ｉが、出生前および出生後の両
時期において、投与量依存的に、培養中の網膜ニューロ
ンの寿命を延ばすよう作用することが証明されている。
以前に発表されたデータに基づき、本発明者らの実験に
おけるニューロン細胞の生存を促進するIGF−Ｉ濃度
は、IGF−Ｉが、それ自身の受容体を通して作用すると
いう事実（カーレー（Karey）ら、1988、イン・ビトロ
・セル・ディブ・バイオル（In Vitro Cell.Dev.Bio
l.）、24:1107−1113頁；バラード（Ballard）ら、198
8、バオケミカル・ジャーナル（Biochem.J.）、249:721
−726頁）と一致する。
実施例 3:IGF−Ｉが、網膜神経突起再生に影響するか
どうかを確認するために、分離した網膜から調製したニ
ューロンの集団を、100nM IGF−Ｉ存在または不在下
で、成分のはっきりしたインスリン／血清−フリー培地
中で培養した。培養をIGF−Ｉ処理後２−４日に位相コ
ントラスト顕微鏡で精査した。図５は、IGF−Ｉ処理培
養が、未処理の対照培養よりも神経突起を有する細胞を
多く含有することを証明し、これは、IGF−Ｉが網膜ニ
ューロンにおける軸索再生に影響することを示してい
る。
実施例 4:IGF−ＩおよびIGF−IIの機能的誘導体の存在
下でインキュベートした場合に、網膜の生存を促進しう
るかどうかを確認するために、IGF−ＩおよびIGF−IIの
双方の中に比較的保存されているIGF−IIの線状断片
を、本発明者らのアッセイで試験した。試験片は、IGF
−IIからの14個のアミノ酸の配列（アミノ酸54−67、こ
こに、IGF−IIのアミノ末端のアミノ酸が、番号１であ
る）を含有する。以後IGF−II（54−67）と名付けるこ
の断片を、分離したラット網膜から調製したニューロン
の集団に、最終濃度100μＭで添加し、図６に示すよう
に網膜ニューロン細胞の生存を促進することが判明し
た。
実施例 5:IGF−ＩまたはIGF−II（54−67）が、ラット
網膜ニューロン培養中の光受容体副次集団の細胞の生存
を特異的に促進しうるか否かを確認するために、以下の
実験を行った：桿状光受容体細胞（rod photoreceptor
cell）の表面に発現しているロドプシンの細胞外ドメイ
ン内の抗原性エピトープに結合するモノクローナル抗体
Rho42（モルデイ（Molday）およびマッケンジー（MacKe
nzie）、1983、バイオケミストリー（Biochemistry）、
22:653頁）を、このアッセイに用いた。出生後のラット
網膜ニューロン培養を、IGF−I 100nMの存在または不在
下でインキュベートした。細胞を収穫し、蛍光標識を添
加したRho42と反応させた。スライドを調製し、培養中
の蛍光レベルを、蛍光顕微鏡を用いて定性的に評価し
た。IGF−Ｉ処理した培養が、未処理の培養に比して蛍
光レベルが増加していることを示していることは図７か
ら明らかであり、これはIGF−Ｉが出生後のラット網膜
ニューロン培養中の細胞の光受容体副次集団の細胞の生
存を促進することを証明している。
このアッセイを定量するために、本発明者らは、以下
の細胞ベースRho42エライザ試験（cell−based ELISA t
est）を開発した：異なった細胞数を含有するいくつか
の出生後のラット網膜培養を２−４日間インキュベート
し、次いで、培養を固定し、該Rho42モノクローナル抗
体、もしくは、ミエローマ細胞系P3X6Ag8により分泌さ
れる非特異的なモノクローナル抗体P3の一方で免疫標識
した。抗体の結合は、490nmに最大吸収波長を有する西
洋ワサビペルオキシダーゼで標識した二次抗体および発
色体基質ｏ−フェニレンジアミン（OPD）を用いて検知
した。培養中にて測定した490nmにおける吸光レベル
は、よって該細胞に元来結合する一次抗体量に直接関連
する。図８において、490nmにおける吸収レベルと、各
々の培養中の細胞数との間に直接関係があることが分か
る。加えて、該アッセイは、反応しなかったP3に比し
て、Rho42のみが該細胞と反応したため、光受容体細胞
に特異的である。
次に、ラット網膜ニューロン培養を、IGF−ＩまたはI
GF−II（54−67）の存在下で48時間インキュベートし、
次いで、それらを前記の細胞ベースELISA試験に付し
た。結果を図９に示す。IGF−ＩおよびIGF−II（54−6
7）は、共に、対照の未処理培養に比して20−30％、光
受容体の生存を促進する。
実施例 6:カチオン化は、ポリペプチドの正味の正の電
荷を増加させるために、ポリペプチドの酸性アミノ酸残
基（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基）
の遊離カルボキシ基を修飾することによる反応である。
カチオン化反応は、アルブミンおよび西洋ワサビペルオ
キシダーゼのような大きな分子のマウス線維芽細胞への
取り込みを向上するために用いられている（シェン（Sh
en）ら、1978、プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエス
エイ（Proc.Natl.Acad.USA）、75:1872−1876頁）。ク
マガイ（Kumagai）ら（1987、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、262:1521
4−15219頁）は、血液−脳関門を透過する運搬を測定す
るモデル系であると報告されているウシ脳からの無傷の
微細血管を用い、分離したウシ脳の微細血管によるカチ
オン化アルブミンの取り込みが、天然アルブミンの取り
込みに比して、向上されることを証明した。
遊離カルボキシル基の全体修飾については、該ペプチ
ド（例えば、IGF−Ｉ、IGF−IIまたは機能的誘導体）
と、過剰量のヘキサメチレンジアミン（HMD）（15.5g/g
全タンパク質）とを室温で30分間反応させ、次いで、HM
Dと１−エチル−３［−３−ジメチル−アミノプロピ
ル］カルボジイミド塩酸塩（EDAC）（1.0g/g全タンパク
質）とを室温で３時間共有結合させることができる。未
反応種は、セントリコン−３ MPS−１分離装置（Centr
icon−3MPS−1separation device）（アミコン社（Amic
on）、マサチューセッツ州（MA）、ダンバーズ（Danver
s））またはイオン交換クロマトグラフィーを用いた濾
過によって除去できる。該精製したポリペプチドは、等
電点電気泳動を用いて分析し、カチオン化量を測定でき
る。
もし全体修飾を、細胞表面受容体に結合するリガンド
であるポリペプチドに用い、該修飾が生物的活性を欠い
た分子を生成したら、該カチオン化反応は、該ポリペプ
チドの受容体結合サイトを保護するために、該ポリペプ
チドを適当な受容体にカチオン化の前に予め結合させる
点を除いて前記のように繰り返してできる。この保護処
理は、以下のようにして達成することができる： 初めに、目的のポリペプチド（例えば、IGF−Ｉ）の
受容体を含有する組織、例えば脳を調製する。［別法と
して、組織由来の受容体の代わりに組換え受容体を用い
ることもできる。］大脳皮質を含有する脳組織を成人ラ
ットから切開し、低速で５分間、10mM HEPES、0.5％ BS
A、0.0125％ HEM、0.025％バシトラシンおよび100KIU/m
lアプロチニンからなるpH7.6の50倍量の氷冷緩衝液を含
有するホモジナイザー（例えば、ブリンクマン・ポリト
ロン・ホモジナイザー（Brinkman Polytron homogenize
r））中でホモジナイズする（ボーアンノン（Bohanno
n）ら、1986、エンドクライノロジー（Endocrinolog
y）、119:943−945頁）。ホモジナイズにつづいて、該
組織を7800×ｇで20分間遠心することによって収集し、
10倍量のアッセイ緩衝液に再懸濁する。
次に、該組織を該ポリペプチドリガンドと共に４℃で
２時間インキュベートし、受容体へ結合させる。反応混
合物を室温に移し、前記のHMDおよびEDACを用いてカチ
オン化反応を行う。次いで、該反応混合物を４℃、16,0
00rpmで30秒間、ソボール（Sorvall）RC5B遠心分離器中
のSS34ローターで遠心する。上清を破棄し、ペレットを
ウシ血清アルブミン（1mg/ml）を含むリン酸緩衝液セリ
ンで３回洗浄する。ペレットを100mMの酢酸に再懸濁
し、４℃で10分間インキュベートして、その受容体から
カチオン化ポリペプチドを解離させる。再度、16,000rp
mで遠心し、解離したカチオン化ポリペプチドを含有す
る上清をNaOHでpH中和する。次いで、それを等電点電気
泳動または生物活性用のいずれの適当なアッセイで分析
する。
実施例 7:全体修飾の別法は、前実施例６で記載した受
容体の保護もしくは保護なしに（IGF−Ｉ、IGF−IIまた
はいずれかの機能的誘導体のような）該ポリペプチドの
遊離カルボキシル基の少なくとも１個にポリリジンを結
合させることである。該方法は、シェン（Shen）らの方
法（1978、プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、75:1872−1876頁）に準
じたものである。例えば、ポリリジン、IGF−Ｉおよび
カルボジイミドを1:1:1の比で水または緩衝液中に室温
で３時間にて添加する。修飾タンパク質は、前実施例６
記載のように分離および分析できる。
実施例 8:血液−脳関門の透過性を向上させる、タンパ
ク質のカルボキシル基を修飾する第３番目の方法は、ジ
アゾメタンまたはN,N−ジメチルホルムアミド Ｒアセ
タール（DMFアセタール）とエステルを形成させること
である（ここで、Ｒは、ジメチル、ジエチル、ジブチ
ル、ジベンジル等である）。修飾のこのタイプは、負に
荷電したカルボン酸基から迅速にエステルを形成し、よ
って全体の正電荷が増加する。この修飾からのさらなる
利点は、これらの付加エステル基がポリペプチドの全体
的な脂質親和性を増加でき、in vivoで内在性エステラ
ーゼにより除去されて無傷の成長因子を得ることができ
ることである。この修飾反応は、前実施例６に記載した
受容体の保護もしくは保護なしに、ジアゾメタンまたは
DMFアセタールを該ポリペプチドと溶液中に1:1の割合
で、室温で30分間反応させ、次いで、前実施例６記載の
ように精製および特徴付けることである。
実施例 9:前実施例６記載の受容体を保護もしくは保護
なしに、カチオン化する第４の方法は、血液−脳関門透
過性を向上させる分解性エステル形成と、ならびに透過
後の無傷の成長因子を得ることと、ポリリジンカチオン
化の利点を合わせたものである。ポリリジンは、塩化ベ
ンジルオキシルアセチルとの反応、次いで、水素添加お
よび温和なエステル化反応によって、反応性とできる
（ハスナー（Hassner）ら、1978、テトラヘドロン・レ
ターズ（Tet.Let.）、46:4475−4478頁；ミハラ（Mihar
a）ら、1986、インターナショナル・ジャーナル・オブ
・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ（Int.J.Pe
ptide Protein Res.）、29:141−145頁）。別法とし
て、ポリリジンと反応できるDMFアセタール誘導体を、
エステル結合を用いてポリリジンを遊離カルボキシ基に
結合するのに用いることができる。
実施例 10:さらなるポリペプチド修飾のタイプは、糖
鎖付加：例えば、グルコースおよびシアノホウ水素化ナ
トリウム（NaCNBH3）を用いた還元的アミノ化によるグ
ルコールまたは同様の残渣の導入である。タンパク質の
糖鎖付加は、これらのタンパク質の細胞取り込みを向上
させることが示されており、血管−脳関門透過性の改善
に有用のようである。実施例６記載の受容体の保護もし
くは保護なしでの糖鎖付加の方法は、シュワルツ（Schw
artz）らの方法（1977....）に基づいており、そこで
は、IGF−Ｉ、IGF−IIまたはいずれかの機能的誘導体の
ようなポリペプチドを、pH7.0の200mMリン酸緩衝液中、
モル比1:300:1600にて、グルコースおよびNaCNBH3と、3
7℃で少なくとも24時間合する。未反応物は、実施例６
記載のように、またはレクチンアフィニティークロマト
グラフィーで除去できる。糖鎖付加アルブミンを用いた
以前の研究において、修飾アルブミンは、ラット精巣上
体微細血管によって、天然アルブミンより非常に高い比
率で取り込まれた（ウイリアムス（Williams）ら、198
1、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA）、78:2393−2397頁））。
実施例 11:IGF−Ｉ、IGF−II、およびIGF−IIIが、網
膜ニューロン細胞の生存を促進しうるか否かを確認する
ために、出生後のラット網膜の分離培養を調製し、IGF
の存在または不在下でインキュベートした後に存在する
全細胞数をアッセイした。出生後の６匹のラットから網
膜を切開し、酵素消化によってバラバラにし、成分のは
っきりしたインスリン／血清−フリー培地に、6.25×10
4細胞/cm2の密度で接種した（ボッテンシュタイン（Bot
tenstein）ら、1979、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユ
ーエスエイ（PNAS）、76:514−517頁））。これらの培
養は、異成分系であり、少なくとも５つの独立した網膜
ニューロン細胞副次集団、すなわち、アマクリン、双
極、水平、光受容体および神経節細胞からなる。各々の
IGF 100nMの存在または不在下で培養をインキュベート
した。４日後に残存する合計細胞数を、６μＭの生活性
株カルセイン−AMとインキュベートすることによりアッ
セイした。この化合物は、全ての細胞に取り込まれる
が、生細胞によってのみ蛍光性誘導体に変換できる。細
胞数と相対蛍光との間の関係は直線であり、このアッセ
イが、細胞数の相対差（relative differences）を評価
するのに用いることができることを示している。図10
は、IGF−Ｉ、IGF−IIおよびIGF−III処理培養におい
て、未処理対照培養に認められるよりも、得られた相対
蛍光単位が高いことを示すグラフである。これらのデー
タは、IGF−Ｉ、IGF−IIおよびIGF−IIIが、未処理培養
よりも、生存する出生後のラット網膜ニューロン細胞の
合計数を増加させることを示している。
実施例 12:IGFの線状ペプチド誘導体が、網膜ニューロ
ン細胞の生存を補助できるか否かを確認するために、出
生後のラット網膜の解離培養を調製し、ペプチド（100
μＭ）の存在または不在下でインキュベート後に存在す
る合計細胞数をアッセイした。網膜ニューロン細胞培養
は、実施例11記載のように調製し、生存する合計細胞数
を同様に分析した。ペプチドは、IGF−ＩおよびIGF−II
Iのアミノ酸領域７−30および55−70、ならびにIGF−II
内の領域、アミノ酸54−67から由来したものであった。
ペプチドIGF−II54−67（ALLETYCATPAKSE）（配列番号:
13）;IGF−II（59がＤ−Ｙである54−67）（配列番号:4
5）;IGF−II（60がセリンで置換された54−67）（配列
番号:71）;IGF−II（58−67）（配列番号:68）;IGF−II
（59がＤ−Ｙである58−67）（配列番号:46）;IGF−Ｉ
およびIGF−III（７−30;18が置換されたセリン:GAELVD
ALQFVSGDRGFYFNKPTG）（配列番号:73）;IGF−ＩおよびI
GF−III（55−70;RRLEMYCAPLKPAKSA）（配列番号:67）;
EALLETYCATPAKSE（配列番号:36）;TYCAPAKSE（配列番
号:70）;TdYCAPAKSE（配列番号:50）；ヨウ素化TYCAPAK
SE（配列番号:25）;ETQCATPAKSE（配列番号:72）;EPYCA
PPAKSE（配列番号:69）;YCAPAKSE（配列番号:54）;YCAP
A（配列番号:55）;TYCAPA（配列番号:56）;CATPAKSE
（配列番号:53）;CAPAKSE（配列番号;24）およびAPSTCE
YKA（配列番号:38）で処理された網膜ニューロン培養
は、未処理培養より高い蛍光値を供した。これらのデー
タは、これらのペプチドが、未処理の培養に対して、出
生後のラット網膜ニューロン培養の解離調製物において
生存する合計細胞数を増加させたことを示している（図
11）。
表５は、テストを行って、相対蛍光単位が、未処理培
養で認められるものに対し増加させないペプチドを列挙
している。それらの構造から予め予想できるものではな
いが、本明細書に列挙したペプチドの高比率は、本発明
の方法に有用であり、本明細書に記載したスクリーニン
グ法、および当業者に公知の方法によって確認できる。
本実施例の新規なペプチドは、ペプチド合成分野の当
業者によく知られた方法を用いた固相ペプチド合成法に
より調製した。それらは、1992年４月15日付け出願の譲
受人の共同譲渡された（assignee's coassigned）特許
出願、USSN 07/869,913号に記載され特許請求されてい
る。
実施例 13 パート1: CALLETYCATPAKSEC（配列番号:17）の合成 化合物CALLETYCATPAKSEC（配列番号:17）は、ミリジ
ェン・バイオサーチ・9600型・ペプチド・シンセサイザ
ー（Milligen Bio Search Model 9600 Peptide Synthes
izer）にてペプチド合成の固相法により調製した。
Fmoc−Cys（Ｓ−トリフェニルメチル）−ｐ−アルコ
キシベンジルアルコール樹脂（アドバンスド ケムテッ
ク社（Advanced Chem Tech））0.5gm（0.46mM/gm）を反
応容器に入れ、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシト
リス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロ
ホスフェート（BOP）および１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール（HOBT）を結合剤として用い、1:1 DMF/DCM中
で、 １）Fmoc−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル ２）Fmoc−セリン−ｔ−ブチルエーテル ３）ε−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Fmoc−リジン ４）Fmoc−アラニン ５）Fmoc−プロリン ６）Fmoc−スレオニン−ｔ−ブチルエーテル ７）Fmoc−アラニン ８）Ｓ−アセトアミドメチル−Fmoc−システイン ９）Fmoc−チロシン−ｔ−ブチルエーテル 10）Fmoc−スレオニン−ｔ−ブチルエーテル 11）Fmoc−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル 12）Fmoc−ロイシン 13）Fmoc−ロイシン 14）Fmoc−アラニン 15）Ｓ−トリフェニルメチル−Fmoc−システイン の1.0mM溶液と順次反応させた。最後に、樹脂0.91gmか
ら、粗ペプチド CALLETYC（Acm）ATPAKSEC（配列番号:
17）を、90％ トリフルオロ酢酸、５％ チオアニソー
ル、３％ エタンジチオールおよび２％ アニソールを
含有する脱遮断剤カクテル 10mLで処理することにより
除去した。4.5時間撹拌した後に、該混合物を濾過し、
濾液をアルゴンを用いて乾燥し、無水エーテルを用いて
沈澱させた。得られた粗ペプチドの重量は、0.34gmであ
った。
パート 2: CALLETYC（Acm）ATPAKSEC（配列番号:17）の環化 粗ペプチド（0.3gm）を水（1000mL）に溶解し、水中
の50％水酸化アンモニウムでpHを8.4に調整する。フェ
リシアン化カリウムの希釈溶液（0.01N）を、淡黄色が
消えなくなるまで滴下する。２時間撹拌した後、氷酢酸
で溶液をpH4.6に調整することによって該反応をクエン
チする。過剰量のフェロ−およびフェリシアンイオン
を、陰イオン交換カラムを通すことにより除去する。溶
出液を10mLに濃縮し、該溶液をpH4.6に調整する。内部
のCysからアセトアミドメチル（Acm）保護基を除去する
ため、水／酢酸1:1中の酢酸水銀（II）の0.2M溶液（4m
L）を添加し、該反応混合物を１時間撹拌する。得られ
た混合物を脱塩し、前記のようにHPLCにより精製する。
実施例 14 環状TYCAPAKSE（配列番号:70）の合成 環状TYCAPAKSE化合物（配列番号:70）は、固相法（ミ
リジェン・バイオサーチ社、9600型ペプチド・シンセサ
イザー）および液相法を利用して調製した。
ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂（バケム・バ
イオサイエンス（Bachem Bio Science）社）0.79g（0.9
7mM/gm）を反応容器に入れ、［２−（1H−ベンゾトリア
ゾール−１−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウ
ムテトラフルオロボレート（TBTU）およびHOBTを結合剤
として用い、1:1 DMF/DCM中で、 １）Fmoc−グルタミン酸−γ−ベンジルエステル ２）Fmoc−セリン−ｏ−ベンジルエーテル ３）ε−ベンジルオキシカルボニル−Fmoc−リジン ４）Fmoc−アラニン ５）Fmoc−プロリン ６）Fmoc−アラニン ７）Ｓ−アセトアミドメチル−Fmoc−システイン ８）Fmoc−チロシン−ｏ−ベンジルエーテル ９）Fmoc−ステオニン−ｏ−ベンジルエーテル の3.0mM溶液と順次反応させた。各々の結合段階は、記
載のように行った（実施例19）。粗ペプチド（0.84g）
を、15mLのTEA、10mLのDCMおよび0.5mLの水を含有する
脱遮断カクテルで処理することにより1.82gの樹脂から
除去した。
該ペプチドを30mLのDMFに溶解し、2mLのＮ−メチルモ
ルホリンおよび2.5mLのジフェニルホスホルアジドを含
有するDMF 1000mL溶液に１時間にわたって添加した。
一晩撹拌した後、該溶媒を蒸発させた。該粗生成物を酢
酸エチル（200mL）に溶解し、溶液を２％ クエン酸、
水および３％ 重炭酸ナトリウムで洗浄した。蒸発後に
得られたペプチドを、溶媒として酢酸エチルを用いた活
性チャコール上の10％Pdを用いて１時間水素添加した。
Acm基を、酢酸水銀（II）を用いてペプチドから除去
し、前記したHPLCを用いて精製した。
＊HPLCによる精製法： RT＝保持時間 溶媒Ａ＝0.1％ TFA＊＊を含有する水、Ｂ＝0.1％TEF
を含有するアセトニトリル 液速＝9.5mL/分（ウォーターズ（Waters））および3.
5mL/分（ビダック（Vydac）） I.40分間でＢを０−40％ カラム：ウォーターズ C8 II.40分間でＢを０−10％ カラム：ウォーターズ C8 III.15分間でＢを５−15％ カラム：ビダック C8 IV.10分間でＢを０−10％ カラム：ビダック C8 V.40分間でＢを５−60％ カラム：ビダック C18 VI.60分間でＢを５−60％ カラム：ウォーターズ C18 VII.25分間でＢを５−40％ カラム：ビダック C18 VIII.40分間でＢを10−25％ カラム：ウォーターズ C
8 IX.40分間でＢを10−30％ カラム：ビダック C8 ＊＊TFA＝トリフルオロ酢酸；（Ｉ）＝ヨウ素化 配列リスト （１）一般情報： （ｉ）出願人：セファロン・インコーポレイテッド
（Cephalon,Inc.） （ii）発明の名称：インスリン様成長因子およびアナ
ログの適用による網膜ニューロン障害の治療 （iii）配列数:79 （iv）通信住所： （Ａ）受信人：フィッシュ・アンド・リチャードソ
ン（Fish ＆ Richardson） （Ｂ）ストリート：フランクリン・ストリート225
番（225 Franklin Street） （Ｃ）都市：ボストン（Boston） （Ｄ）州：マサチューセッツ州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:02110−2804 （ｖ）コンピューター判読型（readable form）： （Ａ）媒体型:3,5''ディスケット、1.44Mb （Ｂ）コンピューター:IBM PS/2モデル50Zまたは55
SX （Ｃ）オペレーティング・システム:MS−DOS（バー
ジョン5.0） （Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト（バージ
ョン5.1） （vi）現出願のデータ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）先の出願のデータ： （Ａ）出願番号:07/790,690 （Ｂ）出願日:1991年11月８日 （viii）代理人情報： （Ａ）氏名：クラーク，ポール・ティー（Cleak,Pa
ul T.） （Ｂ）登録番号:30,162 （Ｃ）参照／事件整理番号:02655/012002 （ix）通信情報： （Ａ）電話：（617）542−5070 （Ｂ）ファックス：（617）542−8906 （Ｃ）テレックス:200154 （２）配列番号１についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:70 （Ｂ）形：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:1: （２）配列番号２についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:67 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:2: （２）配列番号３についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:18 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:3: （２）配列番号４についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:12 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:4: （２）配列番号５についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:9 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:5: （２）配列番号６についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:9 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:6: （２）配列番号７についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:18 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （ix）他の情報:Xaaは、カルボキシ末端のアミド基を
有するスレオニン （xi）配列：配列番号:7: （２）配列番号８についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:9 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （ix）他の情報:Xaaは、カルボキシ末端のアミド基を
有するスレオニン （xi）配列：配列番号:8: （２）配列番号９についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:16 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （ix）他の情報:Xaaは、カルボキシ末端のアミド基を
有するロイシン、Zaaは、側鎖に、アセトアミドメチル
置換基を有する （xi）配列：配列番号:9: （２）配列番号10についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:9 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:10: （２）配列番号11についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:14 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:11: （２）配列番号12についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:10 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:12: （２）配列番号13についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:14 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:13: （２）配列番号14についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:6 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:14: （２）配列番号15についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:8 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:15: （２）配列番号16についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:67 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:16: （２）配列番号17についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:16 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:17: （２）配列番号18についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:13 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:18: （２）配列番号19についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:10 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:19: （２）配列番号20についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:15 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:20: （２）配列番号21についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:19 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:21: （２）配列番号22についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:6 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:22: （２）配列番号23についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:5 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:23: （２）配列番号24についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:7 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:24: （２）配列番号25についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:9 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （ix）他の情報:Xaaは、ヨード化チロシンを示す。
（xi）配列：配列番号:25: （２）配列番号26についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:7 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:26: （２）配列番号27についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:67 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:27: （２）配列番号28についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:13 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:28: （２）配列番号29についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:11 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:29: （２）配列番号30についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:19 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:30: （２）配列番号31についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:16 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:31: （２）配列番号32についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:13 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:32: （２）配列番号33についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:10 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:33: （２）配列番号34についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:16 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:34: （２）配列番号35についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:17 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:35: （２）配列番号36についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:15 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:36: （２）配列番号37についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:14 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:37: （２）配列番号38についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:9 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:38: （２）配列番号39についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:15 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:39: （２）配列番号40についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:10 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:40: （２）配列番号41についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:18 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:41: （２）配列番号42についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:12 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:42: （２）配列番号43についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:9 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:43: （２）配列番号44についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:16 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:44: （２）配列番号45についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:14 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （ix）他の情報:Xaaは、チロシンのＤ−異性体を示
す。
（xi）配列：配列番号:45: （２）配列番号46についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:10 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （ix）他の情報:Xaaは、チロシンのＤ−異性体を示
す。
（xi）配列：配列番号:46: （２）配列番号47についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:16 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （ix）他の情報:Xaaは、チロシンのＤ−異性体を示
す。
（xi）配列：配列番号:47: （２）配列番号48についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:12 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （ix）他の情報:Xaaは、チロシンのＤ−異性体を示
す。
（xi）配列：配列番号:48: （２）配列番号49についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:11 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （ix）他の情報:Xaaは、チロシンのＤ−異性体を示
す。
（xi）配列：配列番号:49: （２）配列番号50についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:9 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （ix）他の情報:Xaaは、チロシンのＤ−異性体を示
す。
（xi）配列：配列番号:50: （２）配列番号51についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:8 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （ix）他の情報:Xaaは、ヨー素化チロシンを示す。
（xi）配列：配列番号:51: （２）配列番号52についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:8 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:52: （２）配列番号53についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:8 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:53: （２）配列番号54についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:8 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:54: （２）配列番号55についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:5 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:55: （２）配列番号56についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:6 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:56: （２）配列番号57についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:12 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:57: （２）配列番号58についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:13 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:58: （２）配列番号59についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:11 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:59: （２）配列番号60についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:11 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:60: （２）配列番号61についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:15 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:61: （２）配列番号62についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:18 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:62: （２）配列番号63についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:14 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:63: （２）配列番号64についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:11 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:64: （２）配列番号65についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:20 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:65: （２）配列番号66についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:12 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:66: （２）配列番号67についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:16 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:67: （２）配列番号68についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:10 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:68: （２）配列番号69についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:11 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:69: （２）配列番号70についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:9 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:70: （２）配列番号71についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:14 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:71: （２）配列番号72についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:11 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:72: （２）配列番号73についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:24 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:73: （２）配列番号74についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:12 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:74: （２）配列番号75についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:10 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:75: （２）配列番号76についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:14 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:76: （２）配列番号77についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:5 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:77: （２）配列番号78についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:9 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:78: （２）配列番号79についての情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長:11 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：測定されず （Ｄ）トポロジー：測定されず （xi）配列：配列番号:79: 他の具体例も、以下に挙げる請求の範囲の範囲のもの
である。
フロントページの続き (72)発明者 ルイス，マイケル・イー アメリカ合衆国ペンシルベニア州19382、 ウエスト・チェスター、サーベル・ロー ド1007番 (72)発明者 イクバル，モハメッド アメリカ合衆国ペンシルベニア州19355、 マルバーン、グラブ・ロード54番 (56)参考文献 国際公開90／014838（ＷＯ，Ａ１) 今堀 和友ら 監修，生化学辞典，株 式会社 東京化学同人，1989年 ９月 １日，第１版第10刷，第1287頁 Ｈ．Ａ．ＨＡＮＳＳＯＮ ｅｔ ａ ｌ．，Ａｃｔａ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃ ａｎｄ．，1986年，Ｖｏｌ．126，ｐ. 609−614 Ｄａｎｉａｓ Ｊ．ｅｔｌ ａｌ．, Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．，1990年, Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．４，ｐ．379−386 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61L 27/00 A61K 38/22 A61P 27/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】IGF−Ｉ、IGF−IIまたはIGF−IIIを含む、
    網膜退化を治療するための医薬組成物。
  2. 【請求項２】該網膜退化が、光退化、外傷、軸索切断、
    神経毒−興奮性退化、虚血性ニューロン退化、遺伝性網
    膜ジストロフィー、糖尿病網膜障害、アルツハイマー病
    関連、小児悪性大理石骨病、セロイド脂褐素症または胆
    嚢うっ滞である請求項１記載の医薬組成物。
  3. 【請求項３】該網膜退化が光受容体細胞についてのもの
    である請求項１または２記載の医薬組成物。
  4. 【請求項４】IGF−Ｉ、IGF−IIまたはIGF−IIIを含有す
    る、眼への移植に適したインプラント。
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Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6310040B1 (en) 1991-11-08 2001-10-30 Cephalon, Inc. Treating retinal neuronal disorders by the application of insulin-like growth factors and analogs
JPH09509140A (ja) * 1993-11-15 1997-09-16 セルトリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 神経学的障害の治療方法
US5712249A (en) * 1994-09-08 1998-01-27 Ciba-Geigy Corporation Use of insulin-like growth factors I and II for inhibition of inflammatory response
WO1996007744A1 (en) * 1994-09-08 1996-03-14 Chiron Corporation A method of improved production of insulin-like growth factor
JP3191038B2 (ja) 1996-06-26 2001-07-23 輝夫 西田 眼科用医薬組成物
WO2000053760A2 (en) * 1999-03-12 2000-09-14 Genentech, Inc. Method of preventing the death of retinal neurons and treating ocular diseases
US6514937B1 (en) 1997-02-25 2003-02-04 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Method of treating psychological and metabolic disorders using IGF or IGF/IGFBP-3
US6025368A (en) * 1997-02-25 2000-02-15 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Method for treating the symptoms of chronic stress-related disorders using IGF
US6015786A (en) * 1997-02-25 2000-01-18 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Method for increasing sex steroid levels using IGF or IGF/IGFBP-3
EP1005869A4 (en) * 1997-03-24 2004-06-23 Fujisawa Pharmaceutical Co BILE SECRETAGOGUES
US6121416A (en) 1997-04-04 2000-09-19 Genentech, Inc. Insulin-like growth factor agonist molecules
US6420518B1 (en) 1997-04-04 2002-07-16 Genetech, Inc. Insulin-like growth factor agonist molecules
US6331523B1 (en) 1998-03-12 2001-12-18 Genentech, Inc. Method of enhancing the survival of retinal neurons and treating ocular diseases using FGF-5
US6875741B2 (en) 1998-09-02 2005-04-05 Renuka Pillutla Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
US7173005B2 (en) 1998-09-02 2007-02-06 Antyra Inc. Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
DK1141014T3 (da) 1999-01-06 2005-04-11 Genentech Inc Insulinlignende vækstfaktor (IGF) i mutantvariant
AU6391000A (en) * 1999-07-28 2001-02-19 Genentech Inc. Method of preventing the injury or death of retinal cells and treating ocular diseases
GB9928323D0 (en) * 1999-11-30 2000-01-26 Cyclacel Ltd Peptides
US20050245451A1 (en) * 2000-04-05 2005-11-03 Pincus Matthew R Peptides selectively lethal to malignant and transformed mammalian cells
ATE389416T1 (de) 2000-05-16 2008-04-15 Genentech Inc Behandlung von knorpelerkrankungen
AU7511101A (en) * 2000-05-31 2001-12-11 Us Gov Health & Human Serv Use of activity-dependent neurotrophic factor-derived polypeptides for enhancinglearning and memory: pre- and post-natal administration
HUP0500733A3 (en) 2001-02-09 2010-01-28 Genentech Inc Crystallization of igf-1
AU2002303856A1 (en) 2001-05-24 2002-12-03 Neuronz Limited Gpe analogs and peptidomimetics
US7605177B2 (en) 2001-05-24 2009-10-20 Neuren Pharmaceuticals Limited Effects of glycyl-2 methyl prolyl glutamate on neurodegeneration
US7714020B2 (en) 2001-05-24 2010-05-11 Neuren Pharmaceuticals Limited Treatment of non-convulsive seizures in brain injury using G-2-methyl-prolyl glutamate
TWI305778B (en) * 2001-12-03 2009-02-01 Nishida Teruo Peptides of an expressing unit for igf-i minimal activity and their pharmaceutical use
JP4253743B2 (ja) * 2001-12-03 2009-04-15 輝夫 西田 新規ペプチドおよびその医薬用途
EP1841443A4 (en) * 2005-01-11 2012-05-02 Heart Failure Technologies Inc METHOD AND SYSTEM FOR TREATING HEART ERRORS
JP2008538501A (ja) * 2005-04-20 2008-10-30 オークランド ユニサービシーズ リミティド ベシキュリン
US8309057B2 (en) * 2005-06-10 2012-11-13 The Invention Science Fund I, Llc Methods for elevating neurotrophic agents
EP2270039B1 (en) * 2006-03-06 2013-05-29 Caregen Co., Ltd. Peptides having activities of insulin like growth factor-1 and their uses
EP2224961A1 (en) * 2007-11-26 2010-09-08 The Research Foundation of the State University of New York Small molecule cancer treatments that cause necrosis in cancer cells but do not affect normal cells
DK2279210T3 (en) 2008-05-07 2017-07-24 Biomarin Pharm Inc Lysosomal targeting peptides and uses thereof
US9132202B2 (en) 2009-07-17 2015-09-15 Aaron T. Tabor Compositions and methods for genetic modification of cells having cosmetic function to enhance cosmetic appearance
CA2768621C (en) 2009-07-22 2016-04-05 Ipsen Pharma S.A.S. Analogues of insulin-like growth factor-1 (igf-1) having amino acid substitution at position 59
WO2011011073A1 (en) * 2009-07-22 2011-01-27 Ipsen Pharma S.A.S. Site-specific pegylated or site-specific lipidated igf-1 and analogues of igf-1
TWI490371B (zh) 2009-07-28 2015-07-01 Industrie De Nora Spa 電解應用上的電極及其製法以及在電極表面上陽極釋氧之電解法和電冶法
EP2509596B1 (en) 2009-12-08 2019-08-28 Case Western Reserve University Gamma aminoacids for treating ocular disorders
KR101669140B1 (ko) * 2015-04-28 2016-10-26 (주)케어젠 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도
CN111763680A (zh) * 2019-05-22 2020-10-13 杭州杰迪生物科技有限公司 一种人胰岛素样生长因子-i或其类似物的制备方法、编码基因、表达载体及宿主细胞

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5077276A (en) * 1985-08-22 1991-12-31 Gropep Pty Ltd Growth factor
US4783524A (en) 1985-09-17 1988-11-08 Monsanto Company Growth factors
SE8505920D0 (sv) 1985-12-13 1985-12-13 Kabigen Ab New protein and its use
DE3851776T2 (de) 1987-04-28 1995-05-04 Boehringer Mannheim Gmbh Verwendung von IGF-II zur Behandlung von Knochenkrankheiten.
SE8703625D0 (sv) * 1987-09-18 1987-09-18 Kabivitrum Ab New medical use
EP0346429B1 (en) 1987-12-24 1994-12-28 Gropep Pty. Ltd. Peptide analogues of insulin-like growth factor 1 (igf-1) or factor 2 (igf-2)
US5093317A (en) * 1989-06-05 1992-03-03 Cephalon, Inc. Treating disorders by application of insulin-like growth factor
US5652214A (en) * 1989-06-05 1997-07-29 Cephalon, Inc. Treating disorders by application of insulin-like growth factors and analogs
CA2114251C (en) * 1991-08-01 2007-11-06 Peter Gluckman Igf-1 to improve the neural condition
US6310040B1 (en) 1991-11-08 2001-10-30 Cephalon, Inc. Treating retinal neuronal disorders by the application of insulin-like growth factors and analogs

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｄａｎｉａｓ Ｊ．ｅｔｌ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．，１９９０年，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．４，ｐ．３７９−３８６
Ｈ．Ａ．ＨＡＮＳＳＯＮ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，１９８６年，Ｖｏｌ．１２６，ｐ．６０９−６１４
今堀 和友ら 監修，生化学辞典，株式会社 東京化学同人，１９８９年 ９月 １日，第１版第１０刷，第１２８７頁

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