DE69936666T2 - Betacellulin-veränderung - Google Patents

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betacellulin
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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Muteine (im Folgenden manchmal auch als mutierte Moleküle bezeichnet) mit einer geringeren das Epithelzellwachstum fördernden Aktivität (EGF-Aktivität), z.B. für glatte Muskelzellen, wobei die Aktivität zur Differenzierung von Betacellulin (BTC) in Pankreas-β-Zellen (BTC-Aktivität) erhalten bleibt, ebenso wie ein Verfahren zur Herstellung davon etc.
  • Hintergrund und Stand der Technik
  • Humanbetacellulin ist ein Proteinfaktor, der aus 80 Aminosäuren besteht, die aus einem Vorläufer herausgeschnitten werden, der aus 178 Aminosäuren besteht. Die gesamte Aminosäuresequenz wurde identifiziert (Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190:1173 (1993)). Endogenes Betacellulin tritt in extrem niedrigen Mengen auf und ist schwierig als endogenes Betacellulin zu erhalten. Ein Verfahren zur Herstellung unter Verwendung einer rekombinanten Technik wurde jedoch in der japanischen nicht geprüften Patentanmeldung (Kokai) H6-87894 offenbart etc. Betacellulin wurde zuerst als ein Faktor gefunden mit Maus-3T3-Zeltwachstum fördernder Aktivität und es wurde anschließend gefunden, dass es eine das Wachstum von vaskulären glatten Muskelzellen und Netzhautpigmentepithelzellen fördernde Aktivität (EGF-Aktivität) aufweist (Shing et al., Science, 259:1604 (1993)). Betacellulin wirkt auch auf undifferenzierte Zellen in der Pankreas, wobei es deren Differenzierung zu Pankreas-β-Zellen fördert, die Insulin erzeugen (BTC-Aktivität) (Mashima et al., J. Clinic. Invest., 97:1647 (1996)) und wird daher als möglicherweise nützlich als prophylaktisches und therapeutisches Mittel für Diabetes angesehen (z.B. insulinabhängigem Diabetes) ebenso für Pankreasfunktionsstörungen und dgl., die mit Diabetes in Beziehung stehen (Miyagawa et al., Abstracts of the 1997 Japan Diabetes Association Conference, 125).
  • Da Betacellulin jedoch eine solche das Wachstum von vaskulären glatten Muskelzellen und Netzhautpigmentepithelzellen fördernde Aktivität hat, haben sich diese Aktivitäten als Problem in Anwendungen als therapeutisches Mittel für Diabetes erwiesen.
  • Das Potenzial solcher Pharmazeutika könnte daher verbessert werden, wenn die wachstumsfördernde Aktivität für vaskuläre glatte Muskelzellen und dgl. vermindert werden könnte, während die Wirkung zur Förderung der Differenzierung von Pankreas-β-Zellen aufrechterhalten werden könnte, aber solche Betacellulinmuteine sind bisher nicht bekannt.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Als Ergebnis intensiver Forschungen an Betacellulinmuteinen haben die Erfinder die vorliegende Erfindung perfektioniert durch Auffindung und weitere Untersuchungen von Muteinen, bei denen Betacellulinmutationen die Aktivität, die das Wachstum glatter vaskulärer Muskeln und dgl. fördert, reduzieren, während die die Differenzierung von Pankreas-β-Zellen fördernde Aktivität konserviert wird, ohne antigenizitätsbezogene Probleme, wenn sie dem lebenden Körper verabreicht werden. Das bedeutet, die vorliegende Erfindung betrifft Betacellulinmuteine, ein Verfahren, um diese Muteine zu erhalten und dgl.
  • Somit betrifft die vorliegende Erfindung:
    • 1. Ein Betacellulinmutein oder ein Salz davon, wobei die die Differenzierung der Pankreas-β-Zellen fördernde Aktivität konserviert ist und die das Epithelzellwachstum fördernde Aktivität reduziert ist und wobei 1 bis 30 Aminosäurereste vom N-Ende des Betacellulins deletiert sein können und 1 bis 4 Aminosäurereste der ersten bis vierten Aminosäurereste des C-Endes von Betacellulin einschließlich Leu an Position 3 des C-Endes deletiert oder durch andere Aminosäurereste substituiert sein können, wobei das Betacellulin ein Polypeptid ist, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die durch SEQ ID Nr. 35 dargestellt wird.
    • 2. Das Betacellulinmutein oder Salz davon gemäß Abschnitt 1 oben, wobei das Verhältnis von Pankreas-β-Zellendifferenzierung fördernder Aktivität zu Epithelzellwachstum fördernder Aktivität mindestens das Zweifache bezogen auf Betacellulin ist.
    • 3. Das Betacellulinmutein oder Salz davon gemäß dem Abschnitt 1 oben, wobei 1 bis 30 Aminosäurereste am N-Ende des Betacellulins deletiert wurden.
    • 4. Das Betacellulinmutein oder Salz davon gemäß Abschnitt 1 oben, das aus (1) einer Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, (2) einer Aminosäuresequenz, bei der 1 bis 30 Aminosäuren vom N-Ende der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz deletiert wurden, (3) einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist oder (4) einer Aminosäuresequenz, bei der 1 bis 30 Aminosäuren vom N-Ende der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz deletiert wurden, besteht.
    • 5. Das Betacellulinmutein oder Salz davon gemäß Abschnitt 1 oben, das aus (1) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 3 dargestellt oder (2) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 4 dargestellt, besteht.
    • 6. Das Betacellulinmutein oder Salz davon gemäß Abschnitt 1 oben, das aus (1) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 37 dargestellt, oder (2) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 38 dargestellt, besteht.
    • 7. Ein Betacellulinmutein oder Salz davon, wobei die die Differenzierung der Pankreas-β-Zellen fördernde Aktivität konserviert ist und die das Epithelzellwachstum fördernde Aktivität reduziert ist und wobei 1 bis 30 Aminosäurereste vom N-Ende des Betacellulins deletiert wurden und 1 bis 5 Aminosäurereste zwischen den Resten 22 und 23 vom C-Ende des Betacellulins insertiert wurden, wobei das Betacellulin ein Polypeptid ist, das aus der in SEQ ID Nr. 35 dargestellten Aminosäuresequenz besteht.
    • 8. Das Betacellulinmutein oder Salz davon gemäß Abschnitt 7 oben, das die in SEQ ID Nr. 44 dargestellte Aminosäuresequenz enthält.
    • 9. Verfahren zur Herstellung eines Betacellulinmuteins oder Salzes davon gemäß einem der Abschnitte 1 bis 8 oben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Transformanten, die mit rekombinanten Vektoren transformiert wurden, die DNA enthalten, die das Betacellulinmutein gemäß einem der Abschnitte 1 bis 8 oben codiert, gezüchtet werden, um das Betacellulinmutein herzustellen.
    • 10. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Betacellulinmutein oder ein Salz davon gemäß einem der Abschnitte 1 bis 8 oben.
    • 11. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Abschnitt 10 oben, wobei die Zusammensetzung ein prophylaktischer oder therapeutischer Wirkstoff für Diabetes ist.
    • 12. Die Verwendung eines Betacellulinmuteins oder eines Salzes davon gemäß einem der Abschnitte 1 bis 8 zur Herstellung eines prophylaktischen oder therapeutischen Mittels für Diabetes.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Konstruktion eines Expressionsplasmids für ein Betacellulin mit 77 Resten (wobei drei C-terminale Reste deletiert sind);
  • 2 zeigt die Konstruktion eines Expressionsplasmids für ein Betacellulin mit 76 Resten (wobei vier C-terminale Reste deletiert sind);
  • 3 zeigt das Ergebnis der Elektrophorese von Betacellulinmuteinen in Beispiel 7;
  • 4 zeigt die Ergebnisse der zellulären Aufnahme von 3H-Thymidin in Beispiel 8;
  • 5 zeigt Fluoreszenzmikrogramme für Zellen, die in β-Zellen differenziert sind, in Beispiel 9;
  • 6 zeigt die Ergebnisse der die β-Zelldifferenzierung fördernden Aktivität in Beispiel 12;
  • 7 erläutert die Konstruktion eines Expressionsplasmids für ein Betacellulin mit den Resten 2 bis 76 (wobei ein N-terminaler Rest und vier C-terminale Reste deletiert sind);
  • 8 zeigt die Konstruktion eines Expressionsplasmids für ein Betacellulin mit den Resten 24 bis 76 (wobei 23 N-terminale Reste und vier C-terminale Reste deletiert sind);
  • 9 zeigt die Ergebnisse der Gelfärbung nach Elektrophorese in Beispiel 19 und
  • 10 zeigt eine schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmid pTB1976 in Referenzbeispiel 1.
  • Beste Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung
  • Wie oben beschrieben, haben die Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung eine reduzierte oder abgeschwächte EGF-Aktivität, während die intakte BTC-Aktivität konserviert ist.
  • Der Ausdruck "Betacellulin", wie er hier verwendet wird, bedeutet ein Polypeptid mit der im Folgenden, SEQ ID Nr. 35, dargestellten Aminosäuresequenz, wie bei Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190:1173 (1993) beschrieben.
  • Figure 00030001
  • Betacellulinmuteine mit intakter BTC-Aktivität sind solche mit mindestens 20%, bevorzugt mindestens 50% der BTC-Aktivität von Betacellulin.
  • Betacellulinmuteine mit reduzierter EGF-Aktivität sind solche mit kleiner gleich 20% und bevorzugt kleiner gleich 15% der EGF-Aktivität von Betacellulin.
  • Beispiele für Betacellulinmuteine mit verminderter EGF-Aktivität und intakter BTC-Aktivität der vorliegenden Erfindung schließen bevorzugt Betacellulinmuteine oder deren Salze ein, bei denen das Verhältnis von die Pankreas-β-Zellendifferenzierung fördernde Aktivität zu der epithelzellwachstumsfördernden Aktivität mindestens das Zweifache des Verhältnisses bei Betacellulin ist.
  • Spezifische Beispiele für Betacellulinmuteine mit reduzierter EGF-Aktivität und intakter BTC-Aktivität der vorliegenden Erfindung schließen Betacellulinmuteine oder deren Salze ein, bei denen 1 bis 30 Aminosäurereste vom N-Ende des Betacellulins deletiert sein können und 1 bis 4 Aminosäurereste der Aminosäurereste 1 bis 4 vom C-Ende, einschließlich Leu an Position 3 des C-Endes, deletiert oder durch andere Aminosäurereste substituiert sein können. Spezifischere Beispiele schließen die vorher erwähnten Betacellulinmuteine oder dgl. ein, bei denen 1 bis 30 oder 1 bis 20 Aminosäurereste vom N-Ende deletiert sind.
  • Die vorher erwähnte "Substitution durch andere Aminosäurereste", die in dem Ausdruck "Betacellulinmuteine, bei denen Reste durch andere Aminosäurereste substituiert sind" erwähnt ist, kann sich auf irgendeine Art von Aminosäurerest beziehen, mit dem Vorbehalt, dass die Substitution das charakteristische Merkmal des Betacellulinmuteins, das zu einer "reduzierten EGF-Aktivität und intakten BTC-Aktivität" führt, nicht beeinträchtigt. Spezifische Beispiele für "andere Aminosäuren" oben schließen nichtpolare (hydrophobe) Aminosäuren (wie Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin), polare (neutrale) Aminosäuren (wie Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin), Aminosäuren mit einer positiven Ladung (basisch) (wie Arginin, Lysin und Histidin) und Aminosäuren mit einer negativen Ladung (sauer) (wie Asparaginsäure und Glutaminsäure) ein.
  • Im Folgenden sind spezifische Beispiele von "Betacellulinmuteinen", bei denen 1 bis 30 Aminosäurereste am N-Ende des Betacellulins deletiert sein können und 1 bis 4 Aminosäurereste der Aminosäurereste 1 bis 4 vom C-Ende, einschließlich Leu an Position 3, vom C-Ende deletiert oder durch andere Aminosäurereste substituiert wurden, angegeben.
    • (1) Betacellulinmuteine mit der folgenden Aminosäuresequenz bis zu Position 76 vom N-Ende von Betacellulin,
      Figure 00040001
      wobei 1 bis 4 Aminosäurereste der Aminosäurereste 1 bis 4 (Asp Leu Phe Tyr) vom C-Ende, einschließlich Leu an Position 3 vom C-Ende, deletiert oder durch andere Aminosäurereste oder andere Peptidketten substituiert wurden, wie ((1)) Betacellulinmuteine mit der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz:
      Figure 00050001
    • ((2)) Betacellulinmuteine mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz:
      Figure 00050002
    • ((3)) Betacellulinmuteine mit der in SEQ ID Nr. 8 dargestellten Aminosäuresequenz:
      Figure 00050003
    • ((4)) Betacellulinmuteine mit der in SEQ ID Nr. 9 dargestellten Aminosäuresequenz:
      Figure 00060001
    • ((5)) Betacellulinmuteine, bei denen der Aminosäurerest an Position 3 (Leu) vom C-Ende von Betacellulin durch einen anderen Aminosäurerest substituiert ist.
  • Von den obigen sind Betacellulinmuteine mit den in den SEQ ID Nr. 1 und 2 dargestellten Aminosäuresequenzen besonders bevorzugt.
    • (2) Betacellulinpoteine, bei denen die Aminosäurereste 1 bis 30 vom N-Ende von Betacellulin deletiert sein können
      Figure 00060002
  • Das Mutein hat die folgende Aminosäuresequenz von den Resten 41 bis 76 vom N-Ende
    Figure 00060003
    und 1 bis 4 Aminosäurereste der ersten bis vierten Aminosäurereste (Asp Leu Phe Tyr) vom C-Ende, einschließlich Leu an Position 3 vom C-Ende, sind deletiert oder durch andere Aminosäurereste substituiert, bevorzugt
    • (i) Betacellulinmuteine, bei denen der erste Aminosäurerest (Asp) vom N-Ende von Betacellulin deletiert sein kann, das Mutein hat die folgende Aminosäuresequenz vom 2. bis 76. Rest vom N-Ende
      Figure 00070001
      und 1 bis 4 Aminosäurereste der ersten bis vierten Aminosäurereste (Asp Leu Phe Tyr) vom C-Ende, einschließlich Leu an Position 3 vom C-Ende, sind deletiert oder durch andere Aminosäurereste ersetzt;
    • (ii) Betacellulinmuteine, bei denen die Aminosäurereste 1 bis 23 vom N-Ende von Betacellulin deletiert sein können
      Figure 00070002
  • Das Mutein hat die folgende Aminosäuresequenz vom 24. bis 76. Rest vom N-Ende
    Figure 00070003
    und 1 bis 4 Aminosäurereste vom ersten bis vierten Aminosäurerest (Asp Leu Phe Tyr) vom C-Ende, einschließlich Leu an Position 3 vom C-Ende sind deletiert oder durch andere Aminosäurereste oder andere Peptidketten substituiert, bevorzugt
    • ((1)) Betacellulinmuteine mit der in SEQ ID Nr. 4 dargestellten Aminosäuresequenz:
      Figure 00070004
    • ((2)) Betacellulinmuteine mit der in SEQ ID Nr. 3 dargestellten Aminosäuresequenz:
      Figure 00080001
    • ((3)) Betacellulinmuteine mit der in SEQ ID Nr. 13 dargestellten Aminosäuresequenz:
      Figure 00080002
    • ((4)) Betacellulinmuteine mit der in SEQ ID Nr. 14 dargestellten Aminosäuresequenz:
      Figure 00080003
    • ((5)) Betacellulinmuteine, bei denen der dritte Aminosäurerest vom C-Ende (Leu) in Teilpeptiden, die durch die Aminosäuresequenz von Position 31 bis 80 vom N-Ende von Betacellulin dargestellt werden, durch einen anderen Aminosäurerest substituiert ist.
    • ((6)) Betacellulinmuteine mit der in SEQ ID Nr. 37 dargestellten Aminosäuresequenz:
      Figure 00090001
    • ((7)) Betacellulinmuteine mit der in SEQ ID Nr. 38 dargestellten Aminosäuresequenz:
      Figure 00090002
  • Von diesen bevorzugt sind Betacellulinmuteine mit den in den SEQ ID Nr. 3, 4, 37 und 38 dargestellten Aminosäuresequenzen. Betacellulinmuteine mit Aminosäuresequenzen, wie in SEQ ID Nr. 37 und 38 dargestellt, sind bevorzugter. Betacellulinmuteine mit der in SEQ ID Nr. 38 dargestellten Aminosäuresequenz sind am meisten bevorzugt.
  • Von den bevorzugten Beispielen für Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung, die in (1) und (2) oben angegeben sind, schließen besonders bevorzugte Beispiele Betacellulinmuteine mit ((1)) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt, ((2)) einer Aminosäuresequenz, in der die Aminosäuren 1 bis 30 vom N-Ende in der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz deletiert sind, ((3)) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 2 dargestellt, ((4)) einer Aminosäuresequenz, bei der die Aminosäuren 1 bis 30 vom N-Ende in der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz deletiert wurden, ((5)) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 37 dargestellt und ((6)) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 38 dargestellt.
  • Besonders bevorzugt sind Betacellulinmuteine mit ((1)) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt, ((2)) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 2 dargestellt, ((3)) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 3 dargestellt, ((4)) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 4 dargestellt, ((5)) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 37 dargestellt, und ((6)) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 38 dargestellt. Besonders bevorzugt sind Betacellulinmuteine mit der in SEQ ID Nr. 38 dargestellten Aminosäuresequenz.
  • Spezifische Beispiele für Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung, die eine reduzierte EGF-Aktivität und intakte BTC-Aktivität haben, schließen Betacellulinmuteine oder Salze davon ein, bei denen 1 bis 30 Aminosäurereste vom N-Ende von Betacellulin deletiert wurden und 1 bis 5 Aminosäurereste zwischen dem 22. und 23. Aminosäurerest vom C-Ende insertiert wurden.
  • Spezifische Beispiele für "Aminosäuren" in "Betacellulinmuteinen, bei denen solche Aminosäurereste insertiert wurden" schließen nichtpolare (hydrophobe) Aminosäuren (wie Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin), polare (neutrale) Aminosäuren (wie Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin), Aminosäuren mit einer positiven Ladung (basisch) (wie Arginin, Lysin und Histidin) und Aminosäuren mit einer negativen Ladung (sauer) (wie Asparaginsäure und Glutaminsäure) ein. Asparagin, Prolin und Serin sind bevorzugt. Spezifische Beispiele für "Peptidketten" beziehen sich auf Peptidketten mit zwei bis fünf solcher "Aminosäuren", die aneinander gebunden sind und bevorzugt schließen sie Peptidketten ein, die aus 2 bis 4 Aminosäureresten bestehen.
  • Beispiele für "Betacellulin, bei dem 1 bis 30 Aminosäurereste des N-Endes deletiert sein können" schließen (1) Polypeptide mit der in der vorher erwähnten SEQ ID Nr. 35 dargestellten Sequenz, (2) Betacellulinmuteine, bei denen 1 bis 30 Aminosäurereste vom N-Ende deletiert wurden und (3) Betacellulinmuteine, bei denen Aminosäurereste (z.B. 1 bis 5 Aminosäurereste) in die Aminosäuresequenz der Reste 1 bis 30 des N-Endes von Betacellulin insertiert wurden.
  • "Betacellulinmuteine, bei denen 1 bis 30 Aminosäurereste vom N-Ende deletiert wurden" schließen 1) solche ein, bei denen 1 bis 30 Aminosäurereste vom N-Ende des Betacellulins deletiert wurden und 2) solche, bei denen 1 bis 30 Aminosäurereste vom N-Ende von Betacellulin deletiert wurden und andere Aminosäurereste (z.B. 1 bis 5 Aminosäurereste) zugefügt wurden.
  • "Betacellulinmuteine, bei denen 1 bis 30 Aminosäurereste vom N-Ende deletiert sein können und 1 bis 5 Aminosäurereste zwischen dem 22. Aminosäurerest vom C-Ende (d.h. Gln, der 58. Aminosäurerest vom N-Ende in der in SEQ ID Nr. 35 dargestellten Aminosäuresequenz) und dem 23. Aminosäurerest (d.h. Thr, dem 59. Aminosäurerest vom N-Ende der in SEQ ID Nr. 35 dargestellten Aminosäuresequenz) insertiert wurden" sollen Betacellulinmuteine sein, bei denen einige der 1 bis 30 Aminosäurereste vom N-Ende von Betacellulin deletiert sein können und 1 bis 5 Aminosäurereste zwischen dem 22. und 23. Aminosäurerest vom C-Ende insertiert wurden. Spezifische Beispiele schließen ein:
    • ((1)) Betacellulinmuteine, bei denen die Aminosäurereste 1 bis 30 vom N-Ende von Betacellulin deletiert wurden
      Figure 00100001
      und 1 bis 5 Aminosäurereste zwischen dem 22. und 23. Aminosäurerest vom C-Ende insertiert wurden, z.B. ein Betacellulinmutein mit einer in SEQ ID Nr. 44 dargestellten Aminosäuresequenz:
      Figure 00110001
  • Bevorzugte Beispiele für "Betacellulinmuteine" der vorliegenden Erfindung schließen Betacellulinmuteine ein mit der in SEQ ID Nr. 44 dargestellten Aminosäuresequenz.
  • Gemäß der üblichen Art und Weise zur Bezeichnung von Peptiden bezieht sich das linke Ende der Betacellulinmuteine in der vorliegenden Beschreibung auf das N-Ende (aminoterminal, Amino-Ende) und das rechte Ende wird als C-Ende bezeichnet (Carboxylende, carboxyterminal). Das C-Ende dieser Betacellulinmuteine ist gewöhnlich eine Carboxylgruppe (-COOH) oder ein Carboxylat (-COO–), aber das C-Ende kann auch ein Amid (-CONH2) oder ein Ester (-COOR) sein. Beispiele für R in solchen Estern schließen C1-C6-Alkylgruppen, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl oder n-Butyl, C3-C8-Cycloalkylgruppen, wie Cyclopentyl und Cyclohexyl, C6-C12-Arylgruppen, wie Phenyl und α-Naphthyl, Phenyl-C1-C2-Alkyle, wie Benzyl, Phenethyl und Benzhydryl oder C7-C14-Aralkylgruppen, wie α-Naphthyl-C1-C2-Alkyl, wie α-Naphthylmethyl und Pivaloyloxymethylgruppen ein.
  • Die Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung schließen solche ein, denen Met am N-Ende zugefügt wurde.
  • Beispiele für Salze der Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung schließen Salze mit physiologisch annehmbaren Basen (z.B. Alkalimetalle) oder Säuren (organische und anorganische Säuren) ein, insbesondere sind physiologisch annehmbare Säuresalze bevorzugt. Beispiele für solche Salze schließen Salze mit anorganischen Säuren (z.B. Salzsäure, Phosphorsäure, Bromwasserstoffsäure und Schwefelsäure) und Säuren mit organischen Säuren (z.B. Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Citronensäure, Apfelsäure, Oxalsäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure und Benzolsulfonsäure) ein.
  • Die Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung können durch Gentechnik hergestellt werden, wie z.B. in der japanischen nicht geprüften Patentanmeldung (Kokai) H6-87894 beschrieben, oder durch eine Proteasebehandlung, die allgemein bekannt ist, bevorzugt durch eine Carboxypeptidasebehandlung und noch bevorzugter durch eine Behandlung mit Rinderpankreascarboxypeptidase A, von Betacellulin, das durch Kultur von Betatumorzellen erhalten wurde. Sie können auch hergestellt werden gemäß der unten beschriebenen Peptidsynthese. Sie können weiterhin hergestellt werden durch Kultur von Transformanten, die DNA enthalten, die Betacellulinmuteine codiert, wie unten beschrieben.
  • Wenn das Betacellulin aus menschlichen oder Säugetiergeweben oder Zellen hergestellt wird, sollten menschliches oder Säugetiergewebe oder -zellen homogenisiert werden und dann mit Säure oder dgl. extrahiert werden und der Extrakt sollte gereinigt und durch eine Kombination von Aussalzen, Dialyse, Gelfiltration und Chromatographie, z.B. Reverse-Phase-Chromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Affinitätschromatographie, gereinigt und isoliert werden.
  • Peptide können z.B. entweder durch Festphasensynthese oder Flüssigphasensynthese synthetisiert werden. Das bedeutet, Teilpeptide oder Aminosäuren, die die Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung aufbauen können, können mit dem Rest kondensiert werden und Schutzgruppen werden entfernt, wenn das Produkt Schutzgruppen hat, wodurch das Ziel-Betacellulinmutein hergestellt werden kann. Die allgemein bekannten Methoden zur Kondensation und Entfernung von Schutzgruppen schließen die folgenden Methoden (1) bis (5) ein.
    • (1) M. Bodanszky und M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
    • (2) Schroeder und Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
    • (3) Nobuo Izumiya et al., Peptide Synthesis Fundamentals and Experiments, Maruzen (1975)
    • (4) Jimei Yahima und Toshihira Kashiwahara, Basic Biochemical Experiments, Vol. 1, Protein Chemistry IV, 205 (1977)
    • (5) Sequel Development of Medical Drugs, Vol. 14, Peptide Synthesis, Kadokawa Shoten, Herausgeber Jimei Yashima
  • Nach der Reaktion kann das erfindungsgemäße Polypeptid durch eine Kombination von z.B. Lösungsmittelextraktion, Destillation, Säulenchromatographie, Flüssigchromatographie und Umkristallisation gereinigt und isoliert werden. Wenn das entstehende Polypeptid in freier Form ist, kann es in ein geeignetes Salz mit allgemein bekannten Methoden umgewandelt werden. Alternativ kann dann, wenn eine Salzform erhalten wurde, diese in die freie Form mit allgemein bekannten Methoden umgewandelt werden.
  • Kommerziell erhältliche Peptid bindende Harze, die zur Amidbildung geeignet sind, können für Amidformen von Betacellulin verwendet werden. Beispiele für solche Harze schließen Chlormethylharze, Hydroxymethylharze, Benzhydrylaminharze, Aminomethylharze, 4-Benzyloxybenzylalkoholharze, 4-Methylbenzhydrylaminharze, PAM-Harze, 4-Hydroxymethylmethylphenylacetamidmethylharze, Polyacrylamidharze, 4-(2',4'-Dimethoxyphenylhydroxymethyl)phenoxyharze und 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminoethyl)phenoxyharze ein. Solche Harze können zur Kondensation von Aminosäuren mit in geeigneter Weise geschützten funktionellen Seitenkettengruppen und α-Aminogruppen am Harz gemäß verschiedener allgemein bekannter Methoden der Kondensation verwendet werden, je nach Sequenz des vorgesehenen Peptids. Nach der Reaktion wird das Peptid von dem Harz geschnitten, die verschiedenen Schutzgruppen werden gleichzeitig entfernt und eine Reaktion zur Bildung intramolekularer Disulfidbindungen wird je nach Bedarf in hoch verdünnter Lösung durchgeführt, um die Ziel-Amidformen zu erzielen.
  • Obwohl verschiedene aktivierende Reagenzien, die für Peptidsynthese verwendet werden können, zur Kondensation solcher geschützten Aminosäuren verwendet werden können, sind Carbodiimide besonders bevorzugt. Beispiele für Carbodiimide schließen DCC, N,N'-Diisopropylcarbodiimid und N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid ein. Zur Aktivierung mit den obigen können Racemisierungsinhibitoren (z.B. HOBt und HOOBt) und geschützte Aminosäuren direkt dem Harz zugefügt werden oder sie können in Form von den entsprechenden Säureanhydriden oder HOBt-Estern oder HOOBt-Estern dem Harz zugefügt werden nach Aktivierung der geschützten Aminosäuren. Lösungsmittel, die zur Kondensation mit Harzen oder Aktivierung geschützter Aminosäuren verwendet werden, können in geeigneter Weise ausgewählt werden aus Lösungsmitteln, von denen bekannt ist, dass sie zur Peptidkondensation verwendet werden können. Beispiele schließen Säureami de, wie N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid und N-Methylpyrrolidon, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid und Chloroform, Alkohole, wie Trifluorethanol, Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid, tertiäre Amine, wie Pyridin, Ether, wie Dioxan und Tetrahydrofuran, Nitrile, wie Acetonitril und Propionitril, Ester, wie Methylacetat und Ethylacetat, und geeignete Mischungen der obigen ein. Die Reaktionstemperatur kann in geeigneter Weise ausgewählt werden innerhalb des bekanntermaßen verwendbaren Bereichs zur Bildung von Peptidbindungen, der gewöhnlich etwa –20 bis 50°C ist. Aktivierte Aminosäurederivate werden gewöhnlich in einer überschüssigen Menge von 1,5- bis 4-fach verwendet. Wenn Ninhydrinreaktionstests eine ungenügende Kondensation anzeigen, wird die Kondensation wiederholt, ohne die Schutzgruppen zu entfernen, bis eine ausreichende Kondensation erzielt worden ist. Wenn eine wiederholte Reaktion keine ausreichende Kondensation liefert, können Essigsäureanhydrid oder Acetylimidazol verwendet werden zur Acetylierung der nicht umgesetzten Aminosäuren, um einen Einfluss auf nachfolgende Reaktionen zu vermeiden.
  • Beispiele für Schutzgruppen für die Aminogruppen der Aminosäuren des Ausgangsmaterials schließen Z, Boc, tert.-Pentyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, Adamantyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, Formyl, 2-Nitrophenylsulfenyl, Diphenylphosphinothioyl und Fmoc ein. Beispiele für Schutzgruppen für Carboxylgruppen schließen solche ein, bei denen R eine C1-C6-Alkylgruppe, C3-C8-Cycloalkylgruppe oder C7-C4-Aralkylgruppe ist, ebenso wie 2-Adamantyl, 4-Nitrobenzyl, 4-Methoxybenzyl und 4-Chlorbenzyl, Phenacylgruppen und Benzyloxycarbonylhydrazid, tert.-Butoxycarbonylhydrazid und Tritylhydrazid.
  • Die Hydroxylgruppen von Serin und Threonin können z.B. durch Veresterung oder Veretherung geschützt werden. Beispiele für Gruppen, die zur Veresterung geeignet sind, schließen Niedrigalkanoylgruppen, wie Acetyl, Alloylgruppen, wie Benzoyl, und von Kohlenstoff abgeleitete Gruppen, wie Benzyloxycarbonyl und Ethoxycarbonyl ein. Beispiele für Gruppen, die zur Veretherung geeignet sind, schließen Benzyl, Tetrahydropyranyl und tert.-Butylgruppen ein.
  • Beispiele für Schutzgruppen für phenolische Hydroxylgruppen von Tyrosin schließen Bzl, Cl2-Bzl, 2-Nitrobenzyl, Br-Z und tert.-Butyl ein.
  • Beispiele für Schutzgruppen für Imidazole von Histidin schließen Tos, 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl, DNP, Benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt und Fmoc ein.
  • Beispiele für aktivierte Carboxylgruppen in dem Ausgangsmaterial schließen die entsprechenden Säureanhydride, Azide und Aktivester (Ester mit Alkoholen (z.B. Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanomethylalkohol, para-Nitrophenol, HONB, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid und HOBt)) ein. Beispiele für aktivierte Aminogruppen im Ausgangsmaterial schließen die entsprechenden Phosphorsäureamide ein.
  • Methoden zur Entfernung (Eliminierung) von Schutzgruppen schließen die Reduktion in direktem Kontakt in einem Wasserstoffstrom in Gegenwart eines Katalysators, wie Pd-Schwarz oder Pd-Kohlenstoff, Säurebehandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff, Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure, Trifluoressigsäure oder Mischungen davon, basische Behandlung mit Diisopropylethylamin, Triethylamin, Piperidin oder Piperazin oder die Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak ein. Bei der Eliminierungsreaktion durch Säurebehandlung oben, die bei einer Temperatur von –20 bis 40°C durchgeführt wird, ist es wirksam, einen Kationenfänger, wie Anisol, Phenol, Thioanisol, meta-Kresol, para-Kresol, Dimethylsulfid, 1,4-Butandithiol oder 1,2-Ethandithiol zuzufügen. 2,4-Dinitrophenyl, das als Imidazolschutzgruppe für Histidin verwendet wird, kann durch Behandlung mit Thiophenol entfernt werden, während Formylgruppen, die als Indolschutzgruppen für Tryptophan verwendet werden, durch Säurebehandlung in Gegenwart des vorher erwähnten 1,2-Ethandiols, 1,4-Butandithiols oder dgl. entfernt werden können und auch durch alkalische Behandlung mit verdünntem Natriumhydroxid, verdünntem Ammoniak oder dgl. entfernt werden können.
  • Methoden zur Einführung von Schutzgruppen für funktionelle Gruppen, die nicht an der Reaktion beteiligt sind, die Eliminierung solcher Schutzgruppen, die Aktivierung von funktionellen Gruppen, die an der Reaktion beteiligt sind und dgl. können mit allgemein bekannten Methoden oder Modifikationen davon durchgeführt werden.
  • Bei einer weiteren Methode, um eine Amidform von Betacellulinmuteinen zu erhalten, wird die α-Carboxylgruppe der carboxyterminalen Aminosäure zuerst amidiert, die Peptidkette dann auf die gewünschte Länge auf Seiten der Aminogruppe verlängert, ein Peptid außer der Schutzgruppen für die α-Aminogruppen am N-Ende der Peptidkette und ein Peptid (oder eine Aminosäure) außer der Schutzgruppen für die Carboxylgruppen am C-Ende vorbereitet und die zwei Peptide dann einer Kondensation in einer Lösungsmittelmischung, wie oben, unterzogen. Die Details der Kondensation sind die gleichen wie oben. Nachdem die geschützten Peptide, die durch die Kondensation entstehen, gereinigt worden sind, können alle Schutzgruppen durch oben beschriebene Methoden entfernt werden, um das gewünschte rohe Polypeptid zu erhalten. Das rohe Polypeptid kann mit einer Vielzahl von bekannten Reinigungstechniken gereinigt werden und die Hauptfraktionen können lyophilisiert werden, was die gewünschte Amidform der Polypeptide ergibt.
  • Um die Esterform der Betacellulinmuteine zu erhalten, können die α-Carboxylgruppen der Aminosäuren am Carboxylende einer Kondensation mit einem gewünschten Alkohol unterzogen werden, um einen Aminosäureester herzustellen und die gewünschte Esterform der Polypeptide kann dann auf gleiche Art und Weise als Amidform erhalten werden.
  • Beispiele für DNA, die Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung codiert, schließen jede DNA ein, die DNA enthält, die (1) ein Betacellulinmutein codiert, bei dem 1 bis 30 Aminosäurereste vom N-Ende des Betacellulins deletiert sein können und 1 bis 4 Aminosäurereste der Aminosäurereste 1 bis 4 vom C-Ende, einschließlich Leu an Position 3 vom C-Ende, deletiert oder durch andere Aminosäurereste substituiert wurden und (2) ein Betacellulinmutein, in dem ein 1 bis 30 Aminosäurereste vom N-Ende des Betacellulins deletiert wurden und 1 bis 5 Aminosäurereste zwischen dem 22. und 23. Aminosäurerest vom C-Ende insertiert wurden. Spezifische Beispiele schließen solche ein mit einer Basensequenz, die ein Betacellulinmutein codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, wie in SEQ ID Nr. 1 bis 4, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 37, SEQ ID Nr. 38 und SEQ ID Nr. 44 in der vorliegenden Erfindung gezeigt.
  • Spezifischere Beispiele schließen (1) DNA ein, die DNA enthält mit einer Basensequenz, die in SEQ ID Nr. 15 bis 18, SEQ ID Nr. 22, SEQ ID Nr. 23, SEQ ID Nr. 27 und SEQ ID Nr. 28 gezeigt ist, wie die DNA, die das Betacellulinmutein mit einer Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID Nr. 1 bis 4, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 13 und SEQ ID Nr. 14 dargestellt ist, (2) DNA, die DNA enthält mit einer Basensequenz, wie in SEQ ID Nr. 42 und 43 dargestellt als DNA, die ein Betacellulinmutein codiert mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 37 und 38 dargestellt, (3) DNA, die DNA enthält mit einer Basensequenz, wie in SEQ ID Nr. 48 dargestellt, (4) DNA von Säugetieren, die mit einer Sequenz (1) bis (3) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und (5) DNA, die keine Hybride mit den in (1) bis (4) gezeigten Sequenzen bildet wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes, die aber ein Polypeptid mit der gleichen Aminosäuresequenz codiert. Die Hybridisierung kann durchgeführt werden mit allgemein bekannten Methoden oder Modifikationen davon. Die oben beschriebenen stringenten Bedingungen schließen z.B. eine Temperatur von 42°C, 50% Formamid, 4 × SSPE (1 × SSPE = 150 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4, H2O, 1 mM EDTA, pH 7,4), 5 × Denhardt's Lösung und 0,1% SDS ein.
  • Expressionsvektoren für die Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung, die verwendet werden, wenn die Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, indem Transformanten gezüchtet werden, die eine DNA enthalten, die Betacellulin codiert, können hergestellt werden, z.B. indem (1) Ziel-DNA-Fragmente aus der DNA geschnitten werden, die ein Betacellulinmutein der vorliegenden Erfindung codiert und (2) die DNA-Fragmente stromabwärts eines Promotors in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden.
  • Beispiele für Vektoren schließen E.-coli-Plasmide (z.B. pBR322, pBR325, pUC12 und pUC13), Bacillus-subtilis-Plasmide (z.B. pUB110, pTP5 und pC194), Hefeplasmide (z.B. pSH19 und pSH15), Bakteriophagen, wie λ-Phagen und Tierviren, wie Retroviren, Vacciniaviren und Baculoviren ein.
  • Beispiele für Promotoren, die verwendet werden können, schließen jeden geeigneten Promotor ein, der dem Wirt entspricht, der verwendet wird, um das Gen zu exprimieren.
  • Wenn der Wirt eine Tierzelle ist während der Transformation kann es nützlich sein, einen von SV40 abgeleiteten Promotor, Retroviruspromotor, Metallothioneinpromotor, Hitzeschockpromotor, Cytomegaloviruspromotor, SRα-Promotor oder dgl. zu verwenden. Bevorzugte Beispiele für E.-coli-Wirte schließen den trp-Promotor, T7-Promotor, lac-Promotor, recA-Promotor, λPL-Promotor, lpp-Promotor und dgl. ein, bevorzugte Beispiele für Bacillus-Wirte schließen den SPO1-Promotor, SPO2-Promotor, penP-Promotor und dgl. ein und bevorzugte Beispiele für Hefewirte schließen den PHO5-Promotor, PGK-Promotor, GAP-Promotor, ADH1-Promotor, GAL-Promotor und dgl. ein. Wenn der Wirt eine Insektenzelle ist, sind Polyhedrin-Promotoren und P10-Promotoren bevorzugt.
  • Zusätzlich zu den obigen können Expressionsvektoren auch Enhancer, Spleißsignale, polyA-Signale, Selektionsmarker, SV40-Replikationsursprung (im Folgenden manchmal als SV40ori bezeichnet) und dgl., je nach Wunsch, enthalten. Beispiele für Selektionsmarker schließend das Dihydrofolatreduktase-(dhfr)-Gen (Methotrexat-(MTX)-Resistenz), das Ampicillinresistenzgen (Ampr) und das Neomycinresistenzgen (G418-Resistenz, manchmal als Neo bezeichnet) ein. Thymidinfreie Medien können zur Selektion verwendet werden, insbesondere in den Fallen, in denen das DHFR-Gen als Selektionsmarker mit CHO-(dhfr–)-Zellen verwendet wird.
  • Eine Signalsequenz, die einem Wirt angepasst ist, kann der N-terminalen Seite des Betacellulinmuteins nach Bedarf zugefügt werden. Bevorzugte Beispiele schließen eine phoA-Signalsequenz, OmpA-Signalsequenz oder dgl. für E.-coli-Wirte ein. Bevorzugte Beispiele schließen eine α-Amylasesignalsequenz, Subtilisinsignalsequenz oder dgl. für Bacillus-Wirte ein. Bevorzugte Beispiele schließen eine Paarungsfaktor-α-(MFα)-Signalsequenz, Invertasesignalsequenz oder dgl. für Hefe-Wirte ein. Bevorzugte Beispiele schließen eine Insulin signalsequenz, α-Interferonsignalsequenz, Antikörpermolekülsignalsequenz oder dgl. für tierische Zellen als Wirte ein.
  • Ein Vektor, der auf diese Art und Weise konstruiert wird, der DNA enthält, die ein Betacellulinmutein codiert, kann zur Herstellung von Transformanten verwendet werden.
  • Wirte, die verwendet werden können, schließen z.B. E. coli, Bacillus, Hefen, Insekten oder Insektenzellen und Tierzellen ein.
  • Beispiele für E. coli schließen E. coli K12 DH1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60:160 (1968)), JM103 (Nucleic Acids Research, 9:309 (1981)), JA221 (Journal of Molecular Biology, 120:517 (1978)), HB101 (Journal of Molecular Biology, 41:459 (1969)), C600 (Genetics, 39:440 (1954)) und MM294 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73:4174 (1976)) ein.
  • Beispiele für Bacillus schließen Bacillus subtilis MI114 (Gene, 24:255 (1983)) und 207-21 (Journal of Biochemistry, 95:87 (1984)) ein.
  • Beispiele für Hefen schließen Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R–, NA87-11A, DKD-5D und 20B-12.
  • Beispiele für Insekten schließen Seidenwurmlarven (Maeda et al., Nature, 315:592 (1985)) ein.
  • Beispiele für Insektenzellen schließen im Fall des AcNPV-Virus etablierte Zelllinien ein, die von Larven von Spodoptera frugiperda (Sf-Zellen) stammen, MG1-Zellen, die von Trichoplusia-ni-Mitteldarmzellen stammen, High FiveTM-Zellen, die von Trichoplusia-ni-Eierstockzellen stammen, Zellen, die von Mamesira brassicae abgeleitet sind und Zellen, die von Estigmena acrea abgeleitet sind. Beispiele, wenn das Virus BmNPV ist, schließen etablierte Zelllinien ein, die von Bombyx mori N stammen (BmN-Zellen). Beispiele für Sf-Zellen schließen Sf9-Zellen (ATCC CRL1711) und Sf21-Zellen (J.L. Vaughn et al., in Vitro, Bd. 13, Seiten 213-217 (1977)) ein.
  • Beispiele für Tierzellen schließen Affen-COS-7-Zellen, Verozellen, CHO-Zellen vom Chinesischen Hamster, DHFR-Gen-defiziente CHO-Zellen vom Chinesischen Hamster (dhfr–CHO-Zellen), Maus-L-Zellen, Maus-3T3-Zellen, Maus-Myelomzellen, menschliche HEK293-Zellen, menschliche FL-Zellen, 293-Zellen, C127-Zellen, BALB3T3-Zellen und Sp-2/0-Zellen ein.
  • E. coli kann z.B. mit einer Methode transformiert werden, wie in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110 (1972) oder Gene, 17:107 (1982) beschrieben.
  • Bacillus kann z.B. transformiert werden mit einer Methode, wie in Molecular & General Genetics, 168:111 (1979) beschrieben.
  • Hefen können z.B. transformiert werden mit einer Methode, wie in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929 (1978) beschrieben.
  • Insektenzellen und Insekten können z.B. transformiert werden mit einer Methode, wie in Bio/Technology, 6, Seiten 47-55 (1988) beschrieben.
  • Tierzellen können z.B. mit der in Virology, 52:456 (1973) beschriebenen Methode transformiert werden.
  • Beispiele für Methoden zur Einführung von Expressionsvektoren in Zellen schließen die Lipofektionsmethode (P.L. Felgner et al. in Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Bd. 84, S. 7413 (1987)), Calciumphosphatmethode (F.L. Graham und A.J. van der Eb in Virology, Bd. 52, Seiten 456-467 (1973)), Elektroporation (E. Nuemann et al. in EMBO J., Bd. 1, Seiten 841-845 (1982)) und dgl. ein.
  • Transformanten, die mit Expressionsvektoren transformiert wurden, die DNA enthalten, die Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung codiert, können auf diese Art und Weise erhalten werden.
  • Bei einer Methode zur stabilen Expression der Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Tierzellen werden Zellen, die einen Expressionsvektor beinhalten, der dem Chromosom der vorher erwähnten Tierzellen zugefügt wurden, durch Klonselektion ausgewählt. Spezifisch werden Transformanten selektiert unter Verwendung der vorher erwähnten Selektionsmarker als Indikatoren. Es ist auch möglich, stabile Tierzelllinien zu erhalten mit einer hohen Expressionskapazität für Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung etc. durch wiederholte Klonselektion von Tierzellen, die erhalten wurden unter Verwendung von Selektionsmarkern auf diese Art und Weise. Wenn ein dhfr-Gen als Selektionsmarker verwendet wird, kann die Kultur durchgeführt werden, wenn die MTX-Konzentration stufenweise ansteigt und resistente Stämme können selektiert werden, so dass die intrazelluläre Amplifikation von DNA, die die Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung codiert, zusammen mit dem dhfr-Gen eine Tierzelllinie ergibt mit noch höherer Expression.
  • Die Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden, indem die vorher erwähnten Transformanten unter Bedingungen kultiviert werden, die die Expression von DNA zulassen, die die Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung codiert, und die Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung können erzeugt und angesammelt werden.
  • Wenn Transformanten mit E. -coli- oder Bacillus-Wirten gezüchtet werden, sind Flüssigmedien zur Kultur geeignet und können Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganisches Material und andere Materialien enthalten, die für das Wachstum der Transformanten notwendig sind. Kohlenstoffquellen schließen Glucose, Dextrine, lösliche Starke und Saccharose ein und Stickstoffquellen schließen anorganische oder organische Substanzen, wie Ammoniumsalze, Nitrate, Maiseinweichwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Sojakuchen und Kartoffelextrakt ein. Beispiele für anorganische Materialien schließen Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und Magnesiumchlorid ein. Hefen, Vitamine, wachstumsfördernde Faktoren und dgl. können auch zugefügt werden. Der pH des Mediums ist bevorzugt etwa 5 bis 8.
  • Ein bevorzugtes Medium zur Züchtung von E. coli ist M9-Medium, das Glucose und Casaminosäure enthält (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, Seiten 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)). Eine Chemikalie, wie 3β-Indolacrylsäure kann zugefügt werden, um den Promotor nach Bedarf zu verstärken.
  • In Fällen, in denen der Wirt E. coli ist, dauert die Kultur gewöhnlich etwa 3 bis 24 Stunden bei etwa 15 bis 43°C. Die Kultur kann nach Bedarf belüftet oder gerührt werden.
  • In Fallen, in denen der Wirt Bacillus ist, dauert die Kultur gewöhnlich etwa 6 bis 24 Stunden bei etwa 30 bis 40°C. Die Kultur kann nach Bedarf belüftet oder gerührt werden.
  • Beispiele für Medien zur Kultur von Transformanten mit Hefewirten schließen Burkholder-Minimalmedium (K.L. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77, 4505 (1980)) und SD-Medium, das 0,5% Casaminosäure enthält (G.A. Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81, 5330 (1984)) ein. Der pH des Mediums kann bevorzugt so eingestellt werden, dass er zwischen 5 und 8 liegt. Die Kultur dauert gewöhnlich etwa 24 bis 72 Stunden bei etwa 20 bis 35°C. Die Kultur kann nach Bedarf belüftet oder gerührt werden.
  • Beispiele für Medien zur Kultur von Transformanten mit Insektenzellwirten schließen Grace's Insektenmedium (T.C.C. Grace, Nature, 195:788 (1962)) geeigneterweise ergänzt mit Additiven, wie 10% immobilisiertem Rinderserum, ein. Der pH des Mediums sollte so eingestellt werden, dass er zwischen etwa 6,2 und 6,4 liegt. Die Kultur dauert gewöhnlich etwa 3 bis 5 Tage bei etwa 27°C. Die Kultur kann nach Bedarf belüftet oder gerührt werden.
  • Beispiele für Medien zur Kultur von Transformanten mit Tierzellwirten schließen MEM-Medium, das etwa 5 bis 20% fötales Kälberserum (Science, 122:501 (1952)), DMEM-Medium (Virology, 8:396 (1959)), RPMI-1640-Medium (The Journal of the American Medical Association, 199:519 (1967)) und 199-Medium (Proceedings of the Society for Biological Medicine, 73:1 (1950)) ein. Der pH liegt bevorzugt bei etwa 6 bis 8. Die Kultur wird gewöhnlich 15 bis 60 Stunden bei etwa 30 bis 40°C durchgeführt. Die Kultur kann nach Bedarf belüftet oder gerührt werden.
  • Insbesondere wenn CHO-(dhfr–)-Zellen und dhfr-Gene als Selektionsmarker verwendet werden, wird DMEM-Medium, das dialysiertes fötales Kälberserum mit praktisch keinem Thymidin enthält, bevorzugt verwendet.
  • Die Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung können aus den vorher erwähnten Kulturen auf folgende Art und Weise z.B. isoliert und gereinigt werden.
  • Wenn die Betacelluline der vorliegenden Erfindung aus gezüchteten Bakterienzellen oder Zellen extrahiert werden, werden die Bakterienzellen oder Zellen mit einer allgemein bekannten Methode nach Beendigung der Kultur gesammelt und in einem geeigneten Puffer suspendiert, sie werden durch Ultraschall, Lysozymbehandlung und/oder Einfrieren und Auftauen etc. aufgerissen und der rohe Polypeptidextrakt wird dann durch Zentrifugation oder Filtration erhalten. Der Puffer kann auch ein Protein denaturierendes Mittel, wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid oder ein Tensid, wie Triton X-100 (eingetragenes Markenzeichen (TM)) enthalten.
  • Wenn Betacellulinmuteine in die Kulturbrühe ausgeschieden werden, werden die Bakterienzellen oder Zellen von dem Überstand mit einer allgemein bekannten Methode nach Vervollständigung der Kultur abgetrennt und der Überstand wird gesammelt.
  • Die erfindungsgemäßen Polypeptide, die in dem Extrakt oder dem Kulturüberstand, die auf diese Weise erhalten wurden, enthalten sind, können mit einer geeigneten Kombination von allgemein bekannten Methoden der Isolation und Reinigung gereinigt werden. Beispiele für solche allgemein bekannten Methoden der Isolierung und Reinigung schließen Methoden ein unter Ausnutzung des Auflösungsgrads, wie Lösungsmittelausfällung oder Aussalzen, Methoden unter Ausnutzung von Unterschieden hauptsächlich im Molekulargewicht, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, Methoden, die Unterschiede in der Ladung verwenden, wie Ionenaustauschchromatographie, Methoden, die eine spezifische Affinität ausnutzen, wie Affinitätschromatographie, Methoden, die hydrophobe Unterschiede ausnutzen, wie Reverse-Phase-HPLC und Methoden, die Unterschiede im isoelektrischen Punkt ausnutzen, wie isoelektrische Elektrophorese und Chromatofokussierung.
  • Wenn die erhaltenen Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung in freier Form erhalten werden, können sie in ein Salz umgewandelt werden mit allgemein bekannten Methoden oder einer Modifikation davon. Alternativ können sie, wenn sie in Form eines Salzes erhalten werden, in die freie Form oder ein anderes Salz umgewandelt werden mit einer allgemein bekannten Methode oder einer Modifikation davon.
  • Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung, die von Rekombinanten erzeugt werden, können nach Wunsch durch Einwirkung von in geeigneter Weise Protein modifizierenden Enzymen vor oder nach der Reinigung modifiziert werden oder die Betacellulinmuteine können teilweise entfernt werden. Beispiele für Protein modifizierende Enzyme schließen Trypsin, Chymotrypsin, Arginylendopeptidase, Proteinkinase und Glycosidase ein.
  • Die entstehenden Betacellulinmuteine können in einer Rückfaltungsstufe behandelt werden, wie in der japanischen nicht geprüften Patentanmeldung (Kokai) H10-191989 z.B. beschrieben. Betacellulinmuteine mit einem N-terminalen Met können einer Reaktion zur Entfernung von Met vom N-Ende unterzogen werden, wie in der japanischen nicht geprüften Patentanmeldung (Kokai) H10-191989 beschrieben, um das N-terminale Met zu entfernen.
  • Die Gegenwart der entstehenden Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung kann durch Enzymimmunoassay oder dgl. unter Verwendung spezifischer Antikörper bestimmt werden.
  • Die Betacellulinmuteine oder deren Salze der vorliegenden Erfindung oder DNA, die die Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung codiert, können zur Entwicklung von Wirkstoffen verwendet werden, um Krankheiten, wie Diabetes (z.B. insulinabhängiger Diabetes (Diabetes Typ I) etc.), Pankreasfunktionsstörungen, die mit Diabetes verbunden sind oder Pankreasfunktionsstörungen, die mit einer ungenügenden Insulinausscheidung aufgrund des Alters verbunden sind, zu verbessern und für Wirkstoffe für Krankheiten, wie undifferenzierter Pankreaskrebs (insbesondere prophylaktische und therapeutische Wirkstoffe für Diabetes (z.B. insulinabhängiger Diabetes) etc.).
  • Weil die Betacellulinmuteine oder ihre Salze gemäß der vorliegenden Erfindung oder DNA, die sie codiert, eine verminderte EGF-Aktivität haben und keine Probleme in Bezug auf Antigenizität haben, können sie nützlich sein als sichere und wenig toxische Wirkstoffe. Die Betacellulinmuteine oder deren Salze gemäß der vorliegenden Erfindung oder DNA, die sie codiert, können als Wirkstoffe verwendet werden, um Krankheiten, wie Diabetes (z.B. insulinabhängiger Diabetes), Pankreasfunktionsstörungen, die mit Diabetes verbunden sind und Pankreasfunktionsstörungen, die mit ungenügender Insulinausscheidung bei älteren Menschen verbunden sind, und als therapeutische und prophylaktische Wirkstoffe für Krankheiten, wie undifferenzierten Pankreaskrebs.
  • Die Betacellulinmuteine oder Salze der vorliegenden Erfindung oder DNA, die sie codiert, können in üblicher Weise wie die vorher erwähnten Wirkstoffe verwendet werden. Z.B. können sie oral in Form von beschichteten oder enterisch beschichteten Tabletten, Kapseln, Elixieren, Mikrokapseln und dgl. verabreicht werden und können parenteral in Form von Injektionen verabreicht werden, wie z.B. sterile Lösungen mit Wasser oder anderen pharmazeutisch annehmbaren Flüssigkeiten oder Suspensionen. Solche Präparate können z.B. hergestellt werden, indem die Verbindungen oder Salze in Einheitsdosisformulierungen, die für allgemein anerkannte Präparate erforderlich sind, vermischt werden, zusammen mit physiologisch zulässigen Trägern, Aromastoffen, Hilfs stoffen, Vehikeln, Antiseptika, Stabilisatoren, Bindemitteln und dgl. Der Gehalt des aktiven Inhaltsstoffs in solchen Formulierungen ergibt die geeignete Dosis innerhalb des angegebenen Bereichs.
  • Beispiele für Additive, die mit Tabletten, Kapseln und dgl. vermischt werden können, schließen Bindemittel, wie Gelatine, Maisstärke, Traganth und Gummi arabicum, Hilfsstoffe, wie kristalline Cellulose, Quellmittel, wie Maisstärke, Gelatine und Alginsäure, Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Süßstoffe, wie Saccharose, Lactose und Saccharin, und Aromastoffe, wie Pfefferminz, Akamonoöl oder Kirscharoma ein. Im Fall von Einheitsformulierungen in Form von Kapselpräparaten kann das Material auch einen flüssigen Träger, wie ein Lipid einschließen. Sterile Zusammensetzungen für Injektionen können mit einer üblichen Methode formuliert werden, wie Auflösen oder Suspendieren eines natürlich erzeugten pflanzlichen Öls oder dgl., wie Sesamöl oder Kokosnussöl und des aktiven Inhaltsstoffs in einem Träger, wie Wasser zur Injektion.
  • Beispiele für wässrige Lösungen zur Injektion schließen physiologische Kochsalzlösung, isotonische Flüssigkeiten, die Glucose oder andere Hilfsstoffe enthalten (wie D-Sorbit, D-Mannit und Natriumchlorid) ei. Geeignete Auflösungshilfsstoffe, wie Alkohole (z.B. Ethanol), Polyalkohole (wie Propylenglycol und Polyethylenglycol) und nichtionische Tenside (wie Polysorbat 80TM und HCO-50) können auch verwendet werden. Beispiele für ölhaltige Lösungen schließen Sesamöl und Sojaöl ein. Beispiele für Auflösungshilfsstoffe schließen Benzylbenzoat und Benzylalkohol ein.
  • Puffer (wie Phosphatpuffer und Natriumacetatpuffer), Analgetika (wie Benzalkonium- und Procainhydrochlorid), Stabilisatoren (wie Humanserumalbumin und Polyethylenglycol), Konservierungsmittel (wie Benzylalkohol und Phenol), Antioxidantien und dgl. können auch zugemischt werden. Injektionen werden allgemein in geeignete Ampullen abgefüllt.
  • Das entstehende Präparat ist sicher und hat eine geringe Toxizität und kann daher z.B. an Menschen und Säugetiere verabreicht werden (wie Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Ziegen, Schweine, Kühe, Katzen, Hunde, Affen, Paviane und Schimpansen).
  • Die Dosierung des Betacellulinmuteins oder Salzes davon gemäß der vorliegenden Erfindung variiert abhängig von den jeweiligen Bedingungen etc. Die oral an Patienten mit Diabetes im Erwachsenenalter oral verabreichte Dosierung (pro 60 kg Körpergewicht) ist im Allgemeinen etwa 0,1 bis 100 mg/Tag, bevorzugt etwa 1,0 bis 50 mg und noch bevorzugter etwa 1,0 bis 20 mg. Die parenteral verabreichte Dosierung zu einem Zeitpunkt variiert abhängig vom Zweck der Verabreichung, dem Zielorgan, dem Zustand des Patienten, der Verabreichungsmethode usw. Intravenöse Injektionen für Patienten mit Diabetes im Erwachsenenalter enthalten z.B. (pro 60 kg Körpergewicht) allgemein etwa 0,01 bis 30 mg/Tag, bevorzugt etwa 0,1 bis 20 mg und noch bevorzugter etwa 0,1 bis 10 mg. Die Dosierung für andere Säugetiere kann auch in Bezug auf 60 kg berechnet werden.
  • Abkürzungen für Basen, Aminosäuren und dgl. in der Beschreibung und den Figuren basieren auf der IU-PUA-TUB Commission an Biochemical Nomenclature und auf Abkürzungen, die auf diesem Gebiet üblich sind. Beispiele sind unten angegeben. Optische Isomere von Aminosäuren sind in L-Form, wenn nicht anders angegeben.
    • DNA:
    Desoxyribonucleinsäure
    cDNA:
    komplementäre Desoxyribonucleinsäure
    A:
    Adenin
    T:
    Thymin
    G:
    Guanin
    C:
    Cytosin
    EDTA:
    Ethylendiamintetraessigsäure
    APMSF:
    (p-Amidinophenyl)methansulfonylfluoridhydrochlorid
    SDS:
    Natriumdodecylsulfat
    TFA:
    Trifluoressigsäure
    Gly:
    Glycin
    Ala:
    Alanin
    Val:
    Valin
    Leu:
    Leucin
    Ile:
    Isoleucin
    Ser:
    Serin
    Thr:
    Threonin
    Cys:
    Cystein
    Met:
    Methionin
    Glu:
    Glutaminsäure
    Asp:
    Asparaginsäure
    Lys:
    Lysin
    Arg:
    Arginin
    His:
    Histidin
    Phe:
    Phenylalanin
    Tyr:
    Tyrosin
    Trp:
    Tryptophan
    Pro:
    Prolin
    Asn:
    Asparagin
    Gln:
    Glutamin
    NMP:
    N-Methylpyrrolidon
  • Substituenten, Schutzgruppen und Reagenzien, die in dieser Beschreibung verwendet werden, werden durch die folgenden Symbole angegeben.
    • Me:
    Methylgruppe
    Et:
    Ethylgruppe
    Bu:
    Butylgruppe
    Ph:
    Phenylgruppe
    TC:
    Thiazolidin-4(R)-carboxamidgruppe
    Bom:
    Benzyloxymethyl
    PAM:
    Phenylacetamidmethyl
    Tos:
    p-Toluolsulfonyl
    HONB:
    N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxyimid
    Bzl:
    Benzylgruppe
    Z:
    Benzyloxycarbonylgruppe
    Br-Z:
    2-Brombenzyloxycarbonylgruppe
    Cl-Z:
    2-Chlorbenzyloxycarbonylgruppe
    Boc:
    t-Butyloxycarbonylgruppe
    HOBt:
    1-Hydroxybenztriazol
    DCC:
    N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
    TFA:
    Trifluoressigsäure
    Fmoc:
    N-9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe
    DNP:
    Dinitrophenylgruppe
    Bum:
    tert.-Butoxymethylgruppe
    Trt:
    Tritylgruppe
  • Die SEQ ID Nummern im Sequenzprotokoll der Beschreibung bezeichnen die folgenden Sequenzen:
    SEQ ID Nr. 1 – Aminosäuresequenz von Betacellulinmutein (BTC1-77) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 2 – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC1-76) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 3 – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC31-77) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 4 – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC31-76) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 5 (Referenzsequenz) – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC1-76, 78-80) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 6 (Referenzsequenz) – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC1-76, 78, 79) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 7 (Referenzsequenz) – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC1-76, 78) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 8 – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC1-77, 79, 80) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 9 – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC1-77, 80) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 10 (Referenzsequenz) – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC31-76, 78-80) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 11 (Referenzsequenz) – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC31-76, 78, 79) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 12 (Referenzsequenz) – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC31-76, 78) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 13 – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC31-77, 79, 80) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 14 – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC31-77, 79) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 15 – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert, das durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird
    SEQ ID Nr. 16 – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert, die durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird
    SEQ ID Nr. 17 – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert, die durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 dargestellt wird
    SEQ ID Nr. 18 – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert, die durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 4 dargestellt wird
    SEQ ID Nr. 19 (Referenzsequenz) – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert, die durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 5 dargestellt wird
    SEQ ID Nr. 20 (Referenzsequenz) – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert, die durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 6 dargestellt wird
    SEQ ID Nr. 21 (Referenzsequenz) – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert, die durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 7 dargestellt wird
    SEQ ID Nr. 22 – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert, die durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 8 dargestellt wird
    SEQ ID Nr. 23 – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert, die durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 9 dargestellt wird
    SEQ ID Nr. 24 (Referenzsequenz) – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert, die durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 10 dargestellt wird
    SEQ ID Nr. 25 (Referenzsequenz) – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert, die durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 11 dargestellt wird
    SEQ ID Nr. 26 (Referenzsequenz) – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert, die durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 12 dargestellt wird
    SEQ ID Nr. 27 – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert, die durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 13 dargestellt wird
    SEQ ID Nr. 28 – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert, die durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 14 dargestellt wird
    SEQ ID Nr. 29 – Basensequenz für Primer 1, der in den Beispielen 1 und 4 unten verwendet wird
    SEQ ID Nr. 30 – Basensequenz für Primer 2, der in den Beispielen 1 und 4 unten verwendet wird
    SEQ ID Nr. 31 – Basensequenz für Primer RI-1, der in den Beispielen 10 und 27 unten verwendet wird
    SEQ ID Nr. 32 – Basensequenz für Primer RI-3, der in den Beispielen 10 und 27 unten verwendet wird
    SEQ ID Nr. 33 – Basensequenz für Primer RI-1Cla, der in den Beispielen 10 und 27 unten verwendet wird
    SEQ ID Nr. 34 – Basensequenz für Primer RI-3Xho, der in den Beispielen 10 und 27 unten verwendet wird
    SEQ ID Nr. 35 – Aminosäuresequenz für Betacellulin
    SEQ ID Nr. 36 – Basensequenz der cDNA, die Betacellulin codiert
    SEQ ID Nr. 37 – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC2-76) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 38 – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC24-76) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 39 – Basensequenz von Primer 3, der in Beispiel 13 unten verwendet wird
    SEQ ID Nr. 40 – Basensequenz von Primer 4, der in den Beispielen 13 und 16 unten verwendet wird
    SEQ ID Nr. 41 – Basensequenz von Primer 5, der in Beispiel 16 unten verwendet wird
    SEQ ID Nr. 42 – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert mit der in SEQ ID Nr. 37 dargestellten Aminosäuresequenz
    SEQ ID Nr. 43 – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert mit der in SEQ ID Nr. 38 dargestellten Aminosäuresequenz
    SEQ ID Nr. 44 – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC31-58, Asn, Pro, Ser, 59-80) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 45 (Referenzsequenz) – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (Asn, Ser, Asp, Ser, Glu, BTC38-80) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 46 (Referenzsequenz) – Aminosäuresequenz des Betacellulinmuteins (BTC1-58, Asn, Pro, Ser, gelöscht bis 80) der vorliegenden Erfindung
    SEQ ID Nr. 47 (Referenzsequenz) – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert mit der in SEQ ID Nr. 46 dargestellten Aminosäuresequenz
    SEQ ID Nr. 48 – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert mit der in SEQ ID Nr. 44 dargestellten Aminosäuresequenz
    SEQ ID Nr. 49 (Referenzsequenz) – Basensequenz der cDNA, die das Betacellulinmutein codiert mit der in SEQ ID Nr. 45 dargestellten Aminosäuresequenz
    SEQ ID Nr. 50 – Basensequenz des Primers BT-95h, der in Referenzbeispiel 1 und Beispiel 22 unten verwendet wird
    SEQ ID Nr. 51 – Basensequenz des Primers BT-94h, der in Referenzbeispiel 1 und Beispiel 23 unten verwendet wird
    SEQ ID Nr. 52 – Basensequenz des Primers PET-1, der in Beispiel 22 unten verwendet wird
    SEQ ID Nr. 53 – Basensequenz des Primers BTC-1, der in Beispiel 22 unten verwendet wird
    SEQ ID Nr. 54 – Basensequenz des Primers BTC-2, der in Beispiel 22 unten verwendet wird
    SEQ ID Nr. 55 – Basensequenz des Primers BTC-3, der in Beispiel 22 unten verwendet wird
    SEQ ID Nr. 56 – Basensequenz des Primers BTC-7, der in Beispiel 23 unten verwendet wird.
  • Der Transformant E. coli MM294 (DE3)/pTCIIBTC77, der in Beispiel 1 unten erhalten wurde, wurde mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6584 am 24. November 1998 beim National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry hinterlegt. Er wurde auch unter der Hinterlegungsnummer IFO 16214 am 2. November 1998 beim Institute for Fermentation (IFO) registriert.
  • Der Transformant E. coli MM294 (DE3)/pPCIIBTC76, der in Beispiel 4 unten erhalten wurde, wurde mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6583 am 24. November 1998 beim National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry hinterlegt. Er wurde auch unter der Hinterlegungsnummer IFO 16213 am 2. November 1998 beim Institute for Fermentation (IFO) registriert.
  • Der Transformant E. coli MM294 (DE3)/pTCIIBTC2-76, der in Beispiel 13 unten erhalten wurde, wurde mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6948 am 24. November 1999 beim National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry hinterlegt. Er wurde auch unter der Hinterlegungsnummer IFO 16334 am 9. November 1999 beim Institute for Fermentation (IFO) registriert.
  • Der Transformant E. coli MM294 (DE3)/pPCIIBTC24-76, der in Beispiel 16 unten erhalten wurde, wurde mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6949 am 24. November 1999 beim National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry hinterlegt. Er wurde auch unter der Hinterlegungsnummer IFO 16335 am 9. November 1999 beim Institute for Fermentation (IFO) registriert.
  • Der Transformant E. coli MM294 (DE3)/pLysS, pTB1516 mit dem Plasmid pTB1516, das in Referenzbeispiel 1 unten erhalten wurde, wurde mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-3836 am 21. April 1992 beim National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry hinterlegt. Er wurde auch unter der Hinterlegungsnummer IFO 15282 am 16. April 1992 beim Institute for Fermentation (IFO) registriert.
  • Beispiele und Referenzbeispiele sind unten angegeben, um die vorliegende Erfindung genauer zu erläutern, wobei der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.
  • Beispiel 11
  • Konstruktion eines Betacellulin mit 77 Resten (dem drei C-terminale Reste fehlen) exprimierenden Stamms
  • Ein Expressionsplasmid für Betacellulin mit 77 Resten (dem drei C-terminale Reste fehlen) wurde auf folgende Art und Weise konstruiert (1).
  • Das Betacellulin-Strukturgen mit 77 Resten (dem drei C-terminale Reste fehlen) wurde mit PCR aus dem pB041-Betacellulin-Expressionsplasmid amplifiziert (Seno et al., Growth Factors, 13:181 (1996)) unter Verwendung eines Primers 1 (5'-CATATGGATGGGAATTCCACCAGAAGTCCTG) mit einer NdeI-Spaltstelle und einem Startcodon benachbart stromaufwärts dem Strukturgen und einem Primer 2 (5'-GGATCCCTAGTCAACTCTCTCACACCTTGCTCC) mit einem Stoppcodon und einer BamHI-Spaltstelle nach der Asparaginsäure bei 77. Das so mit PCR amplifizierte Gen wurde in den pCR2.1-Vektor ligiert unter Verwendung eines TA-Originalklonierungskits (von Invitrogen), um pCR2.1/BTC77 herzustellen. Dieser wurde in E. coli JM109 eingeführt und die Transformanten wurden selektiert unter Verwendung der Ampicillinresistenz und der β-Galactosidaseaktivität als Indikatoren. Transformanten mit pCR2.1/BTC77 wurden kultiviert und pCR2.1/BTC77 wurde hergestellt unter Verwendung eines QIAprep8-Miniprep-Kits (von Qiagen).
  • pBR322 wurde mit NdeI verdaut, die Enden wurden mit T4-DNA-Polymerase geglättet (DNA Blunting-Kit, von Takara Shuzo) und pBRdesNde, dem die NdeI-Erkennungsstelle fehlte, wurde durch Religierung hergestellt. pET3c wurde mit BglII-EcoRV verdaut, Fragmente mit ungefähr 0,26 kbp wurden gewonnen, die Enden wurden mit T4-DNA-Polymerase geglättet und pBR/T7desNde wurde durch Ligierung mit dem ScaI-Fragment von pBRdesNde erzeugt. pBR322desBam, dem die BamHI-Erkennungsstelle von pBR322 fehlte, wurde durch punktgerichtete Mutagenese hergestellt (Quick Change von Stratagene). Das SphI-EcoRV-Fragment von pBR322desBam wurde in das SphI-EcoRV-Fragment von pBR/T7desNde ligiert, was den Tetracyclinresistenz-Expressionsvektor pTCII ergab. pCR2.1/BTC77 wurde mit NdeI und BamHI verdaut und anschließend eine Agaroseelektrophorese laufen gelassen und ungefähr 240 bp des Betacellulin-Strukturgens mit 77 Resten gewonnen unter Verwendung des QIAquick Spin Purification Kit (von Qiagen). Der Expressionsvektor pTCII wurde mit NdeI und BamHI verdaut und anschließend einer Agaroseelektrophorese unterzogen und ungefähr 4,6 kbp Banden wurden auf gleiche Weise gewonnen. Das Betacellulin-Strukturgen mit 77 Resten wurde mit dem NdeI-BamHI-Fragment des pTCII-Expressionsvektors ligiert und dann in E. coli JM109 zur Selektion von Transformanten durch Tetracyclinresistenz eingearbeitet und Plasmide wurden wiederum aus dem Stamm gewonnen, was das Expressionsplasmid pTCIIBTC77 ergab.
  • Das entstehende pTCIIBTC77 wurde in E. coli MM294 (DE3) zur Selektion der Transformanten durch Tetracyclinresistenz eingearbeitet, was die Expressionslinie des Betacellulins mit 77 Resten MM294 (DE3)/pTCIIBTC77 ergab.
  • Beispiel 2
  • Kultur des Expressionsstamms für Betacellulin mit 77 Resten
  • Der Expressionsstamm für Betacellulin mit 77 Resten MM294 (DE3)/pTCIIBTC77 wurde 16 Stunden bei 30°C in 1 l LB-Medium (1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid), das 10 mg/l Tetracyclin enthielt, gezüchtet. 150 ml der entstehenden Kultur wurden verwendet, um 2 l Fermenter, die 1,5 l primäres Fermentationsmedium enthielten (1,68% Natriummonohydrogenphosphat, 0,3% Natriumdihydrogenphosphat, 0,1% Ammoniumchlorid, 0,05% Natriumchlorid, 0,024% Magnesiumsulfat, 0,02% Nupol LB-625, 0,0005% Thiaminhydrochlorid, 1,5% Glucose, 1,0% Casaminosäure, 1,0% Hefeextrakt) zu impfen und die Kultur wurde gestartet durch Belüftung und Rühren unter den Bedingungen von 500 U/min, einer Luftströmungsrate von 2 l/min und einer Temperatur von 37°C. Als die Turbidität der Kultur etwa 1200 Klett-Einheiten erreichte, wurden 5,95 mg/l Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zugegeben. 0,75% Glucose wurden 1 und 2,5 Stunden nach IPTG-Zugabe zugegeben und die Kultur 9 Stunden nach dem Start der Kultur fortgesetzt. Die Kulturbrühe wurde 30 Minuten mit 10.000 U/min zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln.
  • Beispiel 3
  • Reinigung von Met-77-Reste-Betacellulin
  • 10 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0), das 1 mM EDTA, 1 mM APMSF und 7 M Guanidinhydrochlorid enthielt, wurden zu 5 g der in Beispiel 2 erhaltenen Zellen zugefügt, die Mischung wurde über Nacht bei 4°C zur Extraktion gerührt und dann zentrifugiert (20 min mit 10.000 U/min). 250 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), das 0,5 mM oxidiertes Glutathion, 1 mM reduziertes Glutathion, 1 mM EDTA, 0,1 M Argininhydrochlorid und 2 M Harnstoff enthielt, wurden zu 10 ml des entstehenden Überstands zugegeben zur erneuten Faltung über Nacht bei 4°C und anschließend zentrifugiert (20 mm mit 10.000 U/min), was 260 ml Überstand ergab. Der Überstand wurde eingeengt unter Verwendung einer YM3-Membran (Fraktionsmolekulargewicht: 3000, von Millipore). 120 ml 2 M Harnstoff wurden zu 80 ml des entsalzten Konzentrats zugegeben und der pH-Wert wurde dann mit Salzsäure auf 5,0 eingestellt. Der nach 20 min Zentrifugation mit 10.000 U/min erhaltene Überstand wurde mit einer Durchflussrate von 10 ml/min auf eine SP-Toyopearl 650 M Säule (2,2 cm × 12 cm, von Tosoh), die mit 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,0) equilibriert worden war, adsorbiert und die Säule wurde mit dem zur Equilibrierung verwendeten Puffer gewaschen und anschließend mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1,0 M Natriumchlorid eluiert. Die Fraktionen, die Met-77-Reste-Betacellulin enthielten, wurden gesammelt, ein Drittel der Fraktion wurde auf eine C4P-50-Säule (1,0 cm × 25 cm, von Showa Denko), die mit 0,1% Trifluoressigsäure equilibriert worden war, adsorbiert und Met-77-Reste-Betacellulin wurde mit einem linearen Gradienten von 13,5 bis 21,2% Acetonitril eluiert. Das mit zwei weiteren Arbeitsschritten erhaltene Eluat wurde gegen 0,02% Trifluoressigsäure dialysiert und lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wurde in 10 ml destilliertem Wasser gelöst, durch eine Ag1-X8-Säule (1,0 cm × 10 cm, von Nippon Biorad), die mit Essigsäure behandelt worden war, durchfließen gelassen und dann wieder lyophilisiert, was 8 mg Met-77-Reste-Betacellulin ergab.
  • Beispiel 4
  • Konstruktion eines Expressionsplasmids für Betacellulin mit 76 Resten (dem vier C-terminale Reste fehlen)
  • Ein Expressionsplasmid für Betacellulin mit 76 Resten (dem vier C-terminale Reste fehlen) wurde auf folgende Art und Weise konstruiert (2).
  • Das Betacellulin-Strukturgen mit 76 Resten (dem vier C-terminale Reste fehlen) wurde mit PCR aus pTCII/BTC77, der in Beispiel 1 konstruiert worden war, amplifiziert unter Verwendung von Primer 1 (5'-CATATGGATGGGAATTCCACCAGAAGTCCTG) mit einer NdeI-Spaltstelle und einem Startcodon stromaufwärts benachbart dem Strukturgen und einem Primer 2 (5'-GGATCCCTAAACTCTCTCACACCTTGCTCCAATG) mit einem Stoppcodon und einer BamHI-Spaltstelle nach dem Valin an Position 76. Das so mit PCR amplifizierte Gen wurde in den pCR2.1-Vektor ligiert unter Verwendung eines TA Original Cloning Kit (von Invitrogen), um pCR2.1/BTC76 herzustellen. Dieser wurde in E. coli JM109 eingeführt und die Transformanten wurden selektiert unter Verwendung der Ampicillinresistenz und der β-Galactosidaseaktivität als Indikatoren. Transformanten mit pCR2.1/BTC76 wurden kultiviert und pCR2.1/BTC76 wurde hergestellt unter Verwendung eines QIAprep8-Miniprep-Kits (von Qiagen).
  • pCR2.1/BTC76 wurde mit NdeI und BamHI verdaut und anschließend einer Agaroseelektrophorese unterzogen und ungefähr 240 bp des Betacellulin-Strukturgens mit 76 Resten wurden gewonnen unter Verwendung des QIAquick Spin Purification Kit (von Qiagen). Der Expressionsvektor pTCII, der in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde mit NdeI und BamHI verdaut und anschließend einer Agaroseelektrophorese unterzogen und Banden mit ungefähr 4,6 kbp wurden auf gleiche Weise gewonnen. Das Betacellulin-Strukturgen mit 76 Resten wurde mit dem NdeI-BamHI-Fragment des pTCII-Expressionsvektors ligiert und dann in E. coli JM109 zur Selektion von Transformanten durch Tetracyclinresistenz eingebracht und Plasmide wurden wiederum aus dem Stamm gewonnen, was das Expressionsplasmid pTCIIBTC76 ergab.
  • Das entstehende pTCIIBTC76 wurde in E. coli MM294 (DE3) eingebracht zur Selektion von Transformanten durch Tetracyclinresistenz, was den Expressionsstamm für Betacellulin mit 76 Resten MM294 (DE3)/pTCIIBTC76 ergab.
  • Beispiel 5
  • Kultur einer Expressionslinie für Betacellulin mit 76 Resten
  • Die Expressionslinie für Betacellulin mit 76 Resten MM294 (DE3)/pTCIIBTC76 wurde 16 Stunden bei 30°C in 1 l LB-Medium (1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid), das 10 mg/l Tetracyclin enthielt, gezüchtet. Die entstehende Kultur wurde verwendet, um 50 l Fermentertanks, die 20 l primäres Fermentationsmedium enthielten (1,68% Natriummonohydrogenphosphat, 0,3% Natriumdihydrogenphosphat, 0,1 % Ammoniumchlorid, 0,05% Natriumchlorid, 0,024% Magnesiumsulfat, 0,02% Nupol LB-625, 0,0005% Thiaminhydrochlorid, 1,5% Glucose, 1,0% Casaminosäure, 1,0% Hefeextrakt) zu beimpfen und die Kultur wurde durch Belüftung und Rühren unter den Bedingungen von 210 U/min, einer Luftdurchflussrate von 20 l/min und einer Temperatur von 37°C gestartet. Als die Trübheit der Kultur etwa 1200 Klett-Einheiten erreichte, wurden 5,95 mg/l Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zugegeben. 0,75% Glucose wurde 2 und 3,5 Stunden nach der IPTG-Zugabe zugegefügt und die Kultur 11 Stunden nach dem Start der Kultur fortgesetzt. Die Kulturbrühe wurde 30 Minuten mit 10.000 U/min zentrifugiert, um die 540 g Zellen zu sammeln.
  • Beispiel 6
  • Reinigung von Met-76-Reste-Betacellulin
  • 1,0 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0), das 1 mM EDTA, 1 mM APMSF und 7 M Guanidinhydrochlorid enthielt, wurden zu 375 g Zellen, die in Beispiel 5 erhalten worden waren, zugegeben, die Mischung wurde über Nacht bei 4°C zur Extraktion gerührt und dann zentrifugiert (20 min mit 10.000 U/min). 19 l 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), das 0,5 mM oxidiertes Glutathion, 1 mM reduziertes Glutathion, 1 mM EDTA, 0,1 M Argininhydrochlorid und 2 M Harnstoff enthielt, wurde zu 1,0 l des entstehenden Überstands zugegeben zur Rückfaltung über Nacht bei 4°C und anschließend zentrifugiert (20 min bei 10.000 U/min), was 20 l Überstand ergab. Der Überstand wurde unter Verwendung eines Pelicon Kassettensystems eingeengt (Fraktionsmolekulargewicht: 5000, von Millipore). 13,2 l 2 M Harnstoff wurden zu 3,3 l des entsalzten Konzentrats zugegeben und der pH-Wert wurde dann mit Salzsäure auf 5,0 eingestellt. Das Konzentrat wurde mit einer Durchflussrate von 30 ml/min auf eine Poros 50HS Säule (2,2 cm × 12 cm, von Nippon Perceptive), die mit 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,0) equilibriert worden war, adsorbiert und die Säule wurde mit dem Puffer, der zur Equilibrierung verwendet worden war, gewaschen und anschließend mit einem linearen Gradienten von 0,3 bis 1,3 M Natriumchlorid eluiert.
  • Fraktionen, die Betacellulin mit 76 Resten enthielten, wurden gesammelt, dreifach mit destilliertem Wasser verdünnt und dann auf eine TSKgel CM-5PW-Säule (2,15 cm × 15 cm, von Tosoh), die mit 50 mM Natriumacetat (pH 4,5) equilibriert worden war, aufgebracht. Die Fraktionen wurden eluiert von der TSKgel CM-5PW-Säule, die das Met-76-Reste-Betacellulin adsorbiert worden war, mit einem linearen Gradienten von 0,24 bis 0,44 M Natriumchlorid. Fraktionen, die Met-76-Reste-Betacellulin enthielten, wurden gesammelt und an einer TSKgel ODS-120T-Säule (2,15 cm × 30 cm, von Tosoh), die mit 0,1% Trifluoressigsäure equilibriert worden war, adsorbiert und das Met-76-Reste-Betacellulin wurde mit einem linearen Gradienten von 17 bis 24% Acetonitril eluiert. Das Eluat wurde gegen 0,02% Trifluoressigsäure dialysiert und lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wurde in 10 ml destilliertem Wasser gelöst, durch eine Ag1-X8-Säule (1,0 cm × 10 cm, von Nippon Biorad), die mit Essigsäure behandelt worden war, durchfließen gelassen und dann wiederum lyophilisiert, was 93 mg Met-76-Reste-Betacellulin ergab.
  • Beispiel 7
  • Charakterisierung von Betacellulinmuteinen
  • Das in Beispiel 3 erhaltene Met-77-Reste-Betacellulinmutein und das in Beispiel 6 erhaltene Met-76-Reste-Betacellulinmutein wurden auf folgende Art und Weise charakterisiert.
  • a) Analyse mit SDS-PAGE
  • Die Betacellulinmuteine und Met-80-Reste-Betacellulin, das mit der Methode in der japanischen nicht geprüften Patentanmeldung (Kokai) H10-191989 hergestellt worden war, wurden in Probepuffer (125 mM Tris-HCl, 1% Natriumdodecylsulfat, 15% Glycerin, 5% 2-Mercaptoethanol, 0,005% Bromphenolblau) suspendiert und wurden auf Multigel 15/25 (Dai'ichi Kagaku Yakuhin) elektrophoretisch aufgetrennt. Die Anfärbung des Elektrophoresegels mit Rapid CBB Kanto (Kanto Chemical) ergab eine einzige Bande in praktisch allen Fällen (3).
  • b) Analyse der Aminosäurezusammensetzung
  • Die Betacellulinmuteine wurden in der Gasphase 24 und 48 Stunden bei 110°C mit 6 n Salzsäure, die 4% Thioglycolsäure enthielt, hydrolysiert und die Aminosäurezusammensetzung wurde mit einem Aminosäureanalyseautomaten (Hitachi L-8500A Aminosäureanalysator) bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Muteine Methionin enthielten, das aus dem Startcodon ATG stammte und übereinstimmten mit der aus den cDNA-Basensequenzen abgeleiteten Aminosäurezusammensetzung (Tabellen 1 und 2). Tabelle 1: Analyse der Aminosäurezusammensetzung von Betacellulin mit 77 Resten
    Anzahl der Reste pro Mol Theoretischer Wert
    Asx 7,2 7
    Thr 6,0 6
    Ser 4,6 5
    Glx 9,1 9
    Pro 3,9 4
    Gly 7,1 7
    Ala 4,0 4
    Val 3,7 4
    Met 0,9 1
    Ile 2,0 2
    Leu 2,1 2
    Tyr 3,0 3
    Phe 2,1 2
    Lys 5,0 5
    His 3,0 2
    Arg 6,8 7
    Cys ND 8
    Tabelle 2: Analyse der Aminosäurezusammensetzung von Betacellulin mit 76 Resten
    Anzahl der Reste pro Mol Theoretischer Wert
    Asx 6,2 6
    Thr 6,1 6
    Ser 5,1 5
    Glx 9,4 9
    Pro 4,1 4
    Gly 7,4 7
    Ala 4,1 4
    Val 3,8 4
    Met 1,0 1
    Ile 2,0 2
    Leu 2,0 2
    Tyr 3,1 3
    Phe 2,1 2
    Lys 5,0 5
    His 2,3 2
    Arg 7,1 7
    Cys ND 8
  • c) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
  • Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde analysiert unter Verwendung eines Gasphasenproteinsequenzautomaten (Applied Biosystems, Modell 477A). Die Ergebnisse zeigten, dass beide Muteine übereinstimmten mit der aus den cDNA-Basensequenzen abgeleiteten Aminosäurezusammensetzung. Beide Muteine hatten N-terminale Methionine, die aus dem Startcodon ATG stammten, wie die Art mit 80 Resten (Tabellen 3 und 4). Tabelle 3: Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz von Betacellulin mit 77 Resten
    PTH-Aminosäure nachgewiesen (pmol) Aminosäure abgeleitet aus Basensequenz
    1 Met (809) (Met)
    2 Asp (492) Asp
    3 Gly (615) Gly
    4 Asn (425) Asn
    5 Ser (161) Ser
    6 Thr (276) Thr
    7 Arg (253) Arg
    8 Ser (66) Ser
    9 Pro (168) Pro
    10 Glu (127) Glu
    Tabelle 4: Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz von Betacellulin mit 76 Resten
    PTH-Aminosäure nachgewiesen (pmol) Aminosäure abgeleitet aus Basensequenz
    1 Met (195) (Met)
    2 Asp (213) Asp
    3 Gly (413) Gly
    4 Asn (292) Asn
    5 Ser (99) Ser
    6 Thr (151) Thr
    7 Arg (198) Arg
    8 Ser (54) Ser
    9 Pro (149) Pro
    10 Glu (79) Glu
  • d) Analyse der C-terminalen Aminosäuren
  • Die C-terminalen Aminosäuren wurden bestimmt unter Verwendung eines Aminosäureanalyseautomaten (Hitachi L-8500A Aminosäureanalysator) durch Gasphasenhydrazinzersetzung (6 Stunden bei 100°C). Asparaginsäure wurde in dem Met-77-Reste-Betacellulin nachgewiesen und Valin wurde in dem Met-76-Reste-Betacellulin nachgewiesen (Tabellen 5 und 6) Tabelle 5
    Analyse der C-terminalen Aminosäure in Betacellulin mit 77 Resten
    Asp (Ausbeute: 32,5%)
    Tabelle 6
    Analyse der C-terminalen Aminosäure in Betacellulin mit 76 Resten
    Val (Ausbeute: 77,8%)
  • Beispiel 8
  • Test der wachstumsfördernden Aktivität unter Verwendung von 3T3-Zellen
  • Wie in Molecular Cell Biology, 8:588 (1988) beschrieben, wurde die wachstumsfördernde Aktivität untersucht mithilfe der 3H-Thymidinaufnahme in den stationären 3T3 A31-714 Klon 4 (International Journal of Cancer, 12:463 (1973)).
  • Spezifisch wurden unter Verwendung von Dulbecco's modifiziertem Eagle-MEM-Medium, das 5% Rinderserum enthielt, 100 μl 3T3 A31-714 Klon 4 mit 1000 Zellen/ml suspendiert und in 96-Napf-Platten geimpft und einen Tag bei 37°C in Kohlendioxidgasinkubatoren (5% Kohlendioxidgas, 95% Luft) gezüchtet. 75 μl Überstand wurden entnommen und 100 μl serumfreies Dulbecco's modifiziertes Eagle-MEM-Medium wurden zugegeben, um die Serumkonzentration auf 1% einzustellen. Nach zwei weiteren Tagen Kultur wurden verschiedene Konzentrationen Met-77-Reste-Betacellulin, das in Beispiel 3 hergestellt worden war, Met-76-Reste-Betacellulin, das in Beispiel 6 hergestellt worden war, und Met-80-Reste-Betacellulin, das gemäß der in der japanischen nicht geprüften Patentanmeldung (Kokai) H10-191989 hergestellt worden war, zugegeben. 16 Stunden nach Zugabe von Betacellulin wurde 3H-Thymidin (Amersham Pharmacia Biotech) in einer Menge von 0,25 μCi/Napf zugegeben, nach 4 Stunden wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, 100 μl SDS zugegeben und die Zellen lysiert. Das Zelllysat wurde in Szintillationsgläschen überführt, 1 ml Szintillator A (Wako Pure Chemicals) zugegeben und die Aufnahme an 3H-Thymidin in die Zelle mit einem Szintillationszähler gemessen (4).
  • Beispiel 9
  • Test der β-zelldifferenzierungsfördernden Aktivität unter Verwendung von AR42J-Zellen
  • Zellen der AR42J-Zelllinie, die aus Pankreaskrebs stammt, der durch chemische Karzinogene induziert wurde (Christophe, Am. J. Physiol., 266:G963 (1994)), wurden in einer Konzentration von 105 Zellen/ml unter Verwendung von Dulbecco's modifiziertem Eagle-MEM-Medium, das 10% totales Kälberserum und das in Beispiel 3 hergestellte Met-77-Reste-Betacellulin, das in Beispiel 6 hergestellte Met-76-Reste-Betacellulin oder das gemäß der Methode in der japanischen nicht geprüften Patentanmeldung (Kokai) H10-191989 hergestellte Met-80-Reste-Betacellulin enthielt, suspendiert. 500 μl dieser Suspensionen wurden in Kammerträger geimpft und 5 Tage bei 37°C in Kohlendioxidgasinkubatoren (5% Kohlendioxidgas, 95% Luft) inkubiert. Nach 5 Tagen wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen, in 10% Formaldehyd fixiert und 5 Minuten mit 0,1% Triton X-100 behan delt. Block Ace (Snow Brand, Japan) wurde dann 40 Minuten lang zur Blockierung bei Raumtemperatur zugegeben. Anti-Insulin-Antikörper (von Advanced Immunochemicals), verdünnt mit 10% Block Ace, wurden zugegeben und eine Reaktion wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. 0,1% Triton X-100 wurde zugegeben, die Reaktionslösung 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und die Zellen wurden dann dreimal mit PBS gewaschen. Mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) markierte Anti-Maus-IgG-Antikörper (Cappel), die mit 10% Block Ace verdünnt worden waren, wurden zugegeben und eine Reaktion wurde 40 Minuten lang durchgeführt. 0,1% Triton X-100 wurde zugegeben, die Reaktionslösung 5 Minuten lang stehen gelassen, die Zellen dann dreimal mit PBS gewaschen und wurden dann unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Gefärbte Zellen, d.h. Zellen, die zu Insulin produzierenden β-Zellen differenziert waren, wurden in allen Fällen unter Beteiligung der Zugabe von Betacellulin gefunden (5).
  • Beispiel 10
  • Konstruktion eines Expressionsvektors für das alkalische Phosphatasegen aus Humanplazenta
  • Die Differenzierung fördernde Aktivität in β-Zellen wurde auch bestimmt unter Verwendung von AR42J-Zellen, die mit dem Vektor transformiert worden waren, der alkalische Phosphatase enthielt, die als Reporter stromabwärts des Insulinpromotors ligiert war. Spezifisch produzieren Zellen, die durch Zugabe von Betacellulin zu β-Zellen differenziert haben, alkalische Phosphatase. Als Ergebnis kann durch Testen der alkalischen Phosphataseaktivität die die Differenzierung fördernde Aktivität in β-Zellen quantitativ untersucht werden.
  • Genomische DNA wurde auf übliche Art und Weise aus Rattenschwanz präpariert. Die Insulinpromotorregion mit 0,75 kb wurde mit PCR amplifiziert mit einem Primer RI-1 (5'-AGAGTCAAGGATCCCCCAACCACT-3') und einem Primer RI-3 (5'-AGCTGGTCACTTAGGGCTGGGG-3') basierend auf der Basissequenz des wohl bekannten Ratteninsulin-II-Genpromotors (Gen Bank: Zugangsnummer J00748) unter Verwendung von genomischer DNA als Matrize. Die PCR wurde auch durchgeführt unter Verwendung der Primer RI-1Cla (5'-GAATCGATAGAGTCAAGGATCCCCCA-3') und RI-3Xho (5'-GACTCGAGCTGGTCACTTAGGG-3') unter Verwendung des PCR-Produkts als Matrize. Die amplifizierten DNA-Fragmente mit 0,75 kb wurden isoliert und das durch Insertion in den pT7 Blue Vector (Novagen 69820-1) erhaltene pTB1881-Plasmid wurde verwendet, um die Basensequenz der klonierten Fragmente zu sequenzieren, was bestätigt, dass es der Ratteninsulinpromotor war. Das pTBI881-Plasmid wurde mit XhoI-ClaI verdaut, was DNA-Fragmente mit 0,73 kb ergab (Ratteninsulinpromotor). Das pTB1330-Plasmid zur Expression von 2,0 kb cDNA (J. Berger et al., Gene, 66, 1 (1988)), die alkalische Phosphatase aus Humanplazenta (PLAP) codiert, wurde mit XhoI-HindIII verdaut. Die entstehenden DNA-Fragmente mit 2,7 kb (PLAP cDNA, die eine aus SV40 stammende Spleißstelle und PolyA-Additionsstelle, von pBR322 abgeleiteten ori und ein Ampicillinresistenzgen enthält) wurden isoliert und das XhoI-CalI-Fragment mit 0,73 kb der vorher erwähnten Ratteninsulinpromotorregion wurde mit T4 DNA-Ligasereaktion ligiert, was das Plasmid pTB1898 ergab.
  • Beispiel 11
  • Konstruktion von PLAP Expressions-AR42J-Zellen
  • Das pMCneopolyA-Plasmid (Stratagene), das das neor-Gen von Tn5 enthält, und das PLAP Expressionsplasmid pTB1898 wurden gleichzeitig in AR42J-Zellen eingeführt unter Verwendung des Transfektionsreagenzes TransITTM-LT1 (Mirus, PenVera Corporation). Zellen mit eingeführtem Plasmid wurden dann 2 Tage in DMEM, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt war, gezüchtet und die Kultur wurde dann in einem Selektionsmedium fortgesetzt, das mit 800 μg/ml G418 (geneticin, Gibco BRL) ergänzt war. Klone wurden isoliert durch begrenzende Verdünnung von Zellen, die mit G418-Resistenz wuchsen.
  • Zellen von jedem Klon wurden in 24-Napf-Platten ausgesät und 4 Tage mit und ohne Zugabe von 20 ng/ml Met-80-Reste-Betacellulin gezüchtet. Der Überstand wurde gesammelt und 30 Minuten bei 65°C hitzebehandelt und die Aktivität der alkalischen Phosphatase in den Medien wurde dann getestet. Klone, die eine erhöhte alkalische Phosphataseaktivität zeigten bei Zugabe von 80-Reste-Betacellulin wurden selektiert. Die Ergebnisse mit verschiedenen Klonen sind in Tabelle 7 unten angegeben. Tabelle 7
    Klone PLAP-Aktivität (A 405)
    Kein BTC zugefügt BTC zugefügt
    AR1898-033 0,034 0,366
    AR1898-053 0,008 0,089
    AR1898-0192 0,077 0,752
  • Beispiel 12
  • Test der β-Zelldifferenzierung fördernden Aktivität unter Verwendung von PLAP Expressions-AR42J-Zellen
  • Die PLAP Expressions-AR42J-Zellen, die in Beispiel 11 konstruiert worden waren, wurden auf eine Konzentration von 105 Zellen/ml unter Verwendung von Dulbecco's modifiziertem Eagle-MEM-Medium, das 10% fötales Kälberserum und verschiedene Konzentrationen des in Beispiel 3 hergestellten Met-77-Reste-Betacellulins, des in Beispiel 6 hergestellten Met-76-Reste-Betacellulins oder des gemäß der Methode in der japanischen nicht geprüften Patentanmeldung (Kokai) H10-191989 hergestellten Met-80-Reste-Betacellulins enthielt, suspendiert. 100 μl dieser Suspensionen wurden in 96-Napf-Platten geimpft und 5 Tage bei 37°C in Kohlendioxidgasinkubatoren (5% Kohlendioxidgas, 95% Luft) inkubiert. Nach 5 Tagen wurde der Überstand entnommen und 30 Minuten bei 65°C behandelt und 50 μl wurden in 96-Napf-Mikroplatten, die 50 μl 2XSEAP enthielten (2 M Diethanolamin, 1 mM MgCl2, 20 mM Homoarginin) zugefügt. Die Proben wurden 10 Minuten auf 37°C gehalten, 10 μl 20 mg/ml p-Nitrophenylphosphorsäure (Sigma) dann zugefügt und die Reaktion 16 Stunden bei 37°C durchgeführt (6). Met-77-Reste-Betacellulin und Met-76-Reste-Betacellulin zeigten praktisch die gleiche fördernde Aktivität bei der Induzierung der Differenzierung wie das Met-80-Reste-Betacellulin.
  • Beispiel 13
  • Konstruktion der Expressions-Zelllinie für die Reste 2 bis 76
  • (ein N-terminaler und drei C-terminale Reste fehlen)
  • Ein Expressionsplasmid für Betacellulin mit den Resten 2 bis 76 (dem ein N-terminaler Rest und drei C-terminale Reste fehlen) wurde auf folgende Art und Weise konstruiert (7).
  • Das Betacellulin-Strukturgen mit den Resten 2 bis 76 (dem ein N-terminaler Rest und drei C-terminale Reste fehlten) wurde mit PCR aus dem Expressionsplasmid pTCIIBTC76 von Betacellulin mit 76 Resten (dem drei C-terminale Reste fehlen) amplifiziert (Beispiel 4) unter Verwendung eines Primers 3 (5'-CAGCATATGGGGAATTCCACCAGAAGTCCT) mit einer NdeI-Spaltstelle und einem Startcodon stromaufwärts benachbart dem Glycin an Position 2 und einem Primer 4 (5'-GGATCCCTAAACTCTCTCACACCTTGCTCCAATG) mit einem Stoppcodon und einer BamHI-Spaltstelle nach dem Valin am C-Ende. Das so mit PCR amplifizierte Gen wurde in den pCR2.1-Vektor ligiert unter Verwendung eines TA Original Cloning Kit (von Invitrogen), um pCR2.1BTC2-76 herzustellen. Dieses Plasmid wurde in E. coli JM109 eingeführt und Transformanten wurden selektiert unter Verwendung der Ampicillinresistenz als Indikator. Transformanten mit pCR2.1BTC2-76 wurden gezüchtet und pCR2.1BTC2-76 wurde hergestellt unter Verwendung eines QIAprep8 Miniprep Kits (von Qiagen).
  • pCR2.1BTC2-76 wurde mit NdeI und BamHI zur Agaroseelektrophorese verdaut. Ungefähr 230 bp des Betacellulin-Strukturgens mit den Resten 2 bis 76 wurden gewonnen unter Verwendung eines QIAGEN Gel Extraction Kits (von Qiagen). Der Expressionsvektor pTCII (Beispiel 1) wurde mit NdeI und BamHI zur Agaroseelektrophorese verdaut und Banden mit ungefähr 4,6 kbp wurden auf gleiche Weise gewonnen. Betacellulin-Strukturgen mit den Resten 2 bis 76 wurde in das NdeI-BamHI-Fragment des pTCII-Expressionsvektors ligiert und dann in E. coli JM109 zur Selektion von Transformanten durch Tetracyclinresistenz eingeführt und Plasmide wurden wiederum aus dem Stamm gewonnen, was das Expressionsplasmid pTCIIBTC2-76 ergab.
  • Das entstehende pTCIIBTC2-76 wurde in E. coli MM294 (DE3) eingeführt zur Selektion von Transformanten durch Tetracyclinresistenz, was den Betacellulin mit den Resten 2 bis 76 exprimierenden Stamm MM294 (DE3)/pTCIIBTC2-76 ergab.
  • Beispiel 14
  • Kultur des Betacellulin mit den Resten 2 bis 76 exprimierenden Stamms
  • Der Betacellulin mit den Resten 2 bis 76 exprimierende Stamm MM294 (DE3)/pTCIIBTC2-76 wurde 16 Stunden bei 30°C in 30 ml LB-Medium (1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid), das 10 mg/l Tetracyclin enthielt, gezüchtet. 10 ml der entstehenden Kultur wurden verwendet, um jeden von 6 l-1-Mayer-Kolben, die 200 ml primäre Fermentationsmedien enthielten (1,68% Natriummonohydrogenphosphat, 0,3% Natriumdihydrogenphosphat, 0,1% Ammoniumchlorid, 0,05% Natriumchlorid, 0,012% Magnesiumsulfat, 0,0007% Thiaminhydrochlorid, 1,5% Glucose, 1,5% Hicase) zu beimpfen für eine mit 200 U/min gerührte Kultur und bei einer Temperatur von 37°C. Als die Trübheit der Kultur etwa 160 Klett-Einheiten erreichte, wurden 5,95 mg/l Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zugegeben. Die Kultur wurde weitere 4 Stunden, nachdem das IPTG zugefügt worden war, fortgesetzt. Die Kulturbrühe wurde 30 Minuten mit 9.000 U/min zentrifugiert, um 5,1 g Zellen zu sammeln.
  • Beispiel 15
  • Reinigung von Betacellulin mit den Resten 2 bis 76
  • 15 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0), das 1 mM EDTA, 1 mM APMSF und 7 M Guanidinhydrochlorid enthielt, wurden zu 5 g der in Beispiel 14 erhaltenen Zellen zugegeben, die Mischung wurde über Nacht bei 4°C zur Extraktion gerührt und dann zentrifugiert (10 min mit 9.000 U/min). 250 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), das 0,5 mM oxidiertes Glutathion, 1 mM reduziertes Glutathion, 1 mM EDTA, 0,1 M Argininhydrochlorid und 2 M Harnstoff enthielt, wurde zu 15 ml des entstehenden Überstands zugegeben zur Rückfaltung über Nacht bei 4°C und anschließend zentrifugiert (10 min mit 10.000 U/min), was 265 ml Überstand ergab. 1 l 2 M Harnstoff wurden zu dem Überstand zugegeben, der pH-Wert dann mit Essigsäure auf 5,0 eingestellt und über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Er wurde dann zentrifugiert (10 min mit 10.000 U/min), der entstehende Überstand mit einer Durchflussrate von 30 ml/min auf eine Poros 50HS Säule (2,2 cm × 12 cm, von Nippon Perceptive), die mit 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,0) equilibriert worden war, adsorbiert und die Säule wurde intensiv mit dem Puffer, der zur Equilibrierung verwendet worden war, gewaschen und anschließend mit einem linearen Gradienten von 0,3 bis 1,3 M Natriumchlorid eluiert. Die Fraktionen, die Betacellulin mit den Resten 2 bis 76 enthielten, wurden gesammelt, dreifach mit 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 4,5) verdünnt und dann auf eine TSKgel CM-5PW-Säule (0,75 cm × 7,5 cm, von Tosoh), die mit dem Puffer equilibriert worden war, aufgetragen. Die Fraktionen wurden von der TSKgel CM-5PW-Säule, auf der das Betacellulin mit den Resten 2 bis 76 adsorbiert worden war, eluiert mit einem linearen Gradienten von 0,3 bis 0,5 M Natriumchlorid. Die Fraktionen, die das Betacellulin mit den Resten 2 bis 76 enthielten, wurden gesammelt und auf eine TSKgel ODS-120T-Säule (2,15 cm × 30 cm, von Tosoh) adsorbiert, die mit 0,1% Trifluoressigsäure equilibriert worden war, und das Betacellulin mit den Resten 2 bis 76 wurde mit einem linearen Gradienten von 20 bis 44% Acetonitril eluiert. Das Eluat wurde lyophilisiert, dann in 5 ml destilliertem Wasser gelöst, durch eine Ag1-X8-Säule (1,0 cm × 10 cm, von Nippon Biorad), die mit Essigsäure behandelt worden war, durchfließen gelassen und dann wiederum lyophilisiert, was 0,7 mg Betacellulin mit den Resten 2 bis 76 ergab.
  • Beispiel 16
  • Konstruktion eines Expressionsstamms für die Reste 24 bis 76
  • (denen 23 N-terminale und drei C-terminale Reste fehlen)
  • Ein Expressionsplasmid für Betacellulin mit den Resten 24 bis 76 (dem 23 N-terminale Reste und drei C-terminale Reste fehlen) wurde auf folgende Art und Weise konstruiert (8).
  • Das Betacellulin-Strukturgen mit den Resten 24 bis 76 (dem 23 N-terminale Reste und drei C-terminale Reste fehlen) wurde mit PCR aus dem Expressionsplasmid pTCIIBTC76, das in Beispiel 4 hergestellt worden war, mit Betacellulin mit 76 Resten (dem drei C-terminale Reste fehlen) amplifiziert unter Verwendung eines Primers 5 (5'-CAGCATATGGCTACCACCACACAATCAAAG) mit einer NdeI-Spaltstelle und einem Startcodon stromaufwärts benachbart dem Alanin an Position 24 und einem Primer 4 (5'- GGATCCCTAAACTCTCTCACACCTTGCTCCAATG) mit einem Stoppcodon und einer BamHI-Spaltstelle nach dem Valin am C-Ende. Das so mit PCR amplifizierte Gen wurde in den pCR2.1-Vektor ligiert unter Verwendung eines TA Original Cloning Kits (von Invitrogen), um pCR2.1BTC24-76 herzustellen. Dieses wurde in E. coli JM109 eingeführt und Transformanten wurden selektiert unter Verwendung der Ampicillinresistenz als Indikator. Transformanten mit pCR2.1BTC24-76 wurden gezüchtet und pCR2.1BTC24-76 wurde unter Verwendung eines QIAprep8 Miniprep Kits (von Qiagen) präpariert.
  • Der pCR2.1BTC24-76 wurde mit NdeI und BamHI zur Agaroseelektrophorese verdaut und das Betacellulin-Strukturgen mit den Resten 24 bis 76 mit ungefähr 160 bp wurde gewonnen unter Verwendung eines QIAGEN Gel Extraction Kits (von Qiagen). Der in Beispiel 1 hergestellte Expressionsvektor pTCII wurde mit NdeI und BamHI zur Agaroseelektrophorese verdaut und Banden mit ungefähr 4,6 kbp wurden auf gleiche Weise gewonnen. Das Betacellulin-Strukturgen mit den Resten 24 bis 76 wurde in das NdeI-BamHI-Fragment des pTCII-Expressionsvektors ligiert und dann in E. coli JM109 zur Selektion von Transformanten durch Tetracyclinresistenz eingeführt und Plasmide wurden wiederum aus dem Stamm gewonnen, was das Expressionsplasmid pTCIIBTC24-76 ergab.
  • Das entstehende pTCIIBTC24-76 wurde in E. coli MM294 (DE3) zur Selektion von Transformanten durch Tetracyclinresistenz eingeführt, was den Expressionsstamm für Betacellulin mit den Resten 24 bis 76 MM294 (DE3)/pTCIIBTC24-76 ergab.
  • Beispiel 17
  • Kultur eines Expressionsstamms für Betacellulin mit den Resten 24 bis 76
  • Der Expressionsstamm für Betacellulin mit den Resten 24 bis 76 MM294 (DE3)/pTCIIBTC24-76 wurde 16 Stunden bei 30°C in 30 ml LB-Medium (1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid), das 10 mg/l Tetracyclin enthielt, gezüchtet. Die entstehende Kultur wurde verwendet, um 5 l-1-Mayer-Kolben, die 150 ml primäre Fermentationsmedien (1,68% Natriummonohydrogenphosphat, 0,3% Natriumdihydrogenphosphat, 0,1% Ammoniumchlorid, 0,05% Natriumchlorid, 0,012% Magnesiumsulfat, 0,0007% Thiaminhydrochlorid, 1,5% Glucose, 1,5% Hicase) enthielten, zu beimpfen für eine mit 200 U/min gerührte Kultur bei einer Temperatur von 37°C. Als die Trübheit der Kultur etwa 160 Klett-Einheiten erreichte, wurden 5,95 mg/l Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zugegeben. Die Kultur wurde weitere 4 Stunden, nachdem das IPTG zugefügt worden war, fortgesetzt. Die Kulturbrühe wurde 30 Minuten mit 10.000 U/min zentrifugiert, um 3,9 g Zellen zu sammeln.
  • Beispiel 18
  • Reinigung von Betacellulin mit den Resten 24 bis 76
  • 12 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0), das 1 mM EDTA, 1 mM APMSF und 7 M Guanidinhydrochlorid enthielt, wurden zu 3,9 g der in Beispiel 5 erhaltenen Zellen zugegeben, die Mischung wurde über Nacht bei 4°C zur Extraktion gerührt und dann zentrifugiert (10 min mit 9.000 U/min). 200 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), das 0,5 mM oxidiertes Glutathion, 1 mM reduziertes Glutathion, 1 mM EDTA, 0,1 M Argininhydrochlorid und 2 M Harnstoff enthielt, wurden zu 12 ml des entstehenden Überstands zugegeben zur Rückfaltung über Nacht bei 4°C und an schließend zentrifugiert (10 min bei 10.000 U/min), was 212 ml Überstand ergab. 0,8 ml 2 M Harnstoff wurden zu dem Überstand zugegeben, der pH-Wert dann mit Essigsäure auf 5,0 eingestellt und über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Er wurde dann zentrifugiert (10 min mit 10.000 U/min), der entstehende Überstand bei einer Durchflussrate von 30 ml/min auf eine Poros 50HS Säule (2,2 cm × 12 cm, von Nippon Perceptive), die mit 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,0) equilibriert worden war, adsorbiert und die Säule intensiv mit dem zur Equilibrierung verwendeten Puffer gewaschen und anschließend mit einem linearen Gradienten von 0,3 bis 1,3 M Natriumchlorid eluiert. Die Fraktionen, die Betacellulin mit den Resten 24 bis 76 enthielten, wurden gesammelt, dreifach mit 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 4,5) verdünnt und dann auf eine TSKgel CM-5PW-Säule (0,75 cm × 7,5 cm, von Tosoh), die mit dem Puffer equilibriert worden war, aufgetragen. Die Fraktionen wurden von der TSKgel CM-5PW-Säule eluiert, auf die das Betacellulin mit den Resten 24 bis 76 adsorbiert worden war, mit einem linearen Gradienten von 0,3 bis 0,5 M Natriumchlorid. Die Fraktionen, die Betacellulin mit den Resten 24 bis 76 enthielten, wurden gesammelt und auf eine TSKgel ODS-120T-Säule (2,15 cm × 30 cm, von Tosoh), die mit 0,1% Trifluoressigsäure equilibriert worden war, adsorbiert und das Betacellulin mit den Resten 24 bis 76 mit einem linearen Gradienten von 20 bis 44% Acetonitril eluiert. Das Eluat wurde lyophilisiert, dann in 5 ml destilliertem Wasser gellst, durch eine Ag1-X8-Säule (1,0 cm × 10 cm, von Nippon Biorad) durchfließen gelassen, die mit Essigsäure behandelt worden war, und dann wiederum lyophilisiert, was 0,4 mg Betacellulin mit den Resten 24 bis 76 ergab.
  • Beispiel 19
  • Charakterisierung der Betacellulinmuteine
  • Das in Beispiel 3 erhaltene Betacellulinmutein mit den Resten 2 bis 76 und das in Beispiel 6 erhaltene Betacellulinmutein mit den Resten 24 bis 76 wurden auf folgende Art und Weise charakterisiert.
  • a) Analyse mit SDS-PAGE
  • Die Betacellulinmuteine und das Betacellulin mit den 76 Resten, das in Beispiel 6 hergestellt worden war, wurden in Probepuffer (125 mM Tris-HCl, 1% Natriumdodecylsulfat, 15% Glycerin, 5% 2-Mercaptoethanol, 0,005% Bromphenolblau) suspendiert und auf Multigel 15/25 (Dai'ichi Kagaku Yakuhin) elektrophoretisch aufgetrennt. Die Anfärbung des elektrophoretisch aufgetrennten Gels mit Rapid CBB Kanto (Kanto Chemical) ergab eine einzige Bande in praktisch allen Fällen (9).
  • b) Analyse der Aminosäurezusammensetzung
  • Die Betacellulinmuteine wurden in der Gasphase 24 und 48 Stunden bei 110°C mit 6 n Salzsäure, die 4% Thioglycolsäure enthielt, hydrolysiert und die Aminosäurezusammensetzung wurde mit einem Aminosäureanalyseautomaten bestimmt (Hitachi L-8500A Aminosäureanalysator). Die Ergebnisse zeigten, dass beide Muteine mit der auf Basis der cDNA-Basensequenzen vorhergesagten Aminosäurezusammensetzung übereinstimmten (Tabellen 8 und 9). Tabelle 8: Analyse der Aminosäurezusammensetzung von Betacellulin mit den Resten 2 bis 76
    Aminosäure Anzahl der Reste pro Mol Theoretischer Wert
    Asx 5,2 5
    Thr 6,0 6
    Ser 4,6 5
    Glx 9,4 9
    Pro 4,3 4
    Gly 7,3 7
    Ala 4,2 4
    Val 4,1 4
    Met 0,0 0
    Ile 2,0 2
    Leu 2,0 2
    Tyr 2,9 3
    Phe 2,1 2
    Lys 5,1 5
    His 2,3 2
    Arg 7,2 7
    Cys ND 8
    Tabelle 9: Analyse der Aminosäurezusammensetzung von Betacellulin mit den Resten 24 bis 76
    Aminosäure Anzahl der Reste pro Mol Theoretischer Wert
    Asx 1,0 1
    Thr 3,8 4
    Ser 2,9 3
    Glx 6,0 6
    Pro 2,1 2
    Gly 4,0 4
    Ala 3,0 3
    Val 3,9 4
    Met 0,0 0
    Ile 2,0 2
    Leu 0,0 0
    Tyr 2,9 3
    Phe 2,1 2
    Lys 4,9 5
    His 2,2 2
    Arg 6,0 6
    Cys ND 6
  • c) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
  • Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde analysiert unter Verwendung eines Gasphasenproteinsequenzautomaten (Applied Biosystems, Modell 477A). Die Ergebnisse zeigten, dass beide Muteine übereinstimmten mit der aus den cDNA-Basensequenzen abgeleiteten Aminosäurezusammensetzung. (Tabellen 10 und 11). Tabelle 10: Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz von Betacellulin mit den Resten 2 bis 76
    PTH-Aminosäure nachgewiesen (pmol) Aminosäure abgeleitet aus Basensequenz
    1 Gly (388) Gly
    2 Asn (319) Asn
    3 Ser (245) Ser
    4 Thr (261) Thr
    5 Arg (225) Arg
    6 Ser (144) Ser
    7 Pro (246) Pro
    8 Glu (105) Glu
    9 Thr (120) Thr
    10 Asn (162) Asn
    Tabelle 11: Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz von Betacellulin mit den Resten 24-76
    PTH-Aminosäure nachgewiesen (pmol) Aminosäure abgeleitet aus Basensequenz
    1 Ala (463) Ala
    2 Thr (251) Thr
    3 Thr (245) Thr
    4 Thr (483) Thr
    5 Gln (302) Gln
    6 Ser (109) Ser
    7 Lys (64) Lys
    8 Arg (145) Arg
    9 Lys (209) Lys
    10 Gly (170) Gly
  • d) Analyse der C-terminalen Aminosäuren
  • Die C-terminalen Aminosäuren wurden bestimmt unter Verwendung eines Aminosäureanalyseautomaten (Hitachi L-8500A Aminosäureanalysator) mit Gasphasenhydrazinolyse (6 Stunden bei 100°C). Valin wurde bei beiden Muteinen nachgewiesen (Tabellen 12 und 13) Tabelle 12
    Analyse der C-terminalen Aminosäure in Betacellulin mit den Resten 2 bis 76
    Val (Ausbeute: 95,4%)
    Tabelle 13
    Analyse der C-terminalen Aminosäure in Betacellulin mit den Resten 24 bis 76
    Val (Ausbeute: 83,3%)
  • Beispiel 20
  • 1) EGF-Bindungstest unter Verwendung von A431-Zellen
  • Die zellwachstumsfördernde Aktivität wurde untersucht mithilfe der die Bindung von 125I-EGF hemmenden Aktivität unter Verwendung von menschlichen Stachelzellepithel-Karzinomzellen A431 (stark EGF-Rezeptor exprimierende Linie).
  • Spezifisch wurden 100 μl A431-Zellen, die in einer Konzentration von 105 Zellen/ml unter Verwendung von Dulbecco's modifiziertem Eagle-MEM-(DMEM)-Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt war, suspendiert worden waren, in 96-Napf-Platten geimpft und 2 Tage bei 37°C in Kohlendioxidgasinkubatoren (5% Kohlendioxidgas und 95% Luft) gezüchtet. Nach 2 Tagen wurden die Zellen dreimal mit 200 μl/Napf Bindemedium, das eine äquimolare Mischung aus DMEM und F-12, das 20 mM HEPES und 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, enthielt, gewaschen und anschließend wurden 100 μl Bindemedium, das verschiedene Konzentrationen an unmarkiertem EGF, das in Beispiel 15 hergestellte 2-76-Reste-Betacellulin, das in Beispiel 18 hergestellte 24-76-Reste-Betacellulin, das in Beispiel 6 hergestellte Met-76-Reste-Betacellulin und das gemäß der japanischen nicht geprüften Patentanmeldung (Kokai) H10-191989 hergestellte Met-80-Reste-Betacellulin und 0,25 nM 125I-EGF (Amersham Pharmacia Biotech) enthielt, zugegeben. Die Mischungen wurden 90 Minuten bei 4°C stehen gelassen und dann dreimal mit 200 μl Bindemedium gewaschen und die Zellen wurden in 200 μl 0,1 n wässriger Natriumhydroxidlösung, die 1% SDS enthielt, lysiert. Das Zelllysat wurde dann in Szintillationsgläschen überführt, 1 ml Szintillator A (Wako Pure Chemicals) zugegeben und die die Bindung von 125I-EGF hemmende Aktivität mit einem Szintillationszähler untersucht.
  • 2) Test der β-Zelldifferenzierung fördernden Aktivität unter Verwendung von alkalische Phosphatase exprimierenden AR42J-Zellen aus Humanplazenta
  • PLAP-Expressions-AR42J-Zellen wurden auf eine Konzentration von 105 Zellen/ml unter Verwendung von Dulbecco's modifiziertem Eagle-MEM-Medium, das 10% fötales Kälberserum und unterschiedliche Konzentrationen des in Beispiel 15 hergestellten 2-76-Reste-Betacellulins, des in Beispiel 18 hergestellten 24-76-Reste-Betacellulins, des in Beispiel 6 hergestellten Met-76-Reste-Betacellulins, oder des gemäß der japanischen nicht geprüften Patentanmeldung (Kokai) H10-191989 hergestellten Met-80-Reste-Betacellulins enthielt, suspendiert. 100 μl dieser Suspensionen wurden in 96-Napf-Platten geimpft und 5 Tage bei 37°C in Kohlendioxidgasin kubatoren (5% Kohlendioxidgas, 95% Luft) inkubiert. Nach 5 Tagen wurde der Kulturüberstand 30 Minuten bei 65°C behandelt und 50 μl wurden dann in 96-Napf-Mikroplatten, die 50 μl 2 × SEAP (2 M Diethanolamin, 1 mM MgCl2, 20 mM Homoarginin) enthielten, gegeben. 10 μl 20 mg/ml p-Nitrophenylphosphorsäure (Sigma) wurden zugegeben und die Reaktion erfolgte etwa 16 Stunden lang bei 37°C. Das Verhältnis zwischen EGF-Aktivität und BTC-Aktivität aller Muteine reduzierte sich auf etwa 5% von dem von Met-80-Reste-Betacellulin und war etwa gleich wie das von Met-76-Reste-Betacellulin ohne offensichtlichen Einfluss der N-terminalen Deletion.
  • 3) Die Ergebnisse von 1) und 2) oben sind in Tabelle 14 zusammengefasst.
  • Tabelle 14
    BTC-Aktivität EC50 (nM) EGF-Aktivität IC50 (nM) EGF/BTC im Vergleich zu Met-BTC80
    Met-BTC80 0,07 1,2 100,0%
    Met-BTC76 0,30 95,1 5,4%
    BTC2-76 0,12 38,6 5,3%
    BTC24-76 0,03 11,0 4,7%
  • Beispiel 21
  • Konstruktion von hBTC50-Mutein-A-Expressionsplasmid pTB1985, das drei von Heregulin (Her) abgeleitete Reste zwischen Cys3 und Cys4 enthält
  • Eine PCR wurde durchgeführt mit pTB1976 als Matrize unter Verwendung von (1) einem Primer PET-1 auf der 5'-Seite (5'-GAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAG-3') und einem Primer BTC-1 auf der 3'-Seite (5'-AGGAGGGCGTCGAGGGGTTCTGCTCGGCCA-3') und (2) einem Primer BTC-2 auf der 5'-Seite (5'-TGGCCGAGCAGAACCCCTCGACGCCCTCCT-3') und einem Primer BTC-3 auf der 3'-Seite (5'-TCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTC-3').
  • Eine Mischung der PCR-Produkte von (1) und (2) wurde als Matrize für die PCR unter Verwendung eines Primers BT-95h auf der 5'-Seite und eines Primers BT-94h auf der 3'-Seite verwendet, was DNA-Fragmente ergab, die ein Mutein A mit drei Aminosäuren (Asn, Pro, Ser) der Her-Sequenz codierten, die zwischen Cys3 und Cys4 von hBTC50 insertiert war. Das DNA-Fragment wurde mit NdeI und BamHI verdaut und dann in die NdeI-BamHI-Position von pET-3c insertiert, um pTB1985 herzustellen.
  • Beispiel 22
  • Konstruktion des hBTC50-Mutein-B-Expressionsplasmids pTB1987 mit sieben N-terminalen Resten, die durch fünf Reste des Epithelwachstumsfaktors (EGF) in den entsprechenden Postionen substituiert sind
  • pTB1976 wurde als Matrize in der PCR verwendet unter Verwendung eines Primers BTC-7 auf der 5'-Seite (5'-TATACATATGAACAGCGACTCTGAGTGCCCCAAGC-3') und des Primers BT-94h auf der 3'-Seite, was DNA-Fragmente ergab, die Mutein B codierten, bei dem sieben N-terminale Reste von hBTC50 durch fünf entsprechende EGF-Reste ersetzt waren. Das DNA-Fragment wurde mit NdeI und BamHI verdaut und dann in die NdeI-BamHI-Position von pET-3c eingebaut, um pTB1987 herzustellen.
  • Beispiel 23
  • Expression in E. coli
  • Das pTB1976-Plasmid, pTB1985-Plasmid und pTB1987-Plasmid, die in den folgenden Referenzbeispielen und obigen Beispielen hergestellt wurden, wurden in E. coli BL21 (DE3) pLysS (Novagen) zur Expression unter der Kontrolle des Φ10-Promotors des T7-Phagen eingeführt. Die verschiedenen E.-coli-Rekombinanten wurden bei 37°C unter Verwendung von LB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin und 100 μg/ml Chloramphenicol enthielt, gezüchtet. Als die Trübheit 160 Klett-Einheiten erreichte, wurde Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid auf eine Endkonzentration von 0,4 mM zugegeben und die Kultur wurde weitere 4 Stunden bei 37°C fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und bei –80°C bis zur Extraktion aufbewahrt.
  • Beispiel 24
  • Reinigung von hBTC50, Mutein A und Mutein B
  • 4-1) Herstellung von E.-coli-Inclusion-Bodies
  • Die aus 400 ml Kulturbrühe geernteten Zellen wurden in 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10% Saccharose und 10 mM EDTA suspendiert und anschließend eingefroren und aufgetaut. Die Zellen wurden dann 30 Minuten in Eis stehen gelassen und vollständig lysiert. Sie wurden durch Ultraschall (dreimal für 10 s) aufgerissen, während sie auf Eis gekühlt wurden und dann zentrifugiert (15 min bei 9.000 U/min und einer Temperatur von 4°C; Beckman) und der Niederschlag wurde wiederum gesammelt. Diese Waschschritte wurden dreimal wiederholt, um Inclusion-Bodies zu präparieren.
  • 4-2) Proteinextraktion und Rückfaltung
  • Die in 4-1) hergestellten Inclusion-Bodies wurden in 8 ml 7 M Guanidin-HCl, 0,1 M Tris-CH3COOH (pH 8,0) und 1 mM EDTA suspendiert und sie wurden vorsichtig mit einem Rührer 1 Stunde lang bei 4°C gerührt, um rekombinantes Protein zu extrahieren. Reduziertes Glutathion wurde auf 0,1 M zugegeben, der pH-Wert wurde auf 8,4 mit NaOH-Lösung eingestellt und Stickstoffgas wurde in den Extrakt geblasen, um Luft zu verdrängen. Der Extrakt wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann mit 20 Volumina 10 mM Tris-CH3COOH (pH 8,0), 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 1 mM Benzamidin verdünnt. Der verdünnte Extrakt wurde zentrifugiert (9.000 U/min, 15 min, 25°C), um unlösliches Material zu entfernen, oxidiertes Glutathion wurde auf eine Konzentration von 0,5 mM dem Überstand zugegeben und die Lösung wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der Überstand (9.000 U/min, 15 min, 25°C) wurde lyophilisiert und eingeengt und dann dialysiert (Spectrapor: MWCO 1000) gegen 50 mM Tris-CH3COOH (pH 5,5) und 1 mM EDTA bei 4°C. Nach der Dialyse wurde der Überstand (9.000 U/min, 15 min, 4°C) mit einer Acetatcellulosemembran (Millex GV, 0,22 μm: Millipore) filtriert, um unlösliches Material zu entfernen.
  • 4-3) Reinigung des Proteins
  • Die Lösung, die rückgefaltetes Protein enthielt, wurde auf eine Kationenaustauscher-HPLC-Säule (250 × 4,1 mm, I.d., Synchrom CM300, Synchropak), die mit 50 mM Natriumacetat (pH 5,5) equilibriert worden war, geladen und mit einem Gradienten von 0 bis 1 M NaCl eluiert, um Fraktionen zu erhalten. Die eluierten Fraktionen, die bei OD280 beobachtet wurden, wurden auf eine C4-Reverse-HPLC-Säule (150 × 4,6 mm I.d., Ultron 300 C4: Chromatopacking Center), die mit 0,1% HCl und 1% CH3CN equilibriert worden war, geladen und wurden mit einem Gradienten von 1 bis 40% CH3CN eluiert. Die Peakfraktionen, die durch Säulenchromatographie erhalten wurden, wurden dann lyophilisiert. Die Ausbeuten an Mutein A und B waren 78,7 bzw. 103,1 μg.
  • 4-4) Bestimmung der Proteinreinheit
  • Um die Reinheit des gereinigten Produkts zu bestimmen, wurde das Produkt auf eine C18-Reverse-Phase-HPLC-Säule (150 × 4,6 mm i.d., ODS120T, Tosoh) geladen und mit einem Gradienten von 15 bis 30% CH3CN eluiert, was die Identität der Peakproteine der Muteine A und B bestätigte. Beide Proteine hatten eine Reinheit von 94% oder mehr.
  • Beispiel 25
  • Test der zellwachstumsfördernden Aktivität unter Verwendung von 3T3-Zellen
  • Die zellwachstumsfördernde Aktivität wurde untersucht mithilfe der 3H-Thymidin-Aufnahme in einen stationären 3T3 A31-714 Klon 4 (International Journal of Cancer, 12:463 (1973)), wie in Molecular Cell Biology, 8:588 (1988) beschrieben.
  • 100 μl 3T3 A31-714 Klon 4, die mit 1000 Zellen/ml unter Verwendung von Dulbecco's modifiziertem Eagle-MEM-Medium, das 5% Rinderserum enthielt, suspendiert waren, wurden in 96-Napf-Platten geimpft und 1 Tag bei 37°C in Kohlendioxidgasinkubatoren (5% Kohlendioxidgas, 95% Luft) gezüchtet. 75 μl Überstand wurden entnommen und 100 μl serumfreies Dulbecco's modifiziertes Eagle-MEM-Medium wurden zugegeben, um die Serumkonzentration auf 1% einzustellen. Nach zwei weiteren Tage Kultur folgte die Zugabe verschiedener Konzentrationen von hBTC50, Mutein A oder Mutein B, das in den obigen Beispielen hergestellt worden war. 16 Stunden, nachdem dies zugegeben worden war, wurde 3H-Thymidin (Amersham Pharmacia Biotech) in einer Menge von 0,25 μCi/Napf zugegeben, nach 4 Stunden wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, 100 μl 5% SDS wurden zugegeben und die Zellen wurden lysiert. Das Zelllysat wurde in Szintillationsgläschen überführt, 1 ml Szintillator A (Wako Pure Chemicals) wurde zugegeben und die Aufnahme von 3H-Thymidin in die Zellen wurde mit einem Szintillationszähler untersucht.
  • Tabelle 15 gibt die Ergebnisse der Konzentrationen für hBTC50 und die Muteine an, die 50% Aktivität zeigen (ED50), wobei 100% die maximale Aufnahme des 80-Reste-Betacellulins (Referenz) ist. Tabelle 15: Zellwachstumsfördernde Aktivität
    Probe ED50 (nM)
    hBTC50 0,01
    Mutein A 0,6
    Mutein B > 10,0
  • Beispiel 26
  • Test der β-Zelldifferenzierung fördernden Aktivität unter Verwendung von AR42J-Zellen
  • Zellen der AR42J-Zelllinie, die aus Pankreaskrebs stammt, der durch chemische Karzinogene induziert wurde (Christophe, Am. J. Physiol., 266:G963 (1994)), wurden auf eine Konzentration von 105 Zellen/ml in Dulbecco's modifiziertem Eagle-MEM-Medium, das 10% fötales Kälberserum hBTC50, Mutein A, Mutein B oder das 80-Reste-Betacellulin (hBTC80), das gemäß der Methode in der japanischen nicht geprüften Patentanmeldung (Kokai) H10-191989 hergestellt worden war, enthielt, suspendiert. 500 μl dieser Suspensionen wurden auf Kammerträger geimpft und 5 Tage bei 37°C in Kohlendioxidgasinkubatoren (5% Kohlendioxidgas, 95% Luft) inkubiert. Nach 5 Tagen wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen, in 10% Formaldehyd fixiert und 5 Minuten mit 0,1% Triton X-100 behandelt. Block Ace (Snow Brand, Japan) wurde dann 40 Minuten zur Blockierung bei Raumtemperatur zugegeben. Anti-Insulin-Antikörper (von Advanced Immunochemicals), die mit 10% Block Ace verdünnt waren, wurden zugegeben und 40 Minuten bei Raumtemperatur reagieren gelassen. 0,1% Triton X-100 wurde zugegeben, die Reaktionslösung 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und die Zellen dann dreimal mit PBS gewaschen. Mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) markierte Anti-Maus-IgG-Antikörper (Cappel), die mit 10% Block Ace verdünnt waren, wurden zugegeben und die Reaktion 40 Minuten lang durchgeführt. 0,1% Triton X-100 wurde zugegeben, die Reaktionslösung 5 Minuten lang stehen gelassen, die Zellen wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und dann unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet.
  • Gefärbte Zellen, d.h. Zellen, die zu Insulin produzierenden β-Zellen differenziert hatten, wurden in allen Fällen gefunden, an denen eine Zugabe von hBTC50 und den Muteinen A und B beteiligt war, wie es der Fall war, wenn hBTC80 zugegeben wurde.
  • Es gab keinen Unterschied im Vorkommen von Insulin produzierenden Zellen zwischen hBTC80, hBTC50 und den Muteinen A und B.
  • Beispiel 27
  • Test der β-zelldifferenzierungsfördernden Aktivität unter Verwendung von PLAP-Expressions-AR42J-Zellen
  • 3-1) Konstruktion eines Expressionsvektors für das alkalische Phosphatasegen aus Humanplazenta
  • Die die Differenzierung fördernde Aktivität zu β-Zellen wurde auch bestimmt unter Verwendung von AR42J-Zellen, die mit dem Vektor mit alkalischer Phosphatase transformiert waren, der als Reporter stromabwärts des Insulinpromotors ligiert war. Spezifisch erzeugen Zellen, die zu β-Zellen differenziert haben, bei Zugabe von Betacellulin alkalische Phosphatase. Als Ergebnis kann durch Testen der Aktivität der alkalischen Phosphatase die differenzierungsfördernde Aktivität zu β-Zellen quantitativ untersucht werden.
  • Genomische DNA wurde in üblicher Weise aus Rattenschwanz präpariert. Die 0,75-kb-Insulinpromotorregion wurde mit PCR amplifiziert mit einem Primer RI-1 (5'-AGAGTCAAGGATCCCCCAACCACT-3') und einem Primer RI-3 (5'-AGCTGGTCACTTAGGGCTGGGG-3') basierend auf der Basensequenz des wohl bekannten Ratteninsulin-II-Genpromotors (GenBank: Zugangsnummer J00748) unter Verwendung der genomischen DNA als Matrize. Die PCR wurde auch durchgeführt unter Verwendung der Primer RI-1Cla (5'-GAATCGATAGAGTCAAGGATCCCCCA-3') und RI-3Xho (5'-GACTCGAGCTGGTCACTTAGGG-3') unter Verwendung des PCR-Produkts als Matrize. Die amplifizierten 0,75-kb-DNA-Fragmente wurden isoliert und das bei Insertion in den pT7 Blue Vector (Novagen 69820-1) erhaltene Plasmid pTB1881 wurde verwendet, um die Basensequenz der klonierten Fragmente zu sequenzieren, was bestätigte, dass es der Ratteninsulin-II-Promotor war. Das pTB1881-Plasmid wurde mit XhoI-ClaI verdaut, was 0,73-kb-DNA-Fragmente ergab (Ratteninsulinpromotor). Das pTB1330-Plasmid zur Expression von 2,0-kb-cDNA (J. Berger et al., Gene, 66, 1 (1988)), das die alkalische Phosphatase aus der Humanplazenta codiert (PLAP), wurde mit XhoI-HindIII verdaut. Die entstehenden 2,7-kb-DNA-Fragmente (PLAP cDNA, die eine von SV40 stammende Spleißstelle und PolyA-Additionsstelle, einen von pBR322 stammenden ori und ein Ampicillinresistenzgen enthält) wurden isoliert und das vorher erwähnte 0,73-kb-XhoI-CalI-Fragment der Ratteninsulinpromotorregion wurde mit einer T4 DNA-Ligasereaktion ligiert, was das Plasmid pTB1898 ergab.
  • 3-2) Konstruktion von PLAP Expressions-AR42J-Zellen
  • Das pMCneopolyA-Plasmid (Stratagene), das das neor-Gen von Tn5 und das PLAP Expressionsplasmid pTB1898 enthielt, wurden gleichzeitig in AR42J-Zellen eingeführt unter Verwendung des Transfektionsreagenzes TransITTM-LT1 (Mirus, PenVera Corporation). Die inkorporierten Zellen wurden dann 2 Tage in DMEM, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt war, gezüchtet und die Kultur wurde dann in Selektionsmedium, das mit 800 μg/ml G418 (geneticin, Gibco BRL) ergänzt war, fortgesetzt. Die Klone wurden isoliert durch begrenzende Verdünnung von Zellen, die mit G418-Resistenz wuchsen.
  • Zellen jedes Klons wurden in 24-Napf-Platten geimpft und 4 Tage mit und ohne Zugabe von 20 ng/ml 80-Reste-BTC gezüchtet, der Überstand wurde gesammelt und 30 Minuten bei 65°C hitzebehandelt und die alkalische Phosphataseaktivität in den Medien wurde dann untersucht. Klone, die eine erhöhte alkalische Phosphataseaktivität zeigten bei Zugabe von 80-Reste-Betacellulin wurden selektiert. Der AR71-104-Klon wurde unten verwendet.
  • 3-3) Test der β-zelldifferenzierungsfördernden Aktivität unter Verwendung von PLAP Expressions-AR42J-Zellen
  • PLAP Expressions-AR42J-Zellen, die in 3-2) konstruiert worden waren, wurden auf eine Konzentration von 3 × 104 Zellen/ml in Dulbecco's modifiziertem Eagle-MEM-Medium, das 10% fötales Kälberserum und verschiedene Konzentrationen von hBTC50 oder Mutein A oder B, die oben hergestellt worden waren, enthielt, suspendiert. 100 μl dieser Suspensionen wurden in 96-Napf-Platten geimpft und 5 Tage bei 37°C in Kohlendioxidgasinkubatoren (5% Kohlendioxidgas, 95% Luft) inkubiert. Nach 5 Tagen wurden Proben des Kulturüberstands 30 Minuten bei 65°C behandelt und 50 μl wurden dann in 96-Napf-Mikroplatten, die 50 μl 2XSEAP (2 M Diethanolamin, 1 mM MgCl2, 20 mM Homoarginin) enthielten, gegeben. Die Proben wurden 10 Minuten auf 37°C gehalten und 10 μl 20 mg/ml p-Nitrophenylphosphorsäure (Sigma) wurde zugegeben, eine Reaktion 16 Stunden bei 37°C vorangebracht und die Extinktion bei 405 nm (A405) bestimmt.
  • Tabelle 16 gibt die Proteinkonzentration (ED50) an, die notwendig ist, um 50% Aktivität zu zeigen, wobei 100% die maximale Extinktion ist, wenn hBTC50 zugegeben wird. Tabelle 16: Aktivität, die eine Differenzierung zu β-Zellen induziert
    Probe ED50 (nM)
    hBTC50 0,15
    Mutein A 0,5
    Mutein B 0,7
  • Referenzbeispiel 11
  • Konstruktion des Expressionsplasmids pTB1976 für das 50-Reste-Human-Betacellulin (hBTC50)
  • Das pTB1516-Plasmid, das die DNA des 80-Reste-hBTC eingebaut enthält ( japanische nicht geprüfte Patentanmeldung (Kokai) H6-87894 ; Hinterlegungsnummer FERM BP-3836, Hinterlegungsnummer IFO 15282) wurde als Matrize bei der PCR unter Verwendung des BT-95h-Primers (5'-AGCATATGCGGAAAGGCCACTTCTCTAGGT-3') und des BT-94h-Primers (5'-CTGGATCCTAGTAAAACAAGTCAACTCTCT-3') verwendet. PCR-Produkte mit einem Translationsstartcodon und einer NdeI-Stelle am 5'-Ende des C-terminalen hBTC mit 50 Resten und einem Stoppcodon und einer BamHI-Stelle, die am 3'-Ende insertiert war, wurden mit NdeI und BamHI verdaut und wurden unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara) in die NdeI-BamHI-Stelle des pET-3c-Expressionsplasmids (Novagen) mit dem Φ10-Promotor des T7-Phagen insertiert, um das pTB1976-Plasmid zur Expression von hBTC50 herzustellen. Die Basensequenz der insertierten cDNA wurde mit einem ABI-DNA-Sequenzautomaten (ABI377-DNA-Sequenzautomat) bestätigt.
  • 10 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des pTB1976-Plasmids.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Die Betacellulinmuteine der vorliegenden Erfindung und deren Salze haben eine reduzierte EGF-Aktivität und eine intakte BCT-Aktivität ohne mit Antigenizität in Beziehung stehende Probleme. Sie sind nützlich als bessere therapeutische Wirkstoffe für Diabetes.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (12)

  1. Ein Betacellulinmutein oder ein Salz davon, bei dem die die Differenzierung der pankreatischen B-Zellen fördernde Aktivität erhalten ist und die das Epithelzellwachstum fördernde Aktivität reduziert ist und bei dem 1 bis 30 Aminosäurereste vom N-Ende des Betacellulins entfernt sein können und 1 bis 4 Aminosäurereste der ersten bis vierten Aminosäurereste vom C-Ende des Betacellulins, einschließlich Leu an Position 3 vom C-Ende, entfernt oder durch andere Aminosäurereste substituiert worden sind, wobei das Betacellulin ein Polypeptid ist, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die in SEQ ID Nr. 35 dargestellt ist.
  2. Betacellulinmutein nach Anspruch 1 oder ein Salz davon, wobei das Verhältnis von die Pankreas-B-Zellen-Differenzierung fördernder Aktivität zu der das Epithelzellwachstum fördernden Aktivität mindestens das Zweifache des Verhältnisses bei Betacellulin ist.
  3. Betacellulinmutein nach Anspruch 1 oder Salz davon, wobei 1 bis 30 Aminosäurereste vom N-Ende des Betacellulins entfernt sind.
  4. Betacellulinmutein nach Anspruch 1 oder Salz davon bestehend aus (1) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt; (2) einer Aminosäuresequenz, bei der 1 bis 30 Aminosäuren vom N-Ende der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Aminosäuresequenz entfernt sind; (3) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 2 dargestellt oder (4) einer Aminosäuresequenz, bei der 1 bis 30 Aminosäuren vom N-Ende der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz, entfernt sind.
  5. Betacellulinmutein nach Anspruch 1 oder Salz davon bestehend aus (1) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 3 dargestellt oder (2) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 4 dargestellt.
  6. Betacellulinmutein nach Anspruch 1 oder Salz davon bestehend aus (1) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 37 dargestellt; oder (2) einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 38 dargestellt.
  7. Betacellulinmutein oder Salz davon, bei dem die die Pankreas-B-Zellen-Differenzierung fördernde Aktivität konserviert ist und die das Epithelzellwachstum fördernde Aktivität reduziert ist und bei dem 1 bis 30 Aminosäurereste vom N-Ende des Betacellulins entfernt sind und 1 bis 5 Aminosäurereste zwischen dem 22. und 23. Aminosäurerest am C-Ende des Betacellulins insertiert sind, wobei das Betacellulin ein Polypeptid ist bestehend aus der in SEQ ID Nr. 35 dargestellten Aminosäuresequenz.
  8. Betacellulin nach Anspruch 7 oder Salz davon enthaltend die in SEQ ID Nr. 44 dargestellte Aminosäuresequenz.
  9. Verfahren zur Herstellung eines Betacellulinmuteins nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines Salzes davon, dadurch gekennzeichnet, dass die Transformanten, die mit rekombinanten Vektoren transformiert wurden, die DNA enthalten, die das Betacellulinmutein nach einem der Ansprüche 1 bis 8 codiert, gezüchtet werden, um Betacellulinmutein zu erzeugen.
  10. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein Betacellulinmutein nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder ein Salz davon.
  11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die Zusammensetzung ein prophylaktischer oder therapeutischer Wirkstoff für Diabetes ist.
  12. Verwendung eines Betacellulinmuteins nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines Salzes davon zur Herstellung eines prophylaktischen oder therapeutischen Mittels für Diabetes.
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