CZ88298A3 - Upravený neurotrofní faktor odvozený z gliové buněčné linie - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká proteinů, zde označovaných jako í neurotrofni faktory odvozené z gliové buněčné linie (rovněž označované jako neurotrofni faktory odvozené z glie nebo GDNF), které jsou charakteristické schopností podporovat dopaminovou spotřebu dopaminergickými neurony a podporovat přežití neuronů, které umírají při Parkinsonově chorobě. Vynález se zejména týká nových upravených GDNF proteinů.

Dosavadní stav techniky

Neurotrofni faktory jsou proteiny, které se nachází v nervovém systému nebo v ne-nervových tkáních inervovaných nervovým systémem, jejichž funkcí je podporovat přežití a udržení fenotypické diferenciace nervových a/nebo gliových buněk (Varon a kol., Ann. Rev. Neuroscience 1:327, 1979; Thoenen a kol., Science 229:238, 1985). Díky této fyziologické roli mohou být neurotrofni faktory užitečné při léčení degenerace nervových buněk a ztrátě diferencované funkce, ke kterým dochází při různých neurodegenerativních onemocněních.

Aby mohl být příslušný neurotrofni faktor úspěšně použit při léčení nervových poruch, musí být příslušná třída(y) poškozených nervových buněk citlivá(é) na tento faktor. Různé neurotrofni faktory zpravidla ovlivňují přesně odlišené třídy nervových buněk. Je tedy výhodné mít k dispozici více různých diferentních neurotrofních faktorů

9·

9 9 · • · «♦ i ii :

• 9 ·· «99 φ

9 * 0 • 9

9 *·♦· • * ·

9 9

9 9 9 9 '01-3029-97 Če o

ik pro ošetření jednotlivých tříd poškozených se mohou vyskytovat u různých forem onemocnění poškození.

neuronů, které nebo

Neurotrofní faktory mohou chránit citlivé neurony před celou řadou různých, vzájemně spolu zcela nesouvisících, poškození. Nervový růstový faktor (NGF) bude například chránit podstatnou část senzorických neuronů před smrti způsobenou přerušením jejich axonálních procesů (Rich a kol·., J. Neurocytol 16:261, 1987; Otto a kol., J.Neurosci.

83:156, 1987), před ontogenetickou smrtí během embryonálního vývoje (Hamburger a kol., J. Neurosci. 4:767, 1984) a před poškozením, způsobeným podáním taxolu cisplatiny (Apfel a kol., Ann. Neurol. 29:87, 1991).

zjevná generalita proteinu vede k závěru, že neurotrofní faktor chrání citlivé neurony nebo

Tato pokud před experimentálním poškozením, může být rovněž použit při léčeni chorob, jejichž součástí je poškození těchto neuronů u pacientů i v případech, kdy je etiologie neznámá.

Daný neuronově množství, léčení.

tkáních

Hofer a neurotrofní faktor kromě toho, být dostupný že je správně specifický, musí aby mohl být použit v rámci

Vhledem k tomu, že neurotrofní v dostatečném farmaceutického faktory se ve vyskytují zpravidla v malých množstvích (například

Barde Nátuře 331:261, 1988; Lin a kol., Science

246:1023, 1989), by bylo nepohodlné připravovat farmaceutická množství neurotrofníčh faktorů přímo ze zvířecích tkání. Pro přípravu větších množství požadovaného proteinu je vhodnou metodou použití rekombinantniho expresního faktoru.

Lin a kol. již dříve popsal způsob prohledávání neutrofní aktivity biologických vzorků na embryonálních

01-3029-97 Če

• 4	W
	• ·	0 ·
A a · *	9 0 9	99 9 9
I « ·	i* ·	9 ·
		• ·

prekurzorech dopaminergických neuronů černé hmoty (viz patent US 08/182, 183, podaný 23. května 1994 a jeho patentové přihlášky; PCT/US92/07888, podaný 17. záři 1992 (WO 93/06116); a Evropská patentová přihláška 92921022.7 (publikovaná pod č. EP 610 254). Tento biologický test lze použít pro identifikaci neurotrofnich faktorů, které by bylo možné použít při léčení Parkinsonovy choroby (Friedman a kol., Neuro. Sci. Lett. 79:65-72, 1987) jako choroby, která je charakteristická degenerací dopaminergických neuronů ve středním mozku, který inervuje žíhané tělísko.

Lin a kol. dále uvádí charakteristiku neurotrofního faktoru, který se purifikoval z jednoho takového zdroje, konkrétně. z kondiciovaného kultivačního média, glioblastomové buněčné linie B49 (Schubert a kol., Nátuře 249:224-27, 1974). Již dříve bylo publikováno, že kondiciované médium z této buněčné linie má dopaminergickou neurotrofni aktivitu (Bohn a kol., Soc. Neurosci. Abs. 15:277, 1989). Před uvedením studie Lina a kol. nebyl neurotrofni faktor, odvozený z gliové'buněčné linie (GDNF), identifikován jako diskrétní biologicky účinná látka ani izolován jako v podstatě čistý protein. Kromě toho Lin a kol. popsal způsoby klonování lidských genů kódujících GDNF, nukleokyselinovou sekvenci lidských genů, které kódují GDNF a aminokyselinové sekvence GDNF proteinu. GDNF gen se nakloňoval do expresního vektoru a tento vektor se použil pro expresi biologicky účinného GDNF. GDNF protein je homodimerem tvořeným dvěma 134 aminokyselinovými, 22 kĎa, jednotkami vzájemně spojenými disulfidovou vazbou. Popis dále zahrnuje použití GDNF při prevenci a léčení nervových poškození a nemocí souvisejících s nervovým poškozením, například Parkinsonovy choroby.

φ á · · · · « · * · · · ♦ b * ♦ · Í>

«4 + · ·· · · ·

01-3029-97 Če

GDNF terapie je účinná při léčení nervového poškození způsobeného podmínkami, které ohrožují přežití a/nebo správnou funkci jednoho nebo více typů nervových buněk. Takové nervové poškození může mít celou řadu různých příčin. Nervové poškození, ke kterému může dojit u jednoho nebo více typů nervových buněk, může být způsobeno (1) fyzickým poškozením, které způsobí degeneraci axonálních procesů a/nebo nervových buněčných těl v blízkosti místa poškození; (2) dočasným nebo trvalým přerušením proudění krve do části nervového systému, například při mrtvici; (3) cíleným nebo náhodným vystavením neurotoxinů, například vystavením chemoterapeutickým látkám (například cisplatině) v rámci léčení rakoviny nebo dideoxycytidinu (ddC) při léčení AIDS; (4) chronickým onemocněním metabolizmu, například cukrovkou nebo jaterní dysfunkcí; nebo (5) neurodegenerativními chorobami, například Parkinsonovou chorobou, Alzheimerovou chorobou a amyotrofní laterálni sklerózou (ALS), jejichž výsledkem je degenerace specifických neuronových populací.

GDNF terapie by mohla být využita zejména při léčení neurodegenerativních stavů, jejichž součástí je degenerace dopaminergických neuronů černé hmoty, například při léčeni Parkinsonovy choroby. Pouze tato ošetření Parkinsonovy choroby mají paliativní účinek, zaměřující se na zvýšení hladiny dopaminu v žíhaném tělísku. Očekávaným účinkem GDNF terapie není jen zvýšení dopaminergické neurotransmise na dopaminergických nervových zakončeních v žíhaném tělísku, ale rovněž pozvolné snížení nebo dokonce zastavení rozvoje degenerativních procesů a regenerace poškozené nigrostriatální dráhy a obnova její funkce. GDNF může být rovněž použit při léčení dalších forem poškození nebo při zlepšení funkce dopaminergických nervových buněk u lidských

01-3029-97 Če pacientů. K těmto poškozením nebo nesprávným funkcím může docházet při schizofrenii a dalších formách psychózy. Pouze GDNF terapie, použitá v případě těchto chorobných stavů, je symptomatická a využívá účinné látky, které působí na dopaminové receptory nebo místa spotřeby dopaminu a současně zlepšují funkci dopaminergických neuronů, které inervují ty receptory nesoucí neuronové populace, které se podílí na chorobných procesech.

Podstat vynálezu

Vynález poskytuje nové proteinové produkty na bázi:, upraveného neurotrofního faktoru odvozeného z gliové buněčné linie (GDNF). U jednoho provedení vynálezu jsouá upravené GDNF proteiny připravovány rekombinantními technikami genového inženýrství. U alternativního' provedení/ se upravené GDNF proteiny syntetizuji chemickými technikami, nebo kombinací rekombinantnich a chemických technik.

Upravené GDNF proteinové produkty podle vynalezu zahrnuji proteiny reprezentované aminokyselinovou sekvencí

X-[Cys⁴¹-Cys¹³³]-Y. Očíslované zbytků, znázorněné na obr. 1 srovnání se zralým GDNF reprezentuje aminokyselinovou schéma aminokyselinových (SEQ ID NO:2), má usnadnit proteinem. [Cys⁴¹-Cys¹³³] ekvenci Cys⁴¹ až Cys¹³³, jak ukazuje obr. 1 (SEQ ID NO:2). Y znamená koncovou karboxylovou skupinu Cys¹³³ nebo karboxylový koncový aminokyselinový zbytek Ile¹³⁴. X znamená methionylátovanou nebo nemethionylátovanou amínoskupinu Cys⁴¹ nebo aminokyselinový zbytek (zbytky) N-konce, zvolené ze skupiny:

o

01-3029-97 Če t

* i š » <· ··

RG

NRG

P

LP

VLP

	KNRG	(SEQ ID N0:3)
		GKNRG	(SEQ ID NO:4)
		RGKNRG	(SEQ ID NO:5)
		QRGKNRG	(SEQ ID NO:6)
		GQRGKNRG	(SEQ ID NO:7)
		RGQRGKNRG	(SEQ ID NO:8)
		RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:9)
	G	RRGQRGKNRG	(SEQ IDNO:10)
	KG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:11)
	GKG	RRGQRGKNRG	(SEQIDNO:12)
	RGKG	RRGQRGKNRG	(SEQIDNO:13)
	SRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQIDNO:14)
	.NSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:15)
	ENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:16)
	PENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:17)
	NPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID N0:18)
	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:19)
A	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:20)
AA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:21)
AAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:22)
QAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:23)
RQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:24)
NRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:25)
RNRQAAA	'ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:26)
ERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG-(SEQ ID NO:27)
RERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:28)
RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:29)
RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:30)
rrernrqaaa	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ1DNO:31)
RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:32)

01-3029-97 Če

AVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:33)
MAVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:34)
QMAVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:35)
KQMAVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:36)
Dkqmavlp	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:37)
PDKQMAVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:38)

Dá se předpokládat, že takto upravené GDNF produkty budou zahrnovat upravený GDNF protein, který má aminokyselinovou sekvenci reprezentovanou obecným vzorcem X- [Cys⁴¹-Cys¹³³]-Y a jeho varianty nebo deriváty. Takže upravené GDNF produkty podle vynálezu budou rovněž zahrnovat adični substituční a vnitřně delečni varianty a deriváty aminokyselinových sekvencí, reprezentovaných obecným vzorcem X-[Cys⁴¹-Cys¹³³]-Y. Upravené GDNF produkty budou dále zahrnovat methionylátované nebo nemethionylátované formy a stejně tak glykosylátované a neglykosylátované formy upraveného GDNF proteinu.

Jako příklady upravených GDNF proteinů podle vynále-zu lze uvést například [Arg^is-Ile¹³⁴], [Asn²²-Ile¹³⁴], [Profile¹³⁴], [Ser²⁶-Ile¹³⁴], [Arg³²-Ile¹³⁴], [Gly³³-Ile¹³⁴], [Lys³⁷Ile¹³⁴] a [Asn³⁸-Ile¹³⁴] upravené GDNF proteiny buď methylátované nebo nemethylátované a jejich varianty a deriváty. Současně jsou výhodnými upravenými GDNF proteiny podle vynálezu například [Lys³⁷-Ile¹³⁴] a [Asn³⁸-Ile¹³⁴] upravené GDNF proteiny buď methylátované nebo nemethylátované a jejich varianty a deriváty. Příkladnými substitučními variantami jsou [Asn²²ÁSer²²-Ile¹³⁴] a [Pro²³Lys³⁷AAsn³⁷-Ile¹³⁴] upravené GDNF proteiny. Příkladnou adični variantou je Ser-[Pro²³-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein.

Λ

01-3029-97 Če

& * s « φ» ϋ dalšího provedeni vynálezu mohou být upravené GDNF proteiny připraveny glykosylátováných nebo neglykosylátovaných formách. Deriváty upraveného GDNF proteinu zpravidla zahrnují navázání GDNF proteinů na vodou rozpustný polymer. Upravený GDNF protein lze například konjugovat na jednu nebo více polyethylenglykolových molekul a snížit tím srážení upraveného GDNF proteinového produktu ve vodném prostředí.

Vynález rovněž zahrnuje různé polynukleotidy, kódující upravené GDNF proteiny. Tyto nukleokyselinové sekvence se zpravidla používají při expresi upraveného GDNF v eukaryotické nebo prokaryotické hostitelské buňce, přičemž expresní produkt nebo jeho derivát je charakteristický svou schopností- zvyšovat spotřebu dopaminu dopamínergickými buňkami. Tyto polynukleotidy lze rovněž použít při buněčné nebo genové terapii. Mezí vhodné nukleokyselinové sekvence lze zahrnout ty sekvence, které jsou znázorněny na přiložených obrázcích a rovněž další degenerační sekvence: a přirozeně se vyskytující alelové variace.

Vynález dále zahrnuje vektory obsahující nukleotidy, které kódují upravené GDNF proteiny a které jsou operativně spojeny s amplifikační a/nebo expresní kontrolní sekvencí. Jak prokaryotické tak eukaryotické hostitelské buňky mohou být stabilně transformovány nebo transfektovány těmito vektory s cílem exprimovat upravený neurotrofní faktor odvozený z glie. Vynález rovněž zahrnuje rekombinantní produkci upraveného GDNF proteinu, při které se takto transformované nebo transfektované buňky nechají růst ve vhodném živném prostředí a upravený GDNF exprimovaný těmito buňkami se případně izoluje z hostitelských buněk a/nebo živného prostředí. Vynález dále zahrnuje použití * · · « · ·' · · · ·

01-3029-97 Ce

polynukleotidů kódující upravený GDNF a vektorů obsahujících tyto polynukleotidy při genové nebo buněčné terapii.

Vynález rovněž poskytuje rekombinantně připravenou GDNF kompozici obsahující směs zralého GDNF proteinu a jednoho nebo více upravených GDNF proteinů, odvozených z této směsi, přičemž zralý GDNF protein má molekulovou hmotnost přibližně 44 kDa a upravený GDNF protein má molekulovou hmotnost přibližně 36 až 40 kDa, GDNF kompozice může obsahovat alespoň dva upravené GDNF druhy, přičemž první druh má molekulovou hmotnost přibližně 36 kDa a druhý druh má molekulovou hmotnost 40 kDa. Upravené GDNF druhy, které mají molekulovou hmotnost přibližně 40 kDa představují heterodimer GDNF monomeru, majícího molekulovou hmotnost přibližně 22 kDa, a upraveného GDNF monomeru, majícího hmotnost přibližně 18 kDa. Rovněž lze předpokládat, že z této směsi lze pro terapeutické použití izolovat jeden nebo více upravených GDNF druhů.

Další aspekt vynálezu zahrnuje farmaceutické kompozice obsahující upravený GDNF produkt. Upravený GDNF proteinový produkt je zpravidla formulován společně s farmaceuticky přijatelným vehikulem. Pro usnadnění výroby, zlepšení skladování, manipulace, dopravy a/nebo účinnosti, lze použít celou řadu dalších formulačních materiálů. U dalšího provedení vynálezu produkty na bázi upraveného GDNF proteinu zvyšuji spotřebo dopaminu a zlepšují přežití dopaminergických neuronů. Produkty na bázi upraveného GDNF proteinu jsou tedy vhodné zejména pro léčení poruch nervového systému způsobených poškozením nebo onemocněním, například Parkinsonovou chorobou.

01-3029-97 Če 'to

t ·	4 ·	• 4 4 4	4 4	4	4
i v	44	4 ·	4 »	• 4
4	• · ·	4 «'	V 44«	«	4
	4 4	* 4	4	* .
• ·	4 *	4 4 * «·»»		4 4

Další aspekty a výhody vynálezu se stanou odborníkům v daném oboru zřejmějšími po prostudování následujícího podrobného popisu.

Stručný popis obrázků

Obr. 1 znázorňuje nukleokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO:1) kódující zralý humánní neurotrofní faktor, odvozený z gliové buněčné linie (hGDNEj. Obrázek rovněž znázorňuje aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO:2) zralého humánního GDNF proteinu.

Obr. 2 znázorňuje diagram plasmidové konstrukce, vytvořené pro expresi rekombinantních upravených GDNF proteinů.

Obr. 3 znázorňuje . restrikční mapu alternativní nukleokyselinové sekvence (SEQ ID NO:39) kódující GDNF a upravený GDNF. polynukleotid.

Obr. 4 znázorňuje restrikční mapu ještě další nukleokyselinové sekvence (SEQ ID NO:40) kódující GDNF a upravený GDNF polynukleotid.

Obr. 5 znázorňuje nukleokyselinovou sekvenci (SEQ ID N0:41) kódující [Pro²³-Lys³⁷ŮAsn³⁷-Ile¹³⁴] upravenou GDNF proteinovou substituční variantu (SEQ ID NO:42). Tento protein může být rovněž označen jako Met-Ser-[Pro²³Lys³⁷AAsn³⁷-Ile¹³⁴] upravená GDNF proteinová adičně substituční varianta.

Obr. 6 znázorňuje nukleokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 43) kódující [Arg³²-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein (SEQ ID NO:44).

01-3029-97 Če

Obr. 7 znázorňuje nukleokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 45) kódující [Gly³³~Ile¹³⁴] upravený GDNF protein (SEQ ID NO:46).

Obr. 8 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci zralého hGDNF (SEQ ID NO:47). ve srovnání s několika příkladnými upravenými GDNF proteiny: Met-[Arg³²-Ile¹³⁴] (SEQ ID NO:48), Met-[Gly³³-Ile¹³⁴] (SEQ ID NO: 49) a Met-Ser- [Pro²³-Lys³⁷AAsn³⁷Ile¹³⁴] (SEQ ID N0:50) .

Humánní neurotrofní faktor odvozený z gliové buněčné linie (hGDNF) se syntetizuje jako prekurzor, který se zpracovává a sekretuje jako zralý protein tvořený 134 aminokyselinami. Zjistilo se, že zralý humánní GDNF má aminokyselinovou sekvenci, která je znázorněna na obr. 1 (SEQ ID N0:2).

Vynález je založen na nečekaném zjištění, že velikost zralého GDNF proteinu lze redukovat (tento protein je zde označen jako „sestřižený nebo „upravený protein nebo upravený GDNF protein) aniž by došlo ke ztrátě jeho biologické aktivity. Sestřižený protein byl prvně objeven během rekombinantní produkce GDNF v buňkách vaječníku čínského křečka (CHO) . Stručně řečeno,· rekombinantní humánní GDNF (rhGDNF) se připravil následujícím způsobem. Nukleokyselinová sekvence, kódující celý otevřený čtecí rámec zralého humánního GDNF proteinu, se nakloňovala do expresního plasmidu. Pomocí DNA sekvencováni (jako ekvivalentu hGDNF sekvence v genové bance) se potvrdilo, že jde o správnou nukleokyselinovou sekvenci a tato sekvence se přenesla do aminokyselinové sekvence, která je identická s publikovanou sekvencí zralého humánního GDNF (Lín a kol·., i*

01-302’9-97 Če

Zatímco přítomný 22 kDa pás odpovídá zralému GDNF proteinu uváděnému v^j-literatuře, informace o 18 kDa pásu nebyly doposud publikovány. Relativní množství 22 kDa a kDa proteinu se ve vzorcích odebraných z jednotlivých klonů lišila. Kromě sklizně, odebrané ze zmíněných dvou exprimovaného pásů.

GDNF

.....toho .se zjistilo, že i jednotlivé stejného vzorku, vykazují různé poměry Rovněž se zjistilo, proteinu často kDa pásu a současnému že skladování CHOzastoupeni 18 kDa pásu.

vede ke zvýšení snížení zastoupení

Při analýze kondiciovaného média za neredukčních podmínek možné pozorovat tři dobře rozlišené pásy s hmotnostmi 36, 40 a 44 kDa. Toto zjištění je

CHOd buněk, blotů, bylo molekulovými z transfektovaných pomocí westernových - I V z f rovněž v rozporu s předcházejícími zprávami. Relativní intenzita těchto pásů byla různá, ale korelovala s poměrem a 18 kDa monomerních pásů, přítomných v každém vzorku.

Další analýza pomocí monoklonálního antiséra ukázala, že zmíněné tři pásy v neredukčním gelu odpovídají třem různým dimerům, tvořeným dvěma monomery. Největší 44 kDa protein je, jak již bylo uvedeno, dimerem dvou 22 kDa přirozených GDNF proteinů. 40 kDa proteinový meziprodukt tvoří dimer, u kterého se molekulová hmotnost jednoho ze zralých proteinů redukovala na 18 kDa formu. Nejmenší 36 kDa dimer, jak se zdá, obsahuje dva 18 kDa proteiny, tj. u obou 22 kDa forem byla redukována molekulová hmotnost. Tato data poprvé demonstrují nejen přítomnost nové formy GDNF monomerů ale rovněž přítomnost sestřiženého GDNF proteinu v dimerové konfiguraci. Rovněž se zjistilo, že při skladování se monomerní složeni vzorku posouvá směrem k sestřižené formě a odpovídá dimerovým druhům, tj. množství 36 kDa proteinů se, jak se zdá, zvýšilo.

01-3029-97 Če

9'

Science 260, 1130-1132, 1993) . Plasmidová DNA se linearizovala a transíektovala do dihydrofolátreduktázodeficientních CHO buněk (CHOď buněk) pomocí metody jejíž podstatou je vysrážení fosforečnanu vápenatého.

Transfektované buňky se kultivovaly v selektivním médiu a ty kolonie, které přežily selekční proces, se vybraly pro i jednotlivé analytické studie hGDNF exprese.

Odebraná, séra prostá, kondiciovaná média z jednotlivých klonů se podrobila westernové blotové analýze, využívající antiséra, specifického pro hgGDNF. Antiséra zahrnovala králičí polyklonální protilátky, získané z těl králíků imunizovaných rekombinantním hGDNF exprimovaným v

Escherichia coli. Za redukčních podmínek se hGDNF, který byl přítomen v těchto vzorcích, rozdělil do dvou hlavních pásů, které měly molekulové hmotnosti přibližně 22 kDa a 18 kDa. Každý pás byl tvořen těsně přilehlým vzájemně odsazeným dubletem, přibližně 22 + 22,5 kDa, resp. 18 + 17,5 kDa (pro zjednodušení budou tyto dublety označeny jako 22 kDa a 18 kDa pásy nebo druhy).

GDNF, jak již bylo dříve zveřejněno, existuje jako disulfidem spojený homodimer, tvořený dvěma identickými podjednotkami zralého GDNF proteinu, který má molekulovou hmotnost přibližně 20- až 22 kDa. Jak bylo dále zveřejněno, GDNF byl při analýze za neredukčních podmínek identifikován jako široký pás 32 až 42 kDa (Lin a kol., Science 260, 1130-1132, 1993) nebo 33 až 45 kDa (Lin a kol., J. Neurochem. 63(2), 758-768, 1994). Existence tohoto rozmezí byla interpretována jako důsledek heterogenity glykosylace na zralých monomerech, což se potvrdilo pomocí deglykosylačních experimentů.

b · · b <· · · i » 4 · «* ··

ÍJ

01-3029-97 Če

Následně se provedly studie, které měly identifikovat, která část proteinu byla eliminována nebo změněna, aby došlo k redukci molekulové hmotnosti v porovnání se sekvencí již publikovaného zralého GDNF proteinu. Nejprve se ověřilo, že redukce molekulové hmotnosti není důsledkem změn glykosylace.

GDNF obsahuje dvě potenciální N-navázaná glykosylační místa. Nicméně. sestřižený protein není jednoduše neglykosylátovanou nebo glykosylátovanou formou zralého GDNF. To bylo demonstrováno na glykosylačních experimentech v rámci kterých se vzorky ošetřily N-glykanázou, O-glykanázou a neuraminidázou. Na ‘redukčních gelech se 18 kDa protein zredukoval na 13,5 kDa pás N-glykanázovou digerací, což ukazuje na přítomnost ekvivalence 4,5 kDa N-navázaného cukru. Ošetřeni neuraminidázou a O-glykanázou způsobilo, že 18 kDa pás se posunul mírně k 17 kDa. To naznačuje přítomnost O-navázaných cukrů na protein. Bylo publikováno, že zralý 22 kDa pás je glykosylátován* a N-glykanázou rovněž redukován na 18 kDa (tj . rovněž

4,5 kDa). To se dále potvrdilo použitím monoklonální protilátky, která je specifická pro 22 kDa pás na gelu. Glykanázový digerační vzor neredukovaného dimeru byl komplikovanější ale interpretovatelný a .· odpovídá počátečnímu označení tří forem.

Takže 4,5 kDa redukce molekulové hmotnosti proteinu byla dále považována za důsledek delece přibližně 30 až 35 aminokyselinových zbytků a nikoli za důsledek změn v glykosylaci. Na základě následujících zdůvodnění se očekávalo, že k deleci bude nejpravděpodobněji docházet na N-konci zralého GDNF proteinu. Zralý GDNF celkem obsahuje 7 cystinů. Pokud by došlo k deleci na karboxylovém konci,

ϊ 7

01-3029-97 Če • * 4 sedmi cystinů a to by proteinu. Nicméně při tvořeného převážně měřeni potom by se ztratily 2 až 4 ze pravděpodobně vedlo k inaktivaci podrobení sestřiženou testovaného vzorku, formou biologickému testu, zaměřeným na aktivity na dopaminergické neurony, vzorek vykazoval srovnatelnou účinnost se vzorkem, obsahoval proporcionálně více zralé formy GDNF.

neurotrofní

Místo rozštěpení se aminokyselinové sekvenční Vzorky se sekvencovaly Applied doporučeným využívající daném oboru tento který potom určilo na základě analýzy purifikovaného proteinu.

pomocí proteinového v deseti cyklech, techniky odborníkům v sekvenceru

Biosystems 499A výrobcem. Analytické sekvencování aminokyselin jsou známy a. další popis sekvencování například Fausset a kol., v Electrophoresis a patentová přihláška US 576,316 (Evropská patentová přihláška č.

EP 423 980, podaná 4. října 1990,

Factor). Analýza určila, že N-koncem neboli Arg-Gly-Gln-Arg-Gly-Lys. Zralý protein kondiciovaném byl „RGQRGK se tedy v aminokyselin, sestřiženého podaná postupem a postupy proteinů uvádí

12:22-27, 1991

24.

90310899, s názvem srpna 1990 publikace „Stem Cell sestřiženého proteinu médiu zbavil prvních 31 sekvence aminokyselinová začíná aminokyselinou Arg³²,

Zbývající proteinu, která jinak odpovídá aminokyselinové sekvenci zralého GDNF proteinu znázorněné ňa obrázku 1 (SEQ ID NO:2).

Test dopaminergických neuronů upraveného aktivity se faktorů, které [Arg³²-Ile¹³⁴] neurotrofní neurotrofních proteinu.

používá pro by mohly být Základem tohoto prokázal účinnost

Dopaminergický test identifikaci přínosem při testu je již léčení Parkinsonovy choroby.

popsaný test (Friedman a kol., Neuro. Sci. Lett. 79:65-72,

1987) a může zahrnovat modifikace, které popsal Lín a kol. (viz patentová přihláška US 08/182,183, podaná 23. května 1994, a její mateřské přihlášky; PCT/US92/07888, podaná 17. září 1992 (WO 93/06116); a Evropská patentová přihláška 92921022.7 (publikovaná pod č. EP 610 254)). Podrobný popis testu je součástí níže uvedeného příkladu 5.

Následný purífikacní postup, po kterém následovalo aminokyselinové sekvencováni, vedl k objevení dalšího proteinu, ve kterém bylo odstraněno prvních 36 aminokyselinových zbytků z N-konce zralého GDNF: [Lys³²Ile¹³⁴] upravený GDNF protein s N-koncovou sekvencí KNRG(C)VL—. Zbývající aminokyselinové zbytky sestřiženého proteinu se jinak opět shodovaly se zbytky aminokyselinové sekvence zralého GDNF proteinu. [Lys³⁷-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein se rovněž analyzoval biotestem zaměřeným na spotřebu dopaminu. Ukázalo se, že tento upravený GDNF protein je rovněž aktivní při ED50 přibližně 50 pg/ml, podobně jako purifikovaný rekombinantní E. coli exprimovaný zralý GDNF.

Rovněž se zjistilo, že bakteriálně exprimovaný zralý GDNF je možné převést na upravenou formu. Zralý GDNF, exprimovaný v transformovaných buňkách E. coli (jak popisuje Lin a kol. v US patentové přihlášce č. 08/182,183, viz výše) se inkuboval CHO-odvozeným kondiciovaným médiem. Rekombinantní E. coli GDNF měl zdánlivou molekulovou hmotnost 17 kDa na redukčním gelu. Jakmile se tento materiál smísil s kondiciovaným médiem CHO buněk a inkuboval 5 dní při 4°C, zredukovala se molekulová hmotnost proteinu na 12,5 kDa. K v podstatě kompletnímu rozštěpení došlo po jednohodinové nebo dvacetičtyřhodinové inkubaci, z čehož vyplývá, že se za těchto podmínek jedná o časově

01-3029-97 Če	• 4 4 4	4 ♦ *! 4 · · ··· 4 a 4 · 4 · · 4» 444 4444 ·· 4
			17
závislý	proces.	Rovněž	se ukázalo, že	prostá inkubace
rekombinantního	E. coli	GDNF médiem,	obsahujícím 0,1%
fetální	bovinní	sérum,	prováděná přes	noc, neposkytuje

sestřiženou formu, takže se zdá, že přítomnost živých buněk v kultuře je pro realizaci sestřihu nezbytná. Je tedy možné, aby sestřih probíhal v určitých' tkáních in vivo.

Rovněž se zjistilo, že deriváty zralého E. coliexprimovaného hGDNF, například pelylátovaného GDNF (rovněž popsané Línem a kol. v patentové přihlášce US 08/182,183, viz výše) lze zpracovat do upravené formy v přítomnosti CHO-derivovaného kondiciovaného média. Zralý GDNF může být na N-konci pegylátovaný s cílem zkrátit jeho clearanční dobu v oběhu. Pegylace zvětšuje velikost proteinu, přičemž modifikovaný zralý MGDF migruje za redukčních podmínek přibližně na 45 kDa. Stejně jako u nepegylátované zralé formy, poskytuje inkubace pegylátovaného E. coli GDNF (netransfektovaným) kondiciovaným médiem CHO buněk 12,5 kDa pás. V obou případech byly 12,5 kDa druhy na neredukčních. gelech přítomny ve formě dimeru spojeného disulfidovou vazbou. Generování této sestřižené formy zralého proteinu pegylátovaného na N-konci dále naznačuje, že sestřih probíhá na N-konci proteinu, což vyplývá ze ztráty pegylátovaného zbytku na konci sestřihu.

Z těchto zjištění a skutečnosti, že sestřih může rovněž probíhat in vivo vyplývá, že může být sestřiženou formou GDNF proteinu může být zcela přirozeně zpracovaná forma hGDNF za fyziologických podmínek. Byly tedy zváženy výhody produkce upraveného GDNF proteinu nebo .jeho derivátu pro terapeutické použití. Dalo by se například očekávat, že přímo exprimovaný nebo syntetizovaný upravený GDNF protein, například [Arg³²-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein, bude

01-3029-97 če • · *· · w *· 0* φ 0 φ 4 4) 4 4 '4 · · · 44

404* *0'444 φ» «4 ··· ··** *·4« rezistentní proti výše popsané proteolytické aktivitě. Kromě toho pokud by bylo žádoucí připravit GDNF derivát, například pegylátovaný [Arg³²-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein, dalo by se očekávat, že jeho výhodou bude nepřístupnostpro specifický sestřih, který byl pozorován u zralého GDNF derivátu.

Od upravených GDNF produktů lze očekávat i další výhody. Hodnota pl upraveného proteinu, například [Arg³²-Ile¹³⁴] upraveného GDNF proteinu, se bude snižovat přibližně z 10 na přibližně 8,0 až 8,5. To činí protein podstatně méně zásaditějším, což je výhodou, pokud jde o navázání receptorů, snížení cytotoxicity v místě podání, například v místě aplikace intratekální injekce. Další výhodou je, že úsek prvních dvaceti šesti aminokyselin aminokyselinové sekvence zralého GDNF má dvě amidační místa: Arg-Asn-Arg (aminokyseliny 14-16) a Giu-Asn-Ser (aminokyseliny 24-26). Dá se očekávat, že absence jednoho nebo obou těchto míst v upraveném GDNF proteinu bude zvyšovat stabilitu proteinu.

Upravené GDNF produkty

U základního provedení mohou být upravené GDNF proteiny podle vynálezu reprezentovány následující aminokyselinovou sekvencí, přičemž očíslované schéma aminokyselinových zbytků na obr. 1 se použije pro usnadnění srovnání s aminokyselinovou sekvencí zralého GDNF proteinu:

X- [Cys⁴¹-Cys¹³³]-Y ve kterém

01-3029-97 Če ··· ♦··· [Cys⁴¹-Cys¹³³] znamená aminokyselinovou sekvenci Cys⁴¹ až Cys¹³³, která je znázorněna na obr. 1 (SEQ ID NO:2);

Y znamená karboxylovou koncovou skupinu Cys¹³³ nebo karboxylový koncový aminokyselinový zbytek Ile¹³⁴; a

X znamená methionylátovanou nebo nemethionylátovanou aminoskupinu Cys⁴¹ nebo N-koncový aminokyselinový zbytek(y) zvolený(é) ze skupiny:

RG

NRG knrg (SEQ ID NO:3)

GKNRG (SEQ ID NO:4) RGKNRG (SEQIDNO:5)

QRGKNRG (SEQ ID NO:6) GQRGKNRG (SEQ ID NO:7)

RGQRGKNRG (SEQ ID NO:8)

RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:9)

G RRGQRGKNRG (SEQ ID NO: 10)

KG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:11)

GKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO: 12)

RGKG RRGQRGKNRG (SEQIDNO:13)

SRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:14)

NSRGKG RRGQRGKNRG (SEQIDNO:15) ENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:16)

PENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:17)

NPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:18)

ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQIDNO:19)

A ANPENSRGKG

AA ANPENSRGKG

RRGQRGKNRG (SEQ ID N0:20)

RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:21)

AAA ANPENSRGKG

RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:22)

01-3029-97 Če ···· • ·· · « ·♦ • 4 ·· • 4··

	QAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:23)
	RQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:24)
	NRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:25)
	RNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:26)
	ERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:27)
	RERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:28)
	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:29)
P	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID N0:30)
LP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO.-31)
VLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:32)
AVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:33)
MAVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:34)
QMAVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:35)
KQMAVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:36)
DKQMAVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:37)
PDKQMAVLP	RRERNRQAAA	ANPENSRGKG	RRGQRGKNRG	(SEQ ID NO:38)

nebo aktivní syntetické proteiny, upravené

GDNF, varianty biologicky

GDNF

Výraz „upravený GDNF proteinový produkt, jak je zde použit, zahrnuje biologicky rekombinantní upravené GDNF proteiny získané ze zralého aktivního upraveného GDNF (včetně inzerČních, substitučních a delečních variant) a jejich chemicky modifikované deriváty. Tento výraz rovněž zahrnuje proteiny, které jsou v podstatě homogenní s proteinem, majícím aminokyselinovou sekvenci upravené GDNF humánním GDNF

SEQ ID

N0:2.

Výraz „biologicky aktivní, jak je zde uveden, Znamená, že upravený GDNF protein demonstruje podobné neurotrofní vlastnosti, ale ne nezbytně všechny stejné vlastnosti a ne nezbytně stejnou měrou jako GDNF protein mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2. Volba konkrétních sledovaných neurotrofních vlastností závisí na

01-3029-97 Če • toto«··· zamýšleném konečném použití upraveného GDNF proteinového produktu. Upravené GDNF proteinové produkty jsou biologicky aktivní a mají podobný vliv na přežití dopaminergických neuronů jako zralý GDNF protein, jak ukázalo hodnocení dopamínové spotřeby a tyrosinhydroxylázové (TH) exprese, tj. příkladný biologický test, který bude diskutován v níže uvedených příkladech.

Výraz „v podstatě homologický, jak je zde uveden, označuje stupeň homologie s humánním GDNF majícím aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2, která výhodně přesahuje 70 %, výhodněji 30 % a nej výhodněji 90 % nebo i 95 %. Procento homologie, jak je zde uvedeno, se vypočte jako procento aminokyselinových zbytků v menší ze dvou sekvencí, která je zarovnána s identickými aminokyselinovými zbytky sekvence, kterým odpovídá, pokud čtyři mezery v úseků o délce 100 aminokyselin napomohou tomuto zarovnání, jak definuje Dayhoff v Atlas of Protein Sequence and Structure sv. 5, str. 124 (1972), National Biochemical. Research Foundation, Washington, D.C. V podstatě homologický je rovněž libovolný upravený GDNF protein, který lze izolovat pomocí křížové reaktivity s protilátkami GDNF SEQ ID NO:2 nebo jehož geny lze izolovat hybridizací genem nebo segmenty genu kódujícího GDNF SEQ ID NO:1.

Jak bude zřejmé odborníkům v daném oboru po přečtení předloženého popisu, v podstatě homologické proteiny budou zahrnovat alespoň jednu deleci, adici nebo substituci aminokyselinových zbytků upraveného GDNF proteinu reprezentovaného X-[Cys⁴¹-Cys¹³³]-Y. Produkce těchto variant bude popsána níže. Dále bude zřejmé, že vzhledem k tomu, že je vynález zřejmě adresován „upraveným GDNF proteinům,

01-3029-97 Če

to.	•	•	•	♦ · to ·	v	to	•
•	•		··	« ·	• ·		• ·
• *	•	» to	to' ·	• ···	to	to
• to to to	•	• • ·	• to to·· to···	to ··	•	« ··

budou N-koncové adiční varianty zahrnovat adici methioninového zbytku nebo ne-GDNF aminokyselinového zbytku nebo sekvence, ale nebudou zahrnovat adici aminokyselinového zbytku (zbytků), které by vedly k rekonstrukci zralého GDNF proteinu. Upravené GDNF proteiny na bázi přirozeně se vyskytujících alelických mutantů nebo variant budou rovněž spadat do rozsahu vynálezu. Výroba variant GDNF proteinu bude podrobněji popsána níže.

Lín a kol., patentová přihláška US 08/182,183, viz výše) popisuje úpravu zralého GDNF na karboxylovém konci, realizovanou proteolytickým zpracováním Lys-Arg zbytků, které tvoří šestý, resp. pátý zbytek od karboxylového konce zralého GDNF (tj. Lys¹²⁹-Arg¹³⁰ podle očíslování aminokyselinových zbytků na obr. 1 (stejně tak v SEQ ID NO:1 nebo SEQ ID N0:2)). Taková úprava by mohla eliminovat dva cysteinové zbytky ze zralého GDNF proteinu. To by mělo pravděpodobně za následek nesprávné sbalení proteinu a tedy vytvoření inaktivního proteinu. Na druhé straně si X- [Cys⁴¹-Cys¹³³] -Y upravené GDNF proteinové produkty podle vynálezu zachovávají Cys¹³¹ a Cys¹³³ zbytky a představují aktivní proteiny, jak potvrzuje test dopaminové spotřeby.

U jednoho provedení podle vynálezu postrádají upravené GDNF proteinové produkty nejméně jedno deamidační místo. U jednoho provedení podle vynálezu postrádaly výhodné upravené GDNF proteinové produkty nejméně jedno deamidační místo. Tento nedostatek deamidačních míst měl za následek zvýšení biochemické stability purifikovaného proteinu a snížení možnosti degradace produktů, výsledkem čehož byla vyšší stabilita proteinu při skladováni. Příkladným upraveným GDNF je [Ser²⁶-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein,

	• · ··	ww V v v v V • ♦ · ·
	• · · · ·	• · · ··· ·
01-3029-97 Če	• · * ·	♦ · · » «Φ· ·<··
23
který postrádá místa, která mohou	jinak vést	k deamidaci
zralého proteinu. Alternativně	by mohl	[Arg16-Ile134]

upravený GDNF protein postrádat alespoň první deamidační místo, které je přítomné ve zralém proteinu.

V současné době je výhodným upraveným GDNF proteinovým produktem [Arg³²-Ile¹³¹] upravený GDNF protein. Tento upravený GDNF protein postrádá místo, ve kterém probíhá sestřih zralého proteinu nebo v jehož blízkosti tento sestřih probíhá. Takže se dá očekávat, že tento upravený GDNF protein bude rezistentní proti zpracování, které by mohlo rovněž probíhat in vivo. Dalším současně výhodným upraveným GDNF proteinovým produktem je [Lys³⁷-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein. Při dalších úpravách, při kterých by došlo k odstranění zbytků až po Gly⁴⁰ a Ile¹³⁴ , včetně, z N-konce, resp. C-konce by tato úprava dále redukovala pí hodnotu upraveného proteinu. V současné době si nej výhodnější upravené GDNF proteiny zachovávají všechny cysteinové zbytky, které se nachází v přirozeném GDNF proteinu, ale které postrádají některá rozlišitelná místa pro rychlé proteolytické zpracování upraveného GDNF proteinu během exprese a výroby nebo po následujícím in vivo podání. Tyto výhodné proteiny zahrnují [Arg³²-Ile¹³⁴] , [Gly³³-Ile¹³⁴], [Gln³⁴-Ile¹³⁴], [Arg³⁵-Ile¹³⁴], [Gly³⁶-Ile¹³⁴] , [Lys³⁷-Ile¹³⁴], [Asn^3B-Ile¹³⁴], [Arg³⁹-Ile¹³⁴] upravené GDNF proteinové produkty.

Podobné výsledky, pokud jde o schopnost zvyšovat dopaminovou spotřebu embryonálními prekurzory dopaminergických neuronů černé hmoty, jaké byly popsány Línem a kol. (patentová přihláška US 07/855,413, viz výše) pro zralý GDNF vykazuji rovněž upravené GDNF proteiny podle

01-3029-97 Če ·♦··

4 4 * ···

4 4 · * • 4 4« vynálezu. Biologické testy prováděné na upravených GDNF proteinech budou dále popsány v níže uvedeném příkladu 4.

Nové upravené GDNF proteiny se zpravidla izolují a purifikují za vzniku upravených GDNF proteinů, které vpodstatě neobsahují další (ne-GDNF) proteinové materiály. Výhodně jsou upravené GDNF proteinové produkty přibližně z 80 % prosté dalších proteinů, jejichž přítomnost může být způsobena výrobní technologií použitou při výrobě upraveného GDNF proteinového produktu. Upravené GDNF proteinové produkty jsou výhodně přibližně z 90 % prosté dalších proteinů, zvláště výhodně z 95 % prosté dalších proteinů a nejvýhodněji přibližně alespoň z 98 % prosté dalších proteinů. Kromě toho jedinečnou výhodou vynálezu je poskytnutí polynukleotidových sekvencí pro výrobu homogenních upravených GDNF proteinů. Použití polynukleotidové sekvence kódující [Arg³²-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein například umožňuje rekombinantní produkci upraveného GDNF proteinu v E. coli a dalších vhodných expresních systémech. Jinými slovy nové polynukleotidy umožňují produkci upravených GDNF proteinů, které nejsou přístupné pro proteolytické zpracování nebo které mají zhoršený přístup pro toto zpracování nebo pro účinky jiných, výše popsaných, biochemických zpracování. Takže nové polynukleotidy usnadňují přípravu a/nebo izolaci jednotlivých druhů upravených GDNF proteinů tak, že upravené GDNF proteiny nebo jejich produkty neobsahuji vůbec, nebo obsahují snížená množství, výše popsané směsi hetero- a homodimerů. Nicméně by se dalo předpokládat, že finální upravené GDNF proteinové produkty bude možné před podáním kombinovat níže popsaným způsobem s dalšími

4 4 ·

44 4 φ ·

4 · ·· *4

01-3029-97 Če

4444 lil faktory, chemickými kompozicemi «V

44»· <4 ·· • 4 ··

M ·· a/nebo vhodnými farmaceutickými formulačními materiály.

U jednoho provedení vynálezu se budou upravené GDNF proteiny výhodně produkovat pomocí rekombinantních technik, protože tyto techniky jsou schopny poskytnout podstatně vyšší množství proteinu při vyšší čistotě tohoto proteinu. Rekombinantně upravené GDNF proteinové formy zahrnují glykosylátované a neglykosylátované formy proteinu a protein exprimovaný v bakteriálních proteinových systémech, savčích buněčných systémech nebo hmyzích buněčných systémech. Alternativně lze upravené GDNF proteiny chemicky syntetizovat. V současné době výhodné produkční metody budou podrobněji popsány níže.

Varianty a deriváty upraveného GDNF

A. Varianty upraveného GDNF

Další aspekt vynálezu zahrnuje varianty upraveného GDNF proteinu. Výraz „upravené GDNF proteinové produkty, jak je zde použit, zahrnuje varianty proteinů, ve kterých byly zbytky aminokyselinové sekvence přirozeně se vyskytujícího GDNF deletovány („deleční varianty), inzertovány („adiční varianty) nebo substituovány („substituční varianty). Tyto varianty se připravují zaváděním příslušných nukleotidových změn do DNA kódující protein nebo in vitro chemickou syntézou požadovaného proteinu. Odborníkům v daném oboru bude zřejmé, že lze provést celou řadu kombinaci deleci, inzerci a substitucí za předpokladu, že konečný protein bude vykazovat GDNF biologickou aktivitu.

01-3029-97 Če

W v v ▼ »— T — -r -r-r• · ·« · · ·· *· • t · Φ · · ·· ··· *a • · · · · · · ·· «· ·· «·· ···· ·· ··

Odborníkům v daném oboru jsou známy techniky mutageneze pro náhradu, inzerci nebo deleci nejméně jednoho zvoleného aminokyselinového zbytku (například patent US 4,518,584). Při konstrukci variant aminokyselinových sekvencí existují dvě základní proměnné: poloha mutačního místa a povaha mutace. Při navrhování upravených GDNF variant bude poloha mutačního místa a povaha mutace záviset na biochemické vlastnosti (vlastnostech), která(é) se mají modifikovat. Mutační místa lze modifikovat individuálně nebo v sériích (1) nejprve substitucí umírněnou volbou aminokyselin a následně radikálnějšími selekcemi, provedenými na základě dosažených výsledků, (2) deleci cíleného aminokyselinového zbytku, nebo (3) inzercí aminokyselinových zbytků sousedících s příslušnou polohou mutačního místa.

Delece aminokyselinových sekvencí se zpravidla pohybují od jednoho do třiceti aminokyselinových zbytků, obvykleji od jednoho do deseti aminokyselinových zbytků a zpravidla od jednoho do pěti aminokyselinových zbytků. Delece v „X části aminokyselinových zbytků, uspořádaných jako N-konec na Cys⁴¹, se mohou například pohybovat v rozmezí přibližně od jednoho do třiceti zbytků, zatímco delece mezi cysteinovými zbytky [Cys⁴¹-Cys¹³³] se zpravidla pohybují v rozmezí od jednoho do pěti zbytků v závislosti na umístění tak, že nenarušují sbalení proteinů. Delece v upravených GDNF proteinech lze provádět v úsecích nízké homologie se členy rodiny transformačního růstového faktoru-beta (TGF-β). Delece upravených GDNF proteinů v úsecích v podstatě homologických s dalšími sekvencemi TGF-β rodiny budou pravděpodobně mnohem podstatněji modifikovat biologickou aktivitu. Počet celkových deleci a/nebo po sobě

01-3029-97 Če

9 9		to	• 1 · 9	« to	•	•
9	•	*·		• *	• ·	« ·
•	to	v	to ·	to »	• ·· ·	•	•
4 ·	to	to	to to	•	to	9
♦ *	* «		« · · · · · ·	• «	• ·

jdoucích delecí se zvolí tak, aby se ochránila terciální struktura upraveného GDNF proteinu v doméně ovlivnění, například cysteinovou křížovou vazbou.

Adice aminokyselinové sekvence mohou zahrnovat fúze amino- a/nebo karboxylového konce dosahující délek jednoho až sta nebo více zbytků a rovněž vnitřní intrasekvenční inzerce jednoho nebo více aminokyselinových zbytků. Vnitřní adice se mohou zpravidla pohybovat přibližně od jednoho do deseti aminokyselinových zbytků, běžněji přibližně od jednoho do pěti aminokyselinových zbytků a obvykle přibližně od jednoho do tří aminokyselinových zbytků. Jak již bylo uvedeno výše, adiční varianty N-konce podle vynálezu zahrnují adici methioninu (například jako produkt přímé exprese GDNF v bakteriální rekombinantní buněčné kultuře) nebo ne-GDNF aminokyselinového zbytku nebo sekvence. N-koncové adiční varianty nezahrnují adici aminokyselinového zbytku(ů), který(é) by způsobily rekonstrukci zralého GDNF proteinu. Dalším příkladem koncové inzerce je fúze heterologické N-koncové signální sekvence s N-koncem, která má usnadnit sekreci proteinu z rekombinantních hostitelských buněk. Tyto signální sekvence se zpravidla získají z použitých hostitelských buněčných druhů a jsou s nimi tedy homologické. Inzerce .nebo adice mohou rovněž zahrnovat aminokyselinové sekvence odvozené ze sekvence dalších neurotrofních faktorů.

Další skupinou variant jsou aminokyselinové substituční varianty. Tyto varianty postrádají alespoň jeden aminokyselinový zbytek zralého GDNF proteinu a namísto tohoto zbytku mají inzertovaný jiný zbytek, viz například obr. 5, ve kterém byl přirozeně se vyskytující Asn²² nahrazen Ser, čímž se usnadnilo další odstraňování « 4 4 4 4 4* 9 * 4 4 4 4 li 4 4 4444 4

4 4 4 4 <Φ4··44 4 4 *4

01-3029-97 Če

Met zbytku. Při použiti X-[Cys⁴¹-Cys¹³³]-Y pro označení aminokyselinové sekvence a definice upravených GDNF proteinových produktů lze takto upravený GDNF protein označit buď jako substituční variantu Met-[Asn²²ÁSer²²Ile¹³⁴] upraveného GDNF proteinu nebo jako adiční variantu Met-Ser-[Pro^Z3-Ile¹³⁴] upraveného GDNF proteinu. Substituční varianty zahrnují alelové varianty, které jsou charakteristické přirozeně se vyskytujícími nukleotidovými sekvenčními změnami v. populaci druhů, které mohou, ale nemusí být výsledkem aminokyselinové změny.

Specifické mutace sekvencí upravených GDNF proteinů mohou zahrnovat modifikace glykosylačního místa (například šeřinu, threóninu nebo asparaginu). Absence glykosylace nebo pouze částečná glykosylace může vést k aminokyselinové substituci nebo deleci na libovolném, na asparagin navázaném, glykosylačním rozlišovacím místě nebo na libovolném místě proteinu, které je modifikováno adicí 0navázaného cukru. Na asparágin navázané glykosylačňí rozlišovací místo obsahuje tripeptidovou sekvenci, která je specificky rozpoznána příslušnými celulárními glykosylačnimi enzymy. Těmito tripeptidovými sekvencemi jsou buď Asn-Xaa-Thr nebo Asn-Xaa-Ser, kde Xaa může znamenat jinou libovolnou aminokyselinu než Pro. Celá řada různých aminokyselinových substitucí nebo deleci na první a/nebo třetí aminokyselině glykosylačního rozpoznávacího místa (a/nebo aminokyselinové delece na druhé poloze) způsobuje, že v modifikované tripeptidové sekvenci nedochází ke glykosylaci, takže exprese vhodně upravených nukleotidových sekvencí produkuje varianty, které nejsou v tomto místě glykosylátovány. Alternativně lze tuto sekvenci

01-3029-97 Če * ^J · * · · · · · · · · · v · ·· · .« *♦·· i k « * · · · » *·· · ·

V * · · · · · · ·

Φ· ·· ·♦· ···· ·« ♦· modifikovat přidáním glykosylačních míst do upraveného GDNF proteinu.

Jedním způsobem identifikace aminokyselinových zbytků nebo úseků upraveného GDNF pro mutagenezi je způsob označeni jako „alaninová skenovací mutageneze, kterou popsal Cunningham a Wells (Science, 244: 1081-1085, 1989). U tohoto způsobu se identifikuje aminokyselinový zbytek nebo skupina cílových zbytků (například zbytků s nábojem, jakými jsou Arg, Asp, His, Lys a Glu) a nahradí se neutrální nebo záporně nabitou aminokyselinou (nejvýhodněji alaninem nebo polyalaninem), čímž se ovlivní vzájemná reakce . aminokyselin s okolním vodným prostředím v buňce nebo vně buňky. Ty domény, které demonstrují funkční senzitivitu k substitucím, se následně čistí zavedením dalších nebo alternativních zbytků v místech substituce. Takže se předem stanoví místa pro zavedení modifikace a pro optimalizaci aminokyselinové sekvence. V daném místě lze provést skenování alaninu nebo náhodnou mutagenezi, přičemž u vzniklých variant se zjišťuje optimální kombinace požadované aktivity a stupně aktivity.

Nej žádanější místa pro substituční mutagenezi zahrnují místa, ve kterých jsou aminokyseliny, nacházející se v GDNF proteinech, z různých druhů, které se podstatně liší, pokud jde o objem vedlejšího řetězce, náboj a/nebo hydrofobicitu. Další žádaná zajímavá místa zahrnují ta místa, ve kterých se nachází zbytky GDNF-podobných proteinů získaných z různých druhů, které jsou identické. Tyto pozice jsou zpravidla důležité pro biologickou aktivitu proteinu. Tato místa se nejprve modifikují substitucí, prováděnou v podstatě konzervativním způsobem. Tyto konzervativní substituce jsou shrnuty v tabulce 1 pod záhlavím, které

01-3029-97 Če · · · s *··

0 · ♦· * ·· ·· ·· uvádí výhodné substituce. Pokud je výsledkem těchto substitucí změna biologické aktivity, potom může docházet k podstatnějším změnám (exemplárním substitucím) a/nebo dalším adicím/delecím.

Tabulka 1

Aminokyselinové substituce

Původní zbytek

Výhodné substituce

Příkladné substituce

Ala	(A)	Val	Val; Leu; Ile
Arg	(R)	Lys	Lys; Gin; Asn
Asn	(N)	Gin	Gin; His; Lys; Arg
Asp	(D)	Glu	Glu
Cys	(C)	Ser	Ser
Gin	(Q)	Asn	Asn
Glu	(E)	Asp	Asp
Gly	(G)	Pro	Pro
His	(H)	Arg	Asn; Gin; Lys; Arg
Ile	(I)	Leu	Leu; Val; Met; Ala; Phe; norleucin
Leu	(L)	Ile	norleucin; Ile; Val Met; Ala; Phe
Lys	(K)	Arg	Arg; Gin; Asn
Met	(M)	Leu	Leu; Phe; Ile
Phe	(F)	Leu	Leu; Val; Ile; Ala
Pro	(P)	Gly '	Gly
Ser	(S)	Thr	Thr
Thr	(T)	Ser	Ser
Trp	(W)	Tyr	Tyr
Tyr	(Y)	Phe	Trp; Phe; Thr; Ser
Val	(V)	Leu	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; norleucin

01-3029-97 Če

• *	4	4	4·^ 4	4 4	•	4
		• 4	• ·	4 4		• 4
1 to	9	• 9	b ·	4 · 4 *	4	s
• ·	i	•	4 ·	4	4	4
«'·		··	·«*4444	kfl		*4

Dá se očekávat, že konzervativní modifikace aminokyselinové sekvence (a odpovídající modifikace pro kódování nukleokyselinových sekvencí) produkují upravené GDNF proteiny, které mají funkční a chemické vlastnosti podobné vlastnostem upravených GDNF proteinů, popsaných v níže uvedených příkladech. Podstatné modifikace funkčních a/nebo chemických vlastností upraveného GDNF proteinu mohou být zase způsobeny zvolením substitucí, které se podstatně liší svým účinkem na (a) zachování struktury polypeptidového hlavního řetězce v úseku substituce, například listové nebo šroubovicové konformace, (b) změnu hydrofobicity proteinu v cílovém místě, nebo (c) objem vedlejšího řetězce. Přirozeně se vyskytující zbytky jsou rozděleny do skupin na základě společných vlastností bočního řetězce:

1) hydrofobní: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) neutrální hydrofilní: Cys, Ser, Thr;

3) kyselinový: Asp, Glu;

4) základní: Asn, Gin, His, Lys, Arg;

5) zbytky mající řetězcovou orientaci: Gly, Pro; a

6) aromatický: Trp, Tyr, Phe.

Nekonzervativní substituce mohou zahrnovat výměnu členu jedné z těchto tříd za druhý. Takto substituované zbytky lze zavést do úseků upravených GDNF proteinů, které jsou homologické s dalšími TGF-β proteiny nebo do nehomologických úseků tohoto proteinu.

ί· * * • · « ·

«

01-3029-97 Ce •

··· · • «

Β. Deriváty upraveného GDNF

Chemicky modifikované deriváty upraveného GDNF nebo variant upraveného GDNF může odborník v daném oboru připravit na základě zde uvedeného popisu. Pro derivatizaci upravených GDNF proteinů . jsou nej vhodnějšími chemickými skupinami vodou rozpustné polymery. Vodou rozpustný polymer je žádoucí protože protein, na který se váže, se nesráží ve vodném prostředí, například ve fyziologickém prostředí. Polymer bude výhodně farmaceuticky přijatelný pro přípravu terapeutického produktu nebo kompozice. Odborník v daném oboru bude schopen zvolit požadovaný polymer na základě zvážení, zda bude konjugát polymeru a proteinu použit pro terapeutické účely a v případě že ano, bude schopen určit požadovanou dávku, dobu oběhu, odolnost proti proteolýze a další podmínky. Účinnost derivatizace lze stanovit podáním derivátu v požadované formě (tj. pomocí osmotického čerpadla nebo výhodněji injekcí nebo infuzí nebo ve formě formulované pro orální nebo pulmonární podání nebo jiný způsob podání) a určením jeho účinnosti.

Vhodné vodou rozpustné polymery zahrnují neomezujícím způsobem polyethylenglykol (PEG), kopolymery ethylenglykolu a propylenglykolu, monomethoxypolyethylenglykol, karboxymethylcelulózu, dextran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, poly-1,3-dioxolan, poly-1,3,6-trioxan, kopolymer ethylenu a anhydridu kyseliny maleinové, polyaminokyseliny (buď homopolymery nebo nahodilé kopolymery), póly(n-vinylpyrrolídon)polyethylenglykol, homopolymery propylenglykolu, kopolymery propylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylátované polyoly (například glycerol), polyethylenglykolpropionaldehyd a jejich směsi.

	• «4 * I · ··	·: · :	4 ·· · • 4 44
01-3029-97 Če	1 i 4 · 4 b 4 4 4	« ·· fr 4	• 4 4 4 4 4 4 4
	4 4 4 4	·« 4 44 4«	4« 4 4
	33
Výraz „polyethylenglykol,	jak je zde	uveden,	zahrnuj e
veškeré formy PEG, které	se používají	pro derivatizaci

dalších proteinů, například monoalkoxypolyethylenglykolu s 1 až 10 atomy uhlíku v alkoxyskupině nebo aryloxypolyethylenglykolu. Výhodou při výrobě polypropylenglykolpropionaldehydu může být jeho dobrá stabilita ve vodě. Polymer může mít libovolnou molekulovou hmotnost a může být větvený nebo nevětvený.

Vynález se zejména týká upravených GDNF proteinových produktů zahrnujících upravený GDNF protein navázaný na alespoň jednu PEG molekulu. U dalšího provedení se vynález týká upraveného GDNF proteinu navázaného na alespoň jednu PEG molekulu přes acylovou nebo alkylovou vazbu.

Pegylaci lze provádět za použití libovolné pegylační reakce známé v daném oboru. Viz například: Focus on Growth Factors 3(2): 4-10 (1992); EP 0 154 316; EP 0 401 384; a Malík a kol., Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (popisuje pegylaci GM-CSF pomocí tresylchloridu). Výhodně se pegylace provádí pomocí acylačni nebo alkylační reakce s reakČním, vodou rozpustným polymerem. Prostředky výhodné pro derivatizaci budou podrobněji diskutovány níže. Pro acylačni reakce se výhodně zvolí polymer(y), který(é) má (mají) jednu reakční esterovou skupinu. Pro redukční alkylační reakce se výhodně zvoli polymer(y), který(é) má (mají) jednu reakční aldehydovou skupinu. Pro řízení stupně polymerace je výhodné modifikovat zvolený polymer tak, aby mel jednu reakční skupinu, například aktivní esterovou skupinu v případě acylace nebo aldehydovou skupinu v případě alkylace. Vodou rozpustný polymer se zpravidla nezvolí z přirozeně se vyskytujících glykosylových zbytků,

01-3029-97 Če

• 4 4	•	4 4 · ·	4 4« *
4 4		··	• 4	4 4	4 ·
4 *	•	♦ 4	b ·	4 · 4	• ·
ft ·	•	4	4 9	•	• ·
··		• »	4·«		4 4

protože ty se obvykle běžněji připravuji pomocí savčích rekombinantních expresních systémů.

Acylace

Pegylace acylací prováděná v rámci vynálezu zpravidla zahrnuje aktivní esterový .derivát polyethylenglykolu upraveným GDNF proteinem. K provádění pegylačního procesu lze použít libovolnou známou nebo následně objevenou reakční PEG molekulu. Výhodným aktivovaným PEG esterem je PEG esterifikovaný na N-hydroxysukcinimid („NHS). Výrazem „acylace, jak je zde uveden, se rozumí například následující typy vazeb mezi upraveným GDNF proteinem a vodou rozpustným polymerem, jakým je PEG:amidová vazba, karbamátová vazba, urethanová vazba apod. Viz’ Bijoconjugate Chem. 5:133-140 (1994). Reakčními podmínkami mohou být libovolné, pro pegylaci vhodné, reakční podmínky, které jsou v daném oboru známy, ale 'měly by se vyloučit takové

podmínky, například teplota,	rozpouštědlo	a pH,	které by
inaktivovaly upravený GDNF	protein,	které	má být
modifikován.
Výsledkem pegylační	acylace bude	zpravidla
polypegylátovaný upravený GDNF protein.	ve kterém jsou

lysinové ε-aminoskupiny pegylátované pomocí acylové vazebné skupiny. Spojovací vazbou bude výhodně amid. Výsledným produktem bude rovněž výhodně v podstatě pouze (například > 95%) mono-, di- nebo tri-pegylátovaný produkt. Nicméně v závislosti na specifických použitých reakčních podmínkách se bude zpravidla tvořit i odpovídající množství konjugátů s vyššími stupni pegylace. Pokud je to žádoucí, je možné ze směsi pomocí standardních purifikačních technik, například r e e

01-3029-97 Če

0*ř β

Oc fa b

o fc· c	r, ti i	e «τ-
	k '*?	α <!.·.
k €	i ít i	i? c··' t li:
o π«- n « λ e	n r	λ r,·

i’ / i i

* • dialýzy·,' vysolováni/ ultrafiltrace, iontomě-ničové chromatografie)-·* gelové filtrační chromatografie a elektroforézy,'separovat čistší- pegylátované koňjugáty.

' > J i 1 ,· ' ‘ i

Γ '..'.i *

,.Λ; * , ·,

Alkylace

Pegylace alkylací' zpravidla zahrnuje uvedení koncového ! <“ ? ¹ * I. . * f .>

aldehydového derivátu PEG do reakce s upraveným GDNF proteinem v přítomnosti' * redukčního činidla. Alkylačni pegylací lze rovněž získat polypegylátovaný upravený GDNF protein. Kromě toho lze manipulovat s reakčními podmínkami tak, aby pegylace proběhla v podstatě pouze na *a-aminoskupině N-konce proteinu (tj. aby se získaly monopegylátované druhy). Jak v případě monopegylace tak i v případě polypegylace jsou PEG skupiny výhodně navázány na protein přes -CH₂-NH-skupinu. Pokud jde o -CH₂-skupinu, tento typ vazby je zde označován jako „alkylová vazba.

. Selektivní chemickou modifikaci N-konce lze provádět pomocí redukční alkylace, která využívá různé reaktivity různých typů primárních aminokyselin (lysin versus N-konec);'dostupných, pro derivatizaci příslušného proteinu.

Za vhodných* reakčních .podmínek se dosáhne v podstatě selektivní dérivatizace „ proteinu na N-konci polymerem obsahuj.ícim.karbonylovou skupinu. Prováděním reakce při pH, která umožni využít¹ ” výhody rozdílných pK_a ε-aminoskupin lysinovýcii zbytků a 'á-aminoskupin Ň-kóncového zbytku _r ^J -. ^í proteinu,' se^J může ' například' dosáhnout selektivní pegylace

N-konce' proteinu. ' Pomocí' této selektivní derivatizaóe ' se řídí navázání'* Vodou rozpustného polymeru na protein. Konjugace s polymerem probíhá převážně ¹ na N-k’oňci^r proteinu j

.i i

01-3029-97 Če

« v v		V 9		« » • ·
• ·	··
♦ ·	•	• 9	•	« ♦ ·« ·	• ·
• *	•	9	•	• *	• *
J ••ta	• 9				• 9

a nedochází k žádné podstatnější modifikaci ostatních reakčních skupin, například aminoskupin v lysinovém postranním řetězci. Při použití redukční alkylace má výhodně vodou rozpustný polymer jeden reakční aldehyd pro navázání proteinu. Lze použít polyethylenglykolpropionaldehyd, který obsahuje jeden reakční aldehyd.

Vynález zahrnuje pegylátované upravené GDNF proteiny, u kterých je (jsou) PEG skupina (PEG skupiny) navázány přes acylovou nebo alkylovou skupinu. Jak již bylo diskutováno výše, tyto upravené GDNF proteiny mohou být monopegylátované nebo polypegylátované (například obsahující 2-6, výhodně 2-5, PEG skupin). PEG skupiny jsou zpravidla navázány na protein přes a- nebo ε-aminoskupiny aminokyselin, ale rovněž je třeba vzít v úvahu, že PEG skupiny mohou být navázány na libovolnou aminoskupinu proteinu, která je dostatečně reaktivní na to, aby se za vhodných reakčních podmínek navázala na PEG skupinu. Polyethylenglykol může být tedy kovalentně navázán na protein přes reakční skupinu, například volnou aminoskupinu nebo karboxylovou skupinu. Reakčnimi skupinami jsou ty skupiny, na které se může vázat molekula aktivovaného PEG. Aminokyselinové zbytky, které mají volnou aminoskupinu, mohou zahrnovat lysinové zbytky a N-koncový aminokyselinový zbytek. Ty, které mají volnou karboxylovou skupinu, mohou zahrnovat zbytky tvořené kyselinou asparágovou, zbytky tvořené kyselinou glutamovou a C-koncový aminokyselinový zbytek. Sulfhydrylové skupiny lze rovněž použít jako reakční skupinu pro navázání PEG molekuly (PEG molekul). Pro terapeutické účely je zpravidla výhodné navázání na aminoskupinu, například navázání na N-konec nebo lysinovou skupinu. Navázání na zbytky, důležité pro navázání

01-3029-97 Če • 4 4 4 · «4

4 4 4 4 k 4 4 4 • * 4 4

»4 4 ♦ 4 4	•	4
4 4 14	4 4
• ♦'· 4 ···	4	•
4 4 4	4	•
• 44 4*44 «4	44

receptoru, by se mělo vyloučit v případě, že toto navázání receptoru je žádoucí.

V jednom aspektu vynález poskytuje v podstatě homogenní přípravu konjugátu monopolymeru a upraveného GDNF proteinu, ve kterém byla molekula proteinu navázána v podstatě pouze (tj. ~> 95%) v jediném místě. Konkrétněji, pokud se použije PEG, vynález rovněž poskytuje pegylátovaný a upravený GDNF protein, který postrádá možné antigenové vazebné skupiny a má PEG molekulu přímo navázánu na upravený GDNF protein.

Kromě toho glykosylátováného, lze deriváty připravit za použití neglykosylátovaného nebo deglykosyláto vaného upraveného GDNF proteinu. Zpravidla se používají neglykosylátované upravené GDNF proteiny. Prokaryotou exprimovaný [Arg³²-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein lze například chemicky derivatizovat tak, aby zahrnoval mononebo póly-, (například 2 až 4, PEG zbytky, navázané přes acylovou nebo alkylovou skupinou).

Chemickou derivatizaci lze běžně provádět za libovolných vhodných podmínek, používaných pro reakci biologicky účinné látky s aktivovanou polymemí molekulou. Způsoby přípravy pegylátovaných upravených GDNF proteinů budou zpravidla zahrnovat (a) reakci upraveného GDNF proteinu s polyethylenglykolem (například reakčním esterovým nebo aldehydovým derivátem PEG) za podmínek, za kterých se upravený GDNF protein naváže na . nejméně jednu PEG skupinu; a (b) získání reakčního produktu(ů). Optimální reakční podmínky pro acylační reakce se běžně určují případ od případu na základě známých parametrů a požadovaného výsledku. Čím větší je například poměr PEG ku proteinu, tím • · · * ·

01-3029-97 Če

Optimální kterém po • ♦ «

• ···♦ •· • · ♦♦ ·« · · * • ·· ··

4vyšší je poměr (ve ukončení procento polypegylátovaného produktu, smyslu účinnosti reakce, tj . poměr, při reakce nezbyde žádný nezreagovaný protein nebo lze určit pomoci faktorů, jakými jsou například di-, tri-, polymer) požadovaný stupeň derivatizace (například mono-, atd.), molekulová hmotnost zvoleného polymeru, polymerního řetězce (větvená nebo nevětvená) reakční podmínky.

Redukční alkylacé, populaci konjugátu monopolymeru a bude zpravidla zahrnovat (a) proteinu s reakční PEG molekulou podmínek při pH, které v—“ struktura a použité homogenní produkující v podstatě upraveného GDNF proteinu, reakci upraveného GDNF za redukčních alkylačních umožňuje selektivní modifikaci α-aminoskupiny na N-konci upraveného GDNF proteinu; a (b) získání reakčního produktu(ů).

Pro v podstatě homogenní populaci konjugátu a upraveného GDNF proteinu jsou redukčními reakčními podmínkami monopolymeru alkylačními umožňují selektivní navázání vodou zbytku na N-konec upraveného GDNF ty podmínky, které rozpustného polymerního proteinu.

podmínky zpravidla poskytují pK_a diference mezi

Tyto reakční lysinovými

ÍT je pH, při nikoliv).

aminoskupinami a α-aminoskupinou na N-konci kterém je 50 % aminoskupin protonováno a Hodnota pH rovněž ovlivňuje poměr použitého polymeru a proteinu. Zpravidla platí, že při nižší pH hodnotě je třeba použít větší přebytek polymeru ku proteinu (tj. čím méně (P&a %

reaktivní je N-koncová a-aminoskupina, tím více polymeru je V případě tak vysoký tím méně pro dosaženi optimálních podmínek). nemusí být poměr polymeru ku proteinu reaktivnější skupiny jsou dostupné, zapotřebí vyššího pH (tj. čím polymerních molekul je zapotřebí). Pro účely vynálezu bude

01-3029-97 Če

•	•	• ' ’ 9	99 9 ♦ 9 9	9	9
9	•	··	9 · 9 9	• 9
*	•	• · ·	• 9' · 999	•	•
9 ·	• 9	9 9 9	9	9
• »	• *	9*9 9999 99	• 9

pH hodnota zpravidla ležet v rozmezí od 3 do 9, výhodně od

Dalším důležitým parametrem je molekulová hmotnost polymeru. Zpravidla platí, že čím větší molekulovou hmotnost má polymer, tím méně polymerních molekul se může navázat na protein. Při optimalizaci těchto parametrů by mělo být obdobným způsobem zváženo 'větvení .polymeru. Zpravidla platí, že čim vyšší je molekulová hmotnost (více větví), tím vyšší je poměr polymer:protein. Pro zde uvažované pegylační reakce je výhodnou průměrnou molekulovu hmotností přibližně 2 kDa až 100 kDa (výraz „přibližně označuje ± 1 kDa). Výhodnou průměrnou molekulovou hmotností je přibližně 5 kDa až 50 kDa, zvláště výhodně přibližně 12 kDa až 25 kDa. Poměr vodou rozpustného polymeru ku upravenému GDNF proteinu se bude zpravidla pohybovat v rozmezí od 1:1 do 100:1, výhodně (pro polypegylaci) od 1:1 do 20:1 a (pro monopegy.laci) od 1:1 do 5:1.

Při použití výše popsaných podmínek bude redukční alkylace poskytovat selektivní navázání polymeru na libovolný upravený GDNF protein, který má na N-konci α-aminoskupinu, a poskytne v podstatě homogenní přípravu konjugátu monopolymeru a upraveného GDNF proteinu. Výraz „konjugát monopolymeru a upraveného GDNF proteinu, označuje derivát obsahující jednu polymerní molekulu navázanou na upravený GDNF protein. Konjugát monopolymeru a upraveného GDNF proteinu bude mít výhodně polymerní molekulu situovanou na N-konci, ale nikoli na lysinových postranních aminoskupinách. Přípravek bude výhodně tvořen z více než 90 % konjugátem monopolymeru a upraveného GDNF proteinu a výhodně z více než 95 % bude tvořen konjugátem monopolymeru a upraveného GDNF proteinu, přičemž zbytek pozorovaných

01-3029-97 Če

V · 4 · vwv · » v * »4 4» 4 i 4 » 44 » 4' 4 44 4 4 φ 44 » 4 · » · 4 4 » ♦ 44» «4 4'4 4*4 44*4 4« »4 proteinů bude nezreagovaný (tj. protein, postrádající polymerní zbytek).

Pro redukční alkylaci by se mělo použít redukční činidlo, které je stabilní ve vodném roztoku a které je výhodně schopno redukovat pouze Schiffovu bázi, která se tvoří při iniciaci redukční alkylace. Příkladná redukční činidla lze zvolit ze skupiny tvořené borohydridem sodným, kyanoborohydridem sodným, dimethylaminoboranem, trimethylaminoboranem a pyridinboranem. Zvláště výhodným redukčním činidlem je kyanoborohydrid sodný. Další reakční parametry, například rozpouštědlo, reakční dobu, teplotu, atd. a prostředky purifikače produktů lze určit případ od případu na základě běžně dostupných informací, týkajících se derivátizace proteinů vodou rozpustnými polymery.

Lze zvolit přípravu směsi konjugátu polymerů a proteinů acylační a/nebo alkylační metodou a poskytnutou výhodou je, že lze zvolit proporcionální zastoupení konjugátu monopolymeru a proteinu ve směsi. Takže pokud je to žádoucí, lze připravit směs proteinů, která má na sobě navázán různý počet polymerních molekul (tj. di-, tri-, tetra-, atd.) a kombinovat ji s konjugátem monopolymeru a proteinu, připraveným způsoby podle vynálezu, a tak získat směs s předem stanoveným zastoupením konjugátu monopolymeru a proteinu.

Polynukleotidy kódující upravené GDNF proteiny

Vynález dále poskytuje nové polynukleotidy, které kódují upravené GDNF proteiny. Pokud se tyto použijí jako hybridizační sonda nebo amplifikační primer, potom by ·«·· ···· ···· to*.·· · · ♦ · ·· to to¹· ·· · ·>· ···· · to··· · * ·«· ·· ·· ··· ···· ♦· ··

01-3029-97 Če nukleokyselinová sekvence měla být v podstatě prostá všech ostatních nukleokyselinových sekvencí. Při použití v rámci rekombinantní proteinové exprese bude.nukleotidová sekvence v podstatě prostá nukleotidových sekvencí kódujících další proteiny, pokud tím není myšlen fúzní protein. Na základě předloženého popisu a s použitím univerzální kodonové tabulky je odborník v daném oboru schopen snadno určit všechny nukleotidové sekvence, které kódují aminokyselinové sekvence upravených GDNF proteinů. V současné době výhodné nukleotidové sekvence zahrnuji ty polynukleotidy, které kódují [Arg^1Ě-Ile¹³⁴], [Ser^2S-Ile¹³⁴], [Arg³²-Ile¹³⁴] a [Lys³⁷-Ile¹³⁴] upravené GDNF proteiny. Příklady různých polynukleotidů, které kóduji upravené GDNF proteiny, jsou znázorněny na obrázcích 5, 6 a 7 a rovněž na obrázcích 1, 3 a 4. Odborníkovi v daném oboru bude zřejmé, že nové polynukleotidy, které kódují upravené GDNF proteiny, zahrnují ty nukleokyselinové sekvence, které kódují varianty upravených GDNF proteinů, ať jsou připraveny uměle nebo se vyskytují přirozeně.

Rekombinantní expresní techniky, prováděné podle níže uvedeného popisu, lze použít při produkci polynukleotidů a expresi různých upravených GDNF proteinů. Vložením nukleotidové sekvence, která kóduje upravený GDNF.protein, do příslušného vektoru může odborník v daném oboru například snadno připravit velké množství požadované nukleotidové sekvence. Sekvence se mohou následně použít pro generování detekčních sond a amplifikačních primerů. Alternativně může být polynukleotid, kódující upravený GDNF protein, vložen do expresního vektoru. Zavedením expresního vektoru do příslušného hostitele lze produkovat větší množství požadovaného upraveného GDNF proteinu.

• ••to ♦»· · · ·>·* to··· » · ····to · ♦ · · · ·' ♦ ···· · to··· ·.· · · · ·· ·· ··· ···· to· ··

01-3029-97 Če

Jak je zde dále uvedeno, pro propagaci nukleotidových sekvencí a/nebo produkci upraveného GDNF proteinu existuje celá řada vhodných systémů hostitel/vektor. Tyto systémy zahrnují' neomezujícím způsobem plasmidový, virový a inzerční vektor a prokaryotické a eukaryotické hostitele. Odborník v daném oboru může přizpůsobit systém hostitel/vektor, který je schopen propagovat nebo exprimovat heterologickou DNA, tak, aby produkovala nebo exprimovala sekvence podle vynálezu.

Pomocí těchto rekombinantních technik lze upravené GDNF proteiny podle vynálezu snadno vyrábět v komerčním měřítku. Kromě toho může odborník v daném oboru na základě předloženého popisu předpokládat, že nové nukleokyselinové sekvence, které zahrnují degenerační nukleokyselinové sekvence, kódující upravené GDNF proteiny, specificky znázorněné na obrázcích, varianty těchto upravených GDNF proteinů a ty nukleotidové sekvence které hybridizují, výhodně za přísných hybridizačních podmínek, doplňují tyto nukleotidové sekvence (viz Maniatis a kol., Molecular Cloning (A Laboratory Manual); Cold Spring Harbor Laboratory, str. 387 až 389, 1992). Příkladnými přísnými hybridizačními podmínkami jsou hybridizace ve 4 x SSC při 62 až 67°C, následné promýváni v 0,1 x SSC při 62 až 67°C přibližně po dobu jedné hodiny. Alternativními přísnými hybridizačními podmínkami jsou hybridizace ve 45 až 55% formamidu, 4 x SSC při 40 až 45°C. Jsou zde rovněž zahrnuty

DNA sekvence, které hybridizují na komplementární sekvence upraveného

GDNF proteinu za uvolněných hybridizačních podmínek a které kódují upravený GDNF protein podle vynálezu.

Příklady těchto uvolněných hybridizačních

01-3029-97 Ce podmínek jsou 4 x SSC při 45 až 55°C nebo hybridizace 30 až 40% formamidem při 40 až 45°C.

Vynález rovněž poskytuje rekombinantní DNA konstrukty zahrnující vektorovou DNA společně s DNA sekvencí, kódující upravený GDNF protein. V těchto . konstruktech je nukleokyselinová sekvence, kódující upravený GDNF protein (s nebo bez signálních peptidů), v operačním spojení s vhodnou expresní kontrolní nebo regulační sekvencí, která je schopna řídit replikaci a/nebo expresi upraveného GDNF proteinu ve zvoleném hostiteli.

Rekombinantní exprese upraveného GDNF proteinu

Příprava polynukleotidů, kódujících upravený GDNF

Nukleokyselinové sekvence, kódující upravený GDNF, nebo zralý GDNF výchozí materiál, mohou být snadno získány celou řadou způsobů včetně chemické syntézy, cDNA neboprohledávání genomové knihovny, prohledávání expresní knihovny a/nebo PCR amplifikací cDNA. Tyto a další metody, použitelné pro izolování těchto nukleotidových sekvencí, uvádí například Sambrook a kol. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Ausubel a kol., vyd. (Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press, 1994) a Berger a Kimmel (Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, sv. 152, Academie Press, lne., San Diego, CA, 1987). Výhodnými nukleokyselinovými sekvencemi kódujícími GDNF jsou savčí sekvence.

01-3029-97 Če » ··· * t · ♦· • » ·♦ ·· ··

• * · · • · ·♦ ··

Chemické syntézy nukelokyselinové sekvence, která kóduje upravený GDNF protein, mohou být rovněž realizovány za použití v daném oboru známých metod, například metod, které popisuje Engels a kol. (Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734, 1989). Tyto způsoby mimo jiné zahrnují fosfotriesterové, fosforamiditové a H-fosfonátové způsoby syntézy nukleokyselinové sekvence. Délka nukleokyselinové sekvence, kódující upravený GDNF protein, bude mít několik stovek bazických párů (bp) nebo nukleotidů. Velké nukleotidové sekvence, například ty, jejichž délka je větší než přibližně 100 nukleotidů, lze syntetizovat jako několik fragmentů. Tyto fragmenty lze ligovat dohromady za vzniku nukleokyselinové sekvence, kódující upravený GDNF protein. Výhodným způsobem je polymer podporující syntéza, která používá standardní fosforamiditovou chemii.

Alternativně lze vhodnou nukleokyselinovou sekvenci získat prohledáváním příslušné cDNA knihovny (tj. knihovny, připravené nejméně z jednoho tkáňového zdroje, o kterém se předpokládá, že by mohl exprimovat protein) nebo genomové knihovny (knihovny, připravené z celkové genomové DNA) . Zdrojem cDNA knihovny je zpravidla tkáň ze všech druhů, o kterých se dá předpokládat, že exprimují GDNF v podstatnějších množstvích. Zdrojem genomové knihovny může být libovolná tkáň nebo tkáně libovolného savce nebo jiných druhů, o kterých se předpokládá, že deponuji gen, kódující GDNF nebo GDNF homolog. Cílem prohledáváni knihovny je potvrzení přítomnosti GDNF cDNA/genu pomocí alespoň jedné nukleokyselinové sondy (oligonukleotidu, cDNA nebo genomových DNA fragmentů, ' které vykazují přijatelnou hladinu homologie s GDNF nebo GDNF homologickou cDNA nebo genem, který se má klonovat), která bude selektivně

01-3029-97 Če • · · Φ O · · * » · ’

Φ Φ ·« · · Φ · ·Φ * Φ φ · · Φ · · »·· Φ ⁰ ·*·· Φ · Φ«Φ ·« ΦΦ >ΦΦ Φ·*Φ ΦΦ «Φ hybridizovat s GDNF nebo GDNF homologickou (ými) cDNA nebo genem(y), které jsou přítomné v uvedené knihovně. Pro prohledávání knihovny se zpravidla použijí sondy, které kódují krátký úsek GDNF DNA sekvence druhu, který je stejný nebo podobný druhu, ze kterého byla knihovna připravena. Alternativně mohou být sondami degeneráty, jak je zde uvedeno.

Prohledávání knihovny se zpravidla provádí temperováním oligonukleotidové sondy nebo cDNA na klony v knihovně za přísných podmínek, které zabraňují nespecifickému navázání ale umožňují navázání těchto klonů, které mají vysokou hladinu homologie, se sondou nebo primerem. Obvyklé přísné hybridizační a promývací podmínky závisí částečně na velikosti (tj. počtu nukleotidů v celé délce sekvence) cDNA nebo oligonukleotidové sondy a na tom, zda je sondou degenerát. Při navrhování hybridizačního roztoku je rovněž třeba zvážit pravděpodobnost získání klonu(ů) (tj. zdali je prohledávána cDNA nebo genomová knihovna; v případě, že je prohledávána cDNA knihovna, je pravděpodobnost, že je sledovaná cDNA přítomna, velká).

V případě, že se jako sondy použijí DNA fragmenty (například fragmenty cDNA), budou typické hybridizační podmínky zahrnovat podmínky popsané Ausubelem a kol., ed._z viz výše. Po hybridizaci se blot obsahující knihovnu promyje za vhodně přísných podmínek, které závisí na několika faktorech, například na velikosti sondy, očekávané homologii sondy s klonem, typu knihovny, která se prohledává, počtu klonů, které se prohledávají apod. Příklady přísných promývacích roztoků (které mají zpravidla nízkou iontovou sílu a používají se při relativně vysokých teplotách) jsou následující. Jedním takovým promývacím

01-3029-97 Če	• · · · toto to * • · ·« to · • to to · to * · « · · to to · ·· toto to·· ····	• « · » • · to · • to · to « * • · · ·· · ·
	46
roztokem je 0,015 M	NaCl, 0,005 M citrát sodný	a 0,1%	SDS
při 55 až 65°C.	Dalším takovým přísným	pufrem	je

mM Na₂EDTA, 40 mM NaHPOj, pH 7,2 a 1% SDS přibližně při 40 až 50°C. Dalším proplachem je 0,2 x SSC a 0,1% SDS přibližně při 50 až 65°C.

Existuji rovněž exemplární protokoly přísných promývacích podmínek pro prohledávání cDNA nebo genomových knihoven za použití oligonukleotidových sond. První protokol používá například 6 x SSC s 0,05 procenty difosforečnanu sodného při teplotě přibližně 35 až 62°C v závislosti na délce sondy. Sondy o délce čtrnácti bázi se promývají při teplotě 35 až 40°C, sondy o délce sedmnácti bází se promývají při teplotě 45 až 50°C, sondy o délce dvaceti bází se promývají při teplotě 52 až 57°C a sondy o délce dvaceti tří bází se promývají při teplotě 57 až 63°C. V případě, že se nespecifické vazby pozadí zdají vysoké, teplota se může zvýšit o 2 až 3°C. Druhý protokol používá pro promývání tetramethylamoniumchlorid (TMAC). Jedním takovým přísným promývacím roztokem je 3 M TMAC, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 a 0,2% SDS.

Dalším vhodným způsobem pro získání nukleokyšelinové sekvence kódující GDNF protein je polymerázová řetězová reakce (PCR). Při tomto způsobu se z tkáně, která exprimuje GDNF, extrahuje poly(A)+RNA nebo celková. RNA. Z RNA se pomocí enzymatické reverzní transkriptázy následně připraví cDNA, Následně se do samotné cDNA přidají dva primery, které jsou zpravidla komplementární ke dvěma separátním úsekům GDNF cDNA (oligonukleotidů) spolu s polymerázou, například Taq polymerázou, přičemž tato polymeráza amplifikuje cDNA úsek mezi těmito dvěma primery.

01-3029-97	Če	* · · 4 «44 4 * · ·· 4 4 •••44 4 4» * · 4 4 4 4 ·· *4 44· 4444	* 4 4 v • 4 ·· • 4 4 · 4 4 4 4 44 ♦·
		47
Pokud	zvolený	způsob přípravy nukleokyselinové
sekvence,	kódující	požadovaný upravený GDNF	protein,

vyžaduje použiti oligonukleotidových primerů nebo sond (například prohledáváni PCR, cDNA nebo genomová knihovny), potom by měly mít oligonukleotidové sekvence, zvolené jako sondy nebo primery, odpovídající délku a dostatečnou zřejmost, aby minimalizovaly množství nespecifických vazeb, ke kterým by došlo během. prohledávání knihovny nebo PCR amplifikace. Základem, konkrétní sekvence sond nebo primerů jsou zpravidla vysoce homologické sekvence nebo úseky stejného nebo podobného genu druhého organismu. Případně mohou být sondy nebo primery zcela nebo částečně degenerovány, t j. obsahovat směs sond a primerů, která kóduje stejnou aminokyselinovou sekvenci, ale za použití různých kodonů. Alternativním postupem přípravy degenerovaných sond je umístění inosinu do některých kodonových pozic nebo do všech kodonových pozic, které se u jednotlivých druhů liší. Oligonukleotidové sondy nebo primery lze připravit chemickými syntetizačními metodami používanými pro syntézu výše popsané DNA.

Upravené GDNF proteiny, jejichž podstatu tvoří tyto nukleokyselinové sekvence, kódující GDNF, a rovněž jeho mutantní formy nebo varianty, spadají rovněž do rozsahu vynálezu. Jak již bylo uvedeno výše, sekvence mutantních forem nebo variant je sekvence, která obsahuje alespoň jednu nukleotidovou substituci, deleci a/nebo inzerci v porovnání se standardním typem sekvence, která má za následek expresi aminokyselinových sekvenčních variací standardního typu aminokyselinové sekvence. V některých případech mohou existovat přirozeně se vyskytující GDNF aminokyselinové mutantní formy nebo varianty díky existenci

01-3029-97 Če · · · tii · * t « *

4 ·· * * 4 4·· * · v 00 · 0 4 ·· · 4 * • 444 0·04*

44 ··· ···· ··«· přirozených alelových variací. Upravené GDNF proteiny na bázi těchto přirozeně se vyskytujících mutantů nebo variant rovněž spadají do rozsahu vynálezu. Příprava syntetických mutantních sekvenci je v daném oboru rovněž známa a popisuje ji například Wells a kol. (Gene, 34:315, 1985) a Sambrook a kol., viz výše.

Vektory

Genomová DNA nebo cDNA kódující upravený GDNF protein se vloží do vektoru, který se použije pro další klonování (amplifikace DNA) nebo expresi. Vhodné vektory jsou komerčně dostupné nebo mohou být specificky konstruovány. Selekce nebo konstrukce konkrétního vektoru bude záviset na 1) tom, zda má být použit pro DNA amplifikaci nebo pro DNA expresi, 2) velikosti DNA, která má být vložena do vektoru a 3) hostitelské buňce (například savčí, hmyzí, kvasinkové, fungální, rostlinné nebo bakteriální buňce), která má být transformována vektorem. Jednotlivé vektory obsahují různé složky, přičemž složení těchto složek závisí na funkci vektoru (amplifikaci DNA nebo expresi DNA) a jeho slučitelnosti s příslušnou hostitelskou buňkou. Vektorové složky zpravidla zahrnují alespoň jednu z následujících složek: signální sekvenci, počátek replikace, alespoň jeden selekční nebo značkovací gen, zesilovací prvek, promotor, transkripční terminační sekvenci, apod. Tyto složky lze získat z přirozených zdrojů nebo syntetizovat známými postupy. Vektory podle vynálezu zahrnují nukleokyselinovou sekvenci, která kóduje sledovaný upravený GDNF protein, operativně navázaný na nejméně jednu kontrolní nebo regulační sekvenci, která je schopna řídit, regulovat nebo

4 4 4 * 44 ;; ♦

01-3029-97 Če ·· 4*

jinak ovlivňovat expresi upraveného GDNF proteinu zvolenou hostitelskou buňkou.

Signální sekvence

Signální sekvence může být složkou vektoru nebo částí GDNF DNA, která se vloží do vektoru. Nativní GDNF DNA kóduje signální sekvenci na N-konci proteinu, která se odštěpí v průběhu posttranslačního zpracování proteinu za vzniku zralého GDNF proteinu. Do rozsahu vynálezu spadají upravené GDNF polynukleotidy s nativní signální sekvencí a dalšími pre-pro sekvencemi a rovněž upravené GDNF polynukleotidy, ze kterých je nativní signální sekvence odstraněna a nahrazena heterologickou signální sekvencí. Zvolenou heterologickou signální sekvencí by měla být sekvence, kterou hostitelská buňka rozpozná a zpracuje, t.j . rozštěpí pomocí signální peptidázy. Pro prokaryotické hostitelské buňky, které nativní GDNF signální sekvenci nerozpoznají a nezpracují, je tato signální sekvence substituována prokaryotickou signální sekvencí, zvolenou například ze skupiny alkalinfosfatázy, penicilinázy nebo tepelně stabilních enterotoxinových II vodičů. V případě kvasinkové sekrece se může nativní GDNF signální sekvence substituovat kvasinkovou invertázou, alfa faktorem nebo kyselinofosfatázovými vodiči. Savčí expresi vyhovuje nativní signální sekvence jako taková ačkoliv ostatní savčí signální sekvence mohou být rovněž vhodné.

01-3029-97 Če

• · ·	*	4· v * v v	v	v
t *		•e	• · · ·
• ·	•	• ·		•	A
• ·	•	•	* · ·	•	•
		··	···· ··

Počátek replikace

Expresní a klonující vektory zpravidla zahrnuji nukleokyselinovou sekvenci, která vektoru umožňuje replikovat se v nejméně jedné zvolené hostitelské buňce. V klonovacích vektorech je touto sekvencí zpravidla sekvence, která vektoru umožňuje replikovat nezávisle hostitelskou chromozomální DNA a zahrnuje počátek replikace nebo autonomně replikující sekvence. Těmito sekvencemi jsou různé známé bakterie, kvasinky a viry. Počátek replikace v plasmidu pBR322 je vhodný pro většinu gram-negativních bakterií a pro klonování vektorů v savčích buňkách se používají různé počátky (například SV40, polyom, adenovir, VSV nebo BPV). Savčí expresní faktory počátek repiikační složky většinou nevyžadují (například SV40 počátek se často používá pouze proto, že obsahuje raný promotor).

Selekční gen

Expresní a klonovací vektory zpravidla obsahují selekční gen. Tento gen kóduje „markér, což je nezbytný protein pro přežití nebo růst transformovaných hostitelských buněk, pokud se tyto buňky nacházejí v selektivním kulturním médiu. Hostitelské buňky které nebyly transformovány vektorem nebudou obsahovat selektivní gen a tak v kultivačním médiu nepřežijí. Typické selekční geny kódují proteiny, (a) které mu propůjčí odolnost proti antibiotikům nebo jiným toxinům, například ampicilinu, neomycinu, methotrexatu nebo tetracyklinu; (b) které doplňují auxotrofní deficience; nebo (c) které dodávají důležité živiny, které neposkytuje kultivační médium.

• 4 ·

i

01-3029-97 Če

Další selekční geny lze použít pro amplifikaci genu, který se bude exprimovat. Amplifikace je proces, ve kterém se geny,, po kterých je při produkci proteinu kritického pro růst větší poptávka, opakují v chromozomech při. postupném generování rekombinantních buněk. Mezi markéry, vhodné pro savčí buňky, patří například dihydrofolátreduktáza (DHFR) a thymidinkináza.

Transformované savčí buňky se zatíží selekčním tlakem, kterému jsou díky markéru, přítomnému ve vektoru, schopny se přizpůsobit pouze tyto transformované savčí buňky. Selekční tlak si vynucuje kultivace transformovaných buněk za podmínek, za kterých se koncentrace selekčího činidla v médiu postupně mění, což vede k amplifikaci jak selekčního genu tak DNA, která kóduje upravený GDNF a díky tomu se z amplifikované DNA syntetizuje větší množství upraveného GDNF.

Například buňky transformované DHFR selekčním genem se nejprve identifikují kultivací všech transformovaných buněk v kultivačním médiu, které obsahuje methotrexát, což je konkurenční antagonizující činidlo DHFR. Vhodnou hostitelskou buňkou, pokud se použije standardní typ DHFR, je buněčná linie vaječníku čínského křečka, postrádající DHFR aktivitu (viz například Urlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77(7):4216-4220 (1980)). Transformované buňky se následně vystaví působení zvýšených hladin methotrexátu. To vede k syntéze více kopií DHFR genu a současně k více kopiím další DNA, přítomné v expresním vektoru, například DNA kódující upravený GDNF protein.

01-3029-97 Če ·····«* · * ··

Promotor

Expresní a klonovací vektory podle vynálezu budou zpravidla obsahovat promotor, který je rozpoznán hostitelským organizmem a který je operativně .navázán na nukleokyselinovou sekvenci, kódující upravený GDNF protein. Promotory jsou nepřenesené sekvence, uspořádané před (5') počátečním kodonem strukturálního genu (zpravidla přibližně 100 až 1 000 bp), které kontrolují přepis a přenos příslušné nukleokyselinové sekvence, například sekvence kódující upravený GDNF. Promotory jsou běžně rozděleny do dvou skupin na indukovatelné promotory a základní promotory. Indukovatelné promotory iniciují zvýšenou úroveň transkripce z DNA za jejich kontroly v odpovědi na určitou změnu kultivačních podmínek, například na přítomnost nebo nepřítomnost živin nebo změnu teploty. Je znám velký počet promotorů, které jsou rozpoznány celou řadou různých potenciálních hostitelských buněk. Tyto promotory jsou operativně navázány na DNA, kódující upravený GDNF, odstraněním promotoru ze zdroje DNA restrikční enzymatickou digerací a zavedením sekvence požadovaného promotoru do vektoru. Nativní GDNF promotorové sekvence může být použita pro řízeni amplifikace a/nebo exprese upravené GDNF DNA. Výhodným promotorem je heterologický promotor, ale pouze v případě, že umožňuje větší přepis a vyšší. výtěžek exprimovaného proteinu v porovnáni s nativním promotorem a pokud je slučitelný s hostitelským buněčným systémem, který byl pro tyto účely zvolen.

Vhodnými promotory pro prokaryotické hostitele jsou například beta-laktamázy a laktózový promotorový systém; alkalinfosfatázový a tryptofanový (trp) promotorový systém;

01-3029-97 Če • · 9 ·9 9 • 9 · ·· · ·9 • · · 9·

Ml |Ml 9«·· a hybridní promotory, například tac promotor. Rovněž jsou vhodné další známé bakteriální promotory. Jejich nukleotidové sekvence byly již publikovány, což umožnilo odborníkovi v daném oboru ligovat je do po žadované DNA sekvence (sekvencí) za použití spojovníků nebo adaptérů, které jsou potřebné pro dodání všech požadovaných * restrikčních míst.

♦ Vhodné promotorové sekvence pro kvasinkové hostitele jsou v oboru rovněž známy. Kvasinkové zesilovače jsou zvláště výhodně používány spolu s kvasinkovými promotory. Vhodné promotory pro savčí hostitelské buňky jsou již známy a zahrnují promotory získané z genomů virů, například viru polyoma, viru fowlpox, adenoviru (například adenoviru 2), viru bovinního papilomu, viru ptačího sarkomu, cytomegaloviru, retroviru, viru hepatitidy B a nej. výhodně ji opičího viru 40 (SV40). Další vhodné savčí promotory zahrnují heterologické savčí promotory, například promotory tepelného šoku a aktinové promotory. V současné době se při výrobě GDNF proteinů v CHO buňkách používá jako promotor SRa. Viz Takebe a kol., Mol. Cell. Biol. 8(1): 466-472 (1988). Vhodným expresním vektorem je pDSRa2, který bude popsán níže.

Zesilovací prvek

Sekvence zesilovače může být do vektoru vložena pomocí vyšších eukaryot s cílem posílit transkripci DNA sekvence, kódující upravený GDNF protein podle vynálezu. Zesilovači jsou cis-působící prvky DNA, jejichž délka dosahuje zpravidla přibližně 10 až 300 bp, a které působí na promotor tak, že zvyšují jeho transkripci. Zesilovače mají

01-3029-97 Če

relativní orientaci a poziční nezávislost. Nachází se na 5' a 3' konci vzhledem k transkripční jednotce. Je známo několik sekvencí zesilovače poskytovaných savčími geny (např. globin, elastáza, albumin, alfa-feto-protein a inzulín). Nicméně zpravidla se použije zesilovač z viru. Zesilovač SV40, zesilovač cytomegalovirového raného promotoru, polyomový zesilovač a adenovirové zesilovače jsou příkladnými zesilovacími prvky pro aktivaci eukaryotických promotorů. Zatímco zesilovač lze rozdělit do vektoru v poloze 5' a 3' k upravené GDNF DNA, nachází se zpravidla v místě 5' od promotoru.

Transkripční terminace

Expresní vektory použité v eukaryotických hostitelských buňkách (kvasinkových, fungicidních, hmyzích, rostlinných, zvířecích, lidských, nebo nukleovaných buňkách z dalších multicelulárních organizmů) budou rovněž obsahovat sekvence nezbytné pro ukončení transkripce a pro stabilizaci mRNA. Tyto sekvence jsou běžně dostupné z 5' konce a příležitostně z 3' nepřeneseného úseku eukaryotických DNA nebo cDNA. Tyto úseky obsahují nukleotidové segmenty přepsané jako polyadenylátované fragmenty v nepřenesené oblasti mRNA, kódující upravený GDNF.

Konstrukce vhodných vektorů, obsahujících alespoň jednu z výše uvedených složek společně s požadovaným upraveným GDNF proteinem, kódujícím sekvenci, se provádí standardními ligačními technikami. Izolované plasmidy nebo DNA fragmenty se rozštěpí, upraví a religují v požadovaném pořadí pro generování požadovaných plasmidů. Pro potvrzení • · 9

9« 9 9

01-3029-97 Ce • ··9

9·9

9· «

toho, že byly zkonstruovány správné sekvence, se mohou pro transformaci E. coli použit ligační směsi a úspěšné transformanty lze vybrat pomocí známých technik, například pomocí výše popsané ampicilínové nebo tetracyklinové rezistence. Potom se z transformantů připraví plasmidy, které se analyzují restrikční endonukleázovou digescí a/nebo se sekvencují za účelem potvrzení přítomnosti požadovaného konstruktu.

Rovněž lze použít vektory, které poskytují přechodnou expresi DNA, kódující upravený GDNF protein v savčích buňkách. Přechodná exprese zpravidla zahrnuje použití expresního vektoru, který je schopen účinně replikovat v hostitelské buňce tak, že hostitelská buňka akumuluje mnoho kopii expresního vektoru a ten zase syntetizuje vysoké hladiny požadovaného proteinu kódovaného zmíněným .expresním vektorem. Přechodné expresní systémy, které obsahují vhodný expresní vektor a hostitelskou buňku, umožňují běžnou pozitivní identifikaci proteinů, kódovaných klonovanými. DNA, a rovněž rychlé prohledávání požadovaných biologických nebo fyziologických vlastností těchto proteinů. Přechodné expresní systémy jsou tedy použitelné zejména při identifikaci variant sledovaného proteinu.

Selekce a transformace hostitelských buněk

Vynález rovněž poskytuje hostitelské buňky (např. bakteriální, savčí, hmyzí, kvasinkové nebo rostlinné buňky) transformované nukleokyselinovými sekvencemi, použitelné při expresi rekombinantního upraveného GDNF proteinu. Transformovaná hostitelská buňka je kultivována za vhodných podmínek, které umožňují expresi nukleokyselinové sekvence.

01-3029-97 Če

Selekce vhodných hostitelských buněk a způsobů transformace, kultivace, amplifikace, prohledávání a produkce produktu a purifikace jsou v daném oboru známy. Viz například Gething a Sambrook, Nátuře 293: 620-625 (1981) nebo alternativně Kaufman a kol., Mol. Cell. Biol., 5 (7): 1750-1759 (1985) nebo Howley a kol., patent US 4,419,446. Upravený GDNF protein může být expřimován v E. coli, jak popisuje Lin a kol., (patentová přihláška US 07/855,413; patent PCT/US92/07888; WO 93/06116). Línova studie zahrnuje expresi zralého GDNF. Další příkladné materiály a metody budou podrobněji diskutovány níže. Transformovaná hostitelská buňka se kultivuje· ve vhodném médiu a exprimovaný faktor se následně případně izoluje, a purifikuje z kultivačního média (nebo z buňky, pokud exprimoval intracelulárně) pomocí vhodných prostředků, které jsou v daném oboru známé.

Vhodnými hostitelskými buňkami pro klonování nebo exprimování vektorů v rámci vynálezu jsou prokaryotické, kvasinkové, nebo vyšší eukaryotické buňky, které bylý popsány výše. Prokaryotické hostitelské buňky zahrnují neomezujícím způsobem eubakterii, například gram-negativní nebo gram-pozitivní organizmy, například E. coli, zejména druhy B. subtilis, Pseudomonas, například P. aeruginosa, Salmonella typhimurium nebo Serratia marcescans. Alternativně jsou vhodné in vitro metody klonování, např. PCR nebo další nukleokyselinové polymerázové reakce.

Kromě prokaryotických hostitelských buněk mohou být vhodnými hostiteli pro expresi upravených GDNF proteinů eukaryotičtí mikrobi, nitkovité houby nebo kvasinky. Z nižších eukaryotických hostitelských mikroorganizmů se nej Častěji používá Saccharomyces cerevisiae, neboli běžné

01-3029-97 Če pekařské kvasnice, ale rovněž je známa a běžně dostupná celá řada dalších generací druhů a kmenů.

Vhodnými hostitelskými buňkami pro expresi glykosylátovaného upraveného GDNF proteinu jsou buňky, odvozené z vícebuněčných organizmů. Tyto hostitelské buňky jsou schopny komplexního zpracování a glykosylačních aktivit. V podstatě lze použít libovolnou vyšší eukaryotickou buněčnou kulturu, pokud tato kultura zahrnuje buňky obratlovců a bezobratlých včetně rostlinných a hmyzích buněk. Zpravidla se používají buňky obratlovců, protože propagace buněk obratlovců v kultuře (tkáňové kultuře) je známou metodou. Příklady použitelných savčích hostitelských buněčných linií zahrnují neomezujícím způsobem CV1 buněčnou linii opičí ledviny transformovanou pomocí -SV40 (COS—7), humánní

293 buňky nakloňované pro ledvinové buňky nedospělého embryonální .linie růst v suspenzní křečka a buňky (293 nebo kultuře), vaječníku čínského křečka. Další vhodné savčí buněčné linie zahrnují neomezujícím způsobem HeLa, myší L-929 buňky, 3T3 linie odvozené ze Švýcarských, Balb-c nebo NIH myší, BHK nebo HaK křečci buňky.

Pro účely vynálezu jsou v podstatě stejně vhodnými hostitelskými buňkami bakteriální buňky. V oblasti biotechnologie jsou dobře známými hostitelskými buňkami například různé kmeny E. coli (například HB101, DH5a, DH10 a MC1Ó61). Rovněž lze použít různé kmeny Streptomyces spp. V ’ současnosti jsou výhodnými hostitelskými buňkami pro produkci upravených GDNF proteinů bakteriální buňky (například Escherichia coli) a savčí buňky (například buňky vaječníku čínského křečka, COS buňky atd.).

01-3029-97 Če	β · * ♦ » • · ·· · · • · · · · · · • * · · · · a· ·· «··*···	• · ’·· • ··· · · * · · «· · ·
	58
Hostitelské	buňky jsou	transfektovány	a výhodně
transformovány	výše popsanou	expresí nebo	klonovacími

vektory a kultivovány v běžném živném prostředí. Médium může být modifikováno podle potřeby tak, aby bylo vhodné pro indukováni promotoru, selekci transformantů nebo amplifikaci genů, kódujících požadované sekvence. Transfekce a transformace se provádí za použití standardních technik, které jsou odborníkům v daném oboru známy a které se zvolí tak, aby byly vhodné pro zvolené hostitelské buňky. Pro savčí buňky bez buněčných stěn lze například použít metodu srážení fosforečnanu vápenatého. Rovněž lze použít elektroporaci, mikroinjektáž a další známé techniky.

Kultivace hostitelských buněk

Transformované buňky, použité pro produkci upravených GDNF proteinů podle vynálezu, se pěstují ve vhodném prostředí. Toto prostředí může být obohaceno, pokud je to nezbytné, hormony a/nebo dalšími růstovými faktory (například inzulínem, transferinem nebo epidermálním růstovým faktorem), solemi (například chloridem sodným, solemi vápníku, solemi hořčíku a fosforečnanem), pufry (například HEPES), nukleosidy (například adenosin a thymídin), antibiotiky (například gentamicinem), stopovými prvky (definovanými jako anorganické sloučeniny, které jsou zpravidla přítomné v konečných mikromolárních koncentracích) a glukózou nebo jiným energetickým zdrojem. Rovněž je zřejmé, že kultivační médium může obsahovat další doplňky, které budou v médiu obsaženy ve vhodných koncentracích. Vhodné kultivační podmínky, použitelné při

		4 · 4 · ♦ 4 4 4 4	4 4 4 44
01-3029-97	Če	4 4 4 4 4 4 4 4 4	• 4 444 4 * 4 4 4 4
		4 4 4 4 ·	*11·· 44 44
		59
kultivaci	zvolených	hostitelských buněk,	jako například

teplota, pH hodnota apod., jsou odborníkům v daném oboru známy.

Upravené GDNF proteiny lze rovněž připravovat homologickou rekombinací nebo rekombinantní produkční metodou za použití řídicích prvků zavedených do buněk, které již obsahují DNA kódující GDNF. Homologická rekombinace je technika původně vyvinutá pro cílové geny, jejímž úkolem je indukovat nebo opravovat mutace v transkripčně aktivovaných genech (Kucherlapati, Prog. in Nud. Acid Res. and Mol. Biol. 36:301 (1989)). Základní technika byla vyvinuta jako způsob zavádění specifických mutací do specifických oblastí savčího genomu (Thomas a kol., Cell. 44:419-428, 1986; Thomas a Capecchí, Cell. 51:503-512, 1987; Doetschman a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. 85:8583-8587, 1988) nebo pro opravu specifických mutací v defektních genech (Doetschman a kol., Nátuře, 330:576-578, 1987). Příkladné homologické rekombinantní techniky popisuje patent US 5,272,071 (EP 91 90 3051, EP publikace č. 505 500; PCT/US90/07642 a mezinárodní publikace č. WO 91/09955).

Pomocí homologické rekombinace může být DNA sekvence, která má být vložena do genomu, nasměrována do specifického úseku sledovaného genu jejím navázáním na cílovou DNA. Cílovou DNA je DNA> která je komplementární (homologická) s úsekem genomové DNA. Malé části cílové DNA, které jsou komplementární s konkrétním úsekem genomu, se uvedou v průběhu replikačního procesu DNA do kontaktu s parentálním řetězcem. Obecnou vlastností DNA, která byla zavedena do buňky, je hybridizovat a tedy rekombinovat se s dalšími částmi endogenní DNA přes sdílené homologické úseky. Pokud

01-3029-97 Če • ···· * · ·♦ · •· *· • Β · * Β

Β · ·· ·· · Β· se tento komplementární řetězec naváže na oligonukleotid, který obsahuje mutaci nebo odlišnou sekvenci DNA, rovněž se zabuduje do nově syntetizovaného řetězce jako výsledek rekombinace. Díky funkci korektury může nová sekvence DNA sloužit jako matrice. Transferovaná DNA je tedy zabudována do genomu.

Pokud je sekvence příslušného genu známá, například nukleokyselinová sekvence GDNF, potom lze pre-pro sekvenci nebo expresní kontrolní sekvenci, což je část DNA která je komplementární ke zvolenému úseku genu, syntetizovat nebo jinak získat, například vhodnou restrikcí, nativní DNA na specifických rozlišovacích místech vážících sledovaný úsek. Tato část slouží jako cílová sekvence po vložení do buňky, která se bude hybridizovat na homologický úsek uvnitř

genomu. Pokud tato hybridizace proběhne v průběhu replikace, potom bude tato část

DNA a libovolná další sekvence navázaná na tuto část působit jako Okazakův fragment a bude zpětně zavedena do nově syntetizovaného řetězce DNA.

Podle vynálezu jsou úseky, které jsou navázány na tyto druhy cílové DNA úseky DNA, které mohou ovlivňovat expresi GDNF proteinu. Prvek promotor/zesilovač, supresor nebo exogenní transkripční modulační prvek se zavedou do genomu příslušné hostitelské buňky v místě, které se nachází v blízkosti DNA, kódující požadovaný upravený GDNF a s takovou orientací, aby mohly ovlivnit transkripci DNA, kódující požadovaný upravený GDNF. Kontrolní prvek nekóduje upravený GDNF ale řídí část DNA přítomné v genomu hostitelské buňky. Takže exprese upravených GDNF proteinů lze dosáhnout nikoliv samotnou transfekcí DNA, která kóduje upravený GDNF, ale spíše použitím cílové DNA (obsahující

· ♦·

4fl 4 · ·

01-3029-97 Ce *

• 4444

4« · úseky homologické se sledovaným endogenním genem) sloučené s DNA regulačními segmenty, které poskytují endogenní genové sekvenci rozlišitelné .signály pro transkripci upraveného GDNF proteinu.

Homologické rekombinantní metody lze podle vynálezu rovněž použít pro modifikaci buňky, která za normálních podmínek obsahuje transkripčně tichý GDNF gen, přičemž tato modifikace bude produkovat buňku, exprimující GDNF. GDNF protein může být následně zpracován tak, aby poskytl upravený GDNF protein (proteiny).

Upravené GDNF farmaceutické kompozice

Upravené GDNF proteinové farmaceutické kompozice zpravidla zahrnují terapeuticky účinné množství upraveného GDNF proteinového produktu ve směsi s nejméně jedním farmaceuticky a fyziologicky přijatelným formulačním materiálem. Vhodné formulační materiály zahrnují neomezeným způsobem antioxidanty, konzervační látky, barviva, ochucovadla a ředící činidla, emulgační činidla, suspendační činidla, rozpouštědla, plniva, látky zvětšující objem, pufry, dopravní vehikula, ředidla, masťové základy a/nebo farmaceutické adjuvansy. Vhodným vehikulem může být například voda pro injektování, fyziologický solný roztok nebo syntetický mozkomíšní mok (CSF) případně obohacený dalšími materiály, běžnými pro kompozice' určené pro parenterální podání. Dalšími příkladnými vehikuly jsou neutrální pufrovaný fyziologický roztok nebo fyziologický roztok smísený se sérovým albuminem.

01-3029-97 Če ···· ♦ · · · ··· • · e *· • · ·4 «4··

Hlavni rozpouštědlo ve vehikulu může mít vodnou nebo bezvodou povahu. Kromě toho může vehikulum obsahovat další farmaceuticky přijatelné masťové základy, které' budou modifikovat nebo udržovat pH hodnotu, osmolaritu, viskozitu, čirost, barvu, sterilitu, stabilitu, rychlost rozpouštění nebo vůni uvedené formulace. Vehikulum může ještě dále obsahovat ještě další farmaceuticky přijatelné masťové základy, které budou modifikovat nebo udržovat stabilitu, rychlost rozpouštěni nebo rychlost uvolňování upraveného GDNF proteinového produktu nebo podporovat absorbci nebo penetraci proteinového produktu přes hematoCerebrální bariéru. Těmito masťovými základy jsou látky, které se obvykle zpravidla používají při formulacích dávek pro parenterální podání buď v jednotkové dávce nebo vícedávkové formě nebo pro přímou infuzi do CSF kontinuální nebo periodickou infuzi implantované pumpy.

Potom, co je terapeutická kompozice zformulována, se může skladovat ve sterilních láhvích jako roztok, suspenze, gel, emulze, pevná látka nebo dehydratovaný nebo lyofilizovaný prášek. Tyto formulace mohou být skladovány buď v instantní formě nebo například v lyofilizované formě, která vyžaduje před podáním rekonstituci.

Optimální farmaceutickou formulaci zvolí odborník v daném oboru na základě způsobu podání a požadované dávky. Viz například Remington's Pharmaceutical Sciences,

18. vydání (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), str. 1435-1712. Kompozice může rovněž zahrnovat částicové přípravky polymerních sloučenin kyseliny póly(2hydroxypropanové), kyseliny polyglykolové nebo může být součástí liposomu. Rovněž lze použít kyselinu hylauronovou, která podporuje dlouhodobé přetrvávání v oběhu. Tyto *

01-3029-97 Ce • · kompozice mohou mít vliv na fyzikální stav, stabilitu, rychlost in vivo uvolňování a rychlost in vivo clearance přítomných proteinů a derivátů podle vynálezu.

Dalšími vhodnými účinnými aplikačními formami jsou například parenterální pozvolna se uvolňující formulace, inhalační spreje, orálně aktivní formulace nebo čípky. Současné upravené GDNF proteinové farmaceutické kompozice jsou formulovány pro parenterální podání, například intracerebroventrikulární injektování. Tyto parenterálně podané terapeutické kompozice mají zpravidla formu pyrogenu prostého parenterálně přijatelného vodného roztoku obsahujícího upravený GDNF proteinový produkt ve farmaceuticky přijatelném vehikulu. Výhodným vehikulem je fyziologický solný roztok.

Rovněž lze vzít v úvahu, že určité formulace obsahující upravený GDNF proteinový produkt mají být podány orálně. Upravený GDNF proteinový produkt, který se podává tímto způsobem, může být zapouzdřen a případně může být formulován s nosiči, které se obvykle používají při přípravě pevných látkových forem. Kapsle může být navržena tak, aby uvolňovala aktivní složku formulace v trávicím traktu, kde je její biologická dostupnost maximální a pre systemická degradace minimální. Formulace může zahrnovat další masťové základy, které usnadní absorpci upraveného GDNF proteinového produktu. Rovněž mohou být použita ředidla, ochucovadla, vosky s nízkou teplotou tání, rostlinné oleje, maziva, suspendační činidla, tablety, dezintegrující činidla a pojivá.

♦ · v

01-3,029-97 Če * · • · ·· • ··· | · · <· • ♦···

Podání upraveného GDNF proteinového produktu

Upravený GDNF proteinový produkt lze podat parenterálně subkutánni, intramuskulární, intravenózni, transpulmonální transdermální intratekální nebo intracerebrálni cestou. Proteinové růstové faktory, které neprojdou hematocerebrálni bariérou mohou být aplikovány přímo intracerebrálně nebo jiným způsobem společně s dalšími prvky, které je přepraví přes zmíněnou bariéru. Je výhodné, pokud se upravený GDNF proteinový produkt podá intracelebroventrikulárně nebo do mozkového nebo míšního subarachnoidálního prostoru. Upravený GDNF proteinový produkt lze rovněž podávat intracerebrálně přímo do mozkového panenchymu. Pozvolna se uvolňující implantáty v mozku, které obsahují neurotrofní faktor zapouzdřený v biologicky degradovatelné polymerní matrici, mohou rovněž dopravovat upravený GDNF proteinový produkt. Upravený GDNF proteinový produkt může být podán extracerebrálně v chemicky modifikované formě nebo obalený tak, aby prošel hematocelebrální bariérou nebo může být podán společně s alespoň jedním činidlem, které podpoří penetraci upraveného GDNF proteinového produktu touto bariérou. Ukázalo se například, že konjugát NGF a monoklonálních protilátek antitransferinového receptoru dopraví tento proteinový produkt do mozku pomocí navázání na transferinové receptory. Pro dosaženi dávky upraveného GDNF proteinového produktu lze použít opakované denní nebo méně časté injekce nebo lze upravený GDNF proteinový produkt podávat formou kontinuální nebo periodické infuze z implantované pumpy s konstantním nebo programovatelným prouděním. Frekvence dávek bude záviset na farmakokinetických parametrech

01-3029-97 Če formulovaného upraveného GDNF proteinového produktu a způsobu jeho podání.

Bez ohledu na způsob podání se specifická dávka zpravidla vypočte na základě tělesné hmotnosti nebo povrchové plochy těla jedince, kterému má být aplikována. V případě mozkových chorob se specifická dávka zpravidla vypočte na základě přibližné hmotnosti mozku pacienta, kterou lze stanovit na základě tělesné hmotnosti nebo plochy povrchu těla pacienta. Další upřesnění výpočtu, nezbytné pro stanovení vhodné dávky výše zmíněných formulací pro ošetření, je rutinní prací odborníka v daném oboru. Příslušné dávky lze určit za použití testů, které se používají pro stanovení dávek a ze získané závislosti dávka-odezva. Finální dávkový režim stanoví příslušný ošetřující lékař, který musí zvážit různé faktory ovlivňující působení účinných látek, například věk, celkový stav, tělesnou hmotnost, pohlaví a stravu pacienta, závažnost dané infekce, dobu podávání účinné látky a další klinické faktory.

Upravený GDNF proteinový produkt podle vynálezu může být rovněž použit samotný nebo v kombinaci s dalšími růstovými faktory při léčení nervových chorob. Upravený

GDNF proteinový produkt lze například použít, při léčení určitých forem nervových chorob, v kombinaci s nervovým růstovým faktorem. Dále lze upravený GDNF proteinový produkt použít společně s dalšími faktory nebo dalšími molekulami včetně chemických kompozic. Při léčení Parkinsonovy choroby se upravený GDNF proteinový produkt může použít samotný nebo v kombinaci s podáním levodopa, přičemž upravený GDNF by měl zvyšovat produkci endogenního ·

01-3029-97 Če dopaminu a neuronální spotřebu zvýšené koncentrace dopaminu.

Jak již bylo uvedeno výše, rovněž je třeba uvážit, že další neurotrofni neboli neurony zásobující faktory jsou nezbytné při léčení určitých neuronálních buněčných populací nebo určitých typů. Další faktory, které mohou být použity ve spojení s upraveným GDNF, zahrnují neomezujícím způsobem: mítogeny, například inzulín, inzulínu podobné růstové faktory, epidermální růstový faktor, vazoaktivní růstový faktor, polypeptid aktivující adenylátcyklázu podvěsku mozkového, interferon a somatostatin; neurotrofni faktory, jako například z mozku odvozený neurotrofni faktor, neurotrofin-3, neurotrofin-4/5, neurotrofin-6, inzulínu podobný růstový faktor, ciliární neurotrofni faktor, kyselinový a bazický fibroblastový růstový faktor, fibroblastový růstový faktor-5, transformační růstový faktor-β, kokain-amfetaminový regulovaný transkript (CART) a zralý GDNF; a další růstové faktory, například epidermální růstový faktor, faktor inhibující leukémii, interleukiny, interferony a kolonie stimulující faktory; a rovněž molekuly a materiály, které jsou funkčními ekvivalenty těchto faktorů.

Je zřejmé, že pro dané ošetření může být výhodné kontinuální podání nebo trvalá doprava upraveného GDNF proteinového produktu. Zatímco kontinuální podání lze realizovat pomocí mechanických prostředků, například infuzní pumpy, je zřejmé, že lze praktikovat i další způsoby kontinuálního nebo v podstatě kontinuálního podání. Například chemickou derivatizací se může dosáhnou trvale se uvolňujících forem, které umožňují kontinuální přítomnost předem stanoveného množství účinné látky v krevním řečišti.

01-3029-97 Če · {Γγ · /* ’··:: ϊ 4« 99 999 9·99 ·· ·· daného předem stanoveným dávkovým režimem. Upravené GDNF proteinové produkty tedy zahrnují upravený GDNF protein, efektivně derivatizovaný pro kontinuální podání.

Do rozsahu vynálezu rovněž spadá terapie, zahrnující například intracerebrální implantaci buněk, produkující upravený GDNF protein. Toto provedení vynálezu zahrnuje implantování buněk, které jsou schopny syntetizovat nebo sekretovat biologicky aktivní formu upraveného GDNF proteinu do těla pacientů. Těmito buňkami produkujícími upravený GDNF protein mohou být buňky, které normálně neprodukují neurotrofní faktor, ale které byly modifikovány tak, aby produkovaly upravený GDNF nebo buňky, jejichž schopnost produkovat GDNF protein byla rozvinuta transformací polynukleotidem, vhodným pro expresi a sekreci upraveného GDNF proteinu. Aby se minimalizovala potenciální imunologická reakce u pacientů, způsobená podáním GDNF proteinů cizích druhů, je výhodné pro produkci upraveného humánního GDNF proteinu použít buňky lidského původu.

Zapouzdřením implantovaných buněk se vyloučí infiltrace buněk do mozkové tkáně. Humánní nebo nehumánní zvířecí buňky mohou být implantovány do těl pacientů v biologicky slučitelném polopropustném polymerním obalu nebo membráně, která umožní uvolnění upraveného GDNF produktu ale která zabrání destrukci buněk imunitním systémem pacienta nebo jinými škodlivými faktory okolní tkáně. Alternativně by bylo možné implantovat do těla pacienta přímo pacientovy vlastní buňky transformované ex vivo tak, aby produkovaly upravený GDNF protein, přičemž tyto buňky lze implantovat bez jakéhokoliv zapouzdření.

01-3029-97 Če

Metodologie pro membránové zapouzdření živých buněk je odborníkům v daném oboru známa a příprava zapouzdření buněk a jejich implantace do těl pacientů je popsána například v patentu US 4,892,538; 5,011,472; a 5,106,627. Systém pro zapouzdřování živých buněk rovněž popisuje PCT přihláška WO 91/10425 od Aebischera a kol., viz také PCT přihláška WO 91/10470 od Aebischera a kol.; Winn a kol., Exper. Neurol., 113:322-329, 1991; Aebischer a kol., Exper. Neurol., 111:269-275, 1991; Tresco a kol., ASAIO, 38:17-23, 1992.

Při terapii in vivo upraveným GDNF proteinovým genem se nukleokyselinová sekvence, kódující GDNF protein, zavádí přímo do těla pacienta. Nukleokyselinová sekvence, kódující upravený GDNF protein, se například zavádí do cílových buněk lokální injektáží nukleokyselinového konstruktu, případně spolu s vhodným dopravním vektorem, například s adenoasociovaným vektorem. Alternativní virové vektory zahrnují neomezujícím způsobem vektory retroviru, adenoviru, viru herpes simplex

Fyzického přenosu lze dosáhnout in a papilomového viru.

vivo místní injektáží požadovaného nukleokyselinového vhodného dopravního vektoru sekvenci, konstruktu nebo jiného nukleokyselinovou transferu, přímé obsahujícího liposomem požadovanou mediátovaného inj ektáže (holé DNA), receptorem mediovaného transferu (komplex ligand-DNA) bombardováním mikročásticemi (genová pistole).

Je třeba zmínit, že zde popsané upravené nebo

GDNF proteinové formulace mohou být použity pro veterinární a rovněž humánní aplikace a že výraz „pacient by neměl mít omezující význam. V případě veterinární aplikace by mělo být dávkové rozmezí stejné jako ve výše popsaném případě.

• 9 *

01-3029-97 Če «

• 9 99 9 • ·φ •··

Μ· ·Φ

Jako prostředky dále charakterizující upravené GDNF proteiny podle vynálezu mohou být vyvinuty protilátky, které váží upravený GDNF protein podle vynálezu, například epitopeny v X- [Cys⁴¹-Cys¹³³] -Y aminokyselinové sekvenci. Odborník v daném oboru může použít známé publikované postupy pro získání monoklonálních a polyklonálních antibiotik nebo rekombinantních antibiotik, které specificky rozpoznávají a váží různé proteiny kódované aminokyselinovými sekvencemi podle vynálezu. Tato antibiotika lze následně použít pro purifikaci a charakterizaci upraveného GDNF proteinu. Alternativně lze protilátky použít jako terapeutické inhibitory proteinů, proti kterým jsou směrovány.

Další znaky a výhody vynálezu se stanou zřejmějšími po prostudování následujících ilustrativních příkladů. Příklad 1 je adresován expresi zralého GDNF savčího buněčného systému a přípravě upraveného GDNF proteinu. Příklad 2 je adresován expresi zralého GDNF v bakteriálním buněčném systému. Příklad 3 je adresován expresi různých upravených GDNF proteinů v bakteriálním buněčném systému. Příklad 4 porovnává biologickou aktivitu zralého GDNF proteinu a upraveného GDNF proteinu v testu dopaminergické neuronové neurotrofní aktivity.

Následující příklady jsou pouze ilustrativního charakteru a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

01-3029-97 Če

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Exprese zralého humánního GDNF v CHO buňkách a purifikace z CHO-odvozeného upraveného GDNF proteinu

Materiály

Následující materiály se použijí při expresi humánního GDNF v dihydrofolátreduktázu postrádajících CHO buňkách (CHOď buňky například popisuje Urlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 77(7): 4216-4220 (1980)).

CHOď médium obsahovalo: Dulbeccovo modifikované médium Eagle (DMEM) s vysokým obsahem glukózy (Gibco/BRLj; 5% fetální bovinní sérum (HyClone);. MEM nepodstatných aminokyselin (1%) (Gibco/BRL); hypoxanthin/thymidin (1%) (Gibco/BRL); a glutamin/penicilin/streptomycin (1%) (Irvin Scientific).

Selektivní médium obsahovalo: DMEM (vysoký obsah glukózy); 5% dialyzované fetální bovinní sérum (HyClone); MEM nepodstatné aminokyseliny; a glutamin/penicilin/streptomycin.

2X HEPES-pufrovaný fyziologický roztok (HBS) obsahoval: 280 mM NaCl; 10 mM KC1; 1,5 mM Na₂HPO₄; 12 mM dextrózy; a 50 mM HEPES.

Tris-pufrovaný fyziologický roztok plus Tween (TBST) obsahoval: 137 mM NaCl; 20 mM Tris/HCl pH 7,5; a 0,1% Tween-20.

• to · to

• to	• v	«« · «	♦ to	«
• ·	·«	to ·	« «		to ·
• ·	• · ♦	• «	9 ·· ·	•	•
• to	• ·	• «	•	•	«
		to · · · · to	• to		♦ to

01-3029-97 Če

Metody

Transfekce a selekce

CHOď buňky (průchod 20) se inokulovaly do 60mm misek pro kultivaci tkání (Falcon) při hustotě 8xl0⁵ buněk na misku v CHOd růstovém médiu. Následující den, přibližně tři hodiny před transfekcí, se médium na buňkách nahradilo čerstvým médiem.

Plasmidové konstrukty obsahující příslušnou GDNF cDNA se připravily za použití známých technik. Plasmidový konstrukt pDSRa2 se například připravil způsobem, který byl v podstatě shodný se způsobem popsaným v související patentové přihlášce US 501,904, podané 29. března 1990 (viz také Evropská patentová přihláška č. 90305433, publikovaná přihláška EP 398 753, podaná 18. května 1990 a WO/14363 (1990)). Příkladná plasmidová mapa, která ilustruje strukturní organizaci vektoru, je znázorněna na obrázku 2. Je zřejmé, že pro sestavení plasmidové mapy lze použít rovněž celou řadu různých nukleokyselinových sekvencí, kódujících zralý GDNF protein, například lze použít sekvence znázorněné na obrázcích 1, 3 a 4.

Hindlll- Xbal DNA fragment obsahující humánní GDNF, který kóduje sekvence a konvenční Kozákovy sekvence, CCACC(ATG), se izolovaly restrikční enzymatickou digerací z expresního vektoru na bázi pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) . DNA segment se přímo nakloňoval do HindlII/Xbal řezu pDSRct2. Výsledný plasmíd se označil pSW5. Plasmid DNA pSW5 se před transfekcí linearizoval v místě Puvl.

pDSRa2 (obrázek 2) je derivátem plasmidů pCD (Okayama & Berg, Mol. Cell Biol. 3: 280-289, 1983) se třemi hlavními

01-3029-97 Ce to · to · • · ·· modifikacemi: (i) SV40 polyadenylační signál se nahradil signálem z α-podjednotky bovinního folikulárního stimulačního hormonu, α-bFSH (Goodwin a kol., Nucleic Acids Res. 11: 6873-6882, 1983); (ii) myší dihydrofolátreduktázový minigen (Gasser a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. 79: 6522-6526, 1982) vložený-za expresní kazetu, který umožnil selekci a amplifikaci transformantů; a (iii) 267 bp fragment obsahující „R-prvek a část „U5 sekvencí dlouhé koncové repetice (LTR) viru humánní T-buněčné leukémie typu I(HTLV-I) se nakloňoval a vložil mezi SV40 promotor a již popsané sestřihové signály (Takebe a kol·., Mol. Cell Biol. 8: 466-472, 1988).

Připravily se roztoky DNA, které obsahovaly .konečnou koncentraci 3,0 p.g/misku GDNF-plasmidové DNA, 7,0 gg/misku genomové nosné DNA myších ledvin (Clontech), 25 μΐ/misku 2,5M CaCl₂ a sterilní destilovanou vodu do konečného obsahu 250 μΐ/misku. Podobným způsobem se připravily DNA roztoky obsahující pDSRa2 vektorovou DNA nebo samotnou nosnou DNA, jako pozitivní, resp. negativní kontrolní roztoky. DNA roztoky se přidaly po kapkách do shodného objemu 2X HEPESpufrovaného solného roztoku za současného probublávání roztoku vzduchem. DNA/HBS roztoky se inkubovaly 30 minut při pokojové teplotě.

Po odstranění média z CHOď buněčných kultur se do každé misky s kulturou přidalo 500 μΐ DNA roztoků. Misky se inkubovaly 30 minut'při pokojové teplotě. Po uplynuti této doby se do každé misky přidalo 5,0 ml CHOď média. Potom se misky inkubovaly přes noc při teplotě 37°C.

Následující den se médium nahradilo čerstvým CHOď médiem. Den potom, co buňky vytvořily spojitou vrstvu, se • · · • · ·· ··· · ♦

01-3029-97 Ce ♦ · *· » kultury trypsinizovaly a přeočkovaly do lOmm misek (Falcon) v poměru 1 x 60mm misky ku 8 x lOOmm miskám. Buňky se přemísťovaly v selektivním médiu. Kulturám se každé dva až tři dny dodávalo čerstvé médium.

Po patnácti dnech se kolonie transfektovaných buněk izolovaly za použití skleněných klonovacích válců, trypsinizovaly a přeočkovaly na 24jamkové plotny (Falcon). Z GDNF/pSW5-transfektovaných buněk se izolovalo celkem 40 kolonií. Zbývající buňky na plotnách se trypsinizovaly, spojily a přemístily do dvou lOOmm misek (jedno spojení pro každý DNA konstrukt).

Prohledávání transfektovaných buněk

24jamkové a spojené kultury se potom, co vytvořily spojitou vrstvu, zbavily růstového média a toto médium se nahradilo séra prostým médiem (400 μΐ/jamku nebo 4 ml/misku). Buňky se inkubovaly 48 hodin, načež se kondiciované médium sklidilo. GDNF proteinová exprese vzorků kondiciovaného média se analyzovala pomocí westernového blotu. Alíkvotní podíly kondiciovaného média (20 μΐ nebo 40 μΐ) se naředily elektroforézovým vzorkovým pufrem (s nebo bez β-merkaptoethanolu). Vzorky obsahující β-merkaptoethanol se tři minuty vařily (redukční podmínky). Jak redukované, tak neredukované vzorky se analyzovaly na 16% Tris-glycínových gelech- (Novex). Gely se elektroforeticky přenesly na nitrocelulózové filtry (Schleicher a Schuell BA-83, 0,2 μ). Gelové membrány se promyly TBST a následně inkubovaly třicet minut při pokojové teplotě v blokačním roztoku 5% sušeného mléka

01-3029-97 Če ♦ ·· ·««· (Carnation) v TBST. Membrány se následně ošetřovaly jednu hodinu při pokojové teplotě GDNF antisérem (králičí polyklonální antisérum působící proti z E. coli odvozenému GDNF; 1:1000 v 5% mléku v TBST). Membrány se následně promývaly 1 x 10 minut TBST a 2 x 5 minut 1% mlékem v TBST. Potom se ošetřovaly 20 minut anti~králiči, peroxidázou Igselského křenu konjugovanou (1:15 000 v 1% mléku v TBST).

sekundární protilátkou

Membrány se promývaly x 20 minut a 2 x 10 minut TBST a následně se jednu minutu ošetřovaly ECL reakčními činidly (Amersham) a exponovaly'na

Hyperfilm-ECL (Amersham).

Následující postup popisuje purifikaci CHOexprimovaného GDNF a CHO-derivovaného, sestřihem upraveného, GDNF homodimeru z jednoho litru kondiciovaného média. Vzhledem ke značné aktivitě proteázy v CHO médiu, která způsobuje sestřih řetězce na zbytku 31, může postup zahrnovat použití proteázového inhibitoru v průběhu purifikace.

Krok 1.

Kuličková chromatografie

Přidáním jedné padesátiny objemu 1 M MES, pH 6,0 se připravilo séra prosté kondiciované médium 20 mM 2-[Nmorfolino]ethansulfonát (MES), pH 6,0. Přidalo se dvacet pět mililitrů SP sepharózové pryskyřice Sepharose Big Bead (Pharmacia), uvedené do rovnovážného stavu pomocí 20 mM MES, pH 6,0, a míchalo se při 4°C jednu hodinu. Pryskyřice se nechala usadit a následně se izolovala oddekantováním kondiciovaného. média. Neusazená pryskyřice se získala • · · ’ « · ··

01-3029-97 Ce

přefiltrováním oddekantovaného média přes fritový kotoučový filtr. Usazená pryskyřice a pryskyřice následně izolovaná filtrací se resuspendovala a nalila do kolony o průměru

2,5 cm, promyla se třemi objemy kolony (dále jen CV) 0,15 M NaCl, 20 mM MES, pH 6,0 (pufr A). Protein se eluoval 300ml gradientem pufru A až 1,0 M NaCl, 20 mM MES, pH 6,0 (pufru B) při průtoku 0,2 obsahu kolony/minutu, přičemž absorbance se monitorovala při 280 nm. Sebraly se frakce obsahující 1,1 objemu kolony. Přítomnost GDNF ve frakcích se detekovala ' analýzou westernového přenosu. Frakce obsahující GDNF se sloučily pro další purifikaci. GDNF se eluoval mezi 0,3 a 0,6 M NaCl.

Krok 2.

HPLC C4 chromatografie

Sloučená frakce z kroku 1, která se připravila jako 0,1% (obj/obj) trifluorooctová kyselina (TFA), se vakuově přefiltrovala přes 0,45gm filtr a zavedla do kolony Vydac C4 (0,46 x 25cm) kondiciované 10% vodným roztokem acetonitrilu, 0,1% TFA (pufr A). Protein se 50 minut eluoval 2%/min lineárním gradientem (od pufru A do 90% vodného roztoku acetonitrilu, 0,1% TFA (pufru B) ), přičemž absorbance se monitorovala při 280 nm. Odebraly se lmm frakce, u kterých se zjišťovala přítomnost GDNF pomocí analýzy westernového blotu. GDNF se eluoval mezi 45% a 55% acetonitrilem. Frakce se vysušily ve vakuu.

*4 ·

4 44

4* 4

4 4 4 • 4 44

44 •4

44· ··· · · · ♦ · ··* ··· * · «» * »· ··

Krok 3.

Vysoce výkonná S chromatografie

Frakce obsahující GDNF z kroku 2 se znovu rozpustily v jednom mililitru 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0 a aplikovaly do 0,75 x 7,5 cm TSK-Gel 5WP vysoce výkonné S kolony (Toso Haas). Lineární gradient 0,4%/min běžel od 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0 (pufr A) do 1,0 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0 (pufr B) 50 minut při průtoku 1 ml/min. Odebraly se jednominutové frakce a absorbance se měřila při 280 nm. Při 35% B pufru se gradient změnil na 6,5%/min gradient, trvající 10 minut. Analýza westernového blotu na odebraných frakcích ukázala čtyři hlavní GDNF složky. Tři ze složek byly eluovány během 0,4%/min gradientu a čtvrtá se eluovala během 6,5%/min gradientu. Podobné složky se sloučily a použily pro sekvencování. Sekvencováním se identifikovaly přibližně 29 až 36 kD odebrané frakce jako [Arg³²-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein. Přibližně 38 až 40 kD složka se identifikovala jako [Arg³²-Ile¹³⁴] upravený GDNF/zralý GDNF heterodimer. Přibližně 41 až 44 kD složka, která se izolovala během druhé části gradientu, se identifikovala pomocí sekvencování jako zralý GDNF homodimer.

Příklad 2

Zralý humánní GDNF produkovaný E. coli

Bakteriální exprese zralého humánního GDNF lze dosáhnout pomocí způsobu popsaného Línem a kol. (patentová přihláška US 08/182,183, podaná 23. května. 1994 a její

01-3029-97 Če

0 '		•	•	0*0 0	0 0	•	V
0	•		• ·	0 0	• ·	0 0
•	•	•	• ·	0 0	• ·♦♦	0	•
0	•	0	•	0 0	•	•	•
··		• ·	«·· 0000	00	0 ·

mateřské přihlášky; PCT/US92/07888, podaná 17. záři 1992 (WO 93/06116); a Evropská patentová přihláška č. 92921022.7 (publikace č. EP 610 254). Odborníkovi v daném oboru je po prostudování předloženého vynálezu zřejmé, že pro expresi v E. coli nebo dalších bakteriích lze použít nebo přizpůsobit celou řadu různých materiálů a způsobů. V expresních procesech lze využít například střídající se polynukleotidy, zejména ty polynukleotidy, které jsou znázorněny na obrázcích 1, 3 a 4.

Opakované sbalení a purifikace zralého GDNF

Transformované buňky, se zpracovaly při 5°C (není-li. stanoveno jinak) následujícím způsobem: buněčná pasta (30 g) se suspendovala do konečného objemu 200 mililitrů za použití 25 mM Tris, pH 8,5 obsahujícího 5 mM EDTA, čímž se připravila finální 15% buněčná suspenze (hm/obj). Buňky se zcela dispergovaly za použití ručního nízkostřižného homogenizéru Biospec. Suspenze se dvakrát protáhla mikrofluidizérem při 100 MPa, čímž se buňky rozlomily a uvolnila se inkluzní těla. Výsledný homogenizát se následně odstřeďoval 30 minut při 16 000 x g. Peleta inkluznich těl z odstřeďování se promyla resuspenzí v ledové vodě do konečného objemu 240 mililitrů za použití homogenizéru Biospec, jako v předchozím případě za vzniku suspenze. Vzorek této suspenze se udržoval pro HPLC analýzu stupně GDNF exprese. Zbývající suspenze se odstřeďovala 30 minut při 16 000 x g. Supernatant se vypustil a malé množství studené vody se přidalo do odstředivé láhve a ta se mírně provířila za účelem odstranění volně vytvořené membránové vrstvy na vrcholu pelet inkluznich těl. Peleta se

01-3029-97 Če • · ·· • ·44 · · 99

9 9· ·* ··

♦ 4 · ·	4 4	*	4
4 4	4 ·		9 4
4 4	4 ♦··	4	4
4 4	4	4	4
«44 «4*4	4 4		4 4

resuspendovala pomoci homogenizéru Biospec za použití dostatečného objemu studené vody, čímž se získala koncentrace GDNF 2 mg/ml. Inkluzní těla se následně solubilizovala smísením konečné suspenze inkluzních těl (25 ml) a 8M guanidin HCI (25 ml) obsahující 180 mM cystein HCI a 50 mM Tris HCI, pH 8,7. Solubilizační směs se míchala při 25^eC 60 až 90 minut a po uplynutí této doby se nalila za stálého míchání do 2 M močoviny (450 ml, při 5°C), obsahující 20 mM Tris HCI, pH 8,75 a 0,2 M guanidin HCI. Tato znovu sbalená směs se pozvolna míchala 72 hodin při 5°C.

Znovu sbalený GDNF se částečně purifikoval následujícím způsobem: pufr, tvořený 20 mM octanem sodným (250 ml, pH 5), se při 5°C za intenzivního míchání přidal do znovu sbalené směsi a pH hodnota se nastavila na 5 přidáním ledové kyseliny octové. Výsledná sraženina se odstranila 45minutovým odstřeďováním při 13 600 x g a při 5°C. Supernatant, získaný tímto odstřeďováním, se použil jako zásobní roztok pro následný purifikační krok, který zahrnuje kationtovou iontoměničovou chromatografií pomocí SP-velkokuličkové pryskyřici (Pharmacia). Kolona pracovala při 5^eC a 20 mM octanu sodného (pH 5) se použilo pro uvedení do rovnovážného stavu, promývání a jako eluční pufrovací systém. Pryskyřicové lože (5 ml) se dezinfikovalo pěti objemy kolony (CV) 0,2N NaOH a následně uvedlo do rovnovážného stavu pomocí octanového pufru (5 CV) . Zásobní roztok (190- ml) se zavedl do kolony rychlostí 0,5 CV/minutu a následně se propláchnul 10 CV průplachem octanovým pufrem při stejném průtoku. GDNF se následně eluoval z pryskyřice 20 CV lineárním gradientem NaCl od 0,3 M do 0,9M v octanovém pufru při průtoku 0,1 CV/min. U eluátu z kolony

01-3029-97 Če	.......* · ?·.. • · ·· · · · ! . . ...... · · ··; i ; ·..··..· ...»
79
se monitorovala absorbance při frakce, které se analyzovaly obsahující GDNF se odebíraly od píku) k patě píku (10% výška	280 nm a sebral se jako pomocí SDS-PAGE. Frakce čela GDNF píku (10% výška píku). Protein v těchto

odebraných frakcích tvořil zcela GDNF, který v závislosti na použití produkčního kmene obsahoval 32% až 12% kontaminaci modifikovanými GDNF formami. Odebrané frakce se následně dialyzovaly proti PBS nebo dalšímu formulačnímu pufru a v některých případech se zahustily ultrafiltrací na 25 mg/ml. Jak standardní typ, tak analogické formy GDNF, purifikovaného tímto postupem se charakterizovaly HPLC s reverzní fází, kationtoměničovou HPLC, hmotovou spektrometrií a endotoxinovými hladinami, aby se porovnala Čistota přípravků v závislosti na odpovídajících produkčních kmenech.

Příklad 3

Rekombinantní produkce upraveného GDNF v E. coli

Příkladné upravené proteiny se produkovaly v podstatě způsobem/ který popisuje Lin a kol. (patentová přihláška US 08/182, 183, podaná 23. května 1994, viz výše). Rovněž, lze použít alternativní bakteriální expresní materiály a způsoby, které byly popsány výše. V E. coli exprimované upravené GDNF proteiny zahrnují [Pro²³-Ile¹³⁴], [Arg³²“Ile¹³⁴] a [Gly³³-Ile¹³⁴] upravené GDNF proteiny, které jsou znázorněny na obr. 5 a 6, resp. 7. Zkonstruovaly se polynukleotidy, kódující tyto exemplární upravené GDNF proteiny, které jsou znázorněny na obr. 5, 6 a 7, ale rovněž lze použít odpovídající polynukleotidy znázorněné na obrázcích 1, 3 a 4. Polynukleotidy se zkonstruovaly pomocí

01-3029-97 Če standardních PCR postupů, které jsou popsány v PCR Technology, Prínciples and Applications for DNA Amplification, Henry A., Erlich, ed., Stockton Press, NY, 1989 (kapitola 6, Using PCR to Engineer DNA).

Příklad 4

Biotest stanovující dopaminergickou Neuronovou neurotrofni aktivitu

U E. coli exprimovaných [Pro²³-Ile¹³⁴], [Arg³²-Ile¹³⁴], [gLY³³-Ile¹³⁴] a [Lys³⁷-Ile¹³⁴] upravených GDNF proteinů z příkladu 3 a CHO-odvozeného [Arg³²-Ile¹³⁴] upraveného GDNF proteinu z příkladu 1 se kvalitativně stanovovala jejich schopnost podporovat dopaminovou spotřebu dopaminergickými neurony černé hmoty.

Materiály

Při testu, který určoval přežití dopaminergických neuronů v přítomnosti- upravených GDNF proteinů se použily následující materiály:

Buněčné kultivační médium

Vysokoglukózové Dulbeccovo modifikované médium Eagle (DMEM; katalog #11965-092), Hamovo F 12 médium (F12; #11765-021), Leibovitzovo L15 médium bez hydrogenuhličitanu sodného (#41300-039), B27 médiový doplněk (#17504-010), penicilín a streptomycin (#15070-014), L-glutamin (#25030016), Dulbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (D-PBS; #14190-052), Hankův vyrovnávací solný roztok s

01-3029-97 Če

MIH • ’ * Φ ·· « · t ·· • · ·· ·· ·· * vápenatou a horečnatou solí (HBSS; #24020-026), kyselina N2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonovou (HEPES;

#15630-015), myši laminin (#23017-015) a albuminovou frakci V bovinniho séra (#110-18-017) dodala společnost GIBCO, Grand Island, NY. Tepelně inaktivované koňské sérum bylo od společnosti HyClone, Logan, Utah. Conalbumin (C—7786), poly-L-ornithin hydrobromid (P-3655), bovinní inzulín (1-5500), humánní transferin (T-2252), putrescin (P-6024), progesteron (P-6149), selenit sodný (S—9133) a metrizamid (M-3383) byly od společnosti Sigma Chemical company, SaintLouis, MO. Papain, deoxyribonukleáza I (DNAáza) a ovalbumin (Papain dissociation systém) byly od společnosti Worthington Biochemicals, Freehold, NJ.

Sterilní 96jamkové mikroplotny Falcon (#3072), umělohmotné pomůcky a polypropylenové kyvety odstředivky pro tkáňové kultury byly od společnosti Becton-Dickinson, Oxnard, CA. Skleněné zvony Nunc Lab-Tek pro tkáňovou kulturu (#136439) byly od společnosti Baxter, Irvine, CA; 20μπι (#4 60) nylonové síto bylo od společnosti Tetko, Elmsford, NY; a 4'' lékařské kleště a 4^f' lékařské nůžky byly od společnosti Roboz Surgical, Washington, DC.

Protilátky a příbuzná reakční činidla

Polyklonální králičí anti-tyrosinové hydroxylázové protilátky (TE101) od společnosti Eugene Těch, Ridgefield Park, NJ; polyklonální králičí anti-neuronal-specifické enolázové protilátky (NSE, AB951) byly od společnosti Chemicon, Temecula, CA; a biotinylátovaný kozí anti-králičí IgG a peroxidázou konjugovaný avidin/biotinový komplex (ABC

Φ ' · » φφφφ φ · · φ · • «Ο φ φφ *·

01-3029-97 Če

Φ Φ	• *	• ·
φ ·	Φ ΦΦ·	• Φ
φ ·	•	Φ ·
	·	• Φ

Elitě; Vectastain kit ΡΚ—6100) byly od společnosti Vector Laboratories, Burlingame, CA. 3',3'-diaminobenzidin byl od společnosti Cappel Laboratories, West Chester, PA. Blokační pufr Superblock v.PBS (#37515) byl od společnosti Chemical Company, Rockford, IL. Triton X-100 (X100), Nonidet P-40 (N6507) a peroxid vodíku (30%, obj/obj; H1009) byl od společnosti Sigma. GBR-12909 inhibitor dopaminové spotřeby (D-052) byl od společnosti RBI, Natick, MA. ³H-dopamin (tritiovaný dopamin, NE-131; 21 Ci/mmol) byl od společnosti New England Nuclear, Boston, MA. Scintilačni koktejl Optiphase Supermix byl od společnosti Wallac, Turku, Finland. Bílé ViewPlate-96 mikroplotny (#6005182) byly od společnosti Packard Instruments Corporation, Meriden, CT. Všechny další reakční činidla dodala, není-li stanoveno jinak, společnost Sigma Chemical Company.

Příprava média

Základní médium se připravilo jako 1:1 směs DMEM a média F12, která se obohatila B27 médiovým doplňkem, přidaným jako padesátinásobek koncentrovaného zásobního roztoku. L-glutamin se přidal při konečné koncentraci 2 mM, penicilín přibližně při 10 IU/1 a streptomycin přibližně při 100 mg/1. Konečná koncentrace přidaného tepelně inaktivovaného koňského séra byla přibližně 15%. Po smísení se pH hodnota nastavila přibližně na 7,3 a médium se udržovalo při 4°C. Médium se připravilo těsně před použitím, aby se minimalizovaly odchylky během experimentu. Absorpce proteinů se minimalizovala použitím umělohmotných pipet a nádob.

01-3029-97 Če *··· ·· · · · · · · ···· · * · · · · • · · * * · » · ·· ♦ · · a a « · a a·· o· a a «*···ι· a· · ·

Kultivační substrát

Za účelem podpoření optimálního přichycení neuronů substrátu a neuritový růst se povrchy mikrotitrační plotny (kultivační substrát) modifikovaly postupným potažením poly-L-ornithinem a lamininem. Povrchy plotny se zcela pokryly 0,1 mg/ml sterilního roztoku poly-L-ornithinu v 0,1 M kyseliny borité (pH 8,4), při pokojové teplotě, na dobu alespoň jedné hodiny a potom se promyly vodou Super-Q. Promývací voda se následně odsála a na povrchy plotny se přidal 1,0 gg/ml roztoku myšího lamininu v PBS a následovala dvouhodinová inkubace při 37°C. Aby se zajistila reprodukovatelnost výsledků, prováděly se tyto procedury bezprostředně před použitím ploten.

Příprava kultur černé hmoty embryonální krysy

Mozky embryonálních krys Sprague-Dawley se použily jako zdroj dopaminergických neuronů. Použily se 15 dní staré zárodky krys Sprague-Dawley. Pro každý příklad se použilo maximálně .36 emryí (přibližně 31). Gravidní krysy se usmrtily pomocí C0_2/ jejich abdominální dutiny se otevřely pomocí lékařských nůžek a plody se vyjmuly z dělohy. Mozky plodu se následně rozřezaly, zbavily krve a meningů a ventrální tegmentální plocha obsahující černou hmotu se rozřezala za použití známých anatomických zásad (Altman a Bayer, Atlas of Prenatal Rat Brain Development, CRC Press, Boča Raton, FL, 1995). Tkáně se ukládaly do ledově studeného D-PBS, převedly do 10 mililitrů disociačního média (120 jednotek papainu a 2 000 jednotek DNAázy v HBSS) a následně se inkubovaly 45 minut, přibližně při 37°c, na rotační platformové protřepávačce, přibližně

4

01-3029-97 Če při 200 ot./min. Buňky se následně dispergovaly triturací pomoci ohněm leštěných Pasteurových pipet, prosily přes 20pm síto Nitex, čímž se zbavily nedisociované tkáně a odstřeďovaly pět minut při 200 x g za použití IEC klinické odstředivky. Výsledné buněčné pelety se resuspendovaly do HBSS obsahujícího ovalbumin a přibližně 500 jednotek DNAázy, navrstvené na 4% ovalbuminovém roztoku (v HBSS),· a odstřeďovaly přibližně 10 minut při 500 x g. Finální pelety se resuspendovaly v kompletním kultivačním médiu (viz výše), zkorigovaly přibližně na 28 000 buněk/ml a naočkovaly v alikvotních podílech (90 μΐ) do 6mm jamek 96jamkových mikroploten, které byly předem potaženy polyornithinem a lamininem. Navázání buněk probíhalo rychle a povlak pokrýval přibližně 75 % povrchu.

Imunohistochemie dopaminergických neuronů

Mírně modifikovaná nepřímá imunoperoxidázová metoda, kterou popisuje Louis a kol. (J. Pharmacol. Exp. Therap., 262:1274-1283, 1992; Science, 259:689-692, 1993) se použila pro charakterizaci dopaminergických neuronů v kulturách černé hmoty. Kultury se přibližně 30 minut fixovaly při pokojové teplotě, 4% paraformaldehydem v D-PBS, pH 7,4 a následně třemi proplachy v D-PBS ( 200 μΐ na 6mm jamku). Fixované kultury se následně inkubovaly v blokačním pufru Superblock v PBS, obsahujícím 1% NP-40, čímž se zvýšila penetrace protilátek. Následně se ve stejném pufru aplikovaly primární králičí anti-tyrosinové hydroxylázové protilátky při naředění přibližně 1:2000 a inkubovaly se jednu hodinu při 37^eC na rotační protřepávačce. Po třech propláchnutích D-PBS se navázané protilátky detekovaly

01-3029-97 Če

pomocí kozího anti-králičího biotinylátovaného IgG, přibližně při naředění 1:500; tyto sekundární protilátky se inkubovaly buňkami při 37 °C přibližně jednu hodinu. Buňky se následně třikrát promyly D-PBS a sekundární protilátky se detekovaly pomocí avidin-biotinperoxidázového komplexu, naředěného na 1:500, a buňky se inkubovaly přibližně 45 minut při 37*C. Po dalších třech proplaších D-PBS kultury reagovaly 5 až 20 minut v 01 M Tris-HCl, pH 7,4, který obsahoval 0,04% 3',3'-diaminobenzidin-(HC1)4, 0,06 % NiCl₂ a 0,02 % peroxidu vodíku.

Hodnocení přežívání neuronů

Kultury černé hmoty se fixovaly a zpracovaly pro účely výše popsaného imunologického zabarvení a následně se analyzovaly pomocí průzračné optiky při 200násobném zvětšení. Ve všech 6mm 96jamkových mikroplotnách se spočetly neurony zabarvené tyrosinhydroxylázou. Životaschopné neurony byly charakterizovány jako neurony, které mají pravidelně tvarované buněčné tělo s hlavním axonem a několika dendrity. Neurony, které vykazovaly známky degenerace, například nepravidelná, vakuovaná perikara nebo ' fragmentované neurity, byly 'ze sčítání vyloučeny (nicméně většina degenerovaných neuronů se z kultivačního substrátu oddělila). Počet dopaminergických neuronových buněk se vyjádřil buď jako TH-pozitivní neurony/6mm jamku nebo jako změna sbalení, vztažená ke kontrolní hustotě dopaminergických neuronů.

44 b · · • · · • * · ·

01-3029-97 Če

Určení spotřeby dopaminu • · 4 · « · • 9 9· · • 4 44 · ·4 e · *· ♦ · 9 9 » *4··

Dopaminová černé hmoty 15 mikroplotnách ViewPlate-96. Kultury se promyly spotřeba se určovala na kulturách neuronů dní starých embryonálních krys v bílých předehřátým sorpčním pufrem (přibližně 100 μΐ), který modifikovaným Krebs-Ringerovým roztokem, pH 7,4 přibližně 120 mM NaCl, 4,7 mM KC1, MgSO₄, 32 mM NaHPO₄, 1,3 mM Sorpční pufr rovněž obsahoval je tvořen obsahujícím

1,8 mM CaCl₂, 1,2' mM

EDTA mM a 5,6 mM D-glukózy. kyseliny askorbové a μΜ pargylinu, které měly zabránit oxidaci dopaminu.

Buňky se následně přibližně 10 minut preinkubovaly při 37°C v sorpčním pufru. Do kultur černé hmoty se následně přidal tritiovaný dopamin (³H-DA, 21 Ci/mmol), přičemž jeho koncentrace představovala přibližně 50 nM v μΐ sorpčniho minut při 37°C. inkubací kultur pufru, a kultury se inkubovaly přibližně 60

Nespecifická dopaminová spotřeba se určila se sorpčním pufrem obsahujícím inhibitor dopaminové sorpce

GBR-12909 (1 μΜ). Nespecifická spotřeba představovala méně než přibližně jedno procento celkové spotřeby. Testy spotřeby se ukončily odsátím inkubačního média a následnými třemi rychlými proplachy ledově studeným sorpčním pufrem «I (přibližně 120 μΐ) . Buňky se následně lyžovaly přidáním scintilačního radioaktivita koktejlu Optiphase Supermix (200 μΐ) a se určila scintilační spektrometrií za 96jamkových mikroploten Wallac MicrobetaPlus použití čítače (tj. spotřeba dopaminu se analyzovala scintilačním sčítáním zadrženého tritia v kultuře). Výsledky se vyjádřily buď jako dpm/6mm jamku nebo jako změna sbalení vzhledem ke kontrolním kulturám.

01-3029-97 Če ···· * · · · · · • *4 · ♦ · 4 · Β · · · · • · · · · · · · · • 4 ·♦ ··« ···« |« ·«

Testy

Přežití dopaminergických neuronů· a morfologický vývoj

Kultury černé hmoty 15 dní starých (E15) embryonálních krys, obohacené o dopaminové neurony, se použily pro demonstraci vlivů upravených GDNF proteinů na přežití dopaminergických neuronů. Kultury se nechaly růst v polyornithinem a lamininem potažených 96jamkových mikroplotnách šest dní samotné nebo v přítomnosti různých koncentrací (rozmezí přibližně od 1 pg/ml přibližně do 10 ng/ml) následujících proteinů: v E. coli exprimovaného zralého hGDNF; v E. coli exprimovaného [Pro²³-Ile¹³⁴], [Arg³²-Ile¹³⁴], [Gly³³-Ile¹³⁴] a [Lys³⁷-Ile¹³⁴] upraveného GDNF proteinu; v CHO buňkách exprimovaného zralého hGDNF; a CHOodvozeného [Arg³²-Ile¹³⁴] upraveného GDNF proteinu. Kultivační médium, tvořené DMEM/F12, obohacené 15% tepelně inaktivovaným koňským sérem (kultury E15) nebo 2,5% tepelně inaktivovaným koňským sérem, D-glukózou, HEPES, inzulínem· a transferinem (kultury P6). Imunozabarvení tyrosinhydroxylázy (TH), dopaminovou syntézu omezující enzym, se použilo jako markér pro dopaminové neurony. Protože noradrenalinové neurony v rombencefalonu rovněž pozitivně barvi TH, je třeba velmi opatrně vyříznout pouze oblast ventrálního tegmentu mesencefalonu a vynechat kaudálnější oblasti, obsahující noradrenergická buněčná těla. Po šesti dnech byly kultury E15, zpravidla tvořené přibližně ze 70 % neurony (identifikováno výše popsaným neuronálně specifickým enolázovým imunozabarvením) a ze 30 % ne-neuronálními buňkami (které měly zploštělý, fázovětmavý vzhled); přičemž dopaminergické meurony představují přibližně 10 až 15 % neuronové populace.

Φ « « φ • * φφφ • φ φφφφ

01-3029-97 Če

φ φ φ · φφ φφ

Po šesti dnech se kultury fixovaly paraformaldehydem a imunologicky zabarvily pro tyrosinhydroxylázu, což je markér který identifikuje dopaminergické neurony v těchto kulturách. Všechny tyrosinhydroxylázověpozitivní neurony, přítomné v 6mm jamce, se sečetly pod průhlednou optikou. Tři až šest různých jamek se použilo pro analýzu jedné experimentální podmínky. Výsledky se vyjádřily jako procento počtu tyrosihydroxylázověpozitivních neuronů, které se nachází v kontrolních kulturách.

Kultury E15 černé hmoty, ošetřené 1,0 ng/ml GDNF, CHO buňkami exprimovaného GDNF nebo E. coli exprimovaným GDNF, obsahovaly přibližně o 38 %, resp. 27 % TH-imunoreaktivních neuronů více než neošetřené kontrolní kultury, což naznačuje, že oba GDNF druhy podporují přežití dopaminergických neuronů. Kultury E15 černé hmoty, ošetřené 1,0 ng/ml upraveného GDNF proteinu, vykazovaly podobné zvýšení počtu TH-pozitivních neuronů v kulturách po šesti dnech in vitro: 42 % v případě CHO-odvozeného [Arg³²-Ile¹³⁴] upraveného GDNF proteinu; a 26 %, resp. 17 % v případě E. coli exprimovaného [Arg³²-Ile¹³⁴] a [Gly³³-Ile¹³⁴] upraveného GDNF proteinu.

Srovnání kontrolních kultur a kultur ošetřených zralým a upraveným GDNF proteinem rovněž odhaluje zesílený účinek všech GDNF proteinů na morfologickou diferenciaci dopaminergických neuronů. Účinky [Arg³²-Ile¹³⁴] a [Gly³³Ile¹³⁴] upraveného GDNF proteinu byly identické s účinky jim odpovídajících zralých GDNF proteinových komplementárních dílů. TH-imunoreaktivní neurony ve všech kulturách ošetřených GDNF vykazovaly podstatně komplexnější a extenzivnější neuritickou arborizaci a rovněž vyšší stupeň · » · ♦·

01-3029-97 Ce • « · • ·· rozvětveni neuritů a celkově větší tělesnou velikost než TH-pozitivní neurony v kontrolních kulturách.

Dopaminová spotřeba

Dopaminová spotřeba měří počet a aktivitu vysoce afinitních dopaminové resorpčních transportních míst a odráží funkční diferenciaci dopaminergických neuronů. Dopaminová spotřeba se měřila na kulturách černé hmoty E15 krys po šesti dnech in vitro buď se zralým GDNF nebo upraveným GDNF proteinem nebo bez něho. U těchto kultur měla dopaminová spotřeba farmakologicky profilové vlastnosti dopaminových neuronů, tj. byla v podstatě blokována (více než z 98 %) 1,0 μΜ GBR-12909 inhibitorem dopaminového transportu specifickým pro dopaminergické neurony (ID50 = 20 nM) . To naznačuje, že míra dopaminové spotřeby neodráží přítomnost kontaminujících noradrenergických neuronů, které mohou spotřebovávat dopamin prostřednictvím norepinefrinových transportérů ale nejsou citlivé na GBR-12909 inhibici. Účinky CHO-buňkami exprimovaného zralého GDNF a CHO-odvozeného [Arg³²-Ile¹³⁴] upraveného GDNF proteinu byly identické přibližně 65% zvýšením při ED50, přibližně 20 pg/ml. E. coli exprimovaný [Pro²³-Lys³⁷AAsn³⁷-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein, znázorněný na obr. 5, vykazuje 65% zvýšení při ED50 přibližně 40 pg/ml. Účinky dopaminové spotřeby E. coli exprimovaného zralého proteinu a E. coli exprimovaného [Arg³²-Ile¹³⁴], [Gly³³-Ile¹³⁴] a [Lys³⁷-Ile¹³⁴] upraveného GDNF proteinu byly stejné: přibližně 50% zvýšení při ED50, přibližně 50 pg/ml.

Tyto výsledky naznačují, že upravené GDNF proteiny působí jako potenciální faktory, které podporují přežití s •

* · · • · · ·«

01-3029-97 Če indukující diferenciaci dopaminergických neuronů černé hmoty. Předpokládá se, že jako takové jsou použitelné při léčení Parkinsonovy choroby, neurologické nemoci charakteristické sníženou emoční bystrostí, zpomalující jak vůlí ovládaný tak vůlí neovladatelný svalový pohyb, a způsobující ztuhlost a třes. Tyto symptomy jsou znaky progresivní degenerace neuronů produkujících dopamin, které se nachází v černé hmotě. Degenerace těchto neuronů („dopaminergických neuronů) způsobuje zvýšení dopaminu v sousední oblasti mozku, označované jako žíhané tělisko.

I

01-3029-97 Če

Sekvenční protokol (1) údaje k SEQ ID N0:l:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 402 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 1..402 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:l:

TCA Ser 1

CCA GAT AAA CAA ATG

GCA GTG CTT CCT AGA AGA GAG CGG AAT CGG

48

Pro

Asp

Lys

Gin 5

Met

Ala

Val

Leu

Pro 10

Arg

Arg

Glu

Arg Asn Arg 15

CAG

GCT

GCA

GCT

GCC

AAC

CCA

GAG

AAT

TCC

AGA

GGA

AAA

GGT

CGG

AGA

96

Gin

Ala

Ala

Ala

Ala

Asn

Pro

Glu

Asn

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly Arg

Arg

20

25

30

GGC

CAG

AGG

GGC

AAA

AAC

CGG

GGT

TGT

GTC

TTA

ACT

GCA

ATA

CAT

TTA

144

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly Cys

Val

Leu

Thr

Ala

Ile

His

Leu

35

40

45

AAT

GTC

ACT

GAC

TTG-

GGT

CTG'

GGC

TAT GAA

ACC

AAG

GAG

GAA

CTG

ATT

192

Asn

Val

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Glu

Leu

Ile

50

55

60

TTT

AGG

TAC

TGC

AGC

GGC

TCT

TGC

GAT

GCA

GCT

GAG

ACA

ACG

TAC

GAC

240

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Ala

Glu

Thr

Thr

Tyr

Asp

65

70

75

80

01-3029-97 Ce

AAA Lys

ATA Ile

TTG Leu

AAA Lys

AAC Asn 85

TTA Leu

TCC Ser

AGA Arg

AAT Asn

AGA Arg' 90

AGG Arg

CTG Leu

GTG Val

AGT Ser

GAC Asp 95

AAA Lys

288

' GTA

GGG

CAG

GCA

TGT

TGC

AGA

CCC

ATC

GCC

TTT

GAT

GAT

GAC

CTG

TCG

336

Val

Gly

Gin

Ala

Cys

cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Asp

Asp

Leu

Ser

100

105

110

TTT

TTA

GAT

GAT

AAC

CTG

GTT

TAC

CAT

ATT

CTA

AGA

AAG

CAT

TCC

GCT

384

•

Phe

Leu

Asp

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

Ser

Ala

í

115

120

125

AAA

AGG

TGT

GGA

TGT

ATC

402

u

Lys

Arg

Cys

Gly

Cys

Ile

130

(1) údaje k SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 134 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

*

Ser

Pro

Asp

Lys

Gin

Met

Ala

Val

Leu

Pro

Arg

Arg

Glu

Arg

Asn

Arg

1

5

10

15

-

Gin

Ala

Ala

Ala

Ala

Asn

Pro

Glu

Asn

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly Arg Arg

r

20

25

30

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

Cys

Val

Leu

Thr

Ala

Ile

His

Leu

35

40

45

Asn

Val

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Glu

Leu

Ile

50

55

60

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Ala

Glu

Thr

Thr

Tyr

Asp

65

70

75

80

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg Asn.

Arg Arg

Leu

Val

Ser

Asp

Lys

85

90

95

» 4

01-3029-97 Če

Val

Gly

Gin

Ala 100

Cys

Cys

Arg

Pro

Ile 105

Ala

Phe Asp

Asp

Asp 110

Leu

Ser

Phe

Leu

Asp 115

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr 120

His

Ile

Leu Arg

Lys 125

His

Ser

Ala

Lys

Arg 130

Cys

Gly

Cys

Ile

> *	(1)	údaje k SEQ ID NO:3: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
		«·	(A)	DÉLKA: 4 aminokyseliny
			(B)	TYP: aminokyselina
			(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý
-			(D)	TOPOLOGIE:' lineární '
		’ (ii)	DRUH MOLEKULY: peptid
		(xi	) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:
	Lys 1	Asn Arg Gly

(1) údaje k SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP; aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

Gly Lys Asn Arg Gly

01-3029-97 Če

• *	··	•	•	• ·	• ·
• ·	• · ·	•	« ·		• ·
« ·	* ·	•	•	«	• ·
• ·	« 9	·· ·	*···	• ·	··

	94
	(1)	údaje k SEQ ID NO:5: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina
		(C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý
		(D) TOPOLOGIE: lineární
£		(ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:
	Arg	Gly Lys Asn Arg Gly
	1	5
	(1)	.údaje k SEQ ID NO: 6: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
		(ii) DRUH MOLEKULY: peptid
* ♦		(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

5 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(1) údaje k SEQ ID NO:7:

• ♦

01-3029-97 Če • * · · • 4 ** · 44··« • 4 4 44 · · 4 4*44· • 4 4 4 4 4444

44 ··> 4444 4444 (A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

Gly Gin. Arg Gly Lys Asn Arg Gly

5 (1) údaje k SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

5 (1) údaje k SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

4·· 4

4 <

» ••44444 • 4 44 «4

4 4

44

01-3029-97 Če • · 4 fr • 4··

4« 4 44

44 • 4··

DRUH MOLEKULY: peptid (xi)

POPIS SEKVENCE: SEQ ID

NO: 9:

Arg Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO:10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:10:

Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

10 (1) údaje k SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 12 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:

01-3029-97 Če • to·»· • v · ·· • · toto • tototo to • · ·· • to ··· • to ·· • ··· * to ·· • · · ·· ··

Lys Gly Arg Arg Gly Gin. Arg Gly Lys Asn Arg Gly

1510 (1) údaje k SEQ ID NO:12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid ' (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:12:

Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

5 10 (1) údaje k SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 14 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:13:

Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin. Arg Gly Lys Asn. Arg Gly

10

01-3029-97 Če (1) údaje k SEQ ID NO:14;

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:14:

Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

10 15 (1) údaje k SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:15:

Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

10 15 (1) údaje k SEQ ID NO:16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin

01-3029-97 Če · 4 ···· · · * • 444

Β · 4 44 β · 44 • 4·♦

4 4·

4··

44444

4·

4«4« (Β) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:16:

«i <

Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn. Arg « 1 5 ’ 10 15 i

Glý (1) údaje k SEQ ID NO:17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:17:

’ Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn

5 10 15 «*

Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO:18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

01-3029-97 Če

•	9	·*	•	•	• ·	99
•	9	•	• ·	•	• *	·♦·	9	9
•		•	•	•	•	•	9	9
• Λ		♦ ··	····	··	99

100 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:18:

* Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys

10 15 ¹ Asn Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO:19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:19:

Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly 15 10 15

Lys Asn Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

4

4

01-3029-97 Če

101 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:20:

Ala Ala Asn Pro Glu Asn. Sex Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg

10 15

Gly Lys Asn Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:

Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin

10 15

Arg Gly Lys Asn Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 aminokyselin

01-3029-97 Če

102 (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:22:

Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly

10 15

Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23:

Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg

10 15

Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

01-3029-97 Če

103 (A) DÉLKA: 25 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:

Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg

10 15

Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

25 (1) údaje k SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:25:

Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly

10 15

Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

25 (1) Údaje k SEQ ID NO:26:

01-3029-97 Če « · · · *

104 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:26:

Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys

5 10 15

Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

25 (1) údaje k SEQ ID NO:27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:27:

Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly

5 10 . 15

Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

25 (1) údaje k SEQ ID NO:28:

01-3029-97 Če

105 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:28:

Arg Glu Arg Asn. Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg

10 15

Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

25 (1) údaje k SEQ ID NO:29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE; lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:29:

Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser

5 10 15

Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

25 30 (1) údaje k SEQ ID N0:30:

01-3029-97 Če

106 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:30:

Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn

10 .15

Sex Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

25 30 (1) údaje k SEQ ID NO:31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:31:

Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu 15 10 15

Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly

25 30 (1) údaje k SEQ ID NO:32:

01-3029-97 Če

107 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO i 32:

Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro 15 10 15

Glu. Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg

25 30

Gly (1) údaje k SEQ ID NO:33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý’ (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:33:

Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin. Ala Ala Ala Ala Asn

10 15

Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn

25 30

Arg Gly

01-3029-97 Če

108

• 4		•	♦ 4	4 4 ·	4	4
• ·		4«		V	· ·	4 ·
• 4	•		4 4	•	4 · ♦ ♦·	4	4
• 4	•		•	4	4 ·	4	•
• 4		4*				4 4

(1) údaje k SEQ ID NO:34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:34:

Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn. Arg Gin Ala Ala Ala Ala

10 15

Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys

25 30

Asn Arg Gly (1) Údaje k SEQ ID NO:35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:35:

Gin Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala * «*··

01-3029-97 Če

109

Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly

25 30

Lys Asn Arg Gly (1) údaje k SEQ ID NO:36:

? (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 37 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:36.:

Lys	Gin	Met	Ala	Val	Leu	Pro Arg Arg	Glu Arg Asn	Arg	Gin	Ala	Ala
1				5			10			15
Ala	Ala	Asn	Pro	Glu	Asn	Ser Arg Gly	Lys Gly Arg	Arg	Gly	Gin	Arg
			20			25			30
Gly	Lys	Asn	Arg	Gly

(1) údaje k SEQ ID NO:37:

i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 38 aminokyselin'
(B)	TYP: aminokyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý
(D)	TOPOLOGIE: lineární

01-3029-97 Če « *« ·♦

110 (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:37:

Asp Lys Gin Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala

10 15

Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin

	20	25	30
ιΛ	Arg Gly Lys Asn Arg Gly 35

(1) údaje k SEQ ID NO:38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:38:

Pro

Asp

Lys

Gin

Met

Ala

Val

Leu

Pro

Arg Arg Glu

Arg Asn

Arg

Gin

1

5

10

15

Ala

Ala

Ala

Ala' Asn

Pro

Glu

Asn

Ser

Arg Gly Lys

Gly Arg

Arg

Gly

20

25

30

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

(1) údaje k SEQ ID N0:39:

01-3029-97 Če

111 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 417 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:39:

CATATGTCTC CGGATAAACA AATGGCTGTT CTTCCACGTC GTGAACGTAA CCGTCAGGCG 60

GCCGCTGCTA ACCCGGAGAA TTCCCGTGGT AAAGGTCGTC GTGGTCAGCG TGGTAAAAAC 120

CGCGGTTGCG TTCTGACCGC TATCCACCTG AACGTTACCG ACCTGGGTCT CGGTTACGAA 180

ACCAAAGAAG AATTAATCTT CCGTTACTGC TCCGGTTCCT GCGACGCTGC TGAAACCACG 240

TACGACAAAA TCCTGAAAAA CCTGTCCCGT

CAAGCTTGCT GCCGTCCGAT CGCTTTČGAC

GTTTACCACA TCCTGCGTAA ACACTCCGCT

AACCGTCGTC TGGTTTCCGA CAAAGTTGGT 300'

GACGACCTGT CCTTCCTGGA CGACAACCTG 360

AAGCGTTGCG GTTGCATCTA AGGATCC 417 (1) údaje k SEQ ID NO:40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 417 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:40:

• · ···

01-3029-97 Ce

112

CATATGAGCC CGGACAAACA GATGGCAGTA GCAGCTGCAA ACCCGGAAAA CTCCCGTGGT CGTGGTTGTG TTCTGACTGC AATCCACCTG ACCAAAGAAG AACTGATCTT CCGCTACTGC TACGACAAAA TCCTGAAAAA CCTGTCCCGT CAGGCATGCT GCCGTCCGAT CGCATTCGAC GTTTACCACA TCCTGCGTAA ACACTCCGCT

CTTCCACGTC GTGAACGTAA TCGCCAGGCA 60

AAAGGTCGCC GTGGCCAGCG CGGCAAAAAC 120

AACGTTACTG ACCTGGGTCT GGGCTACGAA 180

AGCGGCTCTT GCGACGCAGC TGAAACCACT 240

AACCGCCGTC TGGTAAGCGA CAAAGTAGGT 300

GATGACCTGA GCTTCCTGGA TGACAACCTG 360

AAACGCTGCG GTTGCATCTA AGGATCC 417 (1) údaje k SEQ ID NO:41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 345 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) · TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 1..342

1

[xi)

POPIS

SEKVENCE:

SEQ

ID

NO:

41:

ATG

TCC

CCA

GAA

AAT

TCT

CGT

GGT

AAA

GGT

CGT

CGT

GGT

CAG

CGT

GGT

48

Met

Ser

Pro

Glu

Asn

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly Arg

Arg

Gly

Gin

Arg

Gly

135

140

145

150

AAT

AAC

CGC

GGT

TGC

GTT

CTG

ACC

GCT

ATC

CAC

CTG

AAC

GTT

ACC

GAC

96

Asn

Asn

Arg

Gly

Cys

Val

Leu

Thr

Ala

Ile

His

Leu

Asn

Val

Thr

Asp

155

160

165

CTG

GGT

CTC

GGT

TAC

GAA

ACC

AAA

GAA

GAA

TTA

ATC

TTC

CGT

TAC

TGC

144

Leu

Gly

Leu

Gly Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Glu

Leu

Ile

Phe

Arg

Tyr

Cys

170

175

180

TCC

GGT

TCC

TGC

GAC

GCT

GCT

GAA

ACC

ACG

TAC

GAC

AAA

ATC

CTG

AAA

192

Ser

Gly

Ser

Cys Asp

Ala

Ala

Glu

Thr

Thr

Tyr

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

185

190

195

* · ··« to toto

01-3029-97 Če to to

113 «· · • ·· • to · • to « • · to • ·· to · • « ·· to · to to ··

AAC CTG TCC CGT AAC Asn Leu Ser Arg Asn 200

CGT CGT CTG GTT

TCC GAC AAA GTT

GGT CAA GCT Gly Gin Ala

240

Arg Arg 205

Leu Val

Ser

Asp Lys Val 210

TGC

TGC

CGT

CCG

ATC

GCT

TTC

GAC

GAC

GAC

CTG

TCC

TTC

CTG

GAC

GAC

288

Cys

Cys

Arg'

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Asp

Asp

Leu

Ser

Phe

Leu

Asp

Asp

215

220

225

230

AAC

CTG

GTT

TAC

CAC

ATC

CTG

CGT

AAA

CAC

TCC

GCT

AAG

CGT

TGC

GGT

336

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

Ser

Ala

Lys

Arg

Cys

Gly

235

240

245

TGC

ATC

TAA

345

Cys

ile

1) údaj e

k

SEQ

ID

NO:

42:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

DÉLKA: 114 aminokyselin (A)

TYP: aminokyselina

TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS

SEKVENCE:

SEQ ID NO:42:

Met Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly

1

5

10

15

Asn

Asn

Arg

Gly

Cys

Val

Leu

Thr

Ala

Ile

His

Leu

Asn

Val

Thr

Asp

20

25

30

Leu

Gly

Leu

Gly Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Glu

Leu

Ile

Phe

Arg

Tyr

Cys

35

40

45

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Ala

Glu

Thr

Thr

Tyr

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

50

55

60

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Arg

Leu

Val

Ser

Asp

Lys

Val

Gly

Gin

Ala

65

70

75

80

Cys

Cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Asp

Asp

Leu

Ser

Phe

Leu

Asp

Asp

85

90

95

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

Ser

Ala

Lys

Arg

Cys

Gly

100

105

110

Cys Ile (1) údaje k SEQ ID NO:43:

01-3029-97 Če í

114 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 315 bazických párů (E) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (ix) ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: ODS (B) POZICE: 1..312 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:43:

ATG CGT Met Arg 115

GGT Gly

CAA CGT Gin Arg

GGT AAA AAC CGC GGT TGC GTT CTG ACT GCA ATC

48

Gly 120

Lys Asn Arg

Gly

Cys Val 125

Leu

Thr Ala

Ile 130

CAC

CTG

AAC

GTT

ACT

GAC

CTG

GGT

CTG

GGC

TAC

GAA

ACC

AAA

GAA

GAA

96

His

Leu

Asn

Val

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Glu

135

140

145

CTG

ATC

TTC

CGC

TAC

TGC

AGC

GGC

TCT

TGC

GAC

GCA

GCT

GAA

ACC

ACT

144

Leu

Ile

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Ala

Glu

Thr

Thr

150

155

160

TAC

GAC

AAA

ATC

CTG

AAA

AAC

CTG

TCC

CGT

AAC

CGC

CGT

CTG

GTA

AGC

192

Tyr

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Arg

Leu

Val

Ser

165

170

175

GAC

AAA

GTA

GGT

CAG

GCA

TGC

TGC

CGT

CCG

ATC

GCA

TTC

GAC

GAT

GAC

240

Asp

Lys

Val

Gly

Gin

Ala

Cys

Cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Asp

Asp

180

185

190

CTG

AGC

TTC

CTG

GAT

GAC

AAC

CTG

GTT

TAC

CAC

ATC

CTG

CGT

AAA

CAC

288

Leu

Ser

Phe

Leu

Asp

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

195

200

205

210

TCC

GCT

AAA

CGC

TGC

GGT.

TGC

ATC

TAA

315

Ser

Ála

Lys

Axg

Cys

Gly

Cys

Ile

215 (1) údaje k SEQ ID NO:44:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 104 aminokyselin

01-3029-97 Če

115 (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:44:

Met Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile 15 10 15

His

Leu

Asn

Val 20

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu 25

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys 30

Glu

Glu

Leu

Ile

Phe 35

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly 40

Ser

Cys

Asp

Ala

Ala 45

Glu

Thr

Thr

Tyr

Asp 50

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn 55

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg 60

Arg

Leu

Val

Ser

Asp 65

Lys

Val

Gly

Gin

Ala 70

Cys

Cys

Arg

Pro

Ile 75

Ala

Phe

Asp

Asp

Asp 80

Leu

Ser

Phe

Leu

Asp 85

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr 90

His

Ile

Leu

Arg

Lys 95

His

Ser

Ala

Lys

Arg

Cys

Gly

Cys

Ile

100

1) údaje k SEQ ID NO:45:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 312 bazických párů
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH MOLEKULY: protein
(ix)	ZNAK:
	(A)	NÁZEV/KLÍČ: CDS
	(B)	POZICE: 1..309

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:45:

01-3029-97 Če

116

ATG GGT Met Gly 105

CAA Gin

CGT GGT Arg Gly

AAA AAC CGT GGT TGT GTT CTG ACT GCA ATC CAC

48

Lys 110

Asn Arg Gly

Cys

Val 115

Leu Thr

Ala

Ile His 120

CTG

AAC

GTT

ACT

GAC

CTG

GGT

CTG

GGC

TAC

GAA

ACC

AAA

GAA

GAA

CTG

95

Leu

Asn

Val

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Glu

Leu

125

130

135

ATC

TTC

CGC

TAC

TGC

AGC

GGC

TCT

TGC

GAC

GCA

GCT

GAA

ACC

ACT

TAC

144

Ile

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Ala

Glu

Thr

Thr

Tyr

140

145

150

GAC

AAA

ATC

CTG

AAA

AAC

CTG

TCC

CGT

AAC

CGC

CGT

CTG

GTA

AGC

GAC

192

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Arg

Leu

Val

Ser

Asp

155

160

165

AAA

GTA

GGT

CAG

GCA

TGC

TGC

CGT

CCG

ATC

GCA

TTC

GAC

GAT

GAC

CTG

240

Lys

Val

Gly

Gin

Ala

Cys

Cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Asp

Asp

Leu

170

175

180

AGC

TTC

CTG

GAT

GAC

AAC

CTG

GTT

TAC

CAC

ATC

CTG

CGT

AAA

CAC

TCC -

28Θ

Ser

Phe

Leu

Asp

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

Ser

185

190

195

200

GCT.

.AAA

CGC

TGC

GGT

TGC

ATC

TAA

312

Ala

Lys

Arg

Cys

Gly Cys

Ile

205 (1) údaje k SEQ ID NO:46:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 103 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:46

01-3029-97 Če

117

v 4	4 ”	4	• 4 4 4	• ♦ ·	4
4 φ	4		4 4	4 ·	4 4
• 4	4	• 4	« 4	4 4 4 · ·	4
4 4	4	4	• 4	* ·	4
4 4	4·		444 4*4*	»4	44

Met

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

Cys

Val

Leu

Thr

Ala

Ile

His

1

5

10

15

Leu

Asn

Val

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Glu

Leu

20

25

30

Ile

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Ala

Glu

Thr

Thr

Tyr

35

40

45

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Arg

Leu

Val

Ser

Asp

50

55

60

Lys

Val

Gly

Gin

Ala

Cys

cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Asp

Asp

Leu

65

70

75

80

Ser

Phe

Leu

Asp

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

Ser

85

90

95

Ala

Lys

Arg

Cys

Gly

Cys

Ile

100

(1) údaje k SEQ ID NO:47:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 135 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:47:

Met 1

Ser

Pro

Asp

Lys 5

Gin

Met

Ala

Val

Leu 10

Pro

Arg

Arg

Glu

Arg 15

Asn

Arg

Gin

Ala

Ala 20

Ala

Ala

Asn

Pro

Glu 25

Asn

Ser

Arg

Gly

Lys 30

Gly

Arg

Arg

Gly

Gin 35

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg 40

Gly

Cys

Val

Leu

Thr 45

Ala

, Ile His

Leu

Asn 50

Val

Thr

Asp

Leu

Gly 55

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr 60

Lys

Glu

Glu

Leu

Ile 65

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser 70

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala 75

Ala

Glu

Thr

Thr

Tyr 80

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys 85

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn 90

Arg

Arg

Leu

Val

Ser 95

Asp

Lys

Val

Gly

Gin 100

Ala

Cys

cys

Arg

Pro 105

Ile

Ala

Phe

Asp

Asp 110

Asp

Leu

01-3029-97 Če

118

9		9	•	9 9 9 9	• ·	V	9
•	•		• 9	9 9	9 9		9 9
É	9	•	• 9	• 9 9	···	9	9
*	9		9	9 9	9	9	9
• 9		··	• 9 9 #999	110		9 9

Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser ¹¹⁵ 120 125

Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile

130 135 (1) údaje k SEQ ID NO:48:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 104 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:48:

Met

Arg

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

Cys

Val

Leu

Thr

Ala

Ile

1

5

10

15

His

Leu

Asn

Val

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Glu

20

25

30

Leu

Ile

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Ala

Glu

Thr

Thr

35

40

45

Tyr

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Arg

Leu

Val

Ser

50

55

60

Asp

Lys

Val

Gly

Gin

Ala

Cys

cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Asp

Asp

65

70

75

80

Leu

Ser

Phe

Leu

Asp

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

85

90

95

Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile

100 (1) údaje k SEQ ID NO:49:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 103 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein

9 ♦

01-3029-97 Če

119

(xi

) POPIS

SE]

KVENCE:

SEQ ID NC

>:,49

Met

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

Cys

Val

Leu

Thr

Ala

Ile

His

1

5

10

15

Leu

Asn

Val

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Glu

Leu

20

25

30

Ile

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Ala

Glu

Thr

Thr

Tyr

35

40

45

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Arg

Leu.

Val

Ser

Asp

50

55

60

Lys

Val

Gly

Gin

Ala

Cys

Cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Asp

Asp

Leu

65

70

75

80

Ser

Phe

Leu

Asp

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

Ser

85

90

95

Ala

Lys

Arg

Cys

Gly

Cys

Ile

100 (1) údaje k SEQ ID NO:50:

(i)	CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
	(A) DÉLKA: 114	aminokyselin
	(B) TYP: aminokyselina
	(D) TOPOLOGIE:	lineární
(ii	) DRUH MOLEKULY:	protein
(xi	) POPIS SEKVENCE:	SEQ ID NO	>:50
Met	Ser Pro Glu Asn Ser	Arg Gly Lys	Gly Arg	Arg	Gly	Gin	Arg	Gly
1	5		10					15
Asn	Asn Arg Gly Cys Val	Leu Thr Ala	Ile	His	Leu	Asn	Val	Thr	Asp
	20	25					30
Leu	Gly Leu Gly Tyr Glu	Thr Lys Glu	Glu	Leu	Ile	Phe	Arg	Tyr	cys
	35	40				45
Ser	Gly Ser Cys Asp Ala	Ala Glu Thr	Thr	Tyr	Asp	Lys	Ile	Leu	Lys
	50	55			60
Asn	Leu Ser Arg Asn Arg	Arg Leu Val	Ser	Asp	Lys	Val	Gly	Gin	Ala
65	70			75					80
Cys	Cys Arg Pro Ile Ala	Phe Asp Asp	Asp	Leu	Ser	Phe	Leu	Asp	Asp
	85		90					95
Asn	Leu Val Tyr His Ile	Leu Arg Lys	His	Ser	Ala	Lys	Arg	Cys	Glý.
	100	105					110

Cys Ile

Claims (9)

000» 00 ·· PATENTOVÉ NÁROKY
1. 01-3029-97

   01-3029-97 • 0 · · « · 0 0 0 ·♦ • V ··· 0 ·

   Φ 0·0

   01-3029-97 •· ·<

   • »9 ·· • »94 • 4··

   01-3029-97 • ·*»·

   1---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

   MetSer

   ATGGCAGTACTTCCACGTCGTGAACGTAATCGCCAGGCAGCAGCTGCAAACCCGGAAAAC

   61---------₊---------+---------4·--------_ ₊-------.-- +

   TCCCGTGGTAAAGGTCGCCGTGGCCAGCGCGGCAAAAACCGTGGTTGTGTTCTGACTGCA

   121---------+ ---------+---------4·---------+---------₊

   ..P s

   h

   A

   I

   ATCCACCTGAACGTTACTGACCTGGGTCTGGGCTACGAAACCAAAGAAGAACTGATCTTC

   181 —------- + ----— 4-------- — 4-------240 'p

   Ξ t

   I

   CGCTACTGCAGCGGCTCTTGCGACGCAGCTGAAACCACTTACGACAAAATCCTGAAAAAC

   241 .........+---------*-------------------4----------+---------+ 300

   P v

   u

   I CTGTCCCGTAACCGCCGTCTGGTAAGCGACAAAGTAGGTCAGGCATGCTGCCGTCCGATC 3Q1 — ——— — — — ——4-—-— — — — ——+ — — — — — — — — — 4· — — — — — — — — — + _ — — — — — — ——+ — — — — — — — — — + 360

   B

   S m

   I

   GCATTCGACGATGACCTGAGCTTCCTGGATGACAACCTGGTTTACCACATCCTGCGTAAA

   351 —......-+---------+---------·»---------+ —......+-........ 420

   H I

   CACTCCGCTAAACGCTGCGGTTGCATCTAAGGATCC

   421---------_--------__₊——-----₊-----456

   01-3029-97

   01-3029-97 • * ·♦ •φ ·« • · ·♦ ♦

   9 9 99

   9999

   01-3029-97 • * ·· t ··» • · ·· <

   « · * ·· ··

   01-3029-97

   1/9

   Obr. 1

   Zralý humánní GDNF

   TCA Ser CCA GAT AAA CAA ATG GCA GTG CTT CCT AGA AGA GAG CGG Arg AAT Asn 15 Pro Asp Lys Gin 5 Met Ala Val Leu Pro 10 Arg Arg Glu CGG CAG GCT GCA GCT GCC AAC CCA GAG AAT TCC AGA GGA AAA GGT Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly 20 25 30 CGG AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAC CGG GGT TGT GTC TTA ACT GCA Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn- Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala 35 40 45 ATA CAT TTA AAT GTC ACT GAC TTG GGT CTG GGC TAT GAA ACC AAG Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys 50 55 60 GAG GAA CTG ATT TTT AGG TAC TGC AGC GGC TCT TGC GAT GCA GCT Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala 65 70 75 GAG ACA ACG TAC GAC AAA ATA TTG AAA AAC TTA TCC AGA AAT AGA Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg 80 - 85 90 AGG CTG GTG AGT GAC AAA GTA GGG CAG GCA TGT TGC AGA CCC ATC. Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro Ile 95 100 105 GCC TTT GAT GAT GAC CTG TCG TTT TTA GAT GAT AAC CTG GTT TAC Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr 110 115 120 CAT ATT CTA AGA AAG CAT TCC GCT AAA AGG TGT GGA TGT ATC His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile

   125 130

   01-3029-97 Če

   130

   01-3029-97 Če

   129

   • to • · · * • to to • · · • · to • · «·· • • to • · • • ·«

   RNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:26) ERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NQ:27) RERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:28) RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:29) P RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:30) LP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:31) VLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:32) AVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:33) MAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:34) QMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:35) KQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:36) DKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:37) and PDKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:38)

   a jejich adiční, substituční a vnitřně deleční varianty.

   36. Upravený GDNF protein podle nároku 35, vyznačený tím, že X se zvolí ze skupiny tvořené:

   G

   RG

   NRG

   KNRG (SEQ ID NO:3) gknrg (SEQ ID NO:4) RGKNRG (SEQ ID NO:5) QRGKNRG (SEQ ID NO;6) GQRGKNRG (SEQ ID NO:7) RGQRGKNRG (SEQ ID NO:8) a RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:9) a jejich variantami

   01-3029-97 Če

   128 ve které

   01-3029-97 Če

   9 4 4 ’ 4 • 4 • 4 ♦ * · 4 4 • 4 4 4 • * • 4 4 · • 4 « 4 4 4 >·♦ 4 • · • 4 4 4 4 4 4* 4 4 4 4 4 • 44 4 * 4 ·

   127

   31. GDNF kompozice podle nároku 30, vyznačená

   W*4^4|Rpl4P4l4M|4Í4BIMI4»#é^ * · ¥. · * RW44 IWWM» * Μ τ' Ί^ιιΕιι * jfc. < , tím, že zahrnuje alespoň dva druhy upraveného GDNF proteinu, přičemž první druhy mají molekulovou hmotnost přibližně 36 kDa a druhé druhy mají molekulovou hmotnost přibližně 40 kDa.

   32. GDNF kompozice podle nároku 31, vyznačená tím, že uvedené druhé upravené GDNF druhy mající molekulovou hmotnost přibližně , 40 kDa jsou heterodimerem zralého GDNF monomeru s molekulovou' hmotností přibližně 22 kDa a upraveného GDNF monomeru s molekulovou hmotností přibližně 18 kDa.

   33. Upravený GDNF protein izolovaný z GDNF kompozice podle nároku 30 a mající molekulovou hmotnost přibližně 2.9 až 40 kDa.

   34. Upravený GDNF protein izolovaný z GDNF kompozice podle nároku 30 a mající molekulovou hmotnost přibližně 29 až 36 kDa.

   35. Upravený GDNF protein odvozený od zralého GDNF proteinu exprimovaného rekombinantně modifikovanou bakterií nebo savčí buňkou, přičemž uvedený upravený GDNF protein má aminokyselinovou sekvenci

   X-[Cys⁴¹-Cys¹³³]-Y

   01-3029-97 Če

   126

   26. Upravený GDNF protein, který je rekombinantním l 4 11lib* —¹ — · ·Μ^—OHM··——.éb II· · _w, ,4·.^»--^*4^ vř#, expresním produktem prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky obsahující exogenní polynukleotid podle nároku 13.

   27. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje upravený GDNF proteinový produkt podle nároku 1 spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.

   28. Farmaceutická kompozice, vyznačen.á tím, že obsahuje upravený GDNF protein,. připravený způsobem podle nároku 22, a farmaceuticky přijatelné vehikulum.

   29, Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje upravený GDNF protein, připravený způsobem podle nároku 25, a farmaceuticky přijatelné vehikulum.

   30. Kompozice na bázi neurotrofního faktoru (GDNF) odvozeného z gliové buněčné linie, vyznačená tím, že zahrnuje zralý GDNF protein a jeden nebo více upravených GDNF proteinů, přičemž zralý GDNF protein má molekulovou hmotnost přibližně 44 kDa a uvedený upravený GDNF protein (proteiny) má molekulovou hmotnost přibližně 29 až 40 kDa.

   01-3029-97 Če

   ♦ · » · · ·· t • • · · r · < « ··♦ · • i ♦ ·

   125

   22. Způsob přípravy upraveného GDNF proteinu, obsahující rostoucí hostitelské buňky podle nároku 21 ve vhodném živném médiu a případně izolace uvedeného GDNF z uvedených buněk nebo uvedeného živného média.

   23. Způsob přípravy upraveného GDNF proteinu podle nároku 22, vyznačený tím, že uvedenými hostitelskými buňkami jsou buňky E. coli.

   24. Způsob přípravy upraveného GDNF proteinu podle· nároku 22, vyznačený tím, že uvedenými hostitelskými buňkami jsou buňky vaječníků čínského křečka.

   25. Způsob přípravy proteinového produktu na bázi upraveného neurotrofního faktoru (GDNF) odvozeného z gliové buněčné linie, vyznačený tím, žé zahrnuje:

   (a) kultivaci prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky transformované nebo transfektované vektorem podle nároku 20;

   (b) udržování uvedené hostitelské buňky za podmínek umožňujících expresi upraveného GDNF proteinu uvedenou hostitelskou buňkou; a (c) případnou izolaci upraveného GDNF proteinu exprimovaného uvedenou hostitelskou buňkou.

   • · «· · t ·

   01-3029-97 Če

   124 • 4 · • 4« • 4« · 4 4 ·

   15. tím,

   16. tím,

   17. tím,

   18 . tím,

   19.

   tím,

   20.

   15. tím,

   16. tím,

   17. tím,

   18 . tím,

   19.

   tím,

   20.

   Polynukleotid podle nároku 13, vyznačený že zahrnuje část sekvence znázorněné na obrázku 3.

   Polynukleotid podle nároku 13, vyznačený že zahrnuje část sekvence znázorněné na.obrázku 4.

   Polynukleotid podle nároku 13, vyznačený že zahrnuje sekvenci znázorněnou na obrázku 5.

   Polynukleotid podle nároku 13, vyznačený že zahrnuje sekvenci znázorněnou na obrázku 6.

   Polynukleotid podle nároku 13, vyznačený že zahrnuje sekvenci znázorněnou na obrázku 7.

   Vektor obsahující polynukleotid podle nároku 13, ě navázaný na expresní kontrolní sekvenci.

   Prokaryotická a eukaryotická hostitelská buňka transformovaná nebo transfektovaná polynukleotidem podle nároku 13.

   01-3029-97 če t i::· : / ·*··:::

   _ve ··♦ ♦··· ·« ·«

   123

   01-3029-97 Če

   122

   01-3029-97 Če

   121

   SRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:14) NSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ IDNO:15) ENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQIDNO:16) PENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:17) NPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQIDNO:18) ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:19) A ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:20) AA ANPENSRGKG ‘ RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:21) AAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:22) QAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:23) RQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:24) NRQAAA _;ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:25) ...... RNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:26) ERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:27) RERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:28) RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:29) P RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:30) LP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:31) VLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SÉQ ID NO:32) AVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:33) MAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:34) QNAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:35) KQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:36) DKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:37) and PDKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:33)

   a jejich adični, substituční a vnitřně deleční varianty a deriváty.

   ··

   1, Proteinový produkt na bázi upraveného neurotrotního faktoru (GDNF) odvozeného z gliové buněčné linie mající aminokyselinovou sekvenci

   X-[Cys⁴¹-Cys¹³³] -Y ve které [Cys⁴¹-Cys¹³³] znamená aminokyselinovou sekvenci Cys⁴¹ až Cys¹³³, která je znázorněna na obr. 1 (SEQ ID NO:2);

   Y znamená karboxylovou koncovou skupinu Cys¹³³ nebo karboxylový koncový aminokyselinový zbytek Ile¹³⁴; a

   X znamená methionylátovanou nebo nemethionylátovanou aminoskupinu Cys⁴¹ nebo N-koncový aminokyselinový zbytek (zbytky) zvolené ze skupiny;

   G

   RG

   NRG

   KNRG (SEQ ID NO:3)

   GKNRG (SEQ ID NO:4) rgknrg (SEQ ID NO:5) qrgknrg (SEQ ID NO:6) gqrgknrg (SEQ ID NO:7) RGQRGKNRG (SEQ ID NO:8) RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:9)

   G RRGQRGKNRG (SEQ ID ŇO:10) KG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO111) GKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:12) RGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:13)
2. 2/9

   Obr. 2

   HindIII<SalI<XboI<8amHI <7582

   BamHl

   4000 ♦ · w * » · ·· ··* · · • · · ♦ · »· «· · · * · « · « • · ··· ····

   2. Proteinový produkt podle nároku 1, vyznače- ný tím, že X = RQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:24) nebo jeho varianty.
3. 3/9

   Obr. 3A

   Sekvence metGDNF degenerátu DNA

   CATATGTCTCCGGATAAACAAATGGCTGTTCTTCCAC

   MetSer

   GTCGTGAACGTAACCGTCAGGCGGCCGCTGCTAACCCGGAGAATTCCCGTGGTAAAGGTC

   120

   121

   GTCGTGGTCAGCGTGGTAAAAACCGCGGTTGCGTTCTGACCGCTATCCACCTGAACGTTA +

   180

   CCGACCTGGGTCTCGGTTACGAAACCAAAGAAGAATTAATCTTCCGTŤACTGCTCCGGTT

   240

   181

   3. Proteinový produkt podle nároku 1, vyznačený t i m , že X = NPENSRGKG RRQRGKNRG (SEQ ID NO:18) nebo jeho varianty.
4. 4 4444 • · 44 •· ·

   444 *4 • *4 • 4··

   4 4 •

   4 4 · · • ·44 • «4· • 4 44

   4444

   4]_---------₊---------₊ _^-------+---------₊---------₊---------₊ iqq

   MRG.QRGKNRGCVL TAI HLNV

   ACTGACCTGGGTCTGGGCTACGAAACCAAAGAAGAACTGATCTTCCGCTACTGCAGCGGC

   101 — —)----- — — ~ + — -------1- —-------+ --------------+ J.SO

   TDLGLGYETKEELIFRYCSG

   TCTTGCGACGCAGCTGAAACCACTTACGACAAAATCCTGAAAAACCTGTCCCGTAACCGC

   161---------₊---------₊---------+---------4.---------₊.........4.220

   SCDAAETT. YDKILKNLSRNR

   CGTCTGGTAAGCGACAAAGTAGGTCAGGCATGCTGCCGTCCGATCGCATTCGACGATGAC

   221 ---------4----------+---------+---------+---------4.---------*280

   RLVSDKVGQACCRPIAFDDD

   CTGAGCTTCCTGGATGACAACCTGGTTTACCACATCCTGCGTAAACACTCCGCTAAACGC

   281---------+---------+---------'+---------4-----------++ 340

   LSFLDDN LVYH IL RK HSAKR

   TGCGGTTGCATCTAA

   341 ---------₊ 355 • 0 • 0 0 ♦ • 0 00 • · · 0 · • 0 · · β· ·· ·

   4/9

   Obr. 3Β

   241 s

   u n

   I

   CCTGCGACGCTGCTGAAACCACGTACGACAAAATCCTGAAAAACCTGTCCCGTAACCGTC

   E H a i m n 1 d P 1 I v 0 I u 5 I I I

   GTCTGGTTTCCGACAAAGTTGGTCAAGCTTGCTGCCGTCCGATCGCTTTCGACGACGACC

   ---------+---------_----------*---------₊ _--------+---------+ 360

   TGTCCTTCCTGGACGACAACCTGGTTTACCACATCCTGCGTAAACACTCCGCTAAGCGTT

   ---------+------------------+---------+---------*---------+ 420

   301

   361

   421

   B a m • H ·

   I

   GCGGTTGCATCTAAGGATCC — ------+------— + 440

   4 * 4 * • k • · · ♦ V 4 *' 4 44 • 4 4 · 4 4 • · * « • * • 4 4 4 4 4 4 44 · 4 · • 4 4 4 • 4 • 4 • ·

   37. Upravený GDNF protein podle nároku 35, vyznačený tím, že se zralý GDNF protein exprimuje rekombinantně modifikovanou bakteriální buňkou a upravený GDNF protein se produkuje in vitro nebo in vivo.

   38. Způsob výroby farmaceutické kompozice, vyznačený tím, že se terapeuticky účinné množství upraveného GDNF proteinového produktu podle nároku 1 smísí s alespoň ¹jedním farmaceuticky přijatelným vehikulem.

   39. Použití upraveného GDNF proteinového produktu podle nároku 1 pro výrobu farmaceutické kompozice pro ošetření poškození nervového systému, způsobeného nemocí nebo úrazem.

   Zastupuje:

   »· ♦·

   U1-JUZ9-97

   • 4 · » 4 · 4 4 > 4 4 · 4.4 4 4 4 ·♦ · 4 * • 4 «4 « 4 4 44 4 • 4 4 4 4·

   [Cys⁴¹-Cys¹³³] znamená aminokyselinovou sekvenci Cys⁴¹ až Cys¹³³, která je znázorněna na obr. 1 (SEQ ID NO:2);

   Y znamená karboxylovou koncovou skupinu Cys¹³³ nebo karboxylový koncový aminokyselinový zbytek Ile¹³⁴; a

   X znamená aminovou skupinu Cys⁴¹ nebo N-koncový aminokyselinový zbytek (zbytky) zvolený ze skupiny:

   RG

   NRG

   KNRG

   GKNRG

   RGKNRG

   QRGKNRG

   GQRGKNRG (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:6) (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:8) (SEQ ID NO:9)

   RGQRGKNRG

   RRGQRGKNRG

   G RRGQRGKNRG (SEQ ID NO.-10) KG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:11) GKG RRGQRGKNRG (SEQIDN0:12) RGKG RRGQRGKNRG (SEQIDNO:13) SRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:14) NSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:15) ENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:16) PENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:17) NPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:18) ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQIDNO:19) A ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID N0:20) AA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:21) AAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:22) QAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO-23) RQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:24) NRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:25)

   4. Proteinový produkt podle nároku 1, vyznačený tím, že X = PEN3RGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:17) nebo jeho varianty.
5. 5/9

   Obr. 4

   Sekvence metGDNF degenerátu DNA

   N d

   e

   I CATATGAGCCCGGACAAACAG

   5. Proteinový produkt podle nároku 1, vyznačený tím, že X = SRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO:14) nebo jeho varianty.
6. 6/9

   Obr. 5 [Pro²³-Lys³⁷AAsn³⁷-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein

   ATGTCCCCAGAAAATTCTCGTGGTAAAGGTCGTCGTGGTCAGCGTGGTAATAACCGCGGT

   21---------₊ — λ------+---------₊---------₊---------₊---------₊ gg

   MSPENSRGKGRRGQRGNNRG

   TGCGTTCTGACCGCTATCCACCTGAACGTTACCGACCTGGGTCTCGGTTACGAAACCAAA

   81---------+-------------____ +---------₊---------₊

   CVLTAIH LNVTDLGLGYETK

   GAAGAATTAATCTTCCGTTACTGCTCCGGTTCCTGCGACGCTGCTGAAACCACGTACGAC

   141---------₊---------+---------+---------_----------₊---------₊ 200

   EELIFRYCSGSCDAAETTYD

   AAAATCCTGAAAAACCTGTCCCGTAACCGTCGTCTGGTTTCCGACAAAGTTGGTCAAGCT

   201 — — — — — _ _ _ 4. _ _ „---— --+-----— — — - + —------— — + - - — - -- -- + -- -- -- -- - + 260

   KILKNLSRNRRLVSDKVGQA

   TGCTGCCGTCCGATCGCTTTCGACGACGACCTGTCCTTCCTGGACGACAACCTGGTTTAC

   261 -----------h---------i--------—+---------320

   CCRPIAFDDDLSFLDDNLVY

   CACATCCTGCGTAAACACTCCGCTAAGCGTTGCGGTTGCATCTAA

   321.... +---------+.........+.........+-----HILRKHSAKRCGCI*

   9 · · * • 4 ·· «· · · · • 4 · ♦ · · « · • · ·

   6. Proteinový produkt podle nároku 1, vyznačený tím, že X = RGQRGKNRG (SEQ ID NO:8) nebo jeho varianty.
7. 7/9

   Obr. 6 [Arg³²-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein

   ATGCGTGGTCAACGTGGTAAAAACCGCGGTTGCGTTCTGACTGCAATCCACCTGAACGTTI

   7. Proteinový produkt podle nároku 1, vyznače ný t í .m ·, že X = GQRGKNRG (SEQ ID N0:7) nebo jeho varianty.

   ·· · · · ζ *„*
8. 8/9

   Obr. 7 [Gly³³-Ile¹³⁴] upravený GDNF protein

   ATGGGTCAACGTGGTAAAAACCGTGGTTGTGTTCTGACTGCAATCCACCTGAACGTTACT •í·’ 41---------+ ---------+-------------------_----------₊---------₊ 10Q

   MGQRGKNRGCVLTAI HLNVT

   GACCTGGGTCTGGGCTACGAAACCAAAGAAGAACTGATCTTCCGCTACTGCAGCGGCTCT

   101--------- +------------+----------.+·-----------+---------+--------- + 16Q dlglgyetkeelifrycsgs

   TGCGACGCAGCTGAAACCACTTACGACAAAATCCTGAAAAACCTGTCCCGTAACCGCCGT

   161---------+---------+---------+---------+---------₊---------+. 220

   CDAAETTYDKILKNLSRNRR

   CTGGTAAGCGACAAAGTAGGTCAGGCATGCTGCCGTCCGATCGCATTCGACGATGACCTG

   221 ---------+---------+--------- +---------+---------*---------+ 280 lvsdkvgqaccrpiafdddl

   AGCTTCCTGGATGACAACCTGGTTTACCACATCCTGCGTAAACACTCCGCTAAACGCTGC

   281 —— — — --+---------+---------·— + ~------ — +---------h----------+ 340

   S F L DDN L V υ'η I LRK H S A K R C

   GGTTGCATCTAA

   341 ———+— 352

   8. Proteinový produkt podle nároku 1, vyznačený tím, že X = KNRG (SEQ ID NO: 3) nebo jeho varianty.

   9. Proteinový produkt podle nároku 1, vyznačený tím, že X = NRG nebo jeho varianty.

   10. Proteinový produkt podle nároku 1 až 9, vy- značený tím, že uvedená aminokyselinová sekvence, je glykosylátovaná..

   .

   11. . Proteinový produkt podle nároku 1 až 9, vy značený tím, že uvedená aminokyselinová sekvence není glykosylátovaná.

   12. Proteinový produkt podle nároku 1, vyznačený tím,že uvedeným derivátem je X-[Cys^4L-Cys¹³³]-Y aminokyselinová sekvence, konjugovaná na vodou rozpustný polymer.

   13. Polynukleotid kódující upravený GDNF proteinový produkt podle nároku 1.

   14. Polynukleotid podle nároku 13, vyznačený tím, že zahrnuje část sekvence znázorněné na obrázku 1.
9. 9/9

   Obr

   Srovnání proteinových sekvencí í<i

   GDNF

   GDNF

   GDNF

   GDNF

   MSPDKQMAVL PRRERNRQAA AANPENSRGK

   GRRGQRGKNR

   GCVLTAIHLN .MSPENSRGK

   -MRGQRGKNR

   GCVLTAIHLN

   MGQRGKNR

   GCVLTAIHLN

   GRRGQRGNNR

   GCVLTAIHLN

   100

   GDNF VTDLGLGYET KEELIFRYCS GSCDAAETTY DKILKNLSRN RRLVSDKVGQ -31 GDNF VTDLGLGYET KEELIFRYCS GSCDAAETTY DKILKNLSRN RRLVSDKVGQ -32 GDNF VTDLGLGYET KEELIFRYCS GSCDAAETTY DKILKNLSRN RRLVSDKVGQ -22 GDNF VTDLGLGYET KEELIFRYCS GSCDAAETTY DKILKNLSRN RRLVSDKVGQ 101 135 GDNF ACCRPIAFDD DLSFLDDNLV YHILRKHSAK RCGCI -31 GDNF ACCRPIAFDD DLSFLDDNLV YHILRKHSAK RCGCI -32 GDNF ACCRPIAFDD DLSFLDDNLV YHILRKHSAK RCGCI -22 GDNF ACCRPIAFDD DLSFLDDNLV YHILRKHSAK RCGCI