CN1897977A - 帕金森氏病的体内基因治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于基因治疗的方法和组合物，特别是涉及递送生物活性Neurturin治疗帕金森氏病的体内基因治疗。另一方面，本发明涉及病毒表达构建体，它包含与成熟或N－末端截短的Neurturin连接的哺乳动物信号肽，在信号肽与Neurturin之间无功能性原区(proregion)。这些病毒表达构建体是在体内基因治疗中有效分泌生物活性Neurturin所必需的。本发明还涉及能够大量产生Neurturin的哺乳动物细胞以及使用这些细胞用于重组生产生物活性Neurturin和用于治疗用途。

Description

帕金森氏病的体内基因治疗

本申请要求2003年10月20日提交的丹麦专利申请号DK PA 200301543的优先权。它要求了2003年10月22日申请的美国临时申请号60/512,918的权利。在这些申请和在本申请中引用的所有参考文献在此以其整体引用以供参考。

技术领域

本发明涉及用于基因治疗的方法和组合物，具体涉及用于递送生物活性Neurturin以治疗帕金森氏病的体内基因治疗。另一方面，本发明涉及病毒表达构建体，它包含与成熟或N-末端截短的Neurturin连接的哺乳动物信号肽，在该信号肽与Neurturin之间无功能性原区(proregion)。这些病毒表达构建体是在体内基因治疗中有效分泌生物活性Neurturin所必需的。本发明还涉及能够产生增加的量的Neurturin的哺乳动物细胞以及使用这些细胞在重组制备生物活性Neurturin中的用途以及治疗用途。

背景技术

帕金森氏病(PD)是影响1至1百50万美国人的破坏性神经变性疾病。每年诊断出超过35,000个新病例。帕金森氏病的发病率在超过50岁的群体中最高，但在更年轻的患者中也报道了惊人数量的新病例。

帕金森氏病的主要特征是运动缓慢(运动徐缓)，手，胳膊，腿，颌，和颜面震颤或发抖，四肢和躯干僵硬，且姿势不稳定。随着这些症状的发展，患者的行走，说话，或完成其它简单的日常生活工作可能出现困难。这些行为缺陷与大脑的黑质纹状体系统变性相联系，该系统负责产生流畅的，有目的的运动。具体地说，位于黑质中的神经细胞变性并伴随着由这些细胞产生的多巴胺丧失。黑质神经细胞将轴突或突起伸展进入纹状体，在纹状体中分泌和利用多巴胺。估计在PD症状出现前纹状体内需要发生80％的多巴胺损失。

目前，左旋多巴(levodopa)(商品名为Sinemet)是用于帕金森氏病的主要疗法。在大脑中，左旋多巴转化成多巴胺，矫正帕金森氏病患者大脑中的多巴胺不足。当左旋多巴与外周脱羧酶抑制剂卡比多巴(carbidopa)联合施用时，PD患者表现出明显受益。然而，问题是尽管左旋多巴疗法减轻了PD症状，但是它没有替代损失的神经细胞且不会阻止该疾病的进展。随着PD的进行，患者需要增加左旋多巴的剂量且可能出现副作用，最显著的是无意识运动的能力丧失和僵直。事实上，运动障碍专家通常推迟使用左旋多巴且最初使用其它多巴胺能(dopaminergic)药物，以便在该疾病过程的后期当患者最需要时使用左旋多巴。

因此，左旋多巴具有其局限性且需要建立用于帕金森氏病的其它治疗策略。在这点上，重新激起了手术治疗PD的兴趣。最近，一种称为深度脑刺激的操作引起了相当大的关注。在该操作中，将电极放在PD患者过度活跃的脑区域使得对这些脑区域的电刺激矫正过度反应性。在一些患者中，获得了显著的效果。其它手术介入致力于改善黑质纹状体系统的功能。移植多巴胺能细胞改善帕金森氏病动物模型中的运动神经元缺陷已有成功。人类多巴胺能细胞移植的初步临床试验已经成功，尽管个别双盲临床试验揭示了年轻患者而不是老年患者受益。然而，一些接受移植的患者发展成无意识运动的能力丧失。因此，目前，细胞移植仍然认为是一种实验探索。

另一方法致力于给予黑质纹状体系统生长因子以试图防止黑质神经元变性及神经递质多巴胺的伴随损失。

全世界的许多实验室已经证实神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)在大鼠和灵长类进行的试验中可防止黑质纹状体系统变性的结构和功能后果。使用蛋白质注射，通过泵和通过体内基因治疗施用在临床前试验中实现了将GDNF施用到CNS中。许多研究描述了使用表达GDNF的AAV或慢病毒转导CNS细胞(Kordower，Ann Neurol，200353(suppl 3)，s120-s134；WO 03/018821，Ozawa等；US 2002187951，Aebischer等；Georgievska等，2002，Exp Nero 117(2)，461-474；Georgievska等；2002，NeuroReport 13(1)，75-82；Wang等，2002，Gene Therapy，9(6)，381-389；US 2002031493，Rohne-Poulenc Rorer SA；US6,180,613，Roecketeller University；Kozlowski等，2000，Exp Neurol，166(1)，1，15；Bensadoun 2000，Exp Neurol，164(1)，15-24；Connor等，1999，Gene Therapy，6(12)，1936-1951；Mandel等，1997，PNAS，94(25)，14083-88；Lapchak等，1997，Brain Research，777(1，2)，153-160；Bilang-Bleuel等，1997，PNAS 94(16)，8818-8823)。

治疗帕金森氏病的其它体内基因治疗方案包括用表达芳香L-氨基酸脱羧酶(AADC)，suthalamic谷氨酸脱羧酶(GAD)的病毒来转导(Marutso，NipponNaika Gakkai Zasshi，2003，92(8)，1461-1466；Howard，Nature Biotechnology，2003，21(10)，1117-18)。

尽管GDNF似乎是用于治疗人类帕金森氏病有希望的候选物，但是据报道GDNF治疗引起某些副作用，主要是体重减轻和异常性疼痛(Hoane等，1999，160(1)：235-43)。因此，本领域需要开发治疗帕金森氏病的替代性策略，特别是致力于防止黑质神经元变性的策略。

Neurturin是GDNF生长受体家族中的一员且主要通过GFRα2受体传导信号。NTN和GDNF的受体在空间和时间上均差异表达。因此，可预料到NTN和GDNF的治疗效果是不同的。比较通过渗透型微型泵施用的GDNF和NTN证实了这点(Hoane等，1999，160(1)：235-43)。在用6-羟多巴胺诱导变性的成人多巴胺能神经元(与本发明人所用的动物模型相同)进行的回体基因治疗研究中比较GDNF和NTN，作者注意到GDNF和NTN都阻止了黑质多巴胺能神经元的死亡，但是仅GDNF诱导酪氨酸羟化酶染色强度增强和大量萌发(massive sprouting)(Akerud等，J Neurochemistry，73，1：70-78)。

作为蛋白质配制品或者通过移植过量表达NTN的细胞将Neurturin施用到PD模型的CNS没有产生与用GDNF获得的结果相当的结果。在蛋白质治疗研究中，这可能是由于Neurturin蛋白质配制品的稳定性存在问题(沉淀和半寿期短)。

迄今为止没有报道使用Neurturin体内基因治疗帕金森氏病。使用表达Neurturin的AAV的一个基因治疗研究集中在治疗视网膜疾病(Jomary等，2000，Molecular Vision 7：36-41)。然而，作者推断治疗视网膜退化的rd模型似乎不受单纯调节NTN或GFRα-2表达的影响。因此至今使用Neurturin的体内基因治疗仍是推测性的。

本发明概要

本发明人基于将GDNF家族生长因子通过病毒转导给予6-OHDA损伤模型的纹状体中进行了一系列临床前的动物试验。6-OHDA损伤模型是帕金森氏病的熟知动物模型。这些实验令人吃惊地表明用编码Neuturin的病毒转导产生了至少与用GDNF通过转导获得的效果一样好的治疗性效果。这些数据提供了在帕金森氏病模型中通过体内基因治疗给予Neurturin的效果的首份临床前证据。

Neurturin作为治疗帕金森氏病的优选神经营养因子的特异性由在6-OHDA损伤模型中不存在另一神经营养因子，Neublastin(Artemin)的任何效果得到证实。

因此，本发明的第一个方面涉及治疗帕金森氏病的方法，所述的方法包括给需要的个体的中枢神经系统施用治疗有效量的病毒表达载体，所述的载体包含能够指导可操作相连的多肽的表达的启动子序列，所述多肽包含能够在哺乳动物细胞中发挥功能的信号肽，和选自原-NTN，成熟NTN，N-末端截短的成熟NTN，和任何所述NTN的序列变异体组成的组的人，鼠或大鼠Neurturin(NTN)。

本发明人还确定了在某些情况下当使用编码前体-Neurturin原(前-原-Neurturin)的构建体时Neurturin的分泌可能存在问题。按所附实施例所述用人或小鼠前-原-Neurturin的体外转染和转导和体内转导都导致Neurturin的分泌非常有限。在相同条件下使用相同载体和相同细胞用于转导或转染时，分泌显著量的GDNF。

本发明人提供了获得明显更高分泌水平的一种方法。该方法包括缺失编码原肽(pro-peptide)的部分Neurturin基因。根据该实施方案的表达构建体包括直接与Neurturin的成熟或截短形式或成熟或截短的Neurturin的序列变异体融合的信号肽。信号肽可以是天然Neurturin信号肽或异源信号肽。

获得足够高分泌水平的另一方法包括用异源性信号肽，包括但不限于免疫球蛋白重链信号肽(IgSP)替换天然Neuturin信号肽。在一个具体优选的实施方案中，异源性信号肽与delta原-NTN融合。delta原-Neurturin是指无功能性原区的Neurturin多肽。

与利用Neurturin的发现相反，缺失GDNF的原部分并用IgSP信号肽代替GDNF信号肽导致与自前-原-GDNF的分泌相比GDNF的分泌明显减少。

还观察到用GDNF的前-原部分取代NTN的前-原部分没有导致NTN分泌的任何明显的增加。因此，NTN与GDNF之间的差异不能仅仅归因于两个神经营养因子的前-原部分的差异。

在前-原-NTN和含有GDNF的前-原部分的表达构建体中都观察到从哺乳动物细胞分泌分子量相当于未加工的原-NTN的蛋白质。还观察到该原-NTN不能与GFRα1或GFRα2结合。当使用“无原部分(pro-less)”表达构建体时，分泌分子量相当于成熟Neurturin的蛋白质。通过体内实验证实该蛋白质具有生物活性且能够结合GFRα1和GFRα2。

使用本发明所述的高效表达构建体的一个重要优势在于可减少施用到患者的病毒组合物的量。因此对于相同的治疗效果，其产生需要的病毒组合物更少且通过施用更小体积的组合物，预期副作用也更小。另外，可进行更精确的注射。

在另一方面，本发明涉及病毒表达载体用于制备治疗帕金森氏病的药物的用途，所述的载体包含能够指导可操作相连的多肽表达的启动子序列，所述的多肽包含能够在哺乳动物细胞中发挥功能的信号肽，以及选自原-NTN，成熟NTN，N-末端截短的成熟NTN，和任一所述NTN的序列变异体组成的组的人，鼠或大鼠Neurturin(NTN)。

在另一方面，本发明涉及含有多核苷酸序列的病毒表达载体，该多核苷酸序列包含能够指导可操作连接的多肽表达的启动子序列，所述多肽包含能够在哺乳动物细胞中发挥功能的信号肽，和选自成熟NTN，N-末端截短的成熟NTN，和成熟或N-末端截短的NTN的序列变异体组成的组的Neurturin。该病毒表达载体的特征在于缺少功能性Neurturin原区。

该病毒表达载体专用于体内基因治疗，因为它引起表达和分泌治疗相应量的Neurturin。该病毒表达载体也可用于产生高产量分泌生物活性Neurturin的哺乳动物细胞。

在另一方面，本发明涉及包含根据本发明的载体和一种或多种可药用的佐剂，赋形剂，载体和/或稀释剂的药用组合物。该药用组合物可用于体内和回体基因治疗。

在另一方面，本发明涉及用根据本发明的载体转导的分离的宿主细胞。

该转导的宿主细胞与已知产生NTN的细胞相比和与用编码具有完整原肽的Neurturin的病毒载体转导的细胞相比结果产生意外高产量的Neurturin。因此本发明经转导的宿主细胞构成了工业规模生产Neurturin有前景的细胞来源。

在另一方面，本发明涉及能够产生感染性载体颗粒的包装细胞系，所述的载体颗粒包含逆转录病毒来源的基因组，该基因组包含5’逆转录病毒LTR，tRNA结合位点，包装信号，与编码包含Neurturin和异源性信号肽的融合蛋白的多核苷酸序列可操作连接的启动子，第二链DNA合成的起点和3’逆转录病毒LTR。该融合蛋白不包含功能性Neurturin原区。

这些包装细胞系可用于产生根据本发明的病毒载体，当包入包囊(capsule)并移植到CNS时它们也可用于体内基因治疗。

在另一方面，本发明涉及包含用根据本发明的载体转导的至少一个细胞的嵌合非人哺乳动物。过量表达Neurturin的该动物可用于基因分布型分析(gene profiling)和药物的筛选和开发。

优选转导的细胞具有独特动物的基因型，即，不是同种异体或异种移植物。

在另一方面，本发明涉及可移植的细胞培养装置，该装置包含：允许Neurturin通过其扩散的半透膜；和根据本发明的至少一个分离的宿主细胞。

这些包囊移植进中枢神经系统时可用于Neurturin的局部施用。生长因子的局部和持续施用是治疗许多CNS疾病的优选施用方法，该疾病包括但不限于帕金森氏病(Parkinson’s disease)，阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sdisease)，亨廷顿氏舞蹈病(Huntington’s disease)，中风，和肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral scler(ALS)。

在另一方面，本发明涉及生物相容性包囊，它包含：含有释放病毒载体以感染靶细胞的活包装细胞的核心，其中该病毒载体是根据本发明的载体；和围绕所述核心的外部套(external jacket)，所述外套(jacket)包含渗透性生物相容性材料，所述材料具有这样的孔隙，其被选择以允许大约100nm直径的逆转录病毒载体通过其中，允许从所述的包囊释放所述的病毒载体。

本发明的包囊(capsule)用于使用方法将病毒颗粒递送到患者中的所需位点。将产生载体的细胞系包入包囊允许将病毒颗粒持续递送到靶位点，与单次输注相反。另外，可以重复治疗，减少了免疫攻击的可能性。包囊具有这样的孔隙，其大到足以允许包装细胞释放的病毒颗粒通过，然而可防止宿主细胞通过进入包囊。

该包囊方法增强了安全性和对治疗的控制，因为该装置容易取出(终止治疗)或移出并再植入(改变治疗)。而且，可减少感染的机会，因为包囊装置不是开放型或外置型。

最后，由于包囊化防止了包装细胞在患者体内迁移，且移植延长了包装细胞的存活力，因此该治疗可能需要更少的细胞。这在进一步降低患者的免疫反应方面具有优势。

在另一方面，本发明涉及根据本发明的病毒载体作为药物的用途。

在另一方面，本发明涉及根据本发明的病毒载体用于制备治疗神经系统疾病的药物的用途。

在另一方面，本发明涉及根据本发明的载体用于制备治疗CNS疾病的药物的用途。

另外，本发明涉及治疗神经系统疾病的方法，所述的方法包括给需要的患者施用：

治疗有效量的本发明的载体；

或治疗有效量的本发明的药用组合物；

或包含根据本发明的包装细胞系的生物相容性装置。

根据本发明的该方面，提供了治疗神经系统疾病的改进的体内基因治疗方法。通过所附实施例证实，用本发明的病毒载体体内转导产生了迄今未见过的所编码的治疗因子，例如Neurturin的分泌和组织分布，结果提高了治疗效果。

在另一方面，本发明涉及治疗神经系统疾病的方法，所述的方法包括在有该需要的个体中植入：

i.治疗有效量的本发明的经转导的细胞；或

ii.根据本发明的可移植的装置。

这一方面提供了基于回体基因治疗和植入能够分泌增加量的Neurturin的治疗细胞治疗神经系统疾病的另一方法。

在另一方面，本发明涉及能够以超过500ng/10⁶个细胞/24小时的量分泌neurturin或其功能等同体的哺乳动物细胞。

本发明所述的产生Neurturin的细胞以超过现有技术哺乳动物细胞中所见量至少一个数量级的量产生Neuturin。本发明产生Neurturin的细胞使得可在发酵罐中使用哺乳动物细胞生产该蛋白质，其优点在于该蛋白质被正确加工，糖基化，和折叠且容易从培养基中回收。

附图的简要说明

图1：来自各种哺乳动物的IgSP序列的序列对比。人IgSP(SEQ ID No.1；Genbank#AASC18285)；恒河猴(Rhesus Monkey)IgSP(SEQ ID No.2；Genbank#AAC02637)；狨(Marmoset)IgSP(SEQ ID No.3；Genbank#AAM89745)；小鼠IgSP(SEQID No.4；Genbank#AAA38502)；猪IgSP(SEQID No.5；Genbank#AAA79743)；大鼠IgSP(SEQ ID No.6；Genbank#AAA51349)；

图2：各种神经营养因子的信号序列的表。人神经生长因子(hNGF，Genbank#NP_002497；SEQ ID No 40)；小鼠神经生长因子(mNGF，Genbank#P01139；SEQ ID No 41)；人GDNF(hGDNF，Genbank#NP_000505；SEQ IDNo 42)，小鼠GDNF(mGDNF，SEQ ID No.43；Genbank登录号U36449)；公知的小鼠GDNF信号序列(SEQ ID No 44；Genbank NM_010275的N-末端19个氨基酸；与U36449相比起始密码子似乎被错误地预测)；人Neublastin(hNBN，Genbank#NP_476501；SEQ ID No 45)；人Persephin(hPSP，Genbank#NP_004149；SEQID No.46)；人Neurturin(SEQID No.37)；小鼠Neurturin(SEQ ID No.38)；大鼠Neurturin(SEQ ID No.39)。

图3：pNS1nIgSP.NTN的质粒图谱。

图4：用编码以下物质的构建体转染的细胞在体外产生的Neurturin的夹心ELISA：野生型NTN(SEQ ID No 12)，具有GDNF前原肽的NTN(SEQ IDNo.51)，和具有IgSP的NTN(SEQ ID No 18)。

图5：用编码以下物质的构建体转染的细胞在体外产生的Neurturin的功能性RetL2 ELISA试验：野生型NTN(SEQ ID No 12)，具有GDNF前原肽的NTN(SEQ ID No.51)，和具有IgSP的NTN(SEQ ID No 18)。

图6：来自用编码以下物质的构建体转染的细胞之溶胞产物的Neurturin制备物的Western印迹：野生型NTN(SEQ ID No 12)，具有GDNF前原肽的NTN(SEQ ID No.51)，和具有IgSP的NTN(SEQ ID No 18)。

图7：稳定表达Neurturin的ARPE-19细胞产生的Neurturin的量的定量结果。

图8：pHR′-sC.IgSP-hgNTN.W载体图谱，该载体用于体内基因治疗研究的慢病毒载体。

图9：纹状体内注射慢病毒载体或6-OHDA的示意图。

图10：大鼠的过纹状体的冠状切片，该大鼠用慢病毒载体转导且随后使用抗人NTN或人GDNF的抗体进行免疫组织化学处理。

左上图显示了完整的，未经手术的纹状体的hNTN处理。没有检测到信号。同样，在rLV-wtNTN转导的纹状体的完整侧没有检测到信号(右上图)。相反，在rLV-IgSP转导的纹状体中可见显著的hNTN特异性染色(右下图)且该弥散型染色方式非常类似于在GDNF-免疫组织化学染色的rLV-GDNF转导的动物中观察到的结果(左下图)。

图11：rLV-IgSPNTN对黑质多巴胺神经元的神经保护。在完整侧的黑质中可见许多TH-免疫反应细胞(多巴胺能细胞的指标)(上排左图)。在受到6-OHDA损伤的一侧，保留的TH-免疫反应神经元分布(profiles)的数目在wtNTN处理的动物中明显减少(上排中图)。相反，在接受IgSP-NTN处理的动物中保留更多的TH-免疫反应神经元(上排右图)。定量结果(柱形图)显示IgSP-NTN诱导对毒性损伤(insult)的明显解救(rescue)，与GDNF处理所见的效果相似。以前表明不能zai体内解救黑质多巴胺神经元的NBN与IgSP融合时无保护作用。

图12：实施例1和3中显示delta原Neurturin表达构建体的DNA插入片段(SEQ ID No.15)和编码的多肽(SEQ ID No.16)。

图13：实施例1和3中显示IgSP-Neurturin表达构建体的DNA插入片段(SEQ ID No.17)和编码的多肽(SEQ ID No.18)。

图14：实施例1和3中显示前原GDNF-Neurturin表达构建体的DNA插入片段(SEQ ID No.50)和编码的多肽(SEQ ID No.51)。

图15：(A)包含wt前-原NTN，具有GDNF的前-原部分的NTN(ppG-NTN，SEQ ID No.50)，d原-NTN(SEQ ID No 15)和IgSP-NTN(SEQID No 17)的NTN表达构建体。后一DNA序列包含一个内含子。详细描述见正文。(B)转染的HEK293细胞的溶胞产物和经调节的培养基的NTNWestern印迹。箭头指示了分别具有wt原-NTN，原(GDNF)-NTN和成熟NTN的大小的带。注意标准为分子量略高于wt NTN的NTN-His。(C)用NTN构建体转染的4个不同细胞系的经调节的培养基中的NTN的GFRα2结合活性。(D)溶胞产物(不与GFRα2结合)的NTN Western印迹，和与GFRα2结合的经调节的培养基中的NTN。(E)用NTN构建体转染的4个细胞系的经调节的培养基上的NTN夹心ELISA。数据表示为代表性实验的平均值±SEM(n＝3)且^*表示与用wt构建体转染的细胞差异显著(P＜0.05，Kruskal-Wallis单向秩分析(one way analysis on ranks)，然后是Student-Newman-Keuls方法)。

图16：纹状体内注射慢病毒构建体后转基因的体内表达。慢病毒载体转导且随后使用抗GFP(A)，人NTN(B，D，E，F，G)或GDNF(C)的抗体进行免疫组织化学处理的大鼠的经纹状体冠状切片。在GFP对照组中，使用抗GFP抗体免疫组织化学处理后可见清楚的细胞内染色形式(A)。在rLV-NTN转导的纹状体中观察到弱细胞内免疫反应(箭头)，但无细胞外NTN信号(B，E)。相反，在rLV-IgSP转导的纹状体中可见针对NTN的细胞内(箭头)和明显特异的细胞外染色形式(D，F)。(C)由于蛋白质的分泌在rLV-GDNF转导的动物中的GDNF免疫染色显示出相似的弥散型染色形式。(G)SN网状部中的NTN免疫反应纤维，显示了NTN是从纹状体中IgSP-NTN转导的细胞以前进方式运输的。线条1mm(A-D，G)或62.5μm(E-F)。

图17：rLV-IgSP-NTN对黑质多巴胺神经元的神经保护作用。(A)在4个不同治疗群体中与完整侧相比损伤侧中表达TH的黑质神经元数目。(B)损伤侧VMAT-免疫反应性黑质神经元的数目。数据表示为平均值±SEM(n＝5-7)且^*表示与GFP组差异显著(P＜0.05，单向ANOVA，Dunnett’s方法)。

图18：GFP，NTN，IgSP-NTN和GDNF-处理的动物的经黑质冠状切片。在完整侧可见许多TH-免疫反应性细胞(A)。在受到6-OHDA损伤的一侧，保留的TH-免疫反应性神经元分布的数目在wt NTN或GFP处理的动物中明显降低(B，D)。相反，在接受GDNF(H)或IgSP-NTN处理的动物中保留了更多的TH-免疫反应神经元(C)。注意在GDNF和IgSP-NTN处理的动物中TH染色强度降低。在完整侧(E)，IgSP-NTN处理的动物的损伤侧(G)和wt NTN处理的动物的损伤侧(F)中TH-IR细胞的放大率更高的图像。黑色箭头指示TH表达下调的神经元而白色箭头指示TH表达正常的神经元。线条为1mm(A-E，H)或25μm(E-G)。

定义

功能性Neurturin原区是位于信号肽和成熟肽之间的肽，该前体肽在信号肽裂解后可通过弗林蛋白酶(furin)从成熟肽上裂解下来。“Neurturin原区”是指包含例如，至少相应于SEQ ID No.12的氨基酸-76至-3，相应于SEQID No.13的氨基酸-72至-3，相应于SEQ ID No.14的氨基酸-72至-3的氨基酸。由于这些前-原-Neurturins含有一个以上可能的原位点(RXXR基序)，且由于通过信号肽酶进行的实际裂解可能会变化，因此功能性原区的准确长度可能相应地变化。

信号肽-真核细胞信号肽。真核细胞信号肽是存在于蛋白质上的肽，它注定会分泌或者成为膜成份。它通常位于该蛋白质的N-末端。在本文中，以SignalP(2.0版或优选3.0版)鉴定为信号肽的所有信号肽都认为是信号肽。

哺乳动物信号肽是来自于通过内质网分泌的哺乳动物蛋白质的信号肽。

异源信号肽-不是天然与Neurturin多肽可操作相连的信号肽。

本文使用的成熟人Neurturin多肽是指天然人前-原-Neurturin C-末端的102个氨基酸，即SEQ ID No.12的氨基酸1-102。

本文使用的成熟小鼠Neurturin多肽是指天然小鼠前-原-Neurturin C-末端的100个氨基酸，即SEQ ID No.13的氨基酸1-100。

本文使用的成熟大鼠Neurturin多肽是指天然大鼠前-原-Neurturin C-末端的100个氨基酸，即SEQ ID No.14的氨基酸1-100。

本文使用的Neurturin多肽是指包括天然人Neurturin的氨基酸8-101(SEQ ID No 12)，天然小鼠Neurturin的氨基酸6-99(SEQ ID No 13)，或天然大鼠Neurturin的氨基酸6-99(SEQ ID No.14)的多肽，每种多肽可具有对天然序列多达15个氨基酸的取代。在某些上下文中，应明白“分泌的Neurturin多肽”是指将要分泌的多肽，与已经分泌的多肽相反。

生物活性：与GFRα2二聚化时结合RET并诱导RET二聚化和自身磷酸化的能力。生物活性可用实施例中所述的RET L2 Elisa试验测定。生物活性也可以是与GFRα1二聚化时结合RET并诱导RET二聚化和自身磷酸化的能力。生物活性可用实施例中所述的RETL1 Elisa试验测定。

序列相同性：使用Clustal W(1.82)的默认设置通过对比序列可获得参照氨基酸序列和变异型氨基酸序列之间的序列相同性。计算完全保守的残基数目并除以参照序列的残基数目。

发明详述

I.信号序列

通过附着已知为信号肽或信号序列的短氨基末端序列可完成靶向分泌的蛋白质进入分泌途径(von Heijne，G(1985)J.Mol.Biol.184，99-105；Kaiser，C.A.& Botstein，D.(1986)，Mol.Cell.Biol.6，2382-2391)。信号肽本身含有最佳功能所必需的几个元件，其中最重要的是疏水成份。紧接着疏水序列之前通常是碱性氨基酸或酸，而信号肽的羧基末端是由单个插入氨基酸分开的一对小的，不带电荷的氨基酸，它限定信号肽酶的裂解位点。

优选的哺乳动物信号肽是15到30个氨基酸长(真核生物平均为23个氨基酸)。各种蛋白质信号肽的共有结构通常描述为带正电荷的n-区域，接着是疏水的h-区域和中性但有极性的c-区域。(-3，-1)-规则表明-3和-1位的残基(相对于该裂解位点)必须是小的和中性的残基，以便发生正确的裂解。

真核生物信号序列的n-区域仅略微富含Arg。h-区域较短且非常疏水。c-区域较短且没有可观察到的模式。所述的-3和-1位由小而中性的残基组成。裂解位点C-末端的氨基酸残基在真核生物中重要性较小。

在C-区域中-1和-3位的残基最重要。它们是小的，不带电荷的氨基酸。-1位的残基优选A，G，S，I，T或C。更优选-1位是A，G或S。-3位的残基优选A，V，S，T，G，C，I，或D。更优选的是，-3位是A，V，S或T。

疏水区普遍由疏水残基组成。它们包括A，I，L，F，V，和M。优选的是，在-6至-13位。在组成该区域的8个氨基酸中，至少4个残基是疏水的，更优选至少5个，更优选至少6个，例如7或8个。

在根据本发明的Neurturin构建体中可使用各种不同的信号肽。信号肽可以是任何有功能的信号肽，如异源性信号肽，如免疫球蛋白信号肽(IgSP)。该信号肽可来自于任何合适的物种，如人，小鼠，大鼠，猴，猪。优选来自于人类。

通过所附的实施例证实，使用无Neurturin原肽部分的IgSP通常导致生物活性Neurturin的体外和体内分泌都提高。用慢病毒转导的细胞和用质粒转染的细胞都可重复该结果。当IgSP编码序列直接融合到编码不包括Neuturin天然前原部分的成熟蛋白质的基因时，该细胞分泌该成熟蛋白质作为有生物学活性的蛋白质。

在另一实施方案中，信号肽是天然Neurturin信号肽，如天然人Neurturin信号肽。在本文中，天然Neurturin信号肽和Neurturin多肽的后一种构建体称为delta原neurturin。仅仅去掉编码Neurturin的前体部分的序列导致与前-原-Neurturin的表达相比生物活性Neurturin的分泌意外增加。

使用无原部分的表达构建体与编码功能性Neurturin或GDNF原肽的表达构建体相比生物活性Neurturin的分泌强烈增强，且存在功能性原区导致分泌无生物活性的Neurturin，结合上述观察结果导致本发明人得出的结论是功能性原肽不存在是分泌生物活性Neurturin的前提条件。原区不存在还强烈增强Neurturin的分泌水平。选择强信号肽，例如IgSP，可更进一步增强分泌。

在本发明的一个实施方案中，该编码的信号肽选自NGF信号肽(SEQ IDNo 40或41)，GDNF信号肽(SEQ ID No 42或43)，Persephin信号肽(SEQ IDNo.46)和Neublastin信号肽(SEQ ID No 45)组成的组。优选的是这些信号肽是鼠或人类的，更优选是人类的。

实施例6中信号肽的预测表明具有NGF和GDNF信号肽的成熟Neurturin是与IgSP一样的强信号肽。与成熟Neurturin连接的Persephin信号肽预期也是强信号肽。delta原-表达构建体(与成熟或N-末端截短的NTN连接的NTN信号肽)被评估为强度较小的信号肽。通过实施例中所示的定量数据可证实这一点。

每个具体信号肽可分别与成熟小鼠，大鼠或人NTN(SEQ ID No 10，11，或8)或它们中任意序列的N末端截短形式结合，如实施例6和序列表对于IgSP NTN(SEQ ID No 18-24)与delta原NTN(SEQ ID No 16和25-30)所示的那样。

信号肽的裂解

在决定插入表达构建体中的具体Neurturin形式之前，可使用本领域的预测工具检查信号肽(SP)裂解的可能性。一种该优选的预测工具是可在SignalP WWW服务器( http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)上获得的SignalP软件或优选用可从相同服务器(http：//www.cbs.dtu.dk/services/signalP/)获得的更新的3.0版。

SignalP WWW服务器将在你的序列中的每个位点上产生0到1之间的3个得分：

C-得分(原始(raw)裂解位点得分)

训练(Trained)识别裂解位点与其它序列位置的网络输出得分。训练为：

高：在+1位置(紧接着裂解位点之后)

低：在所有其它位点。

S-得分(信号肽得分)

训练识别信号肽与非信号肽位置的网络输出得分。训练为：

高：在裂解位点之前的所有位置

低：在裂解位点之后的30个位置和在非分泌蛋白的N-末端。

Y-得分(组合裂解位点得分)

通过观察C-得分高且S-得分从高变到低值的情况来优化对裂解位点定位的预测。Y-得分通过结合C-得分的顶点与S-得分的斜率(slope)形式化(formalises)这一点(this)。

具体地说，Y-得分是C-得分和S-得分线性导数(smoothed derivative)(即，目前位置之前的d位置和之后的d位置的平均S-得分之间的差异，其中d随选定的网络体系而变化)的几何平均值。

所有3个得分都是对数据的不同分区训练的5个网络的平均值。

对于每个序列，SignalP将报道最大的C-，S-，和Y-得分，以及N-末端与预期裂解位点之间的平均S-得分。这些值用于区分信号肽和非信号肽。如果预测你的序列具有信号肽，则预期裂解位点紧邻具有最大Y-得分的位置之前。

对于常见的信号肽，C-和Y-得分在+1位置高，而S-得分在裂解位点之前高，在其之后低。

为了比较，可将预测结果与野生型Neurturin信号肽的预期裂解(前-原-NTN(SEQ ID No 12)的19和20位氨基酸之间的裂解)进行比较。对于小鼠和大鼠前-原-Neurturin，裂解预测结果确定性低。预测裂解在氨基酸23和24之间发生，但是也有可能在与人前-原NTN相同的位置裂解。

Y-得分最大值位置提供了对裂解位点位置的最佳预测。序列类型(信号肽或非分泌蛋白)的最佳预测由平均S-得分(位置1与紧邻Y-得分最大值之前的位置之间区域中的S-得分平均值)提供：如果平均S-得分大于0.5，则预测该序列是信号肽。因此，在一个优选的实施方案中，平均S-得分大于0.5。

SignalP的更新版本(3.0版)还包括一个新得分D，或Dmax(鉴别得分(discrimination score))，它描述“信号肽类型(signal peptidedness)”。发现D得分与一通使用所述信号肽与目的蛋白质的情况的分泌水平相关联。优选使用编码表现出至少0.5，例如至少0.6，例如至少0.7，例如至少0.8的Dmax值的信号肽-Neurturin蛋白质的Neurturin表达构建体。

优选的信号肽-Neurturin构建体是SignalP-NN或SignalP-HMM程序中具有在SP和Neuturin之间的预测裂解的那些构建体。特别优选的是在SignalP-NN和SignalP-HMM中在该位点都具有预测信号肽的Neurturin构建体。

当信号肽是IgSP时，该构建体的Neurturin部分可包括从102到96个氨基酸长的任何人Neurturin或从100到96个氨基酸长的任何小鼠或大鼠Neurturin。在所有这些情况中，SignalP-NN和SignalP-HMM都预测到在19个氨基酸信号肽之后的信号肽裂解。

其它优选的信号肽包括GDNF和NGF信号肽以及Persephin信号肽。

在另一优选的实施方案中，该表达构建体编码信号肽-Neurturin蛋白，其中通过SignalP 2.0版或优选3.0版预测的裂解发生在成熟Neurturin的第一个经典(canonical)半胱氨酸之前。

参考文献：Henrik Nielsen，Jacob Engelbrecht，Sren Brunak and Gunnarvon Heijne：Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides andprediction of their cleavage sites.Protein Engineering，10，1-6(1997)。SignalP-HMM输出模型：Henrik Nielsen and Anders Krogh：Prediction of signalpeptides and signal anchors by a hidden Markov model.In Proceedings of theSixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology(ISMB 6)，AAAI Press，Menlo Park，California，pp.122--130(1998)。改进的信号肽的预测：SignalP 3.0.Jannick Dyrlv Bendtsen，Henrik Nielsen，Gunnar vonHeijne和Sren Brunak.J.Mol.Biol.，340：783-795，2004。

IgSP

根据一个特别优选的实施方案，信号肽是免疫球蛋白重链的信号肽。所附的实施例证实，使用该信号肽一般导致编码的Neurturin的体外和体内分泌都提高。用慢病毒转导的细胞(体内和体外)和用质粒转染的细胞(体外)都可重复该结果。即使当IgSP基因直接融合到编码成熟蛋白(即，不包括前体部分)的基因上时该细胞仍然以正确的大小产生成熟蛋白质。

免疫球蛋白信号肽是来自大量哺乳动物群体的19个氨基酸的小肽。来自人类，恒河猴，狨，大鼠，小鼠和猪的该序列在图1中进行了序列比对。与人IgSP相比的序列相同性百分数范围从21％(猪)到68％(狨)。该相对较大的差异表明可在较大范围内改变该具体序列而基本上不改变信号肽的生物学功能。还观察到正如所附实施例证实的存在跨物种反应性。这些试验用小鼠IgSP进行，它在大鼠(体内实验)和人细胞(ARPE 19细胞)以及中国仓鼠细胞(CHO)和大鼠细胞(HiB5)中有功能。

优选的IgSP是鼠或人类来源，因为已知鼠IgSP在小鼠，大鼠和人中有功能。为用于人类，IgSP优选属于人类来源以降低任何跨物种副作用的危险。

II.Neurturin

Neurturin是GDNF(神经胶质细胞系衍生的神经营养因子)的4个成员之一。它通过GFRα2和GFRα1共同受体传导信号。已表明Neurturin可作为治疗性候选物用于治疗许多变性疾病。如果细胞变性涉及神经元变性，该疾病包括，但不限于外周神经病，肌萎缩性侧索硬化，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，亨廷顿氏舞蹈病，局部缺血性中风，急性脑损伤，急性脊髓损伤，神经系统肿瘤，多发性硬化，外周神经创伤或损伤，暴露于神经毒素，代谢性疾病，例如糖尿病或肾机能障碍和由感染因子引起的损伤。如果细胞变性涉及骨髓细胞变性，该疾病包括，但不限于血细胞不足的疾病，诸如，白细胞减少症，包括嗜曙红细胞减少症和/或嗜碱细胞减少症，淋巴细胞减少症，单核细胞减少症，中性白细胞减少症，贫血，血小板减少症以及上述任一细胞的干细胞不足。具体地说，用本发明的构建体和方法施用Neuturin可用于治疗帕金森氏病。

Neurturin在WO 97/08196(华盛顿大学)中首次描述。人neurturin的前原形式在SEQ ID NO 12中表示，小鼠neurturin的前原形式在SEQ ID NO 13中表示，大鼠Neurturin的前原形式在SEQ ID No 14中表示。Neurturin的成熟形式包括SEQ ID No 12的氨基酸1-102(SEQ ID No 8所示的人成熟NTN)，SEQ ID No 13的氨基酸1-100(SEQ ID No.10所示的小鼠成熟NTN)，和SEQID No.14的氨基酸1-100(SEQ ID No 11所示的大鼠成熟形式)。

编码成熟人Neurturin的核苷酸序列在本申请的SEQ ID NO：7中表示。编码的蛋白质长102个氨基酸且在SEQ ID NO：8中表示。成熟小鼠Neurturin在SEQ ID No.10中表示。成熟大鼠Neurturin序列在SEQ ID No 11中表示。实施例1和3描述了克隆人成熟Neurturin的方法。优选用于本发明上下文中的Neurturin是人成熟Neurturin，但是同样预期可使用相应的小鼠和大鼠序列。

本发明的序列变异体适合地参照所编码的生物活性Neurturin来定义。GDNF家族的生长因子之间的序列相同性百分数当对该生长因子成熟部分进行测定时大约在50％的范围内。由于在密切相关的生长因子之间存在该差异，预期可改变Neurturin的序列而不改变该生长因子的生物学活性。在本发明的一个实施方案中，Neurturin的序列变异体是编码生长因子的序列，它与人或小鼠或大鼠Neurturin的C-末端96个氨基酸(SEQ ID No 9和10和11)具有至少70％的序列相同性。更优选的是该序列变异体与所述的Neurturin具有至少75％的序列相同性，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少99％的序列相同性。在一个特别优选的实施方案中，通过与人Neurturin的C-末端96个氨基酸(SEQ ID No 9)进行比较来测定序列相同性。

本领域已知不能随意改变氨基酸序列而不影响该蛋白质的生物学功能。最不可能改变后不严重影响Neurturin的生物学功能的氨基酸残基首先且最重要的包括成熟部分的7个保守的经典半胱氨酸残基(SEQ ID NO.8的残基号8，35，39，69，70，99，和101)。

Neurturin与其它GDNF家族神经营养因子的序列比对为本领域的技术人员提供了关于保守Neurturin的序列变异体的生物学功能最重要的氨基酸残基的信息。在一个优选的实施方案中，Neurturin的序列变异体包含在相应于野生型人NTN(hNTN)的位置完全保守的残基。在一个更优选的实施方案中，该序列变异体包含在相应于野生型hNTN的位置的完全保守和强保守的残基。在另一更优选的实施方案中，NTN的序列变异体包含在相应于野生型hNTN的位置完全，强和弱保守的残基。

表3A：人GDNF家族的神经营养因子的氨基酸序列比较。序列比对显示了前原Neublastin(NBN，SEQ ID No 47)，前原Persephin(PSP，SEQ ID No48)，前原Neurturin(NTN，SEQ ID No 12)，和GDNF(GDNF，SEQ ID No 49)。

Neurturin-全长    --------------------MQRWKAAALASVLCSSVLSIWMCREGLLLSHRLGPA

Neublastin

MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEASLGSAPRSPAPREGPPP

Persephin-全长    -------------------------

GDNF_                     人                  全            长

-----MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDS

Neurturin-                         全                       长

LVPLHRLPRTLDARIARLAQYRALLQGAPDAMELRELTPWAGRPPGPRRRAGPRRR

Neublastin

VLASPAGHLPGGRTARWCSGRARRPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPG

Persephin-                         全                       长

-MAVGKFLLGSLLLLSLQLGQGWGPDARGVPVADGEFSSEQVAKAGGTWLGTHRPL

GDNF_                   人                  全              长

NMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKG

Neurturin-                         全                       长

RARARLGARPCGLRELEVRVSE LGLGYASDETVL FRYCAGACEA-AARVYDLGLRR

Neublastin

SRARAAGARGCRLRSQLVPVRA LGLGHRSDELVR FRFCSGSCRR-ARSPHDLSLAS

Persephin-                         全                       长

ARLRRALSGPCQLWSLTLSVAE LGLGYASEEKVI FRYCAGSCPRGARTQHGLALAR

GDNF_                   人                  全              长

RRGQRGKNRGCVLTAIHLNVTD LGLGYETKEELI FRYCSGSCDA-AETTYDKILKN

                        **  :* ****::.*:**:*:*:* * :. *

Neurturin-                         全                       长

LRQRRRLRRE---RVRA QPCCRPTAYEDEVSFLDAHSRYHTVHEL SARECACV-

Neublastin

LLGAGALRPPPGSRPVS QPCCRPTRYE-AVSFMDVNSTWRTVDRL SATACGCLG

Persephin-                         全                       长

LQGQGRAHGG-------- PCCRPTRYT-DVAFLDDRHRWQRLPQL SAAACGCGG

GDNF_                    人                   全            长

LSRNRRLVSD----KVG QACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKH SAKRCGCI-

                  *            .**** : ::*:*. :::.***.*

*表示具有单个完全保守残基的位置。

:表示下列‘强’组之一是完全保守的：

-STA，NEQK，NHQK，NDEQ，QHRK，MILV，MILF，HY，FYW。

.表示下列‘较弱’组之一是完全保守的：

-CSA，ATV，SAG，STNK，STPA，SGND，SNDEQK，NDEQHK，NEQHRK，VLIM，HFY。

表3B.成熟小鼠(SEQ ID No 10)，大鼠(SEQ ID No 11)和人NTN(SEQ IDNo.8)的Clustal W(1.82)多序列比对。

CLUSTAL W(1.82)多序列比对

小鼠

--PGARPCGLRELEVRVSELGLGYTSDETVLFRYCAGACEAAIRIYDLGLRRLRQRRRVR 58

大鼠

--PGSRPCGLRELEVRVSELGLGYTSDETVLFRYCAGACEAAIRIYDLGLRRLRQRRRVR 58

人

ARLGARPCGLRELEVRVSELGLGYASDETVLFRYCAGACEAAARVYDLGLRRLRQRRRLR 60

      *:*******************:******************:*************:*

小鼠  RERARAHPCCRPTAYEDEVSFLDVHSRYHTLQELSARECACV 100

大鼠  KERVRAHPCCRPTAYEDEVSFLDVHSRYHTLQELSARECACV 100

人    RERVRAQPCCRPTAYEDEVSFLDAHSRYHTVHELSARECACV 102

      :****:**********************::**********

通过标准技术，例如定点诱变和PCR-介导的诱变可在Neurturin中导入突变。优选的是，可对一个或多个预定的非必需氨基酸残基进行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已有定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β-分支侧链(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)的氨基酸。因此，NTN蛋白中预定的非必需氨基酸残基可用相同侧链家族的另一氨基酸残基取代。

氨基酸家族的亲缘关系也可以根据侧链相互作用来测定。取代的氨基酸可以是完全保守的“强(strong)”残基或完全保守的“弱(weak)”残基。“强”组的保守氨基酸残基可以是下列组中的任何一组：STA，NEQK，NHQK，NDEQ，QHRK，MILV，MILF，HY，FYW，其中以单字母氨基酸代码将可互相取代的氨基酸分组。同样，“弱”组的保守残基可以是下列任何一组：CSA，ATV，SAG，STNK，STPA，SGND，SNDEQK，NDEQHK，NEQHRK，VLIM，HFY，其中各组中的字母代表单字母氨基酸代码。

已知GDNF家族生长因子的N-末端截短形式具有生物学活性(US6,184,200描述的截短的GDNF；WO 02/072826描述的截短的Neublastin)。据信Neurturin的N-末端截短形式也具有生物活性。本发明人预期使用编码人成熟Neurturin的C-末端101，100，99，98，97，或96个氨基酸组成的N-末端截短的Neurturin和相应截短的大鼠和小鼠蛋白质的DNA序列。相信具有与成熟蛋白质一样的生物活性的最短人蛋白形式由SEQ ID NO：9所示的96个氨基酸组成。同样，小鼠和大鼠蛋白可以将N-末端截短直到C-末端的96个氨基酸。目前据信必须有一个氨基酸残基存留在第一个经典半胱氨酸残基的N-末端。

通过去掉最后一个典型半胱氨酸残基C-末端的氨基酸残基也可截短C-末端。在人，小鼠，和大鼠中，这相当于缺失了一个C-末端氨基酸。在本发明的一个优选实施方案中，该C-末端氨基酸没有缺失。

III.治疗神经变性疾病的靶组织

使用包含神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)的编码序列的病毒载体治疗或预防或改善帕金森氏病的方法是熟知的。使用蛋白质注射，通过泵施用和通过体内基因治疗的临床前试验已经实现了将GDNF施用到CNS。许多研究描述了使用表达GDNF的AAV或慢病毒转导CNS细胞(Kordower，Ann Neurol，2003 53(suppl 3)，s120-s134；WO 03/018821，Ozawa等；US 2002187951，Aebischer等；Georgievska等，2002，Exp Nerol 117(2)，461-474；Georgievska等，2002，NeuroReport 13(1)，75-82；Wang等，2002，GeneTherapy，9(6)，381-389；US 2002031493，Rohne-Poulenc Rorer SA；US6,180,613 Roeckefeller University；Kozlowski等，2000，Exp Neurol，166(1)，1，15；Bensadoun 2000，Exp Neurol，164(1)，15-24；Connor等，1999，GeneTherapy，6(12)，1936-1951；Mandel等，1997，PNAS，94(25)，14083-88；Lapchak等，1997，Brain Research，777(1，2)，153-160；Bilang-Bleuel等，1997，PNAS94(16)，8818-8823)。这些方法可用于使用本发明的病毒载体将Neurturin施用到中枢神经系统。

体内基因治疗的一个重要参数是选择合适的靶组织。选择大脑区，因为它保持对神经营养因子，特别是Neurturin的响应能力。在人类，将对神经营养因子的响应能力保持到成人期的CNS神经元包括胆碱能前脑基底神经元，内嗅皮层神经元，丘脑神经元，蓝斑神经元，脊髓感觉神经元和脊髓运动神经元。保持有对Neurturin的响应能力的细胞的其它特征是表达Ret和两个共同受体GFRα1和GFRα2之一。

在包括AD，帕金森氏病，和肌萎缩性侧索硬化(ALS，也称为Lou Gehrig′s疾病)的许多神经变性疾病中涉及该神经元复合网络胆碱能区的异常。胆碱能前脑基底(具体地说，前脑基底的Ch4区)是特别合适的靶组织。

在灵长类前脑内，大细胞神经元Ch1-Ch4提供了对大脑皮层，丘脑和杏仁核的基底外侧核的胆碱能神经支配。在诸如AD的神经变性疾病受试者中，具有神经生长因子(NGF)受体的Ch4区(Meynert的下橄榄核)神经元与正常对照相比出现显著的萎缩(参见，例如，Kobayashi，等，Mol.Chem.Neuropathol.，15：193-206(1991))。

在正常受试者中，神经营养蛋白防止发育期间交感神经和感觉神经元死亡并防止成年大鼠和灵长类的胆碱能神经元变性(Tuszynski，等，GeneTherapy，3：305314(1996))。据信在前脑基底的该区域产生的功能性神经元丢失与患有诸如AD的神经变性症状的受试者经历的认知衰退有因果关联(Tuszynski，等，出处同上，和Lehericy，等，J.Comp.Neurol.，330：15-31(1993))。

在人类AD中，前脑基底神经元的丢失发生在直径大约1cm的实质内区域范围内。为了治疗该大区域内的受损神经元，需要在10个以上不同的体内基因载体施用位点用载体组合物治疗。然而，在治疗前脑基底的定向损伤时，大脑的受影响区可能更小，以便选择更少的施用位点(例如，5个或更少)就足以恢复临床上有效数量的胆碱能神经元。

重要的是，选择特异性体内基因施用位点使其聚集在神经元损伤的区域。可使用包括磁共振成像(MRI)和活组织检查的许多已知技术在临床上鉴定该区域。在人类，优选非侵入性体内成像方法，例如MRI。一旦鉴定了神经元损伤的区域，选择施用位点的立体定位分布以便将各单位剂量的NTN施用到大脑内的靶细胞，或离靶细胞500μm的范围内，且离另一施用位点不超过大约10mm。

IV.剂量要求和施用方法

另一重要的参数是施用到靶组织的Neurturin的剂量。在这点上，“单位剂量”一般是指每ml Neurturin组合物中Neurturin的浓度。对于病毒载体，Neurturin的浓度可通过每ml神经营养组合物的病毒颗粒数来限定。优选的是，对于使用病毒表达载体施用Neurturin，每个单位剂量的Neurturin包含2.5到25μL Neurturin组合物，其中该组合物包括在可药用的液体中的病毒表达载体且提供从10¹⁰到10¹⁵的Neurturin表达病毒颗粒每ml Neurturin组合物。这种高滴度特别适用于腺伴随病毒。对于慢病毒，该滴度一般较低，例如，按实施例所述测定为每ml从10⁸到10¹⁰转导单位(TU/mL)。

关于帕金森氏病治疗中Neurturin病毒剂量的教导可在关于使用体内基因治疗施用GDNF的许多引证参考文献中找到。

在一个优选的实施方案中，施用位点是大脑的纹状体，特别是尾状体(caudate)和/或壳核(putamen)。向壳核内的注射可标记位于大脑各种远端区域的靶位点，例如，苍白球，杏仁核，丘脑下核或黑质。对苍白球细胞的转导通常引起丘脑细胞的退行性(retrograde)标记。在一个优选的实施方案中，靶位点或靶位点之一是黑质。也可以在纹状体和黑质中都注射。

在给定靶位点内，载体系统可转导靶细胞。靶细胞可以是在神经组织中发现的细胞，例如，神经元，星形细胞，少突胶质细胞(oligodendrocyte)，小神经胶质细胞或室管膜细胞。在一个优选的实施方案中，靶细胞是神经元，特别是TH阳性神经元。

载体系统优选通过直接注射施用。注射进大脑(特别是纹状体)的方法是本领域熟知的(Bilang-Bleuel等，(1997)Proc.Acad.Nati.Sci.USA94：8818-8823；Choi-Lundberg等，(1998)Exp.Neurol.154：261-275；Choi-Lundberg等，(1997)Science 275：838-841；和Mandel等(1997)，Proc.Acad.Natl.Sci.USA 94：14083-14088)。可给予立体定位注射。

如上所述，为了在诸如大脑的组织中转导，必须使用非常小的体积，因此该病毒制品可通过超速离心进行浓缩。所得的制品应当至少具有10⁸t.u./ml，优选从10⁸到10¹⁰t.u./ml，更优选至少10⁹t.u./ml。(该滴度按实施例2所述以每ml的转导单位(t.u./ml)表示)。已经发现通过增加注射位点的数目并降低注射速率可提高转基因表达的分散(Horellou和Mallet(1997)，如上所述)。通常使用的注射点在1到10个之间，更常见的是2到6个之间。对于包含1-5×10⁹t.u./ml的剂量，注射速率通常在0.1到10μl/min之间，通常为大约1μl/min。

由于本发明提供的改进载体具有高分泌效率，因此与使用编码前-原-NTN的载体相比为获得临床效果需要注射的病毒组合物的体积更小。

通过显微注射，输注，刮开装载(scrape loading)，电穿孔或适合于通过手术切口直接将该组合物定向施用到施用位点组织的其它方法可将Neurturin组合物施用到靶组织中的各施用细胞位点。施用可缓慢完成，例如在大约5-10分钟内完成(依赖于给予的Neurturin组合物的总体积)。

本领域的技术人员将预料到本发明采用的定向施用方法排除了与体内基因治疗相关的限制性风险因素；即liyong携带编码Neurturin的转基因的载体转导非靶向细胞的潜力。在本发明中，施用是定向的且选择施用位点以便分泌的Neurturin的扩散发生在控制的和预定的大脑区域以优化与靶向d神经元的接触，同时最小化与非靶向d细胞的接触。

V.病毒载体

广义上说，基因治疗要求将新的遗传wuzhi转移到患者细胞从而对患者产生治疗益处。该益处包括治疗或预防大范围的疾病，紊乱和其它症状。

回体基因治疗方法涉及修饰分离的细胞，然后将其输注，移植或者植入患者。参见，例如，美国专利号4,868,116，5,399,346和5,460,959。体内基因治疗要求直接靶向体内的宿主患者组织。

用作基因转移载体的病毒包括乳多空病毒，腺病毒，牛痘病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒，和逆转录病毒。合适的逆转录病毒包括由HIV，SIV，FIV，EIAV，MoMLV组成的组。

用于治疗中枢神经系统疾病的优选病毒是慢病毒和腺伴随病毒。两种类型的病毒都无须细胞分裂就可整合进基因组，且两种类型都在用于神经系统，特别是中枢神经系统适应症的临床前动物试验中进行了试验。

制备AAV的方法在本领域中已有描述，例如US 5,677,158，US6,309,634，和US 6,451,306描述了将AAV施用到中枢神经系统的实施例。

具体和优选的逆转录病毒类型包括可转导细胞且无须细胞分裂就整合进其基因组的慢病毒。因此该载体优选是复制缺陷型慢病毒颗粒。可从包含5’慢病毒LTR，tRNA结合位点，包装信号，可操作地连接到编码所述融合蛋白的多核苷酸信号上的启动子，第二链DNA合成起点和3’慢病毒LTR的慢病毒载体产生该慢病毒颗粒。慢病毒的制备和体内施用到神经细胞的方法在US 20020037281(使用慢病毒载体转导神经细胞的方法)和US20020187951(慢病毒介导的生长因子基因治疗神经变性疾病)中描述。

逆转录病毒载体是人类临床试验中最常用的载体，由于它们携带7-8kb且由于它们具有感染细胞的能力且它们具有以高效率稳定整合进宿主细胞的遗传材料。参见，例如，WO 95/30761；WO 95/24929。肿瘤病毒(Oncovirinae)需要至少一轮靶细胞增殖以便将外源性核酸序列转移并整合进患者。逆转录病毒载体随机整合进患者基因组。

已经描述了3类逆转录病毒颗粒；可有效感染鼠细胞的亲嗜性和可感染许多物种细胞的兼嗜性。第三类包括异嗜性逆转录病毒，它可感染不同于产生该病毒的物种的另一物种的细胞。其仅整合进分裂细胞的基因组中的能力使得逆转录病毒对于在发育研究中标记细胞谱系和将治疗性或自杀基因施用到癌症或肿瘤中具有吸引力。这些载体在中枢神经系统的癌症治疗中特别有用，其中在成年患者中细胞分裂相对缺乏。

为了用于人类患者，逆转录病毒载体可以是复制缺陷型。它防止了在靶组织中进一步产生感染性逆转录病毒颗粒——相反复制缺陷型载体变成了稳定插入靶细胞基因组的“被俘”转基因。一般在复制缺陷型载体中，缺失了gag，env，和pol基因(与大多数剩余的病毒基因组一起)。插入异源性DNA代替缺失的病毒基因。异源性基因可以在内源性异源性启动子，在靶细胞中有活性的另一异源性启动子，或逆转录病毒5′LTR(病毒LTR在不同组织中有活性)的控制下。一般来说，逆转录病毒载体具有大约7-8kb的转基因容量。

复制缺陷型逆转录病毒载体需要提供复制和从例如，改造的包装细胞系反式装配(assembly in trans)所必需的病毒蛋白质。重要的是包装细胞不释放有能力复制的病毒和/或辅助病毒。这点可通过从缺少ψ信号的RNAs表达病毒蛋白质，并从分开的转录单位表达gag/pol基因和env基因来实现。另外，在一些2.和3.代逆转录病毒中，5’LTR′s被控制这些基因表达的非病毒启动子取代，且3’启动子最小化到仅含有邻近启动子。这些设计将导致产生有能力复制的载体，或辅助病毒的重组可能性最小化。参见，例如，美国专利号4,861,719，本文引用以供参考。

VI.表达载体

构建用于本发明的重组表达Neurturin的载体可使用对本领域的普通技术人员而言不需详细解释的常规技术来完成。然而，作为回顾，普通技术人员可能愿意查阅Maniatis等，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，冷泉港实验室(NY 1982)。

用于本发明的嵌合表达构建体可按实施例所述产生，例如通过PCR扩增所需片段(信号序列和Neurturin编码序列)并以重叠PCR融合它们。由于一些优选的信号序列相当短，用于扩增Neurturin编码序列的5’PCR引物包括编码信号序列的序列以及TATA框和其它调控元件。

简单地说，构建重组表达载体采用标准连接技术。为了分析证实构建的载体中序列的正确性，可使用例如，Messing，等，(Nucleic Acids Res.，9：309-，1981)的方法，Maxam，等，(Methods in Enzymology，65：499，1980)的方法，或本领域的技术人员已知的其它合适的方法测序该基因。

使用例如，Maniatis，等，(Molecular Cloning，第133-134页，1982)所述的常规凝胶电泳可进行裂解片段的大小分离。

基因的表达在转录，翻译或翻译后水平受到控制。转录开始是基因表达的早期关键性事件。它依赖于启动子和增强子序列且受到与这些序列相互作用的特异性细胞因子的影响。许多基因的转录单位包括启动子，在一些情况中包括增强子或调控元件(Banerji等，Cell 27：299(1981)；Corden等，Science209：1406(1980)；和Breathnach and Chambon，Ann.Rev.Biochem.50：349(1981))。对于逆转录病毒，与逆转录病毒基因组复制相关的控制元件位于长末端重复区(LTR)(Weiss等，编，The molecular biology of tumor viruses：RNAtumor viruses，Cold Spring Harbor Laboratory，(NY 1982))。莫洛尼鼠类白血病病毒(MLV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)LTRs含有启动子和增强子序列(Jolly等，Nucleic Acids Res.11：1855(1983)；Capecchi等，参见：Enhancer and eukaryoticgene expression，Gulzman和Shenk，编，第101-102页，冷泉港实验室(NY1991)。其它有效的启动子包括来自于巨细胞病毒(CMV)的启动子和其它野生型病毒启动子。

许多非病毒启动子的启动子和增强子区也有描述(Schmidt等，Nature314：285(1985)；Rossi和deCrombrugghe，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5590-5594(1987))。维持和增加静息细胞中转基因表达的方法包括使用启动子，该启动子包括胶原蛋白I型(1和2)(Prockop和Kivirikko，N.Eng.J.Med.311：376(1984)；Smith和Niles，Biochem.19：1820(1980)；de Wet等，J.Biol.Chem.，258：14385(1983))，SV40和LTR启动子。

根据本发明的一个实施方案，启动子是选自遍在蛋白启动子，CMV启动子，JeT启动子(US 6,555,674)，SV40启动子，和延伸因子1α启动子(EF1-α)的组成型启动子。

诱导型/抑制性启动子的例子包括：Tet-On，Tet-Off，纳巴霉素(Rapamycin)诱导型启动子，Mx1。

除了使用病毒和非病毒启动子驱动转基因表达外，可使用增强子序列增加转基因表达的水平。增强子不仅可增加其天然基因的转录活性而且也增加一些外源基因的转录活性(Armelor，Proc.Natl.Acad.Sci.USA70：2702(1973))。例如，在本发明中胶原蛋白增强子序列可与胶原蛋白启动子2(I)一起使用以增加转基因表达。另外，可使用在SV40病毒中发现的增强子元件增加转基因表达。该增强子序列由72个碱基对重复组成，其描述参见Gruss等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：943(1981)；Benoist和Chambon，Nature 290：304(1981)，和Fromm和Berg，J.Mol.Appl.Genetics，1：457(1982)，本文引用所有这些文献以供参考。该重复序列当以一连串的形式与各种启动子出现时可增加许多不同病毒和细胞基因的转录(Moreau等，Nucleic Acids Res.9：6047(1981))。

其它表达增强序列包括但不限于土拨鼠(Woodchuck)肝炎病毒转录后调控元件，WPRE，SP163，大鼠胰岛素II-内含子或其它内含子，CMV增强子，和鸡[β]-珠蛋白隔离体(insulator)或其它隔离体。

使用细胞因子调控启动子活性也可以增强转基因表达用于长期稳定的表达。已经报道了调节胶原蛋白2(I)和LTR启动子的转基因表达的一些细胞因子(Chua等，connective Tissue Res.，25：161-170(1990)；Elias等，Annals N.Y.Acad.Sci.，580：233-244(1990))；Seliger等，J.Immunol.141：2138-2144(1988)和Seliger等，J.Virology 62：619-621(1988))。例如，转化生长因子(TGF)，白介素(IL)-1，和干扰素(INF)下调诸如LTR的各种启动子驱动的转基因表达。肿瘤坏死因子(TNF)和TGF 1上调，且可用于控制，启动子驱动的转基因表达。可证实有用的其它细胞因子包括碱性(basic)成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)。

具有胶原蛋白增强子序列(Coll(E))的胶原蛋白启动子也可用于通过抑制在所治疗的大脑中由于其免疫保护状态产生的对该载体的其它任何免疫反应来增加转基因表达。另外，可将包括类固醇，例如地塞米松的抗炎剂在载体组合物施用后立即施用到所治疗的宿主中且优选继续施用直到任何细胞因子介导的炎症反应都平息。也可施用诸如环孢菌素的免疫抑制剂以减少干扰素的产量，后者下调LTR启动子和Coll(E)启动子-增强子，并减少转基因表达。

该载体可包含其它序列诸如编码Cre-重组酶蛋白的序列，和LoxP序列。保证neublastin临时表达的另一方法是通过使用Cre-LoxP系统，其导致在给细胞施用Cre-重组酶(Daewoong等，Nature Biotechnology 19：929-933)或者将编码重组酶的基因插入病毒构建体(Plück，Int J Exp Path，77：269-278)时它导致切除部分插入的DNA序列。在病毒构建体中插入重组酶基因与LoxP位点和结构基因(本发明情况中的neublastin)通常导致结构基因表达大约5天的时间。

VII.药用制剂

为了形成用于本发明的Neurturin组合物，可将编码Neurturin的表达病毒载体置于可药用的悬液，溶液或乳剂中。合适的介质包括盐水和脂质体制品。

更具体地说，可药用的载体包括无菌水性或非水性溶液，悬液，和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇，聚乙二醇，诸如橄榄油的植物油，和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。水载体包括水，乙醇/水性溶液，乳剂或悬液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外用载体包括氯化钠溶液，林格氏(Ringer′s)右旋糖，右旋糖和氯化钠，乳酸盐(lactated)林格氏液或不挥发油。

静脉内用载体包括液体和营养添加剂，电解质添加剂(例如以Ringer′s右旋糖为基础的添加剂)，等等。

也可以存在防腐剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂，和惰性气体等。另外，可使用本领域熟知的方法冻干Neurturin转基因组合物，用于随后根据本发明重建(reconstitution)和使用。

胶体分散系统也可用于靶向的基因递送。

胶体分散系统包括高分子复合物，纳米包囊(nanocapsules)，微球体，珠，和基于脂类的系统，包括水包油乳剂，微胶粒，混合微胶粒，和脂质体。脂质体是用作体外和体内施用载体的人工膜泡囊。已表明大小在0.2-4.0μm范围内的大型单层泡囊(LUV)可装进较大百分比的含有大型高分子的水性缓冲液。RNA，DNA和完整的病毒颗粒可包装进含水内层并以生物学活性形式递送给细胞(Fraley，等，Trends Biochem.Sci.，6：77，1981)。除了哺乳动物细胞外，脂质体可用于植物，酵母和细菌细胞中操作性编码型转基因(operatively encoding transgene)的递送。为了使脂质体成为有效的基因转移载体，应当存在下列特征：(1)高效包装编码Neurturin的基因而不损害其生物学活性；(2)与非靶细胞相比优先且大量与靶细胞结合；(3)将载体的水性内容物高效递送到靶细胞质；和(4)精确且有效表达遗传信息(Mannino，等，Biotechniques，6：682，1988)。

该脂质体的组合物通常是磷脂，具体是高相变温度磷脂的组合，通常与类固醇，特别是胆固醇组合。也可使用其它磷脂或其它脂类。脂质体的物理特性依赖于pH，离子强度，和二价阳离子的存在。

用于脂质体生产的脂类例子包括磷脂酰化合物，例如磷脂酰甘油，磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，脑苷脂，和神经节苷脂。特别有用的是二酰磷脂酰甘油，其中脂质部分含有14-18个碳原子，具体是16-18个碳原子，且是饱和的。举例性的磷脂包括卵磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。

可根据解剖和机械因素分类脂质体的靶向性。解剖学分类以选择性的水平为基础，例如器官特异性，细胞特异性，和细胞器特异性。机械靶向性可根据是被动还是主动来区分。被动靶向利用了脂质体分布到含有窦状隙毛细管的器官中的网状内皮系统(RES)的细胞的天然倾向。

另一方面，主动靶向涉及改变脂质体，其通过将脂质体偶联到诸如单克隆抗体，糖，糖脂，或蛋白质的特异性配体，或者通过改变该脂质体的组成或大小来进行，以实现靶向除天然存在的定位位点之外的器官和细胞类型。

靶向基因传递系统的表面可用各种方法修饰。对于脂质体靶向传递系统，脂类基团可掺入脂质体的脂双层以维持靶向与该脂质体双分子层稳定相连的配体。可使用各种连接基团来连接脂链与靶向型配体。

施用系统的另一例子包括将能够产生本发明所述载体颗粒的包装细胞组合物移植入治疗区。包囊化和移植该细胞的方法是本领域熟知的，具体参见WO 97/44065(Cytotherapeutics)。通过选择能够产生慢病毒颗粒的包装细胞系，获得对治疗区内非分裂细胞的转导。通过使用仅转导分裂细胞的逆转录病毒颗粒，可将转导限制在治疗区的从头分化的细胞。

VIII.细胞的包囊化

包囊化的细胞疗法依据的观点是在移植进宿主前通过用半透性生物相容性材料包围细胞可将细胞与受体宿主免疫系统隔离。本发明包括一种装置，其中将分泌Neurturin的细胞装入免疫隔离型包囊中。“免疫隔离型包囊”是指这样的包囊，其在植入受体宿主时将宿主免疫系统对装置核心中的细胞的有害作用最小化。通过将细胞密封在由微孔膜形成的可移植的聚合物包囊内可使所述细胞与宿主免疫隔离。该方法防止了宿主和植入组织之间的细胞与细胞的接触，消除了通过直接呈递产生的抗原识别。也可以对膜进行改变以根据分子量控制诸如抗体和补体的分子的扩散(Lysaght等，56 J.CellBiochem.196(1996)，Colton，14 Trends Biotechnol.158(1996))。使用包囊化技术，可将细胞移植进宿主而在使用或不用免疫抑制药物时均无免疫排斥。有用的生物相容性聚合物包囊通常含有包含悬浮于液体培养基或者固定在固定基质内的细胞的核心和不含分离的细胞，具有生物相容性，且足以防止核心内细胞受到有害免疫学攻击的通透选择性基质或膜的周围或外周区(“外套(jacket)”)。包囊化阻碍了免疫系统元件进入包囊，从而防止包囊化的细胞受到免疫破坏。包囊膜的半透性性质还允许感兴趣的生物学活性分子容易地从包囊扩散到周围宿主组织中。

包囊可由生物相容性材料制成。“生物相容性材料”是植入宿主后不会引发足以导致对包囊的排斥或例如通过降解使其不宜操作的有害宿主反应的材料。生物相容性材料对于诸如宿主免疫系统的成份的大分子具有相对的不透性，但是对于诸如胰岛素，生长因子，和营养成分的小分子具有通透性，同时允许除去代谢废物。各种生物相容性材料适合于通过本发明的组合物给予生长因子。许多生物相容性材料是已知的，且具有各种外表形态和其它机械和结构特征。优选的本发明的包囊与作为参考文献引用的PCT国际专利申请WO 92/19195或WO 95/05452；或者作为参考文献引用的美国专利号5,639,275；5,653,975；4,892,538；5,156,844；5,283,187；或美国专利号5,550,050所述的包囊相似。所述包囊允许代谢物，营养成分和治疗物质通过，同时最小化宿主免疫系统的有害影响。生物相容性材料的成份包括周围的半透膜和内部细胞支持用支架。优选的是，将转化的细胞接种到被通透选择膜包围的支架上。丝状细胞支架可由选自丙烯酸，聚酯，聚乙烯，聚丙烯聚乙腈，聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene teraphthalate)，尼龙，聚酰胺，聚氨酯，polybutester，蚕丝，棉花，几丁质，碳，或生物相容性金属的任何生物相容性材料制成。另外，结合的纤维结构可用于细胞植入(美国专利号5,512,600，作为参考文献引用)。可生物降解的聚合物包括由聚乳酸PLA，聚(乳酸-共乙醇酸)PLGA(poly(lactic-coglycolic acid)PLGA)，和聚乙醇酸PGA及其等同物组成的聚合物。泡沫支架已被用于提供移植细胞可附着的表面(PCT国际专利申请系列号98/05304，作为参考文献引用)。编织网状管已有用作血管移植物(PCT国际专利申请WO 99/52573，作为参考文献引用)。另外，该核心可由能稳定细胞位置的水凝胶形成的固定基质组成。水凝胶是凝胶形式的交联亲水聚合物的三维网络，基本上由水组成。

可使用各种聚合物和聚合物混合物制造周围半透膜，包括聚丙烯酸酯(包括丙烯酸共聚物)，聚二乙烯(polyvinylidene)，聚氯乙稀共聚物，聚氨酯，聚苯乙烯，聚酰胺，醋酸纤维素，硝酸纤维素，聚砜(包括聚醚砜)，含磷氮链聚合物，聚丙烯腈，poly(acrylonitrile/covinyl chloride)，及其衍生物，共聚物和混合物。优选的是，周围半透膜是生物相容性半透空心纤维膜。该膜及其制备方法由作为参考文献引用的美国专利号5,284,761和5,158,881公开。周围半透膜由聚醚砜空心纤维形成，例如作为参考文献引用的美国专利号4,976,859或美国专利号4,968,733所述的纤维。可供选择的周围半透膜材料是聚丙烯腈/共氯乙烯(poly(acrylonitrile/covinyl chloride))。

包囊可以是适合于维持生物学活性和提供递送该产品或功能的通道的任何外形，包括例如，圆柱形，矩形，盘状，片状，卵形，星形，或球形。另外，包囊可被缠绕或包裹进网状或嵌套结构。如果包囊在植入后需要取出，不能优选容易导致包囊从植入位点迁移的外形，例如小到足以在受体宿主血管中移动的球形包囊。诸如矩形，片状，盘状，圆柱形，和扁平片状的某些形状提供了更大的结构完整性且在需要取出的情况下是优选的。

当使用大包囊时，优选包装10³到10⁸个之间的细胞，最优选在每个装置中包装10⁵到10⁷个细胞。剂量可通过植入更少或更多数量的包囊，优选每个患者1到10个包囊得以控制。

支架可用细胞外基质(ECM)分子包裹。合适的细胞外基质分子的例子包括例如，胶原蛋白，层粘连蛋白，和纤连蛋白。支架的表面也可以通过用等离子辐射处理赋予电荷来进行修饰以增强细胞的粘附。

可使用任何合适的方法密封包囊，包括使用聚合物粘连或卷起，打结和加热密封。另外，也可使用任何合适的“干燥”密封方法，例如参见作为参考文献引用的美国专利号5,653,687所述。

该包囊化的细胞装置可按照已知的技术植入。本发明的装置和方法可用于许多植入位点。这些植入位点包括，但不限于，中枢神经系统，包括脑，脊髓(参见，作为参考文献引用的美国专利号5,106,627，5,156,844，和5,554,148)，和眼的房水和玻璃体(aqueous and vitreous humor)(参见，作为参考文献引用的PCT国际专利申请WO 97/34586)。

ARPE-19细胞系是基于包囊化细胞的递送技术的优质平台细胞系且也用于基于非包囊化细胞的递送技术。ARPE-19细胞系较顽强(即，该细胞系在诸如植入中枢神经系统或眼内环境的严谨条件下是有活力的)。ARPE-19细胞可被遗传修饰为分泌治疗性物质。ARPE-19细胞具有相对较长的生命周期。ARPE-19细胞是人类来源的。此外，包囊化的ARPE-19细胞在体内装置中具有较好的生存力。ARPE-19细胞可递送有效量的生长因子。ARPE-19细胞诱导可忽略的宿主免疫反应。然而，ARPE-19细胞是非致瘤性的。

将包囊植入CNS的方法和装置在US 5,487,739中描述。

在一个方面，本发明涉及生物相容性包囊，它包含：含有分泌病毒载体用于感染靶细胞的活包装细胞的核心，其中该病毒载体是根据本发明的载体；和包围所述核心的外套，所述外套包含可通透的生物相容性材料，所述材料具有选定允许大约100nm直径的逆转录病毒载体通过的孔，从而允许从所述的包囊释放所述的病毒载体。

优选的是，该核心还包含基质，通过该基质固定包装细胞。根据一个实施方案，该外套包含水凝胶或热塑性材料。

包囊化包装细胞的方法和装置在US 6,027,721中公开，在此引用其整体以供参考。

IX.医疗用途和治疗方法

在一个方面，本发明涉及根据本发明的载体用于制备治疗神经系统疾病的药物的用途。该神经系统疾病可以是外周神经系统或中枢神经系统的疾病。

治疗不仅是指治愈性的治疗而且还指防止性(不是绝对防止)或预防性治疗。治疗也可以是改善或针对症状的。

优选的CNS疾病是神经变性疾病或神经学疾病。神经变性疾病或神经学疾病可以是涉及受损害和受创伤的神经元(lesioned and traumatic neuron)的疾病，例如外周神经、延髓(medulla)、脊髓的创伤性损伤(traumatic lesion)，大脑局部缺血性神经元损伤(cerebral ischaemic neuronal damage)，神经病(neuropathy)，外周神经病(peripheral neuropathy)，神经病性疼痛(neuropathicpain)，阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)，亨廷顿氏舞蹈病(Huntington’sdisease)，帕金森氏病(Parkinson’s disease)，肌萎缩性侧索硬化(amyotrophiclateral sclerosis)，与痴呆相联系的记忆损伤(memory impairment connected todementia)。多发性硬化的神经变性成份也是根据本发明可治疗的。

根据本发明的一个优选的实施方案，神经变性疾病是帕金森氏病(见实施例)。

在另一优选的实施方案中，该疾病是肌萎缩性侧索硬化或脊髓损伤。

本发明的载体也可用于治疗眼病，例如色素性视网膜炎(retinitispigmentosa)，黄斑变性(macular degeneration)，青光眼(glaucoma)，糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy)。

神经系统疾病可通过给需要的个体施用治疗有效量的本发明的病毒载体；或者治疗上有效量的本发明的药用组合物来进行治疗。

对于帕金森氏病，包囊和病毒载体的施用在上文“剂量要求和施用方法”部分中描述。对于ALS和脊髓损伤，含有分泌Neurturin的细胞或病毒载体的包囊可通过心室内(intraventricularly)或腰椎内(intralumbarly)施用到鞘内空隙。对于脊髓损伤，也可施用到具有损伤和/或创伤神经元的区域。包囊或病毒载体可递送到接近下运动神经元的颈/腰膨大区。特别是对于ALS，将编码本发明的表达构建体的经修饰的狂犬病病毒注射进患病的肌肉组织，实现由此逆向运输到患病的运动神经元。

尽管本发明集中在体内基因治疗，但是也涉及通过给需要的个体移植如下物质来治疗神经系统疾病：

i.治疗有效量的根据本发明的经转导的细胞；

ii.包含经转导的细胞的植入装置；或

iii.包含包装细胞系的生物相容性装置。

所述的移植包含自体移植，同种异体移植或异种移植。

如果不是全部的话，大多数眼科的疾病和病症与如下三种类型适应症中的一种或多种相关：(1)血管生成，(2)炎症，和(3)变性。为了治疗这些疾病，本发明的病毒载体，治疗性细胞和包囊化的细胞允许将Neurturin递送到眼睛。

使用经视网膜下注射，经玻璃体内注射，或透巩膜(transcleral)注射可完成根据本发明的病毒载体的递送。

例如，糖尿病性视网膜病的特征在于血管生成和视网膜变性。本发明涉及通过在眼内，优选在玻璃体内，或者在眼周，优选在巩膜外层区下部(sub-Tenon′s region)植入装置来递送NTN从而治疗糖尿病性视网膜病。我们最优选将包囊，裸露的细胞，或者病毒载体递送到玻璃体用于该适应症。视网膜病包括，但不限于，糖尿病性视网膜病，增生性玻璃体视网膜病，和中毒性视网膜病。

葡萄膜炎涉及炎症和继发变性。本发明涉及通过在眼内优选在玻璃体或前房植入分泌NTN的包囊或裸露细胞或者通过将根据本发明的病毒载体施用到玻璃体来治疗葡萄膜炎。

作为比较，色素性视网膜炎的特征在于原发性视网膜变性。本发明涉及通过在眼内优选在玻璃体中放置分泌NTN的装置或裸露细胞或者通过将根据本发明的病毒载体施用到玻璃体来治疗色素性视网膜炎。

老年相关性黄斑变性涉及血管生成和视网膜变性。本发明涉及通过使用本发明的包囊或裸露细胞经眼内递送NTN，优选递送到玻璃体，或者通过使用根据本发明的病毒载体经眼内递送NTN，优选递送到玻璃体来治疗该疾病。老年相关性黄斑变性包括，但不限于，干性老年相关性黄斑变性，渗出性老年相关性黄斑变性，和近视性变性(myopic degeneration)。

青光眼的特征在于眼压增加和视网膜神经节细胞损失。本发明涉及的青光眼治疗包括用包囊，裸露细胞的病毒载体经眼内，优选经玻璃体内递送防止视网膜细胞受到青光眼相关性损伤的NTN。

通过眼内，优选在玻璃体中，我们以每天每个患者每眼从50pg到500ng，优选100pg到100ng，且最优选1ng到50ng的剂量范围施用Neuturin。对于经眼周施用，优选在巩膜外层间隙或区域的下部(sub-Tenon’s space orregion)，预期略高的剂量范围为每天每个患者高达1μg。

本发明可用于治疗眼新血管形成，其为与许多眼疾病和障碍相关且导致大多数视力丧失的一种疾病。例如，我们预期治疗视网膜局部缺血相关性眼新血管形成，其为糖尿病和许多其它疾病中失明的主要原因；致使患者容易出现角膜移植失败的角膜新血管形成；和与糖尿病性视网膜病，中心视网膜血管闭塞，和可能与老年相关性黄斑变性相关的新血管形成。

在本发明的一个实施方案中，分泌生物活性Neurturin的活细胞包装在包囊中并通过手术插入(在眼球后麻醉的条件下)眼玻璃体中。对于玻璃体放置(vitreal placement)，可通过巩膜植入该装置，其中部分装置或固定物(tether)突出通过巩膜。最优选的是，该装置的整体植入玻璃体中，没有部分装置伸进或者通过巩膜。优选该装置固定于巩膜(或者其它合适的眼组织)。该固定物可包括缝合针眼，或任何其它合适的固定方法(参见例如，US 6,436,427)。该装置可按需要在玻璃体中保留足够长的时间以完成所需的预防或治疗。例如，该治疗包括促进神经元或光感受器存活或修复，或抑制和/或逆转视网膜或脉络膜新血管形成，以及抑制眼色素层，视网膜，和视神经炎症。该实施方案优选用于将NTN施用到视网膜。

对于玻璃体放置，可将NTN递送到视网膜或RPE。

在另一实施方案中，在眼周，称为眼球筋膜(Tenon′s capsule)的间隙内和下方植入装载有细胞的装置。该实施方案比植入玻璃体的侵入性更小，因此一般是优选的。该施用途径也允许将NTN递送到RPE或视网膜。该实施方案对于治疗脉络膜新血管形成和视神经和葡萄膜的炎症是特别优选的。一般来说，从该植入位点递送允许将NTN循环到脉络膜脉管系统，视网膜脉管系统，和视神经。

根据该实施方案，我们优选将NTN经眼周施用(植入眼球筋膜下方)到脉络膜脉管系统以治疗黄斑变性(脉络膜新血管形成)。

使用本发明的装置和方法将NTN直接递送到脉络膜脉管系统(经眼周)或玻璃体(经眼内)可允许治疗不确定或隐藏的(occult)脉络膜新血管形成。其也提供了通过辅助或维持治疗减少或防止复发脉络膜新血管形成的方法。

可通过本领域已知的任何合适的方法改变剂量。包括改变(1)每个装置中细胞的数目，(2)每只眼中装置的数目，或(3)每个细胞的NTN产生水平。我们优选使用每个装置10³到10⁸个细胞，更优选每个装置5*10⁴到5*10⁶个细胞。

X.宿主细胞

在一个方面，本发明涉及用根据本发明的载体转导的分离宿主细胞。这些细胞优选是哺乳动物宿主细胞，因为它们能够分泌并正确加工编码的Neurturin。

优选的物种包括由啮齿动物(小鼠，大鼠)，兔，狗，猫，猪，猴，人类组成的组。

作为用本发明的载体转导的较好候选物的原代培养物和细胞系的例子包括由CHO，HEK293，COS，PC12，HiB5，RN33b，神经元细胞，胎儿细胞，ARPE-19，MDX12，C2C12，HeLa，HepG2，纹状体细胞，神经元，星形细胞，中间神经元组成的组。

本发明还涉及适合于通过裸露或包囊化细胞来生物递送NTN的细胞，它被遗传修饰成过度表达NTN，且可移植到患者中以局部递送生物活性的NTN多肽。该细胞可广义地称为治疗性细胞。

在本发明的一个优选的实施方案中，治疗性细胞系没有通过插入异源性永生化基因被永生化。由于本发明涉及特别适合于细胞移植的细胞，不论是作为裸露细胞还是优选作为包囊化细胞，因此该永生化细胞系较不优选，因为存在这样的固有风险，即它们在人体内以不受控制的方式开始增殖并可能形成肿瘤。

优选的是，该治疗性细胞系是接触抑制细胞系。接触抑制细胞系是指在培养皿(Petridish)中培养时生长到汇合并随后基本上停止分裂的细胞系。它不排除有限数目的细胞逃离该单层的可能性。接触抑制细胞系也可以在3D，例如包囊内生长。在包囊内，该细胞也可以生长到汇合，然后增殖速率明显缓慢下来或完全停止分裂。具体优选的细胞类型包括上皮细胞，其特性在于是接触抑制的且在培养基中形成稳定的单层。

甚至更优选的是视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)。RPE细胞的来源是通过从哺乳动物视网膜的原代细胞分离。收获RPE细胞的方法是已知的(Li和Turner，1988，Exp.Eye Res.47：911-917；Lopez等，1989，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.30：586-588)且被认为是一种常规方法。在RPE细胞共移植的大多数公开报道中，细胞来自于大鼠(Li和Turner，1988；Lopez等，1989)。根据本发明，RPE细胞来自于人类。除了分离的原代RPE细胞外，培养的人RPE细胞系可用于实施本发明。

在另一实施方案中，治疗性细胞系选自：人成纤维细胞系，人星形细胞系，人中脑细胞系，和人内皮细胞系组成的组，所述细胞优选用TERT，SV40T或vmyc永生化。

产生永生化人星形细胞系的方法以前已有描述(Price TN，Burke JF，Mayne LV.具有星形细胞特异性神经递质功能的新型人星形细胞系(A735)。In Vitro Cell Dev Biol Anim.1999年5月，35(5)：279-88)。该方法可用于产生星形细胞系。

优选对该方法进行如下3种修饰以产生另外的人星形细胞系。

使用从5-12周大的胎儿分离的人胎儿脑组织代替12-16周大的组织。

使用永生化基因v-myc，或TERT(端粒酶)代替SV40T抗原。

使用逆转录病毒基因转移代替通过磷酸钙沉淀技术利用质粒的转染。

XI用于Neurturin产生细胞(Neurturin producing cell)的支持基质

本发明还包括在植入哺乳动物神经系统或眼中之前在支持基质上体外培养Neurturin产生细胞。设计为在植入前将细胞预先附着在微载体上以增强移植细胞的长期存活力并提供长期的功能益处。

为了增强被移植细胞即被移植的NTN-分泌细胞的长期存活力，可在移植前将待移植的细胞体外附着到支持基质上。支持基质的材料包括这样的材料，体外保温后细胞可附着于其上，且在其上细胞能够生长，且可植入哺乳动物身体而不产生可能破坏植入细胞或者干扰其生物学或治疗活性的有毒反应，或炎症反应。该材料可以是合成的或天然化学物质，或者具有生物学来源的物质。

基质材料包括，但不限于，玻璃和其它氧化硅，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，聚偏二氟乙烯，聚氨酯，聚藻酸盐(polyalginate)，聚砜(polysulphone)，聚乙烯醇，丙烯腈聚合物，聚丙烯酰胺，聚碳酸酯，polypentent，尼龙，淀粉酶，天然和经修饰的明胶和天然及经修饰的胶原，天然和经修饰的多糖，包括葡聚糖和纤维素(例如，硝化纤维素)，琼脂，和磁铁矿。可使用能再吸收或不可再吸收的材料。另外还包括本领域熟知的细胞外基质材料。细胞外基质材料可从商业途径获得或者通过培养分泌该基质的细胞来制备，去掉该分泌细胞，并使得待移植的细胞与该基质相互作用并附着于其上。待植入的细胞生长于其上，或者该细胞与其混合的基质材料可以是RPE细胞的固有(indigenous)产物。因此，例如，基质材料可以是由待植入的RPE细胞产生和分泌的细胞外基质或基底膜材料。

为了提高细胞的粘着，存活和功能，固体基质任选在其外表面上用本领域已知的因子包裹以促进细胞粘着，生长或存活。该因子包括细胞粘着分子，细胞外基质，例如，纤连蛋白，层粘连蛋白，胶原蛋白，弹性蛋白，糖胺聚糖，或蛋白聚糖或生长因子。

作为选择，如果被植入的细胞附着其上的固体基质由多孔材料构成，可将生长因子或存活促进因子或者多种因子掺入基质材料中，植入后在体内从其中将它们缓慢释放出来。

当附着到根据本发明的支持物上时，用于移植的细胞一般在支持物的“外表面”。支持物可以是固体或多孔的。然而，实际上在多孔支持物中，细胞与外部环境直接接触而没有隔膜或其它障碍。因此，根据本发明，即使细胞附着的表面是不在颗粒或者珠本身外部的多孔支持材料的内部折叠或卷曲形式，该细胞也被认为是在该支持物的“外表面”。

支持物的外形优选是球形，如以珠子的形式，但是也可以是圆柱形，椭圆形，扁平片状或条状，针或大头针形，等等。支持物基质的优选形式是玻璃珠。另一优选的珠是聚苯乙烯珠。

珠子的大小范围为从大约10μm到1mm直径，优选从大约90μm到大约150μm。关于各种微载体珠的描述，参见，例如，isher Biotech Source 87-88，Fisher Scientific Co.，1987，第72-75页；Sigma Cell Culture Catalog，SigmaChemical Co.，St，Louis，1991，第162-163页；Ventrex Product Catalog，VentrexLaboratories，1989；在此引用这些参考文献以供参考。珠子大小的上限可由珠子刺激的可干扰移植细胞功能并引起周围组织损伤的不良宿主反应来确定。珠子大小的上限也可由施用方法来确定。本领域的技术人员可容易地确定该界限。

XII.体外生产Neurturin

在另一方面，本发明涉及能够以超过500ng/10⁶个细胞/24小时的量分泌neurturin或其功能等同物的哺乳动物细胞。优选的是该细胞能够以至少1000ng/10⁶个细胞/24小时，更优选至少5000，更优选至少10,000，更优选至少15,000，更优选至少20,000，更优选至少25,000，更优选至少30,000，更优选至少35,000ng/10⁶个细胞/24小时的量分泌。如实施例1所示，最佳质粒转染的ARPE19细胞以超过20,000ng/10⁶个细胞/24小时产生。通过包含诸如WPRE(US 6,136,597)的增强子元件甚至可进一步增加表达。与现有技术的BHK细胞(Hoane等2000，Experimental Neurology 162：189-193)相比，这些量非常高。

该高产细胞选自ARPE19细胞，CHO细胞，BHK细胞，R1.1细胞，COS细胞，杀伤细胞，辅助T-细胞，细胞毒性T-淋巴细胞和巨噬细胞组成的组。HEK293细胞和HiB5细胞也是合适的生产细胞。

因此通过培养这些细胞并从培养基中回收neurturin可大量产生Neurturin或其截短的或突变的形式或生物活性序列变异体。哺乳动物产生的Neurturin不需重折叠以具有生物活性。另一优势在于以成熟肽分泌Neurturin且不包含前体肽。本发明人已证实以前-原-Neurturin表达Neuturin导致分泌原-Neurturin，它不能结合GFRα1或GFRα2且因此没有生物活性。

这些Neurturin生产细胞同样可用于治疗目的且可作为裸露(有载体或无载体)或者作为包囊化的细胞植入用于生物活性Neurturin的局部递送。

实施例：

实施例1：用Neurturin构建体的体外转染

材料和方法

基因组NTN序列的克隆

使用PureGene试剂盒(Gentra，Biotech Line，Denmark)从HEK293细胞系(ATCC，USA)纯化的基因组DNA克隆人基因组NTN。用引物NTNgenom.ls+BamHI(5’-TATAGGATCCGGAGGACACCAGCATGTAG-3’，SEQ ID No.52)和NTNgenom.las(5’-TCGCCGAGGATGAATCACCA-3’；SEQID No.53)使用HEK293 gDNA作模板进行PCR。pfx聚合酶(Invitrogen，Denmark)在添加5％ DMSO(Sigma-Aldrich，Denmark)的其相应缓冲液中使用。使用BamHI和XhoI限制性位点将获得的PCR片段克隆进pNS1n(NeuroSearch)，即pcDNA3neo(InVitrogen)的一种常规设计的衍生物，产生载体pNS1n.hNTNgenom。这导致编码成熟NTN的序列(SEQ ID No.7)的克隆。

载体构建

IgSP-NTN表达载体pNS1n.IgSP.NTN的克隆：NTN的成熟片段使用引物NTNs-IgSP.Flap(5’-GGTGAATTCGGCGCGGTTGGGGGCGCGGCCT-3’，SEQ ID No 54)和NTN-594as+XhoI(5’-TATACTCGAGTCACACGCAGGCGCACTCGC-3’；SEQ ID No 55)从pNS1n.hNTNgenom载体通过PCR扩增。在第二个PCR反应中，使用引物IgSPKozakls+BamHI

(5’-TATAGGATCCGCCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATC-3’；SEQ  IDNo.56)和IgSPas-NTN.Flap

(5’-CCAACCGCGCCGAATTCACCCCTGTAGAAAG-3’；SEQ ID No.57)从pNUT-IgSP-CNTF载体(US 6,361,771)扩增IgSP序列。在第三个PCR反应中，两个片段通过重叠融合。等量的两个产物用作模板，使用引物IgSPKozakls+BamHI和NTN-594as+XhoI。

为了产生基于质粒的表达载体，将所得的片段克隆进用BamHI/XhoI消化的pNS1n中。在该载体中，IgSP-NTN序列置于CMV启动子的转录控制下(见图3)。此外，该载体含有在哺乳动物细胞中表达时赋予G418抗性的Neo基因。编码IgSP-NTN的片段的核苷酸序列在图13中给出。

细胞培养

ARPE-19，一种自发产生的(spontaneous arising)人视网膜色素上皮细胞系(Dunn等，1996)在37℃5％CO2中生长。生长培养基由含有Glutamax(Invitrogen，Denmark)并添加10％胎牛血清(Sigma-Aldrich，Denmark)的DMEM/Nutrient Mix F-12组成。细胞每周以1∶5的比例传代大约两次。

瞬时转染试验

ARPE-19细胞用一系列NTN表达载体转染。简单地说，细胞以10⁵个细胞/孔的密度接种在6-孔平板(Corning Costar，Biotech Line，Denmark)上。第二天，使用Fugene6(Roche，Germany)按照厂商说明书以一式两孔用NTN表达质粒转染细胞。转染后72h，从细胞上清取样品等分试样用于RetL2和NTN ELISAs。收获细胞用于western印迹分析。

稳定转染

ARPE-19细胞以2.4*10⁶个细胞/瓶的密度接种进T150“peel-off’瓶(TPP，Switzerland)中。使用Fugene6用10μg DNA/瓶转染细胞。转染后72h，向生长培养基中加入800μg/ml G418(Sigma-Aldrich，Denmark)用于选择稳定克隆。形成不同克隆后，扩增单个克隆用于进一步分析。

NTN ELISA

在该常规免疫测定中，使用NTN-特异性抗体从样品中结合并检测NTN。简单地说，Maxisorp平板(Nunc，Denmark)用含1μg/ml单克隆抗人NTN抗体(#MAB387，R&D Systems，TriChem，Denmark)的包被溶液(0.0025MNa₂CO₃/0.0025M NaHCO₃，pH＝8.2)在4℃温育16小时进行包被。在PBST(含0.05％Tween-20(Sigma-Aldrich，Denmark)的PBS(Invitrogen，Denmark))中洗涤后，在封闭缓冲液(含1％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich，Denmark)和5％蔗糖的PBS)中在室温封闭孔1小时。在PBST中洗涤后，用来自NTN-产生细胞的培养基样品在ARPE-19生长培养基中的稀释液和用作标准的重组NTN(#387-NE，R&D Systems，TriChem，Denmark)在室温温育孔3小时。向孔中加入含1μg/ml多克隆抗人NTN抗体(#AF387，R&D Systems，TriChem，Denmark)的封闭缓冲液并在4℃温育16小时。在PBST中洗涤后，在含0.02％抗山羊-HRP(DAKO，Denmark)的补充有1％正常小鼠血清(DAKO，Denmark)的封闭缓冲液中在室温温育孔2小时。在PBST中洗涤后，加入TMB底物溶液(Promega，Ramcon，Denmark)并在在室温进行温育15分钟。通过向孔中加入1N HCl终止颜色形成，使用ELX-800平板阅读器(Cambrex，Denmark)测量A₄₅₀。

RetL2 ELISA

RetL2 ELISA检测Ret-AP偶联物与结合到NTN-特异性GFRα2受体的NTN复合物的结合。简单地说，Opti-plate平板(Packard Instruments，PerkinElmer，Denmark)用100μl含1μg/ml山羊抗人Fc(Jackson ImmunoresearchLaboratories，TriChem，Denmark)的50mM NaHCO₃(pH＝9.6)在4℃包被16小时。在PBST中洗涤后，在含0.2％I-Block(Tropix，Roche，Denmark)的PBST中在室温封闭孔1小时，接着在PBST中短暂洗涤。随后NTN-产生细胞的样品和重组NTN在ARPE-19生长培养基中的标准稀释液在含有1μg/mlGFRα2/Fc融合蛋白(R&D Systems，TriChem，Denmark)的RET-AP经调节的培养基(Biogen，USA)的孔中在室温温育1.5小时。然后首先在PBST，然后在AP-缓冲液(200mM Tris(pH＝9.8)，10mM MgCl₂)中洗涤孔，接着用含10％Sapphire Enhancer(Tropix，Roche，Denmark)和2％CSPD(Tropix，Roche，Denmark)的AP-缓冲液温育30分钟。定量发光。

Western印迹

细胞在PBS中洗涤并在96℃样品缓冲液(2％SDS，0.4M Tris(ph＝8.0)，10mM二硫苏糖醇和0.25Na₃VO₄)中裂解。使用MultiPhor II系统，按照厂商建议(Amersham Pharmacia，Denmark)，通过变性SDS-PAGE分离蛋白质并印迹到PVDF膜(BioRad，Denmark)上。为了对膜进行免疫染色，采用标准Western印迹技术(Maniatis，XX)。多克隆NTN#AF477抗体(R&D Systems，TriChem，Denmark)用作检测抗体。膜使用ECL系统(Amersham Pharmacia，Denmark)显影并进行胶片曝光。

结果

IgSP元件介导自培养细胞的NTN释放的明显增加。

从瞬时转染的细胞，IgSP表达载体导致与wtNTN和pp(GDNF)-NTN质粒相比分泌到细胞培养物上清的NTN强烈增加。使用GDNF信号肽和前肽与天然NTN信号肽相比也提高分泌，但没有达到与IgSP元件相同的程度。IgSP对NTN分泌的积极影响可使用针对NTN产生的抗体通过标准ELISA技术(图4)以及通过功能性RetL2ELISA试验(图5)来检测，其中NTN与其受体GFRα2的结合通过与GFR共同受体Ret形成的第三复合物来检测。值得注意的是，用两种ELISA测定时，野生型NTN前原肽用GDNF，即已知在重组细胞中大量表达的因子，的前原肽替换都没有导致NTN蛋白表达的明显增加。

缺少前肽元件似乎影响细胞内的NTN蛋白质加工

用重组neurturin作对照通过变性凝胶电泳从经转染的细胞的溶胞产物分离蛋白质。仅在用IgSP-NTN转染细胞的溶胞产物上样的泳道中，观察到与重组neurturin大小相似的带(图6，位于6.4和21.3kDa标记之间的带)。对于wtNTN和pp(GDNF)-NTN转染的细胞，NTN抗体检测到的主要蛋白质比来自细胞的重组NTN和IgSP具有明显更高的分子量。该结果与IgSP-NTN在体外的表达明显更好的观察结果相结合，表明IgSP-NTN，而不是wtNTN和pp(GDNF)-NTN通过细胞内机制对分泌进行正确加工。

分离克隆的高NTN表达

稳定表达NTN的ARPE-19细胞通过用pNS1n.IgSP.NTN转染接着用G418选择克隆来分离。NTN表达水平的范围从分离的克隆获得(图7)。最高生产株，即ARPE-19/pNS1n.IgSP.NTN#24产量高达2000ng NTN/10⁵个细胞/24小时。

实施例2：用Neurturin体内转导大鼠

材料和方法

慢病毒IgSP-NTN构建体和病毒原种的产生

为了产生慢病毒构建体，通过用BamHI和XhoI切下GFP并插入IgSP-NTN作为BamHI/XhoI片段进行代替来将IgSP-NTN片段(实施例1)克隆进pHR′-CMV-GFP-W-SIN(见图8)。pHR′-CMV-GFP-W-SIN是包括WPRE元件的自我失活慢病毒转移构建体pHR’-SIN_-18的衍生物(Dull等，J.Virol.，72(11)：8463-71(1998)；Zufferey等，J.Virol.，72(12)：9873-80(1998)：Zufferey等，J.virol.，73(4)：2886-92(1999))。

通过将pHsC.IgSP.NTN.W与pMD.G(VSV-G假型载体)和pBR8.91(包装载体)(Zufferey等，Nat.Biotech.，15：871-75(1997))共转染进293T细胞反式(intrans)提供所需的病毒蛋白来产生复制缺陷型LV-sC.IgSP.NTN.W病毒颗粒。简单地说，在含4.5g/l葡萄糖和glutamax(Life Technologies，32430-027)并添加10％FCS(Life Technologies，10099-141)的DMEM中培养的293T细胞在转染前一天接种到T75瓶(2×106细胞/瓶)中。对于每个T75瓶，用5μgpMD.G，15μg pBR8.91和20μg转移载体、使用Lipofectamine+按照厂商说明书转染细胞。转染后2-3天收集含有病毒的细胞上清，通过0.45μm醋酸纤维素或多磺酸滤膜过滤灭菌并以50,000xg 4℃超速离心90分钟浓缩。第二轮超速离心后，将浓缩的病毒沉淀重悬于DMEM中，分成等分并贮存于-80℃。为了测定病毒滴度，测定逆转录酶(RT)活性(Cepko和Pear，CurrentProtocols in Molecular Biology，9.13.5-6，supplement 36)，使用具有已知转导活性的EGFP慢病毒作为对照从测定的RT活性计算转导单位(TU)/ml。

利用人和鼠前-原-NTN，前-原-GDNF，和GFP制备相似病毒批次(virusbatch)。

手术操作

使用总共21只年轻成年雌性Sprague-Dawley大鼠(B&K Universal，Stockholm，Sweden)，并在12小时光：暗周期和随意获取大鼠食物和水的条件下圈养。病毒注射和6-OHDA损伤按照Rosenblad等(2000)进行。注射操作在图9中说明。简单地说，以携带GFP，hNTN，mNTN，IgSP-hNTN或GDNF cDNA的rLV载体对异氟烷(isoflourane)麻醉(1.5-2％)的动物(n＝6/组)进行注射。以如下坐标：AP＝1.0mm，ML＝2.6mm，DV₁＝5.0mm DV₂＝4.5mm，和AP＝0.0mm，ML＝3.7mm，DV₁＝5.0mm，DV₂＝4.5mm沿两个针束(needle tracts)在纹状体中制备4个药池(deposits)(0.5μl/1×10⁸t.u./mL的药池)。齿状线(tooth bar)位于-3.3mm处。rLV注射后14天，再麻醉动物并用10-μl Hamilton注射器将单个药池的20μg 6-OHDA(Sigma；以自由基计算并溶于添加了0.02％抗坏血酸的3μl冰冷盐水中)按如下坐标注射进右侧纹状体中：AP＝1.0mm；相对于前囟ML＝3.0mm；相对于硬脑膜DV＝5.0mm，且切线(incisor bar)调到0.0mm。

组织学

6-OHDA注射后21天时，用戊巴比妥钠深度麻醉动物并用盐水穿心(transcardially)灌注1分钟接着用200ml冰冷的含4％PFA的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)穿心灌注。解剖大脑并在相同固定液中后固定3-4h，然后转移进25％蔗糖/0.1M磷酸盐缓冲液中48h。在冰冻切片机上切下5个连续的40-μm切片。通过用山羊抗hNTN或山羊抗-hGDNF一级抗体(R&D Systems；1∶2000溶于含2％正常马血清和0.25％triton X-100的磷酸盐缓冲液中)温育切片然后用生物素标记的马抗小鼠抗体(Jackson Immunoresearch，USA)温育2小时，并按照厂商说明使用抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC)试剂盒(Vector Laboratories，USA)进行hNTN和hGDNF的免疫组织化学。最后，使用3’3’-二氨基联苯胺作色原进行颜色反应。

结果

hNTN的免疫组织化学定位：

观察染色hNTN的切片表明，在接受编码野生型hNTN的慢病毒载体注射(rLV-hNTN)的动物纹状体中，在经转导的纹状体细胞附近没有发现细胞外免疫反应(图10)。相反，接受rLV-IgSPhNTN注射的动物在转导位点周围的纹状体中具有弥漫性扩散(细胞外)的免疫反应物质的显著染色模式(图10)。

hNTN的功能：

通过计数黑质TH+(多巴胺能)神经元来评估hNTN的神经保护效应。与完整侧相比，接受6-OHDA损伤和rLV-GFP病毒的动物黑质中保留明显更少的TH+神经元(23+/-3.4％)。接受rLV-hNTN的动物也显示出显著的损伤诱导的TH+神经元减少(30+/-7.7％保留)。相反，在rLV-IgSPNTN处理的组中，损伤侧TH+神经元的数目为完整侧的91+/-1.2％，与接受GDNF治疗的组中的观察结果(86+/-3.2％)相似。

实施例3：制备NTN表达构建体

载体构建. pHR’-CMV.SIN.hNTN.WPRE：按如下方法将野生型人前原NTN克隆进pHR’-CMV.SIN-PLT7.WPRE：pHR’-CMV.SIN-PLT7.WPRE是通过在BamHI和XhoI位点之间添加多接头(未公开结果)产生的含有土拨鼠后调节元件(WPRE)(Zufferey等，1998；Zufferey等，1999)的pHR’-CMV-SIN-18的衍生物，将它用BamHI和XhoI消化。人前原NTN作为BamHI，XhoI片段从载体pJDM2174(＝含人前原NTN的pBluescript)(JeffMilbrandt惠赠)上切下，并连接进BamHI/XhoI消化的慢病毒转移载体中。人前原NTN用作对照。

pNS1n.hNTN：按实施例1所述制备。

pNS1n.ppGDNF.hNTN：GDNF的前原区使用下列引物：5’引物：5’-TATAGAATTCGCCACCATGAAGTTATGGGATGTCG-3’(SEQ ID No.58)和3’引物：5’-CCAACCGCGCCCTTTTCAGTCTTTTAATGG-3’(SEQ IDNo.59)从全长人GDNF克隆经PCR扩增。该3’引物在3’端含有成熟NTN 5’端的10个碱基。使用下列引物：5’引物：5’-ACTGAAAAGGGCGCGGTTGGGGGCGCGGCCT-3’(SEQ ID No.60)和3’引物：5’-TAGACTCGAGGTCGACGGTATC-3’(SEQ ID No.61)从人全长NTN(pJDM2174)PCR扩增成熟人NTN。该5’引物含有人GDNF原区3’端的10个碱基。使用下列引物：5’引物：5’-TATAGAATTCGCCACCATGAAGTTATGGGATGTCG-3’(SEQ ID No.58)和3’引物：5’-TAGACTCGAGGTCGACGGTATC-3’(SEQ ID No.61)通过重叠PCR将前原GDNF与成熟NTN融合。所得的前原GDNF-成熟NTN片段用EcoRI和XhoI消化并插入表达载体pNS1n(上文所述)的EcoRI和XhoI位点之间。该核苷酸序列和编码的多肽在图14中给出。

pHR’-CMV.SIN.IgSP.NTN.WPRE和pNS1n.IgSP.NTN：小鼠免疫球蛋白重链基因V-区的信号肽(GenBank acc.#：M18950)(IgSP)使用下列引物：5’引物：5’-TATAGGATCCGCCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATC-3’(SEQ ID No56)，3’引物：5’-CCAACCGCGCCGAATTCACCCCTGTAGAAAG-3’(SEQ IDNo.57)从pNUT-IgSP-hCNTF(参见US 6,361,741)经PCR扩增。该3’引物含有人成熟NTN序列5’端的10个碱基。人，成熟NTN使用下列引物：5’引物：5’-GGTGAATTCGGCGCGGTTGGGGGCGCGGCCT-3’(SEQ ID No.54)和3’引物：5’-TATACTCGAGTCACACGCAGGCGCACTCGC-3’(SEQ ID No.55)从含全长成熟NTN的人NTN基因组克隆(pNS1n.NTNgenome，见实施例1)经PCR扩增。5’引物含有IgSP序列3’端的10个碱基。IgSP-人成熟NTN序列使用IgSP和人成熟NTN PCR片段(上文所述)作模板和下列引物：5’引物：5’-TATAGGATCCGCCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATC-3’(SEQ ID No.56)和3’引物：5’-TATACTCGAGTCACACGCAGGCGCACTCGC-3’(SEQ IDNo.55)经重叠PCR产生。含有与人成熟NTN融合的IgSP的最终PCR片段用BamHI和XhoI消化并克隆到pHR’-CMV.SIN-PLT7.WPRE(上文所述)和pNS1n(上文所述)的BamHI和XhoI位点之间。该核苷酸序列和编码的多肽在图13中给出。

pNS1n-d原-NTN：使用含有全长成熟NTN的人NTN基因组克隆(pNS1n.NTNgenome，见实施例1)作模板和下列引物：5’引物：5’-TATAGGATCCGCCACCATGCAGCGCTGGAAGGCGGCGGCCTTGGCCTCAGTGCTCTGCAGCTCCGTGCTGTCCGCGCGGTTGGGGGCGCGG-3，(SEQ ID No.62)和3’引物：5’-TATACTCGAGTCACACGCAGGCGCACTCGC-3’(SEQ ID No.55)在一个PCR反应中产生人delta-原-NTN DNA序列。delta-原-NTN PCR片段用BamHI和XhoI消化并克隆进pNS1n(上文所述)的BamHI和XhoI位点之间。delta原NTN的核苷酸序列和编码的多肽在图14中给出。

慢病毒载体的产生.复制缺陷型病毒颗粒通过将各个不同转移载体构建体与pMD.G(VSV-G假型载体)和pBR8.91(包装载体)(Zufferey等，1997)共转染进293T细胞反式提供所需的病毒蛋白来产生。简单地说，在含4.5g/l葡萄糖和Glutamax^TM(Invitrogen)并添加10％FCS(Life Technologies)的DMEM中培养的293T细胞在转染前一天接种到20个T75瓶(2×10⁶个细胞/瓶)中。对于每个T75瓶，用5μg pMD.G，15μg pBR8.91和20μg转移载体使用Lipofectamine+^TM(Invitrogen)按照厂商说明书转染细胞。转染后2-3天收集含有病毒的细胞上清，通过0.45μm醋酸纤维素或多磺酸(polysulphonic)滤膜过滤灭菌并在4℃以50,000xg超速离心90分钟浓缩。第二轮超速离心后，将浓缩的病毒沉淀重悬于DMEM中，分成等分并贮存于-80℃。为了测定病毒滴度，测定逆转录酶(RT)活性(Cepko和Pear，Current Protocols in MolecularBiology，9.13.5-6，supplement 36)且使用具有已知转导活性的EGFP慢病毒作为对照从测定的RT活性计算转导单位(TU)/ml。

实施例4：分析表达的NTN蛋白

细胞培养.ARPE-19，一种自发产生的人视网膜色素上皮细胞系(Dunn等，1996)在由含有Glutamax(Invitrogen，Denmark)并添加10％胎牛血清(Sigma-Aldrich，Denmark)的DMEM/Nutrient Mix F-12组成的培养基中生长。HiB5(Renfranz等，1991)，HEK293和CHO细胞在含有10％胎牛血清(Invitrogen，Denmark)的DMEM(Invitrogen，Denmark)中生长，CHO细胞的培养基还添加了20mg/L L-脯氨酸。ARPE-19细胞可从ATCC(保藏号CRL-2302)获得。ARPE-19，HEK293和CHO细胞在37℃生长而HiB5细胞在33℃、5％CO₂中生长。

瞬时转染试验.细胞以大约10⁵个细胞/孔的密度接种在6-孔平板(CorningCostar，Biotech Line，Denmark)上。第二天，用不同表达质粒以一式三孔转染细胞。使用Fugene6和3μg质粒/孔转染ARPE-19细胞，而使用2μg质粒/孔和Lipofectamine Plus(Invitrogen，Denmark)按照厂商说明书以一式三孔转染其它三种细胞系。第二天，向孔中加入新鲜的生长培养基，在收集经调节的培养基和收获细胞前将细胞再培养24小时。通过评估用含有EGFP cDNA的相同载体平行转染的孔中的EGFP表达确保足够的转染效率。

NTN Western印迹.细胞在PBS中洗涤并在96℃热样品缓冲液(2％SDS，100mM DTT，60mM Tris，pH 7.5，溴酚蓝)中裂解。向经调节的培养基中加入5倍浓缩的样品缓冲液。在一些实验中，用GFRα2从经调节的培养基中捕捉NTN。通过在用含山羊抗人Fc(Jackson ImmunoResearch，USA)的50mMNa2CO3/NaHCO3，pH 9包被过夜然后在含1％BSA的PBS中封闭1小时的ELISA平板中温育样品3小时，随后用含GFRα2-Ig融合蛋白(R&D Systems，UK)且含0.1％HSA的PBS温育1小时完成捕捉。温育样品后，在PBST中洗涤孔并加入96℃样品缓冲液。样品煮沸5分钟，然后在8-18％梯度的SDS凝胶上电泳，将它电印迹到PVDF膜上。使用1∶500稀释的多克隆NTN抗体(#AF477，R&D Systems，UK)接着用HRP-连接的抗山羊抗体检测NTN。使用ECL+系统(Amersham Life Science)通过化学发光检测带。

GFRa2/GFRa1 ELISA.GFRα2ELISA检测Ret-碱性磷酸酶(Ret-AP)偶联物(Sanicola等，1997)与结合到GFRα2受体上的NTN复合物的结合。简单地说，Opti-plate平板(Packard Instruments，Perkin Elmer，Denmark)用100μl含1μg/ml山羊抗人Fc(Jackson Immunoresearch Laboratories，TriChem，Denmark)的50mM NaHCO₃(pH＝9.6)在4℃包被16小时。在PBST中洗涤后，在含0.2％I-Block(Tropix，Roche，Denmark)的PBST中在室温封闭孔1小时，接着在PBST中短暂(brief)洗涤。随后NTN-生产细胞的样品和重组人NTN(R&D Systems，UK)在ARPE-19生长培养基中的标准稀释液在孔中在室温温育1.5小时，所述孔含有来自表达Ret-AP融合蛋白的293EBNA细胞的、含1μg/ml GFRα2/Fc融合蛋白(R&D Systems，UK)的经调节的培养基(Biogen Idec，USA惠赠)。然后首先在PBST，然后在AP-缓冲液(200mM Tris(pH＝9.8)，10mM MgCl₂)中洗涤孔，接着用含10％Sapphire Enhancer(Tropix，Roche，Denmark)和2％CSPD(Tropix，Roche，Denmark)的AP-缓冲液温育30分钟。使用MicrobetaTrilux Counter(Perkin Elmer，Denmark)定量发光。同样测量与经调节的培养基中的GFRα1的结合活性，但是加入1μg/ml GFRα1/Fc融合蛋白(R&DSystems，UK)代替GFRα2/Fc。使用重组NTN的标准曲线并将野生型构建体转染细胞的值设定为1来计算样品中的相对GFRα2结合活性。

NTN ELISA.Maxisorp平板(Nunc，Denmark)用含1μg/ml单克隆抗人NTN抗体(#MAB387，R&D Systems，UK)的包被溶液(2.5mM Na₂CO₃/2.5mMNaHCO₃，pH 8.2)在4℃温育16小时进行包被。在PBST(含0.05％Tween-20(Sigma-Aldrich，Denmark)的PBS)中洗涤后，在封闭缓冲液(含1％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich，Denmark)和5％蔗糖的PBS)中在室温封闭孔1小时。在PBST中洗涤后，用来自NTN-生产细胞的稀释培养基样品在室温温育孔3小时。重组NTN(#387-NE，R&D Systems，UK)用作标准。向孔中加入含1μg/ml多克隆抗人NTN抗体(#AF387，R&D Systems，UK)的封闭缓冲液并在4C温育16小时。在PBST中洗涤后，在含0.02％抗山羊-HRP(DAKO，Denmark)并补充有1％正常小鼠血清(DAKO，Denmark)的封闭缓冲液中在室温温育孔2小时。在PBST中洗涤后，加入TMB底物溶液(Promega，Ramcon，Denmark)，15分钟后通过加入1N HCl终止颜色形成。使用ELX-800平板阅读器(Cambrex，Denmark)测定A₄₅₀。

NTN的体外表达.人NTN编码197个氨基酸(aa)的前原蛋白，其具有19aa的推定信号肽，接着是76aa的原区。原-NTN在序列RXXR处经蛋白裂解产生102aa的成熟NTN。为了鉴定前-原部分对活性NTN分泌的影响，我们制备了不同的构建体(图15A)。由于转染后从各种细胞类型都可容易地分泌生物活性GDNF，因此制备了具有GDNF前原部分的NTN构建体(ppG-NTN)。另外，构建了两个没有前原部分的构建体，一个具有野生型NTN信号肽(d原-NTN)，且一个具有IgSP(IgSP-NTN)。将DNA构建体亚克隆进哺乳动物表达载体pNSln并瞬时转染进HEK293细胞，CHO细胞，大鼠海马细胞系HiB5或人视网膜上皮细胞系ARPE-19。使用抗NTN抗体对细胞溶胞产物和经调节的培养基进行Western印迹。图15B显示了来自HEK293细胞的结果。在其它三个细胞系中获得了相似的结果(数据未给出)。在用wt NTN转染的细胞中，在细胞溶胞产物以及经调节的培养基中都检测到大小相应于单体原-NTN(～22kDa)的带。在用ppG-NTN转染的细胞的溶胞产物和经调节的培养基中观察到相应于具有GDNF原区的NTN的、大小较小的带(～19.6kDa)。因此，在试验细胞系中NTN的原形式可表达和分泌但是没有可检测水平的加工。在用d原-NTN或IgSP-NTN转染的细胞中，在溶胞产物和经调节的培养基中可见大小相应于成熟单体NTN的带(～12.5kDa)。使用具有IgSP的构建体时比wt NTN SP获得的NTN水平明显更高。

然后我们使用功能试验检测了经调节的培养基中的NTN水平，其中通过与GFRα共同受体Ret形成第三复合物检测NTN与其受体GFRα2的结合(图15C)。来自用wt NTN或ppG-NTN转染的细胞的经调节的培养基显示出低水平的活性NTN(HEK293，ARPE-19，HiB5和CHO细胞分别为7.5±0.6ng/ml，1.5±0.9ng/ml，38.6±3.3ng/ml和18.3±1.7ng/ml)。然而，当使用d原-NTN构建体时样品中的GFRα2结合活性增加(HEK293，ARPE-19，HiB5和CHO细胞的NTN结合分别高90±19，117±13，7.5±1.7和4.1±0.9倍)。根据Western印迹结果，当使用IgSP-NTN构建体时NTN活性进一步增强(HEK293，ARPE-19，HiB5和CHO细胞的NTN结合分别高278±13，771±50，162±29和66±18倍)。当用GFRα1共同受体进行试验时获得了相似的结果(数据未给出)。用pNSln-EGFP瞬时转染的细胞的细胞上清显示出不可检测的NTN活性，证实了该试验的特异性(数据未给出)。我们还对经调节的培养基中的NTN结合到GFRα2-Ig包被的ELISA平板的样品进行了NTN Western印迹。当增加该结合步骤时，没有检测到NTN的前体形式，而在用IgSP-NTN构建体转染的细胞的样品中观察到成熟NTN的大小的带，当使用d原-NTN载体时检测到的程度较小(图15D)。另外，对来自用不同NTN构建体转染的细胞的经调节的培养基进行了NTN夹心ELISA。使用单克隆NTN抗体在ELISA平板上捕捉NTN，随后使用多克隆NTN抗体检测捕捉到的NTN。当用于Western印迹时两种抗体都识别NTN的原形式，但是如图15E所示，在NTN ELISA中没有检测到NTN原形式。这一发现表明NTN的原部分防止抗体与天然折叠的NTN，而不是与变性的NTN的结合。NTN夹心ELISA证实了用IgSP交换wt NTN SP增强了经调节的培养基中NTN的水平(2-8倍，取决于细胞系)。

实施例5：帕金森氏病模型的体内基因治疗

手术操作.使用总共24只年轻成年雌性Sprague-Dawley大鼠(Mllegaarden，Denmark)，并在12小时光：暗周期和随意获取大鼠食物和水的条件下圈养。病毒注射和6-OHDA损伤按照Rosenblad等(2000)进行并略有修改。简单地说，用携带GFP，hNTN，IgSP-hNTN或GDNF cDNA的rLV载体(3×10⁵TU/动物)注射经异氟烷麻醉(1.5-2％)的动物(n＝5-7只/组)。以如下坐标：AP＝1.0mm，ML＝-2.6mm，DV₁＝-5.0mm DV₂＝-4.5mm，和AP＝0.0mm，ML＝-3.7mm，DV₁＝-5.0mm，DV₂＝-4.5mm沿两个针束(needle tracts)在纹状体中制备4个药池(deposits)(0.75μl/药池)。齿状线(tooth bar)位于-2.3mm处。rLV注射后14天，再麻醉动物并用10-μl Hamilton注射器将单个药池的20μg6-OHDA(Sigma；以自由基计算并溶于添加了0.02％抗坏血酸的3μl冰冷盐水中)按如下坐标注射进右侧纹状体中：AP＝0.5mm；ML＝-3.4mm；相对于硬脑膜DV＝-5.0mm，且齿状线调到0.0mm。注射速率为1μl/分钟且在抽出前玻璃吸管在原位再停留3分钟。

苯异丙胺诱导的旋转(rotation).rLV注射后10天和6-OHDA注射后再4周时，用苯异丙胺(2.5mg/kg，Mecobenzon，DK)注射大鼠并监测在自动旋转滚筒(automated rotometer bowls)中的转圈反应90分钟。旋转不对称得分表示为每分钟净90°圈数(net 90°turns)且同侧旋转(即，向注射位点)设定为正值。

组织学.6-OHDA注射后28天时，用戊巴比妥钠深度麻醉动物并用盐水穿心灌注1分钟接着用200ml冰冷的含4％PFA的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)穿心灌注。分离大脑并在相同固定液中后固定3-4h，然后转移进25％蔗糖/0.1M磷酸盐缓冲液中48h。在冰冻切片机上切下6个连续的40-μm切片。免疫组织化学按以前所述进行(Rosenblad等，2003)。简单地说，用在含2％正常马或猪血清和0.25％triton X-100的磷酸盐缓冲液中1∶2000稀释的山羊抗hNTN或山羊抗-hGDNF一级抗体(R&D Systems，UK)，1∶2000稀释的鸡抗-GFP，小鼠抗-TH或兔抗-VMAT抗体(Chemicon)温育切片，接着用合适的生物素标记的第二抗体(Jackson Immunoresearch，USA)温育2小时，并按照厂商说明使用抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC)试剂盒(Vector Laboratories，USA)进行hNTN和hGDNF的免疫组织化学。最后，使用3’3’-二氨基联苯胺作色原形成颜色反应。

形态测量分析.定量SN中TH或VMAT免疫反应细胞的数目.按以前所述(Sauer和Oertel，1994)由盲性观察者(blinded observer)评估SN致密部(parscompacta)中免疫反应神经元的数目。简单地说，使用集中在副视束(accessoryoptic tract)末端内侧核(medial terminal nucleus)(MTN，Paxinos和Watson，1997的图谱中的-5.3)水平的三个连续切片并在40x放大倍数下计数MTN侧面的所有被染色的神经元。细胞数表示为完整侧数目百分数的平均值±S.E.M.。

纹状体纤维密度测定.纹状体DA神经分布通过测量染色TH的切片中在三个吻端尾侧(rostrocaudal)水平上的纹状体的光密度(OD)来评估。使用Olympus DP50数码照相机和恒定照明板(constant illumination table)，收集数码照片。使用ScanImage v.4.02软件测量完整侧和损伤侧的OD。各切片中的胼胝体用作背景染色的参照。

大鼠6-OHDA损伤模型中的体内神经保护.接着，我们希望研究IgSP-NTN构建体在体内可产生何种程度的活性NTN的持续分泌。因此我们构建了编码wt前-原NTN(rLV-wtNTN)和IgSP-NTN(rLV-IgSPNTN)的重组慢病毒载体，且检验了它们是否能够在PD动物模型中提供神经保护，在该模型中以前已证实注射NTN蛋白质可防止DA神经元的丢失(Horger等，1998；Rosenblad等，1999)。使用编码绿色荧光蛋白(GFP；rLV-GFP)或GDNF(rLV-GDNF)的载体分别作为阴性和阳性对照载体。

转基因表达的免疫组织化学定位

检查rLV-GFP处理的动物切片显示了在尾状核壳核(caudate putamen)中央头部(central head)中大约2×0.5mm的经转导的细胞柱(图16A)。大多数经转导的细胞具有纹状体介质大小的(striatal medium sized)刺状突出神经元的形态。在纹状体，和覆盖胼胝体的少突神经胶质中可见具有星形胶质形态的细胞局限于更小的范围。表达GFP的细胞显示出不同的细胞内表达方式。相反，通过rLV-GDNF处理的动物纹状体和黑质并进行了GDNF-免疫组织化学处理的切片显示出纹状体中有弥散型染色，与经转导的细胞的GDNF分泌一致(图16C)。在接受rLV-wtNTN注射的动物中，NTN-免疫组织化学显示出在rLV-wtNTN转导的纹状体细胞附近没有细胞外免疫反应(图16B)。在更高的放大倍数下，沿注射轨迹(tract)观察到具有点状细胞质染色的一些NTN-免疫反应细胞(图16E)。相反，接受rLV-IgSP-NTN注射的动物在纹状体中具有显著的弥散型染色(细胞外)(图16D)，与GDNF处理的动物中所见相似且与分泌一致。在rLV-IgSP-NTN注射的动物中也观察到NTN免疫反应细胞分布，但是大多数免疫反应物质位于细胞外(图16F)。在接受rLV-GDNF以及rLV-IgSPNTN的动物中，在黑质网状部(pars reticulata)存在利用各自的抗体产生的显著标记(数据未给出且见图16G)。免疫反应纤维的致密网明显从纹状体黑质突起(striatonigral projections)产生，因为它们可向头(rostrally)追踪到纹状体。该结果表明NTN可从纹状体在黑质纹状体途径内前行运输，与对GDNF的已有描述一样(Rosenblad等，1999)。

纹状体内6-OHDA损伤后4周时，通过计数表达TH的神经元评估剩下的多巴胺能黑质神经元数目(图17A和图18)。在对照rLV-GFP处理的动物中在损伤侧的黑质中与完整的对侧相比可见明显更少的TH-免疫反应(IR)神经元(23±3.4％)(图17A和18D)。同样，接受rLV-NTN的动物(图17A和18B)显示出显著的损伤诱导的TH-IR神经元减少(剩下30±7.7％)。相反，在rLV-IgSPNTN处理组，损伤侧中TH-IR神经元的百分数明显更高(91±1.2％；p＜0.01)(图17A和18C)，与接受GDNF处理的组中观察到的结果无区别(86±3.2％；p＜0.01)(图17A和18H)。

为了证实TH-IR黑质神经元数目的差别不是由TH酶调节产生，我们定量了相邻切片中的VMAT-IR神经元数目，该神经元已证实不易受到这些神经营养因子的调节(Rosenblad等，2003；Georgievska等，2002；Kirik等，2001)。如图17B所示，与rLV-GFP或rLV-NTN处理的动物(分别为15.5±2.4％和24.9±6.4％)相比，用rLV-IgSPNTN或rLVGDNF转导明显保存损伤侧黑质中VMAT-IR神经元的数目(分别为完整侧数目的75.2±6.8％和59.9±4.2％)，证实了TH-染色所见的结果。

除了保护黑质中的TH-IR和VMAT-IR神经元外，在rLV-IgSPNTN处理的动物样品中显而易见的是，与完整侧的TH-IR神经元(图18E)，或rLV-GFP或rLV-wtNTN处理的动物损伤侧(图18F)相比，在许多剩下的黑质神经元中TH染色强度减小(图18G)。在用GDNF处理后也可见TH染色强度减小，与以前的报道一致(Georgievska等，2002)，熟悉该现象的信号但是不清楚样品情况的观察者不能区分IgSPNTN处理的动物中的“GDNF-样”减小与GDNF施用后所见的减少。

检查TH-免疫组织化学处理的通过纹状体的切片显示了在所有组中，中央和外侧的尾状核-壳核在6-OHDA注射侧没有TH-IR纤维。损伤侧TH-IR神经分布的光密度测量定量表明在4周时剩下15-25％。这与以前在纹状体内6-OHDA损伤模型中的研究一致(Rosenblad等，1999；Georgievska等，2002)，表明TH-IR纹状体神经分布的恢复花费比损伤后4周更长的时间形成。同样，用作纹状体中多巴胺去神经的灵敏方法(Kirik等，1998)的苯异丙胺诱导的旋转表明，在损伤后4周时在任一处理组之间同侧转圈数没有明显差异(从4.5±1.5到13.4±3.3净同侧圈数/分钟之间变化；p＞0.05双向(two-way)重复测量ANOVA)。在病毒转导后10天但在6-OHDA损伤前评估苯异丙胺诱导的转圈表明与rLV-GFP或rLV-NTN组(分别为0.1±0.9和-0.1±1.6)相比，IgSP-NTN(3.3±1.5)和GDNF组(1.9±1.3)表现出轻微但不明显的对侧转圈偏向，与IgSP-NTN诱导侧DA功能的上调一致，类似于以前报道的GDNF处理后发生的结果(Georgievska等，2002；Georgievska等，2003)。

综合我们的结果表明，通过去掉原区和用异源性信号肽取代野生型信号肽明显增强了从慢病毒载体分泌NTN。使用慢病毒施用方法在体内转导的纹状体细胞中也可见活性NTN分泌增强和首次实现对体内损伤的黑质多巴胺神经元的有效神经保护，其类似于以前对GDNF的报道结果。

参考文献(实施例3-5)

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SANICOLA，M.，C.HESSION，D.WORLEY，P.CARMILLO，C.EHRENFELS，L.WALUS，S.ROBINSON，G.JAWORSKI，H.WEI，R.TIZARD，A.WHITTY，R.B.PEPINSKY，and R.L.CAT E.1997.Glial cellline-derived neurotrophic factor-dependent RET activation can be mediated bytwo different cell-surface accessory proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94：6238-6243.

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实施例6.使用SignalP 3.0预测信号肽加工

使用SignalP version 3.0预测信号肽裂解的位置。使用具有各种生长因子的信号肽delta原NTN，IgSP-NTN和NTN进行预测。

具有NTN信号肽的嵌合分子(delta原NTNs)。

＞hNTN信号(SEQ ID No 37)

MQRWKAAALA SVLCSSVLS

＞DELTA原102NTN(SEQ ID No 16)

MQRWKAAALA SVLCSSVLSA RLGARPCGLR ELEVRVSELG LGYASDETVL FRYCAGACEA

AARVYDLGLR RLRQRRRLRR ERVRAQPCCR PTAYEDEVSF LDAHSRYHTV HELSARECAC

V

＞DELTA原101NTN(SEQ ID No 25)

MQRWKAAALA SVLCSSVLSR LGARPCGLRE LEVRVSELGL GYASDETVLF RYCAGACEAA

ARVYDLGLRR LRQRRRLRRE RVRAQPCCRP TAYEDEVSFL DAHSRYHTVH ELSARECACV

＞DELTA原100NTN(SEQ ID No 26)

MQRWKAAALA SVLCSSVLSL GARPCGLREL EVRVSELGLG YASDETVLFR YCAGACEAAA

RVYDLGLRRL RQRRRLRRER VRAQPCCRPT AYEDEVSFLD AHSRYHTVHE LSARECACV

＞DELTA原99NTN(SEQ ID No 27)

MQRWKAAALA SVLCSSVLSG ARPCGLRELE VRVSELGLGY ASDETVLFRY CAGACEAAAR

VYDLGLRRLR QRRRLRRERV RAQPCCRPTA YEDEVSFLDA HSRYHTVHEL SARECACV

＞DELTA原98NTN(SEQ ID No 28)

MQRWKAAALA SVLCSSVLSA RPCGLRELEV RVSELGLGYA SDETVLFRYC AGACEAAARV

YDLGLRRLRQ RRRLRRERVR AQPCCRPTAY EDEVSFLDAH SRYHTVHELS ARECACV

＞DELTA原97NTN(SEQ ID No 29)

MQRWKAAALA SVLCSSVLSR PCGLRELEVR VSELGLGYAS DETVLFRYCA GACEAAARVY

DLGLRRLRQR RRLRRERVRA QPCCRPTAYE DEVSFLDAHS RYHTVHELSA RECACV

＞DELTA原96NTN(SEQ ID No 30)

MQRWKAAALA SVLCSSVLSP CGLRELEVRV SELGLGYASD ETVLFRYCAG ACEAAARVYD

LGLRRLRQRR RLRRERVRAQ PCCRPTAYED EVSFLDAHSR YHTVHELSAR ECACV

具有免疫球蛋白信号肽的嵌合分子(IgSP-delta原NTN)：

＞IgSP，小鼠(SEQ ID No 4)

MKCSWVIFFL MAVVTGVNS

＞IgSp，小鼠(SEQ ID No 4)

MKCSWVIFFL MAVVTGVNS

＞IgSP-102NTN(SEQ ID No 18)

MKCSWVIFFL MAVVTGVNSA RLGARPCGLR ELEVRVSELG LGYASDETVL FRYCAGACEA

AARVYDLGLR RLRQRRRLRR ERVRAQPCCR PTAYEDEVSF LDAHSRYHTV HELSARECAC

V

＞IgSp-101NTN(SEQ ID No 19)

MKCSWVIFFL MAVVTGVNSR LGARPCGLRE LEVRVSELGL GYASDETVLF RYCAGACEAA ARVYDLGLRR

LRQRRRLRRE RVRAQPCCRP TAYEDEVSFL DAHSRYHTVH ELSARECACV

＞IgSP-100NTN(SEQ ID No 20)

MKCSWVIFFL MAVVTGVNSL GARPCGLREL EVRVSELGLG YASDETVLFR YCAGACEAAA RVYDLGLRRL

RQRRRLRRER VRAQPCCRPT AYEDEVSFLD AHSRYHTVHE LSARECACV

＞IgSP-99NTN(SEQ ID No 21)

MKCSWVIFFL MAVVTGVNSG ARPCGLRELE  VRVSELGLGY ASDETVLFRY CAGACEAAAR VYDLGLRRLR

QRRRLRRERV RAQPCCRPTA YEDEVSFLDA HSRYHTVHEL SARECACV

＞IgSP-98NTN(SEQ ID No 22)

MKCSWVIFFL MAVVTGVNSA RPCGLRELEV RVSELGLGYA SDETVLFRYC AGACEAAARV YDLGLRRLRQ

RRRLRRERVR AQPCCRPTAY EDEVSFLDAH SRYHTVHELS ARECACV

＞IgSP-97NTN(SEQ ID No 23)

MKCSWVIFFL MAVVTGVNSR PCGLRELEVR VSELGLGYAS DETVLFRYCA GACEAAARVY DLGLRRLRQR

RRLRRERVRA QPCCRPTAYE DEVSFLDAHS RYHTVHELSA RECACV

＞IgSP-96NTN(SEQ ID No 24)

MKCSWVIFFL MAVVTGVNSp CGLRELEVRV SELGLGYASD ETVLFRYCAG ACEAAARVYD LGLRRLRQRR

RLRRERVRAQ PCCRPTAYED EVSFLDAHSR YHTVHELSAR ECACV

嵌合生长因子-NTN分子(生长因子SP-delta原NTN)

＞hNGF-102NTN(SEQ ID No.31)

MSMLFYTLIT AFLIGIQAAR LGARPCGLRE LEVRVSELGL GYASDETVLF RYCAGACEAA ARVYDLGLRR

LRQRRRLRRE RVRAQPCCRP TAYEDEVSFL DAHSRYHTVH ELSARECACV

＞mNGF-102NTN(SEQ ID No.32)

MSMLFYTLIT AFLIGVQAAR LGARPCGLRE LEVRVSELGL GYASDETVLF RYCAGACEAA ARVYDLGLRR

LRQRRRLRRE RVRAQPCCRP TAYEDEVSFL DAHSRYHTVH ELSARECACV

＞hGDNF-102NTN(SEQ ID No.33)

MKLWDVVAVC LVLLHTASAA RLGARPCGLR ELEVRVSELG LGYASDETVL FRYCAGACEA

AARVYDLGLR RLRQRRRLRR ERVRAQPCCR PTAYEDEVSF LDAHSRYHTV HELSARECAC

V

＞mGDNF-102NTN(SEQ ID No.34)

MKLWDVVAVC LVLLHTASAA RLGARPCGLR ELEVRVSELG LGYASDETVL FRYCAGACEA

AARVYDLGLR RLRQRRRLRR ERVRAQPCCR PTAYEDEVSF LDAHSRYHTV HELSARECAC

V

＞hNBN-102NTN(SEQ ID No.35)

MELGLGGLST LSHCPWPRRQ PALWpTLAAL ALLSSVAEAA RLGARPCGLR ELEVRVSELG LGYASDETVL

FRYCAGACEA AARVYDLGLR RLRQRRRLRR ERVRAQPCCR PTAYEDEVSF LDAHSRYHTV HELSARECAC V

＞hPSP-102NTN(SEQ ID No.36)

MAVGKFLLGS LLLLSLQLGQ GARLGARPCG LRELEVRVSE LGLGYASDET VLFRYCAGAC

EAAARVYDLG LRRLRQRRRL RRERVRAQPC CRPTAYEDEV SFLDAHSRYH TVHELSAREC

ACV

具有NTN信号肽¹的蛋白质的信号肽预测(delta原)

蛋白质	SignalP 3.0-NN				SignalP 3.0HMM			备注
									平均值S	D	Max C	裂解位点	SP概率	裂解位点概率	裂解位点
	前原NTN	0.835	0.643	0.442	19/20	0.997	0.861									19/20
delta原102NTN								0.867	0.738	0.570	19/20	1.000	0.397*	24/25	以HMM预测在19/20裂解具有几乎相同的概率
	delta原101NTN	0.772	0.730	0.726	23/24	1.000	0.812									23/24
delta原100NTN								0.952	0.725	0.486	22/23	0.999	0.449*	21/22	以HMM预测在22/23裂解具有几乎相同的概率
	delta原99NTN	0.798	0.659	0.411	21/22	1.000	0.518									21/22
delta原98NTN								0.835	0.737	0.584	19/20	1.000	0.504	20/21	以HMM预测在19/20裂解具有几乎相同的概率
	delta原97NTN	0.768	0.713	0.694	19/20	1.000	0.978									19/20
delta原96NTN								0.715	0.555	0.272*	23/24	0.997	0.581	23/24	预测在第一个经典半胱氨酸后裂解

    截止值                           0.48          0.43          0.32                                      0.5

¹MQRWKAAALASVLCSSVLS 19个氨基酸(SEQ ID No 37)

^*低于截止值

具有免疫球蛋白信号肽¹的蛋白质的预测信号肽(IgSP-NTN)

蛋白质	SignalP 3.0-NN				SignalP 3.0HMM			备注
									平均值S	D	Max C	裂解位点	SP概率	裂解位点概率	裂解位点
	IgSP-102NTN	0.946	0.911	0.964	19/20	1.000	0.911									19/20
IgSP-101NTN								0.929	0.846	0.752	19/20	0.998	0.488*	19/20
	IgSP-100NTN	0.945	0.874	0.826	19/20	0.999	0.481*									22/23	以HMM预测在19/20裂解概率更低
IgSP-99NTN								0.932	0.858	0.755	19/20	0.999	0.537	19/20
	IgSP-98NTN	0.933	0.916	0.977	19/20	1.000	0.843									19/20
IgSP-97NTN								0.898	0.890	0.988	19/20	1.000	0.988	19/20
	IgSP-96NTN	0.906	0.761	0.516	19/20	0.996	0.582									16/17	以HMM预测在19/20裂解概率更低

   截止值                                0.48           0.43          0.32                                       0.5

¹MKCSWVIFFLMAVVTGVNS 19个氨基酸(SEQ ID No 4)

^*低于截止值

具有生长因子信号肽的蛋白质的信号肽预测

蛋白质	SignalP 3.0-NN				SignalP 3.0HMM			备注
									平均值S	D	Max C	裂解位点	SP概率	裂解位点概率	裂解位点
	hNGF-102NTN1	0.937	0.857	0.849	18/19	0.996	0.563									19/20
mNGF-102NTN2								0.944	0.895	0.964	18/19	0.999	0.818	18/19
	hGDNF-102NTN3	0.947	0.907	0.988	19/20	1.000	0.918									19/20
mGDNF-102NTN4								0.947	0.907	0.988	19/20	1.000	0.918	19/20
	mGDNF-102NTN5	0.156*	0.121*	0.123*	NO	0.014	0.010*									16/17	“信号肽”，相应于小鼠GDNF(Genbank#NM_010275)中错误预测的起始密码子的
hNBN-102NTN6								0.514	0.681	0.852	39/40	0.998	0.879	39/40
	hPSP-102NTN7	0.955	0.874	0.801	21/22	1.000	0.869									21/22

截止值                 0.48         0.43           0.32                                        0.5

hNGF¹SP                  msmlfytlitafligiqa  18个氨基酸(SEQ ID No 40)

mNGF²SP                  msmlfytlitafligvqa  18个氨基酸(SEQ ID No 41)

hGDNF³SP                 mklwdvvavclvllhtasa  19个氨基酸(SEQ ID No 42)

mGDNF⁴SP                 mklwdvvavclvllhtasa  19个氨基酸(SEQ ID No 43)

mGDNF⁵“N-末端”         mgfgplgvnvqlgvygdri  19个氨基酸(SEQ ID No 44)

hNBN⁶SP                  melglgglstlshcpwprrqpalwptlaalallssvaea  39个氨基酸(SEQ ID No 45)

hPSP⁷SP                  mavgkfllgsllllslqlgqg  21个氨基酸(SEQ ID No 46)

^*低于截止值

序列表

SEQ ID NO    类型          说明

1   P        IgSP人

2   P        IgSP猴

3   P        IgSP狨

4   P        IgSP小鼠

5   P        IgSP猪

6   P        IgSP大鼠

7   N        成熟NTN，人

8   P        成熟NTN，人

9   P        96NTN，人

10  P        成熟NTN，小鼠

11  P        成熟NTN，大鼠

12  P        前原NTN，人

13  P        前原NTN，小鼠

14  P        前原NTN，大鼠

15  N        delta原102NTN，人

16  P        delta原102NTN，人

17  N        IgSP-102NTN，嵌合

18  P        IgSP-102NTN，嵌合

19  P        IgSP-101NTN，嵌合

20  P        IgSP-100NTN，嵌合

21  P        IgSP-99NTN，嵌合

22  P        IgSP-98NTN，嵌合

23  P        IgSP-97NTN，嵌合

24  P        IgSP-96NTN，嵌合

25  P        delta原101NTN，人

26  P        delta原100NTN，人

27  P        delta原99NTN，人

28  P        delta原98NTN，人

29  P    delta原97NTN，人

30  P    delta原96NTN，人

31  P    hNGF-102NTN

32  P    mNGF-102NTN

33  P    hGDNF-102NTN

34  P    mGDNF-102NTN

35  P    hNBN-102NTN

36  P    hPSP-102NTN

37  P    hNTN信号肽

38  P    mNTN，信号肽

39  P    rNTN，信号肽

40  P    hNGF，信号肽

41  P    mNGF，信号肽

42  P    hGDNF，信号肽

43  P    mGDNF，信号肽

44  P    mGDNF，推定的信号肽

45  P    hNBN，信号肽

46  P    hPSP，信号肽

47  P    前原NBN，人

48  P    前原PSP，人

49  P    前原GDNF，人

50  N    前原GDNF-102NTN，人

51  P    前原GDNF-102NTN，人

52-62  N    PCR-引物

                               序列表

<110>Ns基因公司(NsGene A/S)

Torne，Jens

Rosenblad，Carl

Wahlberg，Lars

<120>帕金森氏病的体内基因治疗

<130>513-204-WO

<150>DK PA 2003 01543

<151>2003-10-20

<150>US 06/512,918

<151>2003-10-22

<160>62

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>19

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Met Asp Cys Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1             5               10                15

Thr His Ala

<210>2

<211>19

<212>PRT

<213>猕猴(Macaca mulatta)

<400>2

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1             5               10                15

Val Leu Ser

<210>3

<211>19

<212>PRT

<213>狨猴(Callithrix jacchus)

<400>3

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Phe Leu Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1             5               10                15

Ala His Ser

<210>4

<211>19

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>4

Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly

1             5               10               15

Val Asn Ser

<210>5

<211>19

<212>PRT

<213>野猪(Sus scrofa)

<400>5

Met Glu Phe Arg Leu Asn Trp Val Val Leu Phe Ala Leu Leu Gln Gly

1             5               10               15

Val Gln Gly

<210>6

<211>19

<212>PRT

<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)

<400>6

Met Lys Cys Ser Trp Ile Ile Leu Phe Leu Met Ala Leu Thr Thr Gly

1             5               10               15

Val Asn Ser

<210>7

<211>309

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(309)

<223>

<400>7

gcg cgg ttg ggg gcg cgg cct tgc ggg ctg cgc gag ctg gag gtg cgc    48

Ala Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg

1             5               10               15

gtg agc gag ctg ggc ctg ggc tac gcg tcc gac gag acg gtg ctg ttc    96

Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe

          20               25               30

cgc tac tgc gca ggc gcc tgc gag gct gcc gcg cgc gtc tac gac ctc    144

Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu

      35               40                45

ggg ctg cga cga ctg cgc cag cgg cgg cgc ctg cgg cgg gag cgg gtg    192

Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val

   50               55               60

cgc gcg cag ccc tgc tgc cgc ccg acg gcc tac gag gac gag gtg tcc    240

Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser

65               70               75               80

ttc ctg gac gcg cac agc cgc tac cac acg gtg cac gag ctg tcg gcg    288

Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala

             85               90               95

cgc gag tgc gcc tgc gtg tga    309

Arg Glu Cys Ala Cys Val

          100

<210>8

<211>102

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>8

Ala Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg

1             5               10               15

Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe

          20               25               30

Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu

      35               40                45

Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val

   50               55               60

Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser

65               70               75               80

Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala

             85               90               95

Arg Glu Cys Ala Cys Val

          100

<210>9

<211>96

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>9

Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu

1             5               10               15

Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ala

          20               25               30

Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg

      35                40               45

Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg Ala Gln Pro Cys Cys

   50               55               60

Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe Leu Asp Ala His Ser

65               70               75               80

Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala Arg Glu Cys Ala Cys Val

             85               90               95

<210>10

<211>100

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>10

Pro Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val Ser

1             5               10               15

Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr

          20              25                30

Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ile Arg Ile Tyr Asp Leu Gly Leu

      35                40              45

Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Val Arg Arg Glu Arg Ala Arg Ala

   50               55               60

His Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe Leu

65               70               75               80

Asp Val His Ser Arg Tyr His Thr Leu Gln Glu Leu Ser Ala Arg Glu

             85               90               95

Cys Ala Cys Val

          100

<210>11

<211>100

<212>PRT

<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)

<400>11

Pro Gly Ser Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val Ser

1            5                10                15

Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr

          20               25               30

Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ile Arg Ile Tyr Asp Leu Gly Leu

       35               40               45

Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Val Arg Lys Glu Arg Val Arg Ala

   50               55               60

His Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe Leu

65               70               75               80

Asp Val His Ser Arg Tyr His Thr Leu Gln Glu Leu Ser Ala Arg Glu

             85               90               95

Cys Ala Cys Val

          100

<210>12

<211>197

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>PROPEP

<222>(20)..(95)

<223>

<220>

<221>变体

<222>(96)..(96)

<223>A->S

<220>

<221>mat_肽

<222>(96)..()

<223>

<400>12

Met Gln Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ser Val Leu Cys Ser Ser

-95              -90              -85              -80

Val Leu Ser Ile Trp Met Cys Arg Glu Gly Leu Leu Leu Ser His Arg

             -75               -70              -65

Leu Gly Pro Ala Leu Val Pro Leu His Arg Leu Pro Arg Thr Leu Asp

         -60               -55              -50

Ala Arg Ile Ala Arg Leu Ala Gln Tyr Arg Ala Leu Leu Gln Gly Ala

       -45              -40              -35

Pro Asp Ala Met Glu Leu Arg Glu Leu Thr Pro Trp Ala Gly Arg Pro

   -30              -25               -20

Pro Gly Pro Arg Arg Arg Ala Gly Pro Arg Arg Arg Arg Ala Arg Ala

-15             -10               -5             -1 1

Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val

          5                10               15

Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg

      20                25               30

Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly

   35               40               45

Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg

50               55               60               65

Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe

             70               75               80

Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala Arg

          85               90               95

Glu Cys Ala Cys Val

       100

<210>13

<211>195

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<220>

<221>信号

<222>(1)..(23)

<223>

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(96)..()

<223>

<400>13

Met Arg Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Val Ser Leu Ile Cys Ser Ser

-95              -90             -85               -80

Leu Leu Ser Val Trp Met Cys Gln Glu Gly Leu Leu Leu Gly His Arg

             -75              -70               -65

Leu Gly Pro Ala Leu Ala Pro Leu Arg Arg Pro Pro Arg Thr Leu Asp

          -60              -55              -50

Ala Arg Ile Ala Arg Leu Ala Gln Tyr Arg Ala Leu Leu Gln Gly Ala

      -45               -40              -35

Pro Asp Ala Val Glu Leu Arg Glu Leu Ser Pro Trp Ala Ala Arg Ile

    -30             -25               -20

Pro Gly Pro Arg Arg Arg Ala Gly Pro Arg Arg Arg Arg Ala Arg Pro

-15              -10              -5            -1  1

Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val Ser Glu

          5                10               15

Leu Gly Leu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr Cys

      20                25               30

Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ile Arg Ile Tyr Asp Leu Gly Leu Arg

   35               40               45

Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Val Arg Arg Glu Arg Ala Arg Ala His

50               55               60               65

Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe Leu Asp

             70               75               80

Val His Ser Arg Tyr His Thr Leu Gln Glu Leu Ser Ala Arg Glu Cys

          85               90               95

Ala Cys Val

       100

<210>14

<211>195

<212>PRT

<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)

<220>

<221>信号

<222>(1)..(23)

<223>

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(96)..()

<223>

<400>14

Met Arg Cys Trp Lys Ala Ala Ala Leu Val Ser Leu Ile Cys Ser Ser

-95              -90              -85              -80

Leu Leu Ser Val Trp Met Cys Gln Glu Gly Leu Leu Leu Gly His Arg

             -75               -70              -65

Leu Gly Pro Ala Leu Ala Pro Leu Arg Arg Pro Pro Arg Thr Leu Asp

          -60              -55              -50

Ala Arg Ile Ala Arg Leu Ala Gln Tyr Arg Ala Leu Leu Gln Gly Ala

       -45              -40              -35

Pro Asp Ala Val Glu Leu Arg Glu Leu Ser Pro Trp Val Ala Arg Pro

   -30              -25               -20

Ser Gly Pro Arg Arg Arg Ala Gly Pro Arg Arg Arg Arg Ala Arg Pro

-15              -10              -5            -1  1

Gly Ser Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val Ser Glu

          5               10                15

Leu Gly Leu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr Cys

      20                25               30

Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ile Arg Ile Tyr Asp Leu Gly Leu Arg

   35               40               45

Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Val Arg Lys Glu Arg Val Arg Ala His

50               55               60               65

Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe Leu Asp

             70               75               80

Val His Ser Arg Tyr His Thr Leu Gln Glu Leu Ser Ala Arg Glu Cys

          85               90               95

Ala Cys Val

      100

<210>15

<211>392

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(17)..(379)

<223>

<220>

<221>sig_肽

<222>(17)..(73)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(74)..()

<223>

<400>15

tataggatcc gccacc atg cag cgc tgg aag gcg gcg gcc ttg gcc tca gtg    52

               Met Gln Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ser Val

                            -15               -10

ctc tgc agc tcc gtg ctg tcc gcg cgg ttg ggg gcg cgg cct tgc ggg    100

Leu Cys Ser Ser Val Leu Ser Ala Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly

       -5           -1  1             5

ctg cgc gag ctg gag gtg cgc gtg agc gag ctg ggc ctg ggc tac gcg    148

Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala

10               15               20               25

tcc gac gag acg gtg ctg ttc cgc tac tgc gca ggc gcc tgc gag gct    196

Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala

             30               35               40

gcc gcg cgc gtc tac gac ctc ggg ctg cga cga ctg cgc cag cgg cgg    244

Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg

          45               50               55

cgc ctg cgg cgg gag cgg gtg cgc gcg cag ccc tgc tgc cgc ccg acg    292

Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr

      60               65                70

gcc tac gag gac gag gtg tcc ttc ctg gac gcg cac agc cgc tac cac    340

Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His

   75               80               85

acg gtg cac gag ctg tcg gcg cgc gag tgc gcc tgc gtg tgactcgagt     389

Thr Val His Glu Leu Ser Ala Arg Glu Cys Ala Cys Val

90               95               100

ata                                                        392

<210>16

<211>121

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>16

Met Gln Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ser Val Leu Cys Ser Ser

             -15              -10               -5

Val Leu Ser Ala Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu

       -1 1             5                10

Glu Val Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr

   15               20                25

Val Leu Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val

30               35               40               45

Tyr Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg

             50               55               60

Glu Arg Val Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp

          65               70               75

Glu Val Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu

      80                85               90

Leu Ser Ala Arg Glu Cys Ala Cys Val

   95               100

<210>17

<211>484

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IgSP(小鼠)-成熟NTN(人)

<220>

<221>CDS

<222>(12)..(57)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(137)..(453)

<223>

<220>

<221>sig_肽

<222>(12)..(147)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(148)..()

<223>

<400>17

gatcogccac c atg aaa tgc agc tgg gtt atc ttc ttc ctg atg gca gtg     50

           Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val

                        -15               -10

gtt aca g gtaaggggct cccaagtccc aaacttgagg gtccataaac tctgtgacag    107

Val Thr

   -5

tggcaatcac tttgcctttc tttctacag gg gtg aat tcg gcg cgg ttg ggg     159

                          Gly Val Asn Ser Ala Arg Leu Gly

                                    -1  1

gcg cgg cct tgc ggg ctg cgc gag ctg gag gtg cgc gtg agc gag ctg    207

Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val Ser Glu Leu

5                10               15               20

ggc ctg ggc tac gcg tcc gac gag acg gtg ctg ttc cgc tac tgc gca    255

Gly  Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr Cys Ala

              25               30               35

ggc gcc tgc gag gct gcc gcg cgc gtc tac gac ctc ggg ctg cga cga    303

Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly Leu Arg Arg

          40               45               50

ctg cgc cag cgg cgg cgc ctg cgg cgg gag cgg gtg cgc gcg cag ccc    351

Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg Ala Gln Pro

      55                60               65

tgc tgc cgc ccg acg gcc tac gag gac gag gtg tcc ttc ctg gac gcg    399

Cys Cys Arg Pr6 Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe Leu Asp Ala

   70               75               80

cac agc cgc tac cac acg gtg cac gag ctg tcg gcg cgc gag tgc gcc    447

His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala Arg Glu Cys Ala

85               90               95               100

tgc gtg tgacatatca agcttatcga taccgtcgac c                  484

Cys Val

<210>18

<211>121

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>IgSP(小鼠)-成熟NTN(人)

<400>18

Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly

             -15               -10              -5

Val Asn Ser Ala Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu

       -1 1             5                l0

Glu Val Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr

   15               20               25

Val Leu Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val

30               35               40               45

Tyr Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg

             50               55                60

Glu Arg Val Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp

          65               70               75

Glu Val Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu

      80                85               90

Leu Ser Ala Arg Glu Cys Ala Cys Val

   95               100

<210>19

<211>120

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>mIgSP-hNTN

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(20)..()

<223>

<400>19

Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly

             -15               -10              -5

Val Asn Ser Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu

       -1 1             5                10

Val Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val

   15               20               25

Leu Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr

30               35               40               45

Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu

             50               55               60

Arg Val Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu

         65                70               75

Val Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu

      80               85                90

Ser Ala Arg Glu Cys Ala Cys Val

   95               100

<210>20

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>mIgSP-hNTN

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(20)..()

<223>

<400>20

Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly

             -15               -10              -5

Val Asn Ser Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val

       -1 1             5                10

Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu

    15              20               25

Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp

30               35               40               45

Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg

             50               55               60

Val Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val

          65               70               75

Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser

      80                85               90

Ala Arg Glu Cys Ala Cys Val

  95                100

<210>21

<211>118

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>mIgSP-hNTN

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(20)..()

<223>

<400>21

Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly

             -15               -10              -5

Val Asn Ser Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg

       -1 1             5                10

Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe

   15               20               25

ArG Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu

30               35               40               45

Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val

             50               55                60

Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser

          65               70               75

Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala

       80               85               90

Arg Glu Cys Ala Cys Val

    95

<210>22

<211>117

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>mIgSP-hNTN

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(20)..()

<223>

<400>22

Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly

             -15               -10              -5

Val Asn Ser Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val

       -1 1             5                10

Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg

   15               20               25

Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly

30               35               40               45

Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg

             50               55               60

Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe

          65               70               75

Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala Arg

       80               85               90

Glu Cys Ala Cys Val

   95

<210>23

<211>116

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>mIgSP-hNTN

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(20)..()

<223>

<400>23

Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly

             -15               -10              -5

Val Asn Ser Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val Ser

       -1 1             5                10

Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr

   15               20               25

Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly Leu

30               35               40               45

Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg Ala

             50               55               60

Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe Leu

          65               70               75

Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala Arg Glu

       80               85               90

Cys Ala Cys Val

    95

<210>24

<211>115

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>mIgSP-hNTN

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(20)..()

<223>

<400>24

Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly

             -15               -10              -5

Val Asn Ser Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val Ser Glu

       -1 1             5                10

Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr Cys

   15               20               25

Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly Leu Arg

30               35               40               45

Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg Ala Gln

             50               55               60

Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe Leu Asp

          65               70               75

Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala Arg Glu Cys

      80                85               90

Ala Cys Val

   95

<210>25

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(20)..()

<223>

<400>25

Met Gln Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ser Val Leu Cys Ser Ser

             -15               -10              -5

Val Leu Ser Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu

       -1 1             5                10

Val Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val

   15               20               25

Leu Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr

30               35               40               45

Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu

             50               55               60

Arg Val Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu

          65               70               75

Val Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu

      80               85                90

Ser Ala Arg Glu Cys Ala Cys Val

   95               100

<210>26

<211>119

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(20)..()

<223>

<400>26

Met Gln Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ser Val Leu Cys Ser Ser

             -15               -10              -5

Val Leu Ser Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val

       -1 1             5               10

Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu

    15              20               25

Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp

30               35               40               45

Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg

             50               55               60

Val Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val

          65               70               75

Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser

       80               85               90

Ala Arg Glu Cys Ala Cys Val

   95               100

<210>27

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(20)..()

<223>

<400>27

Met Gln Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ser Val Leu Cys Ser Ser

             -15               -10              -5

Val Leu Ser Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg

       -1 1             5                10

Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe

   15               20               25

Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu

30               35               40               45

Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val

             50               55               60

Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser

          65               70               75

Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala

      80                85               90

Arg Glu Cys Ala Cys Val

   95

<210>28

<211>117

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(20)..()

<223>

<400>28

Met Gln Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ser Val Leu Cys Ser Ser

             -15               -10              -5

Val Leu Ser Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val

       -1 1             5                10

Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg

   15               20               25

Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly

30               35               40               45

Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg

             50               55               60

Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe

          65               70               75

Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala Arg

     80               85                 90

Glu Cys Ala Cys Val

   95

<210>29

<211>116

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(20)..()

<223>

<400>29

Met Gln Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ser Val Leu Cys Ser Ser

              -15              -10              -5

Val Leu Ser Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val Ser

       -1 1             5                10

Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr

   15               20               25

Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly Leu

30               35               40               45

Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg Ala

             50               55               60

Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe Leu

          65               70               75

Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala Arg Glu

      80                85               90

Cys Ala Cys Val

   95

<210>30

<211>115

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(20)..()

<223>

<400>30

Met Gln Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ser Val Leu Cys Ser Ser

             -15               -10              -5

Val Leu Ser Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val Ser Glu

       -1 1             5               10

Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr Cys

   15               20               25

Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly Leu Arg

30               35               40               45

Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg Ala Gln

             50               55               60

Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe Leu Asp

          65               70               75

Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala Arg Glu Cys

       80               85               90

Ala Cys Val

   95

<210>31

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>信号

<222>(1)..(18)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(19)..()

<223>

<400>31

Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile

          -15              -10              -5

Gln Ala Ala Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu

   -1 1             5                10

Val Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val

15               20               25               30

Leu Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr

             35               40               45

Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu

         50                55               60

Arg Val Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu

      65               70                75

Val Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu

   80               85               90

Ser Ala Arg Glu Cys Ala Cys Val

95               100

<210>32

<211>120

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>mNGF信号，hNTN成熟

<220>

<221>信号

<222>(1)..(18)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(19)..()

<223>

<400>32

Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Val

          -15              -10              -5

Gln Ala Ala Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu

   -1 1             5                10

Val Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val

15               20               25               30

Leu Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr

             35               40               45

Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu

          50               55               60

Arg Val Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu

       65               70               75

Val Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu

   80               85               90

Ser Ala Arg Glu Cys Ala Cys Val

95               100

<210>33

<211>121

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(20)..()

<223>

<400>33

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

             -15               -10              -5

Ala Ser Ala Ala Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu

       -1 1             5                10

Glu Val Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr

   15               20               25

Val Leu Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val

30               35               40               45

Tyr Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg

             50               55               60

Glu Arg Val Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp

          65               70               75

Glu Val Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu

       80               85               90

Leu Ser Ala Arg Glu Cys Ala Cys Val

   95               100

<210>34

<211>121

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>mGDNF信号，hNTN成熟

<220>

<221>信号

<222>(1)..(19)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(20)..()

<223>

<400>34

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

              -15              -10              -5

Ala Ser Ala Ala Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu

       -1 1             5                10

Glu Val Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr

   15               20               25

Val Leu Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val

30               35               40               45

Tyr Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg

             50               55               60

Glu Arg Val Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp

          65               70               75

Glu Val Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu

       80               85               90

Leu Ser Ala Arg Glu Cys Ala Cys Val

   95               100

<210>35

<211>141

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>信号

<222>(1)..(39)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(40)..()

<223>

<400>35

Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp

             -35               -30               -25

Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu

          -20              -15               -10

Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ala Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly

      -5            -1  1             5

Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala

10               15               20               25

Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala

             30               35               40

Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg

          45               50               55

Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr

       60               65               70

Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His

   75               80               85

Thr Val His Glu Leu Ser Ala Arg Glu Cys Ala Cys Val

90               95               100

<210>36

<211>123

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>信号

<222>(1)..(21)

<223>

<220>

<221>mat_肽

<222>(22)..()

<223>

<400>36

Met Ala Val Gly Lys Phe Leu Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu

   -20               -15              -10

Gln Leu Gly Gln Gly Ala Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg

-5            -1 1            5                 10

Glu Leu Glu Val Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp

          15               20               25

Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala

       30               35               40

Arg Val Tyr Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu

   45               50               55

Arg Arg Glu Arg Val Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr

60               65               70               75

Glu Asp Glu Val Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val

             80               85               90

His Glu Leu Ser Ala Arg Glu Cys Ala Cys Val

          95               100

<210>37

<211>19

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>37

Met Gln Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ser Val Leu Cys Ser Ser

1             5               10               15

Val Leu Ser

<210>38

<211>19

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>38

Met Arg Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Val Ser Leu Ile Cys Ser Ser

1             5               10               15

Leu Leu Ser

<210>39

<211>19

<212>PRT

<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)

<400>39

Met Arg Cys Trp Lys Ala Ala Ala Leu Val Ser Leu Ile Cys Ser Ser

1             5               10               15

Leu Leu Ser

<210>40

<211>18

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>40

Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile

1             5               10               15

Gln Ala

<210>41

<211>18

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>41

Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Val

1             5               10               15

Gln Ala

<210>42

<211>19

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>42

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

1             5               10               15

Ala Ser Ala

<210>43

<211>19

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>43

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

1             5               10               15

Ala Ser Ala

<210>44

<211>19

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>44

Met Gly Phe Gly Pro Leu Gly Val Asn Val Gln Leu Gly Val Tyr Gly

1             5               10               15

Asp Arg Ile

<210>45

<211>39

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>45

Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp

1             5               10               15

Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu

          20               25               30

Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala

       35

<210>46

<211>21

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>46

Met Ala Val Gly Lys Phe Leu Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu

1             5               10               15

Gln Leu Gly Gln Gly

          20

<210>47

<211>220

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>47

Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp

1             5               10               15

Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu

          20               25               30

Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro

       35               40               45

Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His

   50               55               60

Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg

65               70               75               80

Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro

             85               90               95

Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly

          100              105              110

Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln

       115              120              125

Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu

   130               135              l40

Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro

145              150              155               160

His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro

             165              170               175

Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg

          180              185              190

Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val

       195              200              205

Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly

   210              215               220

<210>48

<211>156

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>48

Met Ala Val Gly Lys Phe Leu Leu Gly Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu

1             5               10               15

Gln Leu Gly Gln Gly Trp Gly Pro Asp Ala Arg Gly Val Pro Val Ala

          20               25               30

Asp Gly Glu Phe Ser Ser Glu Gln Val Ala Lys Ala Gly Gly Thr Trp

       35               40               45

Leu Gly Thr His Arg Pro Leu Ala Arg Leu Arg Arg Ala Leu Ser Gly

   50               55               60

Pro Cys Gln Leu Trp Ser Leu Thr Leu Ser Val Ala Glu Leu Gly Leu

65               70               75               80

Gly Tyr Ala Ser Glu Glu Lys Val Ile Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ser

             85               90               95

Cys Pro Arg Gly Ala Arg Thr Gln His Gly Leu Ala Leu Ala Arg Leu

          100              105              110

Gln Gly Gln Gly Arg Ala His Gly Gly Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg

       115              120              125

Tyr Thr Asp Val Ala Phe Leu Asp Asp Arg His Arg Trp Gln Arg Leu

   130               135              140

Pro Gln Leu Ser Ala Ala Ala Cys Gly Cys Gly Gly

145              150              155

<210>49

<211>211

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>49

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

1            5                10               15

Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro

          20               25               30

Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser

       35               40               45

Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val

   50               55               60

Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp

65               70               75               80

Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala

             85               90               95

Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg

          100              105              110

Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr

       115              120              125

Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr

   130              135               140

Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu

145              150              155              160

Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln

             165              170               175

Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp

          180              185              190

Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys

       195              200              205

Gly Cys Ile

   210

<210>50

<211>602

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(35)..(571)

<223>

<220>

<221>sig_肽

<222>(35)..(91)

<223>GDNF信号 肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(92)..(265)

<223>GDNF pro-region

<220>

<221>mat_肽

<222>(266)..()

<223>NTN成熟肽

<400>50

gatccactag tccagtgtgg tggaattcgc cacc atg aag tta tgg gat gtc gtg   55

                                Met Lys Leu Trp Asp Val Val

                                       -75

gct gtc tgc ctg gtg ctg ctc cac acc gcg tcc gcc ttc ccg ctg ccc    103

Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro

-70              -65               -60              -55

gcc ggt aag agg cct ccc gag gcg ccc gcc gaa gac cgc tcc ctc ggc    151

Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro Ala Glu Asp Arg ser Leu Gly

             -50              -45               -40

cgc cgc cgc gcg ccc ttc gcg ctg agc agt gac tca aat atg cca gag    199

Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu

          -35              -30              -25

gat tat cct gat cag ttc gat gat gtc atg gat ttt att caa gcc acc    247

Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr

       -20              -15              -10

att aaa aga ctg aaa agg gcg cgg ttg ggg gcg cgg cct tgc ggg ctg    295

Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ala Arg Leu Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu

   -5            -1 1             5                10

cgc gag ctg gag gtg cgc gtg agc gag ctg ggc ctg ggc tac gcg tcc    343

Arg Glu Leu Glu Val Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser

             15               20               25

gac gaa acg gtg ctg ttc cgc tac tgc gca ggc gcc tgc gag gct gcc    391

Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr Cys Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala

          30               35               40

gcg cgc gtc tac gac ctc ggg ctg cga cga ctg cgc cag cgg cgg cgc    439

Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg

      45               50                55

ctg cgg cgg gag cgg gtg cgc gcg cag ccc tgc tgc cgc ccg acg gcc    487

Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg Ala Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala

   60               65               70

tac gag gac gag gtg tcc ttc ctg gac gcg cac agc cgc tac cac acg    535

Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr His Thr

75               80               85               90

gtg cac gag ctg tcg gcg cgc gag tgc gcc tgc gtg tgacatatca         581

Val His Glu Leu ser Ala Arg Glu Cys Ala Cys Val

             95                 100

agcttatcga taccgtcgac c                               602

<210>51

<211>179

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<222>(92)..(265)

<223>GDNF pro-region

<400>51

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

       -75              -70              -65

Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro

   -60              -55               -50

Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser

-45              -40              -35               -30

Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val

             -25              -20               -15

Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ala Arg Leu

          -10              -5            -1 1

Gly Ala Arg Pro Cys Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Arg Val Ser Glu

   5                10               15

Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr Cys

20               25               30               35

Ala Gly Ala Cys Glu Ala Ala Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly Leu Arg

             40               45               50

Arg Leu Arg Gln Arg Arg Arg Leu Arg Arg Glu Arg Val Arg Ala Gln

          55               60               65

Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe Leu Asp

       70               75               80

Ala His Ser Arg Tyr His Thr Val His Glu Leu Ser Ala Arg Glu Cys

   85               90               95

Ala Cys Val

100

<210>52

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR-引物

<400>52

tataggatcc ggaggacacc agcatgtag                                29

<210>53

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>53

tcgccgagga tgaatcacca                              20

<210>54

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>54

ggtgaattcg gcgcggttgg gggcgcggcct                  31

<210>55

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>55

tatactcgag tcacacgcag gcgcactcgc                   30

<210>56

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>56

tataggatcc gccaccatga aatgcagctg ggttatc           37

<210>57

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>57

ccaaccgcgc cgaattcacc cctgtagaaa g                 31

<210>58

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>58

tatagaattc gccaccatga agttatggga tgtcg            35

<210>59

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>59

ccaaccgcgc ccttttcagt cttttaatgg                  30

<210>60

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>60

actgaaaagg gcgcggttgg gggcgcggcc t                31

<210>61

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>61

tagactcgag gtcgacggta tc                          22

<210>62

<211>91

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>62

tataggatcc gccaccatgc agcgctggaa ggcggcggcc ttggcctcag tgctctgcag    60

ctccgtgctg tccgcgcggt tgggggcgcg g                              91

Claims (82)

1.一种治疗帕金森氏病的方法，所述的方法包括向需要的个体的中枢神经系统施用治疗上有效量的病毒表达载体，所述的载体包含启动子序列，该启动子序列能够指导可操作相连的多肽的表达，所述的多肽包含能够在哺乳动物细胞中发挥功能的信号肽，并且所述多肽包含选自原-NTN，成熟NTN，N-末端截短的成熟NTN，和任一所述NTN的序列变异体组成的组的人，鼠(murine)或大鼠Neurturin(NTN)。

2.权利要求1的方法，其中NTN选自成熟NTN(SEQ ID No 8，10，和11)，N-末端截短的成熟NTN，和成熟或N-末端截短的NTN的序列变异体组成的组。

3.权利要求1的方法，其中所述序列变异体包含与SEQ ID No.9的氨基酸序列具有至少89％，优选至少90％，更优选至少95％的序列相同性的序列。

4.权利要求1的方法，其中NTN是人或鼠NTN。

5.权利要求1的方法，其中NTN是人NTN。

6.权利要求1的方法，其中NTN是人成熟NTN(SEQ ID No 8)。

7.权利要求1的方法，其中该个体是人类。

8.权利要求7的方法，其中施用的病毒组合物为至少10⁸t.u/mL，优选从10⁸到10¹⁰t.u./mL，更优选至少10⁹t.u./mL。

9.权利要求7的方法，其中所施用的组合物的量是每个注射点1-10μL。

10.权利要求7的方法，其中施用的病毒组合物为至少10¹⁰t.u/mL到10¹⁵t.u./mL。

11.权利要求1的方法，其中所述病毒载体是慢病毒。

12.权利要求1的方法，其中所述病毒载体是腺伴随病毒。

13.权利要求1的方法，其中所述病毒被施用到纹状体。

14.权利要求1的方法，其中所述病毒被施用到黑质。

15.病毒表达载体在制备用于治疗帕金森氏病的药物中的用途，所述的载体包含启动子序列，所述启动子序列能够指导可操作相连的多肽的表达，所述的多肽包含能够在哺乳动物细胞中发挥功能的信号肽，并且所述多肽包含选自原-NTN，成熟NTN，N-末端截短的成熟NTN，和任一所述NTN的序列变异体组成的组的人，鼠或大鼠Neurturin(NTN)。

16.权利要求15的用途，其中NTN选自成熟NTN(SEQ ID No 8，10，和11)，N-末端截短的成熟NTN，和成熟或N-末端截短的NTN的序列变异体组成的组。

17.权利要求15的用途，其中NTN是人或鼠NTN。

18.权利要求15的用途，其中NTN是人NTN。

19.权利要求15的用途，其中NTN是人成熟NTN(SEQ ID No 8)。

20.权利要求15的用途，其中施用的病毒组合物为至少10⁸t.u/mL，优选从10⁸到10¹⁰t.u./mL，更优选至少10⁹t.u./mL。

21.权利要求20的用途，其中所述病毒载体是慢病毒。

22.权利要求15的用途，其中所施用的病毒组合物为至少10¹⁰t.u/mL到10¹⁵t.u./mL。

23.权利要求22的用途，其中所述病毒载体是腺伴随病毒。

24.包含多核苷酸序列的病毒表达载体，其中的多核苷酸序列包含启动子序列，所述启动子序列能够指导可操作相连的多肽的表达，所述的多肽包含能够在哺乳动物细胞中发挥功能的信号肽，并且所述多肽包含选自成熟NTN，N-末端截短的成熟NTN，和成熟或N-末端截短的NTN的序列变异体组成的组的Neurturin。

25.权利要求24的载体，其中所述多核苷酸序列不编码有功能的Neurturin原区。

26.权利要求24的载体，其中所述信号肽是NGF信号肽。

27.权利要求24的载体，其中所述信号肽是GDNF信号肽。

28.权利要求24的载体，其中所述信号肽是Persephin信号肽。

29.权利要求24的载体，其中所述信号肽是Neublastin信号肽。

30.权利要求24的载体，其中所述信号肽选自以下信号肽组成的组：人NGF信号肽(SEQ ID No 40)，鼠NGF信号肽(SEQ ID No.41)，人GDNF信号肽(SEQ ID No.42)，鼠GDNF信号肽(SEQ ID No.43)。

31.权利要求24的载体，其中所述信号肽是免疫球蛋白G信号肽(IgSP)。

32.根据权利要求30的载体，其中IgSP选自鼠IgSP(SEQ ID NO 4)，大鼠IgSP(SEQ ID NO 6)，猪IgSP(SEQ ID NO 5)，猴IgSP(SEQ ID NO 2或3)，人IgSP(SEQ ID NO 1)组成的组。

33.权利要求32的载体，其中IgSP是鼠IgSP(SEQ ID No 4)。

34.权利要求32的载体，其中该IgSP是人IgSP(SEQ ID No 1)。

35.根据权利要求24的载体，该载体选自HIV，SIV，FIV，EIAV，AAV，腺病毒，逆转录病毒，疱疹病毒组成的组。

36.根据权利要求24的载体，其中所述载体是复制缺陷型慢病毒颗粒。

37.根据权利要求24的载体，其中所述的载体颗粒从包含以下物质的慢病毒载体产生：5’慢病毒LTR，tRNA结合位点，包装信号，与编码所述融合蛋白的多核苷酸信号可操作地相连的启动子，第二链DNA合成起点和3’慢病毒LTR。

38.根据前述权利要求24至37中任一项的载体，其中能够指导融合蛋白表达的启动子选自以下启动子组成的组：遍在蛋白启动子，CMV启动子，JeT启动子，SV40启动子，延伸因子1α启动子(EF 1-α)。

39.根据前述权利要求24至38中任一项的载体，其中所述启动子是诱导/抑制型启动子，诸如：Tet-On，Tet-Off，纳巴霉素诱导型启动子，M×1。

40.根据前述权利要求24至39中任一项的载体，还包含至少一个表达增强序列，诸如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，WPRE，SP163，大鼠胰岛素II-内含子或其它内含子，CMV增强子，和鸡[β]-珠蛋白隔离体或其它隔离体。

41.根据前述权利要求24至40中任一项的载体，还包含编码Cre-重组酶蛋白的序列，和LoxP序列。

42.一种药用组合物，它包含根据前述权利要求24至41中任一项的载体和一种或多种可药用的佐剂，赋形剂，载体和/或稀释剂。

43.用前述权利要求24至41中任一项的载体转导的分离的宿主细胞。

44.权利要求43的宿主细胞，它为哺乳动物宿主细胞。

45.权利要求44的宿主细胞，其中所述的哺乳动物选自啮齿类(小鼠，大鼠)，兔，狗，猫，猪，猴，人组成的组。

46.权利要求44的宿主细胞，它选自CHO，HEK293，COS，PC12，HiB5，RN33b，神经元细胞，胎儿细胞，ARPE-19，C2C12，HeLa，HepG2，纹状体细胞，神经元，星形细胞，中间神经元组成的组。

47.能够产生感染性载体颗粒的包装细胞系，所述载体颗粒包含逆转录病毒衍生的基因组，所述基因组包含5’逆转录病毒LTR，tRNA结合位点，包装信号，与编码蛋白质的多核苷酸序列可操作地相连的启动子，第二链DNA合成的起点，和3’逆转录病毒LTR，该蛋白质具有能够在哺乳动物中发挥功能的信号肽和Neurturin，所述的NTN是选自原-NTN，成熟NTN，N-末端截短的成熟NTN，和NTN的序列变异体组成的组的人，鼠或大鼠Neurturin。

48.根据权利要求47的包装细胞系，其中该载体颗粒是复制缺陷型载体颗粒。

49.根据权利要求48的包装细胞系，其中该基因组是慢病毒衍生的且LTR是慢病毒LTR。

50.一种嵌合非人哺乳动物，它包含用前述权利要求24至41中任一项的载体转导的至少一个细胞。

51.权利要求50的哺乳动物，其中至少一个转导的细胞包含哺乳动物的基因组。

52.一种可植入的细胞培养物装置，该装置包含：

i.允许生长因子通过其扩散的半透膜；和

ii.由前述权利要求43至46中任一项限定的至少一个分离的宿主细胞或由权利要求74至79中任一项限定的分离的宿主细胞。

53.权利要求52的装置，其中该半透膜是免疫隔离型半透膜。

54.权利要求52的装置，其中该半透膜是多微孔型半透膜。

55.权利要求52的装置，其中该装置还包含置于半透膜内的基质。

56.权利要求52的装置，其中该装置每24小时能够分泌超过10ng的生物活性Neurturin，优选超过20ng的生物活性Neurturin，更优选其分泌的生物活性Neurturin超过40ng/24小时，更优选超过60ng/24小时。

57.权利要求52的装置，其中该装置还包含固定用的锚定物(tetheranchor)。

58.一种生物相容性包囊，包含：含有分泌病毒载体用于感染靶细胞的活包装细胞的核心和包围所述核心的外部套；其中该病毒载体是根据权利要求24至41中任一项的载体，所述的套包含可渗透性生物相容性材料，所述的材料具有这样的孔隙，其被选择为允许大约100nm直径的逆转录病毒载体穿过其中，从而允许所述的病毒载体从所述包囊释放。

59.权利要求58的包囊，其中所述核心还包含基质，包装细胞由该基质固定。

60.权利要求58的包囊，其中所述的套包含水凝胶或热塑性材料。

61.根据权利要求24至41中任一项的载体作为药物的用途。

62.根据权利要求24至41中任一项的载体在制备治疗神经系统疾病的药物中的用途。

63.根据权利要求24至41中任一项的载体在制备治疗CNS疾病的药物中的用途。

64.权利要求62的用途，其中该CNS疾病是神经变性疾病。

65.权利要求64的用途，其中该神经变性疾病是涉及受损害和受创伤的神经元的神经变性疾病，诸如外周神经，延髓，脊髓的创伤性损伤，大脑局部缺血性神经元损伤，神经病，外周神经病，神经病性疼痛，阿尔茨海默氏病，亨廷顿氏舞蹈病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化，与痴呆相联系的记忆损伤。

66.权利要求64的用途，其中所述神经变性疾病是帕金森氏病。

67.权利要求64的用途，其中所述神经变性疾病是脊髓损伤。

68.权利要求64的用途，其中所述神经变性疾病是肌萎缩性侧索硬化。

69.权利要求64的用途，其中所述疾病是眼部疾病，例如色素性视网膜炎，黄斑变性，青光眼，糖尿病性视网膜病。

70.一种治疗神经系统疾病的方法，所述的方法包含给需要的个体施用：

i.治疗有效量的权利要求24至41中任一项的载体；或

ii.治疗有效量的权利要求42的药用组合物。

71.权利要求70的方法，其中该载体或组合物被注射进所述个体的纹状体中。

72.治疗神经系统疾病的方法，所述的方法包含向需要的个体移植：

i.治疗有效量的权利要求43至46中任一项的经转导的细胞；

ii.治疗有效量的权利要求74至81中任一项的细胞；

iii.根据权利要求52至57中任一项的植入装置；或

iv.根据权利要求58至60中任一项的生物相容性装置。

73.权利要求71的方法，其中所述的移植包含自体移植物，同种异体移植物或异种移植物。

74.哺乳动物细胞，其能够以超过500ng/10⁶个细胞/24小时的量分泌neurturin或其功能等同物。

75.权利要求74的细胞，它能够以如下所示的量进行分泌：至少1000ng/10⁶个细胞/24小时，更优选至少5000、更优选至少10,000、更优选至少15,000、更优选至少20,000、更优选至少25,000、更优选至少30,000、更优选至少35,000ng/10⁶个细胞/24小时。

76.权利要求74的细胞，它选自ARPE19细胞，CHO细胞，BHK细胞，R1.1细胞，COS细胞，杀伤细胞，辅助T-细胞，细胞毒性T-淋巴细胞和巨噬细胞组成的组。

77.权利要求74的细胞，其中所述的哺乳动物选自啮齿类(小鼠，大鼠)，兔，狗，猫，猪，猴，人组成的组。

78.权利要求77的细胞，它是人细胞。

79.权利要求74的细胞，选自CHO，HEK293，COS，PC12，HiB5，RN33b，神经元细胞，胎儿细胞，ARPE-19，MDX12，C2C12，HeLa，HepG2，纹状体细胞，神经元，星形细胞，中间神经元组成的组。

80.根据权利要求74的哺乳动物细胞，其由权利要求24至41中任一项的载体转导。

81.根据权利要求74至79中任一项的哺乳动物细胞，其附着于支持物塞质。

82.一种产生neurturin或其功能等同物的方法，所述的方法包含培养权利要求74至79中任一项的细胞并从培养基中回收neurturin。

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