CN1674779A

CN1674779A - 利用逆转录病毒载体表达转基因鸟类中的基因的方法以及由此得到的转基因鸟类

Info

Publication number: CN1674779A
Application number: CNA038192020A
Authority: CN
Inventors: 饭岛信司; 上平正道; 西岛谦一; 小野健一郎
Original assignee: Kaneka Corp; Nagoya Industrial Science Research Institute
Current assignee: Kaneka Corp; Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd; Nagoya Industrial Science Research Institute
Priority date: 2002-08-13
Filing date: 2003-08-11
Publication date: 2005-09-28
Also published as: CA2492927A1; ES2394792T3; EP1548114A4; JPWO2004016081A1; US20060143725A1; AU2003254929A1; JP2013255521A; EP1548114A1; EP1548114B8; JP5815631B2; IL166395A0; JP5473963B2; MXPA05001331A; WO2004016081A1; KR20050067138A; BR0313441A; JP2011147447A; EP1548114B1; JP5468719B2; RU2005106867A

Abstract

本发明提供一种利用复制能力缺失型逆转录病毒载体导入抗体基因，通过表达转基因生产抗体的G0转基因嵌合鸟类，和通过回收该G0转基因嵌合鸟类表达的抗体生产抗体的方法，以及G0转基因嵌合鸟类的生产方法，该方法包括孵育鸟类受精卵，除去紧随孵卵开始后的时期，往其后的受精卵中注入逆转录病毒载体。即，本发明涉及一种利用复制能力缺失型逆转录病毒载体导入抗体基因，通过表达转基因生产抗体的G0转基因嵌合鸟类。

Description

利用逆转录病毒载体表达转基因鸟类中的基因的方法以及由此得到的转基因鸟类

技术领域

本发明涉及能在血液和卵中产生抗体(例如scFv-Fc抗体)的G0转基因嵌合鸟类。本发明还涉及生产抗体的方法，该方法包括产生利用复制能力缺失型逆转录病毒载体导入了外源抗体基因的G0转基因嵌合鸟类，并从该鸟类的血、卵白或卵黄中回收产生的抗体。进一步地，本发明还涉及制备高效表达转基因的G0转基因嵌合鸟类的方法、以及通过该制备方法获得的G0转基因嵌合鸟类。

背景技术

作为基因功能的研究方法，目前正盛行研究把外源基因整合到宿主中的基因导入(转基因)动物。这些转基因动物不仅可以用于基础研究，还可以用于品种改良、物质生产、移植器官的供体和产业应用等。使牛、山羊、绵羊等在乳汁中产生生理活性物质的尝试已经接近于实用，其代表性例子是α1-抗胰蛋白酶和抗凝血酶目前正处于临床试验阶段，旨在将其作为药物应用。

以鹌鹑和鸡为代表的家禽类作为肉食用、产卵用家畜已经有很长的饲养史，为了进行转基因研究，也正在考虑有关提高抗病性、肉质质量等品种改良的各种尝试。另外，鸟类的性成熟时间短，并且可以在小的空间内饲养，因此能以低成本实现蛋白质表达系统，有望作为抗体药物或稀少蛋白质的产生手段进行转基因生产。鸟类的卵含有大量蛋白质，并且每天连续生产，因此，如果能有意识地在卵中以重组蛋白的形式产生基因转导产物，则可以得到高效的生产系统。

近年来数量众多的品种陆续上市，作为药物备受关注的单克隆抗体不能利用大肠杆菌等的廉价表达系统生产，因此价格昂贵，阻碍了其普及应用。鸟类细胞具有构成抗体蛋白质的功能，转基因鸟类有望作为以往难于大量生产的医疗用抗体等的生产途径。并且，鸟类细胞使这些蛋白质产物添加了糖链，由此提高了在血液中的稳定性等，具有作为药物、检测试剂应用的有利性质的可能性更高。

这样，虽然迄今为止在期待用作有用蛋白质生产途径的转基因鸟类中进行了各种试验，但尚没有使鸟卵在实用水平上蓄积重组蛋白的例子。另外，也没有报告高浓度地表达抗体等由多个单元构成的具有高级结构的蛋白质的转基因鸟类的例子。

Harvey等(Harvey，A.J等(2002)Nature Biotechnology.19，396)用来自禽白血病病毒的载体将β-内酰胺酶导入鸡中产生了G0转基因嵌合鸡，但血清或卵中的酶表达量为50～250ng/ml左右。通过该G0转基因嵌合鸡交配产生的G1～G3转基因鸡全身的体细胞中导入了基因，虽然由此增加了酶的表达量，但还是停留在数μg/ml的水平，该值离实用还差很远。

制备转基因动物时，一般采用往受精卵的前核中显微注射DNA的方法，但鸟类不能采用该方法，原因是鸟类中难于获得单细胞期的胚，即使获得了也没有识别卵内的核的方法。为了获得单细胞期的胚，必须从雌性鸟类的输卵管内获得受精不久的卵，并使其正常发育。近年Perry获得了鸡的卵裂前细胞，并确立了体外培养系统(Perry，M.M(1988)Nature，331)，但通过该方法也不能分辨卵内的核并往核内导入目的基因。

因此，鸟类受精卵的基因转导限于往细胞质中注入DNA，可以尝试在脂质二层膜(脂质体)中包含DNA的方法或磷酸钙法、电导入法(电穿孔法)。但这些方法的基因导入效率差，并且导入的质粒DNA整合到染色体中的可靠性低。通过显微注射的基因转导法可以高效地将目的DNA输送到受精卵中，但导入的质粒DNA不整合到宿主染色体中，因此随着宿主体细胞的分裂，转基因质粒丢失，没有希望获得稳定的基因转导效果。

1986年初报告了通过逆转录病毒载体制备转基因鸡的例子(Salter，D.W等(1986)Poultry Sci.，65)。通过显微注射法将逆转录病毒载体注入受精卵的方法是基因转导效率高的方法，在那些不能往核内直接注入DNA的鸟类中，是往染色体中插入目的基因产生稳定的转基因的唯一实用的方法。

本发明反复进行悉心研究，结果发现了转基因鸟类制备方法，该方法使用基因治疗也用到的安全的自主复制能力缺失型病毒载体，高效地导入目的基因(特开2002-176880号公报)。由此可以安全并且高效地构建具有多个转基因拷贝数的转基因鸟类。另外，通过该方法，转基因可以高效地传递给子代，转基因鸟类作为物质生产系统的应用已经接近实用。

然而，此时导入的基因由于大部分在发育初期被宿主灭活(称作基因沉默)，基因表达的结果只产生微量蛋白质。转基因失活的生物学机理尚不明确，但避免这种失活、使目的基因高效表达的技术对转基因鸟类的应用开发是必须的。

发明概述

为了确定通过逆转录病毒载体导入到受精卵中的基因在发育后失活的时间，本发明人以β-半乳糖苷酶表达基因为指标，研究在受精后的各个时期导入载体后表达量的变化。结果发现，转基因的表达量随该基因是在胚胎发育的哪个时期导入而显著变化，从而完成本发明。即，对于抱卵(spawning)后立即导入的基因，转基因的失活明显，而在抱卵后经过一定时间再导入的基因表达频率高。

本发明人利用了这一见解并发现，如果从开始孵卵时开始，经过特定的时间(该时间取决于鸟的种类)后往早期胚中导入外源基因，则可能高效地表达目的基因，而不受宿主导致的失活的影响。

进一步地，本发明人制备整合了下述基因的载体，该基因编码用作药物的嵌合抗体，例如scFv-Fc(单链抗体)，然后通过该方法将其导入鹌鹑(quail)中，以制备G0转基因嵌合鸟类，结果发现，该转基因产生的抗体在血液、卵白和卵黄中高浓度地表达。

即，本发明第一方面涉及制备G0转基因嵌合鸟类的方法和通过该方法得到的G0转基因嵌合鸟类，该方法包括孵育鸟受精卵，在紧随抱卵后的囊胚期(X期)之后，早期胚用复制能力缺失型逆转录病毒载体感染，并孵化该胚。本发明第二方面涉及G0转基因嵌合鸟类，该G0转基因嵌合鸟类中通过复制能力缺失型逆转录病毒载体导入了外源抗体基因，其特征在于，在血、卵白和卵黄中的至少一种中产生来自该转基因的抗体。本发明第三方面涉及生产抗体的方法，该方法包括制备上述G0转基因嵌合鸟类，并从该G0转基因嵌合鸟类的血和/或卵中回收抗体。

已经确认本发明G0转基因嵌合鸟类的转基因表达甚至保持到该鸟类长大为成鸟。因此，通过本发明可以往鸟类中导入特定的基因，即使在成长后也产生目的蛋白质，从而构建一种实用的生产体系。另外，本发明制备的G0转基因嵌合鸟类的转基因通过交配以高传播率传递给子代。由于转基因以整合在染色体中的形式传递给子代，因此，利用该转基因鸟类的生产体系可以进行稳定的物质生产。

通过本发明，转基因鸟类体细胞中产生的目的蛋白质分泌到血液中，从而可以从血清中分离并利用。

进一步地，本发明还发现，具有人IgG恒定区的抗体或者具有鹌鹑IgG、鸡IgG或小鼠IgG恒定区的抗体在鹌鹑和鸡中高效地从血液转移到卵中。当具有这些恒定区的抗体在通过本发明方法制备的G0转基因嵌合鸟类中表达时，血液中分泌的抗体在卵中高浓度蓄积。

往转基因动物中导入基因以获得目的蛋白质时，哺乳动物中一般是使蛋白质分泌到乳汁中并回收，但在转基因鸟类中，是使目的物在卵中蓄积，然后从其卵白、卵黄中回收并纯化。

在鸡蛋等中，全部成分的30％为蛋白质，作为其主成分的蛋白质为卵清蛋白。作为在转基因鸟类的卵中使重组蛋白表达的方法，以往的观点是利用卵清蛋白等的表达启动子，在其下游整合编码目的蛋白质的基因，使目的物在卵白而不是卵清蛋白中表达。

然而，在本发明的方法中，可以在组成型启动子(例如鸡β-肌动蛋白启动子)等的控制下，使大量表达的抗体(例如上述IgG类抗体等)分泌到血液中，并在卵中蓄积。另外，本说明书中，组成型启动子是指全身性表达的启动子。

另外，为了确定抗体结构中对转移至卵中所必需的部分，将经过修饰的抗体Fab、Fc片断接种到鹌鹑和鸡的血中，以研究其向卵中转移的能力。结果Fc片断蓄积在卵中，表明抗体向卵中的转移通过Fc受体进行。

基于以上发现，在将通过转基因鸟类在卵中生产抗体的方法广泛用于一般蛋白质生产的方法时，考虑了以下的生产方法，该方法包括设计生产蛋白质的载体，该蛋白质具有融合了人IgG恒定区(Fc)的结构，然后构建转基因鸟类，从卵中回收包含目的物质的蛋白质，并切出Fc部分以纯化目的物质。

另外，已经指出，以往使用哺乳类转基因动物生产抗体时，存在难于分离和纯化生产动物自身抗体与目的抗体的的问题。用鸟类作为生产动物的抗体生产法的一个优点是，鸟类自身抗体不吸附在蛋白A和蛋白G柱上，因此其易于与目的重组抗体分离。

如上所述，尽管人单克隆抗体可以用作药物，但其生产只有使用动物细胞培养或小鼠腹水的高成本生产方法，因此其单价很高，这阻碍其普及应用。

近年来用基因工程方法制备了仅仅将抗体的H链和L链的V区用连接序列连接的scFv(单链抗体)，其具有用大肠杆菌也能生产的优点，在成本方面备受关注。但是，被称为低分子的这些蛋白质在血液中的稳定性低，难于作为治疗用或试验用而实用。

在scFv上连接Fc区域得到的scFv-Fc在血液中也很稳定，因此认为其更实用，但不能通过大肠杆菌进行生产，只能通过使用动物的生物反应器进行供给。使具有通过鸡等其它动物制备的结合区域的scFv与人Fc结合得到的人源化scFv-Fc有望用于治疗。因此，如果能够通过本发明的G0转基因嵌合鸟类大量生产这种蛋白质，则具有很大的实用性。

本发明的G0转基因嵌合鸟类可以用于廉价、大量地生产用现有方法只能少量生产的抗体，例如scFv-Fc等重组抗体、嵌合抗体和人单克隆抗体等，并可用于实际回收、纯化。

因此，本发明公开了利用逆转录病毒载体在G0转基因嵌合鸟类中高效表达转基因的制备方法。另外，本发明还公开了通过导入特定的基因来制备在鸟类体细胞中产生有用目的蛋白质的G0转基因嵌合鸟类方法。进一步地，本发明还公开了一种低成本生产蛋白的生产体系，该体系在鸟类细胞中产生以往不能通过大肠杆菌生产的人单克隆抗体、嵌合抗体、scFv-Fc抗体、具有复杂高级结构的功能性蛋白等可以用作药物、检测试剂的物质，然后从血清或卵中回收并利用。

另外，还考虑提供应用本发明的G0转基因嵌合鸟类制备法将家禽鸟类朝好的方向改质的方法和得到的改质鸟类。家禽鸟类好的性质包括肉质改善、抗病性的提高和生长速度的提高等。另外，鸟类还具有多种需要，例如作为宠物等。本发明的制备方法也可以用作对作为宠物的优选性质，例如羽毛颜色的改善、攻击性的降低等，在短时间内进行品种改良的方法。

另外，现在一般通过核移植进行哺乳类、两栖类和鱼类等的转基因生产，本发明可以代替该方法作为高效生产转基因动物的新方法。

即，本发明涉及一种G0转基因嵌合鸟类，其通过复制能力缺失型逆转录病毒载体导入了外源抗体基因，并在血、卵白和卵黄的至少一种中产生转基因的抗体。上述抗体的恒定区优选的类为人IgG，亚类为人IgG1、鹌鹑IgG、鸡IgG或小鼠IgG。上述抗体基因优选通过组成型启动子进行控制，该组成型启动子优选鸡β-肌动蛋白启动子。上述逆转录病毒载体优选来自莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒的载体，并优选VSV-G假型。本发明的G0转基因嵌合鸟类优选鸡或鹌鹑，上述抗体优选嵌合抗体。该嵌合抗体的产量在血液中优选为0.5μg/ml以上，更优选5μg/ml以上；在卵白中优选0.1μg/ml以上，更优选1μg/ml以上；在卵黄中优选0.1μg/ml以上，更优选1μg/ml以上。另外，上述抗体优选scFv-Fc抗体。该scFv-Fc抗体的产量在血液中优选为20μg/ml以上，更优选2000μg/ml以上；在卵白中优选5μg/ml以上，更优选500μg/ml以上；在卵黄中优选5μg/ml以上，更优选500μg/ml以上。制备本发明的G0转基因嵌合鸟类，并从该G0转基因嵌合鸟类的血中和/或卵中回收抗体的抗体生产方法也是本发明的一个方面之一。

生产G0转基因嵌合鸟类的方法也是本发明的一个方面之一，该方法包括孵育鸟类受精卵，除去紧随抱卵后的囊胚期，其后的早期胚用复制能力缺失型逆转录病毒载体感染，并孵化该胚。本发明G0转基因嵌合鸟类的生产方法中，复制能力缺失型逆转录病毒载体的感染时间优选是从孵卵开始24小时以后。复制能力缺失型逆转录病毒载体的感染方法优选包括往早期胚中形成的心脏或血管内进行显微注射。该心脏或血管优选是在孵卵开始24小时以后的早期胚中形成的心脏或血管。显微注射的复制能力缺失型逆转录病毒载体的活性优选不低于1×10⁷cfu/ml的滴度，更优选不低于1×10⁸cfu/ml，进一步优选不低于1×10⁹cfu/ml。上述逆转录病毒载体优选来自莫洛尼鼠白血病病毒的载体，更优选VSV-G假型。通过本发明生产的G0转基因嵌合鸟类优选鸡或鹌鹑。整合到上述复制能力缺失型逆转录病毒载体中的转基因优选包含并非来自于逆转录病毒的基因序列。所述并非来自于逆转录病毒的基因序列优选是被鸡β-肌动蛋白启动子控制的基因序列，并优选是编码抗体基因或融合蛋白基因的基因序列。该抗体基因优选嵌合抗体基因，并优选scFv-Fc抗体基因。

通过本发明G0转基因嵌合鸟类生产方法生产的G0转基因嵌合鸟类也是本发明的一个方面之一。

附图说明

图1表示复制能力缺失型逆转录病毒载体的载体构建物pMSCVNΔAβ的结构。其中，Neo^r表示新霉素抗性基因，Amp^r表示氨苄青霉素抗性基因，P_ΔAct表示β-肌动蛋白启动子基因，β-Gal表示β-半乳糖苷酶表达基因，Ψ+表示包装信号序列，5’LTR和3’LTR分别表示MoMLV的长末端重复序列。

图2表示G0转基因嵌合鹌鹑中基因导入的时期与β-半乳糖苷酶活性表达之间的关系。横轴表示孵卵时间(hr)，纵轴表示以mUnit/mg表示的β-半乳糖苷酶活性。

图3表示G0转基因嵌合鸡中基因导入的时期与β-半乳糖苷酶活性表达之间的关系。横轴表示孵卵时间(hr)，纵轴表示以mUnit/mg表示的β-半乳糖苷酶活性。

图4表示导入的逆转录病毒载体的滴度与G0转基因嵌合鹌鹑中β-半乳糖苷酶活性表达之间的关系。横轴表示以cfu/ml表示的病毒滴度，纵轴表示以mUnit/mg表示的β-半乳糖苷酶活性。

图5表示导入的逆转录病毒载体的滴度与G0转基因嵌合鸡中β-半乳糖苷酶活性表达之间的关系。横轴表示以cfu/ml表示的病毒滴度，纵轴表示以mUnit/mg表示的β-半乳糖苷酶活性。

图6表示蓄积在鹌鹑卵中的人IgG抗体。抗体值表示用3只鹌鹑进行相同试验所得结果的平均值。

图7表示蓄积在鸡卵中的人IgG抗体。抗体值表示用3只鸡进行相同试验所得结果的平均值。

图8表示蓄积在鹌鹑卵中的Fab片断。抗体值表示用3只鹌鹑进行相同试验所得结果的平均值。

图9表示蓄积在鸡卵中的Fab片断。抗体值表示用3只鸡进行相同试验所得结果的平均值。

图10表示蓄积在鹌鹑卵中的Fc片断。抗体值表示用3只鹌鹑进行相同试验所得结果的平均值。

图11表示蓄积在鸡卵中的Fc片断。抗体值表示用3只鸡进行相同试验所得结果的平均值。

图12表示抗CD2抗体表达载体构建物pMSCV/GΔAL(图12(A))、pMSCV/GΔAH(图12(B))以及pMSCV/GΔALIH((图12(C))的结构。其中，Amp^r表示氨苄青霉素抗性基因，P_ΔAct表示β-肌动蛋白启动子基因，Ψ+表示包装信号序列，GFP表示绿色荧光蛋白基因，L表示抗CD2抗体轻链基因，H表示抗CD2抗体重链基因，5’LTR和3’LTR分别表示MoMLV的长末端重复序列。

图13表示scFv-Fc抗体表达载体构建物pMSCV/GΔAscFv-Fc的结构。其中，Amp^r表示氨苄青霉素抗性基因，P_ΔAct表示β-肌动蛋白启动子基因，Ψ+表示包装信号序列，GFP表示绿色荧光蛋白基因，scFv-Fc表示scFv-Fc抗体基因，5’LTR和3’LTR分别表示MoMLV的长末端重复序列。

图14表示在G0转基因嵌合鹌鹑血清中表达的scFv-Fc量。横轴表示个体序号，纵轴表示scFv-Fc抗体浓度(μg/ml)。

图15表示在G0转基因鹌鹑卵中表达的scFv-Fc量。横轴表示从抱卵开始后的采卵日，纵轴表示scFv-Fc抗体浓度(μg/ml)。

图16表示用SDS-PAGE进行的纯化scFv-Fc的分析结果。带1表示低分子量标记(LMW)，带4表示高分子量标记(HMW)，带2表示经还原处理的scFv-Fc的电泳结果，带3表示未经还原处理的scFv-Fc的电泳结果。

发明详述

下面详细说明本发明。

本发明G0转基因嵌合鸟类是通过复制能力缺失型逆转录病毒载体导入了外源抗体基因的鸟类，其特征在于，在血液、卵白或卵黄中产生来自转基因的抗体。

对本发明使用的鸟类没有特别限定，包括鸡、火鸡、鸭、鸵鸟和鹌鹑等为食用、采卵等目的而家禽化的家禽鸟类或宠物鸟等。其中，从容易获得和抱卵数量多的方面考虑，优选鸡和鹌鹑。

作为本发明使用的逆转录病毒载体，可以列举来自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、禽白血病病毒(ALV)等的载体。其中优选来自MoMLV的载体，但本发明不限于此。

考虑到安全性，用作转基因载体的病毒是通过除去一般病毒粒子复制所必需的3种基因gag、pol、env中的任意一种或全部而缺失了自我复制能力的病毒。为了使鸟类细胞高效地感染该病毒载体，优选将外壳蛋白人工转化成VSV-G(来自水疱性口炎病毒)假型得到的病毒载体，但本发明不限于该病毒载体。

利用包装细胞或辅助病毒等制备的假型病毒载体通过常规的显微注射法(Bosselman，R.A等(1989)Science 243、533)导入到早期胚、血管和心脏中。作为基因导入方法，其它还包括脂质转染法和电穿孔法等。

对通过本发明导入到鸟类中的基因没有特别限制，但其由标记基因、用于表达目的基因的结构基因、控制这些基因表达的启动子基因和分泌信号基因等构成。

作为上述标记基因，可以列举新霉素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因、LacZ基因、编码GFP(绿色荧光蛋白)等荧光蛋白的基因等。

对表达上述目的蛋白的结构基因没有特别限制，包括编码在基因产业中有用的抗体(例如人单克隆抗体)、酶等的基因等。另外，也可以使用其它有用生理活性物质的基因。特别是从在卵中蓄积的方面考虑，优选具有人IgG类恒定区的抗体基因、具有人IgG1亚类恒定区的抗体基因、具有鹌鹑IgG、鸡IgG或小鼠IgG恒定区的抗体基因等外源抗体的结构基因。

优选的上述结构基因还可以列举嵌合抗体的结构基因。

嵌合抗体是指由两种或多种不同遗传物质构成的抗体。

以往由于通过小鼠杂交瘤制备的医疗用抗体是来自于小鼠，因此施用到人体时存在免疫系统出现排斥反应的问题。作为上述嵌合抗体，可以列举改进了上述缺点、用人抗体替换小鼠抗体中与抗原蛋白结合的区域以外的区域、从而消除排斥反应的嵌合抗体，例如抗人CD2抗体、抗CD20受体抗体、抗TNF抗体等，这些抗体中有些已经作为医药产品上市。

更优选的上述结构基因可以列举scFv-Fc抗体的结构基因。

医疗用的重组抗体中，有一组称为低分子抗体。免疫球蛋白IgG中存在包含VH、VL的异二聚体的区域，其被称为直接与抗原结合的可变区(Fv：可变区的片断)，该Fv区虽然分子量仅为IgG的约1/5，但其单独具有足够的抗原结合能力。在VH、VL区之间用肽接头人工连接得到的物质是称为单链抗体(scFv：单链Fv)的低分子抗体，已知其稳定性比单独的VH、VL高。

Powers等(Powers，D.B等(2000)J Immunol Method.251，123)通过使该scFv与来自人IgG1的Fc部分融合，发现其在血液中的稳定性提高。虽然想将该scFv-Fc抗体用于医疗，但不能用大肠杆菌这一廉价的大量生产系统进行生产。

其它优选的上述基因序列可以列举融合蛋白的结构基因。

通过基因重组使两种或多种蛋白的一部分融合，得到一组人工蛋白，称为融合蛋白，其中已经作为医药产品付诸实用的有TNF受体与免疫球蛋白的Fc融合得到的TNFR-Fc，或LFA3与Fc融合得到的LFA3-Fc等。这些是通过融合Fc变得可以溶解，从而设计成具有强生理活性的人工蛋白。

在本发明的G0转基因嵌合鸟类中，通过使用这些单克隆人抗体基因、嵌合抗体基因、scFv-Fc抗体基因作为导入到鸟中的基因，可以廉价地大量生产以往生产困难的抗体医药产品。

例如，在导入了嵌合抗体基因的G0转基因嵌合鸟类的情况中，血液中的抗体含量优选为0.5μg/ml以上，更优选5μg/ml以上；卵白中的抗体含量优选为0.1μg/ml以上，更优选1μg/ml以上；卵黄中的抗体含量优选为0.1μg/ml以上，更优选为1μg/ml以上。

另外，在导入了scFv-Fc抗体基因的G0转基因嵌合鸟类的情况中，血液中的抗体含量优选为20μg/ml以上，更优选2000μg/ml以上；卵白中的抗体含量优选为5μg/ml以上，更优选500μg/ml以上；卵黄中的抗体含量优选为5μg/l以上，更优选为500μg/ml以上。

作为上述启动子基因，可以列举组成型启动子。抗体基因被组成型启动子控制时，由于抗体基因的表达稳定，因此优选。更优选的组成型启动子可以列举鸡β-肌动蛋白启动子。

本发明抗体生产方法的特征在于，包括生产本发明的G0转基因嵌合鸟类，并从该G0转基因嵌合鸟类的血和/或卵中回收抗体。

以下说明本发明G0转基因嵌合鸟类的生产方法。

作为该生产方法之一，可以列举以下方法，该方法包括孵育鸟类受精卵，除去紧随抱卵后的囊胚期，其后的早期胚用复制能力缺失型逆转录病毒载体感染，并孵化该胚。另外，下述方法也是本发明的生产方法之一，孵育鸟类受精卵，从孵卵开始24小时以后的早期胚用复制能力缺失型逆转录病毒载体感染，并孵化该胚。

更优选往在上述早期胚中形成的心脏或血管内显微注射复制能力缺失型逆转录病毒载体的方法。

即，本发明G0转基因嵌合鸟类的生产方法包括往抱卵后经过特定时间的受精卵中显微注射复制能力缺失型逆转录病毒载体。对于抱卵后受精卵的早期发育，以鸡为例，首先，在输卵管中受精的卵在受精后约1.5小时开始卵裂。以连有细胞质的状态开始盘状卵裂的卵在释放到体外之前分裂1天，变成包含约6万个细胞的称为囊胚的胚(囊胚期)。该囊胚以直径3～4mm的白环在卵黄中央被观察到。该胚分裂成上层和下层，形成囊胚腔。抱卵在形成下胚层时发生，形成原条，囊胚变成上、中、下三层结构，形成三胚层。然后，经过胚的形成、成长，在排卵后的第22天孵化。囊胚期又称为X期。由于生殖细胞产生于该时期的细胞的一部分，因此以往使用该时期的受精卵作为基因导入对象。

本发明中，将紧随抱卵后的囊胚期的受精卵置于适合孵化的条件下(例如，当为鸡时，适于孵化的环境条件为37.7～37.8℃、湿度50～70％左右)，将置于该条件下的时间设为0时间，以此作为孵卵开始时间，陆续进行各种处理。鹌鹑和鸡分别在孵卵开始后36小时和50小时左右观察到卵黄上形成血管系统，并且观察到一种将要分化成心脏的器官的搏动。

孵化导入了上述基因的受精卵时，可以采用利用本发明人开发的人工卵壳的方法(Kamihira，M.等(1998)Develop.Growth Differ.，40，449)等。

作为本发明生产方法中使用的复制能力缺失型逆转录病毒载体、待导入的基因和转基因鸟类，可以列举与上述G0转基因嵌合鸟类中同样的物质。

整合到上述复制能力缺失型逆转录病毒载体中的转基因优选包含并非来自逆转录病毒的基因序列。另外，在本发明的生产方法中，“并非来自逆转录病毒的基因”包括上述结构基因、启动子基因和分泌信号基因等。所述并非来自逆转录病毒的基因序列优选被鸡β-肌动蛋白启动子控制的基因序列，并优选编码抗体基因或融合蛋白基因的基因序列。

本发明的生产方法中，从高效导入基因方面考虑，优选显微注射具有1×10⁷cfu/ml以上，优选1×10⁸cfu/ml以上，更优选1×10⁹cfu/ml以上的滴度的复制能力缺失型逆转录病毒载体。

通过本发明生产方法往受精卵中导入了基因的鸟类以体细胞中具有嵌合状(mosaic shape)转基因的转基因鸟类形式成长。将第一代转基因鸟类称为G0转基因嵌合鸟类。

通过本发明生产方法得到的上述G0转基因嵌合鸟类也是本发明的一个方面之一。

当G0转基因嵌合鸟类与非转基因鸟类交配、或者G0转基因嵌合鸟类彼此之间交配，从在其染色体上携带转基因的那些生殖细胞产生第二、第三代时，其以全身的体细胞都包含转基因的个体形式成长。从G0转基因嵌合鸟类个体继承了转基因的子代依次称为G1～G2～G3转基因鸟类。

使本发明的G0转基因嵌合鸟类与同种异体的非转基因鸟类或配偶型(mating type)G0转基因嵌合鸟类交配，由此可以将转基因传递给子代，并且可以生产全身的体细胞中均携带有转基因的完全转基因鸟类。完全转基因鸟类中携带转基因的体细胞比例高，因此与G0转基因嵌合鸟类相比，其有望提高来自转基因的重组蛋白产量。另外，通过确立转基因稳定传递的转基因鸟类系统，可以使蛋白质生产系统的质量稳定化。

具体实施方式

以下通过实施例详细说明本发明，但本发明不限于这些实施例。

(实施例1)β-半乳糖苷酶表达载体构建物的制备

如下制备β-半乳糖苷酶表达载体构建物pMSCVNΔAβ。

1.用限制酶XhoI和HindIII从质粒pLXRN(BD Biosciences Clontech公司)切取Rous肉瘤病毒(RSV)启动子片断，并插入质粒pBluescriptIISK(+)(Stratagene公司)的XhoI、HindIII位点，制备质粒pBlue/RSV。

2.用限制酶NotI从质粒pCMVβ(BD Biosciences Clontech公司)切取β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因片断，并插入质粒pZeoSV2(+)(Invitrogen公司)的NotI位点。将具有以与T7启动子相同的方向插入了β-Gal基因的结构的质粒称为pZeo/lacZ。

3.用限制酶XhoI和PstI从pBlue/RSV切取RSV启动子片断，用限制酶PstI和XhoI从pZeo/lacZ切取β-Gal基因片断。将上述切取的2个片断连接到经限制酶XhoI处理的质粒pLNHX(BD Biosciences Clontech公司)的载体片断上，制备质粒pLNRβ。

4.用限制酶SacII和XhoI从pLNHX切取包含莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMuSV)5’-长末端重复序列(LTR)、病毒包装信号和新霉素耐性(Neo^r)基因的片断，并连接到经限制酶SacII和XhoI处理的pLXRN的载体片断上，制备质粒pLXL。

5.用限制酶HindIII和XhoI从pZeo/lacZ切取β-Gal基因片断，并连接到经限制酶HindIII和XhoI处理的pLXL的载体片断上，制备质粒pLZL。

6.通过PCR(94℃/15秒→55℃/30秒→72℃/1分30秒：35个循环；KOD-Plus-DNA聚合酶(东洋纺公司))，从质粒pMiwZ(Suemori等，1990，Cell DiFF.Dev.29：181-185)扩增RSV启动子和鸡β肌动蛋白(Act)启动子的杂合启动子(Miw启动子)的5’区域片断，所述PCR以两个化学合成的寡核苷酸5’-cggtctagaggaattcagtggttcg-3’(SEQ ID NO：1)和5’-cca ggatccgacgttgtaaaacgacg-3’(SEQ ID NO：2；下划线所标部分为BamHI限制酶位点)作为引物。然后用限制酶BamHI和MunI切取，插入质粒pGREENLANTERN-1(Gibco BRL公司)的BamHI、MunI位点，制备质粒pGmiw5’。

7.用限制酶MunI和ClaI从pMiwZ切取Miw启动子5’侧中央区域片断，并插入pGmiw5’的MunI、ClaI位点，制备质粒pGmiw5’-2。

8.用BamHI和EcoRI从pGmiw5’-2切取包含Miw启动子5’区域和5’侧中央区域的片断，并插入pBluescriptIISK(+)的BamHI、EcoRI位点，制备质粒pBlue/MiW5’。

9.通过PCR(98℃/15秒→60℃/30秒→72℃/30秒：35个循环)从pMiwZk扩增Miw启动子3’区域片断，所述PCR以两个化学合成的寡核苷酸5’-cca aagcttgccgcagccattgcctttt-3’(SEQ ID NO：3；下划线所标部分为HindIII限制酶位点)和5’-ata cctaggggctggctgcggaggaac-3’(SEQ ID NO：4；下划线所标部分为BlnI限制酶位点)作为引物。然后用限制酶HindIII和BlnI切取，并连接到经限制酶HindIII和BlnI处理的pLXL的载体片断上，制备质粒pLMiw3’。

10.用限制酶EcoRI和MboII从pMiwZ切取Miw启动子3’侧中央区域片断，用限制酶MboII和KpnI从pLMiw3’切取Miw启动子3’区域片断。将上述切取的两个片断插入pBlue/Miw5’的EcoRI、KpnI位点，制备质粒pBlue/Miw。

11.用限制酶BamHI和BlnI从pBlue/Miw切取包含Miw启动子全长的片断，并连接到经限制酶BamHI和BlnI处理的pLXL的载体片断上，制备质粒pLML。

12.用限制酶SmaI和XbaI从pLML切取Act启动子片断，并插入pBluescriptIISK(+)的EcoRV、XbaI位点，制备质粒pBlue/Act。

l 3.用限制酶HindIII和BglII从pLML切取Miw启动子片断，并插入经限制酶HindIII和BamHI处理的pLZL的载体片断上，制备质粒pLMβL。

14.用限制酶SalI和BlnI从pBlue/Act切取Act启动子片断，用限制酶BlnI和BGlII从pLMβL切取β-Gal基因片断。将上述切取的两个片断连接到经限制酶XhoI和BglII处理的pLNRβ的载体片断上，制备质粒pLNAβ。

15.通过PCR(98℃/15秒→60℃/30秒→68℃/2分钟：30个循环)从pMiwZ扩增内含子缺失型肌动蛋白(ΔAct)启动子片断，所述PCR以两个化学合成的寡核苷酸5’-ttta gctagctgcagctcagtgcatgcac-3’(SEQ ID NO：5；下划线所标部分为NHeI限制酶位点)和5’-ataa tctagaaacgcagcgactcccgc-3’(SEO IDNO：6；下划线所标部位为XbaI限制酶位点)为引物。然后用限制酶XhoI(XhoI限制酶位点存在于扩增片断中)和XbaI切取包含ΔAct启动子的一部分的片断。用限制酶BlnI和BglII从pLNAβ切取包含ΔAct启动子其余部分和β-Gal基因的片断。将上述切取的2个片断连接到经限制酶XbaI和BglII处理的pLNAβ的载体片断上，制备质粒pLNΔAβ。

16.用限制酶BlnI和BglII从pLNΔAβ切取包含一系列Neo^r基因、ΔAct启动子和β-Gal基因的片断，并连接到经限制酶BlnI和BglII处理的pLXL的载体片断上，制备质粒pLNΔAβ-2。

17.用限制酶BamHI和BglII从pLNΔAβ-2切取包含一系列Neo^r基因、ΔAct启动子和β-Gal基因的片断，并连接到经限制酶BamHI和BglII处理的质粒pMSCVneo(BD Biosciences Clontech公司)的载体片断上。将BamHI和BglII位点消失的质粒称为pMSCVNΔAβ。

如上制备的复制能力缺失型逆转录病毒的载体构建物pMSCVNΔAβ的结构如图1所示。

(实施例2)表达β-半乳糖苷酶的逆转录病毒载体的制备

为了由实施例1中制备的载体构建物pMSCVNΔAβ制备逆转录病毒载体，将5×10⁶包装细胞GP293(BD Biosciences Clontech公司)接种到直径100mm的培养皿中进行培养。将培养基换成新鲜的DMEM(Dullbecco改进的Eagle培养基)，将P-VSV-G载体(BD Biosciences Clontech公司)8μg和pMSCVNΔAβ 8μg通过脂质转染法导入上述GP293细胞中。48小时后，回收包含病毒粒子的培养上清，并通过0.45μm的醋酸纤维素过滤器(Advantech公司)除去杂质。往所得的溶液中加入Polybrene(Sigma公司)使其浓度为10μg/ml，制备病毒溶液。

将制备的病毒溶液另外添加到所培养的GP293细胞中，48小时后用包含G418(GIBCO BRL公司)600μg/ml的培养液继续培养，得到G418稳定转化的GP293株。

将所得的稳定转化株在直径100mm的皿中培养至80％铺满，通过脂质转染法导入pVSV-G载体16μg，48小时后回收包含病毒粒子的培养上清12ml。

将该培养上清在4℃以50,000×g离心1.5小时，使病毒沉淀。除去上清，往包含病毒粒子的沉淀物中加入50μl的50mM Tris-HCl(PH 7.8)、130mMNaCl、1mM EDTA溶液，在4℃放置一晚，充分悬浮后回收病毒溶液。按照上述方法得到的高滴度病毒载体为10⁸～10⁹cfu/ml。

病毒载体的测定如下进行。在测定的前一天将7×10⁴个NIH3T3细胞(从American Type Culture Collection购得)接种到直径35mm的培养皿中并培养。往各皿中加入1ml稀释10²～10⁶倍的病毒溶液，48小时后用荧光显微镜测定表达GFP(绿色荧光蛋白基因)的细胞的比例，通过下式计算滴度。

病毒滴度＝细胞数×稀释率×表达比例(cfu/ml)

(实施例3)往鹌鹑胚中注入逆转录病毒载体

使用WE品系的鹌鹑受精卵(日本生物科学研究所)，以将该受精卵放置到内置于自动卵转动装置中的孵卵器(Showafuranki公司，P-008型)、37.9℃、湿度65％的环境的时刻作为孵卵开始时刻(0小时)，以后每隔15分钟将卵转动90度，孵卵。

在孵卵开始时，用70％的乙醇将受精卵的卵壳消毒，用钻石切割器(MINIMO7C710，Minitor公司)在尖端部切开直径2cm的圆形，暴露胚。用立体显微镜观察囊胚，同时将玻璃管(CD-1，Olympus公司)用微量移液管制作器(PC-10，Olympus公司)进行加工，将末端折叠使其外径约为20μm，制成针，插入该针，用显微注射器(Transjector5246，Eppendorf公司)在囊胚下腔的中央微量注入实施例2中制备的病毒溶液约2μl。填充卵白至该卵壳的切口，然后用卵白将聚四氟乙烯膜(MilliWrap，Millipore公司)和聚偏氯乙烯盖(wrap)(Saran Wrap，Asahi Kasei公司)糊上，每隔15分钟将卵转动90度，孵卵。

在孵卵开始12小时、24小时后以同样的方法往受精卵中注入病毒。从孵卵后大约第36小时开始发现卵黄表面形成血管，通过立体显微镜可以观察其中的一部分搏动并变成心脏原基。用显微注射器往孵卵后第36、48和第55小时的心脏中微量注入实施例2中制备的病毒溶液2μl。

(实施例4)往鸡胚中注入逆转录病毒载体

使用鸡受精卵(日本生物科学研究所)，以将该受精卵放置到内置于自动卵转动装置中的孵卵器(Showafuranki公司，P-008型)、37.9℃、湿度65％的环境的时刻作为孵卵开始时刻(0小时)，以后每隔15分钟将卵转动90度，孵卵。

在孵卵开始时，用70％的乙醇将受精卵的卵壳消毒，用钻石切割器(MINIMO7C710，Minitor公司)在尖端部切开直径3.5cm的圆形，暴露胚。用立体显微镜观察囊胚，同时将玻璃管(CD-1，Olympus公司)用微量移液管制作器(PC-10，Olympus公司)进行加工，将末端折叠使其外径约为20μm，制成针，插入该针，用显微注射器(Transjector5246，Eppendorf公司)在囊胚下腔的中央微量注入实施例2中制备的病毒溶液约2μl。填充卵白至该卵壳的切口，然后用卵白将聚四氟乙烯膜(MilliWrap，Millipore公司)和聚偏氯乙烯盖(Saran Wrap，Asahi Kasei公司)糊上，每隔15分钟将卵转动90度，孵卵。

在孵卵开始12小时、24小时后以同样的方法处理受精卵。从孵卵后大约第50小时开始发现卵黄表面形成血管，通过立体显微镜可以观察其中的一部分搏动并变成心脏原基。用显微注射器往孵卵后第50、55和第60小时的心脏中微量注入实施例2中制备的病毒溶液2μl。

(实施例5)测定β-半乳糖苷酶的活性

从孵卵开始第115小时后，从卵壳中取出胚，用PBS(磷酸缓冲液)洗净，除去包围胚的膜。将摘出的胚剪细，加入0.8ml反应缓冲液(10mM KCl、1mMMGCl₂、0.1％Triton X-100(和光纯药工业公司)、5mM 2-巯基乙醇(和光纯药工业公司)、2mM磷酸缓冲液，pH 7.5)进行超声破碎，得到细胞液。

将0.6ml细胞液在37℃温育10分钟，加入预先温热的4mg/ml邻-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)(Sigma公司)的0.1M磷酸缓冲液(pH 7.5)溶液0.1ml。反应后加入0.3ml的1M Na₂CO₃(和光纯药工业公司)，用吸光计测定420nm处的波长强度。

β-半乳糖苷酶的活性用ONPG单位表示(1个单位：每1分钟产生1μmol邻-硝基苯酚时的活性)。进行三次实验，取其平均值作为β-半乳糖苷酶活性。

鸡和鹌鹑中基因导入时期与β-半乳糖苷酶活性测定结果的关系如图2和图3所示。鹌鹑在孵卵48小时后、鸡在孵卵55小时后导入的β-半乳糖苷酶基因表达比在此前的时期进行导入时强。这意味着鸟类受精卵通过逆转录病毒使外源基因失活(沉默)的机理在受精后立即明显，并随时间而减弱。因此，在经过因鸟的种类所决定的特定时间后往受精卵中导入目的基因，由此可以生产高效表达转基因而不使其失活的G0转基因嵌合鸟类。

(实施例6)病毒滴度决定的基因表达效率

将实施例2中制备的1×10⁸cfu/ml的病毒液用稀释溶剂(50mMTris-HCl(PH 7.8)、130mM NaCl、1mM EDTA溶液)以10倍、100倍和1000倍三阶段稀释，制备1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵cfu/ml滴度的病毒溶液。孵育鹌鹑受精卵，往48小时后的早期发育心脏中显微注射所制备的病毒液2μl。同样往48小时后的早期发育心脏中只注射稀释溶剂，以此作为对照。

在孵卵开始115小时后按照实施例5测定β-半乳糖苷酶活性。鹌鹑中病毒滴度与基因表达结果之间的关系如图4所示。

同法孵育鸡受精卵，往55小时后的早期发育心脏中显微注射所制备的病毒液2μl。往55小时后的早期发育心脏中只注射稀释溶剂，以此作为对照。

在孵卵开始115小时后按照实施例5测定β-半乳糖苷酶活性。鸡中病毒滴度与基因表达结果之间的关系如图5所示。

在注入了1×10⁸cfu/ml病毒的鹌鹑和鸡中发现了明显的β-半乳糖苷酶活性，低于此浓度时表达量低。该结果表明，转基因的表达受病毒滴度的影响很大，即，为了用本发明的G0转基因嵌合鸟类高效地表达转基因，使用高滴度的复制能力缺失型载体有效。

(实施例7)人抗体向鹌鹑、鸡卵中的转移性

将包含具有3种亚类的人抗体(IgG1、2、3)(Cosmo Bio公司)混合物以及对应的3种抗体片断(Fab-1、Fab-2、Fab-3、Fc-1、Fc-2、Fc-3)(Cosmo Bio公司)用PBS稀释成100μg/ml，将稀释液100μl注射到成年鹌鹑(3只)和成年鸡(3只)的翼下静脉中。

从静脉注射抗体的次日起至第20天进行采卵，测定转移到卵中的抗体量。用PBS将卵黄和卵白分别稀释至50％(W/V)、10％(V/V)，冷冻保藏作为测定样品。

(实施例8)通过ELISA法测定卵黄中的抗体量

将PBS稀释的抗人IgG抗体(Cosmo Bio公司)以100μG/孔加到ELISA平板上，在4℃静置一晚。每孔用PBS-0.05％吐温20溶液200μl洗涤3次，然后以150μl/孔加入PBS-0.05％吐温20溶液-2％脱脂乳。

在室温静置2小时后，用PBS-0.05％吐温20溶液200μl将孔洗涤3次，加入采取的血液、卵白和卵黄样品120μl，在4℃静置一晚。使该ELISA平板恢复至室温后，用PBS-吐温20溶液将各孔洗涤3次，加入用PBS-0.05％吐温20溶液稀释的Peroxide(POD)标记抗人IGG抗体(Cosmo Bio公司)100μl孔，在室温静置1小时。

用PBS-0.05％吐温20溶液将孔洗涤4次，往孔中加入着色液(如下制备：将10mg的邻苯二胺(片山化学工业公司)溶于1ml甲醇中，用蒸馏水稀释至100ml，并加入10μl过氧化氢水(和光纯药工业公司))100μl。加入8M硫酸50μl终止反应，用平板计数器(plate reader)测定490nm处的荧光强度，通过标准校正曲线计算浓度。计算由鹌鹑和鸡各3只得到的样品的抗体浓度平均值作为结果。

将用于绘制标准校正曲线的标准抗体(Cosmo Bio公司)用50％卵黄-PBS(W/V)稀释。

鹌鹑和鸡的卵中蓄积的抗体浓度如图6、图7所示。鹌鹑和鸡的卵中蓄积的Fab、Fc片断浓度如图8、9、10、11所示。

结果发现，在鹌鹑和鸡中，人IgG抗体(人IgG2、人IgG1亚类)高效地蓄积在卵中。另外，Fc片断具有较高的卵内转移性，这表明Fc受体参与人IgG的转移。

(实施例9曲抗CD2抗体表达载体构建物的制备

如下制备抗CD2抗体表达用载体构建物pMSCV/GΔAH、pMSCV/GΔAL和pMSCV/GΔALIH。

1.用QuicK prep Micro mRNA Purification试剂盒(Pharmacia公司)从产生人抗体(IgM)的杂交瘤细胞D253-15-6(American Type Culture CollectionHB-8789)获得mRNA，用cDNA第一链合成试剂盒(First-Strand cDNASynthesis Kit)(Pharmacia公司)由所得的mRNA制备cDNA文库。通过PCR(94℃/1分钟→50℃/1分钟→72℃/1分30秒：25个循环；Taq DNA聚合酶(Perkinelmer公司))从上述cDNA文库扩增人抗体L链链κ恒定区(hCκ)的基因片断，所述PCR以两个化学合成寡核苷酸5’-atc ctcgagaggccaaagtacagtg-3’(SEQ ID NO：7；下划线所标部分为XhoI限制酶位点)和5’-ccc ggatccctaacactctcccct gttgaagct-3’(SEQ ID NO：8；下划线所标部分为BamHI限制酶位点)作为引物。然后用限制酶XhoI和BamHI切取，并插入质粒pBluescriptIIKS(-)(Stratagene公司)的XhoI、BamHI位点，制备质粒pBlue/hCκ。

2.同样地，以两个化学合成寡核苷酸5’-ag cggccgctacaggtgtccactccgacatcgtgatgacccagtctcc-3’(SEQ ID NO：9；下划线所标部分为NotI限制酶位点)和5’-cct ctcgaggatagaagttattcagcaggcacac-3’(SEQ ID NO：10；下划线所标部分为XhoI限制酶位点)为引物，通过PCR从上述cDNA文库扩增人抗体L链可变区(hVL)基因片断，然后用限制酶NotI和XhoI切取，并插入pBluescriptIIKS(-)的NotI、XhoI位点，制备质粒pBlue/hVL。

3.同样地，以两个化学合成寡核苷酸5’-ac ctcgagcgtggccgttggctgcctcgcaca-3’(SEQ ID NO：11；下划线所标部分为XhoI限制酶位点)和5’-act aagcttacgttgtacagggtgggtttacc-3’(SEQ ID NO：12；下划线所标部分为HindIII限制酶位点)引物，通过PCR从上述cDNA文库扩增人抗体H链μ恒定区(hCμ)的基因片断，然后用限制酶XhoI和HindIII切取，并插入pBluescriptIIKS(-)的XhoI、HindIII位点，制备质粒pBlue/hCμ。

4.同样地，以两个化学合成寡核苷酸5’-a gcggccgctacaggtgtccactccgaggtgcagctggtggagtctgg-3’(SEQ ID NO：13；下划线所标部分为NotI限制酶位点)和5’-cacg ctcgaggtatccgacggggaattctcacagga-3’(SEQ ID NO：14；下划线所标部分为XhoI限制酶位点)为引物，通过PCR从上述cDNA文库扩增人抗体H链可变区(hVH)的基因片断，然后用限制酶NotI和XhoI切取，并插入pBluescriptIIKS(-)的NotI、XhoI位点，制备质粒pBlue/hVH。

5.用限制酶XhoI和BamHI从pBlue/hCκ切取hCκ基因片断，并插入质粒pCEP4(Invitrogen公司)的XhoI、BamHI位点，制备质粒pCEP4/hCκ。

6.用使两个化学合成寡核苷酸5’-ccc aagcttgatctccactgggatggtgggggccctcctcttgctgctg-3’(SFQ ID NO：15；下划线所标部分为HindIII限制酶位点)和5’-ccc ggatcctcagtcaaggcgccttcgcatgaagaggccgatccccagggccaccaccagcagcaagaggagggcccc-3’(SEQ ID NO：16；下划线所标部分为BamHI限制酶位点)在具有互补3’末端的21个bp上退火，用T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)通过DNA双链合成反应制备表皮生长因子受体跨膜区(TM)的基因片断。将所得的TM基因片断用限制酶HindIII和BamHI处理后，插入pBluescriptIIKS(-)的HindIII、BamHI位点，制备质粒pBlue/TM。

7.用限制酶XhoI和HindIII从pBlue/hCμ切取hCμ基因片断，并插入pBlue/TM的XhoI、HindIII位点，制备质粒pBlue/hCμTM。

8.用限制酶XhoI和BamHI从pBlue/hCμTM切取包含一系列hCμ基因和TM基因的片断，并插入pCEP4的XhoI、BamHI位点，制备质粒pCEP4/hCμTM。

9.将pCEP4/hCμTM用限制酶BamHI切断，末端用T4 DNA聚合酶进行平滑处理，然后通过自身连接制备质粒pCEP4/hCμTMΔB。

10.利用化学合成寡核苷酸5’-tgaagacagat ggcgccgccacagttcgttt-3’(SEQ IDNO：17；下划线所标部分为NarI限制酶位点)进行定点突变，在不改变氨基酸密码子的条件下，往pBlue/hVL包含的hVL的3’末端导入限制酶NarI位点，制备质粒pBlue/hVLN。

11.利用化学合成寡核苷酸5’-tggggcggatgc ggatcctgaggagac ggt-3’(SEQ IDNO：18；下划线所标部分为BamHI限制酶位点)进行定点突变，在不改变氨基酸密码子的条件下，往pBlue/hVH包含的hVH 3’末端导入限制酶BamHI位点，制备质粒pBlue/hVHB。

12.用QuicK Prep Micro mRNA纯化试剂盒(Purification Kit)从产生抗人CD2小鼠抗体的杂交瘤细胞TS2/18.1.1(American Type CultureCollection HB-195)获得mRNA，用cDNA第一链合成试剂盒(First-StrandcDNA Synthesis Kit)由所得的mRNA制备cDNA文库。以两个化学合成寡核苷酸5’-c gcggccgcctcagggaaagtttgaagatG-3’(SEQ ID NO：19；下划线所标部分为NotI限制酶位点)和5’-c ggcgccgccacagtccgttttatttcca gcttggt-3’(SEQ IDNO：20；下划线所标部分为NarI限制酶位点)为引物，通过PCR从上述cDNA文库扩增小鼠抗体L链可变区(mVL)的基因片断，然后用限制酶NotI和NarI切取，并插入pBlue/hVLN的NotI、NarI位点，制备质粒pBlue/mVL。

13.同样地，以两个化学合成寡核苷酸5’-c gcggccgcgaacacggamccctcaccatg-3’(SEQ ID NO：21；下划线所标部分为NotI限制酶位点)和5’-c ggatcctgcagagacagtgaccagagt-3’(SEQ ID NO：22；下划线所标部分为BamHI限制酶位点)为引物，通过PCR从上述cDNA文库扩增小鼠抗体H链可变区(mVH)的基因片断，然后用限制酶NotI和BamHI切取，插入pBluescriptIIKS(-)的NotI、BamHI位点，制备质粒pBlue/mVH。

14.用限制酶NotI和XhoI从pBlue/mVL切取mVL基因片断，并插入pCEP4/hCκ的NotI、XhoI位点，制备质粒pCEP4/IgLκ。

15.用限制酶NotI和XhoI从pBlue/hVHB切取hVH基因片断，并插入pCEP4/hCμTMΔB的NotI、XhoI位点，制备质粒pCEP4/hIgHμTM。

16.用限制酶NotI和BamHI从pBlue/mVH切取mVH基因片断，并连接到经限制酶NotI和BamHI处理的pCEP4/hIgHμTM的载体片断上，制备质粒pCEP4/IgHμTM。

17.用限制酶BGlII和BamHI质粒从pMSCVneo(BD BiosciencesClontech公司)除去包含鼠磷酸甘油激酶(PGK)启动子和Neo^r基因系列的片断，通过剩余载体片断的自身连接制备质粒pMSCV。

18.用限制酶NotI质粒从pGREEN LANTERN-1(Gibco BRL公司)切取GFP基因片断，并插入pZeoSV2(+)的NotI位点。具有以与T7启动子相同的方向插入了GFP基因的结构的质粒称为pZeo/GFP。

19.用限制酶EcoRI和XhoI从pZeo/GFP切取GFP基因片断，并连接到经限制酶EcoRI和XhoI处理的pMSCV的载体片断上，制备质粒pMSCV/G。

20.用mRNA分离试剂盒(mRNA isolation Kit)(Roche Ltd.)从产生人抗体(IgG1)的骨髓瘤细胞IM-9(Japanese Collection of Research Bioresources 0024)获得mRNA，用Revertra Ace(Toyobo Co.，Ltd.)由所得的mRNA制备cDNA文库。以两个化学合成寡核苷酸5’-caagcttcaagggcccat-3’(SEQ ID NO：23)和5’-atttacccggagacaggga-3’(SEQ ID NO：24)作为引物，通过PCR(95℃/2分钟→52℃/30秒→74℃/3分钟：30个循环；Pfu DNA聚合酶(Promega Corporation))从上述cDNA文库扩增人抗体H链γ1恒定区(hCγ1)的基因片断。进一步地，以两个化学合成寡核苷酸5’-ata ggatccgctagcttcaagggcccatcg-3’(SEQ IDNO：25；下划线所标部分为BamHI限制酶位点)和5’-agc aagctttcatttacccggagacaggga-3’(SEQ ID NO：26；下划线所标部分为HindIII限制酶位点)为引物，通过PCR(94℃/15秒→58℃/30秒→68℃/1分钟：30个循环；KOD-plus-DNA聚合酶)从上述PCR产物扩增hCγ1基因片断，然后用限制酶BamHI和HindIII切取，插入pBluescriptIISK(+)的BamHI、HindIII位点，制备质粒pBlue/hCγ1。

21.用限制酶HindIII和BamHI从pCEP4/IgHμTM切取mVH基因片断，用限制酶BamHI和HindIII从pBlue/hCγ1切取hCγ1基因片断，将上述切取的两个片断连接到经限制酶HindIII处理的质粒pETBlue-2(Novagen，Inc.)的载体片断上，制备质粒pETBlue/IgHγ1。

22.用限制酶HindIII从pETBlue/IgHγ1切取抗体H链γ1(IgHγ1)的基因片断，并插入pMSCV/G的HindIII位点。将具有以与GFP基因相同的方向插入了IgHγ1基因的结构的质粒称为pMSCV/GH。

23.以两个化学合成寡核苷酸5’-acgc gtcgacgtgcatgcacgctcatt g-3’(SEQ IDNO：27；下划线所标部分为SalI限制酶位点)和5’-acgc gtcgacaacgcagcgactcccg-3’(SEQ ID NO：28；下划线所标部分为SalI限制酶位点)为引物，通过PCR(94℃/15秒→50℃/30秒→68℃/1分钟：10个循环；94℃/15秒→62℃/30秒→68℃/1分钟：30个循环)从pMiwZ扩增ΔAct启动子片断，然后用限制酶SalI切取ΔAct启动子片断，并插入pETBlue-2的SalI位点，制备质粒pETBlue/ΔAct。

24.用限制酶SalI从pETBlue/ΔAct切取ΔAct启动子片断，并插入pMSCV/GH的XhoI位点。将具有以与IgHγ1基因相同的方向插入了ΔAct启动子的结构的质粒称为pMSCV/GΔAH。

25.以两个化学合成寡核苷酸5’-aat gtcgacatggtgtccacttctcagctc-3’(SEQ IDNO：29；下划线所标部分为SalI限制酶位点)和5’-ttc gtcgacctaacactctcccctgttgaa-3’(SEQ ID NO：30；下划线所标部分为SalI限制酶位点)为引物，通过PCR(95℃/30秒→50℃/30秒→74℃/2分钟：10个循环；95℃/30秒→60℃/30秒→74℃/2分钟：30个循环；Pfu DNA聚合酶)从pCEP4/IgLκ扩增抗体L链κ(IgLκ)的基因片断，然后用限制酶SalI切取，并插入pETBlue-2的SalI位点，制备质粒pETBlue/IgLκ。

26.用限制酶SalI从pETBlue/ΔAct切取ΔAct启动子片断，并插入pMSCV/G的XhoI位点。将具有以与GFP基因相同的方向插入了ΔAct启动子的结构的质粒称为pMSCV/GΔA。

27.用限制酶SalI从pETBlue/IgLκ切取IgLκ基因片断，并插入pMSCV/GΔA的SalI位点。将具有以与ΔAct启动子相同的方向插入了IgLκ基因片断的结构的质粒称为pMSCV/GΔAL。

28.以两个化学合成寡核苷酸5’-acgc gtcgaccgcccctctccctccccc-3’(SEQ IDNO：31；下划线所标部分为SalI限制酶位点)和5’-ccg ctcgagattatcatcgtgtttttcaaaggaaaaccacgtc-3’(SEQ ID NO：32；下划线所标部分为XhoI限制酶位点)为引物，通过PCR(94℃/15秒→60℃/30秒→68℃/1分钟：30个循环)从质粒pLXIN(BD Biosciences Clontech公司)扩增IRES片断，然后用限制酶SalI和XhoI切取，并插入pETBlue-2的SalI、XhoI位点，制备质粒pETBlue/IRES。

29.用限制酶SalI和XhoI从pETBlue/IRES切取IRES片断，并插入pMSCV/GΔAH的SalI位点。将具有以与IgHγl基因相同的方向插入了IRES的结构的质粒称为pMSCV/GΔAIH。

30.用限制酶SalI从pETBlue/IgLκ切取IgLκ基因片断，并插入pMSCV/GΔAIH的SalI位点。将具有以与ΔAct启动子相同的方向插入了IgLκ基因片断的结构的质粒称为pMSCV/GΔALIH。

如上制备的复制能力缺失型逆转录病毒载体的载体构建物pMSCV/GΔAH、pMSCV/GΔAL和pMSCV/GΔALIH的结构如图12所示。

(实施例10)构建表达抗CD2抗体的G0转基因嵌合鹌鹑

按照实施例2，由载体构建物pMSCV/GΔAH、pMSCV/GΔAL和pMSCV/GΔALIH制备3种逆转录病毒载体。测定逆转录病毒载体的滴度，结果为10⁸cfu/ml～10⁹cfu/ml。

将所得的逆转录病毒载体按照实施例3显微注射到孵卵36小时后的鹌鹑受精卵心脏中，在37.9℃，湿度65％的条件下，每隔15分钟将卵转导90度进行孵卵。

为了使包含轻链、重链的抗体在转基因动物中表达，考虑了单独导入分别表达轻链和重链的载体的方法，和在同一载体中用IRES等序列将表达轻链的基因和表达重链的基因分开并导入该载体的方法。因此，在同时感染pMSCV/GΔAH、pMSCV/GΔAL的情况中(实施例11、实验例1)和单独导入pMSCV/GΔALIH所制备的载体的情况中(实施例11、实验例2)，分别进行注入。

孵卵48小时后，确认发育正常进行，在鸡S型号的卵壳的钝端部开一个直径4cm口，并将所述导入了病毒的胚转入其中。使胚朝上以接触空气，并加入以50mg/ml的浓度悬浮于卵白中的乳酸钙(Sigma公司)溶液0.5ml，然后以卵白为糊将盖密封。再次放入孵卵器中，在37.9℃、湿度65％的条件下培养13天，期间每隔1小时将卵转动60度。停止卵转动，使其处于静置状态，胚转为肺呼吸后，用针在盖上开一小口以促进呼吸。当绒膜尿囊中的血减少时，将雏鸟从培养器中取出并孵化。

(实施例11)血清和卵中的抗CD2抗体浓度测定

将实施例10中孵化的G0转基因嵌合鹌鹑饲养一个月，使雏鸟成长。在30和60天后，从成熟G0转基因鹌鹑的翼下静脉采血，得到血液样品。将所得的血液以15,000rpm离心10分钟，由作为上清获得的血清测定抗CD2抗体的量。

从孵化开始一个半月后，从开始产卵的雌性转基因鹌鹑中采卵，用实施例8的ELISA法测定实施例7制备的卵白、卵黄中的抗CD2抗体量。

含量测定结果见实验例1、实验例2。

(实验例1)

同时感染了由pMSCV/GΔAH、pMSCV/GΔAL制备的载体(3～4×10⁸cFu/ml)的G0转基因嵌合鹌鹑(个体标记序号#1113)在卵黄和卵白中分别表达了0.6μg/ml、0.5μg/ml的抗CD2抗体。

(实验例2)

单独导入了由pMSCV/GΔALIH制备的载体(5×10⁸cfu/ml)的G0转基因嵌合鹌鹑(#4202)在血清中表达了5.2μg/ml的抗CD2抗体。

(实施例12)scFv-Fc抗体表达载体构建物的制备

如下制备ScFv-Fc抗体表达载体构建物pMSCV/scFv-Fc。

1.使5’末端磷酸化的两个化学合成寡核苷酸5’- ctagaccatgaggtctttgctaatcttggtgctttgcttcctgcccctggctgctctgggg-3’(SEQ ID NO：33； ctaga为XbaI识别位点末端、gg为HaeIII识别位点末端)和5’- ccccagagcagccaggggcaggaagcaaagcaccaagattagcaaagacctcatgg t-3’(SEQ ID NO：34； cc为XbaI识别位点末端、 t为HaeIII识别位点末端)退火，制备溶菌酶分泌信号的基因片断。以两个化学合成寡核苷酸5’-gcg tttaaagtgacgttggacgtccg-3’(SEQ ID NO：35； tttaaa为DraI限制酶位点)和5’-atta ggatccgcgcttaaggacggtcagg-3’(SEQ ID NO：36； ggatcc为BamHI限制酶位点)作为引物进行PCR(94℃/15秒→58℃/30秒→68℃/1分钟：30个循环；KOD-Plus-DNA聚合酶)，从pPDS/scFv(Nakamura等，2000，Cytotechnology 32：191-198)扩增scFv基因片断，该pPDS/scFv包含由HUC2-13细胞的鸡抗体可变区基因制备的单链抗体(scFv)的基因。然后用限制酶DraI和BamHI切取，将切取的两个片断插入pBluescriptIISK(+)的XbaI、BamHI位点，制备质粒pBlue/scFv。

2.用限制酶NotI和BamHI从pBlue/scFv切取scFv基因片断，并插入pCEP4的NotI、BamHI位点，制备质粒pCEP4/scFv。

3.用mRNA分离试剂盒(mRNA isolation Kit)从产生人IgG1的骨髓瘤细胞IM-9获得mRNA用ReverTraAce，由所得的mRNA制备cDNA文库。通过以两个化学合成寡核苷酸5’-caagcttcaagggcccat-3’(SEQ ID NO：23)和5’-atttacccggagacaggga-3’(SEQ ID NO：24)为引物，用PCR(95℃/2分钟→52℃/30秒→74℃/3分钟：30个循环；Pfu DNA聚合酶)从上述cDNA文库扩增hCγ1基因片断。进一步地，以两个化学合成寡核苷酸5’-atta ggatccgagcccaaatcttgtgacaaaactc-3’(SEQ ID NO：37； ggatcc为BamHI限制酶位点)和5’-agc aagctttcatttacccggagacaggga-3’(SEQ ID NO：26； aagctt为HindIII限制酶位点)作为引物，通过PCR(94℃/15秒→58℃/30秒→68℃/1分钟：30个循环；KOD-Plus-DNA聚合酶)从上述PCR产物扩增人抗体H链γ1的Fc区域(Fc)的基因片断，然后用限制酶BamHI和HindIII切取，插入pBluescriptIISK(+)的BamHI、HindIII位点，制备质粒pBlue/Fc。

4.用限制酶HindIII和BamHI从pCEP4/scFv切取scFv基因片断，用限制酶BamHI和HindIII从pBlue/Fc切取Fc基因片断。将上述切取的两个片断插入pBluescriptIISK(+)的HindIII位点，制备质粒pBlue/scFv-Fc。

5.用限制酶HindIII从pBlue/scFv-Fc切取具有在鸡单链抗体可变区中连接人抗体H链γ1·Fc的结构(scFv-Fc)的基因片断，，并连接到经限制酶HindIII处理的pMSCV/GΔAH的载体片断上。将具有以与ΔAct启动子相同的方向连接了scFv-Fc基因的结构的质粒称为pMSCV/GΔAscFv-Fc。

如此制备的复制能力缺失型逆转录病毒载体的载体构建物pMSCV/GΔAscFv-Fc的结构如图13所示。

(实施例13)构建表达scFv-Fc抗体的G0转基因嵌合鹌鹑

根据实施例2由载体构建物pMSCV/GΔAscFv-Fc制备逆转录病毒载体。测定逆转录病毒载体的滴度，结果为10⁸cfu/ml～10⁹cfu/ml。

将所得的病毒载体溶液按照实施例3显微注射到孵卵36小时后的鹌鹑受精卵心脏中，根据实施例10使其孵化，得到G0转基因嵌合鹌鹑。

(实施例14)测定血清和卵中的scFv-Fc浓度

将实施例13中得到的G0转基因嵌合鹌鹑饲养1个月，使其雏鹌鹑成长。在30和60天后，从成熟G0转基因嵌合鹌鹑(个体标记序号#3303、#3306、#3310、#3311、#3313)的翼下静脉采血，得到血液样品。将所得的血液以15,000rPm离心10分钟，由作为上清得到的血清测定scFv-Fc抗体的量。

孵化一个半月后，从开始产卵的雌性转基因鹌鹑(个体标记序号#3310)采卵，用实施例8的ELISA法测定根据实施例7制备的卵白、卵黄中的scFv-Fc抗体量。

标准校正曲线用纯化过的scFv-Fc绘制。将实施例12中制备的载体构建物pMSCV/scFv-Fc通过脂质转染法导入GP293细胞，将其培养上清在4℃以3000rpm离心10分钟，以除去固体物质。将该上清边冷却边搅拌，缓慢加入细粉状硫酸铵至50％饱和(313G硫酸铵/1000ml水)，使蛋白质沉淀。将其在4℃静置一晚后，于4℃以15,000rpm离心10分钟使蛋白质完全沉淀，并用少量PBS溶解。用2L的PBS透析三次以除去硫酸铵。

用于纯化的蛋白G柱(Perseptive Biosystems，Inc.)的初期洗涤依次用结合缓冲液(Binding Buffr)(NaHPO₄·2H₂O 1.56g/l、NaHPO₄·12H₂O 7.16g/l)10mL、洗涤缓冲液(Wash Buffr)(醋酸20％、蒸馏水80％)10ml、结合缓冲液(Binding Buffr)10ml进行(流速2ml/分钟)。使溶于PBS的蛋白液以1ml/分钟的速度流过，使scFv-Fc吸附到柱上。使结合缓冲液(BindingBuffr)20ml以1.7ml/分钟的速度流过，除去不需要的蛋白质，然后使洗脱缓冲液(Elution Buffr)(用甘氨酸7.507g/l、2N HCl调至pH 2.5～3.0制备)以1.5ml/分钟的速度流过，洗脱scFv-Fc。

用PBS(2L)将洗脱级分透析3次，得到纯化scFv-Fc，并通过在波长280nm处的吸光度测定蛋白质的浓度。

实施例14中构建的G0转基因嵌合鹌鹑在30天、60天后采血得到的血清中scFv-Fc量如图14所示。导入了scFv-Fc抗体表达基因的G0转基因嵌合鹌鹑在第30天在血清中表达约2mg/ml～4mg/ml的抗体，5只鹌鹑中有3只在60天后显示出同等程度的表达量。

从G0转基因嵌合鹌鹑(#3310)开始产卵日开始，其卵黄、卵白中的scFv-Fc量如图15所示。抗体在卵白、卵黄中的表达量约为500μg/ml～1mg/ml。虽然从产卵开始至第17天稍有变动，但保持稳定的表达量。

(实施例15)scFv-Fc结构的确认

用实施例10的硫酸沉淀和蛋白G柱从实施例13的G0转基因嵌合鹌鹑血清1ml纯化scFv-Fc。通过SDS-PAGE分析纯化所得的scFv-Fc，结果如图16所示。未处理的带显示scFv-Fc的分子量约为120kDa。经还原处理的scFv-Fc的分子量为未处理时的几乎一半(约60kDa)，由此可知G0转基因嵌合鹌鹑产生的scFv-Fc通过S-S键形成了二聚体。这些与在Fc部分具有参与S-S键的半胱氨酸残基的scFv-Fc结构特征相符，表明G0转基因嵌合鹌鹑产生的scFv-Fc保持正确的结构。

(实施例16)表达TNFR-Fc融合蛋白的G0转基因嵌合鸡的构建

根据实施例9制备TNFR-Fc表达载体构建物，并根据实施例2制备逆转录病毒载体。该逆转录病毒载体的滴度为1.7×10⁷cfu/ml。

将所得的病毒载体溶液根据实施例4显微注射到孵卵后55小时的鸡受精卵心脏中，按照实施例10使其孵化后，得到G0转基因嵌合鸡。

往8个受精卵中进行注射，结果有4只孵化，按照实施例14测定其血清中的TNFR-Fc量，结果发现最高有50μg/ml TNFR-Fc被表达。

产业实用性

本发明的G0转基因嵌合鸟类可以高效地表达通过复制能力缺失型逆转录病毒载体导入的基因而不使其失活。另外，本发明的G0转基因嵌合鸟类生产方法可以生产导入嵌合抗体(例如scFv-Fc抗体)基因，并在血液、卵中高效表达抗体的鸟类。进一步地，本发明的抗体生产方法包括制备产生嵌合抗体(例如scFv-Fc抗体)的G0转基因嵌合鸟类，从鸟类的血清和卵中回收抗体并纯化，因此该方法可以高效地生产抗体。

序列表

<110>钟渊化学工业株式会社

(Kaneka Corporation)，

财团法人名古屋产业科学研究所

(Nagoya Industrial Science Research Institute(Chubu Technology LicensingOffice))

<120>利用逆转录病毒载体表达转基因鸟类中的基因的方法以及由此得到的转基因鸟类

<130>T753/TRANS-1

<150>JP P2002-236089

<151>2002-08-13

<160>37

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于Miw启动子5′区片断PCR扩增的5′-引物序列

<400>1

cggtctagag gaattcagtg gttcg 25

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>在5′末端整合了BamH I识别位点的用于Miw启动子5′区片断PCR扩增的3′-引物序列

<400>2

ccaggatccg acgttgtaaa acgacg 26

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>在5′末端掺入了HindIII识别位点的用于Miw启动子3′区片断PCR扩增的5′-引物序列

<400>3

ccaaagcttg ccgcagccat tgcctttt 28

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>在5′末端整合了Bln I识别位点的用于Miw启动子3′区片断PCR扩增的3′-引物序列

<400>4

atacctaggg gctggctgcg gaggaac 27

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>在5′末端整合了Nhe I识别位点的用于对缺少内含子的鸡β-肌动蛋白启动子片断进行PCR扩增的5′-引物序列

<400>5

tttagctagc tgcagctcag tgcatgcac 29

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>在5′末端整合了Xba I识别位点的用于对缺少内含子的鸡β-肌动蛋白启动子片断进行PCR扩增的3′-引物序列

<400>6

ataatctaga aacgcagcga ctcccgc 27

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>在5′末端整合了Xho I识别位点的用于对人抗体轻链κ恒定区编码片断进行PCR扩增的5′-引物序列

<400>7

atcctcgaga ggccaaagta cagtg 25

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>在5′末端整合了BamH I识别位点的用于对人抗体轻链κ恒定区编码片断进行PCR扩增的3′-引物序列

<400>8

cccggatccc taacactctc ccctgttgaa gct 33

<210>9

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>在5′末端整合了Not I识别位点的用于对人抗体轻链可变区编码片断进行PCR扩增的5′-引物序列

<400>9

agcggccgct acaggtgtcc actccgacat cgtgatgacc cagtctcc 48

<210>10

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>在5′末端整合了Xho I识别位点的用于对人抗体轻链可变区编码片断进行PCR扩增的3′-引物序列

<400>10

cctctcgagg atagaagtta ttcagcaggc acac 34

<210>11

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>在5′末端整合了Xho I识别位点的用于对人抗体重链μ恒定区编码片断进行PCR扩增的5′-引物序列

<400>11

acctcgagcg tggccgttgg ctgcctcgca ca 32

<210>12

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>在5′末端整合了Hind III识别位点的用于对人抗体重链μ恒定区编码片断进行PCR扩增的3′-引物序列

<400>12

actaagctta cgttgtacag ggtgggttta cc 32

<210>13

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>在5′末端整合了Not I识别位点的用于对人抗体重链可变区编码片断进行PCR扩增的5′-引物序列

<400>13

agcggccgct acaggtgtcc actccgaggt gcagctggtg gagtctgg 48

<210>14

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了Xho I识别位点的用于人抗体重链可变区编码片断PCR扩增的3′-引物序列

<400>14

cacgctcgag gtatccgacg gggaattctc acagga 36

<210>15

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了Hind III识别位点的用于DNA聚合酶反应以构建人表皮生长因子受体跨膜区编码片断的5′-引物序列

<400>15

cccaagcttg atctccactg ggatggtggg ggccctcctc ttgctgctg 49

<210>16

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了BamH I识别位点的用于DNA聚合酶反应以构建人表皮生长因子受体跨膜区编码片断的3′-引物序列

<400>16

cccggatcct cagtcaaggc gccttcgcat gaagaggccg atccccaggg

ccaccaccag 60

cagcaagagg agggcccc 78

<210>17

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸，用于通过定点突变在人抗体轻链可变区编码片断的3′末端产生Nar I识别位点

<400>17

tgaagacaga tggcgccgcc acagttcgtt t 31

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸，用于通过定点突变在人抗体重链可变区编码片断3′末端产生BamH I识别位点

<400>18

tggggcggat gcggatcctg aggagacggt 30

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了Not I识别位点的用于对小鼠抗体轻链可变区编码片断进行PCR扩增的5′-引物序列

<400>19

cgcggccgcc tcagggaaag tttgaagatg 30

<210>20

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了Nar I识别位点的用于对小鼠抗体轻链可变区编码片断进行PCR扩增的3′-引物序列

<400>20

cggcgccgcc acagtccgtt ttatttccag cttggt 36

<210>21

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了Not I识别位点的用于对小鼠抗体重链可变区编码片断进行PCR扩增的5′-引物序列

<400>21

cgcggccgcg aacacggamc cctcaccatg 30

<210>22

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了BamH I识别位点的用于对小鼠抗体重链可变区编码片断进行PCR扩增的3′-引物序列

<400>22

cggatcctgc agagacagtg accagagt 28

<210>23

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于对人抗体重链γ1恒定区编码片断进行PCR扩增的5′-引物序列

<400>23

caagcttcaa gggcccat 18

<210>24

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用干对人抗体重链γ1恒定区编码片断进行PCR扩增的3′-引物序列

<400>24

atttacccgg agacaggga 19

<210>25

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了BamH I识别位点的用于对人抗体重链γ1恒定区编码片断进行PCR扩增的5′-引物序列

<400>25

ataggatccg ctagcttcaa gggcccatcg 30

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了Hind III识别位点的用于对人抗体重链γ1恒定区或Fc区编码片断进行PCR扩增的3′-引物序列

<400>26

agcaagcttt catttacccg gagacaggga 30

<210>27

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了Sal I识别位点的用于对缺少内含子的鸡β-肌动蛋白启动子片断进行PCR扩增的5′-引物序列

<400>27

acgcgtcgac gtgcatgcac gctcattg 28

<210>28

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了Sal I识别位点的用于对缺少内含子的鸡β-肌动蛋白启动子片断进行PCR扩增的3′-引物序列

<400>28

acgcgtcgac aacgcagcga ctcccg 26

<210>29

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了Sal I识别位点的用于对抗体γ轻链编码片断进行PCR扩增的5′-引物序列

<400>29

aatgtcgaca tggtgtccac ttctcagctc 30

<210>30

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了Sal I识别位点的用于对抗体γ轻链编码片断进行PCR扩增的3′-引物序列

<400>30

ttcgtcgacc taacactctc ccctgttgaa 30

<210>31

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了Sal I识别位点的用于IRES片断PCR扩增的5′-引物序列

<400>31

acgcgtcgac cgcccctctc cctccccc 28

<210>32

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了Xho I识别位点的用于IRES片断PCR扩增的3′-引物序列

<400>32

ccgctcgaga ttatcatcgt gtttttcaaa ggaaaaccac gtc 43

<210>33

<211>61

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸，作为退火中的有义链，用于构建鸡溶菌酶分泌信号的编码片断

<400>33

ctagaccatg aggtctttgc taatcttggt gctttgcttc ctgcccctgg

ctgctctggg 60

g 61

<210>34

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸，作为退火中的反义链，用于构建鸡溶菌酶分泌信号的编码片断

<400>34

ccccagagca gccaggggca ggaagcaaag caccaagatt agcaaagacc

tcatggt 57

<210>35

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了Dra I识别位点的用于scFv编码区PCR扩增的5′-引物序列

<400>35

gcgtttaaag tgacgttgga cgtccg 26

<210>36

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了BamH I识别位点的用于scFv编码区PCR扩增的3′-引物序列

<400>36

attaggatcc gcgcttaagg acggtcagg 29

<210>37

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′末端整合了BamH I识别位点的用于对人抗体重链γ1 Fc区编码片断进行PCR扩增的5′-引物序列

<400>37

attaggatcc gagcccaaat cttgtgacaa aactc 35

Claims

1.一种G0转基因嵌合鸟类，该鸟类通过复制能力缺失型逆转录病毒载体导入了外源抗体基因，其特征在于，在血、卵白和卵黄的至少一种中产生来自转基因的抗体。

2.权利要求1的G0转基因嵌合鸟类，其中抗体恒定区的种类为人IgG。

3.权利要求1的G0转基因嵌合鸟类，其中抗体恒定区的亚类为人IgG1。

4.权利要求1的G0转基因嵌合鸟类，其中抗体恒定区为鹌鹑IgG、鸡IgG或小鼠IgG。

5.权利要求1～4之一的G0转基因嵌合鸟类，其中抗体基因被组成型启动子控制。

6.权利要求5的G0转基因嵌合鸟类，其中组成型启动子为鸡β-肌动蛋白启动子。

7.权利要求1～6之一的G0转基因嵌合鸟类，其中逆转录病毒载体是来自莫洛尼鼠白血病病毒的载体。

8.权利要求1～7之一的G0转基因嵌合鸟类，其中逆转录病毒载体为VSV-G假型。

9.权利要求1～8之一的G0转基因嵌合鸟类，其中鸟类为鸡或鹌鹑。

10.权利要求1～9之一的G0转基因嵌合鸟类，其中抗体为嵌合抗体。

11.权利要求10的G0转基因嵌合鸟类，其中的抗体在血液中的含量为0.5μg/ml或0.5μg/ml以上。

12.权利要求11的G0转基因嵌合鸟类，其中的抗体在血液中的含量为5μg/ml或5μg/ml以上。

13.权利要求10的G0转基因嵌合鸟类，其中的抗体在卵白中的含量为0.1μg/ml或0.1μg/ml以上。

14.权利要求13的G0转基因嵌合鸟类，其中的抗体在卵白中的含量为1μg/ml或1μg/ml以上。

15.权利要求10的G0转基因嵌合鸟类，其中的抗体在卵黄中的含量为0.1μg/ml或0.1μg/ml以上。

16.权利要求15的G0转基因嵌合鸟类，其中的抗体在卵黄中的含量为1μg/ml或1μg/ml以上。

17.权利要求1～9之一的G0转基因嵌合鸟类，其中抗体为scFv-Fc抗体。

18.权利要求17的G0转基因嵌合鸟类，其中的抗体在血液中的含量为20μg/ml或20μg/ml以上。

19.权利要求18的G0转基因嵌合鸟类，其中的抗体在血液中的含量为2000μg/ml或2000μg/ml以上。

20.权利要求17的G0转基因嵌合鸟类，其中的抗体在卵白中的含量为5μg/ml或5μg/ml以上。

21.权利要求20的G0转基因嵌合鸟类，其中的抗体在卵白中的含量为500μg/ml或500μg/ml以上。

22.权利要求17的G0转基因嵌合鸟类，其中的抗体在卵黄中的含量为5μg/ml或5μg/ml以上。

23.权利要求22的G0转基因嵌合鸟类，其中的抗体在卵黄中的含量为500μg/ml或500μg/ml以上。

24.一种产生抗体的方法，其特征在于，该方法包括产生权利要求1～23之一的G0转基因嵌合鸟类，并从该G0转基因嵌合鸟类的血液和/或卵中回收抗体。

25.制备G0转基因嵌合鸟类的方法，该方法包括孵育鸟类受精卵，在紧随抱卵后的囊胚期之后，用复制能力缺失型逆转录病毒载体感染早期胚，并孵化该胚。

26.制备G0转基因嵌合鸟类的方法，该方法包括孵育鸟类受精卵，将孵卵开始24小时后的早期胚用复制能力缺失型逆转录病毒载体感染，并孵化该胚。

27.权利要求25或26的G0转基因嵌合鸟类制备方法，其特征在于，孵育鸟类受精卵，向早期胚中形成的心脏或血管内显微注射复制能力缺失型逆转录病毒载体。

28.权利要求25或26的制备G0转基因嵌合鸟类的方法，其特征在于，孵育鸟类受精卵，孵卵开始24小时后，向早期胚中形成的心脏或血管内显微注射复制能力缺失型逆转录病毒载体。

29.权利要求25～28之一的制备G0转基因嵌合鸟类的方法，其特征在于，显微注射滴度为1×10⁷cfu/ml或1×10⁷cfu/ml以上的复制能力缺失型逆转录病毒载体。

30.权利要求29的制备G0转基因嵌合鸟类的方法，其特征在于，显微注射滴度为1×10⁸cfu/ml或1×10⁸cfu/ml以上的复制能力缺失型逆转录病毒载体。

31.权利要求30的制备G0转基因嵌合鸟类的方法，其特征在于，显微注射滴度为1×10⁹cfu/ml或1×10⁹cfu/ml以上的复制能力缺失型逆转录病毒载体。

32.权利要求25～31之一的制备G0转基因嵌合鸟类的方法，其特征在于，逆转录病毒载体是来自莫洛尼鼠白血病病毒的载体。

33.权利要求25～32之一的制备G0转基因嵌合鸟类的方法，其特征在于，逆转录病毒载体为VSV-G假型。

34.权利要求25～33之一的制备G0转基因嵌合鸟类的方法，其中鸟类为鸡或鹌鹑。

35.权利要求25～34之一的制备G0转基因嵌合鸟类的方法，其中在整合到复制能力缺失型逆转录病毒中的转基因中包含非逆转录病毒来源的基因序列。

36.权利要求35的制备G0转基因嵌合鸟类的方法，其中非逆转录病毒的基因序列被鸡β-肌动蛋白启动子控制。

37.权利要求35或36的制备G0转基因嵌合鸟类的方法，其中非逆转录病毒的基因序列是编码抗体基因的基因序列。

38.权利要求37的制备G0转基因嵌合鸟类的方法，其中抗体基因为嵌合抗体基因。

39.权利要求37的制备G0转基因嵌合鸟类的方法，其中抗体基因为scFv-Fc抗体基因。

40.权利要求35或36的制备G0转基因嵌合鸟类的方法，其中非逆转录病毒来源的基因序列是编码融合蛋白的基因序列。

41.按照权利要求25～40之一的方法制备的G0转基因嵌合鸟类。