KR20050067138A - 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 조류에서의 유전자 발현법 및 그것에 의해 얻어지는 유전자 도입 조류 - Google Patents

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마사미치 가미히라
겐이치 니시지마
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Abstract

본 발명의 목적은, 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터에 의해 항체 유전자가 도입되고, 도입 유전자를 발현시킴으로써 항체를 생성하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류, 및 제조한 G0 트랜스제닉 키메라 조류가 발현하는 항체를 회수하는 것으로 이루어지는 항체 생산법, 및 조류 수정란을 부란하고, 부란 개시 직후를 제외한 그 이후의 수정란에 레트로바이러스 벡터를 인젝션하는 것으로 이루어지는 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법을 제공하는 것이다. 즉, 본 발명은, 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터에 의해 항체 유전자가 도입되고, 도입 유전자를 발현시킴으로써 항체를 생성하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류이다.

Description

레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 조류에서의 유전자 발현법 및 그것에 의해 얻어지는 유전자 도입 조류{METHOD OF EXPRESSING GENE IN TRANSGENIC BIRDS USING RETROVIRUS VECTOR AND TRANSGENIC BIRDS THUS OBTAINED}
본 발명은, 혈액 중 및 알(卵) 중에, 항체, 예를 들어 scFv-Fc 항체를 생성하는 G0 트랜스제닉 (transgenic) 키메라 조류에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터에 의해 외래성 항체 유전자가 도입된 G0 트랜스제닉 키메라 조류를 제조하고, 혈 중, 난백 중 또는 난황 중에 생성된 항체를 회수하는 것으로 이루어지는 항체 생성법에 관한 것이다. 그리고 본 발명은, 효율적으로 도입 유전자를 발현시키는 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법 및 그 제조법에 의해 얻어지는 G0 트랜스제닉 키메라 조류에 관한 것이다.
유전자 기능의 연구 수단으로서, 외래 유전자를 숙주에 삽입한 유전자 도입(트랜스제닉) 동물의 연구가 왕성하게 이루어지고 있지만, 이 트랜스제닉 동물은, 기초 연구뿐만 아니라, 품종 개량이나 물질 생산, 이식용 장기의 도우너 등, 산업응용에도 유효하다. 소, 염소, 양 등의 유즙(乳汁)에 생리 활성 물질을 생성시키려는 시도가 실용에 근접하고 있고, 그 대표예로서 α 1-안티트립신이나 안티트롬빈은 의약품에 응용하는 것을 목적으로 하여 현재 임상 단계에 있다.
메추라기나 닭으로 대표되는 가금 조류는 식육용, 채란(採卵)용 가축으로서 사육 실적이 오래 되었고, 트랜스제닉 연구를 위한 목적으로도 내병성이나 육질 향상 등, 품종 개량에 관한 다양한 어프로치를 생각할 수 있다. 또한, 조류는 성(性)이 성숙되기까지의 기간이 짧고, 좁은 공간에서 사육이 가능하기 때문에 저렴한 비용으로 실시 가능한 단백질 발현계로 여겨져, 항체 의약품이나 희소 단백질의 생성 수단으로서의 트랜스제닉 제조에 기대가 모아지고 있다. 조류의 알은 다량의 단백질을 함유하고, 매일 연속적으로 생산된다는 점에서, 도입 유전자 산물을 재조합 단백질로서 의도적으로 알 중에 생성시킬 수 있다면 효율적인 생산 시스템이 되는 것을 생각할 수 있다.
최근 다수의 품목이 시장에 나와 의약품으로서 주목받고 있는 모노클로날 항체는, 대장균 등에 의한 저렴한 발현 시스템에서는 생산할 수 없고, 단가가 비싼 것이 보급을 방해하고 있다. 조류 세포는 항체 단백질을 구성하는 기능을 구비하고 있어, 트랜스제닉 조류는, 종래 대량 생산이 곤란했던 의료용 항체 등의 생산수단으로서 기대할 수 있다. 또 이들 단백질 생산물에는, 조류 세포에 의해 당 사슬이 부여됨으로써 혈 중에서의 안정성이 향상되는 등, 의약, 검사약으로서의 응용상에 있어 유리한 성질을 구비할 가능성이 높은 것으로 생각된다.
이와 같이, 유용 단백질의 생산 수단으로서의 응용이 기대되는 트랜스제닉 조류이지만, 한편에선 현재까지 다양한 시도가 있었음도 불구하고, 조류의 알에 실용 레벨에서 목적으로 하는 재조합 단백질을 축적시킨 예는 없다. 또한, 항체와 같은 복수의 유닛으로 이루어지는 고차 구조를 갖는 단백질을 고농도로 발현하는 트랜스제닉 조류를 제조한 예도 아직 보고되어 있지 않다.
Harvey 외 (Harvey, A.J 외 (2002) Nature Biotechnology. 19, 396) 는 에비앙·로이코시스·바이러스 유래의 벡터를 사용하여, β -락타마아제 (Lactamase) 유전자를 닭에게 도입함으로써 G0 트랜스제닉 키메라 닭을 제조했지만, 혈청 또는 알에 대한 효소 발현량은 50∼250ng/㎖ 정도였다. 이 G0 트랜스제닉 키메라 닭의 교배에 의해 제조된 G1∼G3 트랜스제닉 닭은, 전신의 체세포에 유전자가 도입됨으로써 효소의 발현량이 증가했지만, 그래도 수 ㎍/㎖ 의 레벨에 머물러 실용에는 많이 부족한 값이었다.
일반적으로 유전자 도입 동물을 제조하기 위해서는 수정란의 전핵에 DNA 를 마이크로 인젝션하는 수법이 채용되지만, 조류에는 이 방법을 응용할 수 없다.
조류에서는 1 세포기의 배(胚)를 취득하기가 어려운 점, 또한 취득할 수 있었다고 해도 알 내의 핵을 분별하는 수법이 없다는 점이 그 이유이다. 1 세포기의 배를 취득하기 위해서는, 자성(雌性) 조류의 수란관 내에서 수정 직후의 알을 취득하여 정상으로 발생시키지 않으면 안된다. 최근 Perry 에 의해 닭의 난할전 세포를 취득하여 체 외에서 배양하는 시스템이 확립되었지만 (Perry, M.M (1988) Nature, 331), 이 수법에 의해서도 알 내의 핵을 분별하여, 핵 안으로 목적 유전자를 도입하는 것이 불가능하다.
따라서, 조류 수정란에 유전자를 도입하는 것은 세포질에 대한 DNA 의 주입에 한정되어, DNA 봉입 지질 2 중막 (리포솜) 의 이용이나 인산칼슘법, 전기 도입법 (Electroporation) 의 이용이 시도되어 왔다. 그러나, 이들 수법에서는 유전자의 도입 효율이 나쁘고, 또한 도입된 플라스미드 DNA 가 염색체에 삽입될 확률이 낮다. 마이크로 인젝션에 의한 유전자 도입법은 효율적으로 목적 DNA 를 수정란에 보낼 수 있지만, 도입된 플라스미드 DNA 가 숙주 염색체에 삽입되지 않기 때문에, 숙주의 체세포 분열에 수반하여 도입 유전자 플라스미드가 탈락되어, 안정적인 유전자 도입 효과를 바랄 수 없다.
1986 년에 처음으로 레트로바이러스 벡터에 의한 트랜스제닉 닭의 제조예가 보고되어 있다 (Salter, D.W 외 (1986) Poultry Sci., 65). 레트로바이러스 벡터를 마이크로 인젝션법에 의해 수정란에 주입하는 수법은 유전자의 도입 효율이 높은 수법으로, 핵 내에 직접 DNA 를 주입할 수 없는 조류에 있어서, 염색체에 목적 유전자가 삽입된 안정적인 트랜스제닉을 제조하는 유일한 실용적 방법이다.
본 발명자들은 예의 연구를 거듭하여, 유전자 치료에도 응용되고 있는 안전한 자기 복제능 결실형 바이러스 벡터를 사용하여, 효율적으로 목적 유전자를 도입하는 트랜스제닉 조류의 제조법을 발견하였다 (일본 공개특허공보 2002-176880호). 이것에 의해, 안전하고 또 효율적으로 복수의 도입 유전자 카피수를 갖는 트랜스제닉 조류의 제조가 가능해졌다. 또한 이 수법에 따르면, 도입 유전자가 높은 효율로 차세대에 전달되는 것도 알 수 있어, 물질 생산 시스템으로서의 유전자 도입조류의 이용이 실용에 가까와졌다.
그러나, 이 때 도입된 유전자의 대부분은, 발생 초기에 숙주에 의해 불활성화되기 때문에 (유전자의 침묵 (gene silencing) 이라고 불린다), 유전자 발현의 결과로서의 단백질 생성이 극히 미량이었다. 도입 유전자가 불활성화되는 생물학적 메카니즘은 아직 해명되어 있지 않지만, 이 불활성화를 회피하여 목적 유전자를 효율적으로 발현시키는 기술이 트랜스제닉 조류의 응용 개발에 필수적이다.
도 1 은, 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터의 벡터 구축물 (vector construct) pMSCVN△Aβ 의 구조를 나타낸다. Neor 은 네오마이신 내성 유전자를, Ampr은 앰피실린 내성 유전자를 나타낸다. P△Act 는 β -액틴 프로모터 유전자를 나타낸다. β -Gal 은 β -갈락토시다제 발현 유전자를 나타낸다. ψ + 는 패키징 시그널 서열을 나타낸다. 5' LTR 및 3' LTR 은 각각 MoMLV 의 롱 터미널 리피트 서열을 나타낸다.
도 2 는, G0 트랜스제닉 키메라 메추라기에 있어서, 유전자의 도입 시기와 β -갈락토시다제 활성 발현의 관계를 나타낸다. 횡축은 부란 시간 (hr) 을, 종축은 mUnit/mg 으로 나타내는 β -갈락토시다제 활성을 나타낸다.
도 3 은, G0 트랜스제닉 키메라 닭에 있어서, 유전자의 도입 시기와 β -갈락토시다제 활성 발현의 관계를 나타낸다. 횡축은 부란 시간 (hr) 을, 종축은 mUnit/mg 으로 나타내는 β -갈락토시다제 활성을 나타낸다.
도 4 는, 도입한 레트로바이러스 벡터의 타이터와 G0 트랜스제닉 키메라 메추라기에서의 β -갈락토시다제 활성 발현의 관계를 나타낸다. 횡축은 cfu/㎖로 나타내는 바이러스 타이터를, 종축은 mUnit/mg 으로 나타내는 β -갈락토시다제 활성을 나타낸다.
도 5 는, 도입한 레트로바이러스 벡터의 타이터와 G0 트랜스제닉 키메라 닭에서의 β -갈락토시다제 활성 발현의 관계를 나타낸다. 횡축은 cfu/㎖ 로 나타내는 바이러스 타이터를, 종축은 mUnit/mg 으로 나타내는 β -갈락토시다제 활성을 나타낸다.
도 6 은, 메추라기알 중에 축적된 인간 IgG 항체를 나타낸다. 항체값은 3 마리의 메추라기로 실시한 동일 실험 결과의 평균값을 나타내고 있다.
도 7 은, 계란 중에 축적된 인간 IgG 항체를 나타낸다. 항체값은 3 마리의 닭으로 실시한 동일 실험 결과의 평균값을 나타내고 있다.
도 8 은, 메추라기알 중에 축적된 Fab 절편을 나타낸다. 항체값은 3 마리의 메추라기로 실시한 동일 실험 결과의 평균값을 나타내고 있다.
도 9 는, 계란 중에 축적된 Fab 절편을 나타낸다. 항체값은 3 마리의 닭으로 실시한 동일 실험 결과의 평균값을 나타내고 있다.
도 10 은, 메추라기알 중에 축적된 Fc 절편을 나타낸다. 항체값은 3 마리의 메추라기로 실시한 동일 실험 결과의 평균값을 나타내고 있다.
도 11 은, 계란 중에 축적된 Fc 절편을 나타낸다. 항체값은 3 마리의 닭으로 실시한 동일 실험 결과의 평균값을 나타내고 있다.
도 12 는, 항 CD2 항체 발현 벡터 구축물 pMSCV/G△AL (도 12(A)), pMSCV/G△AH (도 12(B)) 및 pMSCV/G△ALIH (도 12(C)) 의 구조를 나타낸다. Ampr 은 앰피실린 내성 유전자를 나타낸다. P△Act 는 β -액틴 프로모터 유전자를 나타낸다. ψ + 는 패키징 시그널 서열을 나타낸다. GFP 는 그린·플루오레센트·프로테인 유전자를 나타낸다. L 은 항 CD2 항체 경(輕)쇄 유전자를 나타낸다. H 는 항 CD2 항체 중(重)쇄 유전자를 나타낸다. 5' LTR 및 3' LTR 은 각각 MoMLV 의 롱 터미널 리피트 서열을 나타낸다.
도 13 은, scFv-Fc 항체 발현 벡터 구축물 pMSCV/G△AscFv-Fc 의 구조를 나타낸다. Ampr 은 앰피실린 내성 유전자를 나타낸다. P△Act 는 β -액틴 프로모터 유전자를 나타낸다. ψ + 는 패키징 시그널 서열을 나타낸다. GFP는 그린·플루오레센트·프로테인 유전자를 나타낸다. scFv-Fc 는 scFv-Fc 항체 유전자를 나타낸다. 5' LTR 및 3' LTR 은 각각 MoMLV 의 롱 터미널 리피트 서열을 나타낸다.
도 14 는, G0 트랜스제닉 키메라 메추라기 혈청 중에 발현된 scFv-Fc 양을 나타낸다. 횡축은 개체 번호, 종축은 scFv-Fc 항체 농도 (㎍/㎖) 를 나타낸다.
도 15 는, G0 트랜스제닉 메추라기알 중에 발현된 scFv-Fc 양을 나타낸다. 횡축은 산란 개시로부터의 채란일, 종축은 scFv-Fc 항체 농도 (㎍/㎖) 를 나타낸다.
도 16 은, 정제한 scFv-Fc 의 SDS-PAGE 에 의한 해석 결과를 나타낸다. 레인 1 은 저분자량 마커 (LMW) 를, 레인 4 는 고분자량 마커 (HMW) 를 나타낸다. 레인 2 은 환원 처리한 scFv-Fc 를, 레인 3 은 환원 처리되어 있지 않은 scFv-Fc 를 전기 영동한 결과를 나타낸다.
발명의 상세한 개시
이하에 본 발명을 상세히 서술한다.
본 발명의 G0 트랜스제닉 키메라 조류는, 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터에 의해 외래성 항체 유전자가 도입된 조류로서, 도입 유전자에 유래하는 항체를, 혈 중, 난백 중 또는 난황 중에 생성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용하는 조류로는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 닭, 칠면조, 오리, 타조, 메추라기 등, 식육, 채란 목적으로 가축화되어 있는 가금 조류나 애완용 조류를 들 수 있다. 그 중에서도 닭이나 메추라기는 입수가 용이하고, 산란종으로서도 다산인 점에서 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 레트로바이러스 벡터로는, 몰로니·뮤린·루케미아·바이러스 (MoMLV), 에비앙·로이코시스·바이러스 (ALV) 등에 유래하는 벡터를 들수 있다. 그 중에서도 MoMLV 에 유래하는 것이 바람직하지만, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다.
안전성을 고려하여, 유전자 도입 벡터로서 사용되는 바이러스는, 통상 바이러스 입자의 복제에 필요한 3 종의 운전자 gag, pol, env 중 어느 하나 또는 모두를 가지지 않음으로써 자기 복제능이 결실된 바이러스가 사용된다. 조류 세포에 이 바이러스 벡터를 효율적으로 감염시키기 위해, 외피 단백질을 인공적으로 VSV-G (수포(水疱)성 구내염 바이러스 유래) 슈도 타입로 한 바이러스 벡터가 바람직하지만, 본 발명은 이 바이러스 타입에 한정되는 것은 아니다.
패키징 세포 또는 핼퍼 바이러스 (helper virus) 등을 이용함으로써 조제된 슈도 타입의 바이러스 벡터는, 통상적인 마이크로 인젝션법 (Bosselman, R. A 외 (1989) Science 243, 533) 에 의해, 초기 배, 혈관 내, 심장 내에 도입된다. 유전자 도입법으로는, 이밖에 리포펙션 (Lipofection) 이나 일렉트로포레이션법 등을 생각할 수 있다.
본 발명에 의해 조류에 도입되는 유전자는 특별히 한정되지 않지만, 마커 유전자나 목적 단백질을 발현시키기 위한 구조 유전자, 이들의 유전자 발현을 컨트롤하는 프로모터 유전자, 분비 시그널 유전자 등에 의해 구성된다.
상기 마커 유전자로는, 네오마이신 내성 유전자, β -갈락토시다제 유전자, LacZ 유전자, 형광 단백질, 예를 들어 GFP (그린·플루오레센트·프로테인) 등을 코딩하는 유전자를 들 수 있다.
상기 목적 단백질을 발현시키기 위한 구조 유전자로는 특별히 제한되지 않고, 인간 모노클로날 항체 등 유전자 산업상 유용한 항체, 효소 등을 코딩하는 유전자 등을 들 수 있다. 또한, 그 밖의 유용 생리 활성 물질의 유전자를 사용할 수도 있다. 특히, 알 중에서의 축적이 양호한 점에서, 인간 IgG 클래스의 정상 영역을 갖는 항체의 유전자, 인간 IgG1 의 서브 클래스의 정상 영역을 갖는 항체의 유전자, 메추라기 IgG, 닭 IgG 나 마우스 IgG 의 정상 영역을 갖는 항체의 유전자 등 외래성 항체의 구조 유전자가 바람직하다.
또한 바람직한 상기 구조 유전자로는 키메라 항체의 구조 유전자를 들 수 있다.
키메라 항체란, 2 종 이상의 상이한 유전 형질로 구성되는 항체를 말한다.
종래, 마우스 하이브리도머에 의해 제조된 의료용 항체는 마우스 유래이기 때문에, 인체 내에 투여되면 면역계에 의한 거절 반응이 야기된다는 문제가 있었다. 상기 키메라 항체로는, 예를 들어, 항 인간 CD2 항체, 항 CD20 수용체 항체, 항 TNF 항체 등, 해당 결점을 개량하여 마우스 항체 중 항원 단백질과 결합하는 영역 이외를 인간 항체로 치환하여 거부 반응을 없앤 키메라 항체를 들 수 있으며, 이미 의약품으로서 시장에 나와 있는 것도 있다.
더욱 바람직한 상기 구조 유전자로는, scFv-Fc 항체의 구조 유전자를 들 수 있다.
의료용의 재조합 항체에는 저분자 항체로 불리우는 1 군이 있다. 면역 글로불린 IgG 에는 직접 항원과 결합하는 가변 영역 (Fv: Fragment of variable regeon) 이라고 불리는 VH, VL 의 헤테로 2 량체로 이루어지는 도메인이 있고, 이 Fv 도메인은 IgG 의 약 5분의 1 의 분자량이면서, 단독으로 충분한 항원 결합능을 갖는다. VH, VL 도메인 사이를 인공적으로 펩티드 링커에 의해 결합한 것이 단일 사슬 항체 (scFv: single chain Fv) 라고 불리는 저분자 항체로서, VH, VL 단독보다도 안정성이 향상되는 것이 알려져 있었다.
Powers 등 (Powers, D.B 외 (2000) J Immunol Method. 251, 123) 은, 이 scFv 에 인간 IgG1 에 유래하는 Fc 부를 융합시킴으로써 혈 중에서의 안정성이 증가하는 것을 발견하였다. 상기 scFv-Fc 항체는 의료용으로서 유용한 것으로 생각되지만, 저렴한 대량 생산 시스템인 대장균에서는 생산되지 않는다.
다른 바람직한 상기 유전자 서열로서, 융합 단백의 구조 유전자를 들 수 있다.
유전자 재조합에 의해 2 종 또는 그 이상의 단백의 일부를 융합시킨 인공적인 1 군의 단백은 융합 단백이라고 불리우며, 의약품으로서 실용화되어 있는 것에 TNF 수용체에 면역 글로불린의 Fc 를 융합시킨 TNFR-Fc 나 LFA3 에 Fc 를 융합시킨 LFA3-Fc 등이 있다. 이들은 Fc 를 융합시키는 것에 의해 가용화되어, 보다 강력한 생리 활성을 갖도록 설계된 인공 단백이다.
본 발명의 G0 트랜스제닉 키메라 조류에 있어서, 조류에 도입되는 유전자로서, 이들 인간 모노클로날 항체 유전자, 키메라 항체 유전자, scFv-Fc 항체 유전자를 사용함으로써 종래 생산이 곤란하던 항체 의약품을 저렴하게 대량 생산할 수 있다.
예를 들어, 키메라 항체 유전자를 도입한 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 경우, 혈액 중의 항체 함유량은, 바람직하게는 0.5㎍/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 5㎍/㎖ 이상이다. 또한, 난백 중의 항체 함유량은, 바람직하게는 0.1㎍/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 1㎍/㎖ 이상이고, 난황 중의 항체 함유량은, 바람직하게는 0.1㎍/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 1㎍/㎖ 이상이다.
또한, scFv-Fc 항체 유전자를 도입한 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 경우, 혈액 중의 항체 함유량은, 바람직하게는 20㎍/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 2000㎍/㎖ 이상이다. 또한, 난백 중의 항체 함유량은, 바람직하게는 5㎍/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 500㎍/㎖ 이상이다. 난황 중의 항체 함유량은, 바람직하게는 5㎍/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 500㎍/㎖ 이상이다.
상기 프로모터 유전자로는 구성적인 프로모터를 들 수 있다. 항체 유전자가 구성적인 프로모터에 의해 제어되어 있는 경우, 항체 유전자 발현이 안정되어 양호하기 때문에 바람직하다. 보다 바람직한 구성적인 프로모터로서 닭 β -액틴 프로모터를 들 수 있다.
본 발명의 항체의 생산법은, 본 발명의 G0 트랜스제닉 키메라 조류를 작성하여, 상기 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 혈 중 및/또는 알 중에서 항체를 회수하는 것을 특징으로 한다.
다음에 본 발명의 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법에 대해서 설명한다.
해당 제조법의 하나로서, 조류 수정란을 부란하고, 방란 직후의 배반엽기를 제외하는 그 이후의 초기 배에 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터를 감염시켜, 그 배를 부화시키는 제조법을 들 수 있다. 또한, 조류 수정란을 부란하고, 부란개시로부터 24시간 이후의 초기 배에 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터를 감염시켜, 그 배를 부화시키는 제조법도 본 발명의 제조법의 하나로 들 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 초기 배에 형성되는 심장 내지는 혈관 내에 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터를 마이크로 인젝션하는 방법이다.
즉, 본 발명의 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법은, 방란 후 특정 시간이 경과된 수정란에 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터를 마이크로 인젝션하는 것으로 이루어진다. 방란 후의 수정란의 초기 발생에 관해서 닭을 예로 들면, 우선 수란관 안에서 수정된 알은, 수정 후 약 1.5시간에 난할을 시작한다. 세포질이 이어진 채로 반할이 시작된 알은, 1 일에 걸쳐 체외로 방출되는 사이에 분열되어, 약 6만개의 세포로 이루어지는 배반엽이라고 불리는 배가 된다 (배반엽기). 이 배반엽은, 난황 중앙부의 직경 3∼4mm 의 흰 링으로 관찰된다. 이 배는 상층 (epiblast) 과 하층 (hypoblast) 으로 분열되어, 할강(割腔)을 형성한다. 방란은 배반엽 하층이 형성될 즈음에 일어나, 원 줄기(原條)가 형성되고, 배반엽은 상, 중, 하의 3 중 구조를 취하여, 삼배엽이 형성된다. 그 후, 배의 형성, 성장을 거쳐 배란으로부터 22일째에 부화된다. 배반엽기는 스테이지 X 라고도 불리우며, 이 시기의 세포의 일부로부터 생식 세포가 발생하기 때문에, 종래에는 유전자 도입의 대상으로 이 시기의 수정란을 사용하고 있다.
본 발명에 있어서는, 방란 직후, 배반엽기의 수정란을 부화 조건, 예를 들어 닭의 경우 37.7∼37.8℃, 습도 50∼70% 정도의 부화에 적합한 환경 조건에 둔 시간을 0 시간으로 하고, 이것을 부란 개시시로 하여 시간의 경과에 따라 각종 처리를 실시하였다. 메추라기에서는 부란 개시로부터 36시간 후, 닭에서는 부란 개시후 50시간즈음부터, 난황 상에 혈관계의 형성이 관찰되고, 심장으로 분화되는 기관의 맥동을 관찰할 수 있었다.
상기 서술한 유전자를 도입한 수정란의 부화에는, 본 발명자들이 개발한 인공 알껍질에 의한 방법 (Kamihira, M. 외 (1998) Develop. Growth Differ., 40, 449) 등을 응용할 수 있다.
본 발명의 제조법에 있어서 사용되는 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터, 도입하는 유전자, 유전자 도입 조류로는, 상기 서술한 G0 트랜스제닉 키메라 조류와 동일한 것을 들 수 있다.
상기 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터에 삽입되는 도입 유전자는, 레트로바이러스에 유래하지 않은 유전자 서열을 함유하는 것이 바람직하다. 또 본 발명의 제조법에 있어서, 「레트로바이러스에 유래하지 않은 유전자」 로는, 상기 서술한 구조 유전자, 프로모터 유전자, 분비 시그널 유전자 등을 들 수 있다. 상기 레트로바이러스에 유래하지 않은 유전자 서열은, 닭 β -액틴 프로모터에 의해 제어되어 있는 유전자 서열인 것이 바람직하고, 항체 유전자 또는 융합 단백 유전자를 코딩하는 유전자 서열인 것이 바람직하다.
본 발명의 제조법에서는, 1× 107cfu/㎖ 이상, 바람직하게는 1× 108cfu/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 1x 109cfu/㎖ 이상의 타이터를 갖는 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터를 마이크로 인젝션하는 것이 유전자를 효율적으로 도입할 수 있다는 점에서 바람직하다.
본 발명의 제조법으로 수정란에 유전자가 도입된 조류는, 그 체세포에 모자이크 형상으로 도입 유전자를 가진 트랜스제닉 조류로서 성장한다. 이 1 세대의 유전자 도입 조류를 G0 트랜스제닉 키메라 조류라고 부른다.
이러한 본 발명의 제조법에 의해 얻어지는 G0 트랜스제닉 키메라 조류도, 본 발명의 하나이다.
G0 트랜스제닉 키메라 조류와 비(非)트랜스제닉 조류, 또는 G0 트랜스제닉 키메라 조류끼리를 교배시켜 탄생하는 2 세대, 3 세대가 도입 유전자를 염색체에 갖는 생식 세포로부터 발생한 경우, 전신의 체세포에 도입 유전자를 함유하는 개체로서 성장한다. G0 트랜스제닉 키메라 조류 개체로부터 도입 유전자를 이어받는 자손을 대대로 G1∼G2∼G3 트랜스제닉 조류라고 칭한다.
본 발명에 의한 G0 트랜스제닉 키메라 조류를 동종의 비트랜스제닉 조류 또는 배우형 G0 트랜스제닉 키메라 조류와 교배시키는 것에 의해, 도입 유전자를 자손에게 전파시킬 수 있는 동시에, 전신의 체세포에 도입 유전자를 갖는 완전한 트랜스제닉 조류를 제조할 수 있다. 완전한 트랜스제닉 조류는, 도입 유전자를 갖는 체세포의 비율이 많기 때문에, G0 트랜스제닉 키메라 조류와 비교하여 도입 유전자에 유래하는 재조합 단백질의 생성량의 증가를 기대할 수 있다. 또, 안정적으로 도입 유전자를 전파하는 트랜스제닉 조류의 계통을 확립함으로써, 단백질 생성 시스템으로서의 품질의 안정화가 가능하다.
레트로바이러스 벡터에 의해 수정란에 도입된 유전자가, 발생 후 어느 시기에 불활성화되는지를 특정하기 위해, 본 발명자들은 β -갈락토시다제(galactosidase) 발현 유전자를 지표로 하여, 수정 후의 다양한 시기에 벡터를 도입하고 발현량이 어떻게 변화하는지를 검토했다. 그 결과, 도입 유전자의 발현량은 그 유전자가 배 발생의 어느 시기에 도입되었는가에 따라서 크게 변화해 가는 것을 발견하여, 본 발명에 이르렀다. 즉, 도입 유전자의 불활성화는, 방란(放卵; spawning) 직후에 도입된 유전자에 대하여 현저하고, 방란으로부터 일정 시간경과 후에 도입된 유전자는 발현 빈도가 높다는 것이다.
본 발명자들은 이 발견을 이용하여, 조류의 종류에 따라서 결정되는 특정한 시간이 부란(孵卵; incubation) 개시시로부터 경과한 후에 그 초기 배에 외래 유전자를 도입하면, 숙주에 의한 불활성화의 영향을 받지 않고, 목적 유전자를 효율적으로 발현시키는 것이 가능해짐을 발견하였다.
또, 의약품으로서 유용한 키메라 항체, 예를 들어 scFv-Fc (단일 사슬 항체)를 코딩하는 유전자를 삽입한 벡터를 만들고, 이 방법에 의해 메추라기에 도입하여 G0 트랜스제닉 키메라 조류를 제조한 결과, 혈 중, 난백, 난황 중에 도입 유전자에 유래하는 항체가 고농도로 발현되는 것이 발견되었다.
즉, 제 1 본 발명은, 조류 수정란을 부란하고, 방란 직후의 배반엽기 (스테이지 X) 를 제외한 그 이후의 초기 배에 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터를 감염시켜, 그 배를 부화시키는 것으로 이루어지는 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법, 및 그 방법에 의해 제조된 G0 트랜스제닉 키메라 조류에 관한 것이고, 제 2 본 발명은, 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터에 의해 외래성 항체 유전자가 도입된 G0 트랜스제닉 키메라 조류로서, 도입 유전자에 유래하는 항체를 혈 중, 난백 중 및 난황 중의 적어도 하나에 생성하는 것을 특징으로 하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류에 관한 것이며, 제 3 본 발명은, 상기 G0 트랜스제닉 키메라 조류를 제조하여, 그 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 혈 중 및/또는 알 중에서 항체를 회수하는 것으로 이루어지는 항체의 생산법에 관한 것이다.
본 발명의 G0 트랜스제닉 키메라 조류에 의한 도입 유전자의 발현은, 탄생한G0 트랜스제닉 키메라 조류가 성조(成鳥)가 되어도 유지되는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명에 의해 특정한 유전자를 조류에 도입하여, 목적 단백질을 성장 후에도 생성하는 실용적인 생산 시스템을 구축할 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 제조된 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 도입 유전자는, 교배에 의해 높은 전파 효율로 차세대에 계승된다. 도입 유전자는 염색체에 삽입된 형태로 차세대에 계승되기 때문에, 이 트랜스제닉 조류에 의한 생산 시스템은 안정적인 물질 생산이 가능하다.
본 발명에 의해, 트랜스제닉 조류가 그 체세포 중에 생성시킨 목적 단백질이 혈액 중에 분비되고, 혈청으로부터 분리함으로써 이용 가능해진다.
또 본 발명자들은, 인간 IgG 클래스의 정상 영역을 갖는 항체나, 메추라기 IgG, 닭 IgG 또는 마우스 IgG 의 정상 영역을 갖는 항체가, 메추라기, 닭에 있어서 혈 중으로부터 알 중으로 효율적으로 이행하는 것을 발견했다. 이들 정상 영역을 갖는 항체를 본 발명의 방법에 의해 제조된 G0 트랜스제닉 키메라 조류에 발현시킨 경우, 혈 중에 분비된 항체가 알 중에 고농도로 축적된다.
트랜스제닉 동물에게 유전자를 도입하여 목적 단백질을 취득하는 경우, 포유류에서는 유즙 중에 분비시켜 회수하는 것이 일반적이지만, 조류의 트랜스제닉에서는 알에 목적물을 축적시키고, 그 난백, 난황으로부터 회수, 정제하는 것이 실제적이다.
계란 등에서는 전체 성분의 30% 가 단백질이고, 그 주성분이 되는 단백질은 난백 알부민 (ovalbumin) 이다. 종래 트랜스제닉 조류의 알 중에 재조합 단백질을 발현시키는 방법으로서, 이 난백 알부민 등의 발현 프로모터를 이용하여 그 하류에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입하고, 난백 중에 난백 알부민을 대신하여 목적물을 발현시킨다는 방식이 채용되고 있었다.
그러나, 본 발명의 방법에 있어서, 구성적인 프로모터, 예를 들어 닭 β -액틴 프로모터 등의 제어하에 대량으로 발현된 항체, 예를 들어 상기 IgG 클래스 항체 등을 혈 중에 분비시켜, 알 중에 축적시키는 것이 가능해진다. 또 본 명세서에 있어서 구성적인 프로모터란, 전신성으로 발현하는 프로모터를 의미한다.
그리고 항체 구조 중에서, 알 중으로의 이행에 필수적인 부분을 특정하기 위해, 항체를 Fab, Fc 절편으로 한 것을 메추라기, 닭의 혈 중에 접종하여 알에 대한 이행성을 조사했다. 그 결과, 알 내에는 Fc 절편이 축적되어, 항체의 알 안으로의 이행은 Fc 리셉터를 통하여 이루어지는 것이 시사되었다.
이것으로부터 트랜스제닉 조류에 의한 항체의 알 내에서의 생산법을 단백질 전반의 생산에 범용화하는 방법으로서, 인간 IgG 의 정상 영역 (Fc) 이 융합한 구조를 갖는 단백질을 생산하는 벡터를 설계하고, 트랜스제닉 조류를 제조하여 알로부터 목적물을 함유하는 단백질을 회수하고, Fc 부를 절단하여 목적물을 정제하는 생산법을 생각할 수 있다.
또한, 종래 포유류의 트랜스제닉 동물을 사용하여 항체를 생산한 경우, 생성 동물이 갖는 자기 항체와 목적 항체를 분리 정제하기가 어렵다는 문제가 지적되고 있었다. 생성 동물로 조류를 사용하는 항체 생산법의 이점으로서, 조류의 자기 항체가 프로테인 A, 프로테인 G 칼럼에 흡착되지 않기 때문에 목적으로 하는 재조합 항체와의 분리가 용이한 점도 들 수 있다.
전술한 바와 같이, 인간 모노클로날 항체는 의약품으로서 유용함에도 불구하고, 그 생산에서는 동물 세포 배양이나 마우스 복수(腹水)와 같은 고가의 생산 수단밖에 없어, 단가가 높은 것이 보급시에 방해가 되고 있다.
최근 유전자 공학적 수법을 사용하여, 항체의 H 사슬, L 사슬의 V 영역만을 링커 서열로 연결한 scFv (단일 사슬 항체) 가 제작되어 있고, 이것은 대장균에서도 생산된다는 이점이 있어, 비용면에서 주목받고 있다. 그러나, 저분자 항체라고 불리는 이들 단백질은 혈 중에서의 안정성이 낮기 때문에, 치료용, 시험용으로서의 실용성에 어려움이 있었다.
scFv 에 Fc 영역을 연결한 scFv-Fc 는 혈 중에서도 안정적이어서 보다 실용적이라고 생각되지만, 대장균에서는 생산할 수 없고, 동물 세포를 사용한 바이오리액터에 의해서만 공급할 수 있다. 닭 등 다른 동물에 제조시킨 결합 영역을 갖는 scFv 에 인간의 Fc 를 결합시킨 인간화 scFv-Fc 는 치료용으로도 유망하여, 이 단백질을 본 발명에 의한 G0 트랜스제닉 키메라 조류에 의해 대량으로 생산할 수 있다면, 그 유용성이 크다.
본 발명의 G0 트랜스제닉 키메라 조류는, scFv-Fc 와 같은 재조합 항체, 키메라 항체, 인간 모노클로날 항체 등, 종래 방법으로는 소량밖에 생산할 수 없었던 항체 단백질을 저렴하게 대량으로 생산하여, 실용적으로 회수, 정제하고 이용함에 있어서 응용할 수 있다.
이와 같이 본 발명에서는 레트로바이러스 벡터에 의한 G0 트랜스제닉 키메라 조류에 있어서, 도입 유전자를 효율적으로 발현시키는 제조법을 개시한다. 또한 본 발명에서는, 특정 유전자를 도입함으로써 조류 체세포에 유용한 목적 단백을 생성시키는 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법을 개시한다. 그리고 종래 대장균 등에서 생성이 불가능했던 모노클로날 인간형 항체나, 키메라 항체, scFv-Fc 항체, 복잡한 고차 구조를 갖는 기능성 단백질 등, 의약, 검사약으로서 유용한 물질을 조류 세포에 생성시키고, 혈청이나 알 중에서 회수하여 이용하는, 생산 비용이 낮은 단백 생산 시스템을 개시한다.
또한 본 발명의 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법을 응용하여, 가금 조류를 바람직한 방향으로 개질하는 수법 및 개질된 조류를 제공하는 것도 생각할 수 있다. 가금 조류의 바람직한 성질로는, 육질 개선, 내병성 향상, 생육 속도의 향상 등을 들 수 있다. 조류는 또 애완용도로도 다양한 종류의 수요를 갖고 있어, 본 발명의 제조법은, 털색의 개선, 공격성의 저하 등, 애완용으로서 바람직한 형질로 단기간에 품종 개량하기 위한 수단으로도 응용할 수 있다.
또, 현재 포유류, 양서류, 어류 등의 트랜스제닉은 통상적으로 핵 이식에 의해 제조되지만, 본 발명은 이를 대신하는 새로운 트랜스제닉 동물 제조의 효율적 수법으로도 응용할 수 있다.
즉, 본 발명은, 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터에 의해 외래성 항체 유전자가 도입된 G0 트랜스제닉 키메라 조류로서, 도입 유전자 (transgene) 에 유래하는 항체를, 혈 중, 난백 중 및 난황 중의 적어도 하나에 생성하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류이다. 상기 항체의 정상 영역은, 클래스가 인간 IgG 이거나, 서브 클래스가 인간 IgG1 이거나, 메추라기 IgG, 닭 IgG, 또는 마우스 IgG 인 것이 바람직하다. 상기 항체 유전자는, 구성적인 프로모터 (constitutive promoter) 에 의해 제어되어 있는 것이 바람직하고, 상기 구성적인 프로모터는 닭 β -액틴(actin) 프로모터인 것이 바람직하다. 상기 레트로바이러스 벡터가 몰로니·뮤린·루케미아·바이러스 (moloney-murine leukemia virus) 유래 벡터인 것이 바람직하고, VSV-G 슈도 타입 (pseudotype) 인 것이 바람직하다. 본 발명의 G0 트랜스제닉 키메라 조류는, 닭 또는 메추라기인 것이 바람직하다. 상기 항체는 키메라 항체인 것이 바람직하고, 상기 키메라 항체의 생성량이, 혈액 중에서는 0.5 ㎍/㎖ 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5㎍/㎖ 이상이고, 난백 중에서는 0.1㎍/㎖ 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1㎍/㎖ 이상이고, 난황 중에서는 0.1㎍/㎖ 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1㎍/㎖ 이상이다. 또한, 상기 항체는, scFv-Fc 항체인 것이 바람직하고, 상기 scFv-Fc 항체의 생성량이, 혈액 중에서는, 20㎍/㎖ 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 2000㎍/㎖ 이상이고, 난백 중에서는 5㎍/㎖ 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 500㎍/㎖ 이상이고, 난황 중에서는 5㎍/㎖ 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 500㎍/㎖ 이상이다. 본 발명의 G0 트랜스제닉 키메라 조류를 제조하여, 상기 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 혈 중 및/또는 알 중에서 항체를 회수하는 항체의 생산법도 또한 본 발명의 하나이다.
조류 수정란을 부란하고, 방란 직후의 배반엽기를 제외한 그 이후의 초기 배에 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터를 감염시켜, 그 배를 부화시키는 것으로 이루어지는 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법도 또한 본 발명의 하나이다. 본 발명의 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법에 있어서, 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터를 감염시키는 시기는 부란 개시로부터 24시간 이후인 것이 바람직하다. 상기 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터를 감염시키는 방법은, 초기 배에 형성되는 심장 내지는 혈관 내에 마이크로 인젝션하는 것이 바람직하다. 상기 심장 내지는 혈관은 부란 개시로부터 24시간 이후의 초기 배에 형성되는 것이 바람직하다. 마이크로 인젝션하는 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터의 활성은, 1×107cfu/㎖ 이상의 타이터(titer)인 것이 바람직하고, 1× 108cfu/㎖ 이상의 타이터인 것이 보다 바람직하고, 1× 109cfu/㎖ 이상의 타이터인 것이 더욱 바람직하다.
상기 레트로바이러스 벡터는 몰로니·뮤린·루케미아·바이러스 유래 벡터인 것이 바람직하고, VSV-G 슈도 타입인 것이 바람직하다. 본 발명에서 제조하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류는, 닭 또는 메추라기인 것이 바람직하다. 상기 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터에 삽입되는 도입 유전자는, 레트로바이러스에 유래하지 않은 유전자 서열을 함유하는 것이 바람직하다. 상기 레트로바이러스에 유래하지 않은 유전자 서열은, 닭 β -액틴 프로모터에 의해 제어되어 있는 유전자 서열인 것이 바람직하고, 항체 유전자 또는 융합 단백 유전자를 코딩하는 유전자 서열인 것이 바람직하다. 상기 항체 유전자는 키메라 항체 유전자인 것이 바람직하고, scFv-Fc 항체 유전자인 것이 바람직하다.
본 발명의 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법으로 제조된 G0 트랜스제닉 키메라 조류도 또한 본 발명의 하나이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1) β -갈락토시다제 발현 벡터 구축물의 조제
β -갈락토시다제 발현 벡터 구축물 pMSCVN△Aβ 는, 다음과 같이 제조했다.
1. 플라스미드 pLXRN (clontech 사 제조) 으로부터 라우스·살코머·바이러스 (RSV: Rous Sarcoma Virus) 프로모터 단편을 제한효소 XhoI 및 HindIII 에 의해 잘라내고, 플라스미드 pBluescriptIISK(+) (Stratagene 사 제조) 의 XhoI, HindIII 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pBlue/RSV 를 제조했다.
2. 플라스미드 pCMVβ (clontech 사 제조) 로부터 β -갈락토시다제 (β -Gal) 유전자 단편을 제한효소 NotI 에 의해 잘라내고, 플라스미드 pZeoSV2(+)(Invitrogen 사 제조) 의 NotI 사이트에 삽입했다. T7 프로모터와 동 방향으로 β -Gal 유전자가 삽입된 구조의 플라스미드를 pZeo/lacZ 로 했다.
3. pBlue/RSV 로부터 RSV 프로모터 단편을 제한효소 XhoI 및 PstI 에 의해 잘라내었다. pZeo/lacZ 로부터 β -Gal 유전자 단편을 제한효소 PstI 및 XhoI 에 의해 잘라내었다. 제한효소 XhoI 에 의해 처리한 플라스미드 pLNHX (clontech 사 제조) 의 벡터 단편에 상기 잘라낸 2 단편을 연결하여, 플라스미드 pLNRβ 를 제조했다.
4. pLNHX 로부터 일련의 몰로니·뮤린· 살코머·바이러스 (MoMuSV) 5'-롱·터미널·리피트 (LTR), 바이러스·패키징·시그널 및 네오마이신 내성 (Neor) 유전자를 함유하는 단편을 제한효소 SacII 및 XhoI 에 의해 잘라내고, 제한효소 SacII 및 XhoI 에 의해 처리한 pLXRN 의 벡터 단편에 연결하여, 플라스미드 pLXL 을 제조했다.
5. pZeo/lacZ 로부터 β -Gal 유전자 단편을 제한효소 HindIII 및 XhoI 에 의해 잘라내고, 제한효소 HindIII 및 XhoI 에 의해 처리한 pLXL의 벡터 단편에 연결하여, 플라스미드 pLZL 을 제조했다.
6. 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-cggtctagaggaattcagtggttcg-3'(서열 번호 1) 및 5'-ccaggatccgacgttgtaaaacgacg-3'(서열 번호 2; 하선부는 BamHI 제한효소 사이트) 를 프라이머로 하는 PCR (94℃/15초 → 55℃/30초 → 72℃/1분 30초: 35 사이클; KOD-Plus-DNA 폴리메라아제 (토요보사 제조)) 에 의해, 플라스미드 pMiwZ (Suemori et al., 1990, Cell Diff. Dev. 29: 181-185) 로부터 RSV 프로모터와 닭 β 액틴 (Act) 프로모터의 하이브리드 프로모터 (Miw 프로모터) 의 5' 영역 단편을 증폭 후, 제한효소 BamHI 및 MunI 에 의해 잘라내고, 플라스미드 pGREEN LANTERN-1 (GIBCO BRL 사 제조) 의 BamHI, MunI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pGmiw5' 를 제조했다.
7. pMiwZ 로부터 Miw 프로모터 5' 측 중앙 영역 단편을 제한효소 MunI 및 ClaI 에 의해 잘라내고, pGmiw5' 의 MunI, ClaI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pGmiw5'-2 를 제조했다.
8. pGmiw5'-2 로부터 Miw 프로모터 5' 영역 및 5' 측 중앙 영역을 포함하는 단편을 제한효소 BamHI 및 EcoRI 에 의해 잘라내고, pBluescriptIISK(+) 의 BamHI, EcoRI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pBlue/Miw5' 를 제조했다.
9. 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-ccaaagcttgccgcagccattgcctttt-3' (서열 번호 3; 하선부는 HindIII 제한효소 사이트) 및 5'-atacctaggggctggctgcggaggaac-3' (서열 번호 4; 하선부는 BlnI 제한효소 사이트)를 프라이머로 하는 PCR (98℃/15초 → 60℃/30초 → 72℃/30초: 35 사이클) 에 의해 pMiwZ 로부터 Miw 프로모터 3' 영역 단편을 증폭 후, 제한효소 HindIII 및 BlnI 에 의해 잘라내고, 제한효소 HindIII 및 BlnI 에 의해 처리한 pLXL 의 벡터 단편에 연결하여, 플라스미드 pLMiw3' 를 제조했다.
10. pMiwZ 로부터 Miw 프로모터 3' 측 중앙 영역 단편을 제한효소 EcoRI 및 MboII 에 의해 잘라내었다. pLMiw3' 로부터 Miw 프로모터 3' 영역 단편을 제한효소 MboII 및 KpnI 에 의해 잘라내었다. pBlue/Miw5' 의 EcoRI, KpnI 사이트에 상기 잘라낸 2 단편을 삽입하여, 플라스미드 pBlue/Miw 를 제조했다.
11. pBlue/Miw 로부터 Miw 프로모터 전체 길이를 포함하는 단편을 제한효소 BamHI 및 BlnI 에 의해 잘라내고, 제한효소 BamHI 및 BlnI 에 의해 처리한 pLXL 의 벡터 단편에 연결하여, 플라스미드 pLML 을 제조했다.
12. pLML 로부터 Act 프로모터 단편을 제한효소 SmaI 및 XbaI 에 의해 잘라내고, pBluescriptIISK(+) 의 EcoRV, XbaI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pBlue/Act 를 제조했다.
13. pLML 로부터 Miw 프로모터 단편을 제한효소 HindIII 및 BglII 에 의해 잘라내고, 제한효소 HindIII 및 BamHI 에 의해 처리한 pLZL 의 벡터 단편에 연결하여, 플라스미드 pLMβ L 을 제조했다.
14. pBlue/Act 로부터 Act 프로모터 단편을 제한효소 SalI 및 BlnI 에 의해 잘라내었다. pLMβ L 로부터 β -Gal 유전자 단편을 제한효소 BlnI 및 BglII 에 의해 잘라내었다. 제한효소 XhoI 및 BglII 에 의해 처리한 pLNRβ의 벡터 단편에 상기 잘라낸 2 단편을 연결하여, 플라스미드 pLNAβ 를 제조했다.
15. 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-tttagctagctgcagctcagtgcatgcac-3' (서열 번호 5; 하선부는 NheI 제한효소 사이트) 및 5'-ataatctagaaacgcagcgactcccgc-3' (서열 번호 6; 하선부는 XbaI 제한효소 사이트) 를 프라이머로 하는 PCR (98℃/15초 → 60℃/30초 → 68℃/2분: 30 사이클) 에 의해 pMiwZ 로부터 인트론 결실 액틴 (△Act) 프로모터 단편을 증폭 후, 제한효소 XhoI (XhoI 제한효소 사이트는 증폭 단편 중에 존재) 및 XbaI 에 의해 △Act 프로모터의 일부를 포함하는 단편을 잘라내었다. △Act 프로모터의 나머지 부분과 β -Gal 유전자를 함유하는 단편을 pLNAβ 로부터 제한효소 BlnI 및 BglII 에 의해 잘라내었다. 제한효소 XbaI 및 BglII 에 의해 처리한 pLNAβ 의 벡터 단편에 상기 잘라낸 2 단편을 연결하여, 플라스미드 pLN△Aβ 를 제조했다.
16. pLN△Aβ 로부터 일련의 Neor 유전자, △Act 프로모터, 및 β -Gal 유전자를 함유하는 단편을 제한효소 BlnI 및 BglII 에 의해 잘라내고, 제한효소 BlnI 및 BglII 에 의해 처리한 pLXL의 벡터 단편에 연결하여, 플라스미드 pLN△Aβ -2 를 제조했다.
17. pLN△Aβ -2 로부터 일련의 Neor 유전자, △Act 프로모터, 및 β -Gal 유전자를 함유하는 단편을 제한효소 BamHI 및 BglII 에 의해 잘라내고, 제한효소 BamHI 및 BglII 에 의해 처리한 플라스미드 pMSCVneo (clontech 사 제조) 의 벡터단편에 연결했다. BamHI 및 BglII 사이트가 소실된 플라스미드를 pMSCVN△Aβ로 했다.
이와 같이 제조한 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터의 벡터 구축물 pMSCVN△Aβ 의 구조를 도 1 에 나타내었다.
(실시예 2) β -갈락토시다제 발현 레트로바이러스 벡터의 조제
실시예 1 에서 제조한 벡터 구축물 pMSCVN△Aβ 로부터 레트로바이러스 벡터를 조제하기 위해, 패키징 세포 GP293 (clontech 사 제조) 를 직경 100mm 의 배양디쉬에 5× 106 세포를 심고, 배양했다. 배지를 신선한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 으로 교환하고, p-VSV-G 벡터 (clontech 사 제조) 8㎍과 pMSCVN△Aβ 8㎍ 을 리포펙션법에 의해 상기 GP293 세포에 도입했다. 48시간 후, 바이러스 입자를 함유하는 배양 상등액을 회수하고, 0.45㎛ 아세트산셀룰로오스 필터 (Advantech 사 제조) 를 통하여 협잡물을 제거했다. 얻어진 용액에 폴리브렌 (시그마사 제조) 을 10㎍/㎖ 가 되도록 첨가하여 바이러스액으로 했다.
조제한 바이러스액을 따로 배양한 GP293 세포에 첨가하고, 48시간 배양 후, 600㎍/㎖ 의 G418 (GIBCO BRL 사 제조) 을 함유하는 배양액으로 옮겨 심어, G418 안정 형질 전환 GP293 주를 취득했다.
얻어진 안정 형질 전환주를 80% 컨플루언트가 되도록 직경 100mm 디쉬에 배양하고, 16㎍ 의 pVSV-G 벡터를 리포펙션법으로 도입했다. 48시간 후 바이러스 입자를 함유하는 배양 상등액 12㎖ 를 회수했다.
이 배양 상등액을 50,000× g, 4℃ 에서 1.5시간 원심하여, 바이러스를 침전시켰다. 상등액을 제거하고, 바이러스 입자를 함유하는 침전물에 50㎕ 의 50mM Tris-HCl (pH 7.8), 130mM NaCl, 1mM EDTA 용액을 첨가하여, 4℃ 에서 하룻밤 방치 후, 잘 현탁하여 바이러스 용액을 회수했다. 이렇게 해서 얻은 고(高)타이터 바이러스 벡터는, 108∼109cfu/㎖ 였다.
바이러스 타이터는 다음과 같이 측정했다. 측정 전일에 NIH3T3 세포 (Americam Type Culture Collection 으로부터 입수) 를 직경 35 mm 의 디쉬에 7× 104 세포를 심고, 배양했다. 102∼106 배로 희석한 바이러스 용액을 각 디쉬에 1㎖ 첨가하고, 48시간 후에 형광 현미경에 의해 GFP (그린·플루오레센트·프로테인) 를 발현하고 있는 세포의 비율을 측정하여, 이하의 계산식에 의해 타이터를 결정했다.
바이러스 타이터 = 세포수× 희석률× 발현비율 (cfu/㎖)
(실시예 3) 메추라기 배에 대한 레트로바이러스 벡터의 인젝션
WE 계통의 메추라기 수정란 (일본 생물과학연구소) 을 사용했다. 이 수정란을 자동 전란(轉卵) 장치가 내장된 부란기 (쇼오와프랭키사 제조 P-008 형) 안에서 37.9℃, 습도 65% 의 환경에 방치한 시간을 부란 개시 시간 (0 시간) 으로 하고, 이후 15분마다 90도 전란시키면서 부란하였다.
부란 개시시, 수정란의 알껍질을 70% 에탄올에 소독하고, 예리한 단부를 직경 2cm 의 원형으로 다이아몬드 커터 (MINIMO7C710, 미니타사 제조) 에 의해 잘라내어, 배를 노출시켰다. 배반엽을 실체 현미경으로 관찰하면서, 유리관 (CD-1, 올림프스사 제조) 을 마이크로 피펫 제작기 (PC-10, 올림프스사 제조) 에 의해 가공하여, 외경 약 20㎛ 가 되도록 선단을 부러뜨려 제조한 바늘을 꽂고, 마이크로 인젝터 (Transjector5246, 엣펜도르프사 제조) 를 사용하여, 배반 하강의 중앙에 실시예 2 에서 조제한 바이러스 용액 약 2㎕ 를 미량 주입했다. 이 알껍질의 베인 입구까지 난백을 채운 후, 난백을 풀로 하여 테플론막 (밀리랩, 미리포아사 제조) 과 폴리염화비닐리덴랩 (사란랩, 아사히가세이사 제조) 으로 뚜껑을 덮고, 15분마다 90도 전란하면서 부란했다.
부란 개시로부터 12시간 후, 24시간 후의 수정란에 동일한 방법으로 바이러스를 주입했다. 부란 후 약 36시간째부터 난황 표면에 혈관의 발생이 인정되고, 그 일부가 맥동하여 심장의 원기(原基, primordium)가 되는 것을 실체 현미경으로 관찰할 수 있다. 부란 후 36시간, 48시간, 55시간의 심장 내에, 실시예 2에서 조제한 바이러스 용액 2㎕ 를 마이크로 인젝터에 의해 미량 주입했다.
(실시예 4) 닭 배에 대하여 레트로바이러스 벡터의 인젝션
닭 수정란 (일본 생물과학연구소) 을 사용했다. 이 수정란을 자동 전란장치가 내장된 부란기 (쇼오와프랭키사 제조 P-008 형) 안에서 37.9℃, 습도 65%의 환경에 방치한 시간을 부란 개시 시간 (0 시간) 으로 하고, 이후 15분마다 90도 전란시키면서 부란하였다.
부란 개시시, 수정란의 알껍질을 70% 에탄올에 소독하고, 예리한 단부를 직경 3.5cm 의 원형으로 다이아몬드 커터 (MINIMO7C710, 미니타사 제조) 에 의해 잘라내어, 배를 노출시켰다. 배반엽을 실체 현미경으로 관찰하면서, 유리관 (CD-1, 올림프스사 제조) 을 마이크로 피펫 제작기 (PC-10, 올림프스사 제조) 에 의해 가공하여, 외경 약 20㎛ 가 되도록 선단을 부러뜨려 제조한 바늘을 꽂고, 마이크로 인젝터 (Transjector5246, 엣펜도르프사 제조) 를 사용하여 배반 하강의 중앙에 실시예 2 에서 조제한 바이러스 용액 약 2㎕ 를 미량 주입했다. 이 알껍질의 베인 입구까지 난백을 채운 후, 난백을 풀로 하여 테플론막 (밀리랩, 미리포아사 제조) 과 폴리염화비닐리덴랩 (사란랩, 아사히가세이사 제조) 으로 뚜껑을 덮고, 15분마다 90도 전란하면서 부란했다.
부란 개시로부터 12시간 후, 24시간 후의 수정란을 동일하게 처리했다. 부란 후 약 50시간째부터 난황 표면에 혈관의 발생이 인정되고, 그 일부가 맥동하여 심장의 원기가 되는 것을 실체 현미경으로 관찰할 수 있다. 부란 후 50시간, 55시간, 60시간의 심장 내에, 실시예 2 에서 조제한 바이러스 용액 2㎕ 를 마이크로 인젝터에 의해 미량 주입했다.
(실시예 5) β -갈락토시다제 활성 측정
부란 개시로부터 115시간 후, 배를 알껍질로부터 추출하고 PBS (인산 완충액) 으로 세정하여, 배를 둘러싼 막을 제거했다. 적출한 배를 잘게 전단하여, 0.8㎖ 의 반응 버퍼 (10mM KCl, 1mM MgCl2, 0.1% Triton X-100 (와코쥰야쿠고오교 제조), 5mM 2-메르캅토에탄올 (와코쥰야쿠고오교 제조), 2mM 인산 버퍼 pH 7.5) 을 첨가하고 초음파 파쇄하여, 세포액을 얻었다.
0.6㎖ 의 세포액을, 37℃ 에서 10분간 인큐베이트하고, 미리 따뜻하게 해 둔 4mg/㎖ 의 o-니트로페닐-β -D-갈락토피라노시드 (ONPG) (시그마사 제조) 를 0.1M 인산 버퍼 (pH 7.5) 에 용해한 액 0.1㎖ 를 첨가했다. 반응 후 0.3㎖ 의 1M Na2CO3 (와코쥰야쿠고오교 제조) 를 첨가하여, 흡광도계에 의해 420nm 의 파장 강도를 계측했다.
β -갈락토시다제의 활성은 ONPG unit 로 나타내었다 (1 unit:1μ mol 의 o-니트로페놀이 1 분 동안에 생성될 때의 활성). 3 회 실험하여, 그 평균값을 β -갈락토시다제 활성으로 했다.
닭 및 메추라기의, 유전자 도입 시기와 β -갈락토시다제 활성 측정 결과의 관계를 도 2, 도 3 에 나타내었다. 메추라기에서는 부란 후 48시간 후, 닭에서는 부란 후 55시간 후에 도입한 β -갈락토시다제 유전자가, 그 이전의 시기에 도입된 것에 비하여 강하게 발현되었다. 이는 조류 수정란이, 레트로바이러스에 의한 외래 유전자를 불활성화하는 (사일런싱) 메카니즘이 수정 직후에 현저하고, 시간이 지남에 따라서 약해져 가는 것을 시사한다. 이것으로부터, 조류의 종류에 따라서 결정되는 특정한 시간이 경과한 수정란에 목적 유전자를 도입함으로써, 불활성화되는 일없이 효율적으로 도입 유전자를 발현하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조가 가능해진다.
(실시예 6) 바이러스 타이터에 의한 유전자 발현의 효율
실시예 2 에서 조제한 1× 108cfu/㎖ 의 바이러스액을, 희석 용매 (50mM Tris-HCl (pH 7.8), 130mM NaCl, 1mM EDTA 용액) 에 의해 10배, 100배, 1000배로 3 단계 희석하여, 1× 107, 1× 106, 1× 105cfu/㎖ 의 타이터·바이러스 용액으로 했다. 메추라기 수정란을 부란하고, 48시간 후의 발생 초기 심장에 조제한 바이러스액 2㎕ 를 마이크로 인젝션했다. 동일한 방법으로 48시간 후의 발생 초기 심장에 희석 용매만을 2㎕ 인젝션한 것을 대조로 했다.
부란 개시로부터 115시간 후, 실시예 5 에 준하여 β -갈락토시다제 활성을 측정했다. 메추라기에서의 바이러스 타이터와 유전자 발현 결과의 관계를 도 4에 나타내었다.
동일한 방법으로 닭 수정란을 부란하고, 55시간 후의 발생 초기 심장에 조제한 바이러스액 2㎕ 를 마이크로 인젝션했다. 55시간 후의 발생 초기 심장에 희석 용매만을 2㎕ 인젝션한 것을 대조로 했다.
부란 개시로부터 115시간 후, 실시예 5 에 준하여 β -갈락토시다제 활성을 측정했다. 닭에서의 바이러스 타이터와 유전자 발현 결과의 관계를 도 5 에 나타내었다.
1× 108cfu/㎖ 의 바이러스가 주입된 메추라기 및 닭에서 현저한 β -갈락토시다제 활성이 확인되고, 그 이하의 농도에서는 발현량이 낮았다. 도입 유전자의 발현에는 바이러스 타이터가 크게 영향을 주는 것, 즉 본 발명에 의한 G0 트랜스제닉 키메라 조류에서, 도입 유전자를 효율적으로 발현시키기 위해서는 고타이터의 복제능 결실형 벡터를 사용하는 것이 유효하다는 것이 시사되었다.
(실시예 7) 인간 항체의, 메추라기 및 닭의 알 안으로의 이행성
3 종의 서브 클래스를 갖는 인간 항체 (IgG1, 2, 3) (코스모바이오사 제조)를 혼합한 것, 및 대응하는 3 종의 항체 절편 (Fab-1, Fab-2, Fab-3, Fc-1, Fc-2, Fc-3) (코스모바이오사 제조) 를 100㎍/㎖ 가 되도록 PBS 로 희석하고, 희석액 100㎕ 를 성숙한 메추라기 (3 마리) 또는 성숙한 닭 (3 마리) 의 날개밑 정맥에 주사했다.
항체를 정맥에 주사한 다음날로부터 20일째까지 채란하여, 알 안으로 이행된 항체를 정량했다. 난황은 50%(W/V), 난백은 10%(V/V) 가 되도록 PBS 를 사용하여 희석하고, 동결 보존하여 측정용 샘플로 했다.
(실시예 8) ELISA 법에 의한 난황 중 항체의 정량
PBS 로 희석한 항 인간 IgG 항체 (코스모바이오사 제조) 를 ELISA 플레이트에 100㎍/well 넣고, 4℃ 에서 하룻밤 정치했다. PBS-0.05% Tween20 용액 200㎕ 로 각 well 을 3 회 세정한 후, PBS-0.05% Tween20 용액-2% 스킴밀크를 150㎕/well 넣었다.
실온에서 2시간 정치 후, well 을 200㎕ 의 PBS-0.05% Tween20 용액으로 3회 세정하고, 채취한 혈액, 난백, 난황 샘플을 120㎕ 넣어, 4℃ 에서 하룻밤 정치했다. 이 ELISA 플레이트를 실온으로 되돌린 후, PBS-Tween20 용액으로 3회 각 well 을 세정하고, PBS-0.05% Tween20 용액으로 희석한 Peroxide (POD) 표지 항 인간 IgG 항체 (코스모바이오사 제조) 를 100㎕/well 넣어, 실온에서 1시간 정치했다.
PBS-0.05% Tween20 용액으로 well 을 4회 세정하고, 발색액 (10mg 의 o-페닐렌디아민 (가타야마가가꾸고오교 제조) 을 1㎖ 의 메탄올에 용해하고 증류수에 의해 100㎖ 로 한 것에, 10㎕ 의 과산화수소수 (와코쥰야쿠고오교 제조) 를 첨가하여 조제했다) 100㎕ 를 well 에 첨가했다. 8M 황산을 50㎕ 첨가하여 반응을 멈추고, 490nm 의 형광 강도를 플레이트 리더에 의해 측정하여, 표준 검량선으로부터 농도를 계산했다. 메추라기, 닭의 각각 3 마리로부터 얻은 샘플의 항체 농도를 평균한 것을 결과로 했다.
표준 검량선 제작을 위한 표준 항체 (코스모바이오사 제조) 는, 50% 난황-PBS (W/V) 로 희석했다.
메추라기 및 닭의 알 중에 축적된 항체 농도를 도 6, 7 에 나타내었다. 메추라기 및 닭의 알 중에 축적된 Fab, Fc 절편 농도를 도 8, 9, 10, 11 에 나타내었다.
메추라기 및 닭에 있어서, 인간 IgG 항체, 서브 클래스에서는 인간 IgG2, 인간 IgG1 이 효율적으로 알 중에 축적되는 것을 알 수 있었다. 또한 Fc 절편이 알 내에 대하여 높은 이행성을 나타내기 때문에, 인간 IgG 의 이행은 Fc 리셉터를 통한 것임이 시사되었다.
(실시예 9) 항 CD2 항체 발현 벡터 구축물의 제조
항 CD2 항체 발현용 벡터 구축물 pMSCV/G△AH, pMSCV/G△AL 및 pMSCV/G△ALIH1 은, 다음과 같이 제조했다.
1. 인간 항체 (IgM) 생성 하이브리도머 세포 D253-15-6 (아메리칸·타입·컬쳐·컬렉션 HB-8789) 으로부터 Quick Prep Micro mRNA Purification Kit (Pharmacia 사 제조) 를 사용하여 mRNA 를 취득하고, 얻어진 mRNA 로부터 First-Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia 사 제조) 를 사용하여 cDNA 라이브러리를 조제했다. 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-atcctcgagaggccaaagtacagtg-3' (서열 번호 7; 하선부는 XhoI 제한효소 사이트) 및 5'-cccggatccctaacactctcccctgttgaagct-3' (서열 번호 8; 하선부는 BamHI 제한효소 사이트) 를 프라이머로 하는 PCR (94℃/1분 → 50℃/1분 → 72℃/1분 30초: 25 사이클; Taq DNA 폴리메라아제 (PerkinElmer 사 제조)) 에 의해 상기 cDNA 라이브러리로부터 인간 항체 L 사슬 κ 정상 영역 (hCκ) 의 유전자 단편을 증폭 후, 제한효소 XhoI 및 BamHI 에 의해 잘라내고, 플라스미드 pBluescriptIIKS(-) (Stratagene 사 제조) 의 XhoI, BamHI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pBlue/hCκ 를 제조했다.
2. 동일한 방법으로, 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-agcggccgctacaggtgtccactccgacatcgtgatgacccagtctcc-3' (서열 번호 9; 하선부는 NotI 제한효소 사이트) 및 5'-cctctcgaggatagaagttattcagcaggcacac-3' (서열 번호 10; 하선부는 XhoI 제한효소 사이트) 를 프라이머로 하는 PCR 에 의해 상기 cDNA 라이브러리로부터 인간 항체 L 사슬 가변 영역 (hVL) 의 유전자 단편을 증폭 후, 제한효소 NotI 및 XhoI 에 의해 잘라내고, pBluescriptIIKS(-) 의 NotI, XhoI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pBlue/hVL 을 제조했다.
3. 동일한 방법으로, 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-acctcgagcgtggccgttggctgcctcgcaca-3' (서열 번호 11; 하선부는 XhoI 제한효소 사이트) 및 5'-actaagcttacgttgtacagggtgggtttacc-3' (서열 번호 12; 하선부는 HindIII 제한효소 사이트) 를 프라이머로 하는 PCR 에 의해 상기 cDNA 라이브러리로부터 인간 항체 H 사슬 μ 정상 영역 (hCμ ) 의 유전자 단편을 증폭 후, 제한효소 XhoI 및 HindIII 에 의해 잘라내고, pBluescriptIIKS(-) 의 XhoI, HindIII 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pBlue/hCμ 를 제조했다.
4. 동일한 방법으로, 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-agcggccgctacaggtgtccactccgaggtgcagctggtggagtctgg-3' (서열 번호 13; 하선부는 NotI 제한효소 사이트) 및 5'-cacgctcgaggtatccgacggggaattctcacagga-3' (서열 번호 14; 하선부는 XhoI 제한효소 사이트) 를 프라이머로 하는 PCR 에 의해 상기 cDNA 라이브러리로부터 인간 항체 H 사슬 가변 영역 (hVH) 의 유전자 단편을 증폭 후, 제한효소 NotI 및 XhoI 에 의해 잘라내고, pBluescriptIIKS(-) 의 NotI, XhoI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pBlue/hVH 를 제조했다.
5. pBlue/hCκ 로부터 hCκ 유전자 단편을 제한효소 XhoI 및 BamHI 에 의해 잘라내고, 플라스미드 pCEP4 (Invitrogen 사 제조) 의 XhoI, BamHI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pCEP4/hCκ 를 제조했다.
6. 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-cccaagcttgatctccactgggatggtgggggccctcctcttgctgctg-3' (서열 번호 15; 하선부는 HindIII 제한효소 사이트) 및 5'-cccggatcctcagtcaaggcgccttcgcatgaagaggccgatccccagggccaccaccagcagcaagaggagggcccc-3' (서열 번호 16; 하선부는 BamHI 제한효소 사이트) 를 21bps 에 걸쳐 상보적인 3' 말단에서 어닐시키고, T4 DNA 폴리메라아제 (다까라슈조사 제조) 를 사용한 DNA 2 중쇄 합성 반응에 의해 상피 증식 인자 수용체막 관통 영역 (TM) 의 유전자 단편을 조제했다. 얻어진 TM 유전자 단편을 제한효소 HindIII 및 BamHI 에 의해 처리 후, pBluescriptIIKS(-) 의 HindIII, BamHI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pBlue/TM 을 제조했다.
7. pBlue/hCμ 로부터 hCμ 유전자 단편을 제한효소 XhoI 및 HindIII 에 의해 잘라내고, pBlue/TM 의 XhoI, HindIII 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pBlue/hCμ TM 을 제조했다.
8. pBlue/hCμ TM 으로부터 일련의 hCμ 유전자 및 TM 유전자를 함유하는 단편을 제한효소 XhoI 및 BamHI 에 의해 잘라내고, pCEP4 의 XhoI, BamHI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pCEP4/hCμ TM 을 제조했다.
9. pCEP4/hCμ TM 을 제한효소 BamHI 에 의해 절단하고, 말단을 T4 DNA 폴리메라아제에 의해 평활 처리 후, 셀프라이게이션 (self-ligation) 에 의해 플라스미드 pCEP4/hCμ TM△B 를 제조했다.
10. 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-tgaagacagatggcgccgccacagttcgttt-3' (서열 번호 17; 하선부는 NarI 제한효소 사이트) 를 사용한 부위 특이적 변이 도입에 의해 pBlue/hVL 이 보유하는 hVL 의 3' 말단에 아미노산 암호의 변경을 수반하지 않고서 제한효소 NarI 사이트를 도입하여, 플라스미드 pBlue/hVLN 을 제조했다.
11. 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-tggggcggatgcggatcctgaggagacggt-3' (서열 번호 18; 하선부는 BamHI 제한효소 사이트) 를 사용한 부위 특이적 변이 도입에 의해 pBlue/hVH 가 보유하는 hVH 의 3' 말단에 아미노산 암호의 변경을 수반하지 않고서 제한효소 BamHI 사이트를 도입하여, 플라스미드 pBlue/hVHB 를 제조했다.
12. 항 인간 CD2 마우스 항체 생성 하이브리도머 세포 TS2/18.1.1 (아메리칸·타입·컬쳐·컬렉션 HB-195) 로부터 Quick Prep Micro mRNA Purification Kit 를 사용하여 mRNA 를 취득하고, 얻어진 mRNA 로부터 First-Strand cDNA Synthesis Kit를 사용하여 cDNA 라이브러리를 조제했다. 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-cgcggccgcctcagggaaagtttgaagatg-3' (서열 번호 19; 하선부는 NotI 제한효소 사이트) 및 5'-cggcgccgccacagtccgttttatttccagcttggt-3' (서열 번호 20; 하선부는 NarI 제한효소 사이트) 를 프라이머로 하는 PCR 에 의해 상기 cDNA 라이브러리로부터 마우스 항체 L 사슬 가변 영역 (mVL) 의 유전자 단편을 증폭 후, 제한효소 NotI 및 NarI 에 의해 잘라내고, pBlue/hVLN 의 NotI, NarI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pBlue/mVL 을 제조했다.
13. 동일한 방법으로, 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-cgcggccgcgaacacggamccctcaccatg-3' (서열 번호 21; 하선부는 NotI 제한효소 사이트) 및 5'-cggatcctgcagagacagtgaccagagt-3' (서열 번호 22; 하선부는 BamHI 제한효소 사이트) 를 프라이머로 하는 PCR 에 의해 상기 cDNA 라이브러리로부터 마우스항체 H 사슬 가변 영역 (mVH) 의 유전자 단편을 증폭 후, 제한효소 NotI 및 BamHI 에 의해 잘라내고, pBluescriptIIKS(-) 의 NotI, BamHI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pBlue/mVH 를 제조했다.
14. pBlue/mVL 로부터 mVL 유전자 단편을 제한효소 NotI 및 XhoI 에 의해 잘라내고, pCEP4/hCκ의 NotI, XhoI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pCEP4/IgLκ를 제조했다.
15. pBlue/hVHB 로부터 hVH 유전자 단편을 제한효소 NotI 및 XhoI 에 의해 잘라내고, pCEP4/hCμ TM △B 의 NotI, XhoI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pCEP4/hIgHμ TM 을 제조했다.
16. pBlue/mVH 로부터 mVH 유전자 단편을 제한효소 NotI 및 BamHI 에 의해 잘라내고, 제한효소 NotI 및 BamHI 에 의해 처리한 pCEP4/hIgHμ TM 의 벡터 단편에 연결하여, 플라스미드 pCEP4/IgHμ TM 을 제조했다.
17. 플라스미드 pMSCVneo (clontech 사 제조) 로부터 일련의 뮤린·포스포글리세레이트·키나아제 (PGK: phosphoglycerate kinase) 프로모터 및 Neor 유전자를 함유하는 단편을 제한효소 BglII 및 BamHI 에 의해 제거하고, 남은 벡터 단편의 셀프라이게이션에 의해 플라스미드 pMSCV 를 제조했다.
18. 플라스미드 pGREEN LANTERN-1 (GIBCO BRL 사 제조) 로부터 GFP 유전자 단편을 제한효소 NotI 에 의해 잘라내고, pZeoSV2(+) 의 NotI 사이트에 삽입했다. T7 프로모터와 동 방향으로 GFP 유전자가 삽입된 구조의 플라스미드를 pZeo/GFP 로 했다.
19. pZeo/GFP 로부터 GFP 유전자 단편을 제한효소 EcoRI 및 XhoI 에 의해 잘라내고, 제한효소 EcoRI 및 XhoI 에 의해 처리한 pMSCV 의 벡터 단편에 연결하여, 플라스미드 pMSCV/G 를 제조했다.
20. 인간 항체 (IgG1) 생성 미엘로머 세포 IM-9 (재패니즈·컬렉션·오브·리서치·바이오리소시즈 0024) 로부터 mRNA isolation Kit (로슈사 제) 를 사용하여 mRNA 를 취득하고, 얻어진 mRNA 로부터 ReverTra Ace (토요보사 제조) 를 사용하여 cDNA 라이브러리를 조제했다. 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-caagcttcaagggcccat-3' (서열 번호 23) 및 5'-atttacccggagacaggga-3' (서열 번호 24) 를 프라이머로 하는 PCR (95℃/2분 → 52℃/30초 → 74℃/3분: 30 사이클; Pfu DNA 폴리메라아제 (프로메가사 제조)) 에 의해 상기 cDNA 라이브러리로부터 인간항체 H 사슬 γ 1 정상 영역 (hCγ 1) 의 유전자 단편을 증폭했다. 그리고, 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-ataggatccgctagcttcaagggcccatcg-3' (서열 번호 25; 하선부는 BamHI 제한효소 사이트) 및 5'-agcaagctttcatttacccggagacaggga-3' (서열 번호 26; 하선부는 HindIII 제한효소 사이트) 를 프라이머로 하는 PCR (94℃/15초 → 58℃/30초 → 68℃/1분: 30 사이클; KOD-plus-DNA 폴리메라아제) 에 의해 상기 PCR 산물로부터 hCγ1 유전자 단편을 증폭 후, 제한효소 BamHI 및 HindIII 에 의해 잘라내고, pBluescriptIISK(+) 의 BamHI, HindIII 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pBlue/hCγ1을 제조했다.
21. pCEP4/IgHμ TM 로부터 mVH 유전자 단편을 제한효소 HindIII 및 BamHI 에 의해 잘라내었다. pBlue/hCγ1 로부터 hCγ1 유전자 단편을 제한효소 BamHI 및 HindIII 에 의해 잘라내었다. 제한효소 HindIII 에 의해 처리한 플라스미드 pETBlue-2 (노바젠사 제조) 의 벡터 단편에 상기 잘라낸 2 단편을 연결하여, 플라스미드 pETBlue/IgHγ1을 제조했다.
22. pETBlue/IgHγ1 로부터 항체 H 사슬 γ 1 (IgHγ1) 의 유전자 단편을 제한효소 HindIII 에 의해 잘라내고, pMSCV/G 의 HindIII 사이트에 삽입했다. GFP 유전자와 동 방향으로 IgHγ1 유전자가 삽입된 구조의 플라스미드를 pMSCV/GH 로 했다.
23. 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-acgcgtcgacgtgcatgcacgctcattg-3' (서열 번호 27; 하선부는 SalI 제한효소 사이트) 및 5'-acgcgtcgacaacgcagcgactcccg-3' (서열 번호 28; 하선부는 SalI 제한효소 사이트) 를 프라이머로 하는 PCR (94℃/15초 → 50℃/30초 → 68℃/1분: 10사이클; 94℃/15초 → 62℃/30초 → 68℃/1분: 30 사이클) 에 의해 pMiwZ 로부터 △Act 프로모터 단편을 증폭 후, 제한효소 SalI 에 의해 △Act 프로모터 단편을 잘라내고, pETBlue-2 의 SalI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pETBlue/△Act 를 제조했다.
24. pETBlue/△Act 로부터 △Act 프로모터 단편을 제한효소 SalI 에 의해 잘라내고, pMSCV/GH 의 XhoI 사이트에 삽입했다. IgHγ1 유전자와 동 방향으로 △Act 프로모터가 삽입된 구조의 플라스미드를 pMSCV/G△AH로 했다.
25. 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-aatgtcgacatggtgtccacttctcagctc-3' (서열 번호 29; 하선부는 SalI 제한효소 사이트) 및 5'-ttcgtcgacctaacactctcccctgttgaa-3' (서열 번호 30; 하선부는 SalI 제한효소 사이트) 를 프라이머로 하는 PCR (95℃/30초 → 50℃/30초 → 74℃/2분: 10 사이클; 95℃/30초 → 60℃/30초 → 74℃/2분: 30 사이클; Pfu DNA 폴리메라아제) 에 의해 pCEP4/IgLκ 로부터 항체 L 사슬 κ (IgLκ) 의 유전자 단편을 증폭 후, 제한효소 SalI 에 의해 잘라내고, pETBlue-2 의 SalI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pETBlue/IgLκ를 제조했다.
26. pETBlue/△Act 로부터 △Act 프로모터 단편을 제한효소 SalI 에 의해 잘라내고, pMSCV/G 의 XhoI 사이트에 삽입했다. GFP 유전자와 동 방향으로 △Act 프로모터가 삽입된 구조의 플라스미드를 pMSCV/G△A 로 했다.
27. pETBlue/IgLκ 로부터 IgLκ 유전자 단편을 제한효소 SalI 에 의해 잘라내고, pMSCV/G△A 의 SalI 사이트에 삽입했다. △Act 프로모터와 동 방향으로 IgLκ 유전자 단편이 삽입된 구조의 플라스미드를 pMSCV/G△AL 로 했다.
28. 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-acgcgtcgaccgcccctctccctccccc-3' (서열 번호 31; 하선부는 SalI 제한효소 사이트) 및 5'-ccgctcgagattatcatcgtgtttttcaaaggaaaaccacgtc-3' (서열 번호 32; 하선부는 XhoI 제한효소 사이트) 를 프라이머로 하는 PCR (94℃/15초 → 60℃/30초 → 68℃/1분: 30 사이클) 에 의해 플라스미드 pLXIN (clontech 사 제조) 으로부터 IRES 단편을 증폭 후, 제한효소 SalI 및 XhoI 에 의해 잘라내고, pETBlue-2 의 SalI, XhoI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pETBlue/IRES 를 제조했다.
29. pETBlue/IRES 로부터 IRES 단편을 제한효소 SalI 및 XhoI 에 의해 잘라내고, pMSCV/G△AH 의 SalI 사이트에 삽입했다. IgHγ1 유전자와 동 방향으로 IRES 가 삽입된 구조의 플라스미드를 pMSCV/G△AIH 로 했다.
30. pETBlue/IgLκ 로부터 IgLκ 유전자 단편을 제한효소 SalI 에 의해 잘라내어, pMSCV/G△AIH 의 SalI 사이트에 삽입했다. △Act 프로모터와 동 방향으로 IgLκ 유전자 단편이 삽입된 구조의 플라스미드를 pMSCV/G△ALIH 로 했다.
이와 같이 제조한 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터의 벡터 구축물 pMSCV/G△AH, pMSCV/G△AL 및 pMSCV/G△ALIH 의 구조를 도 12에 나타내었다.
(실시예 10) 항 CD2 항체 발현 G0 트랜스제닉 키메라 메추라기의 제조
실시예 2 에 준하여, 벡터 구축물 pMSCV/G△AH, pMSCV/G△AL 및 pMSCV/G△ALIH 로부터 3 종류의 레트로바이러스 벡터를 조제했다. 이 레트로바이러스 벡터의 타이터를 측정한 결과, 108cfu/㎖∼109cfu/㎖ 였다.
얻어진 레트로바이러스 벡터를, 실시예 3 에 준하여 부란 후 36시간의 메추라기 수정란 심장에 마이크로 인젝션하고, 37.9℃, 습도 65% 로 15분마다 90도 전란시키면서 부란했다.
경쇄 (Light Chain), 중쇄 (Heavy Chain) 로 이루어지는 항체를 트랜스제닉 동물에서 발현시키기 위해서는, 각각의 경쇄, 중쇄를 발현시키는 벡터를 각각 단독으로 도입하는 방법과, 경쇄를 발현하는 유전자와 중쇄를 발현하는 유전자를 IRES와 같은 배열로 구획하고, 동일한 벡터로서 도입하는 방법을 생각할 수 있다.
그래서 인젝션은, pMSCV/G△AH, pMSCV/G△AL 을 동시에 감염시킨 경우 (실시예 11, 실험예 1) 와, pMSCV/G△ALIH 로부터 조제한 벡터를 단독으로 도입한 경우 (실시예 11, 실험예 2) 로 나눠 실시하였다.
부란 48시간 후, 발생이 정상적으로 진행되고 있음을 확인하고, 닭의 S 사이즈 알껍질의 무딘 단부에 직경 4cm 의 구멍을 뚫은 것에 이 바이러스 도입 배를 이식하였다. 배를 위로 하여 공기와 접촉하도록 하고, 농도 50mg/㎖ 로 난백에 현탁한 락트산칼슘 (시그마사 제조) 용액을 0.5㎖ 첨가 후, 난백을 풀로 하여 랩으로 밀폐했다. 다시 부란기에 넣고, 37.9℃, 습도 65% 로 1시간마다 60도 전란하면서 13일간 배양했다. 전란을 멈추고 정치 상태로 하고, 배가 폐 호흡으로 이행되면, 랩에 바늘로 작은 구멍을 뚫어 호흡을 도왔다. 장뇨막 (漿尿膜) 의 피가 빠지면 배양기로부터 병아리를 꺼내어, 부화시켰다.
(실시예 11) 혈청 중, 알 중의 항 CD2 항체 농도의 측정
실시예 10 에 의해 부화시킨 G0 트랜스제닉 키메라 메추라기를 1 개월간 사육하여 병아리를 성장시켰다. 30일 후 및 60일 후, 성장한 G0 트랜스제닉 메추라기의 날개밑 정맥으로부터 채혈하여, 혈액 샘플을 얻었다. 얻어진 혈액을 15,000rpm 으로 10분간 원심하고, 상등액으로서 얻어지는 혈청으로부터 항 CD2 항체량을 측정했다.
부화로부터 1.5개월 후, 산란을 시작한 자성 트랜스제닉 메추라기로부터 채란하고, 실시예 7 에 준하여 조제한 난백, 난황 중의 항 CD2 항체량을 실시예 8 에 준하여 ELISA 법에 의해 정량했다.
실험예 1, 실험예 2 의 정량 결과를 나타낸다.
(실험예 1)
pMSCV/G△AH, pMSCV/G△AL 로부터 조제한 벡터 (3∼4× 108cfu/㎖) 를 동시에 감염시킨 G0 트랜스제닉 키메라 메추라기 (개체 식별 번호 # 1113) 는, 난황 중에 0.6㎍/㎖, 난백 중에 0.5㎍/㎖ 의 항 CD2 항체를 발현하였다.
(실험예 2)
pMSCV/G△ALIH 로부터 조제한 벡터 (5× 108cfu/㎖) 를 단독으로 도입한 G0 트랜스제닉 키메라 메추라기 (#4202) 는, 혈청 중에 5.2㎍/㎖ 의 항 CD2 항체를 발현하였다.
(실시예 12) scFv-Fc 항체 발현 벡터 구축물의 제조
scFv-Fc 항체 발현 벡터 구축물 pMSCV/scFv-Fc 는, 다음과 같이 제조했다.
1. 5' 말단을 인산화한 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-ctagaccatgaggtctttgctaatcttggtgctttgcttcctgcccctggctgctctgggg-3' (서열 번호 33; ctaga 는 XbaI 인식 부위 말단, gg 는 HaeIII 인식 부위 말단) 및 5'-ccccagagcagccaggggcaggaagcaaagcaccaagattagcaaagacctcatggt-3' (서열 번호 34: cc 는 XbaI 인식 부위 말단, t 는 HaeIII 인식 부위 말단) 을 어닐시키고, 리소자임 분비 시그널의 유전자 단편을 조제했다. 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-gcgtttaaagtgacgttggacgtccg-3' (서열 번호 35: tttaaa 는 DraI 제한효소 사이트) 및 5'-attaggatccgcgcttaaggacggtcagg-3' (서열 번호 36; ggatcc 는 BamHI 제한효소 사이트) 를 프라이머로 하는 PCR (94℃/15초 → 58℃/30초 → 68℃/1분: 30 사이클; KOD-P1us-DNA 폴리메라아제) 에 의해, HUC2-13 세포의 닭 항체 가변 영역 유전자로부터 조제된 단일 사슬 항체 (scFv) 의 유전자를 함유한 플라스미드 pPDS/scFv (Nakamura et al., 2000, Cytotechnology 32: 191-198) 로부터 scFv 유전자 단편을 증폭 후, 제한효소 DraI 및 BamHI 에 의해 잘라내었다. pBluescriptIISK(+) 의 XbaI, BamHI 사이트에 상기 조제한 2 단편을 삽입하여, 플라스미드 pBlue/scFv 를 제조했다.
2. pBlue/scFv 로부터 scFv 유전자 단편을 제한효소 NotI 및 BamHI 에 의해 잘라내고, pCEP4 의 NotI, BamHI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pCEP4/scFv 를 제조했다.
3. 인간 IgG1 생성 미엘로머 세포 IM-9 로부터 mRNA isolation Kit 를 사용하여 mRNA 를 취득하고, 얻어진 mRNA 로부터 ReverTra Ace 를 사용하여 cDNA 라이브러리를 조제했다. 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-caagcttcaagggcccat-3' (서열 번호 23) 및 5'-atttacccggagacaggga-3' (서열 번호 24) 를 프라이머로 하는 PCR (95℃/2분 → 52℃/30초 → 74℃/3분: 30 사이클; Pfu DNA 폴리메라아제) 에 의해 상기 cDNA 라이브러리로부터 hCγ1 유전자 단편을 증폭했다. 또, 2 개의 화학 합성 올리고뉴클레오티드 5'-attaggatccgagcccaaatcttgtgacaaaactc-3' (서열 번호 37: ggatcc 는 BamHI 제한효소 사이트) 및 5'-agcaagctttcatttacccggagacaggga-3' (서열 번호 26; aagctt 는 HindIII 제한효소 사이트) 를 프라이머로 하는 PCR (94℃/15초 → 58℃/30초 → 68℃/1분: 30 사이클; KOD-plus-DNA 폴리메라아제) 에 의해 상기 PCR 산물로부터 인간항체 H 사슬 γ 1 의 Fc 영역 (Fc) 의 유전자 단편을 증폭 후, 제한효소 BamHI 및 HindIII 에 의해 잘라내고, pBluescriptIISK(+) 의 BamHI, HindIII 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pBlue/Fc 를 제조했다.
4. pCEP4/scFv 로부터 scFv 유전자 단편을 제한효소 HindIII 및 BamHI 에 의해 잘라내었다. pBlue/Fc 로부터 Fc 유전자 단편을 제한효소 BamHI 및 HindIII 에 의해 잘라내었다. pBluescriptIISK(+) 의 HindIII 사이트에 상기 잘라낸 2 단편을 삽입하여, 플라스미드 pBlue/scFv-Fc 를 제조했다.
5. pBlue/scFv-Fc 에서 닭 단일 사슬 항체 가변 영역에 인간 항체 H 사슬 γ 1· Fc 가 연결된 구조 (scFv-Fc) 의 유전자 단편을 제한효소 HindIII 에 의해 잘라내고, 제한효소 HindIII 에 의해 처리한 pMSCV/G△AH 의 벡터 단편에 연결했다. △Act 프로모터와 동 방향으로 scFv-Fc 유전자가 연결된 구조의 플라스미드를 pMSCV/G△AscFv-Fc 로 했다.
이와 같이 제조한 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터의 벡터 구축물 pMSCV/G△AscFv-Fc 의 구조를 도 13 에 나타내었다.
(실시예 13) scFv-Fc 항체 발현 G0 트랜스제닉 키메라 메추라기의 제조
실시예 2 에 준하여, 벡터 구축물 pMSCV/G△AscFv-Fc 로부터 레트로바이러스 벡터를 조제했다. 이 레트로바이러스 벡터의 타이터를 측정한 결과, 108cfu/㎖∼109cfu/㎖ 였다.
얻어진 바이러스 벡터 용액을, 실시예 3 에 준하여 부란 후 36시간의 메추라기 수정란 심장에 마이크로 인젝션하고, 실시예 10 에 준하여 부화시킴으로써 G0 트랜스제닉 키메라 메추라기를 탄생시켰다.
(실시예 14) 혈청 중, 알 중의 scFv-Fc 농도의 측정
실시예 13 에 의해 탄생한 G0 트랜스제닉 키메라 메추라기를 1 개월간 사육하여 병아리를 성장시켰다. 30일 후 및 60일 후, 성장한 G0 트랜스제닉 키메라 메추라기 (개체 식별 번호 #3303, #3306, #3310, #3311, #3313) 의 날개밑 정맥으로부터 채혈하여, 혈액 샘플을 얻었다. 얻어진 혈액을 15,000rpm 으로 10분간 원심하고, 상등액으로서 얻어지는 혈청으로부터 scFv-Fc 항체량을 측정했다.
부화로부터 1.5개월 후, 산란을 시작한 자성 트랜스제닉 메추라기 (개체 식별 번호 #3310) 로부터 채란하고, 실시예 7 에 준하여 조제한 난백, 난황 중의 scFv-Fc 항체량을 실시예 8 에 준하여 ELISA 법에 의해 정량했다.
표준 검량선은 정제한 scFv-Fc 를 사용하여 제조했다. 실시예 12 에서 제조한 벡터 구축물 pMSCV/scFv-Fc 를 리포펙션법에 의해 GP293 세포에 도입하고, 그 배양 상등액을 4℃, 10분간, 3000rpm 으로 원심하여 고형물을 제거했다. 이 상등액을 냉각하면서 교반하여, 50% 포화가 되도록 잘게 부순 황산암모늄을 서서히 첨가하여 (313g 황산암모늄/1000㎖ 물), 단백질을 침전시켰다. 이것을 4℃ 에서 하룻밤 정치한 후, 4℃ 에서 10분간, 15,000rpm 으로 원심하여 침전을 완전히 침강시키고, 소량의 PBS 에 의해 용해했다. 2L 의 PBS 로 3 회 투석하여 황산암모늄을 제거했다.
정제용의 프로테인 G 칼럼 (퍼젭티브바이오시스템즈사 제조) 의 초기 세정을 Binding Buffer (NaHPO4·2H2O 1.56g/l, NaHPO4·12H2O 7.16g/l) 10㎖, Wash Buffer (아세트산 20%, 증류수 80%) 10㎖, Binding Buffer 10㎖ 의 순으로 실시하였다 (유속 2㎖/분). PBS 에 용해한 단백질액을 1㎖/분으로 흐르게 하여, scFv-Fc 를 칼럼에 흡착시켰다. Binding Buffer 20㎖ 를 1.7㎖/분으로 흐르게 하여 불필요한 단백질을 제거하고, Elution Buffer (글리신 7.507g/l, 2N HCl 에 의해 pH 2.5∼3.0 으로 조제) 를 1.5㎖/분으로 흐르게 하여 scFv-Fc 를 용출하였다.
용출 분획을 PBS (2L) 로 3 회 투석하여 정제 scFv-Fc 로 하고, 파장 280nm 의 흡광도로부터 단백질 농도를 정량했다.
실시예 14 에서 제조한 G0 트랜스제닉 키메라 메추라기의 30일 후, 60일 후 채혈 혈청 중의 scFv-Fc 양을 도 14 에 나타내었다. scFv-Fc 항체의 발현 유전자가 도입된 G0 트랜스제닉 키메라 메추라기는, 30일째에 약 2mg/㎖∼4mg/㎖ 의 항체를 혈청 중에 발현하고, 5 마리 중 3 마리가 60일 후에도 같은 정도의 발현량을 나타내었다.
G0 트랜스제닉 키메라 메추라기 (#3310) 가 산란을 시작한 날로부터, 난황, 난백 중의 scFv-Fc 양을 도 15 에 나타내었다. 항체는 난백, 난황 중에 약 500㎍/㎖∼1mg/㎖ 발현되고, 산란 개시로부터 17일째까지 약간의 변동은 있지만 안정된 발현량을 유지했다.
(실시예 15) scFv-Fc 구조의 확인
실시예 13 에서 제조한 G0 트랜스제닉 키메라 조류 혈청 1㎖ 로부터 실시예 10 에 준하여, 황산암모늄 침전과 프로테인 G 칼럼에 의해 scFv-Fc 를 정제했다. 정제한 scFv-Fc 를 SDS-PAGE 에 의해 해석하고, 그 결과를 도 16 에 나타내었다. 미처리 레인으로부터 scFv-Fc 의 분자량 약 120kDa 가 표시되었다. 환원 처리한 scFv-Fc 의 분자량이 미처리 경우의 거의 절반 (약 60kDa) 으로 되어 있는 것에서, G0 트랜스제닉 키메라 메추라기에 의해 생성된 scFv-Fc 는 S-S 결합에 의한 2 량체를 형성하고 있음을 알 수 있었다. 이들은, S-S 결합에 관여하는 시스테인 잔기를 Fc 부에 갖는 scFv-Fc 의 구조적 특징에 부합하여, G0 트랜스제닉 키메라 메추라기에 의해 생성된 scFv-Fc 는 올바른 구조를 유지하고 있음이 시사되었다.
(실시예 16) TNFR-Fc 융합 단백 발현 G0 트랜스제닉 키메라 닭의 제조
실시예 9 에 준하여 TNFR-Fc 발현 벡터 구축물을 제조하고, 실시예 2 에 준하여 레트로바이러스 벡터를 제조했다. 이 레트로바이러스 벡터의 타이터는, 1.7× 107cfu/㎖ 였다.
얻어진 바이러스 벡터 용액을, 실시예 4 에 준하여 부란 후 55시간의 닭 수정란 심장에 마이크로 인젝션하고, 실시예 10 에 준하여 부화시킴으로써 G0 트랜스제닉 키메라 닭을 탄생시켰다.
8 개의 수정란에 인젝션한 결과 4 마리가 부화되고, 실시예 14 에 준하여 그혈청 중의 TNFR-Fc 를 정량한 결과, 최고로 50㎍/㎖ 의 TNFR-Fc 가 발현되어 있었다.
본 발명의 G0 트랜스제닉 키메라 조류는, 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터에 의해 도입된 유전자를 불활성화하지 않고 효율적으로 발현시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법은, 키메라 항체, 예를 들어 scFv-Fc 항체의 유전자를 도입하여, 혈 중, 알 중에 항체를 효율적으로 발현시킬 수 있는 조류의 제조를 가능하게 한다. 그리고, 본 발명의 항체 생산법은, 키메라 항체, 예를 들어 scFv-Fc 항체를 생성하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류를 제조하여, 항체를 조류의 혈청, 알 중에서 회수, 정제하는 것으로 이루어지기 때문에, 효율적인 항체 생산을 가능하게 한다.
<110> Kaneka Corporation, Nagoya Industrial Science Research Institute (Chubu Technology Licensing Office) <120> Method of gene expression in transgenic birds transformed with retrovirus vectors and transgenic birds thus obtained <130> T753/TRANS-1 <150> JP P2002-236089 <151> 2002-08-13 <160> 37 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5'-primer used for PCR amplification of the Miw promoter 5' region fragment <400> 1 cggtctagag gaattcagtg gttcg 25 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 3'-primer incorporating the BamH I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the Miw promoter 5' region fragment <400> 2 ccaggatccg acgttgtaaa acgacg 26 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5'-primer incorporating the Hind III recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the Miw promoter 3' region fragment <400> 3 ccaaagcttg ccgcagccat tgcctttt 28 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 3'-primer incorporating the Bln I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the Miw promoter 3' region fragment <400> 4 atacctaggg gctggctgcg gaggaac 27 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5`-primer incorporating the Nhe I recognition site at the 5` terminal used for PCR amplification of the chicken beta-actin promoter fragment lacking the intron <400> 5 tttagctagc tgcagctcag tgcatgcac 29 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 3'-primer incorporating the Xba I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the chicken beta-actin promoter fragment lacking the intron <400> 6 ataatctaga aacgcagcga ctcccgc 27 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5'-primer incorporating the Xho I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the human antibody light chain kappa constant region <400> 7 atcctcgaga ggccaaagta cagtg 25 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 3'-primer incorporating the BamH I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the human antibody light chain kappa constant region <400> 8 cccggatccc taacactctc ccctgttgaa gct 33 <210> 9 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5'-primer incorporating the Not I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the human antibody light chain variable region <400> 9 agcggccgct acaggtgtcc actccgacat cgtgatgacc cagtctcc 48 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 3'-primer incorporating the Xho I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the human antibody light chain variable region <400> 10 cctctcgagg atagaagtta ttcagcaggc acac 34 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5'-primer incorporating the Xho I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the human antibody heavy chain mu constant region <400> 11 acctcgagcg tggccgttgg ctgcctcgca ca 32 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 3'-primer incorporating the Hind III recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the human antibody heavy chain mu constant region <400> 12 actaagctta cgttgtacag ggtgggttta cc 32 <210> 13 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5'-primer incorporating the Not I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the human antibody heavy chain variable region <400> 13 agcggccgct acaggtgtcc actccgaggt gcagctggtg gagtctgg 48 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 3'-primer incorporating the Xho I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the human antibody heavy chain variable region <400> 14 cacgctcgag gtatccgacg gggaattctc acagga 36 <210> 15 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5'-primer incorporating the Hind III recognition site at the 5' terminal used for DNA polymerase reaction to construct the coding fragment of the human epidermal growth factor receptor transmembrane region <400> 15 cccaagcttg atctccactg ggatggtggg ggccctcctc ttgctgctg 49 <210> 16 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 3'-primer incorporating the BamH I recognition site at the 5' terminal used for DNA polymerase reaction to construct the coding fragment of the human epidermal growth factor receptor transmembrane region <400> 16 cccggatcct cagtcaaggc gccttcgcat gaagaggccg atccccaggg ccaccaccag 60 cagcaagagg agggcccc 78 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide used for site-directed mutagenesis to generate the Nar I recognition site at the 3' terminal of the coding fragment of the human antibody light chain variable region <400> 17 tgaagacaga tggcgccgcc acagttcgtt t 31 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide used for site-directed mutagenesis to generate the BamH I recognition site at the 3' terminal of the coding fragment of the human antibody heavy chain variable region <400> 18 tggggcggat gcggatcctg aggagacggt 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5'-primer incorporating the Not I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the mouse antibody light chain variable region <400> 19 cgcggccgcc tcagggaaag tttgaagatg 30 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 3'-primer incorporating the Nar I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the mouse antibody light chain variable region <400> 20 cggcgccgcc acagtccgtt ttatttccag cttggt 36 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5'-primer incorporating the Not I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the mouse antibody heavy chain variable region <400> 21 cgcggccgcg aacacggamc cctcaccatg 30 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 3'-primer incorporating the BamH I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the mouse antibody heavy chain variable region <400> 22 cggatcctgc agagacagtg accagagt 28 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5'-primer used for PCR amplification of the coding fragment of the human antibody heavy chain gamma 1 constant region <400> 23 caagcttcaa gggcccat 18 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 3'-primer used for PCR amplification of the coding fragment of the human antibody heavy chain gamma 1 constant region <400> 24 atttacccgg agacaggga 19 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5'-primer incorporating the BamH I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the human antibody heavy chain gamma 1 constant region <400> 25 ataggatccg ctagcttcaa gggcccatcg 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 3'-primer incorporating the Hind III recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the human antibody heavy chain gamma 1 constant or Fc region <400> 26 agcaagcttt catttacccg gagacaggga 30 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5'-primer incorporating the Sal I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the chicken beta-actin promoter fragment lacking the intron <400> 27 acgcgtcgac gtgcatgcac gctcattg 28 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 3'-primer incorporating the Sal I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the chicken beta-actin promoter fragment lacking the intron <400> 28 acgcgtcgac aacgcagcga ctcccg 26 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5'-primer incorporating the Sal I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the antibody kappa light chain <400> 29 aatgtcgaca tggtgtccac ttctcagctc 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 3'-primer incorporating the Sal I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the antibody kappa light chain <400> 30 ttcgtcgacc taacactctc ccctgttgaa 30 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5'-primer incorporating the Sal I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the IRES fragment <400> 31 acgcgtcgac cgcccctctc cctccccc 28 <210> 32 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 3'-primer incorporating the Xho I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the IRES fragment <400> 32 ccgctcgaga ttatcatcgt gtttttcaaa ggaaaaccac gtc 43 <210> 33 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide acting as a sense chain in annealing to construct the coding fragment of the chicken lysozyme secretion signal <400> 33 ctagaccatg aggtctttgc taatcttggt gctttgcttc ctgcccctgg ctgctctggg 60 g 61 <210> 34 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide acting as an anti-sense chain in annealing to construct the coding fragment of the chicken lysozyme secretion signal <400> 34 ccccagagca gccaggggca ggaagcaaag caccaagatt agcaaagacc tcatggt 57 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5'-primer incorporating the Dra I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the scFv coding fragment <400> 35 gcgtttaaag tgacgttgga cgtccg 26 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 3'-primer incorporating the BamH I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the scFv coding fragment <400> 36 attaggatcc gcgcttaagg acggtcagg 29 <210> 37 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed sequence of a 5'-primer incorporating the BamH I recognition site at the 5' terminal used for PCR amplification of the coding fragment of the human antibody heavy chain gamma 1 Fc region <400> 37 attaggatcc gagcccaaat cttgtgacaa aactc 35

Claims (41)

  1. 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터에 의해 외래성 항체 유전자가 도입된 G0 트랜스제닉 키메라 조류로서, 도입 유전자에 유래하는 항체를, 혈 중, 난백 중 및 난황 중의 적어도 하나에 생성하는 것을 특징으로 하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  2. 제 1 항에 있어서, 항체의 정상 영역의 클래스가 인간 IgG 인 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  3. 제 1 항에 있어서, 항체의 정상 영역의 서브 클래스가 인간 IgG1 인 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  4. 제 1 항에 있어서, 항체의 정상 영역이 메추라기 IgG, 닭 IgG, 또는 마우스 IgG 인 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 유전자가 구성적인 프로모터에 의해 제어되어 있는 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  6. 제 5 항에 있어서, 구성적인 프로모터가 닭 β -액틴 프로모터인 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 몰로니·뮤린·루케미아·바이러스 유래 벡터인 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 VSV-G 슈도 타입인 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 조류가 닭 또는 메추라기인 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 키메라 항체인 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  11. 제 10 항에 있어서, 혈액 중에 항체를 0.5㎍/㎖ 이상 함유하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  12. 제 11 항에 있어서, 혈액 중에 항체를 5㎍/㎖ 이상 함유하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  13. 제 10 항에 있어서, 난백 중에 항체를 0.1㎍/㎖ 이상 함유하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  14. 제 13 항에 있어서, 난백 중에 항체를 1㎍/㎖ 이상 함유하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  15. 제 10 항에 있어서, 난황 중에 항체를 0.1㎍/㎖ 이상 함유하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  16. 제 15 항에 있어서, 난황 중에 항체를 1㎍/㎖ 이상 함유하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  17. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 scFv-Fc 항체인 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  18. 제 17 항에 있어서, 혈액 중에 항체를 20㎍/㎖ 이상 함유하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  19. 제 18 항에 있어서, 혈액 중에 항체를 2000㎍/㎖ 이상 함유하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  20. 제 17 항에 있어서, 난백 중에 항체를 5㎍/㎖ 이상 함유하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  21. 제 20 항에 있어서, 난백 중에 항체를 500㎍/㎖ 이상 함유하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  22. 제 17 항에 있어서, 난황 중에 항체를 5㎍/㎖ 이상 함유하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  23. 제 22 항에 있어서, 난황 중에 항체를 500㎍/㎖ 이상 함유하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 기재된 G0 트랜스제닉 키메라 조류를 제조하여, 상기 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 혈 중 및/또는 알 중에서 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는 항체의 생산법.
  25. 조류 수정란을 부란하고, 방란 직후의 배반엽기를 제외한 그 이후의 초기 배에 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터를 감염시켜, 그 배를 부화시키는 것으로 이루어지는 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법.
  26. 제 25 항에 있어서, 조류 수정란을 부란하고, 부란 개시로부터 24시간 이후의 초기 배에 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터를 감염시켜, 그 배를 부화시키는 것으로 이루어지는 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 조류 수정란을 부란하고, 그 초기 배에 형성되는 심장 내지는 혈관 내에 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터를 마이크로 인젝션하는 것을 특징으로 하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법.
  28. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 조류 수정란을 부란하고, 부란 개시로부터 24시간 이후의 초기 배에 형성되는 심장 내지는 혈관 내에 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터를 마이크로 인젝션하는 것을 특징으로 하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법.
  29. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 1× 107cfu/㎖ 이상의 타이터를 갖는 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터를 마이크로 인젝션하는 것을 특징으로 하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법.
  30. 제 29 항에 있어서, 1× 108cfu/㎖ 이상의 타이터를 갖는 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터를 마이크로 인젝션하는 것을 특징으로 하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법.
  31. 제 30 항에 있어서, 1× 109cfu/㎖ 이상의 타이터를 갖는 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터를 마이크로 인젝션하는 것을 특징으로 하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법.
  32. 제 25 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 몰로니·뮤린·루케미아·바이러스 유래 벡터인 것을 특징으로 하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법.
  33. 제 25 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 VSV-G 슈도 타입인 것을 특징으로 하는 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법.
  34. 제 25 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 조류가 닭 또는 메추라기인 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법.
  35. 제 25 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스에 유래하지 않은 유전자 서열이, 복제능 결실형 레트로바이러스 벡터에 삽입되는 도입 유전자에 함유되는 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법.
  36. 제 35 항에 있어서, 레트로바이러스에 유래하지 않은 유전자 서열은, 닭 β -액틴 프로모터에 의해 제어되어 있는 유전자 서열인 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법.
  37. 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서, 레트로바이러스에 유래하지 않은 유전자 서열은, 항체 유전자를 코딩하는 유전자 서열인 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법.
  38. 제 37 항에 있어서, 항체 유전자가 키메라 항체 유전자인 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법.
  39. 제 37 항에 있어서, 항체 유전자가 scFv-Fc 항체 유전자인 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법.
  40. 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서, 레트로바이러스에 유래하지 않은 유전자 서열은, 융합 단백 유전자를 코딩하는 유전자 서열인 G0 트랜스제닉 키메라 조류의 제조법.
  41. 제 25 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 G0 트랜스제닉 키메라 조류.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060191026A1 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Origen Therapeutics, Inc. Tissue specific expression of antibodies in chickens
JP5468719B2 (ja) * 2002-08-13 2014-04-09 株式会社カネカ レトロウイルスベクターによる遺伝子導入鳥類での遺伝子発現法およびそれによって得られる遺伝子導入烏類
ATE540580T1 (de) * 2004-01-08 2012-01-15 Kaneka Corp Verfahren zur herstellung eines transgenen vogels.
WO2006035687A1 (ja) * 2004-09-28 2006-04-06 Kaneka Corporation 遺伝子導入鳥類作製法
JP2006271266A (ja) * 2005-03-29 2006-10-12 Univ Nagoya 高発現および効率的遺伝子導入鳥類
US20090064351A1 (en) * 2005-03-30 2009-03-05 Kaneka Corporation Transgenic bird producing erythropoietin and method of constructing the same
EP1931698B1 (en) * 2005-10-05 2019-05-29 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Rapid production of high titer virus
KR101323563B1 (ko) * 2005-10-18 2013-10-29 니토 보세키 가부시기가이샤 항체를 생산하는 트랜스제닉 누에와 그의 제조방법
JPWO2008018562A1 (ja) * 2006-08-10 2010-01-07 株式会社カネカ 糖鎖修飾された抗体等有用タンパク質のトランスジェニックニワトリ卵黄への生産
EP2126071A4 (en) 2007-01-26 2010-12-08 Synageva Biopharma Corp TRANSGENEXPRESSION IN BIRDS
NZ585555A (en) * 2008-01-07 2012-08-31 Synageva Biopharma Corp Transgenic chicken containing a transgene comprising a glycosyltransferase coding sequence
JPWO2009142186A1 (ja) * 2008-05-20 2011-09-29 株式会社カネカ 細胞障害性組成物

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0424044A1 (en) * 1989-10-16 1991-04-24 Merck & Co. Inc. Transgenic fowl expressing bovine growth hormone
JPH0928235A (ja) * 1995-07-17 1997-02-04 Hoechst Japan Ltd 骨減少症モデルトランスジェニック動物
ES2357495T3 (es) * 1997-10-16 2011-04-27 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Aves transgénicas y producción de proteína.
US6936465B1 (en) * 1999-06-04 2005-08-30 Nippon Institute For Biological Science Plasmid vector comprising a retroviral integrase gene and an integrase recognition region
US20010044937A1 (en) * 1999-12-17 2001-11-22 Gerald Schatten Methods for producing transgenic animals
JP2002176880A (ja) * 2000-12-12 2002-06-25 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 効率的な遺伝子導入鳥類の作製法及びそれによって得られる遺伝子導入鳥類
US20020108132A1 (en) * 2001-02-02 2002-08-08 Avigenics Inc. Production of a monoclonal antibody by a transgenic chicken
EP1438401B1 (en) * 2001-09-18 2011-06-15 Synageva BioPharma Corp. Production of a transgenic avian by cytoplasmic injection
JP5468719B2 (ja) * 2002-08-13 2014-04-09 株式会社カネカ レトロウイルスベクターによる遺伝子導入鳥類での遺伝子発現法およびそれによって得られる遺伝子導入烏類
KR20070029103A (ko) * 2003-08-29 2007-03-13 카네카 코포레이션 렌티바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 조류 제조법 및그것에 의해 얻어지는 유전자 도입 조류

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