JPWO2008018562A1

JPWO2008018562A1 - 糖鎖修飾された抗体等有用タンパク質のトランスジェニックニワトリ卵黄への生産

Info

Publication number: JPWO2008018562A1
Application number: JP2008528887A
Authority: JP
Inventors: 信司飯島; 正道上平; 謙一西島; 敬山下
Original assignee: Nagoya University NUC; Kaneka Corp; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Current assignee: Nagoya University NUC; Kaneka Corp; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Priority date: 2006-08-10
Filing date: 2007-08-09
Publication date: 2010-01-07
Also published as: WO2008018562A1

Abstract

外来性タンパク質を生産するあらゆる方法がこれまで開示されてきたが、タンパク質によっては、修飾される糖鎖構造の違いから本来の効果が得られないことがあった。これを解消するために、ヒトの糖鎖構造と同等もしくは類似している糖鎖構造を有する外来性タンパク質を生産する方法が必要とされている。トランスジェニック鳥類特にニワトリの卵黄中に蓄積される外来性タンパク質は、ヒトの糖鎖構造と同等もしくは類似した糖鎖構造を有するため、これを用いると高い生理活性を持ったヒト医薬品タンパク質を大量に生産することが可能となる。

Description

本発明は、外来性融合タンパク質遺伝子が導入されたトランスジェニック鳥類またはその子孫由来の卵黄中に該外来性融合タンパク質を蓄積させ、それを分離することよりなる糖鎖付加融合タンパク質の生産方法に関する。さらに詳しくは、卵黄中に蓄積した該外来性融合タンパク質が、ヒトの糖鎖構造と同等もしくは類似している糖鎖構造を有することを特徴とする糖鎖付加融合タンパク質の生産方法に関する。

遺伝子組換え技術の発展により、数多くの生理活性タンパク質が工業生産され、医薬品などの用途に用いられるようになった。
一般に組換え技術を用いた有用タンパク質の多量生産には、大腸菌などの原核生物を利用する系、酵母などの真核生物を利用する系が知られており、ある種の単純な構造を持つタンパク質については成功を収めている。さらに、哺乳動物又は昆虫の培養細胞を利用する系が広く利用されている。しかしながら、これらには以下に述べるような問題点があることも知られている。

まず、大腸菌等の原核生物を用いた系では、多量体形成及び／又は糖鎖付加といった翻訳後修飾が正確に行われないという問題点が知られている。また、酵母を利用した系についても翻訳後修飾が不完全であり、生じたタンパク質が必ずしも本来の機能を有しない場合があることが指摘されている。真核生物の培養細胞を用いた系としては昆虫細胞を用いる系、哺乳動物の培養細胞を用いる系があるが、昆虫細胞においては付加される糖鎖の構造が他の生物種と大きく異なるという問題点があり、哺乳動物の培養細胞は、その維持管理に労力と多大な費用を必要とするにも関わらず外来性タンパク質の産生量に限界がある。

これらの問題を克服するために、動物工場が注目されてきた。遺伝子導入（トランスジェニック）動物を用いて目的タンパク質を生産する技術である。ヤギやヒツジやウシ等を用いたトランスジェニック哺乳類を作製し、その乳汁中に目的タンパク質を生産させる方法が試みられてきた。目的タンパク質にもよるが、抗体が乳汁中に１０ｍｇ／ｍｌ発現したという報告もある（非特許文献１参照）。しかし、この方法にも、牛海綿症脳症（ＢＳＥ）の問題や利用可能な哺乳類の個体が大きく生産、飼育、管理が大変であること、性成熟の期間がヤギやヒツジで８ヶ月、ウシでは１５ヶ月と長いこと等の問題がある。

そこで、トランスジェニック鳥類を用いて卵中に目的タンパク質を発現させる方法が検討されている。この方法は、卵の生産性の高さや、ＢＳＥ問題が存在しないこと、性成熟の期間がニワトリで５ヶ月と短いこと、個体が小さいため大量の個体の飼育が可能であること、人工授精法が確立しており大規模のトランスジェニック群を急速に育成可能であること、一般に卵の中が自然に無菌であること等の利点が挙げられる。

哺乳類の抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの５種類のクラスが存在することが明らかとなっているが、ヒトの各種疾患の診断、予防及び治療には、血中半減期が長く、各種エフェクター機能を有する等の機能特性からヒトＩｇＧクラスの抗体が主として利用されている。特に抗体のエフェクター機能である抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）や補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ活性）がＩｇＧ１サブクラスの抗体でもっとも高いことから（非特許文献２参照）、リツキサンやハーセプチンをはじめとするその効果発現に高いエフェクター機能を必要とする抗腫瘍ヒト化抗体のほとんどはヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体である。
一般に糖タンパク質を修飾する糖鎖は、生物種によってその糖鎖構造が異なるため、糖タンパク質の作用は種特異性があることが知られている。したがって、それぞれの種に最適な有用タンパク質を安価かつ大量に生産する方法の開発が望まれている。つまり、ヒトへの医薬品を産生するためにはその糖鎖構造がヒト型である必要がある。

シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸が最も多く、ついでＮ−グリコリルノイラミン酸が占めている。非特許文献３では、精製したヒトＩｇＧ及びニワトリＩｇＧの修飾糖鎖末端のシアル酸が他動物のＩｇＧとは違い、Ｎ−アセチルノイラミン酸のみで構成されていることが示されている。また、ニワトリＩｇＧにフコースが付加されていないため高いＡＤＣＣ活性を持つことが示唆されている。

一方で、ニワトリ卵白中に産生された外来性モノクローナル抗体の糖鎖構造にはシアル酸が含まれず、血中安定性が低いことが示されている（非特許文献４参照）。
また、無細胞系を用いて糖鎖を人工的に付加させる方法が開示されているが、大量に生産可能なトランスジェニック動物法とは全く異なるものである（特許文献１参照）。
さらに細胞を遺伝子変換して、ヒト糖鎖と同等な糖鎖を付加させる方法もある（非特許文献５参照）が、大量に生産可能なトランスジェニック動物法とは全く異なるものである。
特開２００２−２３８５９５号公報ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９Ｓｅｐ；１７（９）：３６７−７４ＣｈｅｍｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８，１９９７Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙｖｏｌ．１０ｎｏ．５ｐｐ４７７−４８６，２０００Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５Ｓｅｐ；２３（９）：１１５９−６９Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９９，３３８，５２９−５３８

外来性タンパク質を生産するあらゆる方法がこれまで開示されてきたが、タンパク質によっては、修飾される糖鎖構造の違いから本来の効果が得られないことがあった。
これを解消するために、ヒトの糖鎖構造と同等もしくは類似している糖鎖構造を有する外来性タンパク質を生産する方法が必要とされている。

生産する外来性タンパク質が高い生理活性を持ったヒト用医薬品タンパク質となるためには、糖鎖構造がヒトの糖鎖構造と同等もしくは類似している糖鎖を持たなければならない。
本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、トランスジェニック鳥類卵黄中に蓄積した外来性タンパク質が、ヒトの糖鎖構造と同等もしくは類似している糖鎖を有していることを見出した。
よって、本発明が提供するのは、以下のとおりである。
（１）外来性融合タンパク質遺伝子が導入されたトランスジェニック鳥類またはその子孫由来の卵黄中に該外来性融合タンパク質を蓄積させ、それを分離することを特徴とする糖鎖付加融合タンパク質の生産方法。
（２）外来性融合タンパク質が、ヒト免疫グロブリンの定常領域との融合タンパク質であることを特徴とする（１）記載の糖鎖付加融合タンパク質の生産方法。
（３）外来性融合タンパク質が、ＴＮＦレセプターとヒト免疫グロブリンの定常領域との融合タンパク質であることを特徴とする（１）記載の糖鎖付加融合タンパク質の生産方法。
（４）卵黄中に蓄積した外来性融合タンパク質を、プロテインカラムを用いて分離精製することを特徴とする（１）記載の糖鎖付加融合タンパク質の生産方法。
（５）（１）〜（４）のいずれか１項記載の方法によって得られる糖鎖付加融合タンパク質。
（６）糖鎖全体の５パーセント以上がモノシアル酸を有する糖鎖であることを特徴とする（５）記載の糖鎖付加融合タンパク質。

以下に本発明を詳細に述べる。
本発明の糖鎖付加融合タンパク質の生産方法は、外来性融合タンパク質遺伝子が導入されたトランスジェニック鳥類またはその子孫由来の卵黄中に産生される該外来性融合タンパク質が、ヒトの糖鎖構造と同等もしくは類似している糖鎖を有することを特徴とする。
本発明で用いられるトランスジェニック鳥類の作製法は、本発明者らによってすでに確立されているが（国際公開第０４／０１６０８１号パンフレット）、これに限定せず、ありとあらゆる公知の方法を用いることができる。

生殖細胞に外来性融合タンパク質遺伝子を保有するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を、野生型鳥類、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類又はその子孫と交配させ、孵化した雛を選別することによってＧ１トランスジェニック鳥類を得ることができる。Ｇ１トランスジェニック鳥類は血液、体細胞、精子もしくは卵由来のＤＮＡやＲＮＡをＰＣＲ法等によって調べることによって体細胞や生殖細胞への遺伝子導入の確認をすることができる。また、遺伝子導入した外来性融合タンパク質の発現からも判断できる。該タンパク質の発現はＥＬＩＳＡ法や電気泳動法、活性測定等によって調べることができる。

Ｇ２以降の世代のトランスジェニック鳥類は、Ｇ１トランスジェニック鳥類を交配させることによって作製される。交配型はＧ１トランスジェニックオスと野生型メス、Ｇ１トランスジェニックメスと野生型オス、Ｇ１トランスジェニックのオスとメス等が考えられ、さらに子孫とその親による戻し交配も可能である。なかでもＧ１オスと野生型メスの交配は、１羽のＧ１オスに対し、複数の野生型メスを交配させることができるため、効率の点から好ましい。

本発明で使用する鳥類としては、特に限定されないが、家畜として利用可能な家禽鳥類であることが好ましい。家禽鳥類としては、ニワトリ、七面鳥、カモ、ダチョウ、ウズラ、アヒル等を挙げることができる。なかでもニワトリは入手が容易で、産卵種としても多産であり、卵も大きく大量飼育法が確立しており、ワクチン等の生産でその安全性が証明されているため特に好ましい。

本発明の外来性融合タンパク質は、特に限定されず、例えばヒトモノクローナル抗体など遺伝子産業上有用な抗体、酵素、成長因子、サイトカイン等を融合させた融合タンパク質等が挙げられる。特に糖タンパク質でその活性に糖鎖が重要視されるタンパク質が好ましい。なかでも、ヒト免疫グロブリンの定常領域との融合タンパク質であるのが好ましく、ＴＮＦレセプターとヒト免疫グロブリンの定常領域との融合タンパク質であるＴＮＦＲ−Ｆｃであるのが特に好ましい。外来性融合タンパク質としてＴＮＦＲ−Ｆｃを用いた場合、卵白に生産される５０倍以上の目的タンパク質を卵黄中に蓄積させることができる。

また、外来性融合タンパク質としては、近年の遺伝子工学の発展により生産が可能となった遺伝子組換え抗体でも特にヒト化抗体、キメラ抗体が好ましいが、これに限定しない。ここで言うヒト化抗体とは、抗体の抗原認識に機能するアミノ酸配列領域以外をヒトが通常産生する抗体配列とした抗体を指す。ここで言うキメラ抗体とは、ある動物内で生産される抗体の一部を、異種の動物が産生する抗体の相当領域に置き換えた抗体を指す。置き換える領域としては特に限定しないが、血中安定性の観点から、ヒトが通常産生する抗体の定常領域であることが好ましい。本発明では、卵中の蓄積がよいことから、ヒトＩｇＧクラスの定常領域を持つ抗体の遺伝子で、特にヒトＩｇＧ１のサブクラスの定常領域を持つ抗体の遺伝子を用いたが、これに限定しない。ヒトＩｇＧ１のサブクラスの定常領域を持つ抗体としては、例えば抗ＣＤ２ヒトＩｇＧ抗体等が挙げられる。

医療用組換え抗体には、低分子抗体と称される一群がある。免疫グロブリンＩｇＧには直接抗原と結合する可変領域（Ｆｖ：Ｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれるＶＨ、ＶＬのヘテロ二量体からなるドメインがあり、このＦｖドメインはＩｇＧの約５分の１の分子量でありながら、単独で十分な抗原結合能を持つ。ＶＨ、ＶＬドメイン間を人工的にペプチドリンカーで結合したものが１本鎖抗体（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎＦｖ）と呼ばれる低分子抗体で、ＶＨ、ＶＬ単独よりも安定性が向上することが知られていた。

Ｐｏｗｅｒｓら（Ｐｏｗｅｒｓ，Ｄ．Ｂら（２０００）ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄ．２５１，１２３）は、このｓｃＦｖにヒトＩｇＧ１に由来するＦｃ部を融合させることで、血中での安定性が増すことを見出した。このｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体は医療用として有用と考えられるが、安価な大量生産システムである大腸菌では生産されない。
上記ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体も、本発明の生産方法で得られる外来性融合タンパク質として好ましいものである。

Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類作製時に、上記外来性融合タンパク質遺伝子を導入すれば、生理活性が糖鎖修飾の有無、糖鎖修飾の種類により決まるタンパク質の生理活性をより高められ、生産が困難だった抗体医薬品やタンパク質を安価に大量に生産できる。
本発明の卵黄中に蓄積する糖鎖付加融合タンパク質は、それが有する糖鎖構造に特徴を持つ。糖鎖で修飾された糖タンパク質をヒトへの医薬品とする場合、その糖鎖構造がヒトの糖鎖構造と同等もしくは類似していない場合、効果の減少及び／又は消失が起こり、さらにはアレルギー等の投薬副作用の原因にもなりかねない。
すなわち、当該タンパク質がヒトの糖鎖構造と同等もしくは類似している糖鎖構造を持つことにより、医薬品で問題となる血中安定性を高めることや、シグナル的作用を強調して標的細胞あるいは標的臓器への取り込みを促進させること、また、本来付与された生理活性を増大させること、さらには新たな生理活性の付与なども期待することができる。

糖タンパク質糖鎖の体内における挙動に最も関与しているのは、糖鎖非還元末端（糖タンパク質に結合していない末端）のシアル酸であり、このシアル酸が除去されたアシアロ糖タンパク質は肝臓に認識されて取り込まれ、血中から速やかに消失することがＡｓｈｗｅｌｌ，Ｍｏｒｅｌｌら（Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｄ．，４１，９９，１９７４）によってすでに報告されている。医薬品の体内における薬効は一般に有効血中濃度を維持することが重要であるため、従来のこの知見からの応用は、糖タンパク質のアシアロ化を防いで肝臓での取り込みを制御し、体内循環における半減期を延長させようとする試みであった。

本発明者らは、本発明のトランスジェニック鳥類またはその子孫由来の卵中に産生される外来性融合タンパク質で、特に卵黄中に産生される外来性融合タンパク質がシアル酸を含む糖鎖で修飾されていることを見出した。また、ニワトリＩｇＧに付加される糖鎖のシアル酸は、ヒトの糖鎖と同様にＮ−アセチルノイラミン酸のみで構成されていることがすでに報告されている（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙｖｏｌ．１０ｎｏ．５ｐｐ４７７−４８６，２０００）ことと、卵黄中に蓄積する外来性融合タンパク質は、トランスジェニック鳥類の全組織で発現したタンパク質が、血流にのって卵黄へ移行したものであることから、全組織のいずれかにはヒトの糖鎖修飾と同等の修飾をする糖修飾酵素が存在し、そのため糖鎖構造がヒトと同等もしくは類似していると推測できる。

本発明者らは、さらにタンパク質の種類によっては、卵黄中に積極的に蓄積するものがあることを見出した。例えば、融合タンパク質ＴＮＦＲ−Ｆｃの場合、卵白中の抗体含有量が１μｇ／ｍｌ以下もしくは０．１μｇ／ｍｌ以下なのに対し、卵黄中の抗体含有量は０．１μｇ／ｍｌ以上、若しくは１μｇ／ｍｌ以上である。本発明ではＴＮＦＲ−Ｆｃに関して測定を行ったが、他タンパク質でも積極的に卵黄中に蓄積するものがあることは容易に推測できる。

Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類は遺伝子導入後、２１日で孵化する。該メス雛は約５ヶ月で性成熟をし、一日に約１個産卵する。また、Ｇ１以降のトランスジェニック鳥類に関しても同様で、孵化後約５ヶ月後に一日一個の卵を産卵するようになる。

これより、本発明で見出された卵黄中に蓄積する外来性融合タンパク質を精製、調製することで、血中安定性が高く、高い生理活性を持った医薬品タンパク質を安定に大量生産することが可能となる。
卵黄中に蓄積した外来性融合タンパク質は、プロテインカラムを用いて分離精製することが好ましい。本発明により卵黄中に蓄積された融合タンパク質は、例えばＦｃの特性を利用したプロテインＡやプロテインＧによるアフィニティー精製が可能である。他、Ｆｃの特性を利用したあらゆる公知の手法により卵黄から精製回収することが可能である。また融合タンパク質をプロテアーゼ処理することにより、目的タンパク質およびＦｃに分離または分離回収することも可能である。

上記の糖鎖付加融合タンパク質の生産方法によって得られる糖鎖付加融合タンパク質もまた、本発明のひとつである。
本発明の糖鎖付加融合タンパク質は、糖鎖全体の５パーセント以上がモノシアル酸を有する糖鎖であることが好ましい。より好ましいモノシアル酸の割合は５〜２０パーセント、更に好ましくは５〜１０パーセントである。

本発明によれば、ヒトの糖鎖構造と同等もしくは類似している糖鎖構造を有する外来性融合タンパク質が提供される。その結果として、高い生理活性を有するヒト用医薬品タンパク質を大量に生産することが可能となる。本発明では卵黄中に蓄積した外来性融合タンパク質を利用できるため、本発明は利点が高い。

本発明の実施例を以下に示すが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
（実施例１）ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体発現Ｇ０トランスジェニックキメラニワトリの作製
本発明者らはすでにｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体発現ベクターコンストラクトの作製法、ウイルスベクター調製法、Ｇ０トランスジェニックキメラニワトリ作製法を開示している（国際公開第２００４／０１６０８１号パンフレット）。本発明はこれにしたがって一連の操作を行い、Ｇ０トランスジェニックキメラニワトリを作製した。

（実施例２）ｐＭＳＣＶ／Ｇ△ＡＴＮＦＲ−Ｆｃレトロウイルスベクターの構築
ＴＮＦＲ−Ｆｃを発現するトランスジェニックニワトリ作製用のウイルスベクターコンストラクトを以下のように作製した。
ＴＮＦＲの遺伝子領域は、市販ベタター、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｌｏｎｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＩＤ：５１８１０７０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を購入し、下記のプライマーにてＰＣＲ増幅した。下線は制限酵素ＸｈｏＩおよび制限酵素ＳｃａＩである。５’−ＡＡＴＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＧＴＣＧＣ−３’（配列番号１）
５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＴＡＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＧＧＧＧＧＧ−３’（配列番号２）
ヒト免疫グロブリン遺伝子の定常領域ｈＣγ１領域の取得方法はＨｏｔｔａらによる文献に詳細に記載されており（Ｊｏｕｒｎａ１ｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＶｏｌ．９８（２００４），Ｎｏ．４，ｐ．２９８−３０３）、これを鋳型として下記プライマーにて増幅した。下線は制限酵素ＳｃａＩおよび制限酵素ＢａｍＨＩおよび制限酵素ＣｌａＩである。
５’−ＡＡＡＡＧＴＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣ−３’（配列番号３）
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧ−３’（配列番号４）
上記ＰＣＲで増幅したＴＮＦＲ遺伝子断片を制限酵素ＸｈｏＩおよびＳｃａＩで消化し、同様にＰＣＲで増幅したｈＣγ１遺伝子を制限酵素ＳｃａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＥＴＢｌｕｅ−２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＢａｍＨＩとＸｈｏＩサイトに３断片のライゲーションにより組み込んだ。このベクターをｐＥＴ／ＴＮＦＲ−Ｆｃとした。
このｐＥＴ／ＴＮＦＲ−Ｆｃを制限酵素ＸｈｏＩおよびＣｌａＩで消化し、Ｈｏｔｔａらの文献（Ｊｏｕｒｎａ１ｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＶｏｌ．９８（２００４），Ｎｏ．４，ｐ．２９８−３０３）に記載のｐＭＳＣＶ／Ｇ△Ａの制限酵素ＳａｌＴおよび制限酵素ＣｌａＩサイトにライゲーションすることによって、ｐＭＳＣＶ／Ｇ△ＡＴＮＦＲ−Ｆｃベクターを構築した。

（実施例３）ＴＮＦＲ−Ｆｃを発現するトランスジェニックニワトリの作製
ＴＮＦＲ−Ｆｃを発現するトランスジェニックニワトリの作製は、実施例２に記載のウイルスベクターを基に、国際公開第２００４／０１６０８１号パンフレット記載の方法によりパッケージング細胞株を樹立した。このパッケージング細胞を基に、国際公開第２００４／０１６０８１号パンフレットに準じてＴＮＦＲ−Ｆｃを発現するトランスジェニックニワトリを作製した。

（実施例４）卵中のＴＮＦＲ−Ｆｃ濃度測定用サンプルの調製
実施例３により誕生したＧ０トランスジェニックキメラニワトリを性成熟させ、産卵した卵を回収した（個体識別番号：＃０３１４、＃０５１３、＃０６０８、＃０７０９、＃０７１１、＃０７１２）。＃０３１４に関しては産卵した翌日より７日目まで採卵を行い、卵中のＴＮＦＲ−Ｆｃ濃度を定量した。
また、＃０５１３、＃０６０８、＃０７０９、＃０７１１、＃０７１２に関しては産卵初日に採卵し、卵中のＴＮＦＲ−Ｆｃ濃度を定量した。卵黄は５０％（Ｗ／Ｖ）、卵白は１０％（Ｖ／Ｖ）となるようにＰＢＳを用いて希釈し、凍結保存して測定用サンプルとした。

（実施例５）ＥＬＩＳＡ法による卵中ＴＮＦＲ−Ｆｃの定量
ＰＢＳで希釈した抗ヒトＩｇＧ抗体（コスモバイオ社製）をＥＬＩＳＡプレートに１００μｇ／ｗｅｌｌ入れて４℃で一晩静置した。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を２００μｌで各ｗｅｌｌを３回洗浄した後、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液−２％スキムミルクを１５０μｌ／ｗｅｌｌ入れた。
室温で２時間静置後、ｗｅｌｌを２００μｌのＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で３回洗浄し、実施例４で調製した卵黄、卵白サンプルを１２０μｌ入れ、４℃で一晩静置した。このＥＬＩＳＡプレートを室温に戻した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０溶液で３回各ｗｅｌｌを洗浄し、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で希釈したＰｅｒｏｘｉｄｅ（ＰＯＤ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体（コスモバイオ社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ入れて室温で１時間静置した。

ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液でｗｅｌｌを４回洗浄し、発色液（１０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン（片山化学工業製）を１ｍｌのメタノールに溶解し、蒸留水で１００ｍｌとしたものに１０μｌの過酸化水素水（和光純薬工業製）を加えて調製した）１００μｌをｗｅｌｌに加えた。８Ｍ硫酸を５０μｌ添加して反応を止め、４９０ｎｍの蛍光強度をプレートリーダーで測定して、標準検量線から濃度を計算した。調製した１サンプルにつき３ｗｅｌｌ行い、平均したものを結果とした。
標準検量線は精製したＴＮＦＲ−Ｆｃを用いて作製した。
実施例２で作製したＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質ベクターコンストラクトをリポフェクション法によりＧＰ２９３細胞に導入し、その培養上清を４℃、１０分間、３０００ｒｐｍで遠心して、固形物を除去した。この上清を冷却しながら攪拌し、５０％飽和となるよう細かく砕いた硫酸アンモニウムを徐々に加え（３１３ｇ硫酸アンモニウム／１０００ｍｌ水）、タンパク質を沈殿させた。これを４℃で一晩静置した後、４℃で１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心して沈殿を完全に沈降させ、少量のＰＢＳで溶解した。２ＬのＰＢＳで３回透析して硫酸アンモニウムを除去した。

精製用のプロテインＧカラム（日本ガイシ社製）の初期洗浄をＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（ＮａＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ１．５６ｇ／ｌ、ＮａＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ７．１６ｇ／ｌ）１０ｍＬ、ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ（酢酸２０％、蒸留水８０％）１０ｍｌ、ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ１０ｍｌの順で行った（流速２ｍｌ／分）。ＰＢＳに溶解したタンパク液を１ｍｌ／分で流し、ＴＮＦＲ−Ｆｃをカラムに吸着させた。ＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ２０ｍｌを１．７ｍｌ／分で流して不要なタンパクを除去し、ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（グリシン７．５０７ｇ／ｌ、２ＮＨＣｌにてｐＨ２．５〜３．０に調製）を１．５ｍｌ／分で流してＴＮＦＲ−Ｆｃを溶出した。
溶出分画をＰＢＳ（２Ｌ）で３回透析し、精製ＴＮＦＲ−Ｆｃとし、波長２８０ｎｍの吸光度よりタンパク濃度を定量した。

＃０３１４の定量結果を図１に、＃０５１３、＃０６０８、＃０７０９、＃０７１１、＃０７１２の定量結果を図２に示す。図１より採卵日により若干のぶれはあるものの、卵白中に比べ卵黄中に多く蓄積していることが分かる。また、図２より卵黄中への蓄積は遺伝子導入したニワトリ個体によるものではないことが分かる。

（実施例６）卵黄中に蓄積したｓｃＦｖ−Ｆｃの糖鎖解析用のサンプルの調製
実施例１により誕生したＧ０トランスジェニックキメラニワトリを性成熟させ、産卵した卵を回収した。３羽の卵より卵黄を１５ｍｌ回収した。これにＰＢＳを６０ｍｌ加え、４℃、１０分間、１５０００ｒｐｍで遠心し、上清を回収した。この過程を４回繰り返した。これにｒＰｒｏｔｅｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（商品名、アマシャム社製）を１ｍｌ加え、４℃で２時間撹拌した。その後、４℃、５分間、１５０００ｒｐｍで遠心し、上清を除き、ＰＢＳで５回洗浄した。これをＦＩＳＨＥＲｂｒａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇｃｏｌｕｍｎ（商品名、フィッシャー・ヘルスケア社製）に添加し、ＰＢＳ２０ｍｌで洗浄し、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）で溶出し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和し、１０ｍＭ酢酸アンモニウムで透析し、糖鎖解析用のサンプルとした。

（実施例７）卵黄中に蓄積したｓｃＦｖ−Ｆｃの糖鎖解析
実施例６で調製したサンプルを糖鎖解析した。
サンプル２．０ｍｇを１０ｍｍｏｌ／ｌ炭酸水素アンモニウム２Ｌに対して一晩透析した。これをヒドラジン分解用試験管６本に採取し、凍結乾燥した。その後ヒドラクラブＳ−２０４（生化学工業社製）内にセットし、減圧下５０℃で１２時間乾燥した。無水ヒドラジン２ｍｌを減圧下で注入し、１００℃で２時間ヒドラジン分解を行った。２時間後、減圧下でヒドラジンを留去した。室温に戻し、ヒドラジン分解用試験管を取り出した。
ヒドラジン分解後の各試験管に酢酸アンモニウム緩衝液２００μｌを加えて攪拌した。これにトリメチルピリジン１０μｌを加えて攪拌した。さらに無水酢酸１０μｌを加えて攪拌した。すべて室温で２０分間反応させて、その後遠心エバポレーターで乾固した。
精製用のセルロースカートリッジ（タカラバイオ社製）の初期平衡を行った。
セルロースカートリッジを精製水１０ｍｌで３回洗浄した。これをセルロースカートリッジ用溶媒２（５０ｖｏｌ％エタノール）１０ｍｌで洗浄した。さらに、セルロースカートリッジ用溶媒１（６７ｖｏｌ％ブタノール／１７ｖｏｌ％エタノール）１０ｍｌで平衡化した。

これに上記の乾固したサンプル６本分をまとめて４００μｌの精製水で溶解し、１００００ｒｐｍ、２分で遠心後、上清にエタノール０．４ｍｌと１−ブタノール１．６ｍｌを加えて攪拌した。これを平衡化したカートリッジに注入した。その後カートリッジをセルロースカートリッジ用溶媒１（６７ｖｏｌ％ブタノール／１７ｖｏｌ％エタノール）１０ｍｌで洗浄し、セルロースカートリッジ用溶媒２（５０ｖｏｌ％エタノール）２ｍｌで溶出し、溶出液をリアクションチューブ５本に分注し、遠心エバポレーターで乾固した。
ひとまず、カップリング試料を調製した。
２−アミノピリジン（ＰＡＬＳＴＡＴＩＯＮＰｙｒｉｄｙｌａｍｉｎａｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ糖鎖分析用、タカラバイオ社製）のバイヤル１本（３００ｍｇ）に酢酸１００μｌを加え、オーブン中で加熱溶解した。

次に、還元試料を調製した。
Ｂｏｒａｎｅ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｃｏｍｐｌｅｘ（ＰＡＬＳＴＡＴＩＯＮＰｙｒｉｄｙｌａｍｉｎａｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔＫｉｔ糖鎖分析用、タカラバイオ社製）２５．５ｍｇを秤量し、酢酸１２８μｌを加えて溶解した。
先ほど、遠心エバポレーターで乾固した各チューブに調製したカップリング試薬２０μｌを加えて攪拌した。これを９０℃のオーブンに挿入し、６０分間反応させた。これに還元試薬２０μｌを加えて攪拌した。これを８０℃のオーブンに挿入し、６０分間反応させた。
上記５本に試料をまとめてゲルろ過を実施し、ピリジンアミノ化糖鎖を精製した。以下に条件を示す。
カラム：ＴＳＫｇｅｌトヨパールＨＷ−４０Ｆ１．５ｃｍ×５０ｃｍ（東ソー社製）
溶出溶媒：１０ｍｍｏｌ／ｌ炭酸水素アンモニウム
フラクション：約４ｍｌ／チューブ計５０本
各画分について吸光度（２９０ｎｍ）を測定した。
推定ピリジンアミノ化オリゴ糖画分より２００μｌずつ分取し、減圧乾固後、２μｌの精製水に溶解した。これをＴＬＣにプロットし、風乾後、２ｗ／ｖ％オルシノール／硫酸を噴霧、１００℃で発光させ、ピリジンアミノ化糖鎖の溶出位置を確認した。その後、ピリジンアミノ化オリゴ糖画分を減圧乾固し、精製水５００μｌに溶解した。
その後、ＨＰＬＣ（イオン交換）で分析し、シアル酸の有無を確認した。分析条件を以下に示す。なお、糖鎖標準品についても同様に分析し、溶出位置を比較した。また、分析に先立ち、精製水１０μｌを注入してグラジエント分析し、ゴーストピークのないことを確認した。標準品はタカラバイオ社製のＰＡ−ＳｕｇａｒＣｈａｉｎ００１、０２１、０２３、０２４、０１２、０１３、０１４、０１５およびＰＡ−ＧｌｕｃｏｓｅＯｌｉｇｏｍｅｒ（ＤＰ＝３−２２）を用いた。
装置：ＬＣ−１０Ａｖｐシステム（島津製作所社製）
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌＤＥＡＥ−５ＰＷ７．５ｃｍ×７．５ｍｍＩ．Ｄ．（東ソー社製）
カラム温度：室温
移動相：
（１）１０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ９．０
（２）５００ｍｍｏｌ／ｌ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ８．０
グラジエント：（１）／（２）＝１００：０．ｖ／ｖ０分→１００：０５分→７０：３０３０分
移動相流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
試料注入量：１０μｌ
検出波長：Ｅｘ．３１０ｎｍ、Ｅｍ．３８０ｎｍ
ＨＰＬＣ（イオン交換）分析を行った結果より、アシアロ糖鎖が主成分ではあったが、モノシアロ糖鎖（６．７％）も検出された。これより、卵黄中に産生されるｓｃＦｖ−Ｆｃの糖鎖にはシアル酸が付加されていることが分かった。この結果を図３に示す。

（実施例８）卵黄中に蓄積した抗ＣＤ２ヒトＩｇＧ抗体の糖鎖解析
本発明者らはすでに抗ＣＤ２ヒトＩｇＧ抗体発現ベクターコンストラクトの作製法、ウイルスベクター調製法、Ｇ０トランスジェニックキメラニワトリの作製法を開示している（国際公開第２００４／０１６０８１号パンフレット）。本発明はこれにしたがって一連の操作を行い、Ｇ０トランスジェニックキメラニワトリを作製した。
卵黄中に蓄積した抗ＣＤ２ヒトＩｇＧ抗体の糖鎖解析用のサンプルの調製は、実施例６に準じて行った。また卵黄中に蓄積した抗ＣＤ２ヒトＩｇＧ抗体の糖鎖解析は、実施例７に準じて行った。
ＨＰＬＣ（イオン交換）分析を行った結果より、アシアロ糖鎖が主成分ではあったが、モノシアロ糖鎖（６．０％）が検出された。これより、卵黄中に産生される抗ＣＤ２ヒトＩｇＧ抗体の糖鎖にはシアル酸が付加されていることが分かった。

実施例５で測定したＴＮＦＲ−Ｆｃベクターコンストラクトを遺伝子導入したＧ０トランスジェニックキメラニワトリ１羽の卵中のＴＮＦＲ−Ｆｃ蓄積量を示す。産卵日によらず卵白中よりも卵黄中での蓄積量が多いことが分かる。実施例５で測定したＴＮＦＲ−Ｆｃベクターコンストラクトを遺伝子導入したＧ０トランスジェニックキメラニワトリ５羽の卵中のＴＮＦＲ−Ｆｃ蓄積量を示す。個体によらず卵白中よりも卵黄中での蓄積量が多いことが分かる。実施例７で行った卵黄中に蓄積したｓｃＦｖ−Ｆｃの糖鎖解析の結果を示す。糖鎖非還元末端のシアル酸が除去されたアシアロ糖鎖が主成分ではあったが、微量のモノシアロ糖鎖（６．７％）が検出された。これより、卵黄中に産生されるｓｃＦｖ−Ｆｃの糖鎖にはシアル酸が付加されていることが分かった。

Claims

外来性融合タンパク質遺伝子が導入されたトランスジェニック鳥類またはその子孫由来の卵黄中に該外来性融合タンパク質を蓄積させ、それを分離することを特徴とする糖鎖付加融合タンパク質の生産方法。
外来性融合タンパク質が、ヒト免疫グロブリンの定常領域との融合タンパク質であることを特徴とする請求項１記載の糖鎖付加融合タンパク質の生産方法。
外来性融合タンパク質が、ＴＮＦレセプターとヒト免疫グロブリンの定常領域との融合タンパク質であることを特徴とする請求項１記載の糖鎖付加融合タンパク質の生産方法。
卵黄中に蓄積した外来性融合タンパク質を、プロテインカラムを用いて分離精製することを特徴とする請求項１記載の糖鎖付加融合タンパク質の生産方法。
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法によって得られる糖鎖付加融合タンパク質。
糖鎖全体の５パーセント以上がモノシアル酸を有する糖鎖であることを特徴とする請求項５記載の糖鎖付加融合タンパク質。