JP2018515073A - Ｆｃ融合タンパク質のトランスジェニック産生 - Google Patents

Abstract

１つの態様において、本開示は、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質の産生のための方法、細胞、及びトランスジェニック非ヒト哺乳動物、並びに、それら方法、細胞及びトランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られた１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。

Description

関連出願の相互参照

本出願は、参照することによってその全てが本願に援用される、２０１５年５月４日出願の米国仮特許出願第６２／１５６，８７９号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下での利益を主張する。

本開示は、Ｆｃドメインに融合したポリペプチドを含む融合タンパク質のトランスジェニック産生（transgenic production）の分野に関する。

Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ（「Ｆｃ」）ドメインは、細胞表面のＦｃ受容体に結合する免疫グロブリンの領域に該当する。Ｆｃドメインは、多くの様々なタンパク質に融合されている。Ｆｃ融合タンパク質を含む多様な製品がＦＤＡの認可を受けている（例えば、Ｎｕｌｏｊｉｘ（ベラタセプト）、Ｅｙｌｅａ（アフリベルセプト）、Ａｒｃａｌｙｓｔ（リロナセプト）、ＮＰｌａｔｅ（ロミプロスチム）、Ｏｒｅｎｃｉａ（アバタセプト）、Ａｍｅｖｉｖｅ（アレファセプト）、及びＥｎｂｒｅｌ（エタネルセプト）；非特許文献１において総説されている。

Czajkowsky et al. (2012) EMBO Mol. Med. 4:1015-1028

Ｆｃドメイン融合ポリペプチドをトランスジェニック技術により発現させ、それによってトランスジェニック産生されるポリペプチドの半減期を増加させる方法をこの中に記載する。１つの態様において、本開示は、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質の産生及び使用の方法に関する。

有意なこととして、この中に提供する方法は、その発現が動物の発生に有害となり得るタンパク質を含む、タンパク質のトランスジェニック動物における効率的な産生を可能にする。ある態様において、この中に記載される方法は、Ｆｃドメインとの融合体として多量体タンパク質（multimeric protein）の１つ以上の構成成分を発現させることにより、多量体タンパク質の改善されたトランスジェニック発現を可能にする。そのような方法の多量体タンパク質への適用は、半減期の増大及びタンパク質フォールディングの改善につながり得る。

本発明の態様は、乳腺において、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現するように改変されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供し、更にそのトランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳腺により産生された乳から融合タンパク質を採取することを含む方法に関する。ある実施形態において、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。ある実施形態では、Ｆｃドメインの配列は配列番号１を含む。

ある実施形態において、融合タンパク質は、２つ以上のサブユニットを含み、そのサブユニットは同じトランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生される。他の実施形態では、融合タンパク質は、２つ以上のサブユニットを含み、そのサブユニットは異なるトランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生される。ある実施形態において、サブユニットは、異なるトランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生された後、組み合わされる(combined)。ある実施形態では、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ウシ亜科の動物（bovine）、ブタ類の動物(porcine)、ヤギ亜科の動物(caprine)、ヒツジ属の動物(ovine)、又は齧歯動物である。ある実施形態において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物はヤギである。他の実施形態では、トランスジェニック非ヒト哺乳動物はウサギである。

ある実施形態において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、その哺乳動物において産生される融合タンパク質が、シアリルトランスフェラーゼを発現しないトランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生されるその融合タンパク質と比較して、増大したシアリル化を有するように、シアリルトランスフェラーゼを組換え的に発現するように操作されている。ある実施形態では、融合タンパク質は、ポリペプチドとＦｃドメインとの間にリンカー領域を含む。

本発明の更なる態様は、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、かつ更に乳を含む、組成物を提供する。ある実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体を含む。

本発明の更なる態様は、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現するように改変されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。ある実施形態では、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、シアリルトランスフェラーゼを発現するように改変されている。ある実施形態において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ウシ亜科の動物、ブタ類の動物、ヤギ亜科の動物、ヒツジ属の動物、又は齧歯動物である。ある実施形態では、トランスジェニック非ヒト哺乳動物はヤギである。他の実施形態では、トランスジェニック非ヒト哺乳動物はウサギである。

本発明の更なる態様は、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含むトランスジェニック産生された融合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む方法に関する。ある実施形態において、対象はヒト又は非ヒト哺乳動物である。

発明の限定のそれぞれは、本発明の様々な実施形態を包含し得る。従って、任意の１つの要素又は要素の組合せを含む発明の限定のそれぞれは、本発明の各態様に含まれ得る。この発明は、その適用において、以下の説明に記載され又は図面に例示されている構成の詳細及び構成要素の配列に限定されない。本発明は、他の実施形態も可能であり、様々な様式で実行又は実施できる。

添付の図面は、正確な縮尺率とすることを意図していない。図面は、単に例示的なものであり、本開示の実施可能性に要求されない。明確性のために、全ての構成要素が全ての図面において表示されているわけではない。

図１Ａ〜１Ｄは、融合構成物の略図、並びにｅＣＧ−Ｆｃ融合タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列を示す。図１Ａ及び１Ｂはそれぞれ、ｅＣＧαサブユニット−Ｆｃ融合体、及びｅＣＧβサブユニット−Ｆｃ融合体を示す。 図１−１の続き。図１Ｃは、ｅＣＧαサブユニット−Ｆｃ融合体（配列番号３及び４）に相当する配列を示す。 図１−２の続き。図１Ｄは、ｅＣＧβサブユニット−Ｆｃ融合体（配列番号５及び６）に相当する配列を示す。 抗Ｆｃ一次抗体を用いて２９３細胞におけるｅＣＧ−Ｆｃ融合タンパク質の一過性発現を検出する代表的なウェスタンブロットを示す。 抗Ｆｃ一次抗体を用いてトランスジェニックマウスの乳中でのｅＣＧ−Ｆｃ融合タンパクの発現を検出する代表的なウェスタンブロットを示す。各マウスの遺伝子型は、α／−、−／β、又はα／βで表される。 図３と同じ代表的な膜であるが、トランスジェニックマウスの乳中の指示タンパク質の産生を明示するポンソーＳで染色した膜を示す。マウスの遺伝子型は、α／−、−／β、又はα／βで表される。 図５Ａ及び５Ｂは、トランスジェニックマウスの乳中でのｅＣＧ−Ｆｃ融合タンパクの発現を示す。図５Ａは、ポンソーＳで染色した代表的な膜を示し、図５Ｂは、抗Ｆｃ一次抗体を用いてウェスタンブロットした同じ膜を示す。マウスの遺伝子型は、α／−、−／β、又はα／βで表され、マウスの世代は、Ｆ０、Ｆ１、又はＦ２で指示されている 図６Ａ〜６Ｃは、抗Ｆｃ一次抗体及び抗ｅＣＧ一次抗体の両方で検出されたｅＣＧ−Ｆｃ融合タンパクを示す。図６Ａは、抗Ｆｃ一次抗体を用いた代表的なウェスタンブロットを表わす。図６Ｂは、図４Ａと同じ膜であるが、抗ｅＣＧ一次抗体を用いて検出した膜を表わす。図６Ｃは、抗Ｆｃ一次抗体及び抗ｅＣＧ一次抗体の両方を用いて検出した膜のオーバーレイを表わす。マウスの遺伝子型は、α／−、−／β、又はα／βで表される。 図７Ａ及び７Ｂは、トランスジェニックマウスの乳中でのｅＣＧ及びｅＣＧ−Ｆｃ融合タンパクの相対的発現レベルを示す。図７Ａは、抗Ｆｃ一次抗体を用いた代表的なウェスタンブロットを表わし、図７Ｂは、抗ｅＣＧ一次抗体を用いた同じ試料のウェスタンブロットを表わす。試料を、非還元（ＮＲ）及び還元（Ｒ）条件下で評価した。ＢＭＥ＝還元試料（αとβを切り離す）；ＮＲ＝非還元試料（αとβを切り離さない）。 図８は、非限定的な実施形態における、トランスジェニックマウスの乳中でのｅＣＧ−Ｆｃ融合タンパクの発現に関連する表現型を表わす。

Ｆｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質の産生のための方法、細胞及びトランスジェニック哺乳動物をこの中に開示する。驚くべきことに、ポリペプチドをＦｃドメインに融合させると、トランスジェニック産生されたポリペプチドの半減期の増大及びタンパク質フォールディングの改善をもたらすことが明らかにされた。本発明に関連する方法及び組成物は、トランスジェニック産生されたタンパク質の安定性及び半減期の増大を可能にする。

有意なこととして、この中に提供される方法及び組成物は、その発現が動物の発生に有害となり得るタンパク質をその動物においてトランスジェニック発現させることに関連する技術における以前の課題に対処する。特に、この中に記載される方法は、タンパク質の発現が動物の発生に有害な影響を有することが予測される場合に、動物の乳腺においてそのタンパク質をトランスジェニック産生させることに関連する課題に対処する。ある例示において、多量体タンパク質のトランスジェニック発現は、動物の発生に有害となり得る。この中に記載される方法を用いて、Ｆｃドメインとの融合体として多量体タンパク質の１つ以上の成分を発現させることにより、多量体タンパク質を、動物の乳腺において効率的にトランスジェニック産生させることができる。この中に記載されているある実施形態では、多量体タンパク質の異なる成分を、異なる動物においてトランスジェニック発現させる。

この発明は、その適用において、以下の説明に記載され又は図面に例示されている構成の詳細及び構成要素の配列に限定されない。本発明は、他の実施形態も可能であり、様々な様式で実行又は実施できる。また、この中で用いられている表現及び用語は、説明の目的のためであり、限定としてみなされるべきではない。「含める(including)」、「含む(comprising)」、又は「有する(having)」、「含有する(conaining)」、「伴う（involving）」、並びにこの中でのその変形の使用は、その後に列挙される項目及びその同等物、並びに追加の項目を包含することが意味される。

Ｆｃ融合体
本発明の態様は、Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ（「Ｆｃ」）ドメインに融合した１つ以上のポリペプチドを発現させることに関する。この中で用いられている「Ｆｃドメイン」は、細胞表面のＦｃ受容体と相互作用する免疫グロブリン分子の部分を意味する。Ｆｃドメインは、１つ以上の重鎖定常ドメイン（ＣＨ）を含み得る。ある実施形態では、Ｆｃドメインは、２つの重鎖定常ドメインを含む。ある実施形態において、Ｆｃドメインは、重鎖定常ドメインＣＨ２及びＣＨ３を含む。任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ）及び任意のサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）の免疫グロブリンに由来するＦｃドメインは、本発明の態様に適合することができる。ある実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。ある実施形態では、Ｆｃドメインは、米国特許第７、８６７、４９１号に開示されかつそれを参照することにより組み込まれるような、ハイブリッドＦｃドメインである。

生物活性タンパク質へのＦｃドメインの融合は、当業界で知られている（例えば、米国特許第８，４３１，１３２号；米国特許第７，８６７，４９１号；Czajkowsky et al. (2012) EMBO Mol Med 4:1015-1028；Beck et al. (2011) MAbs 3:415-416；Low et al. (2005) Humen Reproduction 20(7):1805-1813；Ashkenazi et al. (1993) Int. Rev. Immunol. 10:219-227；Chamow et al. (1996) Trends Biotechnol. 14:52-60；Kim et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:2429-2434を参照）。Ｆｃドメインは、例えば、適した起源からのＰＣＲ増幅のような、通常の技術により得ることができる。Ｆｃドメインは天然のものでも又は合成のものでもよい。ある実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒト、霊長類、ウシ亜科の動物、ブタ類の動物、ヤギ亜科の動物，ヒツジ属の動物、齧歯動物、又はイヌ科の哺乳動物に由来する。より具体的には、Ｆｃドメインは、限定はされないが、ヒト又は他の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、雌牛(cow)、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス又はラットを含む、哺乳動物源に由来する。

ある実施形態において、ヒトに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、ヒトに由来する。他の実施形態では、ヒトに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非ヒト源に由来する。ある実施形態において、霊長類に投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、霊長類に由来する。他の実施形態では、霊長類に投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非霊長類源に由来する。ある実施形態において、ウシ亜科の動物に投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、ウシ亜科の動物に由来する。他の実施形態では、ウシ亜科の動物に投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非ウシ亜科の動物源に由来する。ある実施形態において、ブタ類の動物に投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、ブタ類の動物に由来する。他の実施形態では、ブタ類の動物に投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非ブタ類の動物源に由来する。ある実施形態において、ヤギ亜科の動物に投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、ヤギ亜科の動物に由来する。他の実施形態では、ヤギ亜科の動物に投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非ヤギ亜科の動物源に由来する。ある実施形態において、ヒツジ属の動物に投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、ヒツジ属の動物に由来する。他の実施形態では、ヒツジ属の動物に投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非ヒツジ属の動物源に由来する。ある実施形態において、齧歯動物に投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、齧歯動物に由来する。他の実施形態では、齧歯動物に投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非齧歯動物源に由来する。ある実施形態において、イヌに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、イヌに由来する。他の実施形態では、イヌに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非イヌ源に由来する。ある実施形態において、ネコに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、ネコに由来する。他の実施形態では、ネコに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非ネコ源に由来する。ある実施形態において、ウマに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、ウマに由来する。他の実施形態では、ウマに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非ウマ源に由来する。ある実施形態において、雌牛に投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、雌牛に由来する。他の実施形態では、雌牛に投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非雌牛源に由来する。ある実施形態において、ブタに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、ブタに由来する。他の実施形態では、ブタに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非ブタ源に由来する。ある実施形態において、ヒツジに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、ヒツジに由来する。他の実施形態では、ヒツジに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非ヒツジ源に由来する。ある実施形態において、ヤギに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、ヤギに由来する。他の実施形態では、ヤギに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非ヤギ源に由来する。ある実施形態において、ウサギに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、ウサギに由来する。他の実施形態では、ウサギに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非ウサギ源に由来する。ある実施形態において、マウスに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、マウスに由来する。他の実施形態では、マウスに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非マウス源に由来する。ある実施形態において、ラットに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、ラットに由来する。他の実施形態では、ラットに投与されるＦｃ融合タンパク質内のＦｃドメインは、非ラット源に由来する。

ある実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号１の配列を含む。ある実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号１の配列からなる。ある実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号１に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。

Ｆｃドメインのアミノ酸配列の非限定的な例は、配列番号１に示される：
ＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

Ｆｃドメインの核酸配列の非限定的な例は、配列番号２に示される：
ＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＴＣＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡ

ある実施形態において、Ｆｃドメインをコードする核酸は、配列番号２を含む。ある実施形態では、Ｆｃドメインをコードする核酸は、配列番号２からなる。ある実施形態において、Ｆｃドメインをコードする核酸配列は、配列番号２に対して、少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。

Ｆｃドメインはポリペプチドに共有結合してよい。ある実施形態において、ポリペプチドは、Ｆｃドメインに直接結合している。例えば、ポリペプチドは、Ｆｃドメインのフレキシブルなヒンジ領域に結合することができる。当業者に理解されるように、Ｆｃドメインにポリペプチドを接続させるリンカー領域を含めてもよい。リンカー配列の例は、配列番号７：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；に提供される。

ある態様において、この中に提供される方法は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物における多量体タンパク質の産生に有利となり得る。この中で用いられている「多量体タンパク質」は、組み合わさって単一タンパク質を形成することができる、２つ以上の独立した非共有結合したサブユニット又はポリペプチドから構成されるタンパク質を意味する。ある実施形態では、多量体タンパク質の各サブユニットがＦｃドメインに融合する。ある実施形態においては、多量体タンパク質の少なくとも１つのサブユニットがＦｃドメインに融合する。ある実施形態では、多量体タンパク質の各サブユニットがトランスジェニック非ヒト哺乳動物で産生され、それぞれのトランスジェニック哺乳動物から各サブユニットを採取した後に、それらを組み合わせる。多量体タンパク質の１つ以上のサブユニットを同じトランスジェニック動物で産生させても又は異なるトランスジェニック動物において産生させてもよい。

本発明に関連するＦｃドメインは、Ｆｃフラグメントの重鎖（Ａｓｎ２９７）におけるＦｃγグリコシル化部位に１つ以上のＮ−グリカンを含み得る。様々なグリコシル化パターンがＦｃγグリコシル化部位で生じ得る。この部位でみられるオリゴ糖として、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）、マンノース、シアル酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ又はＮＡＮＡ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）、及びフコースが挙げられる。Ｆｃγグリコシル化部位でみられるＮ−グリカンは通常、抗体のアスパラギンに結合する最初のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、その最初のＧｌｃＮＡｃに結合する２番目のＧｌｃＮＡｃ、及びその２番目のＧｌｃＮＡｃに結合する最初のマンノースの非分枝鎖からなる共通のコア構造を有する。２つの追加のマンノースが、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−マンノース鎖の最初のマンノースに結合してコア構造を完成し、更なるグリコシル化のための２つの「アーム」を提供する。更に、フコース残基がＮ−結合した最初のＧｌｃＮＡｃに結合し得る。

本発明の態様は、Ｆｃドメインへの１つ以上のポリペプチドの融合に関する。Ｆｃドメインは、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端の何れかで融合することができる。ある実施形態において、ＦｃドメインはポリペプチドのＣ末端に融合する。ある実施形態では、多量体タンパク質の２つ以上のサブユニットがそれぞれ、Ｆｃドメインに融合する。Ｆｃドメイン融合ポリペプチドは、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において産生され得る。Ｆｃドメインに融合した、ポリペプチド又は多量体タンパク質のサブユニットを含む、複数のポリペプチドを、同じトランスジェニック哺乳動物の乳腺において産生させるか、或いは、異なるトランスジェニック哺乳動物の乳腺において産生させ、それぞれのトランスジェニック哺乳動物から各サブユニットを採取した後、それらを組み合わせることができる。

この中に記載されている方法、細胞及び組成物は、Ｆｃドメインに融合させる任意のポリペプチドに適合できることを理解すべきである。

トランスジェニック動物からの精製
１つの態様において、Ｆｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物から精製される。ある実施形態において、Ｆｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳中に分泌される。ある実施形態において、多量体タンパク質の２つ以上のサブユニットがそれぞれ、Ｆｃドメインに融合する。ある実施形態では、Ｆｃドメインに融合したサブユニットは、同じ又は異なるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳中に分泌される。Ｆｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、Ｆｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質が実質的に純粋になるように、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳から精製することができる。ある実施形態において、Ｆｃドメインに融合した多量体タンパク質の各サブユニットは、Ｆｃドメインに融合した各サブユニットが実質的に純粋になるように、同じ又は異なるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳から精製することができる。そのような実施形態において、Ｆｃドメインに融合したサブユニットを、その後に組み合わせてよい。ある実施形態では、実質的に純粋とは、混在物(contaminants)を実質的に含まないことを含める。

１つの態様において、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現するように改変された乳腺上皮細胞から精製される。Ｆｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、Ｆｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質が実質的に純粋になるように乳腺上皮細胞から精製することができる。ある実施形態では、各Ｆｃドメイン融合サブユニットが実質的に純粋になるように、Ｆｃドメインに融合した多量体タンパク質の各サブユニットを、同じ又は異なる乳腺上皮細胞から精製することができる。ある実施形態では、実質的に純粋とは、混在物を実質的に含まないことを含める。

トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳から又は乳腺上皮細胞から採取されたＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、当業界で知られている任意の適した手段を用いて精製することができる。ある実施形態において、Ｆｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、カラムクロマトグラフィを用いて精製される。カラムクロマトグラフィは、当業界でよく知られている（例えば、一般的なクロマトグラフィ法に関して、Current Protocols in Essential Laboratory Techniques Unit 6.2 (2008)を参照)。ある実施形態では、Ｆｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、プロテインＧ／Ａアフィニティクロマトグラフィ(例えば、Carter (2011) Exp Cell Res 317:1261-1269を参照)を用いて精製される。ある実施形態において、Ｆｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、免疫沈降(例えば、Current Protocols in Cell Biology Unit 7.2 (2001)を参照)により精製される。ある実施形態では、Ｆｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、ポリペプチドを特異的に認識する抗体又はその断片、或いはＦｃドメインを特異的に認識する抗体又はその断片を用いて、精製される。

融合タンパク質を発現するトランスジェニック動物を作製するための構築物
ある実施形態において、核移植によりトランスジェニックヤギを作製するのに使用するための構築物（例えば、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする）を含む初代細胞株を作製するために、その構築物を、初代ヤギ皮膚上皮細胞にトランスフェクトすることができ、それはクローン拡大され、さらに、導入遺伝子コピー数、導入遺伝子の構造的完全性、及び染色体への組み込み部位を評価するために十分に特徴付けられる。本明細書で使用される場合、「核移植」はドナー細胞からの核を除核卵母細胞に移植するクローニング法を意味する。

関心タンパク質（例えば、Ｆｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質）のコード配列は、ＮＣＢＩ、Ｇｅｎｂａｎｋなどの配列データベースから得られた、選択動物由来のゲノム材料又は逆翻訳メッセンジャーＲＮＡ(reverse-translated messenger RNA)のライブラリーをスクリーニングすることによって、或いは、そのポリペプチドの配列を得ることによってなど、任意の適切な供給源から得ることができる。配列を適当なプラスミドベクター中にクローン化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）のような適した宿主生物中で増幅させることができる。ベクターの増幅後、ＤＮＡ構築物を切り出し、ベクターの残部から精製し、トランスジェニック動物を作製するのに使用できる発現ベクターに導入することができる。トランスジェニック動物は、そのゲノム中に一体化された所望のトランスジェニックタンパク質を有するであろう。

また、ベクターの増幅後、ＤＮＡ構築物を、適切な５’及び３’制御配列と共に切り出し、ベクター残部から精製し、所望の発現構築物をそのゲノム中に取り込んだトランスジェニック動物を作製するのに使用することができる。逆に、酵母人工染色体（ＹＡＣ）のようなあるベクターを用いると、組み立てた構築物（assembled construct）をベクターから除去する必要がなく、そのような場合には、増幅させたベクターを、トランスジェニック動物の作製に直接使用することができる。コード配列をトランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳中に発現させることを可能にする制御配列に、コード配列を作動的に連結させることができる。

Ｆｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質の産生をトランスジェニック動物の乳に方向付けるのに適したＤＮＡ配列は、天然由来の乳タンパク質に由来する５’−プロモータ領域を担持し得る。従って、このプロモータは、ホルモン及び組織特異的因子の制御下にあり、乳汁分泌乳房組織において最も活性が高い。ある実施形態では、プロモータは、ヤギβ−カゼインプロモータである。このプロモータを、トランスジェニックタンパク質の乳腺上皮を越えて乳中への分泌を導くタンパク質リーダー配列の産生を導くＤＮＡ配列に、作動的に連結させることができる。ある実施形態では、天然に分泌される乳タンパク質に由来し得る３’−配列を、ｍＲＮＡの安定性を高めるために付加することができる。

本明細書で使用されるとき、「リーダー配列」又は「シグナル配列」は、タンパク質分泌シグナルをコードする核酸配列であり、トランスジェニックタンパク質をコードする下流の核酸分子に作動的に連結すると、分泌を導く。リーダー配列は、天然のヒトリーダー配列、又は人工的に生成されたリーダー配列でよく、或いは、導入遺伝子コード配列の転写を導くのに使用されるプロモータと同じ遺伝子から得られたもの、又は哺乳動物の乳腺上皮細胞などのような、細胞から普通に分泌される別のタンパク質から得たものであってもよい。

ある実施形態において、プロモータは、乳特異的プロモータである。本明細書で使用されるとき、「乳特異的プロモータ」は、タンパク質を乳中に分泌する細胞（例えば、乳腺上皮細胞など）における遺伝子の発現を天然に導くプロモータであり、例えば、カゼインプロモータ、例えば、α−カゼインプロモータ（例えば、アルファＳ−１カゼインプロモータ、アルファＳ２カゼインプロモータなど）、β−カゼインプロモータ（例えば、ヤギβ−カゼイン遺伝子プロモータ（DiTullio, BioTechnology 10:74-77, 1992）、γ−カゼインプロモータ、κ−カゼインプロモータ、ホエー酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモータ（Gordon et al., BioTechnology 5: 1183-1187, 1987）、β−ラクトグロブリンプロモータ（Clark et al., BioTechnology 7: 487-492, 1989）、及びα−ラクトグロブリンプロモータ（Soulier et al., FEBS Letts. 297:13, 1992）などが挙げられる。この定義にはまた、例えばマウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモータのような、乳房組織で特異的に活性化されるプロモータも含まれる。

本明細書で使用されるとき、コード配列及び調節配列は、調節配列の影響下又は制御下でコード配列を発現又は転写するようにそれらが共有結合している場合、「作動的に連結している」という。コード配列が機能性タンパク質に翻訳されるように、コード配列は調節配列に作動的に連結される。５’調節配列におけるプロモータの誘導がコード配列の転写をもたらし、かつ２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさないか、（２）コード配列の転写を導くプロモータ領域の機能を妨げないか、又は（３）タンパク質に翻訳される対応するＲＮＡ転写機能を妨げない場合、その２つのＤＮＡ配列は作動的に連結しているという。従って、プロモータ領域が、得られる転写物が所望のタンパク質又はポリペプチドに翻訳され得るように、そのＤＮＡ配列の転写を達成することができる場合、そのプロモータ領域はコード配列に作動的に連結している。

本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、異なる遺伝子環境間における輸送のため、又は宿主細胞における発現のために、制限及びライゲーションによって、その中に所望の配列が挿入され得る多数の核酸のいずれであってもよい。ＲＮＡベクターも使用できるが、通常、ベクターはＤＮＡで構成される。ベクターとしては、プラスミド及びファージミドが挙げられるが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞で複製できるものであり、１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によって更に特徴づけられ、その制限部位においてベクターが特定可能な態様で切断され、新しい組換えベクターが宿主細胞で複製する能力を保持するようにその部位に所望のＤＮＡ配列が連結され得る。プラスミドの場合、プラスミドは宿主細菌内でコピー数が増加するので、所望の配列の複製が何回も起こるか、或いは、宿主が有糸分裂で生殖するので、一宿主につき１回のみ起こり得る。ファージの場合、複製は溶菌相の過程で能動的に、又は溶原相の過程で受動的に起こり得る。発現ベクターは、その中に、所望のＤＮＡ配列を、調節配列に作動的に連結されるように、制限及びライゲーションによって挿入することができ、ＲＮＡ転写物として発現させることができるものである。ベクターは、そのベクターで形質転換又はトランスフェクトされた又はされていない細胞の同定に使用するのに適した１つ以上のマーカー配列を更に含んでいてよい。マーカーとしては、例えば、抗生物質又は他の化合物に対する耐性又は感受性を増大又は減少させるタンパク質をコードする遺伝子、当業界で知られている標準アッセイによって活性を検出できる酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、又はアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、及び形質転換又はトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニー又はプラークの表現型に目に見えて影響する遺伝子が挙げられる。好ましいベクターは、自己複製が可能で、かつそれらが作動的に連結しているＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子産物を発現できるものである。

融合タンパク質の産生のための乳腺上皮細胞及びトランスジェニック動物
１つの態様において、本開示は、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する乳腺上皮細胞を提供する。ある実施形態では、本開示は、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する乳腺上皮細胞を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する
１つの態様において、本開示は、（ａ）１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする導入遺伝子ＤＮＡ構築物で非ヒト哺乳動物細胞をトランスフェクトし；（ｂ）前記導入遺伝子ＤＮＡ構築物が細胞のゲノム中に挿入された細胞を選択し；更に、（ｃ）最初の核移植手順を実施して、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質に関してヘテロ接合性であり、かつその乳中に１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現できる非ヒトトランスジェニック哺乳動物を作製する；工程を含む、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質の産生のための方法を提供する。

１つの態様において、本開示は、（ａ）１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現するように操作された非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する；（ｂ）非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳中に１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現させる；及び（ｃ）乳中に産生された１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を単離する；方法を提供する。

トランスジェニック動物は、当業界で知られている方法に従い作製することができる（例えば、米国特許第５，９４５，５７７号を参照）。トランスジェニック発現に適した動物としては、ヤギ、ヒツジ、バイソン、ラクダ、雌牛、ウサギ、ブタ、ウマ、ラット又はラマが挙げられるが、これらに限定されない。また、好適な動物として、ウシ亜科の動物、ヤギ亜科の動物、ブタ類の動物、齧歯動物、及びヒツジ属の動物が挙げられ、それらはそれぞれ、雌牛、ヤギ、ブタ、ラット及びヒツジの様々な種に関連する。好適な動物としては、有蹄動物も挙げられる。本明細書で使用されるとき、「有蹄動物」は、通常、草食性で四肢の有蹄哺乳動物であるか又はそれに関連し、限定はされないが、例えば、ヒツジ、ヤギ、畜牛(cattle)及びウマが挙げられる。１つの実施形態では、動物は、別個の構築物で初代細胞をコトランスフェクトすることにより作製される。これら細胞は次に核移植に用いられる。或いは、マイクロインジェクションを用いてトランスジェニック動物を作製する場合、構築物が注入される。

クローニングは、それぞれ１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質又は他の関心遺伝子構築物を産生することができる、多様なトランスジェニック動物をもたらすであろう。生産方法は、クローン動物及びそれら動物の子孫の使用を含む。ある実施形態では、クローン動物は、ヤギ亜科の動物又はウシ亜科の動物である。クローニングは、胎仔の核移植、核移植、組織及び臓器移植、並びにキメラ子孫の作出も包含する。

クローニングプロセスの１つの工程は、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含む細胞のゲノムを脱核卵母細胞に移植することを含む。本明細書で使用されるとき、「導入遺伝子」は、技術により細胞又はその原細胞に挿入され、その細胞から発生する動物のゲノムの一部になる核酸分子の任意の断片を意味する。そのような導入遺伝子は、トランスジェニック動物に対して、部分的に又は全体的に外生的な（すなわち、外来の）遺伝子を含むか、或いは、その動物の内在性遺伝子に同一性を有する遺伝子を表わし得る。

卵母細胞に好適な哺乳動物源としては、ヤギ、ヒツジ、雌牛、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、非ヒト霊長類などが挙げられる。卵母細胞は有蹄動物から得ることが好ましく、ヤギ又は雌牛から得ることが最も好ましい。卵母細胞を単離する方法は、当業界でよく知られている。本質的に、そのプロセスは、例えばヤギのような哺乳動物の卵巣又は生殖器官から卵母細胞を単離することを含む。容易に入手可能な有蹄動物の卵母細胞源は、ホルモン誘発した雌動物からのものである。遺伝子工学、核移植及びクローニングなどの技術を上手く使用するには、卵母細胞を、それら細胞が核移植のレシピエント細胞として使用される前で、かつそれらが精子細胞によって受精されて胚になる前に、生体内で十分に成熟させることが好ましい。生体内で成熟した減数第二分裂中期の卵母細胞は、核移植技術でうまく使用されている。本質的に、減数第二分裂中期の成熟卵母細胞は、発情開始後又はヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）又は類似のホルモンの注射後、数時間の過排卵処置していない又は過排卵処置した動物から外科的に採取される。

乳腺で発現される組換えタンパク質の量及び質を予測するのに使用される手段の１つは、乳汁分泌の誘導による（Ebert KM, 1994）。誘導された乳汁分泌は、妊娠により生ずる最初の自然の乳汁分泌（これは少なくとも１年後になるであろう）からよりむしろ、トランスジェニック生成の初期の段階からのタンパク質の発現及び分析を可能にする。乳汁分泌の誘導は、ホルモン又は手によりなされ得る。

ある実施形態において、この中に提供される方法により産生される融合タンパク質の組成物は、乳を更に含む。ある実施形態では、この中に提供される方法は、トランスジェニック動物の乳から融合タンパク質を単離する工程を含む（例えば、Pollock et al., Journal of Immunological Methods, Volume 231, Issues 1-2, 10 December 1999, Pages 147-157を参照）。

従って、１つの態様において、本開示は、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を産生する乳腺上皮細胞及びトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。本発明の態様に従う乳腺上皮細胞及びトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を発現する。

融合タンパク質の産生
１つの態様において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物又は乳腺上皮細胞において、本明細書に記載されているように産生された１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、他の方法により産生される同じ融合タンパク質と比較して、変化した特性を有する。例えば、本明細書に記載されるように産生された融合タンパク質は、他の方法により産生された融合タンパク質と比較して、増大した半減期及び／又は安定性を示すことができる。また、本明細書に記載されるように産生された融合タンパク質は、他の方法により産生された融合タンパク質と比較して、低減された免疫原性を示すことができる。

１つの態様において、本開示は、組換え又はトランスジェニック産生された、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質、並びにそのようなタンパク質を含む組成物を提供し、融合タンパク質はグリコシル化及び／又はシアリル化を示す。例えば、この中に記載される方法により産生された融合タンパク質は、他の組換え方法を含む他の方法により産生された同じ融合タンパク質に匹敵する又はより高いレベルのグリコシル化及び／又はシアリル化を示すことができる。

例えば、ある実施形態において、非ヒト哺乳動物の乳腺上皮細胞において産生された１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、乳腺上皮細胞で産生されたものではない同じ融合タンパク質と比較した場合に、高められたレベルのグリコシル化及び／又はシアリル化を有し得る。ある実施形態では、乳腺上皮細胞で産生されたものではない融合タンパク質は、細胞培養で産生される。この中で用いられるとき、乳腺上皮細胞において産生された融合タンパク質と比較される場合、「細胞培養において産生された」の語は、乳腺上皮細胞を除く標準的な産生細胞株（例えばＣＨＯ細胞又はバキュロウイルス−Ｓｆ９細胞）において産生された融合タンパク質を指す。

ある実施形態において、上記の方法は、乳汁分泌を誘導するための工程を更に含む。更に他の実施形態では、その方法は、追加の単離及び／又は精製工程を更に含む。更に他の実施形態では、その方法は、例えば非乳腺細胞培養のような細胞培養において産生された融合タンパク質のグリコシル化パターンを比較するための工程を更に含む。更なる実施形態では、その方法は、非乳腺上皮細胞によって産生された融合タンパク質と、得られた融合タンパク質のグリコシル化パターンを比較するためのステップを更に含む。そのような細胞は、細胞培養物の細胞であってよい。融合タンパク質のグリコシル化パターンを評価するための実験技術は、当業者に知られている。そのような方法として、例えば、液体クロマトグラフィ質量分析、タンデム質量分析、及びウェスタンブロット分析が挙げられる。

１つの態様において、この中に開示されている１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物又は乳腺上皮細胞において１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を産生させることにより生成される。ある実施形態では、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質のシアリル化レベルを増加させることは有利となり得る。１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質のシアリル化レベルは、例えば、融合タンパク質をシアリルトランスフェラーゼにさらすことにより増加させることができる。１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を、インビボ又はインビトロでシアリルトランスフェラーゼにさらすことができる。融合タンパク質をシアリルトランスフェラーゼ及び適切な糖類ベースの基質にさらすことによってインビトロにおいて１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質をシアリル化することができる。乳腺又は乳腺上皮細胞においてシアリルトランスフェラーゼを産生させることによってインビボにおいて１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質をシアリル化することができる。

１つの態様において、本開示は、α−２，６−シアリル化のレベルが増加した１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質のトランスジェニック動物の乳腺における及び乳腺上皮細胞における産生のための方法を提供する。ある実施形態では、シアリル化の増加を示す融合タンパク質は、高められた抗炎症特性を示し得る。

１つの態様において、本開示は、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質の乳腺における産生のために遺伝子導入され、更に、シアリルトランスフェラーゼの産生のためにも遺伝子導入されたトランスジェニック動物（及び乳腺上皮細胞）を提供する。そのような動物及び細胞によって産生される１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、末端のα−２，６−シアル酸連結のレベルが増加していることが期待される。ある実施形態において、トランスジェニック動物（及び乳腺上皮細胞）は、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質の乳腺における産生のために遺伝子導入され、及びシアリルトランスフェラーゼの産生のためにも遺伝子導入されている。

１つの態様において、本開示は、末端のα−２，６−シアル酸結合のレベルが増加している１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を対象に投与することを含む、対象を治療する方法を提供する。

ある実施形態において、本明細書において提供されるように産生されたトランスジェニック動物の乳から又はそのトランスジェニック動物の子孫から、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を採取することにより、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を得ることができる。ある実施形態では、トランスジェニック哺乳動物により産生された１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を、産生される乳の１リットル当たり少なくとも１グラムのレベルで、好ましくは、産生される乳の１リットル当たり少なくとも２、３、４グラム、更に好ましくは産生される乳の１リットル当たり少なくとも５グラムのレベルで産生される。

例えば、ある実施形態では、本明細書に記載される方法は、１リットル当たり少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０グラムの産生を可能にする。

組成物
ある態様において、本開示は、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質、及び薬学的に許容されるビヒクル、希釈剤又は担体を含む、医薬組成物を包含する組成物を提供する。ある実施形態において、組成物は乳を含む。

ある実施形態では、提供される組成物は、インビボにおける適用のために使用される。インビボでの意図される投与様式に依存して、使用される組成物は、例えば錠剤、丸剤、粉剤、カプセル、ゲル、軟膏、液剤、懸濁剤などの、固体、半固体、又は液体の剤形であってよい。好ましくは、組成物は、正確な用量の１回の投与に適した単位剤形で投与される。組成物はまた、所望される製剤に依存して、動物又はヒトへの投与のための医薬組成物を製剤するのに一般に使用される水性ビヒクルとして定義される、薬学的に許容される担体又は希釈剤を含んでいてもよい。希釈剤は、対象のヒト組換えタンパク質の生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液である。同様の希釈剤を、対象の凍結乾燥組換えタンパク質を再構成するのに使用してもよい。更に、医薬組成物はまた、他の薬剤、医薬品、担体、アジュバント、無毒の、非治療用の、非免疫原性の安定剤などを含んでいてもよい。そのような希釈剤又は担体の有効量は、成分の溶解性、生物学的活性などの点から、薬学的に許容される製剤を得るのに有効な量である。ある実施形態では、本明細書において提供される組成物は滅菌されている。

インビボでの処置の間の投与は、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、眼、膣、及び直腸を含む任意の数の経路によるものであってよい。包内（intracapsular）、静脈内、及び腹腔内投与経路も使用できる。当業者は、投与経路が、所望の応答に依存して変動することを認識する。例えば、本明細書における組成物は、経口、非経口、又は局所投与を介して対象に投与することができる。一実施形態では、本明細書における組成物は、静脈内注入によって投与される。

組成物は、それらを全身的に送達することが望ましい場合、注射による、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与用に製剤してよい。注射用の製剤は、添加される保存剤と共に、単位剤形で、例えばアンプル中に、又は複数回用量の容器中に提供してもよい。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁剤、水剤、又は乳剤のような形態を取ってもよく、懸濁化剤、安定化剤、及び／又は分散剤などのような調合剤を含有してもよい。

非経口投与用の医薬製剤は、水溶性の形態をした活性組成物の水剤を含む。更に、活性組成物の懸濁剤は、適切な油性注射懸濁剤として調製してもよい。適した親油性溶媒又はビヒクルは、ゴマ油などのような脂肪油、又はオレイン酸エチル若しくはトリグリセリドなどのような合成脂肪酸エステル、又はリポソームを含む。水性注射懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなどのような懸濁剤の粘性を増加させる物質を含有してもよい。任意選択で、懸濁剤はまた、高濃縮溶液の調製を可能にするために、組成物の溶解性を増加させる適切な安定剤又は物質も含有してよい。或いは、活性組成物は、使用前に、例えば滅菌発熱物質不含水のような適切なビヒクルで構成するように、粉末形態であってもよい。

経口投与については、医薬組成物は、結合剤（例えばアルファ化とうもろこしデンプン、ポリビニルピロリドン、若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えばラクトース、結晶セルロース、若しくはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、若しくはシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプン若しくはデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手段によって調製される、例えば、錠剤又はカプセルのような形態を取ってもよい。錠剤は、当技術分野においてよく知られている方法によってコーティングしてもよい。経口投与用の液体調製物は、例えば水剤、シロップ、若しくは懸濁剤の形態を取ってよく、或いは、それらは、使用前に水若しくは他の適切なビヒクルを用いて構成するように、乾燥製品として提供されてもよい。そのような液体調製物は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体、又は硬化食用脂）；乳化剤（例えばレシチン又はアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、又は分留された植物油）；及び保存剤（例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル若しくはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル又はソルビン酸）などのような、薬学的に許容される添加剤を用いて、従来の手段によって調製することができる。調製物はまた、緩衝塩、香味剤、着色剤、及び甘味剤を適宜含有してもよい。

成分は、経口送達が有効となるように化学的に修飾してもよい。通常、考慮される化学修飾は、少なくとも１つの分子の付加であり、その分子は、（ａ）タンパク質分解の阻害、及び（ｂ）胃又は腸から血液循環への取込みを可能にする。全体的な安定性の増加及び体内での循環時間の増加もまた所望される。そのような分子の例として、ポリエチレングリコール、エチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、並びにポリプロリンが挙げられる（Abuchowski and Davis, 1981, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, pp. 367-383；Newmark, et al., 1982, J. Appl. Biochem. 4:185-189）。使用できるであろう他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−トリオキソカンである。ポリエチレングリコール分子は、上記に指摘するように、医薬用途にとって好ましい。経口組成物については、放出の場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸、若しくは回腸）、又は大腸であろう。当業者は、胃において溶解しないが、十二指腸又は他の腸において物質を放出させるであろう入手可能な製剤を有する。好ましくは、放出は、生物学的活性物質の保護によって、又は腸におけるような、胃環境を過ぎてからの生物学的活性物質の放出によって、胃環境の悪影響を回避するであろう。口腔内投与については、組成物は、従来のやり方で製剤された錠剤又はロゼンジの形態を取ってよい。

組成物はまた、例えば、カカオバター又は他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含有する、坐剤又は保持浣腸剤などのような直腸又は膣用の組成物に製剤されてもよい。

医薬組成物はまた、適切な固相又はゲル相担体又は賦形剤を含んでいてもよい。そのような担体又は賦形剤の例として、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、並びにポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。

適切な液体又は固体の医薬調製物の形態は、例えば、吸入用の水溶液若しくは生理食塩水溶液、マイクロカプセル封入、渦巻型化（encochleated）、顕微鏡的金微粒子への被覆、リポソームへの封入、噴霧、エアロゾル、皮膚内移植ペレット、又は皮膚切創用鋭利物面での乾燥がある。また、医薬用組成物としては、顆粒剤、粉剤、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、クリーム、滴剤、若しくは活性組成物の持続放出を有する調製物が挙げられ、これらの製剤では、通例、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、香味剤、甘味剤、又は可溶化剤などの賦形剤及び添加剤及び／又は補助物質が前述のように用いられる。こうした医薬用組成物は、種々の薬物送達システムでの使用に好適である。薬物送達の方法についての簡単な総説については、参照により本明細書に組み込まれるLanger, Science 249:1527-1533, 1990を参照。

治療薬は、それ自体で（そのままで(neat)）又は薬学的に許容される塩の形態で投与してもよい。医薬で使用される場合、塩は、薬学的に許容できるものであるべきであるが、薬学的に許容できない塩は、その薬学的に許容できる塩を調製するのに好都合に使用してもよい。そのような塩として、以下の酸から調製されるものが挙げられるが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタリン−２−スルホン酸、及びベンゼンスルホン酸。また、そのような塩は、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩、又はカルシウム塩のような、アルカリ金属塩又はアルカリ土類塩として調製することができる。

適切な緩衝剤として、酢酸及び塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸及び塩（１〜３％ｗ／ｖ）；硼酸及び塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；並びにリン酸及び塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）が挙げられる。適切な保存剤として、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）、及びチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。

本開示の医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に含まれる、１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質の有効量、並びに任意選択で治療剤を含有する。薬学的に許容される担体という用語は、ヒト又は他の脊椎動物への投与に適した、１つ以上の適合する固体又は液体増量剤、希釈剤、又はカプセル化物質を意味する。担体という用語は、適用を容易にするために活性成分と組み合わせられる天然の又は合成の有機又は無機成分を表わす。医薬組成物の構成成分はまた、所望の薬学的な効率を実質的に害する相互作用がないように、本開示の組成物と、及び互いに、混ぜることができる。

融合タンパク質を含む治療剤は、ある実施形態において、粒子で提供してもよい。この中で使用される粒子は、全体的に若しくは部分的に治療剤からなることができる又は他の更なる治療剤を含むことができるナノ粒子若しくは微粒子（又はある場合には、より大きい）を意味する。粒子は、治療剤に加えて、侵食性、非浸食性、生分解性、若しくは非生物分解性物質又はその組合せを含むがこれらに限定されない、薬学及び医学の分野でごく普通に使用されるそれら物質のいずれを含んでいてもよい。粒子は、溶液中に又は半固体状態で治療剤を含有するマイクロカプセルであってもよい。粒子は、事実上任意の形状をしていてよい。

本明細書において他に定義されない限り、本開示に関して使用される科学用語及び専門用語は、当業者らによって一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によってそうでないことが要求されない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含むものとする。本開示の方法及び技術は、当技術分野においてよく知られている従来の方法に従って一般的に実行される。概して、この中に記載される生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関して使用される命名法並びにそれらの技術は、当技術分野においてよく知られており、また、一般的に使用されるものである。本開示の方法及び技術は、別段の指示がない限り、当技術分野においてよく知られており、本明細書の全体にわたって参照され、議論される様々な全般的な及びより詳細な参考文献において記載される従来の方法に従って、一般的に実行される。

以下の実施例により本発明を更に説明するが、それらは決して更なる限定を加えるものであると解釈されるべきではない。本願全体を通して参照されている全ての参考文献（参照文献、登録特許、公開特許出願及び同時継続出願を含む）の全内容が参照により、特に、ここまでに参照されている教示において、本明細書に明示的に組み込まれる。しかしながら、いかなる参考文献の参照も、それが先行技術であると認めることを意図していない。

実施例１：ｅＣＧを産生するトランスジェニックマウスの作製
ゲノム中にｅＣＧのα及びβサブユニットをコードする核酸配列を含むトランスジェニックマウスを作製した。従来のマイクロインジェクション技術を使用してｅＣＧを産生するマウスを作製した。ｅＣＧのα及びβサブユニットをコードするｃＤＮＡを、公開されているそのアミノ酸配列に基づき合成した。それらＤＮＡ配列を発現ベクターにライゲーションした。これらプラスミドにおいて、ｅＣＧをコードする核酸配列は、マウスの乳腺におけるｅＣＧの発現を促進するプロモータの制御下にある。原核生物の配列を除去し、ＤＮＡをマウスの着床前の胚の中にマイクロインジェクトした。次いで、これらの胚を偽妊娠している雌に移入した。結果として生じる子孫を導入遺伝子の存在についてスクリーニングした。ｅＣＧのαサブユニット及びβサブユニットの両方の導入遺伝子を担持するものをトランスジェニックの初代として同定した。

適した年齢になると、初代動物を繁殖させ、Ｆ１子孫を作製した。妊娠及び出産の後、マウスを搾乳した。表１に示されているように、ＰＭＳＧ（ｅＣＧ）ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＤＲＧ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて、トランスジェニックマウスの乳中におけるｅＣＧの産生を定量化した。適した年齢になると、高ｅＣＧ発現のＦ１マウスを繁殖させ、Ｆ２子孫を作製した。

実施例２：ｅＣＧを産生するトランスジェニックＳＴ６マウスの作製
トランスジェニックマウスにおいて産生されるｅＣＧのα及びβサブユニットのシアリル化レベルを増大させるため、実施例１に記載されているｅＣＧ発現マウスを、シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）の産生に関してトランスジェニックであるマウスと交配させた。表２に示すように、トランスジェニックｅＣＧ産生マウスとトランスジェニックＳＴ３Ｇａｌ６産生マウスとの間の最初の交配は、ｅＣＧ及びＳＴ３Ｇａｌ６の両方の導入遺伝子を有する２４匹の子孫マウスをもたらした。適した年齢になると、これらのマウスを繁殖させた。妊娠及び出産の後、マウスを搾乳し、その動物の乳中に産生されたｅＣＧを特徴づけた。

実施例３：ｅＣＧ−Ｆｃ融合体の作製及び発現
トランスジェニック産生されたｅＣＧの半減期を増大させるために、両方のｅＣＧサブユニットを、そのＣ末端において、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列に融合させた構築物を作製した（図１Ａ〜１Ｄ）。それら構築物を独立して又は一緒に、２９３組織培養細胞にトランスフェクトした。表３に示すように、トランスフェクト細胞から上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりｅＣＧ産生に関して分析した。

また、図２に示すように、トランスフェクト細胞から上清及び細胞溶解物を回収し、ウェスタンブロットにより分析した。試料を抗Ｆｃ一次抗体で調べた。Ｆｃ領域に融合したどちらか一方のサブユニット又は両方のサブユニットを発現する細胞の上清（レーン８、９、及び１０）では、ｅＣＧサブユニットがウェスタンブロットにより検出されたが、Ｆｃ融合のないｅＣＧサブユニットを発現する細胞の上清（レーン１１）では検出されなかった。

図１Ｃに示される配列は、以下の配列に該当する配列番号３及び４に相当する：
配列番号３：
ＭＤＹＹＲＫＨＡＡＶＩＬＡＴＬＳＶＦＬＨＩＬＨＳＦＰＤＧＥＦＴＴＱＤＣＰＥＣＫＬＲＥＮＫＹＦＦＫＬＧＶＰＩＹＱＣＫＧＣＣＦＳＲＡＹＰＴＰＡＲＳＲＫＴＭＬＶＰＫＮＩＴＳＥＳＴＣＣＶＡＫＡＦＩＲＶＴＶＭＧＮＩＫＬＥＮＨＴＱＣＹＣＳＴＣＹＨＨＫＩＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号４：
ＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＡＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＡＣＣＣＴＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧＴＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＣＣＣＴＧＡＧＴＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＴＡＣＣＣＴＡＣＣＣＣＣＧＣＣＡＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＣＣＴＧＴＴＧＣＧＴＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＡＴＧＧＡＣＣＧＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＣＴＡＣＴＧＣＴＣＴＡＣＣＴＧＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡＧＡＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＴＣＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡ

図１Ｄに示される配列は、以下の配列に該当する配列番号５及び６に相当する：
配列番号５：
ＭＥＴＬＱＧＬＬＬＷＭＬＬＳＶＧＧＶＷＡＳＲＧＰＬＲＰＬＣＲＰＩＮＡＴＬＡＡＥＫＥＡＣＰＩＣＩＴＦＴＴＳＩＣＡＧＹＣＰＳＭＶＲＶＭＰＡＡＬＰＡＩＰＱＰＶＣＴＹＲＥＬＲＦＡＳＩＲＬＰＧＣＰＰＧＶＤＰＭＶＳＦＰＶＡＬＳＣＨＣＧＰＣＱＩＫＴＴＤＣＧＶＦＲＤＱＰＬＡＣＡＰＱＡＳＳＳＳＫＤＰＰＳＱＰＬＴＳＴＳＴＰＴＰＧＡＳＲＲＳＳＨＰＬＰＩＫＴＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

配列番号６：
ＡＴＧＧＡＡＡＣＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＴＧＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＧＣＣＣＣＴＧＴＧＣＡＧＡＣＣＣＡＴＣＡＡＴＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＧＣＣＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＣＣＴＡＴＣＴＧＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＡＣＴＧＣＣＣＴＴＣＴＡＴＧＧＴＧＣＧＣＧＴＧＡＴＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＣＣＴＣＡＧＣＣＣＧＴＧＴＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＧＣＴＧＡＧＡＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＴＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＣＧＴＧＧＡＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＴＧＣＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＧＡＣＴＧＴＧＧＣＧＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＴＧＣＧＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＡＡＧＧＡＣＣＣＣＣＣＴＡＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＣＡＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＧＣＴＣＣＣＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＴＣＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＡＴＡＡ

実施例４：ｅＣＧ−Ｆｃ融合タンパクを産生するトランスジェニックマウスの作製
両方のｅＣＧサブユニットを、そのＣ末端において、ヒトＩｇＧ１配列のＦｃ部分に融合させた構築物を作製した（図１Ａ〜１Ｄ）。従来のマイクロインジェクション技術を使用してｅＣＧ−Ｆｃ融合タンパクを産生するマウスを作製した。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列に融合したαサブユニット及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列に融合したβサブユニットをコードする合成ＤＮＡを作製した。その融合配列を発現ベクターにライゲーションした。これらプラスミドにおいて、ｅＣＧサブユニット−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸配列は、マウスの乳腺におけるｅＣＧサブユニット−Ｆｃ融合タンパク質の発現を促進するプロモータの制御下にある。原核生物の配列を除去し、ＤＮＡをマウスの着床前の胚の中にマイクロインジェクトした。次いで、これらの胚を偽妊娠している雌に移入した。結果として生じる子孫を、ｅＣＧα−Ｆｃ及びｅＣＧβ−Ｆｃ融合体の導入遺伝子の両方の存在についてスクリーニングした。１４匹のマウスが、両方の融合タンパク質を担持するものとして同定された；２匹のマウスは、ｅＣＧα−Ｆｃ融合体の導入遺伝子のみを担持するとして同定され、３匹のマウスは、ｅＣＧβ−Ｆｃ融合体の導入遺伝子のみを担持するとして同定された。

適した年齢になると、初代動物を繁殖させ、Ｆ１子孫を作製した。妊娠及び出産の後、マウスを搾乳した。図２〜６に示すように、抗Ｆｃ一次抗体及びポンソーＳタンパク質染色を用いたウェスタンブロットにより、トランスジェニックマウスの乳中におけるｅＣＧ−Ｆｃ融合体の産生を分析した。また、図７に示すように、抗Ｆｃ一次抗体及び抗ｅＣＧ一次抗体を用いたウェスタンブロットによってトランスジェニックマウスからの乳を分析した。図７は、Ｆｃに融合していないｅＣＧと比較して、トランスジェニックマウスの乳中のＦｃに融合したｅＣＧが増大した安定性を示したことを表わす。

表４及び図８に示すように、遺伝的背景及び導入遺伝子の発現レベルに依存して、マウスにおいて異なる表現型が観察された。

実施例５：トランスジェニックヤギにおけるｅＣＧ−Ｆｃ発現
ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列に融合したｅＣＧサブユニットの１つ以上をコードする核酸配列（図１Ａ〜１Ｄ）を発現するトランスジェニックヤギを作製する。従来のマイクロインジェクション技術を使用して、一方又は両方のｅＣＧサブユニット−Ｆｃ融合タンパク質を産生するヤギを作製する。その融合配列を発現ベクターにライゲーションする。これらプラスミドにおいて、ｅＣＧサブユニット−Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸配列は、ヤギの乳腺におけるｅＣＧサブユニット−Ｆｃ融合タンパク質の発現を促進するプロモータの制御下にある。原核生物の配列を除去し、ＤＮＡをヤギの着床前の胚の中にマイクロインジェクトする。次いで、これらの胚を偽妊娠している雌に移入する。結果として生じる子孫を、ｅＣＧサブユニット−Ｆｃ導入遺伝子の一方又は両方の存在についてスクリーニングする。

適した年齢になると、初代動物を繁殖させる。妊娠及び出産の後、ヤギを搾乳する。ｅＣＧ−Ｆｃ融合タンパクの産生を分析し、更にトランスジェニック動物の乳からｅＣＧ−Ｆｃ融合タンパクを精製する。

等価物
当業者は、通常の実験のみを使用して、この中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識又は確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

この中に開示された特許文献を含む全ての参考文献は、その全体が、参照によってこの中に取り込まれる。

Claims (20)

1. 乳腺において１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現するように改変されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供し、更に
   前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳腺により産生された乳から前記融合タンパク質を採取することを含む、方法。
2. 前記ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項１に記載の方法。
3. 前記Ｆｃドメインの配列は配列番号１の配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記融合タンパク質が２つ以上のサブユニットを含み、該サブユニットは同じトランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記融合タンパク質が２つ以上のサブユニットを含み、該サブユニットは異なるトランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記サブユニットは、異なるトランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生された後に組み合わされる、請求項５に記載の方法。
7. 前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ウシ亜科の動物、ブタ類の動物、ヤギ亜科の動物、ヒツジ属の動物、又は齧歯動物である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物はヤギである、請求項７に記載の方法。
9. 前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物はウサギである、請求項７に記載の方法。
10. 前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、前記乳腺で産生された融合タンパク質が、シアリルトランスフェラーゼを発現していないトランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生された前記融合タンパク質と比較して増大したシアリル化を有するように、シアリルトランスフェラーゼを組換え的に発現するように操作されている、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記融合タンパク質が、ポリペプチドとＦｃドメインとの間にリンカー領域を含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
12. １つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、更に乳を含む、組成物。
13. 薬学的に許容される担体を更に含む、請求項１２に記載の組成物。
14. １つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現するように改変されているトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
15. シアリルトランスフェラーゼを発現するように改変されている、請求項１４に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
16. 前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ウシ亜科の動物、ブタ類の動物、ヤギ亜科の動物、ヒツジ属の動物、又は齧歯動物である、請求項１４又は１５に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
17. 前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物はヤギである、請求項１６に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
18. 前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物はウサギである、請求項１６に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
19. トランスジェニック産生された１つ以上のＦｃドメイン融合ポリペプチドを含む融合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、方法。
20. 前記対象はヒト又は非ヒト哺乳動物である、請求項１９に記載の方法。

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