JP4683821B2 - ヒト組織因子を産生するノックイン非ヒト動物 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒト組織因子(human tissue factor;hTF)を産生するノックイン非ヒト動物に関する。
背景技術
組織因子(TF)の阻害物質は、血液凝固阻害薬、抗血管新生阻害薬、動脈硬化等の治療薬などとして有用である。しかしながら、ヒト組織因子に対する阻害物質は種特異性が高く、例えば、抗ヒト組織因子抗体は霊長目以外の動物の組織因子に反応しない。そのため、ヒト組織因子に対する阻害物質を評価する上で、ヒト組織因子を発現する動物の作製が望まれている。
ヒト組織因子のノックアウトマウスは胎生致死であるが、ヒト組織因子を発現させると胎生致死を回避できる(Parry GCNら、J.Clin.Invest.101:560−569(1998))。しかし、このマウスはヒト組織因子ミニジーンを導入しているため、組織因子発現量が低いため、交配成績が悪い(Erlich Jら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96:8138−8143(1999))。
発明の開示
従って、本発明は、ヒト組織因子を産生することができる非ヒト動物を提供しようとするものである。
上記の課題を解決するため、本発明は、非ヒト動物組織因子を実質的に産生せずに、ヒト組織因子を産生する非ヒト動物を提供する。より具体的には、本発明は、ヒト組織因子をコードする遺伝子が挿入されているゲノムを有することを特徴とする非ヒト動物を提供する。好ましくは、ヒト組織因子をコードする遺伝子は、非ヒト動物の組織因子と同じ染色体上に挿入される。好ましくは、ヒト組織因子をコードする遺伝子は、非ヒト動物の組織因子遺伝子の翻訳開始コドンの上流に挿入される。好ましくは、ヒト組織因子をコードする遺伝子は、その3’−末端側に不安定化シグナルまたはpolyAシグナルを含む。より好ましくは、ヒト組織因子をコードする遺伝子が、その3’−末端側に不安定化シグナル及びpolyAシグナルを含む。好ましくは、非ヒト動物はげっ歯類であり、例えばマウスである。
本発明はまた、上記のノックイン非ヒト動物の種々の利用方法を提供する。
即ち、本発明は、ヒト組織因子に起因する疾患の治療薬のスクリーニング方法において、
(a)被験物質を、本発明のヒト組織因子を産生するノックイン非ヒト動物、又は該非ヒト動物と他の非ヒト動物を交配させて得られた非ヒト動物に投与し、
(b)前記被験物質を投与した非ヒト動物において、ヒト組織因子に起因する疾患の症状が抑制されたか否かを測定する、
ことを含んで成る方法を提供する。例えば前記ヒト組織因子に起因する疾患は、血栓症又は敗血症である。
本発明はまた、被験物質が安全か否かを確認する方法において、
(a)被験物質を、本発明のヒト組織因子を産生するノックイン非ヒト動物、又は該非ヒト動物と他の非ヒト動物を交配させて得られた非ヒト動物に投与し、
(b)前記被験物質を投与した非ヒト動物が出血症状を引き起こしているか否かを確認する、
ことを含んで成る方法を提供する。
本発明はまた、抗腫瘍薬のスクリーニング方法において、
(a)被験物質を、本発明のヒト組織因子を産生するノックイン非ヒト動物、又は該非ヒト動物と他の非ヒト動物を交配させて得られた非ヒト動物に投与し、
(c)前記被験物質を投与した非ヒト動物において、腫瘍が抑制されているか否かを測定する、
ことを含んで成る方法を提供する。
本発明はまた、血管新生阻害薬のスクリーニング方法において、
(a)被験物質を、本発明のヒト組織因子を産生するノックイン非ヒト動物、又は該非ヒト動物と他の非ヒト動物を交配することにより得られる非ヒト動物に投与し、
(c)前記被験物質を投与した非ヒト動物において、血管新生が抑制されているか否かを測定する、ことを含んで成る方法を提供する。
本発明はまた、動脈硬化治療薬のスクリーニング方法において、
(a)被験物質を、本発明のヒト組織因子を産生するノックイン非ヒト動物、又は該非ヒト動物と他の非ヒト動物を交配させて得られた非ヒト動物に投与し、
(b)前記被験物質を投与した非ヒト動物において、動脈硬化が抑制されたか否かを測定する、ことを含んで成る方法を提供する。
本発明はさらに、上記の非ヒト動物に、該非ヒト動物由来の組織因子を免疫することを特徴とする、抗非ヒト動物組織因子抗体の作製方法を提供する。
発明の実施の形態
非ヒト動物においてヒトTFを産生させるためには、非ヒト動物ゲノム遺伝子中の適当な部位にヒトTFをコードする遺伝子を挿入すればよい(トランスジェニック非ヒト動物)が、非ヒト動物TFを産生せず、且つヒトTFを産生するという2条件を備えた非ヒト動物を得るには、非ヒト動物の生来のTF遺伝子を不活性化する必要がある。他方、ParryらJ.Clin.Invest.Vol.101,p560(1998)により、TFのエクソン1とエクソン2との間のイントロン1には発現調節エレメントが存在することが知られているため、非ヒト動物TFゲノム遺伝子を欠失させることはせず、非ヒト動物TF遺伝子の発現を不活性化する手法を採用した。
すなわち、本発明において、ヒトTFをコードする遺伝子を挿入する部位としては、非ヒト動物のTFゲノム遺伝子と同じ染色体上、特に非ヒト動物のTFゲノム遺伝子の翻訳開始コドンの上流が好ましい。これにより、複数の開始コドンが直列的に存在する場合には最初の開始コドンが優先的に使用されるという生物学的法則から、ヒトTF遺伝子のみが発現され、非ヒト動物TF遺伝子は発現されないことが期待される。さらに、ヒトTFcDNAの3’−側にpolyA付加シグナルを存在せしめることにより、ヒトTFcDNAから、非ヒト動物TFゲノム遺伝子のリードスルーを防止することが可能となる。
本発明のヒトTFは、全長のアミノ酸配列を有するヒトTFでも、ヒトTFの断片(好ましくはアミノ酸残基が100個以上のペプチドであり、さらに好ましくは200個以上のペプチド(例えば、Morrissey et al.,Cell,50,129−135(1987)記載のアミノ酸残基−32〜242の274アミノ酸を含むペプチド)である)でもよいが、好ましいのは全長アミノ酸配列を有するヒトTFである。従って、ヒトTFをコードする遺伝子も特に限定されず、全長ヒトTFをコードする遺伝子でも、その断片をコードする遺伝子でもよいが、好ましいのは全長ヒトTFをコードする遺伝子である。
本発明のヒトTFをコードする遺伝子は、ヒトTFを発現可能な遺伝子であれば特に限定されず、例えば、cDNAやゲノムDNAを用いることが可能である。本発明において好ましいヒトTFをコードする遺伝子はcDNAである。又、本発明のヒトTFをコードする遺伝子は、該遺伝子の発現を調節する調節遺伝子などの他の遺伝子が付加されていてもよい。ヒトTFに付加される調節因遺伝子などは、その由来は特に制限されず、ヒト由来のものでもよいし、非ヒト動物由来のものでもよい。
さらに、本発明においては、ヒトTFをコードする遺伝子に不安定化シグナル、polyAシグナル、非翻訳領域(UTR)などを付加することができる。不安定化シグナルは、当業者に公知の配列を用いることができ、例えば、ATTTAなどを使用することができる。polyAシグナルは、当業者に公知の配列を用いることができ、例えば、AATAAAなどを使用することができる。非翻訳領域としては、例えば、3’UTRや5’UTRなどを挙げることができるが、好ましいのは3’UTRである。本発明で用いる不安定化シグナル、polyAシグナル、非翻訳領域などは、その由来は特に制限されず、ヒト由来のものや非ヒト動物由来のもの等を用いることができる。
ヒトTFをコードする遺伝子に、不安定化シグナル、polyAシグナル、非翻訳領域などを付加する場合には、それらのうちいずれか一種類を付加してもよいがそれらのうち二種類以上を付加することが好ましい(例えば、不安定化シグナルとpolyAシグナル、又は非翻訳領域とpolyAシグナル、など)。又、不安定化シグナル、polyAシグナル、非翻訳領域などを付加する場合には、同一種類のものを複数付加することも可能である(例えば、polyAシグナルを付加する場合、同一配列のpolyAシグナル又は異なる配列のpolyAシグナルを2つ以上付加することも可能である)。次に、上記の構造を含むベクターを常法に従ってES細胞に導入し、非ヒト動物胚にES細胞を注入し、非ヒト動物を再生せしめる。
非ヒト動物TFを実質的に産生しないとは、非ヒト動物TFの発現が人為的に抑制されていることを意味し、好ましくは非ヒト動物TFが検出されないことを意味する。非ヒト動物TFの検出方法としては、例えば、実施例2に記載の抗非ヒト動物TF抗体を用いた検出方法などを挙げることができる。
本発明の非ヒト動物は特に限定されず、マウス・ラット・ハムスター等のげっ歯類、サル・チンパンジーなどの非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、ブタなどの哺乳動物や、鳥類、両生類、爬虫類、魚類などを用いることが可能であるが、好ましくはげっ歯類であり、さらに好ましくはマウスである。
本発明のノックイン非ヒト動物は、ヒトTFに起因する疾患のモデル動物として利用できる。ヒトTFに起因する疾患としては、例えば、血栓症(例えば、播種性血管内血液凝固症候群(Disseminated Intravascular Coagulation;DIC)、動脈狭窄及び閉塞、脳梗塞、静脈血栓症、肺塞栓症、心房血栓等)や、感染症などによる敗血症などが挙げられる。又、本発明のノックイン非ヒト動物は、上記疾患以外にも、腫瘍や血管新生、動脈硬化などの疾患モデル動物の作製にも利用することが可能である。
従って,本発明のノックイン非ヒト動物をこれらの疾患モデルとして使用する事により、これらの疾患の治療剤又は予防剤のスクリーニングを行うことが出来る。
例えば、血栓症を惹起させた本発明のノックイン非ヒト動物に被検物質を投与し、その後、この非ヒト動物においてヒトTFに起因する疾患が抑制されるか否かを確認することにより、ヒトTFに起因する疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニングを行うことができる。
又、本発明の非ヒト動物に食餌による負荷などを与えた非ヒト動物を用いてスクリーニングを行うことも可能である。例えば、高脂肪食負荷をして得られた非ヒト動物を用いて抗動脈硬化薬のスクリーニングを行うことが可能である。さらに、本発明の非ヒト動物に腫瘍を移植して得られた非ヒト動物を用いて抗腫瘍薬もしくは血管新生阻害薬のスクリーニングを行うことも可能である。
血管新生阻害薬のスクリーニング方法の場合、本発明の非ヒト動物に、FGF、VEGF、PDGFなどの当業者に公知の血管新生惹起物質を投与して得られた非ヒト動物を用いることも可能である。
又、敗血症治療薬又は予防薬のスクリーニング方法の場合、本発明の非ヒト動物に細菌若しくは細菌の成分を投与することにより、若しくは外科的手法を用いて非ヒト動物の腸内に存在する細菌などを腸外に出すことにより、敗血症を発症させた非ヒト動物を用いることも可能である。細菌としては、例えば、髄膜菌・緑膿菌などのグラム陰性菌や、ブドウ球菌・リステリアなどのグラム陽性菌を挙げることができるが、好ましくはグラム陰性菌である。細菌成分の好適な例としては、細菌の細胞壁成分として存在するエンドトキシンを挙げることができ、また、エンドトキシンの一成分であるリポポリサッカライド(LPS)を単独で用いることも可能である。
更に、本発明のノックイン非ヒト動物と他の非ヒト動物とを交配させることにより得られた非ヒト動物を用いてスクリーニングを行うことも可能である。従って、本発明においては、本発明の非ヒト動物を用いる場合だけでなく、本発明の非ヒト動物と他の非ヒト動物を交配して得られた非ヒト動物を用いた場合でも、本発明の非ヒト動物を用いたスクリーニング方法に含有される。
例えば、マウスの場合には、本発明のノックインマウスと癌易発性マウスとを交配させて得られたマウスを用いれば抗腫瘍薬又は抗血管新生阻害薬のスクリーニングを行うことが可能である。癌易発性マウスは当業者に公知のマウスを用いることができ、例えば、C3Hマウス、AKRマウス、129マウスなどを用いることができる。さらに、重症複合免疫不全症(Severe Combined Immunodeficiency Disease;SCID)マウス(Bosma GCら、Nature,301,527−530(1983);日本クレア株式会社より入手可能)やヌードマウスと交配させて得られたマウスに腫瘍を移植し、抗腫瘍薬又は抗血管新生阻害薬のスクリーニングを行うことも可能である。
又、本発明のノックインマウスと当業者に公知の動脈硬化易発性マウス(例えば、アポリポプロテインE(ApoE)ノックアウトマウス(Piedrahita JAら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,89,4471−4475(1992);The Jackson Laboratory(USA)より入手可能)、LDLRノックアウトマウス、など)を交配させて得られたマウスを用いれば抗動脈硬化薬のスクリーニングを行うことが可能である。上記のようにして得られたマウスを用いてスクリーニングを行う場合でも、本発明のマウスを用いたスクリーニング方法に含まれる。
スクリーニングに用いる被検物質は特に限定されず、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出物などが挙げられる。
本発明のスクリーニング法には、本発明のノックイン非ヒト動物、及び当該ノックイン非ヒト動物と他の非ヒト動物との交配により得られる非ヒト動物のみならず、これらの非ヒト動物から採取した臓器、組織、細胞、血液などの生体材料を用いることも可能である。
ヒトTFに起因する疾患が抑制されるか否かは、例えば疾患が播種性血管内血液凝固症候群(Disseminated Intravascular Coagulation;DIC)の場合には、厚生省DIC診断基準(1988年改訂)やDICスコアリングシステム(Taylor FB,Jr.et al.,(2001)Thromb.Haemost.86;1327−1330)を指標にするなどして判断でき、動脈狭窄及び閉塞の場合には、血管開通率や再閉塞の有無などにより判断でき、脳梗塞の場合には、中大脳動脈閉塞モデルなどで脳梗塞巣形成が抑制されるか否かなどにより判断でき、敗血症の場合には、死亡率が改善されるか否かなどにより判断でき、静脈血栓症の場合には、血栓量が減少するか否かなどにより判断でき、肺塞栓症の場合には、死亡率が改善されるか否かなどにより判断でき、心房血栓の場合には、血栓量が減少するか否かなどにより判断できる。
又、腫瘍増殖又は血管新生が抑制されたか否かは、それらの大きさや形成される頻度などにより判断することができ、動脈硬化が抑制されたか否かは非侵襲的血管内治療を施したのちの新生内膜の肥厚が抑制されるか否かなどにより判断することができる。
本発明の非ヒト動物は非ヒト動物TFを産生しないという特徴を有しているので、抗非ヒト動物TF抗体の作製に利用することも可能である。抗非ヒト動物TF抗体は、正常非ヒト動物の脳などから精製した非ヒト動物TF又は大腸菌、酵母、昆虫細胞や哺乳動物細胞などの宿主を利用して作製した組換え型非ヒト動物TF、もしくは非ヒト動物TFの一部のペプチド断片を、本発明のノックイン非ヒト動物に免疫する(Declerck PJ et al.(1995)J.Biol.Chem.270,8397−8400:ノックアウト動物への免疫による抗体作製法の1例)、または非ヒト動物TFを発現するnaked DNAを本発明の非ヒト動物に注入することにより作製することができる。抗体の作成は周知の常法に従って行うことが出来、ポリクローナル抗体(抗血清)又はモノクローナル抗体を作成することが出来る。
又、本発明の非ヒト動物はヒトTFに起因する疾患の治療薬、例えば抗ヒトTF抗体やヒトTFに結合する物質など、を投与した場合の安全性の評価、例えば出血症状の評価、等に利用できる。
さらに、本発明の非ヒト動物から採取した臓器、組織、細胞、血液などの生体材料を用いて、ヒトTFに由来する診断薬または試薬を調製することが可能である。これらの診断薬または試薬はヒトTFに起因する疾患の診断だけではなく、治療薬の評価にも利用できる。例えば、ヒト由来トロンボプラスチン試薬に替わるプロトロンビン時間測定試薬として使用できる。
次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。
実施例1.ノックインマウスの作出
(1)ベクターの構築
マウスTF(mTF)ゲノム遺伝子はMackmanらの報告(Arteriosclerosis and Thrombosis Vol.12 p474,1992)を参考にして、PCR法によってクローニングした。mTFのエクソン1からエクソン2までの約3kbの領域をmTF1SpS、及びmTF2Aのプライマーセットで増幅し、その後にpGEM−T−Easyベクター(Promega)にクローニングした。プライマーの配列は次の通りである。mTF1SpS:5’−CGA GCA AAT GCT ACT AGT AGG ATA AGT GAT CGT CTA AGG C−3’(配列番号:1)、mTF2A:5’−CTG TAC AGT GTA GGT ATA GTT GGT GGG TTT GGG TTG−3’(配列番号:2)。
PCR法における反応混合物の組成はマウスゲノムDNA(ES細胞由来、129系マウス、400μg/ml)1μl;10XLA緩衝液 5μl;dNTP 8μl;mTF1SpS(100μM)0.1μl;mTF2A(100μM)0.1μl;蒸留水 35.3μl;LA Taq(TAKARA)酵素 0.5μlであった。PCRは、94℃にて1分間の前加熱、98℃にて20秒間及び68℃にて15分間の増幅反応30サイクル、並びに72℃にて10分間の複加熱とした。
また、mTF遺伝子のエクソン2からエクソン6までの約10.5kb領域もPCR法によってクローニングした。プライマーセットは以下の通りで、PCR条件は上記と同じである。mTF1SpS:5’−CGA GCA AAT GCT ACT AGT AGG ATA AGT GAT CGT CTA AGG C −3’(配列番号:1);mTFe6ScA:5’−ATC AGA GCT CTC CGC AAC AGT GCC GT−3’(配列番号:3)。ここで増幅したフラグメントをSac I制限酵素で切断し、pBluescript(STRATAGENE)にクローニングした。
ヒトTF(hTF)cDNAの3’UTR(発現調節領域)は、J82細胞(ヒト膀胱癌)のmRNAより、以下のプライマーとBcaBEST RNA PCR kit(TAKARA)を用いてクローニングした。ShTF3:5’−TGT TCA AGC AGT GAT TCC C−3’(配列番号:4);RhTF2:5’−AAC AAT TCC CAG TCA CCT T−3’(配列番号:5)。
クローニングした1.37kbのフラグメントは、配列を確認した後にHpa IサイトでhTFのコード配列(CDS)部分と結合させ、完全長hTF cDNAを作製した。この完全長hTF cDNAは、開始コドン周辺をKozak配列に変換してあるものの、3’UTR部分はMackmanらの報告(Biochemistry Vol.28,p1755,1989)を参考にしており、polyAが付加される部分(AATAAAGGTGACTGGGAATTGTT、下線はhTFのpolyA付加シグナル)(配列番号:6)までの領域が含まれている。
この配列を配列番号:7に示す。この配列中、塩基番号1〜11はKozak配列(Nucleic Acids Research Vol.15,p8125 1987)に改変されており、塩基12〜14のATGはヒトTFの翻訳開始コドンであり、ヒトTFコード領域は塩基896において終了する。
これらのmTFゲノムDNA、及び完全長hTF cDNAを用いて、図1に示すノックインベクターを構築した。mTFのエクソン1内で開始コドン(ATG)前にあるKpn Iサイトに、ヒトTF(hTF)cDNAを薬剤耐性遺伝子(neo)とともに挿入した。Parryらが、TF遺伝子のイントロン(エクソン1とエクソン2の間)に発現調節エレメントの存在を報告していることから(J.Clin.Invest.Vol.101,p560,1998)、mTFのゲノムを欠失させる操作は行わなかった。
しかし、このベクターではmTF遺伝子の前にhTF cDNAが存在し、しかもpolyA付加シグナルが存在することから、このノックインマウスではhTF遺伝子のみ発現するものと予想された。たとえ、hTFにpolyAが付加せずにリードスルーしてmTF遺伝子が転写されたとしても、最初の開始コドンが優先されて蛋白質の翻訳がなされるという生物学的法則から、そのfusion mRNAからはhTFのみが翻訳され、mTF蛋白質は産生されないものと考えられた。
さらには、このベクターではmTFのエクソン2を並列につないでコンストラクトを作製していることから、仮にmTFの蛋白質が翻訳されたとしても、機能的なものにはならないと考えられた。ジフテリアトキシンAフラグメント(DTA)の遺伝子は、相同組み換え体を効率よく得るための、ネガティブ選択マーカーである。また、薬剤耐性遺伝子であるneoにはpgk遺伝子のプロモーターが付加されており、ES細胞内ではneo遺伝子が発現することになるが、この部分は上流に導入したhTF遺伝子の発現を抑制することから、後にこの部分(neo)を抜く操作を加えることにした。その為に、neo遺伝子の両側にはloxP配列(ATA ACT TCG TAT AGC ATA CAT TAT ACG AAG TTA T)(配列番号:8)を配置し、Creを作用させると組換えによって、間に挟まれたneo遺伝子が抜ける仕組みになっている。
(2)ES細胞への導入
TAKARAから販売されているThe Mouse Kit(LEXION GENETICS Inc.)を用いて、ES細胞(129SvEvマウス由来のAB2.2細胞)に、上記のhTFノックイン(KI)ベクターをエレクトロポレーションにより導入し、相同組み換え体をPCR法によってスクリーニングした。ベクターは、60μgをNot Iで直鎖状化しフェノール/クロロホルム抽出後、エタノール沈殿させPBSに溶解して用いた。
スクリーニングで用いるES細胞は96穴プレートで培養し、1ウェルあたり200μlのPBS溶液で2回洗浄後、以下の組成の細胞溶解緩衝液(10XLA緩衝液(TAKARA LA Taq用)5μl;5% NP−40 5μl;プロティナーゼ K(TAKARA,20mg/ml)4μl;蒸留水 36μl)を加えて55℃ 2時間処理し、続いて95℃にて15分処理することで、プロティナーゼ Kを失活させてPCRサンプルとした。
PCR反応混合物はサンプル1μl、2 X GC緩衝液 25μl、dNTP(2.5mM)8μl、プライマー(各20μM)各1μl、LA Taq(TAKARA)0.5μl、及び蒸留水 13.5μl(全 50μl)とした。また、PCR条件は、95℃にて1分間の前加熱、95℃にて30秒間、64℃にて30秒間及び72℃にて1分20秒間の増幅サイクル40サイクル、並びに72℃にて7分間の複加熱とした。
プライマーは以下の通りで、相同組み換えを起こしたES細胞のサンプルでは、約1.1kbのバンドが増幅される。プライマーはmTF2がKIベクターの外で5’側のmTFゲノム領域に配置し、hTF−AはhTF cDNA内に配置した(図1を参照)。mTF2(前方)5’−CCA GTA GGA TAA GTG ATC GTC TAA GGC−3’(配列番号:9);hTF−A(後方)5’−GCC ACA GTA TTT GTA GTG CCT GAA GC−3’(配列番号:10)。
以下にスクリーニング結果(相同組み換え効率)を示す。2回の実験で、1,180個のES細胞を解析した結果、計13個の相同組み換えを起こしたクローンが得られた(組み換え効率は2回の実験で平均1.1%であった)。
(3)ノックインマウスの作出
相同組換えESクローンをトリプシン処理により浮遊させ、ES細胞培地で洗浄した。48時間間隔で5IUのウマ絨毛ゴナドトロピン(eCG)およびヒト絨毛ゴナドトロピン(hCG)を腹腔内投与することにより、過剰排卵処理を施したC57BL/6Jの雌マウスを同系統の雄マウスと交配した。雌マウスのプラグが確認された日を0.5日とし、妊娠2.5日に子宮および卵管を灌流し、8細胞期から桑実期の胚を回収した。回収した胚を37℃にて一晩培養し、胚盤胞に発生した胚を宿主胚として10〜15個のES細胞を注入した。注入後の胚は2.5日齢となるように偽妊娠させたICR系の受容雌の子宮内に移植し、17日後に産仔を得た。
以下の表が、その時の注入の成績をまとめたものである。毛色によりESクローンの寄与率が高く(野生色の割合が高いマウスで)、しかもES細胞はXY染色体を持つことから、雄マウスの割合が高いESクローンから作製されたキメラマウスが、相同組み換えを起こしたノックイン(KI)対立遺伝子を効率よく仔に伝えることができるものと期待される。すなわち、ESクローンの7、76及び80からのキメラマウスが、KI対立遺伝子を伝達できるマウスであると期待された。
Germline transmissionの検討
相同組み換え体である3つのESクローンから作出されたマウスの毛色キメラ率が良かったことから、これらのキメラマウスをC57BL/6Jの雌マウスと交配し、ESクローン由来の染色体のgermline transmissionを検討した。以下の表がそのまとめである。
クローン7由来の6匹のキメラマウス(すべて、毛色キメラ率が90%)のうち、4匹のキメラマウスが効率良くgermline transmissionし、計95匹のF1マウスを得ることができた。また、クローン80由来のキメラマウスは、germline transmissionしなかったものの、クローン76由来のキメラマウスは、germline transmissionしたことから、独立した2系統のノックインマウスを樹立することができた。以後、これらのクローン由来のマウスを、それぞれ07系統、76系統と称する。
KIマウスの遺伝子解析
F1マウスは、毛色によってESクローン由来の仔(野生色)か、宿主胚由来の仔(黒色)か判断できる。しかし、ESクローン由来の仔でも、実際に相同組み換えを起こした側の染色体を持っているか否かは1/2の確率になる。それらを判別するために、マウスは離乳された後に約2cmの尾を採取され、KURABOのNA−1000によってゲノムDNAを抽出される。解析は、この100ngのゲノムDNAを用いて、前述のスクリーニング時に使ったPCR法によって行った。
(4)neo遺伝子の除去
体外受精によって、hTF KIマウス(♂)とC57BL/6J(♀)との受精卵を採取し、Cre遺伝子を発現させるベクター(約3ng/μl)を、その前核にインジェクションすることによってneo遺伝子を除去した。この際、用いたベクターは二種類pCAGGS−Cre−NLS、pCre−Pacである。pCAGGS−Cre−NLSはpCAGGSベクターに、C末側に核移行シグナル(NLS)が付加されるCre遺伝子が挿入されている。
pCAGGSベクターはサイトメガロウィルスのエンハンサーと、ニワトリのβアクチンのプロモーターによって構成され、挿入された遺伝子を哺乳類の細胞で強く発現することが可能なベクターである。一方、pCre−Pacは、MC−1のプロモーターによって、N末側にNLSが付加されるCreが発現するようなベクターである。これらのベクターによって、neo遺伝子を除去する操作を行った。以下の表が、そのまとめである。
上記の表のように、どちらのベクターを用いてもneoを除去する効率は等しく100%であったが、NLSを付加されていないCreを用いると、neoが完全には抜けていないキメラ状態になっていた。なお、この解析はマウスのゲノムDNA 5μgを使用して、ドットサザンブロット法によって行った。すなわち、neo遺伝子、及びhTF遺伝子をプローブにし、hTF遺伝子のみ検出できたものがneoの除去されたhTF KIマウスであり、両方のプローブで検出されたものは、neoが除去されなかったhTF KIマウスと判断した。
(5)hTFホモマウスの作製
上記で得られたhTF KIマウス(−neo)同士を交配させ、hTFのホモマウス(TFヒト型化マウス)を作製した。このマウスの遺伝子解析は、前述のPCR法にてhTFKI対立遺伝子の有無を判定し、さらにプライマーセット〔mTF−5(前方)5’−TTCACTCAAACCCACTGCGG−3’(配列番号:11);mTF−H(後方)5’−GCTACGCTACAGGAGCGATCG−3’(配列番号:12)〕で野生型対立遺伝子の有無を判定した。PCRの条件はともに同じであるが、別々にPCR反応を行った。完全にヒト型化されたホモTF KIマウスは、KI対立遺伝子を判別するためのPCRのみバンドが増幅される。
hTFマウスの発現解析
mTFの発現する組織をノザンブロット法を用いて検討した。マウスは、C57BL/6Jの♂8週齢を4匹用いた。脳、肺、胸腺、心臓、肝臓、脾臓、リンパ節、腎臓、精巣よりpolyA+RNAを調製し、そのうちの5μgを実験に用いた(図2)。それぞれの組織で、mTFの発現が確認されたが、その中でも脳、肺に於ける発現が高かったことから、作製したhTF KIマウスの発現解析は、これらの組織で行うことにした。その結果を図3に示す。
使用したマウスは、1ヶ月齢の野生型マウス♀(+/+)(レーン1及び8)および同じ1ヶ月齢の07系統の♀(レーン2〜5、9〜12)である。そのうちヘテロマウス(KI/+)(レーン2、4、9及び11)、ホモマウス(KI/KI)(レーン3、5、10及び12)で、さらにneoを除去しているもの(−neo)(レーン4、5、11及び12)、していないもの(+neo)(レーン2、3、9及び10)での脳(レーン1〜5)と肺(レーン8〜12)におけるmTFの発現を比較した。さらに、07系統(レーン6及び13)と76系統(7及び14)の♀の4ヶ月齢のヘテロマウスで系統間でのhTFの発現比較を行ない、さらに07系統(レーン2と6、9と13)で週齢間でのhTFの発現比較を行った。
これらのデータから、デザイン通りにノックインベクターが相同組み換えを起こし、mTFのかわりにhTFが発現するマウスが得られたことが確認された。すなわち、作製されたhTF KIマウスのhTFの発現パターンは、本来のmTFの発現パターンに類似していることから、ノックインマウスの作製は成功したものと考えられる。また、週齢や系統間で発現の差は認められなかった。
こうして作製されたhTF KIマウス(KI/KI,+neo)同士を交配させ、繁殖性を調べた。その結果、野生型マウスと同程度の繁殖性を示し、Erlichらが報告しているmTFノックアウトマウスとhTFゲノムトランスジェニックマウスとの、ダブルトランスジェニックマウスで明らかになっている妊娠中の問題点(Proc,Natl,Acad,Sci,USA Vol96 p8138 1999)は、本マウスでは認められなかった。
実施例2.ノックインマウスにおけるTFの発現の確認
(1)TFタンパク質の抽出
野生型マウスC57BL/6J(日本クレア)雌雄それぞれ5匹及び76系統ヒトTFノックインマウス雌雄それぞれ7匹より脳アセトン粉末を調製した。マウスを頚椎脱臼したのち、開頭して全脳を摘出して、液体窒素で急速に凍結した。これに脳重量1gあたり1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)を含むTBS(Tris−buffered−saline;宝酒造)2mLを加え、金属製及びテフロン製ホモジナイザーで組織を破砕した。4℃下、10,000×gで1時間遠心分離し、上清を除去した。
沈渣に前述と同量のTBSを加え、よく撹拌したのち、4℃下、10,000×gで1時間遠心分離して、上清を除去した。得られた沈渣に、脳重量1gあたり2mLの氷冷したアセトンを加え、よく懸濁した。4℃下、約2,000×gで20分間遠心し、上清を除去した。これを再度行い、脱脂した。得られた沈渣に窒素ガスを噴射して乾燥させ、これを脳アセトン粉末とした。
野生型マウス雌雄、ヒトTFノックインマウス雌雄それぞれの脳アセトン粉末を10mgに2% Triton X−100を含むTBSを400μL加えて、1時間超音波を与えて懸濁した。遠心操作(4℃,15,000rpm,10分間)により上清を回収し、1.2mLのTBSを加えて希釈し、1M MnCl2及び1M CaCl2を終濃度1mMになるように加えた。0.5% Triton X−100/TBS(含む1mM MnCl2,1mM CaCl2)で平衡化したConA Sepharose樹脂(Pharmacia Biotech)約50μLに前述の抽出液を加え、4℃下で一晩転倒混和した。
樹脂の10倍容量の0.5% Triton X−100/TBS(含む1mM MnCl2,1mM CaCl2)で洗浄し、SDS−PAGE Sample Buffer(Bio−Rad Laboratories)を加えて溶出し、95℃で5分間処理し、遠心操作(25℃,15,000rpm,1分間)により上清を回収し、試料とした。CHO細胞由来可溶型ヒトTF(WO99/51743参照)及びCHO細胞由来可溶型マウスTFはSDS−PAGE Sample Buffer(Bio−Rad Laboratories)と等量混和し、試料とした。分子量マーカーはPrestained Precision Protein StandardsTM(Bio−Rad Laboratories)を用いた。
(2)TFの抗体検出
脳アセトン粉末からの抽出物は3mg/lane由来相当を、精製可溶型TFは100ng/laneを、10%ポリアクリルアミドゲル(テフコ)2枚にて電気泳動した。セミドライ型ブロッキング装置にてPVDF膜(Millipore)に電気的に転写し、1×PBS/Casein Blocker(Bio−Rad Laboratories)にてブロッキングした。一方(ヒトTF検出系)は2μg/mLの抗ヒトTF抗体(American Diagnostica Inc.Cat.#4503)にて、もう一方(マウスTF検出系)は2μg/mLの抗マウスTF抗体MFR−37にて室温で1時間反応させた。 0.05% TweenTM 20を含むPBSで5分間、3回洗浄したのち、1000倍に希釈した二次抗体を反応させた。ヒトTF検出系にはアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスIgG(H+L)(ZYMED、Cat.#62−6522)を、マウスTF検出系にはアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ラットIg(BIOSOURCE、Cat.#ARI3405)を用い、室温で1時間反応させた。0.05% TweenTM 20を含むPBSで5分間、3回洗浄したのち、1st Step NBT/BCIP(PIERCE)により発色させた。結果を図4に示す。図4においてAは抗マウスTF抗体MFR−37によって検出した結果であり、Bは抗ヒトTF抗体ADI#4503によって検出した結果である。抗マウスTF抗体によっては、野生型マウスの脳組織にしかTFが検出されず、抗ヒトTF抗体によってはヒトTFノックインマウスの脳組織にしかTFが検出されなかった。
(3)ヒトTF活性の検出
前述のように調製した脳アセトン粉末を用い、血漿凝固活性によりヒトTF活性を検出した。ヒト血漿は標準ヒト血漿(Dade Behring Marburg GmbH)を、マウス血漿はICRマウスよりクエン酸血漿を採取したものを用いた。脳アセトン粉末を8mg/mLとなるようにTBSに懸濁し、TBSで希釈したヒト型化抗ヒトTF抗体hATR−5(ib2)(WO99/51743)40,4,0.4,0μg/mLと等量混和し、室温で1時間反応させた。100μL/cupの血漿にアセトン粉末−抗体混合液50μl/cupを加え、37℃で3分間加温した。これに20mM CaCl2(Dade Behring GmbH)を加え、凝固を開始させ、Amelung KC−10A(Heinrich Amelung GmbH)で凝固時間を測定した。 結果を図5及び図6に示す。図5は、マウス血漿凝固時間を測定した結果で、縦軸に血漿凝固時間を示し、各カラムは抗体の終濃度を示す。マウス血漿の凝固活性は野生型及びヒトTFノックインマウスに同程度に認められ、抗ヒトTF抗体によっては、ヒトTFノックインマウス由来のTF活性しか阻害できなかった。図6は、ヒト血漿凝固時間を測定した結果で、縦軸に血漿凝固時間を示し、各カラムは抗体の終濃度を示す。野生型マウスTFの活性はヒトTFノックインマウスの活性に比べ非常に弱かった(Janson TL.et al.(1984)Haemostasis 14,440−444)。また、抗ヒトTF抗体によっては、ヒトTFノックインマウス由来のTF活性しか阻害できなかった。
実施例3.改良型ノックインマウスの作製
(1)ノックインマウスの作製
実施例1で作成したマウスにおいて、以下の2点が変更されたマウスを実施例1と同様の方法で作製した。
変更点1
マウスのTF遺伝子の蛋白質翻訳開始点である開始コドンATGをCTGに変換して、マウスTF遺伝子に変異を入れた。
変更点2
ヒトTF遺伝子(配列番号7)の終止コドン(配列番号7の897−899番目にあたるコドンTAA)より後ろの配列(900−2041番目)を、マウスTFの3’UTRの配列に変更した。
マウスTF遺伝子の3’UTR配列は、Arteriosclerosis and Thromosis Vol.12,No.4,p474,(1992)に記載されているマウスゲノム配列の3’UTR部分(該文献中の配列989番目の塩基〜最後の塩基まで(TAGAGGAAA〜tgactccg))を用いた。
具体的には、C57BL/6Jマウスのゲノムを鋳型とし、以下のPCRプライマーを用いて、PCRクローニングを行った(鋳型ゲノムDNAを100ng、TaKaRa LA Taqを用いて、total 50μlの反応系でPCRを行い、PCR条件は95℃ 1分の後、(95℃ 0.5min、62℃ 0.5min、72℃ 1min)を35サイクル、最後に72℃ 7minの処理を行い、4℃で反応を終了した)。
FmTF3UTR:5’−TCATCCTCCTGTCCATATCTCTGTGC−3’(配列番号:13)
RmTF3UTR:5’−CGGAGTCACCTAATGTGAAAACCAAG−3’(配列番号:14)
増幅をしたフラグメントはTAクローニング(Promega社)を行い、シーケンスを確認し、上記論文記載の配列と同一であることを確認した。
得られたC57BL/6マウスのmTF 3’UTRを、hTFのcording領域(hTF CDS)にアセンブルPCRにより付加した。アセンブルPCRにはPyrobest(TaKaRA)を用いた。
hTF cording領域、mTF 3’UTRをそれぞれプライマーhTFassem−mTFhTF、mTFassem−hTFmTF(hTFassem:5’−GGA TCC TCG AGG CCA CCA TGG AGA CCC CTG−3’(配列番号:15)(Xho I,BamH Iサイト付加)、mTFassem:5’−TCT AGA CTC GAG CGG AGT CAC CTA ATG TGA−3’(配列番号:16)(Xho I,Xba Iサイト付加)、hTFmTF:5’−ACT CCC CAC TGA ATG TTT CAT AAA GGA AAG GCT GAA GCG C−3’(配列番号:17)、mTFhTF:5’−GCG CTT CAG CCT TTC CTT TAT GAA ACA TTC AGT GGG GAG T−3’)(配列番号:18)を用いてPCRにより増幅し、得られたフラグメントを精製した。PCRは95℃ 1min,(95℃ 0.5min,60℃ 0.5min,72℃ 1min)X 30cycles,72℃ 7min,4℃の条件で行った。
精製したhTF cording領域、mTF 3’UTRフラグメントを混合し、以下の条件でアセンブルPCRを行った。プライマー非存在下で(94℃ 2min,58℃ 2min,72℃ 2min)を2サイクル行った後に、hTFassem及びmTFassemプライマーを添加し、(95℃ 0.5min,58℃ 0.5min,72℃ 21min)を30サイクル,最後に72℃ 7minの処理を行い,4℃で反応を終了した。
得られたDNAを用いて実施例1と同様の方法でノックインマウスを作製した。
(2)hTFの発現解析
実施例1と同様の方法で、脳におけるTFの発現をノザンブロット法を用いて解析した。その結果を図7に示す。
なお、発現解析には、改良前ノックインマウス(実施例1のマウス)及び改良型ノックインマウスいずれも染色体の片方にのみヒトTF遺伝子(ノックインした遺伝子)が存在し、もう片方は保存されている(野生型)ものを用いた。従って、改良型ノックインマウス、改良前ノックインマウスはともに、ヒト及びマウスのTFを両方とも発現している。しかしながら、改良型ノックインマウスの方が、改良前ノックインマウスよりも、hTFを高発現していることが確認された(図7)。
従って、マウスに挿入したヒト遺伝子を高発現させる場合に、ヒト3’UTRのかわりにマウス3’UTRを用いることは、非常に有効な方法である。
この方法はマウスだけでなく、他のノックイン非ヒト動物を作製する場合にも応用できると考えられ、挿入する遺伝子にノックイン非ヒト動物由来の3’UTRを付加することにより、挿入した遺伝子が高発現するよう調節することが可能である。
実施例4.動脈閉塞モデル
ヒトTFノックインマウス76系統(♂,8〜20週齢)を用い、動脈血栓モデルを作製した。マウスをペントバルビタール(50mg/kg,i.p.)投与により麻酔し、マウスを背位に保定して、直腸温測定プローブを装着した。頸部を切開して左総頸動脈を露出し、動脈に並走する神経を剥離して動脈を他組織より単離した。ヒト型化抗ヒトTF抗体hATR−5(ib2)(WO99/51743)(30mg/kg)もしくはその溶媒(150mM NaClを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0))を尾静脈もしくは右総剄静脈より静脈内投与(50μL/10g B.W.)した。Pulsed Doppler Flow/Dimension System,Model SAGE3(Triton Technology Inc.)に接続したソフトカフプローブ0.5mm,20MHz(Crystal Biotech)を動脈に装着し、チャートレコーダーLINEARCORDER mark VII WR3101(Graphtec)上でモニターした。薬物投与5分以上経過したのち、直腸温36〜37℃の状態で動脈に刺激を与えた。40w/v% FeCl3・6H2Oを含むグリセリン溶液(FeG)を、総頚動脈のプローブ装着部位より心臓側の血管表面に、滴状に付着させて刺激した。2分間の刺激ののち、FeGを除去し、チャート上に示される血流をモニターしながら、動脈の開通状態をモニターした。刺激開始から30分間観察し、開通時間を測定し、その開通率を算出した。
hATR−5(ib2)投与により、開通時間が有意に延長し、開通率が有意に増加したことから、動脈閉塞を有意に抑制した。
実施例5.ヒトTFノックインマウスを用いた抗マウスTF抗体の作製
マウスTFを等容量のフロインド(Freund)完全アジュバンド(Difco Laboratories)とガラスシリンジ内で混合することによりエマルジョン化した。マウスTFにはCHO細胞由来可溶型TF(smTF)を用い、10μg/マウスを皮下注射により、雄性ノックインマウス07系統ならびに76系統それぞれ3匹に免疫した。2週間後、smTFを等容量のフロインド(Freund)不完全アジュバンド(Difco Laboratories)とガラスシリンジ内で混合することによりエマルジョン化(smTF−FIA)し、10μg/マウスを皮下注射により免疫した。以降、1週間毎にsmTF−FIAを皮下投与により免疫した。2回目から4回目は10μg/mouse、5回目は30μg/mouse、6,7回目は20μg/mouse相当のsmTFを免疫した。
また、各回の免疫する直前に眼窩より採血し、血清を分離して、ELISAにより抗マウスTF抗体の抗体価を測定した。なお、7回目免疫後の採血は、免疫の4日後に行った。ELISAの手順は以下に示す。
固相化バッファーでsmTFを1μg/mLに希釈し、96ウェルマイクロウェルプレート(Maxisorp;Nunc)に100μL/wellで分注し、smTFを固相化した。固相化バッファーには0.02w/v% NaN3を含む炭酸水素ナトリウム水溶液(pH9.6)を用いた。洗浄バッファー300μL/wellで3回洗浄し、ブロッキングバファー200μL/wellでブロッキングした。洗浄バファーには0.05vol%のTween登録商標 20を含むPBS(−)、ブロッキングバッファーには0.15M NaCl,1mM MgCl2,0.05vol% Tween登録商標 20,0.02w/v% NaN3,1w/v%ウシ血清アルブミンを含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.1)を用いた。ブロッキングバッファーを除去したのち、ブロッキングバッファーで適当に希釈した抗血清を100μL/well反応させた(室温、1時間)。洗浄バッファー300μL/wellで3回洗浄したのち、ブロッキングバッファーで1,000倍に希釈したAP−Goat Anti−Mouse IgG(H+L)(ZYMED Laboratories)を100μL/well反応させた(室温、2時間)。洗浄バッファー300μL/wellで5回洗浄したのち、アルカリホスファターゼ基質溶液を100μL/well分注して、室温で発色させ、405nmの吸光度(対照655nm)を測定した。吸光度はModel 3550Microplate Reader(Bio−Rad)を用いて測定した。基質溶液には1mg/mLのSIGMA登録商標104,10mM MgCl2を含む50mM炭酸水素ナトリウム水溶液(pH9.8)を用いた。
その結果、マウスTFに対する抗体価が上昇し、抗血清が得られた。
結果を図7〜図12に示す。
実施例6.LPS惹起DICモデルの作製
野生型マウスとヒトTFノックインマウスのそれぞれにLPSを投与して敗血症を惹起させた。野生型マウスにはC57BL/6J(日本クレア)、雌、15週齢を、ヒトTFノックインマウスには76系統、雌、14週齢を用いた。LPSは大腸菌(セロタイプ0111:B4)由来のもの(SIGMA−Aldrich Co.)を用いた。LPSを生理食塩水に溶解し、野生型マウスには0,5mg/kgを、hTFノックインマウスには0,1,5,25mg/kgを腹腔内投与(0.1mL/10g B.W.)した。投与6時間後、エーテル麻酔下で腹部大静脈より採血した。この際、抗凝固物質として3.8%クエン酸を最終1/10容となるように加えた。血小板数は自動血球計数装置F−800(シスメックス)にて測定した。
血小板数が減少し、DIC様の症状を呈することが確認された。
参考例1.抗マウスTF抗体の作製
(1)抗原の調製
マウス組織因子(マウスTF)のアミノ酸番号1〜251(Hartzell S.et al.(1989)Mol.Cell.Biol.9,2567−2573)の内、N末端側アミノ酸番号1〜29の配列を大腸菌発現用にメチオニン(M)に置換し、C末端にFLAGペプチド(DYKDDDDK)を付した組換え型solubleマウス組織因子タンパク質(smTF)をコードする遺伝子をT7プロモーターを含む大腸菌用発現ベクターに挿入して大腸菌BL21株に導入した。
組換え大腸菌の培養中に終濃度1mMのIPTGを添加してsmTFを発現誘導し、大腸菌を回収し、その溶菌液をSDS−PAGEにて分析した結果、smTFが分子量およそ25kDaのタンパク質として発現した。組換え大腸菌を2L培養して、600nmの吸光度が0.2になった時点で終濃度1mMになるようにIPTGを添加して更に5時間培養して菌体を回収し、回収した菌体を−80度Cにて凍結保存した。
菌体を超音波破砕した後、菌体破砕後の沈殿物を4% Triton−X 100および2M尿素にて3回洗浄し更にMilliQ水で2回洗浄した後、100mLの8M尿素/10mMジチオスレイトール/50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)で可溶化した。25,000xGで20分間遠心分離して不溶物を除去し可溶物を回収して、これをsmTF(U)とした。smTF(U)をリフォールディングさせるため、50mLのsmTF(U)を5Lの5mM還元型グルタチオン/1mM酸化型グルタチオン/20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)で透析し、2時間後と6時間後に透析外液を交換して更に16時間透析した。
透析した内液を25,000xGで20分間遠心分離して得られた溶液を20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)で脱塩してグルタチオンを除去した後、20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)で平衡化したResource Q6mLカラム(Pharmacia Biotech)に添加し、2カラム容量の同緩衝液で洗浄した。20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)中、NaCl濃度を0Mから0.3Mまで直線的に上げ、可溶型マウスTFを溶出した。得られた可溶型マウスTF画分をsmTF(R)とした。
(2)免疫とハイブリドーマの作製
組換え型可溶性マウス組織因子(TF)を等容量のフロインド(Freund)完全アジュバント(Difco Laboratories)とガラスシリンジ内で約30分間混合することによりエマルジョン化(油中水型)し、TFとしてsmTF(R)は50μg/ラット、smTF(U)は100μg/ラットで6週齢のWister雄性ラット(日本チャールスリバー)の尾根部皮下に接種した。
追加免疫では、フロインド完全アジュバントの代わりにフロインド不完全アジュバント(Difco Laboratories)を使用して同様にエマルジョンを調製し、これを、初回免疫から15日後及び22日後に、smTF(R)は50μg/ラットの量で、smTF(U)は100μg/ラットの量で投与し、更に、初回免疫から29日後、43日後及び50日後に、smTF(R)は25μg/ラットの量で、smTF(U)は50μg/ラットの量で、ラットの尾根部皮下に接種した。後述する免疫原を抗原としたELISAにより充分な抗体価の上昇を確認後、最終免疫として、初回免疫から57日後にsmTF(R)は50μg/ラットの量で、smTF(U)は100μg/ラットの量で、尾静脈内投与した。
最終免疫3日後にラットから無菌的に脾細胞を調製し、調製した脾細胞1.85×108個とマウスミエローマ細胞P3/X63−Ag8.U1(以下、P3U1)1.85×107個を混合し、常法(Harlow,E.and Lane,D.(1988)Antibodies A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratry)に従ってポリエチレングリコール1500(BOEHRINGER MANNHEIM)を用いて細胞を融合させた。融合細胞を10%ウシ胎仔血清(INTERGEN)を含むRPMI1640培地(GIBCO BRM)(以下、RPMI培地)に浮遊し、P3U1密度で5×104細胞/100μL/ウエルとなるよう96ウエル.マイクロプレートに播種し培養した。
細胞を播種する96ウエル.マイクロプレートの枚数は、ラット1匹あたり4枚(ウエル数352個)とした。翌日、2% BM−condimed H1(BOEHRINGER MANNHEIM)およびHAT(GIBCO BRL)を含むRPMI1640培地(以下、HAT培地)を100μL/ウエルで添加し、さらに細胞融合の2日、3日及び5日後に半量をHAT培地に置換することによりHAT選択を行った。
細胞融合9日後に、1次スクリーニングとしてcell ELISAにより各ウエルの抗体価を測定した。高い吸光度を示したウエルから12枚のウエルプレートに継代培養し、2次スクリーニングに供した。
1次スクリーニングの4日後に、2次スクリーニングとしてcell ELISA、smTF(U)およびCOS細胞で発現させたsmTF(smTF(cos))を抗原としたELISAによる抗体価の測定、並びにFactor Xa産生阻害活性、の測定を行った。Factor Xa産生阻害活性が認められたウエルについてはFactor X結合阻害活性を測定し、抗体のタイプ分けを行った。
2次スクリーニングで選択したハイブリドーマは限界希釈法を2回繰り返すことによりクローン化して、2% BM−condimed H1を含むRPMI1640培地に馴化した後、抗体産生能に変化がないことを確認し、これをもってハイブリドーマの樹立を完了した。
最終的に、ヒトFactor Xa産生阻害活性、ヒトFactor X結合阻害活性のどちらも有する抗体6クローン(MFR−36、MFR−37、MFR−40、MFR−66(IgG2a)、MFR−25、MFR−51(IgM))を樹立した。
(3)腹水の作製及び抗体の精製
樹立したハイブリドーマの腹水の作製は常法に従って行った。すなわち、in vitroで継代したハイブリドーマ(MFR−37)1×106個を、予め鉱物油を2回腹腔内に投与しておいたBALB/c系雄性ヌードマウスBALB/c−nu/nu(日本チャールスリバー)の腹腔内に移植した。移植後1〜2週目で腹部が肥大したマウスから腹水を回収した。
腹水からの抗体(MFR−37)の精製はSP Sepharose Fast Flowカラムクロマトグラフィー、Protein G Sepharose 6 FFカラムクロマトグラフィー操作を組み合わせて行った。すなわち、20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)で10倍に希釈し、SP Sepharose Fast Flowカラム(50mmID×130mmH)に吸着させ、20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)で洗浄したのち、500mM塩化ナトリウムを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で溶出した。溶出画分を1Mトリス水溶液でpHを6前後に調整し、Protein G Sepharose 6 FFカラム(16mmID×125mmH)に吸着させた。
カラムの約10倍容量の20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で洗浄したのち、50mM酢酸で溶出した。溶出画分を精製水で2倍に希釈したのち、1Mトリス水溶液でpHを5.0に調整して、SP Sepharose XLカラム(10mmID×100mmH)に吸着させた。カラムの約10倍容量の20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)で洗浄し、さらにカラムの約10倍容量の20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で洗浄したのち、200mM塩化ナトリウムを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で溶出させ、精製抗体とした。
参考例2.CHO細胞由来可溶型マウスTFの調製
TFのアミノ酸番号1〜251(Hartzell S.et al.(1989)Mol.Cell.Biol.9,2567−2573)のC末端にFLAGペプチド(DYKDDDDK)を付したタンパク質をコードする遺伝子を、DHFR発現遺伝子を含む哺乳動物細胞用発現ベクターに挿入し、CHO細胞に導入した。メトトレキサートにて発現増幅をかけ、可溶型マウスTF発現CHO細胞を樹立した。
この細胞を無血清培地CHO−S−SFM II(GIBCO BRL)で培養し、可溶型マウスTFを含む培養上清を得た。培養上清に2倍容量の20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)を加え、3倍希釈した。20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)で平衡化したQ−Sepharose Fast Flowカラム(200mL,Pharmacia Biotech)に添加し、3カラム容量の同緩衝液で洗浄した。20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)中、NaCl濃度を0Mから1Mまで直線的に上げ、可溶型マウスTFを溶出した。
得られた可溶型マウスTF画分に30%飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、遠心操作により夾雑タンパク質を沈殿させた。上清を回収し、50%飽和となるように硫酸アンモニウムを追加添加し、遠心操作により夾雑タンパク質を沈殿させた。上清をButyl−TOYOPEARL(21.5mL、TOSOH)に添加し、3カラム容量の1.8Mの硫酸アンモニウムを含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH6.8)で洗浄した。50mMトリス塩酸緩衝液(pH6.8)中、硫酸アンモニウム濃度を1.8Mから0Mまで直線的に下げ、可溶型マウスTFを溶出させた。
可溶型マウスTFを含むピーク画分をCentri−Prep 10(アミコン)で濃縮した。150mM NaClを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化したTSKgel G3000SWGカラム(21.5×600mm、TOSOH)に濃縮液を添加し、可溶型マウスTFのピーク画分を回収した。これを0.22μmのメンブランフィルターで滅菌し、CHO細胞由来可溶型マウスTFとした。試料の吸光度280nmのモル吸光係数をε=39,670、分子量を45,000として、試料の濃度を算出した。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、本発明のヒト組織因子(TF)ノックインマウスの作製におけるゲノムDNAの形成を模式的に示す図である。この図中、AはマウスTFゲノムDNA(1)と挿入されるべき完全長ヒトTFcDNA及びネオマイシン耐性遺伝子(2)との関係を模式的に示す。Bは、マウスTFゲノムDNA(a)及びノックインベクター(b)が相同性組換えを起してノックインされたゲノムDNA(c)が生成する様子を模式的に示す図であり、(a)と(b)との間の×印は(a)と(b)の間で相同性組換えが生ずることを示す。
図2はマウスにおけるTF遺伝子の発現の組織分布を示すノザンブロット解析の結果を示す図である。
図3は本発明に関連する種々のマウスの発現生成物の様子を示すノザンブロット解析の結果を示す図である。
図4において、野生型マウス及びノックインマウスの脳のおけるTFの発現を、Aは抗マウスTF抗体MFR−37によって検出した結果であり、Bは、抗ヒトTF抗体ADI#4503によって検出した結果であり、Westernブロット解析の結果を示す写真である。
図5は、野生型マウス及びヒトTFノックインマウスでの、抗ヒトTF抗体によるマウス血漿凝固阻害を、血漿凝固時間として測定した結果を示すグラフでり、縦軸に血漿凝固時間を、各カラムは抗体の終濃度を示す。
図6は、図5と同様であるが、ヒト血漿凝固時間を測定した結果を示すグラフである。
図7は、実施例5における抗マウスTF抗体の作製の結果を示すグラフであり、縦軸は405nmの吸光度(対照655nm)を示し、横軸は血清希釈率をしめす。07系統マウスNo.1の結果を示す。
図8は、図7と同様であり、07系統マウスNo.2の結果を示す。
図9は、図7と同様であり、07系統マウスNo.3の結果を示す。
図10は、図7と同様であり、76系統マウスNo.4の結果を示す。
図11は、図7と同様であり、76系統マウスNo.5の結果を示す。
図12は、図7と同様であり、76系統マウスNo.6の結果を示す。
Claims (13)
- ヒト組織因子(TF)をコードする遺伝子であってヒトTFの翻訳開始コドン及び3'UTRを含むものが、非ヒト動物の組織因子遺伝子の翻訳開始コドンの上流に挿入されており、これにより前記ヒトの翻訳開始コドンが非ヒト翻訳開始コドンに先行しているためにヒトTF遺伝子が優先的に翻訳され、当該非ヒト動物組織因子を実質的に産生せずに、ヒト組織因子を産生する非ヒト動物。
- ヒト組織因子をコードする遺伝子が、その3’-末端側に不安定化シグナルまたはpolyAシグナルを含むことを特徴とする請求項1に記載の非ヒト動物。
- ヒト組織因子をコードする遺伝子が、その3’-末端側に不安定化シグナル及びpolyAシグナルを含むことを特徴とする請求項2記載の非ヒト動物。
- 非ヒト動物がげっ歯類であることを特徴とする請求項1から3いずれかに記載の非ヒト動物。
- 非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項4記載の非ヒト動物。
- ヒト組織因子に起因する疾患の治療薬のスクリーニング方法において、
(a)被験物質を、請求項1〜5のいずれか1項に記載の非ヒト動物に投与し、
(b)前記被験物質を投与した非ヒト動物において、ヒト組織因子に起因する疾患の症状が抑制されたか否かを測定する、
ことを含んで成る方法。 - ヒト組織因子に起因する疾患が血栓症であることを特徴とする請求項6記載の方法。
- ヒト組織因子に起因する疾患が敗血症であることを特徴とする請求項6記載の方法。
- 被験物質が安全か否かを確認する方法において、
(a)被験物質を、請求項1〜5のいずれか1項に記載の非ヒト動物に投与し、
(b)前記被験物質を投与した非ヒト動物が出血症状を引き起こしているか否かを確認する、
ことを含んで成る方法。 - 抗腫瘍薬のスクリーニング方法において、
(a)被験物質を、請求項1〜5のいずれか1項に記載の非ヒト動物に投与し、
(c)前記被験物質を投与した非ヒト動物において、腫瘍が抑制されているか否かを測定する、
ことを含んで成る方法。 - 血管新生阻害薬のスクリーニング方法において、
(a)被験物質を、請求項1〜5のいずれか1項に記載の非ヒト動物に投与し、
(c)前記被験物質を投与した非ヒト動物において、血管新生が抑制されているか否かを測定する、
ことを含んで成る方法。 - 動脈硬化治療薬のスクリーニング方法において、
(a)被験物質を、請求項1〜5のいずれか1項に記載の非ヒト動物に投与し、
(b)前記被験物質を投与した非ヒト動物において、動脈硬化が抑制されたか否かを測定する、ことを含んで成る方法。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載の非ヒト動物に、該非ヒト動物由来の組織因子を免疫することを特徴とする、抗非ヒト動物組織因子抗体の作製方法。
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