CN107979973A - Fc融合蛋白质的转基因生产 - Google Patents

Abstract

一方面，本公开提供了用于生产包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白的方法，细胞和转基因非人哺乳动物，以及包含获自这些方法，细胞和转基因非人哺乳动物的包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质。

Description

FC融合蛋白质的转基因生产

相关申请

本申请要求于2015年5月4日提交的美国临时申请号62/156,879的在35U.S.C.§119(e)下的权益，其全部内容通过引用并入本文。

发明领域

本公开涉及包含融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质的转基因生产领域。

发明背景

可结晶片段(Fragment crystallizable)(“Fc”)结构域对应于结合细胞表面Fc受体的免疫球蛋白的区域。Fc结构域已融合到许多不同的蛋白质。包含Fc-融合蛋白质的多种产品已获得FDA批准(例如,Nulojix(贝拉西普),Eylea(阿普西柏),Arcalyst(rilonacept),NPlate(罗米司亭),Orencia(阿巴西普),Amevive(阿来塞普),以及Enbrel(依那西普)；综述于Czajkowsky et al.(2012)EMBO Mol.Med.4:1015-1028。

发明概述

本文公开的是转基因表达融合到Fc结构域的多肽，从而增加转基因生产的多肽的半衰期的方法。一方面，本公开涉及包含融合到Fc结构域的一个或多个多肽的融合蛋白质的生产和使用方法。

重要的是，本文提供的方法允许有效地在转基因动物中生产蛋白质，所述蛋白质包括蛋白质的表达可能不利于动物发育的蛋白质。在一些方面，本文所述的方法允许通过以与Fc结构域的融合物表达多聚体蛋白质的一种或多种组分来改善多聚体蛋白质的转基因表达。将这些方法应用于多聚体蛋白质可导致半衰期增加和蛋白质折叠改善。

本发明的方面涉及方法，其包括提供已经被修饰以在乳腺中表达包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质，并且从由转基因非人哺乳动物的乳腺生产的乳中收获所述融合蛋白质。在一些实施方案中，Fc结构域是人IgG1Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域的序列包含SEQ ID NO:1。

在一些实施方案中，融合蛋白质包含超过一个亚基，并且所述亚基在不同转基因非人哺乳动物中生产。在其他实施方案中，融合蛋白质包含超过一个亚基，并且所述亚基在不同转基因非人哺乳动物中生产。在一些实施方案中，在不同的转基因非哺乳动物中生产后，组合所述亚基。在一些实施方案中，转基因非人哺乳动物是牛、猪、山羊、绵羊或啮齿动物。在一些实施方案中，转基因非人哺乳动物是山羊。在其他实施方案中转基因非人哺乳动物是兔。

在一些实施方案中，转基因非人哺乳动物已经被工程化以重组表达唾液酸转移酶，使得在所述哺乳动物中生产的融合蛋白质相较于在不表达唾液酸转移酶的转基因非人哺乳动物中生产的融合蛋白质而言具有增加的唾液酸化。在一些实施方案中，融合蛋白质包含在所述多肽和所述Fc结构域之间的接头区。

本发明的其它方面包括组合物，其包含含有融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质，并还包含乳。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。

本发明的其它方面提供了转基因非人哺乳动物，其已经被修饰以表达包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质。在一些实施方案中，转基因非人哺乳动物已经被修饰以表达唾液酸转移酶。在一些实施方案中，转基因非人哺乳动物是牛、猪、山羊、绵羊或啮齿动物。在一些实施方案中，转基因非人哺乳动物是山羊。在其他实施方案中转基因非人哺乳动物是兔。

本发明的其它方面涉及方法，其包括向受试者施用有效量的转基因生产的包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质。在一些实施方案中，受试者是人或非人哺乳动物。

本发明的每个限制可以包括本发明的各种实施方案。因此，预期涉及任何一个元素或元素组合的本发明的每个限制可以包括在本发明的每个方面中。本发明并不限于其在以下描述中阐述或在附图中示出的成分的构建和布置的细节。

附图简述

附图并不意图按比例绘制。这些附图仅是说明性的，并且不需要用于实现本公开。为了清楚起见，不是每个成分均在每幅附图中标出。在附图中：

图1A-1D展示了融合构建体的原理图，以及eCG-Fc融合蛋白质的核酸和氨基酸序列。图1A和图1B分别描绘了eCGα亚基Fc融合物以及eCGβ亚基Fc融合物。图1C和图1D分别呈现了对应于eCGα亚基Fc融合物(SEQ ID NO:3和4)以及eCGβ亚基Fc融合物(SEQ ID NO:5和6)的序列。

图2描绘了代表性的Western印迹，其在293细胞中用抗Fc一抗检测eCG-Fc融合蛋白质的瞬时表达。

图3描绘了代表性的Western印迹，其在转基因小鼠的乳中用抗Fc一抗检测eCG-Fc融合蛋白质的表达。每只小鼠的基因型由α/-,-/β,或α/β表示。

图4描绘了与图3相同的代表性膜(但用Ponceau S染色)，证明了在转基因小鼠的乳中产生指示的蛋白质。每只小鼠的基因型由α/-,-/β,或α/β表示。

图5A和图5B显示了转基因小鼠的乳中eCG-Fc融合蛋白质的表达。图5A呈现了代表性Ponceau S染色的膜，以及图5B呈现了使用抗Fc一抗的Western印迹的相同的膜。每只小鼠的基因型由α/-,-/β,或α/β表示，并且用F0,F1,或F2指示小鼠的世代。

图6A-图6C显示了通过抗Fc一抗和抗eCG一抗两者检测的eCG-Fc融合蛋白质。图6A呈现了使用抗Fc一抗的代表性Western印迹。图6B呈现了与图4A相同的但用抗eCG一抗探测的膜。图6C呈现了用抗Fc一抗和抗eCG一抗两者探测的膜的覆盖物(overlay)。每只小鼠的基因型由α/-,-/β,或α/β表示。

图7A和图7B显示了转基因小鼠的乳中eCG和eCG-Fc融合蛋白质的相对表达水平。图7A呈现了使用抗Fc一抗的代表性Western印迹，并且图7B呈现了使用抗eCG一抗的相同样品的Western印迹。在非还原(NR)和还原(R)条件下评价样品。BME＝还原样品(分开α和β)；NR＝非还原样品(不分开α和β)。

图8呈现了在非限制性实施方案中，与转基因小鼠的乳中eCG-Fc融合蛋白质的表达相关的表型。

发明详述

本文公开的是用于生产包含融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质的方法、细胞和转基因哺乳动物。本文令人惊讶地证明了将多肽与Fc结构域融合导致转基因生产的多肽的增加的半衰期和改善的折叠。与本发明相关的方法和组合物允许转基因生产的蛋白质的增加的稳定性和半衰期。

重要的是本文提供的方法和组合物解决了与动物蛋白质(其表达可能不利于动物的发育)中转基因表达相关的本领域中的以前的挑战。特别地，本文所述的方法解决了与以下相关的问题，即当蛋白质的表达预期对动物的发育具有不利影响时，在动物的乳腺中转基因生产蛋白质。在一些实例中，多聚体蛋白质的转基因表达可能不利于动物的发育。使用本文所述的方法，可以通过作为与Fc结构域的融合物表达一种或多种多聚体蛋白质的组分来在动物的乳腺中在转基因上有效地生产多聚体蛋白质。在本文描述的一些实施方案中，多聚体蛋白质的不同组分在不同的动物中转基因地表达。

本发明不限于其应用于以下描述中阐述或在附图中示出的组分的构造和排列的细节。本发明能够具有其他实施方案并且能够以各种方式得以实践或执行。此外，本文使用的措辞和术语是为了描述的目的，不应被视为限制。本文中使用的“包括”，“包含”或“具有”，“牵涉(involving)”，及其变化意在包括其后列出的项目及其等同物以及附加项目。

Fc融合物

本发明的方法涉及表达一种或多种融合到可结晶片段(“Fc”)结构域的多肽。如本文所用，“Fc结构域”指与细胞表面Fc受体相互作用的免疫球蛋白分子的部分。Fc结构域可以包含一个或多个重链恒定结构域(CH)。在一些实施方案中，Fc结构域包含两个重链恒定域。在一些实施方案中，Fc结构域包含重链恒定结构域CH2和CH3。来自任何同种型的免疫球蛋白(例如IgG，IgA，IgM，IgE，IgD)和任何亚型(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)的Fc结构域可以与本发明的方面相容。在一些实施方案中，Fc结构域是IgG1Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域是杂合(hybrid)Fc结构域，如美国专利号7,867,491中描述的并通过引用并入。

Fc结构域与生物活性蛋白质的融合是本领域已知的(例如参见美国专利号8,431,132,美国专利号7,867,491,Czajkowsky et al.(2012)EMBO Mol Med4:1015-1028；Becket al.(2011)MAbs 3:415-416；Low et al.(2005)Human Reproduction 20(7):1805-1813；Ashkenazi et al.(1993)Int.Rev.Immunol.10:219-227；Chamow et al.(1996)Trends Biotechnol.14:52-60；Kim et al.(1994)Eur.J.Immunol.24:2429-2434)。Fc结构域可以从适当的来源通过常规技术，例如进行PCR扩增获得。Fc结构域可以是天然存在的或合成的。在一些实施方案中，Fc结构域源自人、灵长类、牛、猪、山羊、绵羊、啮齿动物，或犬哺乳动物。更具体地，Fc结构域来自哺乳动物源，包括但不限于人或其他灵长类、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠或大鼠。

在一些实施方案中，向人施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自人。在其他实施方案中，向人施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非人来源。在一些实施方案中，向灵长类动物施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自灵长类动物。其他实施方案中，向灵长类动物施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非灵长类动物来源。在一些实施方案中，向牛施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自牛。在其他实施方案中，向牛施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非牛来源。在一些实施方案中，向猪施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自猪。在其他实施方案中，向猪施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非猪来源。在一些实施方案中，向山羊施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自山羊。在其他实施方案中，向山羊施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非山羊来源。在一些实施方案中，向绵羊施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自绵羊。在其他实施方案中，向绵羊施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非绵羊来源。在一些实施方案中，向啮齿动物施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自啮齿动物。在其他实施方案中，向啮齿动物施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非啮齿动物来源。在一些实施方案中，向狗施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自狗。在其他实施方案中，向狗施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非狗来源。在一些实施方案中，向猫施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自猫。在其他实施方案中，向猫施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非猫来源。在一些实施方案中，向马施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自马。在其他实施方案中，向马施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非马来源。在一些实施方案中，向牛施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自牛。在其他实施方案中，向牛施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非牛来源。在一些实施方案中，向猪施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自猪。在其他实施方案中，向猪施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非猪来源。在一些实施方案中，向绵羊施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自绵羊。在其他实施方案中，向绵羊施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非绵羊来源。在一些实施方案中，向山羊施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自山羊。在其他实施方案中，向山羊施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非山羊来源。在一些实施方案中，向兔施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自兔。在其他实施方案中，向兔施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非兔来源。在一些实施方案中，向小鼠施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自小鼠。在其他实施方案中，向小鼠施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非小鼠来源。在一些实施方案中，向大鼠施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自大鼠。在其他实施方案中，向大鼠施用的Fc融合蛋白质中的Fc结构域源自非大鼠来源。

在一些实施方案中，Fc结构域包含SEQ ID NO:1的序列。在某些实施方案中，Fc结构域由SEQ ID NO:1的序列组成。在一些实施方案中，Fc结构域与SEQ ID NO:1至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

Fc结构域的非限制性实例的氨基酸序列在SEQ ID NO:1中提供：

KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Fc结构域的非限制性实例的核酸序列在SEQ ID NO:2中提供：

AAGACCCACACCTGTCCTCCCTGTCCCGCCCCTGAACTGCTGGGAGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCTCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCCCCCAGCAGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAG CCTGAGCCCCGGCAAATAATGA

在一些实施方案中，编码Fc结构域的核酸包含SEQ ID NO:2。在某些实施方案中，编码Fc结构域的核酸由SEQ ID NO:2组成。在一些实施方案中，编码Fc结构域的核酸序列与SEQ ID NO:2至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

Fc结构域可以与多肽共价连接。在一些实施方案中，多肽直接附接到Fc结构域。例如，多肽可以附接到Fc结构域的柔性铰链区。如本领域普通技术人员将理解的，也可以包括将多肽连接到Fc结构域的接头区。接头序列的实例由SEQ ID NO:7：GGGGSGGGGSGGGGS提供。

在一些方面，本文提供的方法可以有利于在转基因非哺乳动物中生产多聚体蛋白质。如本文所用，“多聚体蛋白质”指包含可以组合以形成单个蛋白质的超过一个独立的、非共价连接的亚基或者多肽的蛋白质。在一些实施方案中，多聚体蛋白质的每个亚基融合到Fc结构域。在一些实施方案中，多聚体蛋白质的至少一个亚基融合到Fc结构域。在一些实施方案中，在转基因非人哺乳动物中生产多聚体蛋白质的每个亚基，并且在从相应转基因哺乳动物收获每个亚基后组合所述亚基。可以在相同的转基因动物或在不同的转基因动物中生产多聚体蛋白质的一个或多个亚基。

与本发明相关联的Fc结构域可以在Fc片段的重链的Fc-gamma糖基化位点处(Asn297)包含一个或多个N-多聚糖。在Fc-gamma糖基化位点处可发生多种糖基化模式。在该位点处发现的寡糖包括半乳糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNac)，甘露糖，唾液酸，N-乙酰神经氨酸(NeuAc或NANA)，N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)和岩藻糖。在Fc-gamma糖基化位点处发现的的N-多聚糖一般有一个共同的核心结构，该核心结构由附接于抗体的天冬酰胺的第一N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、附接于第一GlcNac的第二GlcNAc，以及附接于第二GlcNAc的第一甘露糖的不分支链(unbranched chain)组成。两个另外的甘露糖与GlcNAc-GlcNAc-甘露糖链的第一甘露糖附接以完成核心结构并为额外的糖基化提供两个“臂”。另外，岩藻糖残基可以附接到N-连接的第一GlcNAc。

本发明的方面涉及一个或多个多肽与Fc结构域的融合。Fc结构域可以在多肽的N末端或C末端处融合。在一些实施方案中，Fc结构域与多肽的C末端融合。在一些实施方案中，多聚体蛋白质的两个或多个亚基各自与Fc结构域融合。可以在转基因哺乳动物的乳腺中产生融合到Fc结构域的多肽。可以在相同转基因哺乳动物的乳腺或不同转基因哺乳动物的乳腺中产生融合到Fc结构域的多种(multiple)多肽(其包括多肽或多聚体蛋白质的亚基)，并且在从各自的转基因哺乳动物收获每个亚基后合并所述多种多肽。

应当理解，本文所述的方法，细胞和组合物可以与融合到Fc结构域的任何多肽相容。

从转基因动物纯化

一方面，从转基因非人哺乳动物纯化包含融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质。在一些实施方案中，包含融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质分泌到转基因非人哺乳动物的乳中。在一些实施方案中，多聚体蛋白质的两个或多个亚基各自融合到Fc结构域。在一些实施方案中，融合到Fc结构域的亚基分泌到相同或不同转基因非人哺乳动物的乳中。可以从转基因非人哺乳动物的乳中纯化包含融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质，使得包含融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质是基本纯的。在一些实施方案中，可以从相同或不同的转基因非哺乳动物的乳中纯化融合到Fc结构域的多聚体蛋白质的每个亚基，使得融合到Fc结构域的每个亚基基本上是纯的。在此类实施方案中，可以随后组合融合到Fc结构域的亚基。在一些实施方案中，基本上纯的包含基本上没有污染物。

一方面，从已经被修饰以表达包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质的乳腺上皮纯化包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质。可以从乳腺上皮细胞纯化包含融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质，使得包含融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质是基本纯的。在一些实施方案中，可以从相同或不同的乳腺上皮细胞纯化融合到Fc结构域的多聚体蛋白质的每个亚基，使得融合到Fc结构域的每个亚基基本纯的。在一些实施方案中，基本上纯的包含基本上没有污染物。

可以使用任何本领域已知的合适方式来纯化从转基因非人哺乳动物的乳中或从哺乳动物上皮细胞收获的包含融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质。在一些实施方案中，使用柱色谱来纯化包含融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质。柱色谱法是本领域公知的(关于通用色谱方法，例如参见Current Protocols in Essential LaboratoryTechniques Unit 6.2(2008))。在一些实施方案中，使用蛋白质-G/A亲和层析来纯化包含融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质(例如参见Carter(2011)Exp Cell Res 317:1261-1269)。在一些实施方案中，通过免疫沉淀反应来纯化包含融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质(例如参见Current Protocols in Cell Biology Unit 7.2(2001))。在一些实施方案中，使用特异性识别该多肽的抗体或其片段或者使用特异性识别Fc结构域的抗体或其片段来纯化包含融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质。

用于生产表达融合蛋白质的转基因动物的构建体

在一些实施方案中，为了生产含有用于通过核转移来生产转基因山羊的构建体(如编码融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质)的原代细胞系，可以用该构建体转染进入原代山羊皮肤表皮细胞，所述细胞是克隆扩大并且是充分表征的，以评估转基因拷贝数，转基因结构完整性和染色体整合位点。如本文所用，“核转移”指克隆方法，其中将来自供体细胞的核移植到去核卵母细胞中。

可以从任何合适的来源(包括通过筛选基因组材料或源自所选动物的反向翻译的信使RNA的文库)来获得，从诸如NCBI、Genbank的序列数据库来获得，或通过获得多肽的序列来获得感兴趣的蛋白质(例如包含融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质)的编码序列。可以将该序列克隆进入合适的质粒载体并在合适的宿主生物体(如大肠杆菌)中扩增。载体扩增后，可以切出DNA构建体，从载体的剩余部分纯化，和导入可用于生产转基因动物的表达载体中。转基因动物将具有整合到其基因组中的所需转基因蛋白质。

载体扩增后，也可以用适当的5'和3'控制序列切出DNA构建体，从载体的剩余部分纯化，和用于生产已经将所需的表达构建体整合到它们基因组中的转基因动物。反过来，对于一些载体，如酵母人工染色体(YACs)，没有必要从载体中除去组装的构建体；在这种情况下，扩增载体可以直接用于制备转基因动物。可以可操作地将编码序列连接到控制序列，该控制序列使编码序列能够在转基因非哺乳动物的乳中表达。

适合于将包含融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质生产引导到转基因动物的乳中的DNA序列可以携带衍生自天然来源的乳蛋白的5’启动子区域。因此，该启动子处于激素和组织特异性因子的控制之下，并且在哺乳乳腺组织中最为活跃。在一些实施方案中，该启动子是山羊beta酪蛋白启动子。可以将启动子可操作地连接到指导生产蛋白质前导序列的DNA序列，该前导序列指导转基因蛋白质穿过乳腺上皮到乳中。在一些实施方案中，可以将3’序列(其可以源于天然分泌的乳蛋白质)添加以改善mRNA的稳定性。

如本文所用，“前导序列”或“信号序列”是编码蛋白质分泌信号，并且当可操作地连接至编码转基因蛋白质的下游核酸分子时指导分泌的核酸序列。前导序列可以是天然人类的前导序列，人工衍生的前导序列，或可以获得自与用于引导转基因编码序列转录的启动子相同的基因，或获得自通常由细胞(如哺乳动物乳腺上皮细胞)分泌的另一种蛋白质。

在一些实施方案中，启动子是乳特异性启动子。如本文所用，“乳特异性启动子”是在将蛋白质分泌到乳中的细胞(例如乳腺上皮细胞)中天然指导基因表达的启动子，并例如包括酪蛋白启动子，如α-酪蛋白启动子(如alpha S-1酪蛋白启动子和alpha S2-酪蛋白启动子)，β-酪蛋白启动子(如山羊beta酪蛋白基因启动子(DiTullio,BIOTECHNOLOGY 10:74-77,1992)，γ-酪蛋白启动子，κ-酪蛋白启动子，乳清酸性蛋白(WAP)启动子(Gordon etal.,BIOTECHNOLOGY 5:1183-1187,1987)，β-乳球蛋白启动子(Clark et al.,BIOTECHNOLOGY 7:487-492,1989)和α-乳清蛋白启动子(Soulier et al.,FEBSLETTS.297:13,1992)。该定义中还包括的是在乳腺组织中特异性激活的启动子，如例如小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)的长末端重复(LTR)启动子。

如本文所用，当编码序列和调节序列以将编码序列的表达或转录置于调节序列的影响或控制下的方式共价连接时，编码序列和调节序列被称为“可操作地连接的”。为了将编码序列翻译成功能性蛋白质，编码序列可操作地连接到调节序列。如果5’调节序列中启动子的导入导致编码序列的导入并且如果两个DNA序列间的连接的性质并不(1)导致导入移码突变，(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应的RNA转录物翻译成蛋白质的能力，则两个DNA序列被称为可操作地连接。因此，如果启动子区域能够实现DNA序列的转录使得所得到的转录物可以被翻译成所需的蛋白质或多肽，则启动子区域可操作地连接至编码序列。

如本文所用，“载体”可以是多种核酸之任一种，其中可以通过限制和连接将所需序列插入载体，用于在不同遗传环境之间运输或用于在宿主细胞中表达。尽管RNA载体也是可用的，载体通常由DNA组成。载体包括但不限于质粒和噬菌粒。克隆载体是下述载体，其能够在宿主细胞中复制，并且可以通过一个或多个内切核酸酶限制性位点进一步表征，在所述内切核酸酶限制性位点处可以以可确定的方式切割载体并且可以对载体连接期望的DNA序列，使得新的重组载体保留其在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情况下，期望序列的复制可以随质粒在宿主细菌内在拷贝数上增加而发生多次，或者随宿主通过有丝分裂复制而每个宿主仅发生一次。在噬菌体的情况下，复制可以在溶解阶段期间主动发生，或者在溶原相期间被动地发生。表达载体是载体，其中可以通过限制和连接将所需的DNA序列插入载体，使得其是可操作地连接至调节序列并可以作为RNA转录物表达。载体可以进一步包含一个或多个适用于鉴定细胞的标志物序列，所述细胞已经或尚未用载体转化或转染。标志物例如包括编码增加或降低对抗生素或其他化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因，编码其活性可通过本领域已知的标准测定法检测的酶(例如β半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)的基因，以及可见地影响转化或转染细胞、宿主、集落或菌斑表型的基因。优选的载体是那些能够自主复制并表达存在于它们可操作连接的DNA区段中的结构基因产物的载体。

用于融合蛋白质生产的哺乳动物上皮细胞和转基因动物

一方面，本公开提供了表达包含一个或多个融合至Fc结构域的多肽的融合蛋白质的乳腺上皮细胞。在一些实施方案中，本公开提供了包含乳腺上皮细胞的转基因非人哺乳动物，所述乳腺上皮细胞表达包含一个或多个融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质。

一方面，本公开提供了生产包含一个或多个融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质的方法，其包括(a)用编码包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质的转基因DNA构建体转染非人哺乳动物细胞；(b)选择所述DNA构建体已经插入到细胞基因组中的细胞；以及(c)进行第一次核转移步骤以生产非人转基因哺乳动物，其对于包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质是杂合的，且能够在其乳中表达包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质。

一方面，本公开提供了以下方法：(a)提供非人转基因哺乳动物，其经工程化改造以表达包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质，(b)在非人转基因哺乳动物的乳中表达包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质；以及(c)分离乳中生产的包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质。

也可以根据本领域已知的方法产生转基因动物(例如参见美国专利号5,945,577)。适合转基因表达的动物包括但不限于山羊、绵羊、野牛、骆驼、牛、兔、猪、马、大鼠或美洲驼(llama)。合适的动物还包括牛、山羊、猪、啮齿动物和绵羊，其分别涉及牛、山羊、猪、大鼠和绵羊的各种物种。合适的动物也包括有蹄类动物。如本文所用，“有蹄类动物”是或涉及有蹄典型性草食四足哺乳动物，包括但不限于绵羊、山羊、牛和马。在一个实施方案中，通过用不同的构建体共转染原代细胞来产生动物。然后将这些细胞用于核转移。或者，如果使用显微注射来产生转基因动物，则可以注射构建体。

克隆将导致多种转基因动物--每个能够产生包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质或其他感兴趣的基因构建体。生产方法包括使用克隆的动物和这些动物的后代。在一些实施方案中，克隆的动物是山羊，牛。克隆还涵盖胚胎的核转移、核转移、组织器官移植和产生嵌合后代。

克隆过程的一个步骤包括将细胞的基因组转移到去核卵母细胞中，所述基因组含有编码包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质的转基因。如本文所用，“转基因”指通过技巧插入细胞或其祖先，并成为从该细胞发育的动物的基因组的一部分的的核酸分子的任何部分。此类转基因可以包括对转基因动物部分或完全外源(即异源)的基因，或可以表示与动物的内源基因具有同一性的基因。

卵母细胞的合适哺乳动物来源包括山羊、绵羊、牛、兔、豚鼠、仓鼠、大鼠、非人灵长类动物等。优选地，卵母细胞从有蹄类动物并且最优选从山羊和牛获得。分离卵母细胞的方法是本领域熟知的。基本上，该方法包括从哺乳动物(如山羊)的卵巢或生殖道分离卵母细胞。一种容易获得的有蹄类卵母细胞的来源是激素诱导的雌性动物。为了成功使用基因工程，核转移和克隆等技术，卵母细胞优选在这些细胞可以用作核转移的受体细胞前，以及在精子细胞受精以发育成胚胎之前体内成熟。已经成功地将已经在体内成熟的中期(metaphase)II期卵母细胞用于核转移技术。基本上，成熟的中期II卵母细胞是从发情后几个小时或在注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)或类似激素后的非超级排卵或超排卵动物手术收集的。

用于预测在乳腺中表达的重组蛋白的数量和质量的工具之一是通过泌乳的诱导(Ebert KM,1994)。诱导的泌乳允许对转基因生产的早期(而不是至少1年后的从妊娠引起的第一次天然泌乳)的蛋白质的表达和分析。泌乳的诱导可以通过激素或手动进行。

在一些实施方案中，根据本文提供的方法生产的融合蛋白质的组合物还包括乳。在一些实施方案中，本文提供的方法包括从转基因动物的乳中分离融合蛋白质的步骤(参见例如Pollock et al.,Journal of Immunological Methods,231卷,1-2期,1999年10月10日,第147-157页)。

因此，一方面，本公开提供了生产包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质的乳腺上皮细胞和转基因非人哺乳动物。根据本发明方面的乳腺上皮细胞和转基因非哺乳动物表达编码包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质的核酸序列。

融合蛋白质的生产

一方面，如本文中描述在转基因非人哺乳动物中或在乳腺上皮细胞中生产的包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质相较于通过其他方法生产的相同的融合蛋白质具有改变的特性。例如，如本文描述的方法生产的融合蛋白质相较于通过其他方法生产的融合蛋白质可以显示出增加的半衰期和/或稳定性。如本文描述生产的融合蛋白质相较于通过其他方法生产的融合蛋白质还可以显示出降低的免疫原性。

一方面，本公开提供了重组或转基因生产的包含一种或多种融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质和包含此类蛋白质的组合物，其中所述融合蛋白质展示糖基化和/或唾液酸化。例如，与通过其他方法(包括其他重组方法)生产的相同的蛋白质相比，使用本文描述的方法生产的融合蛋白质可以显示可比较的或更高水平的糖基化和/或唾液酸化。

例如，在一些实施方案中，当与不在乳腺上皮细胞中产生的相同的蛋白质相比较时，在非人哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生的包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质可以具有增高水平的糖基化和/或唾液酸化。在一些实施方案中，不在乳腺上皮细胞中产生的融合蛋白质在细胞培养物中产生。如本文所用，当与在乳腺上皮细胞中产生的融合蛋白质相比较时，“在细胞培养物中产生”指在标准生产细胞系((例如CHO细胞或杆状病毒-Sf9细胞)但排除哺乳动物上皮细胞)中产生的融合蛋白质。

在一些实施方案中，如上的方法还包括诱导泌乳的步骤。在另一些实施方案中，所述方法还包括额外的分离和/或纯化步骤。在其他实施方案中，所述方法还包括比较在细胞培养物(如非哺乳动物细胞培养物)中产生的融合蛋白质的糖基化模式的步骤。在进一步的实施方案中，所述方法还包括将所获得的融合蛋白质的糖基化模式与通过非哺乳动物上皮细胞产生的融合蛋白质相比较的步骤。此类细胞可以是细胞培养物的细胞。用于评估融合蛋白质的糖基化模式的实验技术是本领域普通技术人员已知的。此类技术例如包括液相色谱质谱，串联质谱，和Westen印迹分析。

一方面，本文公开的包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质是通过在转基因非人哺乳动物中或在哺乳动物上皮细胞中产生包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质来生成。在一些实施方案中，增加包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质的唾液酸化水平可以是有利的。例如可以通过将融合蛋白质进行唾液酸转移酶处理来增加包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质的唾液酸化水平。可以在体外或体内将包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质进行唾液酸转移酶处理。可以通过将融合蛋白质受到唾液酸转移酶和合适的糖基底物，在体外对包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质唾液酸化。可以通过在乳腺或哺乳动物上皮细胞中生产唾液酸转移酶来在体内对包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质唾液酸化。

一方面，本公开提供了在转基因动物的乳腺和哺乳动物上皮细胞中生产具有增加的alpha-2,6-唾液酸化水平的融合蛋白质的方法，所述融合蛋白质包含一种或多种融合到Fc结构域的多肽。在一些实施方案中，展示增加的唾液酸化的融合蛋白质可以展示增加的抗炎性质。

一方面，本公开提供了转基因动物(和哺乳动物上皮细胞)，其对于乳腺中包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质的生产是转基因的，并且对于唾液酸转移酶的生产是转基因的。通过此类动物和细胞生产的包含一种或多种融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质预期具有增加水平的末端alpha-2,6-唾液酸连接。在一些实施方案中，转基因动物(和哺乳动物上皮细胞)对于乳腺中包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质的生产是转基因的，并且对于唾液酸转移酶的生产是转基因的。

一方面，本公开提供了治疗受试者的方法，其包括向受试者施用具有增加水平的末端alpha-2,6-唾液酸连接的包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质。

在一些实施方案中，可以通过从如本文提供的那样生产的转基因动物的乳或从所述转基因动物的后代中收获包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质来获得包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质。在一些实施方案中，通过转基因动物生产的包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质以每升生产的乳中至少1克，优选地每升生产的乳中至少2、3、4克，以及优选地每升生产的乳中至少5克的水平生产。

例如，在一些实施方案中，本文描述的方法允许每升中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70克的生产。

组合物

在一些方面中，本公开提供了包含药学组合物在内的组合物，所述药学组合物含有包含一种或多种融合到Fc结构域的多肽的融合蛋白质和药学上可接受的媒介物、稀释剂或载体。在一些实施方案中，所述组合物包含乳。

在一些实施方案中，所提供的组合物用于体内应用。取决于预期的体内施用模式，所使用的组合物可以是以下剂型：固体，半固体或液体，如片剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、凝胶剂、软膏剂、液体、悬浮剂等。优选地，组合物以适合于单次施用精确剂量的单位剂型施用。根据所需的制剂，组合物还可以包括药学上可接受的载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制用于动物或人类施用的药物组合物的水性媒介物。选择稀释剂以不影响感兴趣的人重组蛋白质的生物活性。此类稀释剂的实例为蒸馏水、生理盐水、林格溶液(Ringer'ssolution)、葡萄糖溶液，和汉克氏溶液(Hank's solution)。可以使用相同的稀释剂来重建感兴趣的冻干重组蛋白。另外，药物组合物还可以包括其它药剂(medicinal agents)，药物，载体，佐剂，无毒、非治疗、非免疫原性稳定剂等。此类稀释剂或载体的有效量是在组分的溶解度、生物活性等方面获得药学上可接受的制剂有效的量。在一些实施方案中，本文提供的组合物是无菌的。

体内治疗期间的施用可以通过任何数量的途径，包括口服、胃肠外、肌内、鼻内、舌下、气管内、吸入、眼、阴道，和直肠。还可以使用囊内、静脉，和腹腔施用途径。本领域技术人员认识到，施用途径根据所需的应答而变化。例如，可以向受试者经由口服，肠胃外或局部施用来施用本文的组合物。在一个实施方案中，通过静脉内输注施用本文的组合物。

当需要全身递送时，可以将组合物配制成通过注射(例如通过推注或连续输注)胃肠外给药。用于注射的制剂可以以单位剂型呈现，例如在具有加入防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物可以采取在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。

用于肠胃外施用的药物制剂包括水可溶形式中的活性组合物的水溶液。此外，可以将活性组合物的悬浮液制备为合适的油性注射悬液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯，或甘油三酯，或脂质体。含水注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇，或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有增加组合物的溶解度以允许制备高度浓缩溶液的合适的稳定剂或药剂。或者，活性组合物可以是粉末形式，用于在使用前用合适的载体(例如无菌无热原水)构成。

对于口服施用，药物组合物可以采取通过常规手段用药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊的形式，所述赋形剂诸如结合剂(如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙甲基纤维素)；填充剂(如乳糖，微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(如硬脂酸镁，滑石或二氧化硅)；崩解剂(如马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)；或润湿剂(如月桂基硫酸钠)。片剂可以通过本领域熟知的方法进行包衣。用于口服施用的液体制剂可以采用例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或者它们可以在使用前呈现为用水或其他合适的载体构建的干燥产品。可以通过用药学上可接受的添加剂通过常规手段制备此类液体制剂，所述添加剂诸如悬浮剂(如山梨醇糖浆，纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(如杏仁油，油酯，乙醇或分馏的植物油)；和防腐剂(如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。所述制剂还可以在适当时含有缓冲盐(buffer salts)、风味剂(flavoring)、着色剂和甜味剂。

组分可以是化学修饰的使得口服递送是有效的。通常，预期的化学修饰是附接至少一个分子，其中所述分子允许(a)抑制蛋白水解；和(b)从胃或肠吸收到血液中。还期望的是整体稳定性的增加和体内循环时间的增加。此类分子的实例包括：聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowskiand Davis,1981,"Soluble Polymer-Enzyme Adducts"于:Enzymes as Drugs,Hocenbergand Roberts,eds.,Wiley-Interscience,New York,NY,pp.367-383；Newmark,et al.,1982,J.Appl.Biochem.4:185-189。可以使用的其他聚合物为聚-1,3-二氧戊环和聚-1,3,6-三氧杂环戊烷(tioxocane)。如上所述，药物用途优先的是聚乙二醇分子。对于口服组合物，释放的位置可以是胃、小肠(十二指肠，空肠或回肠)或大肠。本领域技术人员可获得不会在胃中溶解，而是会在十二指肠或肠内其他部位释放物质的制剂。优选地，通过保护生物活性物质或通过在胃环境以外(如肠内)释放生物学活性材料将避免对胃部环境的有害影响。对于口腔给药，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

组合物也可以配制成直肠或阴道组合物，例如栓剂或保留灌肠(retentionenemas)，如含有常规栓剂基质如可可脂或其它甘油酯。

药物组合物还可以包含合适的固相或凝胶相载体或赋形剂。此类载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶，和聚合物如聚乙二醇。

合适的液体或固体药物制剂形式例如是，用于吸入的水性或盐溶液，微囊化，encochleated，涂覆到微观金颗粒上，包含在脂质体，雾化的，气溶胶中，用于植入皮肤的颗粒，或干燥到锋利的物体上用于刮入皮肤。药物组合物还包括颗粒剂、粉剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆、乳剂、悬浮剂、霜剂、滴剂或长时间释放活性组合物的制剂，在该制剂中赋形剂和添加剂和/或助剂(如崩解剂、粘合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、风味剂、甜味剂或增溶剂)通常如上所述使用。药物组合物适用于各种药物递送系统。为了药物递送方法的简要综述，参见Langer,Science249:1527-1533,1990，其通过引用并入本文。

治疗剂可以本身(纯的)或药学上可接受的盐的形式施用。当用于药物时，盐应当是药学上可接受的，但非药学上可接受的盐可以方便地用于制备其药学上可接受的盐。此类盐包括但不限于由以下酸制备的那些：盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，马来酸，乙酸，水杨酸，对甲苯磺酸，酒石酸，柠檬酸，甲磺酸，甲酸，丙二酸，琥珀酸，萘-2-磺酸，和苯磺酸。此外，这些盐可以制备为碱金属或碱土金属盐，如羧酸基团的钠，钾或钙盐。

合适的缓冲剂包括：乙酸和盐(1-2％w/v)；柠檬酸和盐(1-3％w/v)；硼酸和盐(0.5-2.5％w/v)；以及磷酸和盐(0.8-2％w/v)。合适的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03％w/v)；氯丁醇(0.3-0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25％w/v)和硫柳汞(0.004-0.02％w/v)。

本公开的药物组合物包含有效量的包含融合至Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质以及任选地包含在药学上可接受的载体中的治疗剂。术语药学上可接受的载体意指适用于人或其他脊椎动物施用的一种或多种相容的固体或液体填充剂，稀释剂或包封物质。术语载体指与活性成分组合以促进应用的天然或合成的有机或无机成分。药物组合物的组分也能够以使得不存在将显著损害所需药物效率的相互作用的方式与本公开的组合物混合，以及彼此之间混合，

在一些实施方案中，可以在颗粒中提供包括融合蛋白质的治疗剂。如本文所用的颗粒是指纳米颗粒或微粒(或在某些情况下更大)，其能够全部或部分由治疗剂组成，或者能够包括其他额外的治疗剂。除了治疗剂之外，颗粒可以包括药学和医学领域常规使用的任何材料，包括但不限于可侵蚀，不可侵蚀，可生物降解或不可生物降解的材料或其组合。颗粒可以是在溶液中或半固体状态含有治疗剂的微胶囊。颗粒可以是任何形状。

除非本文另有定义，与本公开有关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括多项，复数词应包括单数。本公开的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行。通常，本文所述的与生物化学，酶学，分子和细胞生物学，微生物学，遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的命名法和技术是本领域公知和常用的。除非另有说明，本公开的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法进行，并且如在本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的。

通过以下实施例进一步说明本发明，其实际上不应被解释为进一步的限制。在整个申请中引用的所有参考文献(包括文献参考文献，已发表的专利申请和共同未决专利申请)的全部内容特别地通过引用并入本文，特别是对于上文所引用的教导。然而，任何参考文献的引用并不意味着承认参考文献是现有技术。

实施例

实施例1：产生eCG的转基因小鼠的生产

生产了转基因小鼠，所述转基因小鼠在其基因组中包括编码eCG的α和β亚基的核酸序列。使用传统显微注射技术来生产产生eCG的小鼠。基于公开的氨基酸序列合成编码eCG的α和β亚基的cDNA。将这些DNA序列连接入表达载体。在这些质粒中，编码eCG的核酸序列在促进小鼠乳腺中eCG表达的启动子的控制之下。去除原核序列并且将DNA显微注射入小鼠的植入前胚胎。然后将这些胚胎转移到假妊娠雌性。对产生的后代筛选出转基因的存在。将那些携带eCG的α和β亚基两者的转基因的后代鉴定为建立者。

当年龄适当时，繁殖建立者动物以产生F1后代。妊娠和分娩后，对小鼠挤奶。如表1所示，使用PMSG(eCG)ELISA试剂盒(DRG International)定量转基因小鼠乳中eCG的生产。当适合产生F2小鼠的龄时，培育出高表达eCG的F1小鼠。

表1：小鼠中eCG的转基因表达

实施例2：产生eCG的转基因ST6小鼠的产生

为了增加转基因小鼠中生产的eCG的α和β亚基的唾液酸化水平，将实施例1中描述的表达eCG的小鼠与用于生产唾液酸转移酶(ST)的转基因小鼠相杂交。如表2所示，生产eCG的转基因小鼠与生产ST3Gal6的转基因小鼠的初始杂交导致具有eCG和ST3Gal6转基因两者的24只后代小鼠。当年龄适当时，繁殖这些小鼠。妊娠和分娩后，对它们取奶并且表征了动物乳中产生的eCG。

表2：杂交的eCG-和ST-产生小鼠的产生

	eCG	-
			ST	24(7雄性,17雌性)	22(9雄性,13雌性)
-	22(9雄性,13雌性)	21

实施例3：eCG-Fc融合物的产生和表达

为了增加转基因生产的eCG的半衰期，生产了构建体，该构建体中eCG亚基都是在C末端与人IgG1Fc序列融合(图1A-1D)。将构建体独立地或一起转染到293组织培养细胞中。收集来自转染细胞的上清液，并通过ELISA分析eCG产生，如表3所示。

表3：293细胞上清液中eCG-Fc融合物的瞬时表达

还从转染的细胞中收集上清液和细胞裂解物，并通过Western印迹法分析，如图2所示。用抗Fc一抗探测样品。在表达融合到Fc区域的一个亚基或两个亚基的细胞的上清液中通过Western印迹检测到eCG亚基(道8,9,和10)，但在没有Fc融合物的情况下表达eCG亚基的细胞上清液中未检测到eCG亚基(道11)。

图1C中描绘的序列对应于SEQ ID NOs:3和4，其对应于以下序列：

SEQ ID NO:3:

MDYYRKHAAVILATLSVFLHILHSFPDGEFTTQDCPECKLRENKYFFKLGVPIYQCKGCCFSRAYPTPARSRKTMLVPKNITSESTCCVAKAFIRVTVMGNIKLENHTQCYCSTCYHHKIGGGGSGGGGSGGGGSKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:4:

ATGGACTACTACAGAAAGCACGCCGCCGTGATCCTGGCTACCCTGTCCGTGTTTCTGCACATCCTGCACAGCTTCCCCGACGGCGAGTTCACAACCCAGGACTGCCCTGAGTGCAAGCTGAGAGAGAACAAGTACTTCTTCAAGCTGGGCGTGCCCATCTACCAGTGCAAGGGCTGCTGCTTCAGCAGGGCCTACCCTACCCCCGCCAGATCCAGAAAGACCATGCTGGTGCCCAAGAACATCACCAGCGAGAGCACCTGTTGCGTGGCCAAGGCCTTCATCAGATGGACCGTGATGGGCAACATCAAGCTGGAAAACCACACCCAGTGCTACTGCTCTACCTGCTACCACCACAAGATCGGCGGAGGCGGAAGTGGCGGCGGAGGATCTGGGGGAGGCGGATCTAAGACCCACACCTGTCCTCCCTGTCCCGCCCCTGAACTGCTGGGAGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCTCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCCCCCAGCAGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAATAATGA

图1D中描绘的序列对应于SEQ ID NOs:5和6，其对应于以下序列：

SEQ ID NO:5:

METLQGLLLWMLLSVGGVWASRGPLRPLCRPINATLAAEKEACPICITFTTSICAGYCPSMVRVMPAALPAIPQPVCTYRELRFASIRLPGCPPGVDPMVSFPVALSCHCGPCQIKTTDCGVFRDQPLACAPQASSSSKDPPSQPLTSTSTPTPGASRRSSHPLPIKTSGGGGSGGGGSGGGGSKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:6:

ATGGAAACACTGCAGGGCCTGCTGCTGTGGATGCTGCTGTCTGTGGGCGGAGTGTGGGCCAGCAGAGGACCTCTGAGGCCCCTGTGCAGACCCATCAATGCCACACTGGCCGCCGAGAAAGAGGCCTGCCCTATCTGCATCACCTTCACCACCAGCATCTGCGCCGGCTACTGCCCTTCTATGGTGCGCGTGATGCCTGCCGCCCTGCCTGCTATTCCTCAGCCCGTGTGCACCTACAGAGAGCTGAGATTCGCCAGCATCAGGCTGCCCGGATGTCCTCCTGGCGTGGACCCCATGGTGTCTTTCCCTGTGGCCCTGTCTTGCCACTGCGGCCCCTGCCAGATCAAGACCACCGACTGTGGCGTGTTCAGGGACCAGCCTCTGGCCTGCGCTCCACAAGCCAGCAGCAGCTCTAAGGACCCCCCTAGCCAGCCCCTGACCAGCACCTCTACACCTACACCTGGCGCCTCCAGAAGAAGCAGCCACCCCCTGCCCATCAAAACCTCTGCGGCGGAGGATCTGGGGGAGGCGGAAGCGGAGGGGGCGGATCTAAGACCCACACCTGTCCTCCATGCCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCTCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCTCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCCCCCAGCAGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACACCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAAGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAATAA

实施例4：产生eCG-Fc融合蛋白质的转基因小鼠的产生

生成了其中两个eCG亚基在C末端与人IgG1序列的Fc部分融合的构建体(图1A-1D)。使用传统显微注射技术生成产生eCG-Fc融合蛋白质的小鼠。制备了编码融合到人IgG1Fc序列的α亚基以及融合到人IgG1Fc序列的β亚基的合成的DNA。将该融合的序列连接入表达载体。在这些质粒中，编码eCG亚基-Fc融合蛋白质的核酸序列在促进小鼠乳腺中eCG亚基-Fc融合蛋白质表达的启动子的控制之下。去除原核序列并且将DNA显微注射入小鼠的植入前胚胎。然后将这些胚胎转移到假妊娠雌性。对得到的后代筛选eCGα-Fc和eCGβ-Fc融合转基因两者的存在。14只小鼠被鉴定出携带两种融合蛋白质；两只小鼠被鉴定出仅携带eCGα-Fc融合转基因，并且三只小鼠被鉴定为仅携带eCGβ-Fc融合转基因。

当年龄适当时，繁殖建立者动物以产生F1后代。妊娠和分娩后，对小鼠挤奶。通过使用抗Fc一抗的Western印迹和Ponceau S蛋白染色来分析转基因小鼠乳中eCG-Fc融合物的生产，如图2-6中所示。如图7所示，还通过使用抗Fc一抗和抗eCG一抗的Western印迹分析了来自转基因小鼠的乳。图7揭示了转基因小鼠的乳中，相较于不融合到Fc的eCG，融合到Fc的eCG显示出增加的稳定性。

如表4和图8所示，取决于遗传背景和转基因的表达水平，在小鼠中观察到不同的表型。

表4：生产eCG-Fc的转基因小鼠的表型

实施例5：转基因山羊中的eCG-Fc表达

生成了表达编码融合到人IgG1Fc序列的一种或多种eCG亚基的核酸序列的转基因山羊(图1A-1D)。使用传统的显微注射技术生成产生一个或两个eCG亚基-Fc融合蛋白质的山羊。将该融合的序列连接入表达载体。在这些质粒中，编码eCG亚基-Fc融合蛋白质的核酸序列在促进山羊乳腺中eCG亚基-Fc融合蛋白质表达的启动子的控制之下。去除原核序列并且将DNA显微注射入山羊的植入前胚胎。然后将这些胚胎转移到假妊娠雌性。对所得的后代筛选eCG亚基-Fc转基因之一或两者的存在。

当年龄适当时，繁殖建立者动物。妊娠和分娩后，对山羊挤奶。分析了eCG-Fc融合蛋白质的生产，并且从转基因动物的乳中纯化了eCG-Fc融合蛋白质。

等同方案

本领域技术人员将认识到本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物或能够仅仅使用常规实验来确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在被所附权利要求所涵盖。包括专利文献在内的所有参考文献通过引用以其整体并入本文。

序列表

<110> 法国化学与生物科技实验室

Biotechnologies

生物资源股份有限公司

<120> FC融合蛋白质的转基因生产

<130> L0719.70008WO00

<140> 尚未指定

<141> 2016-05-04

<150> US 62/156,879

<151> 2015-05-04

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 1

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

1 5 10 15

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

20 25 30

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

35 40 45

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

50 55 60

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

65 70 75 80

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

85 90 95

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

100 105 110

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

115 120 125

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

130 135 140

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

145 150 155 160

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

165 170 175

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

180 185 190

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

195 200 205

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

210 215 220

Gly Lys

225

<210> 2

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 2

aagacccaca cctgtcctcc ctgtcccgcc cctgaactgc tgggaggccc tagcgtgttc 60

ctgttccccc caaagcccaa ggacaccctg atgatcagca ggacccccga agtgacctgc 120

gtggtggtgg atgtgtctca cgaggaccct gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc 180

gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagccc agagaggaac agtacaacag cacctacagg 240

gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc 300

aaggtgtcca acaaggccct gcctgccccc atcgaaaaga ccatcagcaa ggccaagggc 360

cagcccaggg aaccccaggt gtacacactg ccccccagca gggatgagct gaccaagaac 420

caggtgtccc tgacctgtct cgtgaagggc ttctacccct ccgatatcgc cgtggaatgg 480

gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccctgtgct ggacagcgac 540

ggctcattct tcctgtacag caagctgaca gtggacaaga gcagatggca gcagggcaac 600

gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 660

agcctgagcc ccggcaaata atga 684

<210> 3

<211> 361

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 3

Met Asp Tyr Tyr Arg Lys His Ala Ala Val Ile Leu Ala Thr Leu Ser

1 5 10 15

Val Phe Leu His Ile Leu His Ser Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Thr

20 25 30

Gln Asp Cys Pro Glu Cys Lys Leu Arg Glu Asn Lys Tyr Phe Phe Lys

35 40 45

Leu Gly Val Pro Ile Tyr Gln Cys Lys Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala

50 55 60

Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Arg Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn

65 70 75 80

Ile Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ala Phe Ile Arg Val

85 90 95

Thr Val Met Gly Asn Ile Lys Leu Glu Asn His Thr Gln Cys Tyr Cys

100 105 110

Ser Thr Cys Tyr His His Lys Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

130 135 140

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

145 150 155 160

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

165 170 175

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

180 185 190

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

195 200 205

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

210 215 220

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

225 230 235 240

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

245 250 255

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

260 265 270

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

275 280 285

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

290 295 300

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

305 310 315 320

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

325 330 335

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

340 345 350

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

355 360

<210> 4

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 4

atggactact acagaaagca cgccgccgtg atcctggcta ccctgtccgt gtttctgcac 60

atcctgcaca gcttccccga cggcgagttc acaacccagg actgccctga gtgcaagctg 120

agagagaaca agtacttctt caagctgggc gtgcccatct accagtgcaa gggctgctgc 180

ttcagcaggg cctaccctac ccccgccaga tccagaaaga ccatgctggt gcccaagaac 240

atcaccagcg agagcacctg ttgcgtggcc aaggccttca tcagatggac cgtgatgggc 300

aacatcaagc tggaaaacca cacccagtgc tactgctcta cctgctacca ccacaagatc 360

ggcggaggcg gaagtggcgg cggaggatct gggggaggcg gatctaagac ccacacctgt 420

cctccctgtc ccgcccctga actgctggga ggccctagcg tgttcctgtt ccccccaaag 480

cccaaggaca ccctgatgat cagcaggacc cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg 540

tctcacgagg accctgaagt gaagttcaat tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac 600

gccaagacca agcccagaga ggaacagtac aacagcacct acagggtggt gtccgtgctg 660

accgtgctgc accaggattg gctgaacggc aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag 720

gccctgcctg cccccatcga aaagaccatc agcaaggcca agggccagcc cagggaaccc 780

caggtgtaca cactgccccc cagcagggat gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc 840

tgtctcgtga agggcttcta cccctccgat atcgccgtgg aatgggagag caacggccag 900

cccgagaaca actacaagac caccccccct gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg 960

tacagcaagc tgacagtgga caagagcaga tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc 1020

gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaagt ccctgagcct gagccccggc 1080

aaataatga 1089

<210> 5

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 5

Met Glu Thr Leu Gln Gly Leu Leu Leu Trp Met Leu Leu Ser Val Gly

1 5 10 15

Gly Val Trp Ala Ser Arg Gly Pro Leu Arg Pro Leu Cys Arg Pro Ile

20 25 30

Asn Ala Thr Leu Ala Ala Glu Lys Glu Ala Cys Pro Ile Cys Ile Thr

35 40 45

Phe Thr Thr Ser Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Ser Met Val Arg Val

50 55 60

Met Pro Ala Ala Leu Pro Ala Ile Pro Gln Pro Val Cys Thr Tyr Arg

65 70 75 80

Glu Leu Arg Phe Ala Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Pro Gly Val

85 90 95

Asp Pro Met Val Ser Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys His Cys Gly Pro

100 105 110

Cys Gln Ile Lys Thr Thr Asp Cys Gly Val Phe Arg Asp Gln Pro Leu

115 120 125

Ala Cys Ala Pro Gln Ala Ser Ser Ser Ser Lys Asp Pro Pro Ser Gln

130 135 140

Pro Leu Thr Ser Thr Ser Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Arg Arg Ser

145 150 155 160

Ser His Pro Leu Pro Ile Lys Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

165 170 175

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

180 185 190

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

195 200 205

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

210 215 220

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

225 230 235 240

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

245 250 255

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

260 265 270

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

275 280 285

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

290 295 300

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

305 310 315 320

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

325 330 335

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

340 345 350

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

355 360 365

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

370 375 380

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

385 390 395 400

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

405 410

<210> 6

<211> 1232

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 6

atggaaacac tgcagggcct gctgctgtgg atgctgctgt ctgtgggcgg agtgtgggcc 60

agcagaggac ctctgaggcc cctgtgcaga cccatcaatg ccacactggc cgccgagaaa 120

gaggcctgcc ctatctgcat caccttcacc accagcatct gcgccggcta ctgcccttct 180

atggtgcgcg tgatgcctgc cgccctgcct gctattcctc agcccgtgtg cacctacaga 240

gagctgagat tcgccagcat caggctgccc ggatgtcctc ctggcgtgga ccccatggtg 300

tctttccctg tggccctgtc ttgccactgc ggcccctgcc agatcaagac caccgactgt 360

ggcgtgttca gggaccagcc tctggcctgc gctccacaag ccagcagcag ctctaaggac 420

ccccctagcc agcccctgac cagcacctct acacctacac ctggcgcctc cagaagaagc 480

agccaccccc tgcccatcaa aacctctgcg gcggaggatc tgggggaggc ggaagcggag 540

ggggcggatc taagacccac acctgtcctc catgccctgc ccctgaactg ctgggcggac 600

ctagcgtgtt cctgttcccc ccaaagccca aggacaccct gatgatcagc aggacccccg 660

aagtgacctg cgtggtggtg gatgtgtctc acgaggaccc tgaagtgaag ttcaattggt 720

acgtggacgg cgtggaagtg cacaacgcca agaccaagcc cagagaggaa cagtacaaca 780

gcacctaccg cgtggtgtcc gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg aacggcaaag 840

agtacaagtg caaggtgtcc aacaaggccc tgcccgctcc catcgaaaag accatcagca 900

aggccaaggg ccagcccagg gaaccccagg tgtacacact gccccccagc agggatgagc 960

tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgtc tcgtgaaggg cttctacccc tccgatatcg 1020

ccgtggaatg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta caagaccaca ccccccgtgc 1080

tggacagcga cggctcattc ttcctgtaca gcaagctgac agtggacaag agcagatggc 1140

agcagggcaa cgtgttcagc tgcagcgtga tgcacgaagc cctgcacaac cactacaccc 1200

agaagtccct gagcctgagc cccggcaaat aa 1232

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 7

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Claims (20)

1.方法，其包括：

提供转基因非人哺乳动物，其已经被修饰以在乳腺中表达包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质，并且

从由所述转基因非人哺乳动物的乳腺生产的乳中收获所述融合蛋白质。

2.权利要求1的方法，其中所述Fc结构域是人IgG1 Fc结构域。

3.权利要求1或2的方法，其中所述Fc结构域的序列包含SEQ ID NO:1。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述融合蛋白质包含超过一个亚基，并且其中所述亚基在同一转基因非人哺乳动物中生产。

5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述融合蛋白质包含超过一个亚基，并且其中所述亚基在不同转基因非人哺乳动物中生产。

6.权利要求5的方法，其中在不同的转基因非哺乳动物中生产后，组合所述亚基。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述转基因非人哺乳动物是牛、猪、山羊、绵羊或啮齿动物。

8.权利要求7的方法，其中所述转基因非人哺乳动物是山羊。

9.权利要求7的方法，其中所述转基因非人哺乳动物是兔。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述转基因非人哺乳动物已经被工程化以重组表达唾液酸转移酶，使得在所述哺乳动物中生产的融合蛋白质相较于在不表达唾液酸转移酶的转基因非人哺乳动物中生产的融合蛋白质而言具有增加的唾液酸化。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述融合蛋白质包含在所述多肽和所述Fc结构域之间的接头区。

12.组合物，其包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质，并还包含乳。

13.权利要求12的组合物，其还包含药学上可接受的载体。

14.转基因非人哺乳动物，其已经被修饰以表达融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质。

15.权利要求14的转基因非人哺乳动物，其中所述转基因非人哺乳动物已经被修饰以表达唾液酸转移酶。

16.权利要求14或15的转基因非人哺乳动物，其中所述转基因非人哺乳动物是牛、猪、山羊、绵羊或啮齿动物。

17.权利要求16的转基因非人哺乳动物，其中所述转基因非人哺乳动物是山羊。

18.权利要求16的转基因非人哺乳动物，其中所述转基因非人哺乳动物是兔。

19.方法，其包括：

向受试者施用有效量的转基因生产的包含融合到Fc结构域的一种或多种多肽的融合蛋白质。

20.权利要求19的方法，其中所述受试者是人或非人哺乳动物。