CN110267674A - 包含瘦素的融合蛋白及其生产和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种融合蛋白，包含瘦素和与第二种蛋白。第二种蛋白的存在可以增加体内的生物活性和/或延长半衰期。本发明还提供了与肽、抗体或抗体片段融合的人、犬、猫瘦素分子，增强了瘦素分子透过血脑屏障(BBB)运输的能力。本发明还进一步提供了一种融合蛋白，包含一种肽激动剂，该肽激动剂能够结合并刺激GLP‑1受体、胰高血糖素受体和GIP受体等三种受体中的一种、两种或者全部。本发明还公开了一种通过重组技术生产此类融合蛋白的方法。本发明还公开了一种药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的融合蛋白，以及使用该药物组合物治疗狗、猫和人疾病的方法。

Description

包含瘦素的融合蛋白及其生产和使用方法
相关申请的交叉援引
本申请要求2016年7月8日提交的编号为62/360,271的美国临时申请作为优先权，并将其全部内容援引于本申请中。
技术领域
本发明涉及一种融合(即嵌合)蛋白，包含抗体或其片段和瘦素蛋白。本发明还涉及包含该融合蛋白的药物组合及其制备和使用方法。特别地，本发明涉及Fc区域和包含免疫球蛋白的瘦素(“瘦蛋白”)融合蛋白的制备和应用。
背景技术
宠物的代谢紊乱与一些重要的生理紊乱有关，如糖尿病、高血压、心脏病和某些类型的癌症以及其他代谢紊乱相关的疾病。例如，仅在美国，据估计约有52.7％或约4380万只狗超重或肥胖，其中大约有17.6％或约1390万只狗被判定为肥胖。此外，在美国估计约有57.9％或约5500万只猫超重或肥胖，其中大约有28.1％或约2620万只猫被判定为肥胖。越来越多的迹象表明，在美国以及世界各地，肥胖已成为家庭伴侣动物的严重健康问题。
肥胖是一种多因素表型，它可以是生理、心理、遗传和环境等多种因素共同作用的结果。与肥胖相关的一个特殊因素是肥胖(ob)基因，该基因已被成功克隆。
在正常小鼠中，ob基因编码一种叫做瘦素的激素。瘦素通过与其受体结合发挥功能，该受体具有细胞质结构域，能够进行信号转导。通过受体-激素机制，脂肪组织向血液中释放瘦素来告知大脑能量储存的状态，瘦素在血液中穿过血脑屏障到达下丘脑的瘦素受体。当大脑接收能量存储信息后，通过减少食物摄入和/或增加能量消耗来进行相应地调整。
病理状态(即病态的老鼠，ob/ob纯合子)即肥胖小鼠，具有两个突变的ob等位基因纯合子。突变等位基因产生缩短的瘦素，这类瘦素不具备功能，可能会在体内迅速降解。具有两个突变ob等位基因(ob/ob Mice)的小鼠，缺乏功能性瘦素，导致嗜睡、体温过低、高血糖、高胰岛素和不育。在人类中，虽然大多数肥胖患者报告有高水平的循环瘦素，但缺乏瘦素发挥功能的证据，并显示体重显著增加和出现肥胖相关性疾病。
通常认为，重组瘦素可以缓解ob/ob小鼠由于缺乏瘦素所导致的代谢紊乱及相关的各种症状。例如，有研究表明，每天腹腔注射瘦素可以降低ob/ob小鼠的摄食量、体重、体脂率、血糖和胰岛素浓度。此外，服用瘦素还能提高代谢率、体温和运动能力，而这些都需要消耗能量。研究还表明，瘦素治疗可以降低体重、摄食量和体脂率。正常小鼠在瘦素治疗中也可获益。其他研究也表明，重组瘦素也可用于改善雌性和雄性ob/ob小鼠的不育症。
据估计，大约5-10％的肥胖人群对瘦素治疗敏感。不幸的是，目前的瘦素治疗需要每天进行多次注射，且需要高剂量的瘦素才能达到预期的临床效果。例如，在最近的临床试验中，一些受试者需要每天注射三次高剂量的瘦素，持续给药六个月才能观察到药效。由于低剂量的瘦素相对无效和/或相对较短的血清半衰期，所以认为高剂量和较长的治疗时间是必需的，除此之外没有任何理论限制。因此，人们认为使用天然瘦素需要频繁地大剂量给药。
这一发现也与ob/ob小鼠实验的观察结果一致，ob/ob小鼠需要在腹腔内注射5-20mg/kg/day的瘦素，经过较长时间的给药体重才会显著下降。在ob/ob小鼠中实现瘦素所需的血浆浓度以克服瘦素的这种缺点(即效力低和/或半衰期短)的一种方法，需要连续皮下注射400ng/hr的瘦素。
同样，不受任何理论限制的是，瘦素的大小、制备方法等内在特征似乎是瘦素在肥胖治疗中应用不足的原因之一。例如，瘦素的分子量约为16kD，小到足以被肾脏过滤清除。为了弥补体内瘦素相对较短的血清半衰期，需要给予相对较大的剂量。
此外，利用细菌制备较小的蛋白分子如瘦素，可能会较为困难和具有不确定性。在某些情况下，使用大肠杆菌生产小分子蛋白质如瘦素，可能会导致蛋白以不溶性包涵体的形式产生。为了从包涵体中获取蛋白，通常需要使用变性剂如盐酸胍，来溶解包涵体，从而导致目的蛋白遭到破坏。此外，纯化过程中可能会涉及变性条件。因此，利用细菌生产小的功能性蛋白往往需要在分离后的适当条件下进行“折叠”。此外，包括瘦素在内的一些蛋白含有分子内二硫键，这些键也必须重铸或重新形成。因此，利用细菌生产可溶性生物活性小分子有时需要对制备的蛋白进行再生、重折叠和/或形成分子内二硫键。
由于这种生产过程较为复杂，如果有可能的话，利用原核生物生产瘦素等小功能蛋白往往是困难的。研究人员曾尝试通过提高瘦素的溶解度来提高其产量。例如，一种方法是用天冬氨酸或谷氨酸取代某些氨基酸残基，使瘦素等电点(pI)从5.84提高到5.5或更低。例如，参见美国专利，编号5,719,266。然而，由此产生的瘦素“衍生物”在受试者中可能具有免疫原性。
由于治疗需求剂量大，生产效率低，血清半衰期短，纯化过程极其复杂，因此急需一种能够提高瘦素生产收率的方法。同时，也需要瘦素具备更好的药理学特征。目前，已知一种半衰期更长的犬类瘦素类似物，以聚乙二醇化修饰的形式存在(见PCT公开号WO2014/165189)，目前仍然需要活性更强、半衰期更长的瘦素类似物来治疗犬类的肥胖和相关代谢紊乱。
发明概述
本发明的某些方面，提供了一种融合蛋白和嵌合蛋白，其中包含一种瘦素，该瘦素改善了(i)体内的药理特性，(ii)体内半衰期，(iii)或以上两者。在某些实施方案中，包括瘦素的融合蛋白(即嵌合蛋白)提高了半衰期。
本发明的一个具体方面，提供了一种融合蛋白，该融合蛋白包含与第二种蛋白相连接的第一种蛋白。第一种蛋白可以通过接头连接到第二种蛋白，或者它们彼此也可以直接连接。示例性接头包括但不限于SEQ IDNO：36-40。值得庆幸的是，任何合适的接头都可以使用，包括聚乙二醇(PEG)以及其他本领域内所熟知的氨基酸链。第一种蛋白包括(a)犬免疫球蛋白Fc(Ig Fc)区域；(b)犬白蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID NO:25有至少75％序列同源性；(c)猫Ig Fc区；或(d)猫白蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID NO:26有至少75％序列同源性。根据第一种蛋白的特性，第二种蛋白可以是犬瘦素蛋白，也可以是猫瘦素蛋白。
本发明的另一个方面，第一种蛋白质包括人源瘦素或其类似物，其氨基酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3有至少85％序列同源性；第二种蛋白包括从人IgG1Fc中选择的Fc片段(例如SEQ ID NO：8)，从人IgG2Fc中选择的Fc片段(例如SEQ ID NO：9)，以及从人IgG4Fc中选择的Fc片段(例如SEQ ID NO：10)。
本发明的另一个方面，提供了一种嵌合分子。所述嵌合分子包括(a)一种肽激动剂，选自GLP-1或其类似物、GIP或其类似物、艾塞那肽或其类似物、胃泌酸调节素或其类似物；(b)能够结合低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)、转铁蛋白受体、胰岛素受体或脑内皮受体的结合结构域；(c)瘦素或其类似物。
本发明的一些具体融合蛋白包括(i)Fc-瘦素融合蛋白其氨基酸序列与SEQ IDNO：41和SEQ NO：47或二者的组合有至少90％，典型的有至少95％，通常有至少98％，更多的是至少99％，最为常见的是100％序列同源性；(ii)一种Fc-瘦素融合蛋白其氨基酸序列与SEQ ID NO：42有至少90％，典型的有至少95％，通常有至少98％，更多的是至少99％，最为常见的是100％序列同源性，并且具有1个、2个或3个糖基化位点；(iii)一种融合蛋白其氨基酸序列与SEQ ID NO：43至少为90％，典型的有至少95％，通常有至少98％，更多的是至少99％，最为常见的是100％序列同源性。
本发明的另一个方面，提供了一种Fc-瘦素融合蛋白。在不受任何理论限制的情况下，我们认为这种融合蛋白通过将突变引入融合蛋白的Fc区域，进一步延长了瘦素在体内的半衰期，增加了与Fc受体FCRN的亲和力。本发明的一个具体融合蛋白，包含Fc-瘦素，其氨基酸序列与SEQ ID NO：48有至少90％，典型的有至少95％，通常有至少98％，更多的是至少99％，最为常见的是100％序列同源性。
本发明的另一个方面，提供了一种Fc-瘦素融合分子，该融合分子与白蛋白相连接(即融合)。在不受任何理论限制的情况下，通常认为添加白蛋白可以进一步延长Fc-瘦素融合蛋白的体内半衰期。融合蛋白的一个具体实施方案中，与犬白蛋白相连的犬Fc-瘦素融合蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO：49有至少90％，典型的有至少95％，通常有至少98％，更多的是至少为99％，最为常见的是100％序列同源性。
本发明的另一个实施方案还提供了犬Fc-瘦素融合蛋白的核酸序列，该序列与SEQID NO：50、51或52有至少90％，典型的有至少95％，通常有至少98％，更多的是至少为99％，最为常见的是100％序列同源性。
本发明的另一个方面，提供了一种在大肠杆菌等微生物中表达犬Fc-瘦素融合蛋白的方法。适用于表达本发明融合蛋白的典型微生物包括细菌、酵母以及该领域内所知的其他微生物。通常，当使用大肠杆菌表达时，融合蛋白以包涵体形式表达。通过这种方式，包涵体被收集、裂解，融合蛋白随后被氧化和纯化为具有生物活性的形式。
本发明的另一个方面，提供了微生物(如大肠杆菌)表达Fc-瘦素融合蛋白的一种重折叠方法。通常，目的蛋白的重折叠是通过将裂解的包涵体稀释到氧化性溶液中进行的。在一个具体的实施方案中，氧化溶液包含约25mM至约100mM的Tris缓冲液，约1M至约3M的尿素，约5％至约15％的蔗糖，约75mM至约300mM的精氨酸，氧化还原对半胱氨酸浓度在0.5mM到10mM之间，胱氨酸的浓度在0.1mM到2mM之间，和/或附加成分。氧化溶液的pH值通常在7.5到10之间。一般情况下，氧化溶液用量约为复溶包涵体溶液体积的4～20倍。通常，混合物在约0℃至约30℃的条件下，孵育约4小时至约48小时。
在一个具体的实施方案中，氧化溶液包含约50mM Tris，约10％的蔗糖，约150mM的精氨酸，约2.5M的尿素，约10mM的半胱氨酸，约1mM的胱胺，溶液pH约为9。
本发明的另一个方面，提供了与瘦素连接的抗原结合片段(Fab)蛋白。在本发明中，一个具体实施方案如Fab-瘦素融合分子，在该融合分子中瘦素与Fab蛋白的重链和轻链的C端相连。在某些情况下，重链的氨基酸序列与SEQ ID NO：44有至少90％的序列同源性。在其他情况下，轻链的氨基酸序列与SEQ ID NO：45有至少90％的序列同源性。
本发明的另一个方面，提供了一种抗体-瘦素融合分子，该融合分子包括与抗体重链C端相连的瘦素。本发明中，所述抗体包含一条重链和一条轻链，其中抗体重链氨基酸序列与SEQ ID NO：46有至少75％的序列同源性。
本发明的其他方面包括(i)编码本发明所述融合蛋白的核苷酸序列；(ii)包含这种核苷酸序列的表达载体；(iii)用这种载体转染的宿主细胞。
本发明的其他方面提供了(i)制备本文所述的融合蛋白或嵌合分子的方法，(ii)包含本发明所述的融合蛋白或嵌合分子的药物组合物，以及药学上可接受的载体；(iii)使用这种药物组合物治疗受试者的代谢紊乱的方法。
附图说明
图1是根据本发明的犬Fc-瘦素类似物融合蛋白的示意图。
图2是Fab-瘦素类似物融合蛋白的示意图。Fab段能够与脑内皮受体相结合。
图3是艾塞那肽/抗体/瘦素类似物融合蛋白的示意图。抗体部分能够与大脑内皮受体结合。
图4为犬IgGB Fc-瘦素融合分子示意图。
图5是犬IgGB Fc-瘦素融合分子的示意图，该分子在Fc区域中具有点突变，目的是增加与FcRN的亲和力。
图6是犬白蛋白-IgGB Fc-瘦素融合分子示意图。
图7显示了细胞裂解物和包涵体的SDS-PAGE分析结果。
图8显示了在不同pH和时间点的氧化样品的SDS-PAGE分析结果。
图9显示了蛋白A亲和层析纯化样品的SDS-PAGE分析结果。
图10显示了Fc-瘦素融合蛋白A细胞活性测定结果。
图11显示了Fc-瘦素融合蛋白B和C细胞活性测定结果。
图12显示了不同物种中瘦素及其类似物的氨基酸序列。
图13显示了不同物种中IgG Fc及其类似物的氨基酸序列。
图14显示了一些多肽、抗体或抗体片段的氨基酸序列，这些蛋白能够促进瘦素融合蛋白跨血脑屏障(“BBB”)的递送。
图15显示了不同物种的血清白蛋白的氨基酸序列。
图16中，表格显示的是GLP-1、GIP、胃泌酸调节素和胰高血糖素及其类似物的氨基酸序列。在表中，“Aib”是指氨基异丁酸。
图17中，表格显示的是可用于本发明的肽接头示例。
图18显示了本发明的一些瘦素融合蛋白氨基酸序列示例。
图19显示了本发明的一些瘦素融合蛋白核酸序列示例。
具体实施方式
本发明提供了一些含有至少一部分瘦素氨基酸序列的融合蛋白和嵌合蛋白，及其制备和使用的方法。本发明人发现，通过将包含至少一部分瘦素的氨基酸序列与抗体或其片段连接，可改善体内半衰期和/或提高瘦素的效力。通常，本发明的融合蛋白和嵌合蛋白与相应的天然瘦素相比，半衰期至少提升十(10)倍(即1000％)或更多，典型的是至少三十(30)倍或更多，通常至少是一百(100)倍或更多。术语“大约”意味着±20％，典型的是±10％，通常为±5％的数值。术语“相应的天然瘦素”是指来自与本发明的融合蛋白或嵌合蛋白相同物种的瘦素。
本发明的一个具体方面，提供了一种融合蛋白，该融合蛋白包含与第二种蛋白相连接的第一种蛋白。在一些实方案中，第一种蛋白包括(a)与犬类免疫球蛋白Fc片段，即典型的的IgG Fc区域氨基酸至少为75％，典型的至少为80％，通常为85％，更常见的是90％，更常见的是95％，更常见的是96％，更常见的是97％，更常见的是98％，更常见的是99％，最为常见的是100％序列同源性；(b)一种犬白蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID NO：25为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同源性；(c)猫Ig Fc区域；(d)猫白蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID NO：26有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同源性。根据第一种蛋白的特性，第二种蛋白可以是犬瘦素蛋白，也可以是猫瘦素蛋白。在一些实施方案中，第一种和第二种蛋白通过肽接头连接。肽接头可以是寡肽，如SEQ ID NOS：36-40，也可以是本领域技术人员已经的其他蛋白或肽接头，例如，包括但不限于聚乙二醇接头、多糖接头、聚乙烯接头等。
关于序列比对，通常有一个序列作为参考序列，与测试序列进行比对。在使用序列比对算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算出测试序列相对于参考序列的序列同源性百分比。
用于比较序列的最佳比对可以通过例如S Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法进行，通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)同源性比对算法进行，通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)寻找相似性方法进行，可以通过这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传学软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA,遗传学电脑集团，575Science Dr.,Madison,WI.)，或者通过目视检查[(参见，Current Protocols in Molecular Biology,(Ausubel,F.M.et al.,eds.)John Wiley&Sons,Inc.,New York(1987-1999,including supplements such assupplement 46(April 1999)]。使用这些程序进行序列比对时通常使用针对每个程序的默认参数。
另一个适用于确定序列同源性和相似性的算法是BLAST算法，正如Altschul等人在J.Mol.Biol.,215:403-410(1990)中所描述。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国立生物技术中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字来识别高评分序列对(HSPs)，当与数据库序列中的相同长度的字对齐时，该短字匹配或满足一些正值阈值分数T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul等，同上)。这些最初的邻居单词充当种子，用于启动搜索以找到包含它们的更长的HSPs。只要可以增加累积比对得分，单词搜索就沿着每个序列在两个方向上延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。在以下情况下，停止每个方向上的单词搜索的扩展：累积对齐分数从其最大实现值的数量X下降；由于一个或多个负评分残基排列的累积，累积评分为零或低于零；或达到任一序列的结尾。为了确定核酸或多肽是否在本发明的范围内，BLAST程序的默认参数是合适的。BLAST算法参数W，T和X决定比对的灵敏度和速度。BLAST算法参数W，T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长为3，期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
除了计算序列同源性百分比之外，BLAST算法还可以对两个序列之间的相似性进行统计学分析(参见，Karlin&Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的相似性度量之一是最小概率之和(P(N))，它表示两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然匹配的概率。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小概率总和小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.01，则认为核酸与参考序列相似。
两个核酸序列基本相同的另一个指标是两个分子在严格条件下彼此杂交。“充分结合”是指探针核酸和靶核酸之间的互补杂交，并且包括可通过降低杂交介质的严格性来实现所需的靶多核苷酸序列检测的微小错配。短语“特异性杂交”或“特异性杂交到”是指当该序列存在于复杂混合物(例如细胞总DNA或RNA)中时，分子仅在严格条件下与特定核苷酸序列结合、双链化或杂交。
术语“严格条件”是指探针或引物与其靶亚序列杂交但不与其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下会有所不同。较长的序列在较高温度下进行特异性杂交。通常，严格条件选择为在特定离子强度和pH下，比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。在其他情况下，严格条件选择为比序列的解链温度低约20℃或25℃，并且探针与靶标具有精确或近似精确的互补性。在本发明中，解链温度是指双链核酸分子半离解成单链的温度。计算核酸解链温度的方法在此领域内是众所周知的(参见Berger and Kimmel(1987)Methods in Enzymology,vol.152:Guide to Molecular Cloning Techniques,SanDiego:Academic Press,Inc.和Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd ed.,vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory)，两者在此引用合并。如标准参考文献所示，Tm值的简单估计可以通过以下等式计算：当核酸在1M NaCl水溶液中时，Tm＝81.5+0.41(％G+C)(参见Anderson and Young,“Quantitative FilterHybridization,”in Nucleic Acid Hybridization(1985))。其他参考文献还包括更复杂的计算方法，将结构和序列特征考虑在内以计算Tm值。杂交体的解链温度(以及严格杂交的条件)受各种因素的影响，例如探针或引物的长度和性质(DNA、RNA和碱基组成)和靶标的性质(DNA、RNA、碱基组成以及存在形式是溶液或固相化等)，以及盐和其他组分的浓度(例如甲酰胺、硫酸葡聚糖和聚乙二醇的存在与否)。这些因素的作用在本领域内是众所周知的，并在标准参考文献中进行了讨论，例如：Sambrook,同上，和Ausubel,同上。通常，严格条件是盐浓度小于约1.0M Na离子，通常约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，pH7.0至8.3，温度至少约30℃。对于短探针或引物(例如，10至50个核苷酸)和对于长探针或引物(例如，大于50个核苷酸)至少约60℃。还可以通过添加诸如甲酰胺之类的去稳定剂来达到严格的条件。
在一个实施方案中，当第一个蛋白是犬IgFc(通常是IgG Fc)区或犬白蛋白，第二蛋白是犬瘦素蛋白，其氨基酸与犬瘦素蛋白或SEQ ID NO:4或SEQID NO:5类似物序列同源性分别为至少87％，至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同源性。当第一蛋白是猫Ig Fc区或猫白蛋白，第二蛋白是猫瘦素或类似物，其氨基酸与犬瘦素蛋白或SEQ ID NO:6或SEQID NO:7类似物分别为至少87％，至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同源性。
第二个蛋白能够与第一个多肽的C-端或N-端连接。
在一些实施方案中，犬Ig Fc区的氨基酸与SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：13或SEQ ID NO：14至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同源性。在一个特定的实施方案中，犬Ig Fc区多肽是犬IgG D Fc区包含氨基酸，与SEQ ID NO：14至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同源性。
在另外的实施方案中，犬IgGD Fc区包含SEQ ID NO：14的ProAlaAla(S10P/L16A/L17A)突变。在其它的实施方案中，犬IgGD Fc区包含SEQ ID NO：14.1879Q和M213L突变。
在另外的实施方案中，猫Ig Fc(通常是IgG Fc)区的氨基酸与SEQ ID NO：15或SEQID NO：16至少85％，至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同源性。
本发明的融合蛋白同样包含结合域。结合域可以为多肽，抗体，或抗体片段。结合域有结合低密度脂蛋白受体-相关蛋白1(LPR1)，转铁蛋白受体，胰岛素受体或脑内皮细胞受体的能力，因此引起受体内吞或转胞吞作用。此外，结合域的存在增加了融合蛋白通过血脑屏障的递送。
在一个实施方案中，结合域是血管生成素-2多肽来自由SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18序列构成的组中。在某些情况下，血管生成素-2多肽是连接于融合蛋白的N-端。
在另外的实施方案中，结合域的氨基酸与SEQ ID NO：19至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同源性。其他合适的结合域的氨基酸与SEQ ID NOS：20-24任何一个至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同源性。
融合蛋白同样也包含多肽激动剂，该激动剂能够激活选自包含以下组中受体的能力：(a)GLP-1受体，(b)胃抑制多肽(GIP)受体，(c)胰高血糖素受体，和(d)两个或两个以上的组合。多肽激动剂能够通过链接器连接融合蛋白。合适的链接器包含本文所涉及的那些。在一个特定实施方案中，多肽激动剂选自包含以下组中(i)GLP-1或其衍生物；(ii)唾液素-4或其衍生物；(iii)GIP或其衍生物；和(iv)胃泌酸调节素或其衍生物。多肽激动剂能够连接融合蛋白的N-端或C-端。在另一个实施方案中，多肽激动剂包含氨基酸序系列选自含SEQID NOS：28-35的组中。
本发明的另一方面，提供融合蛋白包含第一个人瘦素蛋白或其衍生物，其氨基酸序列与SEQ ID NO：1,SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3至少85％，至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同源性。并且第二个蛋白连接于第一个蛋白。第二个蛋白的Fc片段来自于人IgG1Fc，人IgG2Fc和人IgG4Fc，其氨基酸序列与SEQ ID NOS：8-10分别为至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同源性。在一些实施方案中，第二个蛋白是人白蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID NO：27至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同源性。在一些实施方案中，第一和第二蛋白是通过接头连接的。接头可以是寡肽，如在SEQ ID NOS：36-40的示例中，或者可以是本领域技术人员已知的其他蛋白质或肽接头，例如，但不仅限于，聚乙二醇接头，多糖接头，聚乙烯接头，等等。融合蛋白还可以包括肽激动剂，该肽激动剂能够激活来自：(a)GLP-1受体；b)胃抑制多肽(GIP)受体，(c)胰高血糖素受体，(d)两个或两个以上的组合受体。在一个特定的实施方案中，多肽激动剂包含氨基酸序列来自由SEQ ID NOS：28-35序列构成的组。
本发明的另一方面提供一种嵌合分子。本发明的嵌合分子包括(a)多肽激动剂选自含GLP-1或其衍生物，GIP或其衍生物，唾液素-4或其衍生物，胃泌酸调节素和其衍生物的组；(b)结合区有结合低密度脂蛋白-相关蛋白1(LRP1)，转铁蛋白受体，胰岛素受体，或脑内皮细胞受体；和(c)一个瘦素或其衍生物。嵌合分子同样可以包括多肽激动剂和结合区两者间的接头。除此之外，或可替代地，嵌合分子同样也包括结合区和瘦素两者间的接头。
在一个实施方案中，嵌合分子中的瘦素其氨基酸序列与SEQ ID NOS：1-7其中一个序列至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同源性。
在一些实施方案中，嵌合分子的多肽激动剂包括来自SEQ IDS：28-35的氨基酸序列。
然而，在其他实施方案中，嵌合分子的结合域来自SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的血管生成素-2多肽的氨基酸序列。
同时，在其他是实施方案中，嵌合分子结合域是一种抗体或一种抗体片段。该抗体或抗体片段有结合低密度脂蛋白受体-相关蛋白1(LRP1)，转铁蛋白受体，胰岛素受体，或脑内皮细胞受体的能力。在一个特定的实施方案中，结合域的氨基酸序列与SEQ ID NOS：19or20至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同源性。
本发明中具体的融合蛋白和/或嵌合分子包括，但不限于：(i)Fc-瘦素融合蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO：41和SEQ NO：47至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同源性；(ii)Fc-瘦素融合蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO：42序列同源性为至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％，并具有至少1个、2个或3个糖基化位点；和(iii)融合蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO：43至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％序列同源性。
Fc-瘦素蛋白的另一方面是进一步增加(i)瘦素体内半衰期(在融合蛋白Fc结构域导入突变)，(ii)和/或与Fc受体FCRN的结合亲和力。本发明一个特定的融合蛋白包括Fc-瘦素融合蛋白氨基酸序列与SEQ ID NOS：47或48序列同源性为至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％。本发明一个特殊的融合蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO:48至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％序列同源性。
在一些实施例中，Fc-瘦素融合蛋白与白蛋白融合(即，连接或接上)。不受任何理论限制，相信将会进一步增加Fc-瘦素蛋白的体内半衰期。本发明的一个特定的融合蛋白包含犬Fc-瘦素融合蛋白连接于犬白蛋白。与犬白蛋白连接的示例性Fc-瘦素融合蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO：49至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％序列同源性。
本发明其他的实施方案包括犬Fc-瘦素融合蛋白核酸序列与SEQ ID NO：50，51，或52至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％序列同源性。
本发明另一方面提供了使用宿主细胞生产犬Fc-瘦素融合蛋白的方法。虽然宿主细胞可以是本领域技术人员已知的任何微生物，但是用于产生Fc-瘦素融合蛋白的一种特定宿主细胞为大肠杆菌。在一些实施方案中，融合蛋白是以包涵体的形式表达的。此方法同样也包括包涵体的复性，溶解和氧化以产生可以纯化的具有生物活性的融合蛋白。
大肠杆菌表达的犬Fc-瘦素可以重折叠以获得有生物活性形式的融合蛋白。典型地，融合蛋白重折叠是通过稀释溶解包涵体到氧化溶液中完成的。标准的氧化溶液包含25-100mM Tris，1-3M尿素，5-15％蔗糖，75-300mM精氨酸，0.5-10mM浓度半胱氨酸和0.1-2mM浓度的胱氨酸氧化还原对，和/或增加的组分，pH为7.5到10。所用氧化溶液的量是溶解包涵体溶液体积的约4-20倍。通常混合物允许在0-30℃中孵育4-48小时。在一个特定的实施方案中，氧化溶液包含约50mM Tris，约10％蔗糖，约150mM精氨酸，约2.5M尿素，约10mM半胱氨酸，约1mM胱氨酸，和约pH 9。
本发明另一方面提供了一个Fab-瘦素融合分子，包含的瘦素是连接于抗原结合片段(Fab)的重链和轻链的C-末端。重链氨基酸序列具有与SEQ ID NO:45至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％序列同源性。
本发明另一方面还提供了一个抗体-瘦素融合分子，包含的瘦素是连接于抗体重链的C-末端。该抗体包含重链和轻链。抗体重链氨基酸与SEQ ID NO：46至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，99％或100％序列同源性。
本发明其他方面包括(i)本文公开多核苷酸编码的融合蛋白或嵌合分子，(ii)包含这种多核苷酸的表达载体，和(iii)用这种载体转染的宿主细胞。本发明编码融合蛋白的多核苷酸序列包括但不限于SEQ ID NO：50，51和52中所示的那些。术语“表达载体”是指一种线性或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并可操作地连接到提供其表达的控制序列。术语“宿主细胞”是指对包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体易于转化，转染，转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”还包括由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。典型的宿主细胞是微生物，如细菌或酵母。通常将大肠杆菌用作转染的宿主细胞。然而，应当理解，本发明的范围不限于大肠杆菌，因为本领域技术人员可以容易地识别合适的宿主细胞用于本文公开的表达载体和宿主细胞的转染。术语“分离的”或“可恢复的”是指在自然界中不存在的形式或环境中的物质。
本文公开的一个特定的生产生物活性融合蛋白的方法包括(i)在足以从表达载体产生包涵体形式的融合蛋白的条件下培养宿主细胞；和在足以生产生物活性融合蛋白条件下氧化前文所述融合蛋白。在一些实施方案中，氧化步骤包含：(i)从前文所述宿主细胞中获得的包涵体；(ii)在氧化剂存在下，足以产生前文所述生物活性融合蛋白的条件下使溶解获得包涵体；和(iii)视情况纯化前文所述生物活性融合蛋白。
本发明还包括包含本文所述的融合蛋白或嵌合分子的药物组合物。本发明的组合物也包括了药学上可接受载体。
本发明的药物组合物可用于治疗受试者的代谢紊乱，例如人，狗和猫。在一个特定的实施方案中，代谢紊乱来自肥胖症、糖尿病，心脏疾病(例如，动脉粥样硬化)，肝脏疾病(例如，脂肪肝)的构成的组。
本发明的附加目的、优点和新颖特征对于本领域技术人员根据本文以下例子进行研究后变得显而易见，这些实施方案不是限制性的。在实施方案中，以现在时态描述建设性地减少实践的程序，并且以过去时态阐述在实验室中实施的程序。
实施例
实施例1：通过CHO细胞表达和纯化瘦素融合蛋白。合成嵌合分子的DNA，包含Fc-瘦素融合蛋白(SEQ ID NO：42，命名为ASKB-O42)，然后克隆到表达载体中。DNA测序确认其包含完整表达构建体的DNA基因。通过转化DH10B大肠杆菌并培养过夜来扩增表达载体。制备表达载体的DNA，并通过无内源质粒试剂盒(来自)纯化。
表达载体通过电穿孔法导入到GS-/-中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中，并使用不含谷氨酰胺的选择性培养基(CD CHO Fusion Growth Medium)来筛选转染的CHO细胞，获得稳定表达ASKB-O42的细胞系。以这种方式建立32个或更多个稳定的微型混合克隆，并且基于其在分批和补料分批培养中的表达水平选择主要的微型混合克隆。ELISA测定法检测表达水平。使用克隆培养基并通过有限稀释进行单克隆筛选。基于批次和补料分批培养中的表达量和细胞生长情况，从100多个阳性克隆中选择两个最好的单克隆。扩增该单克隆，以0.5×106cells/mL接种，2L摇瓶中装液量为300mL，并将细胞在37℃，5％CO2，70％湿度，120rpm的条件下振荡培养。在第3，6，7，8和9天，使用feed A+0.5％feed B(来自GE Health)进行补料。每隔一天监测细胞活力，活细胞密度，培养至第11-13天收获。
离心(2000rpm，10分钟)约600mL培养物，然后过滤，收获细胞培养基。将澄清的上清液通过Protein A亲和柱，纯化嵌合分子。然后通过离子交换色谱，疏水相互作用色谱，羟基磷灰石色谱和/或混合模式色谱进一步纯化蛋白质。将产物进一步浓缩并使用UFDF进行缓冲液交换并进行制剂罐装。使用CE-SDS和HPLC方法分析产物的纯度。
实施例2：大肠杆菌表达Fc-瘦素融合蛋白。Fc-瘦素融合蛋白A，B和C由大肠杆菌BL21DE3菌株进行表达。Fc-瘦素融合蛋白A，B和C的原理构造图在图4，5，和6中进行阐述。质粒包含的基因序列如SEQ ID NO：50，和52所述，是通过DNA2.0合成。含有Fc-瘦素融合蛋白B基因的质粒序列如SEQ ID NO：51所示，该序列是来自于SEQ ID NO:50(Fc-瘦素融合蛋白A)突变。转化大肠杆菌，铺板并选择阳性克隆。用LB培养基在摇瓶中进行过表达，用1mM IPTG诱导表达。收获诱导后大约5小时至过夜的细胞。Fc-瘦素融合蛋白在IPTG诱导后不同时间点的表达水平见图7。结果表明在IPTG诱导约5小时后表达水平稳定。
实施例3：收获包涵体。将约15克(湿重)的细胞沉淀物重新悬浮于约60ml蒸馏水中。将混合物用Fisher Scientific的Model FB50超声波仪约85的振幅在冰上超声处理20-30秒，三次，每次超声处理间隔1分钟。用Sorvall RC 3BP离心机离心得到的细胞裂解液，300RPM离心20分钟。将颗粒再重悬于60毫升蒸馏水中离心洗涤2次。第三次离心获得的含融合蛋白的包涵体沉淀物直接冻存于-80℃，直至后续使用。
实施例4：溶解，重折叠和纯化大肠杆菌表达的Fc-融合蛋白。加入约50mM Tris碱，1.5M鸟嘌呤-HCl，6M尿素和8mM二硫苏糖醇(DTT)溶解包涵体(冷藏解冻)。将混合物充分混合，在室温下孵育60分钟以上。
实施例5：氧化和Fc-瘦素融合蛋白A的纯化。约40ml溶解的包涵体加入到210ml的氧化缓冲液中，充分混合，并在2-8℃孵育过夜。澄清氧化池和装载至10ml蛋白A亲和柱上。洗涤用50mM醋酸，pH3.6洗脱亲和柱。滴定蛋白A池l到pH约5，然后过滤。用SDS-PAGE和SEC-HPLC分析检测蛋白A池的纯度。用基于细胞活性分析方法检测蛋白A池的活性。pH8.5和9.5以及不同时间点的氧化池分析结果见图8。结果表明在孵育17小时后在两种pH下形成二聚。蛋白A亲和纯化的Fc-瘦素融合蛋白A的SDS-PAGE分析结果见图9。
实施例6：体外生物学活性研究：在STAT3响应元件控制下稳定转染荧光素酶和OB-Rb(瘦素受体)，表达于细胞表面。瘦素与瘦素受体结合，激活STAT3同源二聚体和STAT3/STAT1异源二聚体，它们与STAT3序列响应元件相互作用和结合。这种相互作用驱动荧光素酶基因的表达，并刺激细胞产生荧光素酶。在加入荧光素酶底物并反应后，发光量与化合物的活性成正比。生物学活性是基于4参数拟合的EC50值。
第一天：接种细胞到96孔细胞培养板中，30,000个/50μl/孔，并将培养板放置37℃，5％CO2孵育过夜。
第二天：野生型(WT)犬瘦素的起始浓度为100ng/ml，Fc-瘦素融合蛋白为1到400ng/ml，由此，从每个样品中取出50μl，在稀释板行间作3倍连续稀释。然后将50μl样品转到分析板的每孔中。孵育6小时后，加入100μl荧光素酶底物到每孔中。在Biotek synergyHTX酶标仪上读数。
Fc-瘦素融合蛋白A基于细胞的活性检测见图10。该结果表明了Fc-瘦素蛋白与犬瘦素EC50类似。Fc-瘦素融合蛋白B和C基于细胞的活性检测结果见图11。该结果表明了Fc-瘦素融合蛋白B和C与犬瘦素活性类似。
实施例7：体内活性的研究：本研究旨在评价ASKB-O42对肥胖雌性和雄性犬体重、体成分及摄食行为的影响。实施例1中的ASKB-O42在pH7.4磷酸盐缓冲液和4％(重量/体积)海藻糖的体系下配制浓度为5.1mg/ml的制剂。
一共十八(18)只犬，犬龄一(1)年以上：九(9)只完整雄性和九(9)只完整雌性比格犬。这些犬为肥胖犬，体重约12至18kg(26.4至39.6磅)。在前4周的适应期间，(或直到达到期望体重值)，犬喂食实验室高脂肪(约45％)干粮，这些食物满足或超过维持健康的营养要求。所有犬在适应期间随意喂食，以便增加体重。在适应期的最后两周和剩余的研究时间里，所有犬都被喂食商业性的正常脂肪(约12％)干粮，以便降低内源性瘦素水平和恢复瘦素敏感性。在整个研究里，治疗组1和2中的犬继续提供随意喂食。治疗组3中的动物根据饮食标签说明实行节食喂养，每天2次。动物可以通过碗或每个笼子里装的自动补水系统随意取水。在研究过程中，没有其他伴随用药。
此研究每个性别采取随机分配。犬随意分配犬笼。每个性别以基线(第14天)体重进行动物分组。共三组，每组三只雄性，三只雌性。第一组包括3只最低体重的雄性和3只最低体重的雌性。第二组内的每个性别包括3只次低体重雄性和3只次低体重雌性。最后组内的每个性别包括最高体重的3只雄性和最高体重的3只雌性。
本发明前述讨论呈现用于说明和描述的目的。前述内容并不意欲将本发明仅限定为本文中所特定公开的形式。因此，与上面教导以及相关领域的技术和知识相当的变化和修改处于本发明的范围内。尽管本发明的说明已包括一个或多个可能实施方式的描述以及某些变化和修改，但是在理解本发明之后，其它变化和修改也在本发明的范围内，例如处于本领域技术和知识范围内的变化和修改。本发明意在获得包含所允许范围内的替代实施例的权益，包括所要求的替代的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或步骤，不管这种替代的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或步骤是否在本文中公开，本发明并不意图捐献任何可获得专利的主题。本文引用的所有参考文献都通过引用整体并入。

Claims (39)

1.一种融合蛋白，包括与第二种蛋白相连接的第一种蛋白，其中所述第一种蛋白包含：
(a)犬免疫球蛋白Fc(“Ig Fc”)区；
(b)犬白蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID NO：25至少有75％序列同源性；
(c)猫Ig Fc区；或
(d)猫白蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID NO：26至少有75％序列同源性；
当所述第一种蛋白是犬Ig Fc区或犬白蛋白时，则所述第二种蛋白氨基酸序列与SEQID NO：4或SEQ ID NO：5所示的犬瘦素蛋白至少有87％序列同源性；
当所述第一种蛋白是猫Ig Fc区或猫白蛋白时，则所述第二种蛋白氨基酸序列与SEQID NO：6或SEQ ID NO：7所示的猫瘦素蛋白至少有87％序列同源性。
2.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一种蛋白通过蛋白质接头与所述第二种蛋白连接。
3.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第二种蛋白与所述第一种蛋白的C-末端连接。
4.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述犬Ig Fc区包含的氨基酸序列与序列SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14至少有90％序列同源性。
5.权利要求4所述的融合蛋白，其中所述犬Ig Fc区肽是犬IgGD Fc区，其包含氨基酸序列与SEQ ID NO：14至少有90％序列同源性，并且其中所述犬IgGD Fc区包含SEQ ID NO：14的ProAlaAla(S10P/L16A /L17A)突变体。
6.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与SEQ ID NO：47、48或49至少有98％的序列同源性。
7.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述猫Ig Fc区包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16有至少95％序列同源性。
8.权利要求1所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含结合域，结合域为多肽、抗体、或抗体片段；所述结合域能够结合低密度脂蛋白受体-相关蛋白1(LPR1)、转铁蛋白受体、胰岛素受体或脑内皮细胞受体，引起受体内吞或转胞吞作用，增加融合蛋白通过血脑屏障的递送。
9.权利要求8所述的融合蛋白，其中所述结合域是选自SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的血管生成素-2多肽。
10.权利要求9所述的融合蛋白，其中所述血管生成素-2多肽连接于所述融合蛋白的N-端。
11.权利要求8所述的融合蛋白，其中所述的结合域包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：19有至少95％序列同源性。
12.权利要求1所述的融合蛋白，其进一步包含能够激活选自下组受体的肽激动剂：(a)GLP-1受体、b)胃抑制性多肽(GIP)受体、(c)胰高血糖素受体、和(d)其两种或多种的组合。
13.权利要求12所述的融合蛋白，其中所述肽激动剂通过连接器与所述融合蛋白连接。
14.权利要求12所述的融合蛋白，其中所述肽激动剂选自(i)GLP-1或其类似物、(ii)艾塞那肽或其类似物、(iii)GIP或其类似物、(iv)胃泌酸调节素或其类似物。
15.权利要求12所述的融合蛋白，其中所述肽激动剂与所述融合蛋白的N-末端连接。
16.权利要求12所述的融合蛋白，其中所述肽激动剂包含的氨基酸序列选自SEQ IDNO：28-35。
17.一种融合蛋白，包括与第二种蛋白相连接的第一种蛋白；第一种蛋白是人瘦素或其类似物，与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3有至少85％序列同源性；第二种蛋白的Fc片段选自人IgG1Fc，人IgG2Fc和人IgG4
18.权利要求17所述的融合蛋白，其进一步包含能够激活选自下组受体的肽激动剂：(a)GLP-1受体、b)胃抑制性多肽(GIP)受体、(c)胰高血糖素受体、和(d)其两种或多种的组合。
19.权利要求18所述的融合蛋白，其中所述肽激动剂包含选自SEQ ID NO：28-35的氨基酸序列。
20.一种嵌合分子，包含：
(a)选自GLP-1或其类似物、GIP或其类似物、艾塞那肽或其类似物、胃泌酸调节素及其类似物的肽激动剂；
(b)能够结合低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)、转铁蛋白受体、胰岛素受体或脑内皮受体的结合域；和
(c)瘦素或其类似物。
21.权利要求20所述的嵌合分子，所述肽激动剂和所述结合结构域之间有接头。
22.权利要求20所述的嵌合分子，所述结合结构域和所述瘦素之间有接头。
23.权利要求20所述的嵌合分子，其中所述瘦素的氨基酸序列与SEQ ID NO：1-7具有至少75％的序列同源性。
24.权利要求20所述的嵌合分子，其中所述肽激动剂的氨基酸序列选自SEQ ID：28-35。
25.权利要求20所述的嵌合分子，其中所述结合域的氨基酸序列选自SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。
26.权利要求20所述的嵌合分子，其中所述结合域是能够结合低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)、转铁蛋白受体、胰岛素受体或脑内皮受体的抗体或抗体片段。
27.权利要求20所述的嵌合分子，其中所述结合域的氨基酸序列与SEQ ID NO：19或20具有至少75％的序列同源性。
28.选自下组的Fc-瘦素融合蛋白，包含：
与SEQ ID NO：41具有至少90％序列同源性；
与SEQ ID NO：42具有至少90％序列同源性，且具有至少1、2或3个糖基化位点；
与SEQ ID NO：43具有至少90％序列同源性；和
与抗原结合(Fab)片段的重链和轻链的C-末端连接的瘦素，其中所述重链的氨基酸序列与SEQ ID NO：44有至少90％、至少95％、至少98％或100％的序列同源性，所述轻链的氨基酸序列与SEQ ID NO：45有至少98％的序列同源性。
29.一种抗体-瘦素融合分子，其包含与抗体重链C末端连接的瘦素，其中所述抗体的重链的氨基酸序列与SEQ ID NO：46有至少98％序列同源性。
30.多核苷酸，选自SEQ ID NO：50、51和52。
31.一种表达载体，包含权利要求30的多核苷酸。
32.一种用权利要求31的载体转染的宿主细胞。
33.权利要求32所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
34.一种生产生物活性融合蛋白的方法，所述方法包括：
在足以从表达载体产生包涵体形式的融合蛋白的条件下培养权利要求33所述的宿主细胞；
从所述表达载体中至少部分地分离所述包涵体；
在变性和还原条件下溶解包涵体以制备变性的融合蛋白；
在可以产生足够生物活性融合蛋白的条件下氧化和重折叠所述变性的融合蛋白；
可选地纯化所述生物活性融合蛋白
35.权利要求34所述的方法，所述氧化和重折叠步骤包括混合所述变性的融合蛋白和氧化溶液，体积比为1：4至1：20。
36.权利要求35所述的方法，所述氧化溶液包含1-3M的尿素、5-15％的蔗糖、75-300mM的精氨酸，pH值为7.5-10。
37.权利要求36所述的方法，所述混合物在0-30℃下孵育4-48小时。
38.一种药物组合物，包含权利要求1-29中任一项所述的的融合蛋白或嵌合分子。
39.一种治疗受试者代谢紊乱的方法，包括给需要这种治疗的受试者施用权利要求38的药物组合物，其中所述代谢紊乱选自肥胖症、糖尿病、心脏病和肝脏疾病。
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