CN116096733A - Covid-19融合蛋白的抗原特异性免疫疗法和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了重组生产的融合蛋白，其包含与人Fc片段连接的SARS‑CoV‑2受体结合结构域(SARS‑CoV‑2‑RBD)片段或其类似物，用于与2019新型冠状病毒(COVID‑19)相关的用途。实施方式包括将融合蛋白施用于已从COVID‑19恢复的患者作为加强疫苗接种、施用于抗体空白的患者以产生针对SARS‑CoV‑2病毒的抗体以使患者成为恢复期的血浆供体，施用于已感染SARS‑CoV‑2病毒和已接触COVID‑19的患者以限制感染范围并改善疾病，并作为预防性COVID‑19疫苗。除了使用和制备方法之外，还提供了示例性Fc融合蛋白和示例性Fc融合蛋白的药物制剂。

Description

COVID-19融合蛋白的抗原特异性免疫疗法和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求以下的优先权权益：2020年4月10日提交的美国临时专利申请序列号63/008,497、2020年4月10日提交的序列号63/008,503、2020年4月10日提交的序列号63/008,509、2020年4月10日提交的序列号63/008,515、2020年6月19日提交的序列号63/041,574、2020年6月19日提交的序列号63/041,579、2020年6月19日提交的序列号63/041,582、2020年6月19日提交的序列号63/041,584、2020年7月7日提交的序列号63/048,939、2020年8月21日提交的序列号63/068,775、2020年8月21日提交的序列号63/068,805、2020年8月21日提交的序列号63/068,843、2020年8月21日提交的序列号63/068,894和2020年8月21日提交的序列号63/068,911，各自名称为COVID-19融合蛋白的抗原特异性免疫疗法及使用方法，并且其各自通过引用以其全文并入本文。
序列表
以下申请包含计算机可读格式(CRF)的序列表，以ASCII格式的文本文件形式提交，命名为“SequenceListing_044”，创建于2021年4月9日，大小为83KB。CRF的内容通过引用并入本文。
技术领域
本技术涉及包含包含与人Fc片段连接的SARS-CoV-2受体结合结构域(SARS-CoV-2-RBD)或其类似物的SARS-CoV-2表面糖蛋白截短的融合蛋白及其关于2019新型冠状病毒(COVID-19)的用途。
背景技术
背景技术的以下描述仅作为有助于理解本技术而提供，并且不承认描述或构成本技术的现有技术。
Fc融合蛋白
Fc融合蛋白由物种特异性免疫球蛋白Fc结构域组成，该结构域与另一种肽(例如具有治疗潜力的蛋白质或肽)连接。如本文所用，术语“融合蛋白”和“Fc融合蛋白”是指包含多于一个部分的蛋白质，例如来自不同来源(例如，不同的蛋白质、多肽、细胞等)，它们通过肽键共价连接。Fc融合蛋白优选通过以下方式共价连接：(i)将编码每个部分的基因连接成单个核酸分子，和(ii)在宿主细胞(例如，HEK细胞或CHO细胞)中表达核酸分子编码的蛋白质。完全重组合成方法优于单独合成治疗性蛋白质和Fc片段然后进行化学缀合的方法。化学缀合步骤和随后的纯化过程增加生产复杂性，降低产品产量，并增加成本。
术语“Fc片段”、“Fc区”、“Fc结构域”或“Fc多肽”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区。Fc片段、区域、结构域或多肽可以是天然序列Fc区或变体/突变Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同，但它们通常包含重链的铰链区、重链的CH2区和重链的CH3区的一些或全部。Fc片段(例如，犬或人Fc片段)的铰链区包含将重链的CH1结构域连接至重链的CH2区的氨基酸序列，并且含有一个或多个半胱氨酸，这些半胱氨酸形成一个或多个重链间链二硫键，以从两个相同但分开的Fc融合蛋白单体形成Fc融合蛋白的同型二聚体。铰链区可以包含全部或部分天然存在的氨基酸序列或非天然存在的氨基酸序列。
Fc结构域的存在由于其与新生儿Fc受体(FcRn)的相互作用而增加血浆半衰期，此外由于大分子大小导致Fc融合蛋白的肾清除较慢，导致分子的体内循环实现连接肽的活性延长并提高Fc融合蛋白分子的溶解度和稳定性。Fc结构域还使Fc融合蛋白能够与免疫细胞上的Fc受体相互作用。在一些实例中，治疗性蛋白质或肽通过接头与免疫球蛋白Fc结构域连接。治疗性蛋白质或肽和接头有效地替换抗体的可变区，同时保持Fc区完整。
Fc受体(FcR)是指与Fc片段或抗体的Fc区结合的受体。在实例中，FcR是犬或人FcR的天然序列，并且FcR是结合IgG抗体(γ受体)的Fc片段或Fc区的受体并且包括但不限于Fc(γ)受体I、Fc(γ)受体IIa、Fc(γ)受体IIb和Fc(γ)受体III亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可选的剪接形式。“FcR”还包括新生儿受体FcRn，它负责将母体IgG分子转移至胎儿，还负责延长体内抗体和Fc融合蛋白的体内消除半衰期。在实例中，人源的FcR在体外(例如，在测定中)用于测量包含任何哺乳动物源的Fc片段的Fc融合蛋白的结合，从而评估它们的FcR结合特性。本领域技术人员将理解来自一个物种的哺乳动物FcR(例如，人源的FcR)有时能够在体外结合来自第二物种的Fc片段(例如，犬源的FcR)。
本技术的总结
本文描述了融合蛋白，每个均包含各自的病毒受体结合结构域和Fc片段，其中病毒受体结合结构域和Fc片段通过任选的接头(例如肽接头)连接。在一个或多个实施方式中，病毒受体结合结构域包含SARS-CoV-2表面糖蛋白的RBD片段，其包含SEQ ID NO:1，或其功能片段、类似物或变体/突变体。在一个或多个实施方式中，病毒受体结合结构域包含RBD片段的SP/RBD片段，其包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8，或其功能片段、类似物或变体/突变体。在一个或多个实施方式中，病毒受体结合结构域包含以下序列或其功能片段：SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15。在一个或多个实施方式中，Fc片段包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:33的序列或功能片段。在一个或多个实施方式中，接头，如果存在，包含以下序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:27。在一个或多个实施方式中，融合蛋白包含(基本上由以下组成或甚至由以下组成)：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的序列或其功能片段。在一个或多个实施方式中，融合蛋白是同型二聚体。在一个或多个实施方式中，Fc片段被糖基化。
本文还描述了免疫原性组合物，其包含根据本文所述的任何实施方案或实施方案的组合的融合蛋白(或多种)和药学上可接受的载体，或基本上由其组成。在一个或多个实施方式中，融合蛋白分散在载体中。在一个或多个实施方式中，组合物进一步包含佐剂。在一个或多个实施方式中，佐剂是MontanideTM ISA-720。在一个或多个实施方式中，融合蛋白与佐剂一起乳化。在一种或多种实施方式中，乳化在施用之前现场制备。在一个或多个实施方式中，制备的乳化物在冷藏(4℃)或室温下稳定至少8小时，优选长达24小时。在一个或多个实施方式中，组合物是可注射制剂。在一个或多个实施方式中，组合物适用于皮下施用。在一个或多个实施方式中，组合物适用于预防性疫苗接种。在一个或多个实施方式中，组合物适用于治疗性疫苗接种。
本文还描述了用于增加受试者中针对抗原剂的抗体产生的各种方法。该方法通常包括向受试者施用治疗有效量的根据本文所述的任何实施方式或实施方式的组合的融合蛋白(或多种)或免疫原性组合物(或多种)。在一个或多个实施方式中，在施用融合蛋白或免疫原性组合物之前，受试者具有针对抗原剂的可测量的抗体效价。在一个或多个实施方式中，在施用融合蛋白或免疫原性组合物之前，受试者是抗体空白的(antibody 
Figure BDA0003950764700000042
)。在一个或多个实施方式中，融合蛋白或免疫原性组合物通过注射施用。在一个或多个实施方式中，融合蛋白或免疫原性组合物经皮下或肌内施用。在一个或多个实施方式中，融合蛋白或免疫原性组合物作为单位剂型提供。在一个或多个实施方式中，融合蛋白或免疫原性组合物与佐剂共同施用。在一个或多个实施方式中，该方法进一步包括制备融合蛋白或免疫原性组合物用于施用，其中该制备包括在施用之前将融合蛋白或免疫原性组合物与佐剂预混合。在一个或多个实施方式中，预混合包括乳化佐剂和融合蛋白以产生乳剂，并且向受试者施用乳剂。在一个或多个实施方式中，制备的乳化物在冷藏(4℃)或室温下稳定至少8小时，优选在制备之后稳定长达24小时。
本文还描述了在受试者中诱导针对病毒感染，优选SARS-CoV-2病毒，更优选COVID-19的免疫应答的方法。该方法通常包括向受试者施用治疗有效量的根据本文所述的任何实施方式或实施方式的组合的融合蛋白(或多种)或免疫原性组合物(或多种)。在一个或多个实施方式中，在施用融合蛋白或免疫原性组合物之前，受试者具有针对病毒感染的可测量的抗体效价。在一个或多个实施方式中，在施用融合蛋白或免疫原性组合物之前，受试者是抗体空白的(antibody
Figure BDA0003950764700000041
)。在一个或多个实施方式中，融合蛋白或免疫原性组合物通过注射施用。在一个或多个实施方式中，融合蛋白或免疫原性组合物经皮下或肌内施用。在一个或多个实施方式中，融合蛋白或免疫原性组合物作为单位剂型提供。在一个或多个实施方式中，融合蛋白或免疫原性组合物与佐剂共同施用。在一个或多个实施方式中，该方法进一步包括制备融合蛋白或免疫原性组合物用于施用，其中该制备包括在施用之前将融合蛋白或免疫原性组合物与佐剂预混合。在一个或多个实施方式中，预混合包括乳化佐剂和融合蛋白以产生乳剂，并且向受试者施用乳剂。在一个或多个实施方式中，制备的乳化物在冷藏(4℃)或室温下稳定至少8小时，优选在制备之后稳定长达24小时。
本文还描述了产生根据本文所述的任何实施方式或实施方式的组合的融合蛋白的方法。该方法通常包括将编码融合蛋白的核酸瞬时转染到HEK293或CHO-SE细胞中，其中转染的HEK293或CHO-SE细胞表达融合蛋白，或将编码融合蛋白的核酸稳定转染到CHO细胞中，其中重组CHO细胞表达融合蛋白。在一个或多个实施方式中，融合蛋白由细胞分泌到细胞培养基中，进一步包括从培养基中纯化或分离融合蛋白。有利地，在任何前述表达系统中纯化的或分离的融合蛋白的产量大于20mg/L。
本文还描述了经工程化以表达融合蛋白的细胞，其是根据本文所述的任何实施方式或实施方式的组合的融合蛋白。在一个或多个实施方式中，细胞用编码融合蛋白的核酸转染。在一个或多个实施方式中，细胞是HEK293细胞或CHO细胞。
本文还描述了编码根据本文所述的任何实施方式或实施方式的组合的融合蛋白的cDNA分子。本公开还涉及包含编码根据本文所述的任何实施方式或实施方式组合的融合蛋白的cDNA的表达载体和/或DNA表达构建体。
如本文所述，根据本文所述的任何实施方式或实施方式组合的融合蛋白(或多种)或免疫原性组合物(或多种)可用于治疗和/或用作药物。
如本文所述，根据本文所述的任何实施方式或实施方式组合的融合蛋白(或多种)或免疫原性组合物(或多种)可用于增加受试者的抗体产生。
如本文所述，根据本文所述的任何实施方式或实施方式的组合的融合蛋白(或多种)或免疫原性组合物(或多种)可用于治疗和/或预防病毒感染，优选SARS-CoV-2病毒，更优选COVID-19。
如本文所述，根据本文所述的任何实施方式或实施方式组合的融合蛋白(或多种)或免疫原性组合物(或多种)可用作预防性、治疗性和/或加强疫苗。
具体实施方式涉及选自由以下组成的组的融合蛋白(或多种)：SEQ ID NO:16、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21或其药物组合物，用于治疗和/或预防病毒感染，优选SARS-CoV-2病毒，更优选COVID-19。
如本文所述，根据本文所述的任何实施方式或实施方式组合的融合蛋白(或多种)或免疫原性组合物(或多种)可用于制备用于治疗和/或预防病毒感染的药物。
例如，最初在BALB/c小鼠中评价在ISA 720佐剂中乳化的SEQ ID NO:19的免疫原性和诱导产生结合和中和SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白(SP)的抗体(Ab)的能力。在与SP的受体结合结构域(SP/RBD)结合后，这些疫苗诱导的Ab防止病毒附着至宿主靶蛋白ACE2，其在多种细胞类型(包括肺内皮细胞、血管和神经元)上表达。即使在单次注射1μg至100μg的在佐剂MontanideTM ISA 720中的SEQ ID NO:19之后，在小鼠、NHP和兔中诱导了大量中和抗体，其1)与重组SP/RBD结合，2)抑制重组ACE2与重组SP/RBD结合，和3)防止SARS-CoV-2病毒感染天然表达ACE2的活VERO-E6细胞。值得注意的是，在每种上述动物模型中诱导中和Ab的SEQ ID NO:19疫苗的效力通常与从恢复期COVID-19受试者获得的人血清的中和能力相当或更高，从而设定预期在MontanideTM ISA 720佐剂中的SEQ ID NO:19应该在人中诱导足够的保护作用。本文所述的测定和动物模型用于证明SEQ ID NO:19在MontanideTM ISA 720佐剂中的最佳剂量水平在30μg至100μg范围内，皮下(s.c.)或肌内(i.m.)给予的两个剂量诱导最大免疫原性应答，并且间隔14天给予的3个剂量的在MontanideTM ISA 720中的100μg的SEQ ID NO:19在兔GLP毒理学研究中未显示出毒性或严重不良反应。如预期，观察到由于MontanideTM ISA 720佐剂引起的轻度且短暂的注射部位反应。
附图说明
图1显示了胰岛素-Fc融合蛋白同型二聚体的示意图。
图2显示了示例性SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白同型二聚体的示意图。
图3显示了Fc(γ)受体I与SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白的结合。
图4显示了患有化学诱导的糖尿病的6只比格犬，在连续8次给药SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白后，针对RHI的抗胰岛素抗体(AIA)效价平均超过200倍稀释。
图5显示了从试验第0天开始，患有化学诱导的糖尿病的6只比格犬在连续8次每周给药SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白后，针对RHI的抗胰岛素抗体(AIA)效价的百分比变化。
图6显示了根据实施例52的方案1或方案2，用SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白治疗糖尿病的8只客户犬的归一化AIA效价。
图7显示了用SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白治疗糖尿病且治疗中断的单只犬的归一化AIA效价。
图8显示了用在HEK瞬时细胞池或CHO稳定细胞池中制备的SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白治疗糖尿病后表现出AIA的犬数量的图示。
图9显示了用SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白治疗糖尿病的8只犬的归一化AIA效价。
图10显示了在用SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白治疗糖尿病后表现出AIA的犬数量的图示。
图11示出了通过Fc(γ)受体对Fc融合蛋白的APC加工。
图12示出了促进B细胞激活和抗SARS-CoV-2SP/RBD IgG产生。
图13示出了SEQ ID NO:2(SARS-CoV-2的延伸SP/RBD)和SEQ ID NO:9(SARS-CoV-2表面糖蛋白的新型截短)的并排序列比较。
图14示出了SEQ ID NO:2(SARS-CoV-2的延伸SP/RBD)和SEQ ID NO:10(SARS-CoV-2表面糖蛋白的新型截短)的并排序列比较。
图15示出了SEQ ID NO:2(SARS-CoV-2的延伸SP/RBD)和SEQ ID NO:14(SARS-CoV-2表面糖蛋白的新型截短)的并排序列比较。
图16示出了SEQ ID NO:2(SARS-CoV-2的延伸SP/RBD)和SEQ ID NO:15(SARS-CoV-2表面糖蛋白的新型截短)的并排序列比较。
图17示出了SEQ ID NO:2(SARS-CoV-2的延伸SP/RBD)和SEQ ID NO:13(SARS-CoV-2表面糖蛋白的新型截短)的并排序列比较。
图18示出了疫苗佐剂的一般作用机制。
图19示出了人Fc(γ)RI与SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白结合的EC50。
图20示出了人Fc(γ)RIIa与SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白结合的EC50。
图21示出了人Fc(γ)RIIb与SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白结合的EC50。
图22示出人Fc(γ)RIII与SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白结合的EC50。
图23示出了人ACE2与SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白和人IgG结合的EC50。
图24示出了人FcRn受体与SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白结合的EC50。
图25示出了在单次给药不同剂量水平的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2 RBD-hIgG-Fc融合蛋白后21天在6至8周龄雌性BALB/c小鼠中的抗SP/RBD IgG Ab效价反应。
图26示出了在第0天和第21天注射不同剂量水平的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2RBD-hIgG-Fc融合蛋白后第35天在6至8周龄雌性BALB/c小鼠中的抗SP/RBD IgG Ab效价反应。
图27显示了在第0天、第21天和第42天注射SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2 RBD-hIgG-Fc融合蛋白后对1μg、3μg、10μg、30μg和100μg剂量水平的动力学反应。
图28示出了在向6至8周龄小鼠施用不同剂量水平的没有佐剂的SEQ ID NO:2的SP/RBD或SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白后诱导的抗SP/RBD IgG Ab效价反应，如在第0天单次给药后第14天和第21天所测量的。
图29示出了在第0天单次给药后第21天，接受含有10μg剂量水平的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的各种含佐剂制剂的6至8周龄雌性BALB/c小鼠的抗SP/RBD IgG Ab效价反应。
图30示出了在第0天和第21天注射后第35天接受含有10μg剂量水平的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的各种含佐剂制剂的6至8周龄雌性BALB/c小鼠的抗SP/RBD IgG Ab效价应答。
图31示出了在第0天、第21天和第42天注射后第56天接受含有10μg剂量水平的SEQID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的各种含佐剂制剂的6至8周龄雌性BALB/c小鼠的抗SP/RBD IgG Ab效价应答。
图32示出了在第0天、第21天和第42天注射后第88天接受含有10μg剂量水平的SEQID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的各种含佐剂制剂的6至8周龄雌性BALB/c小鼠的抗SP/RBD IgG Ab效价应答。
图33示出了在第0天单次注射有或没有佐剂的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白后第21天计算与人恢复期血清相比，6至8周龄小鼠中ACE2-SP/RBD结合抑制效力(ID50)。
图34示出了在第0天和第21天注射有或没有佐剂的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白后第35天计算与人恢复期血清相比，6至8周龄小鼠中ACE2-SP/RBD结合抑制效力(ID50)。
图35示出了在第0天、第21天和第42天注射有或没有佐剂的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白后第56天计算与人恢复期血清相比，6至8周龄小鼠中ACE2-SP/RBD结合抑制效力(ID50)。
图36示出了在第0天、第21天和第42天注射有或没有佐剂的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白后第88天计算与人恢复期血清相比，6至8周龄小鼠中ACE2-SP/RBD结合抑制效力(ID50)。
图37示出了在向8至10月龄小鼠施用不同剂量水平的有佐剂的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白后诱导的抗SP/RBD IgG Ab反应和ACE2-SP/RBD结合抑制效力(ID50)，如在第21天单次给药后所测量的。
图38示出了在向8至10月龄小鼠施用不同剂量水平的有佐剂的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白后诱导的抗SP/RBD IgG Ab反应和ACE2-SP/RBD结合抑制效力(ID50)，如在第0天和第21天注射后第35天所测量的。
图39示出了在向8至10月龄小鼠施用不同剂量水平的有佐剂的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白后诱导的抗SP/RBD IgG Ab反应和ACE2-SP/RBD结合抑制效力(ID50)，如在第0天、第21天和第42天注射后第56天所测量的。
图40示出了在单次给药后第14天，施用1μg或10μg剂量水平的有或没有佐剂的SEQID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的6至8周龄雌性BALB/c小鼠的抗SP/RBDIgG Ab效价应答。
图41示出了在第0天和第21天注射后第35天，施用1μg或10μg剂量水平的有或没有佐剂的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的6至8周龄雌性BALB/c小鼠的抗SP/RBD IgG Ab效价应答。
图42示出了在第0天、第21天和第42天注射后第56天，施用1μg或10μg剂量水平的有或没有佐剂的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的6至8周龄雌性BALB/c小鼠的抗SP/RBD IgG Ab效价应答。
图43示出了在单次注射后第14天，施用1μg或10μg剂量水平的有或没有佐剂的SEQID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的6至8周龄雌性BALB/c小鼠的ACE2-SP/RBD结合抑制效力(ID50)。
图44示出了与人恢复期血清相比，在第0天和第21天注射后第35天，施用1μg或10μg剂量水平的有或没有佐剂的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的6至8周龄雌性BALB/c小鼠的ACE2-SP/RBD结合抑制效力(ID50)。
图45示出了与人恢复期血清相比，在第0天、第21天和第42天注射后第56天，施用1μg或10μg剂量水平的有或没有佐剂的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的6至8周龄雌性BALB/c小鼠的ACE2-SP/RBD结合抑制效力(ID50)。
图46示出了在第0天和第21天施用1μg或10μg剂量水平的SEQ ID NO:19的6至8周龄雌性BALB/c小鼠的血清样本的诱导抗SP/RBD PRNT中和效力，如在第21天和第35天所测量的。
图47示出了施用10μg剂量水平的有或没有佐剂(包括MontanideTM ISA 720)的SEQID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的6-8周龄BALB/C小鼠的抗SP/RBD IgG1效价，如在第0天、第21天和第42天注射后第14天、第35天和第56天所测量的。
图48示出了施用10μg剂量水平的有或没有佐剂(包括MontanideTM ISA 720)的SEQID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的6-8周龄BALB/C小鼠的抗SP/RBD IgG2a效价，如在第0天、第21天和第42天注射后第14天、第35天和第56天所测量的。
图49示出了施用10μg剂量水平的有或没有佐剂(包括MontanideTM ISA 720)的SEQID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的6-8周龄BALB/C小鼠的抗SP/RBD IgG2b效价，如在第0天、第21天和第42天注射后第14天、第35天和第56天所测量的。
图50示出了施用10μg剂量水平的有或没有佐剂(包括MontanideTM ISA 720)的SEQID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的6-8周龄BALB/C小鼠的抗SP/RBD IgG3效价，如在第0天、第21天和第42天注射后第14天、第35天和第56天所测量的。
图51示出了在第0天单次施用1μg或10μg剂量水平的SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:23(及小鼠IgG2a-Fc)或0.5μg或5μg剂量水平的SEQ ID NO:2的6至8周龄雌性BALB/c小鼠的抗SP/RBD IgG效价，如在第14天所测量的。
图52示出了施用1μg或10μg剂量水平的SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:23(及小鼠IgG2a-Fc)或0.5μg或5μg剂量水平的SEQ ID NO:2的6至8周龄雌性BALB/c小鼠的抗SP/RBDIgG效价，如在第0天和第21天注射后第35天所测量的。
图53示出了与人恢复期血清相比，施用1μg或10μg剂量水平的SEQ ID NO:19或SEQID NO:23(及小鼠IgG2a-Fc)或0.5μg或5μg剂量水平的SEQ ID NO:2的6至8周龄雌性BALB/c小鼠的诱导ACE2-SP/RBD结合抑制效力(ID50)，如在第14天所测量的。
图54示出了与人恢复期血清相比，施用1μg或10μg剂量水平的SEQ ID NO:19或SEQID NO:23(及小鼠IgG2a-Fc)或0.5μg或5μg剂量水平的SEQ ID NO:2的6至8周龄雌性BALB/c小鼠的诱导ACE2-SP/RBD结合抑制效力(ID50)，如在第0天和第21天注射后第35天所测量的。
图55示出了在注射新鲜制备的乳剂相比于在4℃和25℃下储存1天和7天的乳剂后第14天测量的小鼠中SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的诱导ACE2-SP/RBD结合抑制。
图56示出了与食蟹猴的Fc(γ)RI受体相比，SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白与人Fc(γ)RI受体的结合。
图57示出了与食蟹猴的Fc(γ)RIIa受体相比，SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白与人Fc(γ)RIIa受体的结合。
图58示出了与食蟹猴的Fc(γ)RIII受体相比，SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白与人Fc(γ)RIII受体的结合。
图59示出了与食蟹猴的FcRn受体相比，SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白与人FcRn受体的结合。
图60示出了在第0天和第21天注射后第0天、第14天、第21天、第35天和第42天，施用与MontanideTM ISA 720佐剂以30％/70％(v/v)配制的10μg或30μg剂量水平的SEQ IDNO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的雄性和雌性食蟹猴的抗SP/RBD IgG Ab效价应答。
图61示出了在第0天和第21天注射后第21天和第42天，施用与MontanideTM ISA720佐剂以30％/70％(v/v)配制的10μg或30μg剂量水平的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的雄性和雌性食蟹猴的诱导ACE2-SP/RBD结合抑制效力(ID50)。
图62示出了与人恢复期血清相比，在第0天和第21天注射后，在第21天和第42天测量的NHP血清样本中SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白诱导的SARS-CoV-2病毒中和效力，其中SEQ ID NO:19与MontanideTM ISA 720佐剂以30％/70％(v/v)配制。
图63示出了在接受加强注射后接种的NHP中的抗SP/RBD反应。
图64示出了来自用SEQ ID NO:19处理的NHP的免疫血清结合重组N501Y和E484KSP/RBD突变体以及，或大于，野生型SP/RBD分子。
图65示出了来自用SEQ ID NO:19处理的小鼠的免疫血清结合重组体，N501Y和E484K RBD突变体以及，或大于，野生型RBD。
图66示出了SEQ ID NO:2的SP/RBD与SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的SP/RBD变体的并排序列比较。
图67示出了在第一次给药、第二次给药和第三次给药之前以及在第三次给药之后测量的在第1天、第15天和第29天皮下施用有MontanideTM ISA 720佐剂的溶媒对照的新西兰白兔的抗SP/RBD IgG Ab效价。
图68示出了在第一次给药、第二次给药和第三次给药之前以及在第三次给药之后测量的在第1天、第15天和第29天施用没有佐剂的30μg剂量水平的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的新西兰白兔的抗SP/RBD IgG Ab效价。
图69示出了在第一次给药、第二次给药和第三次给药之前以及在第三次给药之后测量的在第1天、第15天和第29天施用没有佐剂的100μg剂量水平的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的新西兰白兔的抗SP/RBD IgG Ab效价。
图70示出了在第一次给药、第二次给药和第三次给药之前以及在第三次给药之后测量的在第1天、第15天和第29天施用有MontanideTM ISA 720佐剂的30μg剂量水平的SEQID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的新西兰白兔的抗SP/RBD IgG Ab效价。
图71示出了在第一次给药、第二次给药和第三次给药之前以及在第三次给药之后测量的在第1天、第15天和第29天施用有MontanideTM ISA 720佐剂的100μg剂量水平的SEQID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的新西兰白兔的抗SP/RBD IgG Ab效价。
图72示出了在第0天和第21天注射后第15天和第29天测量的施用有MontanideTMISA的30μg或100μg剂量水平的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的新西兰白兔的诱导ACE2-SP/RBD结合抑制效力(ID50)。
图73示出了与人恢复期血清相比，在第21天和第35天测量的新西兰白兔血清样本中SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白诱导的SARS-CoV-2病毒中和效力，其中SEQ ID NO:19与MontanideTM ISA 720佐剂一起乳化并在第0和21天施用。
图74示出了通过皮下(SC)注射或肌内注射(IM)施用100μg剂量水平的有MontanideTM ISA 720佐剂的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的新西兰白兔的抗SP/RBD IgG Ab效价，如在第0天和第21天注射后第15天、第29天和第36天所测量的。
图75示出了通过皮下(SC)注射或肌内注射(IM)施用100μg剂量水平的有MontanideTM ISA 720佐剂的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的新西兰白兔的诱导ACE2-SP/RBD结合抑制效力(ID50)，如在第0天和第21天注射后第15天、第29天和第36天所测量的。
图76示出了通过皮下(SC)注射施用100μg剂量水平的有MontanideTM ISA 720佐剂的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的新鲜乳剂和在2-8℃下储存24小时的乳剂的新西兰白兔的抗SP/RBD IgG Ab效价，如在第0天和第21天注射后第15天、第29天和第36天所测量的。
图77示出了通过肌内(IM)注射施用100μg剂量水平的有MontanideTM ISA 720佐剂的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的新鲜乳剂和在2-8℃下储存24小时的乳剂的新西兰白兔的抗SP/RBD IgG Ab效价，如在第0天和第21天注射后第15天、第29天和第36天所测量的。
图78示出了根据实施例36，从空白NHP和已用有MontanideTM ISA 720的SEQ IDNO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白免疫的NHP采集的每mL鼻拭子的基因组或亚基因组SARS-CoV-2病毒RNA拷贝数。
图79示出了根据实施例36，从空白NHP和已用有MontanideTM ISA 720的SEQ IDNO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白免疫的NHP采集的每mL支气管肺泡灌洗(BAL)液的基因组或亚基因组SARS-CoV-2病毒RNA拷贝数。
图80示出了SEQ ID NO:8(SARS-CoV-2的RBD)与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:14和SEQ ID NO:15(具有新突变的SARS-CoV-2的所有RBD)的并排序列比较。
图81示出了96孔微孔板，例如可用于评价血清中现有SARS-CoV-2抗体效价的一般血清学测定。
具体实施方式
新型冠状病毒病2019
新型冠状病毒病2019(COVID-19)是由SARS-CoV-2病毒引起的重度急性呼吸道疾病。2019年12月报告了首例COVID-19病例，并且截至2020年11月18日，迄今为止全球已有约56百万(M)例病例(量化为已确认的SARS-CoV-2病毒和未确认的“可能的”),其中有18.5M例活跃病例、36M例恢复病例和1.3M例归因于COVID-19的死亡病例(J.H.大学，约翰霍普金斯大学系统科学与工程中心(CSSE)的COVID-19仪表板；www.covidtracker.com/)。在2020年底，仅Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗BNT162b2根据世界卫生组织(WHO)的紧急使用清单(EUL)程序获批用于COVID-19的紧急使用。Moderna的第二种疫苗(mRNA-1273)预期将于2021年2月底根据WHO EUL程序获批用于COVID-19的紧急使用疫苗。专家们的共识是，除非并且直至赋予人群足够水平的免疫力，否则社会无法恢复正常。据估计，欲实现自然群体免疫，至少需要70％的人群被感染，这将导致全球数百万例死亡，这是道德上不可接受的结局。
ACE2受体
血管紧张素转换酶2(ACE2)是负责介导SARS-CoV-2感染的宿主细胞受体(即SARS-CoV-2与其结合以感染细胞)。ACE2是1型跨膜金属羧肽酶。聚合酶链反应(PCR)分析显示，ACE2在肺上皮、血管内皮和特定的神经元细胞上表达，这似乎分别解释了COVID-19的主要临床表现，包括肺部、心血管和神经系统并发症。基于SARS-CoV-2和SARS-CoV之间受体结合结构域的序列相似性，研究人员已表明，SARS-CoV-2可以利用人细胞表面表达的ACE2进入表达ACE2的HeLa细胞。
用于治疗病毒患者的恢复期血清
世界各地的临床医生和研究人员正致力于开发各种解决方案，以减轻由SARS-CoV-2引起的大流行。科学家们正致力于开发可以预防COVID-19的疫苗和抗病毒治疗，以减少疾病的严重程度和症状。正在开发治疗SARS-CoV-2的疫苗、单克隆抗体(mAb)或药物。许多临床医生认为，人恢复期血清是预防和治疗COVID-19的可行选择。
恢复期血清是被动抗体疗法的一种形式，通过该疗法，将来自感染和恢复个体的含有抗病毒抗体的血清输注至易感或感染个体，为该个体提供一定程度的免疫力，以预防或减轻疾病的严重程度。这种治疗与疫苗不同，疫苗通过诱导个体产生免疫应答，从而使个体产生自己的抗病毒抗体。2002年SARS-CoV爆发和2009-2010年H1N1流感爆发的经验表明，已感染并从病毒恢复的患者的血清(人恢复期血清)含有能够中和病毒的抗体，并可用作有重度疾病症状个体的干预或作为预防性疫苗。
使用人恢复期血清具有风险和局限性。首先，血液物质从一个人转移到另一个人带来意外感染另一种感染性疾病的风险以及对其他血清成分产生反应的风险。使用恢复期血清的另一个挑战是一些从病毒性疾病恢复的患者没有高效价的中和抗体。在一个关于另一种人类冠状病毒中东呼吸综合征(MERS-CoV)的病例中，韩国的三名患者接受恢复期血清治疗，但仅有两名接受者的血清中含有中和抗体。在从病毒性疾病恢复后确实具有中和抗体的人中，有些人可能没有足够高效价的中和抗体以成为活体供体。与SARS-CoV相关的进一步调查发现，99个SARS患者恢复期血清样本中，87个具有中和抗体，几何平均效价为1:61。这些和其他各项研究表明，很少有患者产生高效价应答，并且中和抗体效价还随时间下降。许多公司希望通过生产重组抗体来克服这一挑战，而不是仅仅依赖于恢复患者的抗体；然而，生产规模不足，并且每隔数周至数月向患者施用有效剂量所需的医疗干预很可能是通过静脉内注射或输液而非常繁琐。
更重要的限制是在COVID-19流行病中建议使用恢复期血清将依赖于具有高效价SARS-CoV-2中和抗体的制剂。这需要大量已从疾病恢复并可以捐献恢复期血清的供体。确定已患有这种疾病并已经产生一些免疫力的人存在挑战。COVID-19表现出多种严重程度的症状，并且许多轻症病例的个体可能并不知晓自己已患这种疾病。还需要高度可获得且低成本的检测试剂盒来测量抗SARS-CoV-2抗体。
然而，即使能够识别出具有高效价中和抗体的恢复患者，单一个体的血浆也不太可能治疗多名患者。因此，虽然目前的恢复期血清治疗方法可能能够预防或治疗少数患者的COVID-19，但该解决方案并不能满足人类在大流行期间和之后的更大需求。
当前疫苗的概述和挑战
世界各地的临床医生和研究人员正致力于开发各种解决方案，以减轻由SARS-CoV-2病毒引起的大流行。这些解决方案包括可以预防COVID-19的疫苗和抗病毒治疗，以减少疾病的严重程度和症状。对可预见的未来的预期是，天然和疫苗诱导的免疫很可能不会长期存在，因此，如有必要，需要每6个月频繁接种具有成本效益且安全的疫苗，以维持人群的强大免疫力。因此，有效的预防性COVID-19疫苗的关键设计特征是：i)诱导SARS-CoV-2病毒中和IgG效价的强效能力和T辅助1型(Th1)细胞应答，优选地在单次给药后；ii)可接受的安全性和耐受性特征，特别是对于由反应原性(全身效应)和注射部位(局部效应)引起的炎症，在可生产性和疫苗效力方面有利的商品成本(COG)决定了剂量-频率和剂量水平，以及合适的供应链途径，包括足够的储存保质期和稳健的供试品制备和施用程序。
减毒活病毒或灭活全病毒疫苗代表了经典策略。全病毒疫苗的主要优势是其固有免疫原性和刺激Toll样受体(TLR，包括TLR 3、TLR 7/8和TLR 9)的能力。然而，活病毒疫苗通常需要大量另外检测来确认其安全性。鉴于免疫接种活或灭活全病毒SARS冠状病毒疫苗后感染性增加的发现，这对于冠状病毒疫苗而言尤其是个问题。Johnson&Johnson正在使用Janssen的
Figure BDA0003950764700000181
腺病毒载体，该载体以他们的
Figure BDA0003950764700000182
细胞系技术生产，用于产生他们的先导疫苗JNJ-78436735，该疫苗最近已完成3期试验并已获批在美国紧急用药。这项技术尝试产生一种病毒载体以用据称是良性腺病毒载体代替整个病毒，该载体携带部分SARS-CoV-2病毒DNA。然而，使用JNJ-78436735遇到了导致临床试验暂停的极严重不良事件(SAE)。
SARS冠状病毒疫苗早期开发的另外两个障碍是发现1)Th2介导的嗜酸性粒细胞浸润形式的非期望免疫增强作用和2)由ADE驱动的病毒感染性增加，这在免疫接种全病毒疫苗和完全SP疫苗后的攻击感染之后发生。仍在研究Th2介导的嗜酸性粒细胞浸润和肺部病理在SARS-CoV-2感染中的风险，但已在受呼吸道合胞病毒(RSV)攻击或免疫接种全RSV疫苗的婴儿和动物中发现。
ADE是其他病毒疫苗的不利特征，包括用于原始SARS-CoV、登革热病毒和寨卡病毒感染的疫苗，其中疫苗诱导的Ab浓度或亲和力太低而无法中和病毒感染，而是与倾向于通过Ab的Fc结构域与骨髓细胞表面上的Fcγ受体相互作用的病毒形成免疫复合物。此类Ab未中和病毒感染或诱导Fcγ介导的病毒清除(Li)，而是通过直接增加通过Fcγ受体的病毒摄取或通过激活下游途径促进病毒在细胞内复制以拮抗先天免疫而有助于病毒感染(在Sun中综述)。在ADE和Th2免疫增强中，有证据表明猫IgG2a mAb(可能是Th2同种型)可以介导这两种不利条件，而IgG1 mAb(已知具有强效应子功能，即Th1同种型)可以避免这种影响。
除了引起ADE和/或Th2免疫增强的风险之外，病毒载体疫苗的另一个挑战是相对较低的可生产性产量，因此由于基于鸡蛋的生产或细胞表达系统(Ewer)导致的商品成本(COG)较高。
作为可选方案，用于COVID-19的核酸表达载体疫苗平台编码主要冠状病毒靶抗原(Ag)，即刺突蛋白(SP)，这通过其结合宿主受体ACE2来介导病毒的感染机制。已通过3期试验的此类疫苗的两个实例是编码由BioNTech/Pfizer开发的全长SP的mRNA疫苗BNT162b2和Moderna mRNA-1273。这两种疫苗均已报告非常积极的3期结果，其在防止症状性SARS-CoV-2病毒感染方面的有效性超过90％，导致最近获得美国FDA的紧急使用授权(EUA)。用RNA或DNA进行免疫的概念始于1993年在小鼠中显示出对流感的保护性免疫的有前景的结果，但几十年来这些发现并没有转化成人体中的类似发现。此外，虽然这些RNA和DNA表达载体疫苗是非复制性的，但许多这些RNA和DNA表达载体疫苗在诱导预期的免疫应答后仍能很好地内源性产生靶病毒Ag，这方面最终可能产生对病毒的免疫耐受性，这是日益受到关注并且可能称为这种当前的COVID-19mRNA疫苗的实际风险。这些核酸疫苗的其他挑战是应答的持久性低，可能需要过于频繁的给药，以及由于通过化学合成的繁琐可生产性而导致的不利COG。此外，由于RNA的固有不稳定性，产品必须在冷冻条件下保存和运输，这使得世界上大部分地区都很难获得。
作为另一种选择，重组亚单位疫苗依赖于引发针对SP的免疫应答，以防止其与宿主靶蛋白ACE2对接。此类疫苗包含全部或部分SP，而不是编码蛋白质的DNA或RNA，然后将其与佐剂混合以增强免疫应答。由于蛋白质相对于RNA和DNA具有固有稳定性，亚单位疫苗的储存和运输要求不那么严格。开发重组亚单位疫苗的公司包括Novavax，该公司已开发并生产基于SP重组表达的免疫原性病毒样纳米颗粒，NVX-Cov2373，其采用基于皂苷的佐剂系统Matrix-MTM配制而成，以及Clover Biopharmaceuticals，该公司正在使用其专利
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技术开发由三聚SARS-CoV-2SP组成的亚单位疫苗。然而，已知全长SP靶Ag在细胞表达系统中的表达产量较低，并且已知当用于SARS疫苗时，诱导针对SP的非中和表位的抗SP IgG效价，这又可以介导增加的病毒感染性(即ADE)和由肺嗜酸性粒细胞增多引起的炎症(即Th2介导的免疫增强，下文讨论)。仅由SARS SP的受体结合结构域(RBD)组成的亚单位疫苗具有减轻这些安全性挑战的潜力。
由贝勒医学院德克萨斯儿童医院疫苗开发中心领导的联盟已开发并检测了仅由SARS SP的受体结合结构域(RBD)组成的亚单位疫苗，并且当与明矾一起配制时，这种基于RBD的疫苗除了避免ADE和免疫增强作用外，还可以在同源病毒攻击时引发高水平的保护性免疫。初步发现SARS和SARS-CoV-2 RBD表现出超过80％氨基酸相似性并结合相同的ACE2靶标，这为开发其中一种蛋白Ag作为亚单位疫苗提供了机会。事实上，这种亚单位疫苗的概念验证已在MERS和SARS感染的冠状病毒SP/RBD Ag上成功证明。
目前正在开发的170多种SARS-CoV-2候选疫苗中正在实施其中一些(但不是全部)特性，包括活病毒、核酸和重组蛋白亚基，它们可能最终有望成为针对COVID-19的预防性疫苗。然而，每种疫苗策略在生产、安全性和有效性方面均具有独特的优势和挑战，必须同时以最佳方式进行管理。
本公开涉及制备和使用新型融合蛋白的方法，其实现以成本效益的方式生产大量针对SARS-CoV-2病毒的重组亚单位疫苗，该疫苗可以在温和的温度下运输和储存。本公开具体涉及用于制备和使用用于预防性、治疗性或加强疫苗的融合蛋白的方法，该疫苗可有效地使患者产生针对SARS-CoV-2病毒的抗病毒抗体。使用SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白使患者产生针对SARS-CoV-2病毒受体结合结构域(RBD)部分的内源性抗体，预期其成本效益显著高于重组产生抗SARS-CoV-2治疗性抗体，然后注射到患者体内。
在实例中，可以将包含SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的加强疫苗作为抗体扩增治疗(AAT)施用已从COVID-19恢复的患者，以增加他们的抗SARS-CoV-2抗体效价，使得他们捐献的血清用作恢复期血清治疗，可用于治疗更多人。恢复的患者可以在每次新血清捐献前数周施用这种AAT，这提高提取血清的抗SARS-CoV-2抗体效价，从而显著增加每次捐赠可以治疗的病毒患者数量。
在实例中，SARS-CoV-2-RBD-IgG-Fc融合蛋白可用于检测从个体提取的血清中的抗SARS-CoV-2抗体。使用SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白作为关键试剂来构建检测试剂盒的能力，以可靠地确定血清中抗SARS-CoV-2抗体的存在和浓度，使临床医生能够确定已感染病毒并从病毒恢复的个体，这在患者可能出现很少症状或没有症状的情况下尤为重要。在实例中，此类检测试剂盒可用于评价新兴候选SARS-CoV-2疫苗的性能，通过快速且具有成本效益的能力来确定在疫苗接种后提取的血清中宿主产生的抗SARS-CoV-2抗体的存在和浓度。这种检测试剂盒的广泛部署预期将明显增加恢复期血清的潜在供体的数量。
在实例中，将SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的药物组合物用于已感染SARS-CoV-2病毒并已感染COVID-19的患者，以限制其感染范围并改善疾病。在实例中，SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白结合ACE2受体，阻断SARS-CoV-2病毒受体结合结构域(RBD)的进一步摄取，同时还生成中和SARS-CoV-2病毒的抗体，使暴露于宿主细胞的RBD更少。
在实例中，SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的药物组合物作为预防性COVID-19疫苗施用于未感染SARS-CoV-2病毒的个体，导致个人产生自己的抗SARS-CoV-2抗体池和免疫力。
等同物和定义
如本文所用，冠词“一种(a和an)”是指冠词的语法对象中的一个或多于一个，例如至少一个。当与本文中的术语“包含”结合使用时，使用的词语“一种(a或an)”可以意指“一个”，但它还与“一个或更多”、“至少一个”和“一个或多个”的含义一致。如本文所用，短语“和/或”在两个或更多个项目的列表中使用时，意指所列项目中的任何一个可以单独使用，或者两个或更多个所列项目的任何组合均可以使用。例如，如果组合物被描述为含有或不包括组分A、B和/或C，则该组合物可以含有或不包括单独A；单独B；单独C；A和B的组合；A和C的组合；B和C的组合；或A、B和C的组合。
如本文所用，“约”和“大约”通常表示给定测量的性质或精密度的测量量的可接受的误差程度。
如本文所用，有效治疗病症(例如，本文所述的病症)的分子、化合物、缀合物或物质的量、“治疗有效量”或“有效量”是指该分子、化合物、缀合物或物质在向受试者单次或多次给药后，在治疗受试者，或在治愈、减轻、缓解或改善患有病症(例如，本文所述的病症)的受试者超过在没有这种治疗的情况下预期的结果的量。
如本文所用，术语“类似物”是指具有与另一种化合物或缀合物相似的化学结构但在至少一个方面不同的化合物或缀合物(例如本文所述的化合物或缀合物，例如，RBD)。
如本文所用，术语“抗原”是指导致患者免疫系统产生针对其的抗体的任何物质。抗原可以是来自环境的物质，例如化学物质、细菌、病毒或花粉，或者抗原还可以在体内形成。抗原的实例是SARS-CoV-2病毒。
如本文所用，术语“抗体”或“抗体分子”是指免疫球蛋白分子(Ig)，或免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原(例如与抗原发生免疫反应)的结合位点的分子。如本文所用，术语“抗体结构域”是指免疫球蛋白的可变区或恒定区。本领域记载了人抗体包含几个类别，例如在哺乳动物(例如人和犬)的情况下的IgA、IgM或IgG。哺乳动物IgG免疫球蛋白的类别可以进一步分为不同亚型，例如犬的IgGA、IgGB、IgGC和IgGD，以及人的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。本领域技术人员将认识到给定免疫球蛋白类别的免疫球蛋白亚型将包含彼此不同的氨基酸序列、结构和功能特性(例如，对Fc(γ)受体或ACE2受体的不同结合亲和力)。“特异性结合”或“与其发生免疫反应”意指抗体与期望的抗原的一个或多个抗原决定簇反应并且对其他多肽具有较低亲和力，例如与其他多肽不反应。
如本文所用，术语“二聚体”是指包含共价连接的两个多肽的蛋白质或融合蛋白。在实施方式中，两个相同多肽共价连接(例如，通过二硫键)形成“同型二聚体”(在图1和图2中以图表方式表示，图1是供参考的胰岛素-Fc融合蛋白的图示，图2是SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的图示)。更详细地参考图1，胰岛素多肽(包含通过C链肽与胰岛素A链类似物连接的胰岛素B链类似物)可以具有来自天然胰岛素的一个或多个氨基酸突变。胰岛素肽通过接头与Fc片段连接。二硫键(实际上二硫键的总数可以大于或小于图1所示的数量)从两个相同Fc融合蛋白构建同型二聚体。更详细地参考图2，SARS-CoV-2 RBD片段可以包含完整SARS-CoV-2表面糖蛋白的一部分。RBD片段可以具有来自天然SARS-CoV-2表面糖蛋白的一个或多个氨基酸突变。使用任选的接头将RBD片段与Fc片段连接(在一些实例中，RBD片段与Fc片段直接共价连接而没有接头)。二硫键从两个相同SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白构建同型二聚体(实际上二硫键的总数可以大于或小于图2中所示的数量)。Fc融合蛋白同型二聚体可以由单个核酸分子编码，其中通过首先形成Fc融合蛋白单体，然后在细胞内进一步加工后将两个相同Fc融合蛋白单体组装成同型二聚体，在细胞内重组制备同型二聚体。
如本文所用，术语“多聚体”、“多聚体的”或“多聚体状态”是指非共价缔合形式的Fc融合蛋白二聚体，其可以与Fc融合蛋白二聚体平衡或可以作为永久聚集形式的Fc融合蛋白二聚体(例如，Fc融合蛋白同型二聚体的二聚体、Fc融合蛋白同型二聚体的三聚体、Fc融合蛋白同型二聚体的四聚体，或含有五个或更多个Fc融合蛋白同型二聚体的更高阶聚集体)。可以预期，多聚体形式的Fc融合蛋白可以具有与融合蛋白同型二聚体不同的物理、稳定性或药理活性。
如本文所用，RBD-Fc融合蛋白和SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白(这些术语可以互换使用)是指与SARS-CoV-2刺突蛋白(SP)受体结合结构域(SP/RBD或RBD)或其类似物连接的人免疫球蛋白Fc结构域，可用于生成特异性结合SARS-CoV-2抗原的抗体。为了便于参考，术语“RBD”和/或“SP/RBD”在本文中可以互换使用，并且除非上下文另有说明，否则涵盖由受体结合结构域本身、受体结合的较小片段，或包含受体结合结构域和来自刺突蛋白片段的邻近残基的更大变体组成的蛋白质残基结构域，条件是片段和/或更大变体保留RBD的活性(例如，保留结合刺突蛋白受体的能力)。如本文所用，通用术语“融合蛋白”和“Fc融合蛋白”是指包含多于一个部分的蛋白质，例如来自不同来源(例如，不同的蛋白质、多肽、细胞等)，它们通过肽键共价连接。Fc融合蛋白通过以下方式共价连接：(i)将编码每个部分的基因连接成单个核酸分子，和(ii)在宿主细胞(例如，HEK细胞或CHO细胞)中表达核酸分子编码的蛋白质。完全重组合成方法优于单独合成治疗性蛋白质和Fc片段然后进行化学缀合的方法。化学缀合步骤和随后的纯化过程增加生产复杂性，降低产品产量，并增加成本。
如本文所用，术语“生物活性”、“活性”、“生物学活性”、“效力”、“生物活性效力”或“生物效力”是指Fc融合蛋白结合或激活细胞受体和/或产生或减少天然或外来物质的程度。如本文所用，“体外活性”或“受体活性”是指Fc融合蛋白与细胞受体结合的亲和力，并且通常通过使Fc融合蛋白达到其最大结合的一半(即EC50值)的Fc融合蛋白浓度来测量。例如，SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的“生物活性”是指在细胞测定或靶受试者中SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白诱导抗SARS-CoV-2抗体产生的程度。
如本文所用，术语“生物合成”、“重组合成”或“重组制备”是指通过用编码Fc融合蛋白(例如，其中整个Fc融合蛋白由单个核酸分子编码)的核酸分子(例如，载体)转染宿主细胞而在宿主细胞内表达Fc融合蛋白的过程。示例性宿主细胞包括哺乳动物细胞，例如，HEK293细胞或CHO细胞。可以使用本领域的标准方法培养细胞，并且可以使用本领域的标准方法从细胞培养物中收获和纯化表达的Fc融合蛋白。
如本文所用，术语“细胞表面受体”是指通常在细胞膜的外表面上发现并且与可溶性分子(例如在血液供应中循环的分子)相互作用的分子(例如蛋白质)。在一些实施方式中，细胞表面受体可以包括宿主细胞受体(例如，ACE2受体)或Fc受体，其与抗体的Fc片段或Fc区(例如，Fc(γ)受体，例如Fc(γ)受体I，或Fc新生儿受体，例如FcRn)结合。如本文所用，“体外活性”或“Fc(γ)受体活性”或“Fc(γ)受体结合”或“FcRn受体活性”或“FcRn结合”是指Fc融合蛋白与Fc受体(例如Fc(γ)受体或FcRn受体)结合的亲和力，并且通常通过Fc融合蛋白的浓度来测量，该浓度导致Fc融合蛋白达到其最大结合的一半(即EC50值)，如使用在酶标仪上测量的OD 450nm值在测定(例如，酶联免疫吸附试验(ELISA)测定)中测量的。
如本文所用，术语“免疫原性的”或“免疫原性”是指给定分子(例如，本发明的Fc融合蛋白)激发靶受试者的免疫系统的能力，使得在施用该分子后，受试者产生能够结合分子的全部或特定部分的抗体(即抗药物抗体或ADA)。如本文所用，术语“中和”、“中和抗体”或“中和抗药物抗体”是指抗体在靶受试者中干扰全部或部分Fc融合蛋白生物活性的能力。例如，在向人施用SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合分子的情况下，免疫原性是指与分子的SARS-CoV-2 RBD部分结合的抗体，因为分子的hIgG-Fc部分对于人是内源的，因此不太可能引发抗hIgG-Fc抗体。同样，当那些抗SARS-CoV-2RBD抗体抑制SARS-CoV-2 RBD与ACE2受体之间的结合时，通过施用SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合分子产生的抗体具有中和作用，这与受试者体内SARS-CoV-2 RBD的生物活性直接相关。
如本文所用，术语“单体”是指包含单一多肽的蛋白质或融合蛋白。在实施方式中，“单体”是蛋白质或融合蛋白，例如单一多肽，包含RBD多肽和Fc片段多肽，其中RBD和Fc片段多肽通过肽键连接形成单一多肽。在实施方式中，单体由单一核酸分子编码。
如本文所用并且如图1和图2中所示，“N-末端”是指由含有游离胺基团的氨基酸起始的蛋白质或多肽的起点，该游离胺基团是氨基酸的α-氨基(例如，与一个碳原子共价连接的游离氨基，该碳原子位于与第二碳原子邻近的位置，其中第二碳原子是氨基酸的羰基的一部分)。如本文所用并且如图1和图2所示，“C-末端”是指蛋白质或多肽的末端，该末端由含有羧酸基团的氨基酸终止，其中羧酸基团的碳原子位于与氨基酸的α-氨基邻近的位置。
如本文所用，术语“载体”在本文中用于指代稀释剂、赋形剂、溶媒等，其中可以分散、乳化或封装Fc融合蛋白用于施用。合适的载体将是药学上可接受的。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在生物学上或其他方面不是非期望的，因为它可以在没有过度毒性、刺激或过敏反应的情况下施用于受试者，并且不引起不可接受的生物学效应或以有害方式与含有它的组合物的任何其他组分相互作用。如本领域技术人员所熟知的，将自然选择药学上可接受的载体以使化合物或其他试剂的任何降解最小化并且使受试者中的任何不良副作用最小化。药学上可接受的成分包括那些可用于兽医用途以及人用药物用途的成分，并且取决于施用途径。可以使用与赋形剂(或多种)和Fc融合蛋白(或多种)相容的任何载体。
如本文所用，“药效学”或“PD”通常是指Fc融合蛋白在受试者中的生物学效应。例如，在本文中，SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的PD是指在施用SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白之后受试者中抗SARS-CoV-2抗体效价随时间的测量值。
如本文所用，“药代动力学”或“PK”通常是指Fc融合蛋白与受试者身体在其吸收、分布、代谢和排泄方面的特征性相互作用。例如，在本文中，PK是指在施用SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白之后的给定时间，受试者的血液或血清中SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的浓度。如本文所用，“半衰期”是指受试者血液或血清中的Fc融合蛋白浓度达到其原始值的一半所用的时间，如从药物消除的一阶指数衰减模型计算。具有更长“半衰期”值的Fc融合蛋白在靶受试者中表现出更长的作用持续时间。
如本文所用的术语氨基酸或核苷酸序列中的“序列同一性”、“序列同源性”、“同源性”或“相同”描述了当变体的核苷酸序列或氨基酸序列的指定的连续片段与参考序列的核苷酸序列或氨基酸序列进行比对和比较时，在变体和参考序列中发现相同的核苷酸或氨基酸残基。用于序列比对和确定序列之间同一性的方法是本领域已知的，包括使用ClustalOmega，其组织、比对和比较序列的相似性，其中软件突出显示每个序列位置并比较该位置的所有序列，以及分配以下评分之一：“*”(星号)表示具有单个完全保守残基的序列位置，“:”(冒号)表示在Gonnet PAM 250矩阵中评分大于0.5的具有强相似属性的基团之间的保守性，和“.”(句点)表示在Gonnet PAM 250矩阵中评分小于或等于0.5的具有弱相似属性的基团之间的保守性，“-”(破折号)表示序列空位，表示在序列的某个范围内的特定的比较集中不存在局部同源性，以及空格“”表示比较序列中该特定位置的序列同源性很小或没有序列同源性。
关于两个核苷酸序列的最佳比对，变体核苷酸序列的连续区段可以具有相对于参考核苷酸序列的额外的核苷酸或缺失的核苷酸。同样，为了两个氨基酸序列的最佳比对目的，变体氨基酸序列的连续区段可以相对于参考氨基酸序列具有额外的氨基酸残基或缺失的氨基酸残基。在一些实施方式中，用于与参考核苷酸序列或参考氨基酸序列比较的连续区段将包含至少6、10、15或20个连续核苷酸或氨基酸残基，并且可以是30、40、50、100或更多个核苷酸或氨基酸残基。可以通过分配空位罚分来校正与在变体的核苷酸序列或氨基酸序列中包含空位相关的增加的序列同一性。序列比对的方法是本领域已知的。
在实施方式中，使用数学算法完成两个序列之间的同一性百分比或“同源性”的确定。例如，使用Smith-Waterman同源性搜索算法确定氨基酸序列的同一性百分比，该算法使用具有12的空位开放罚分和2的空位延伸罚分的仿射6空位搜索，BLOSUM矩阵62。在实施方式中，使用Smith-Waterman同源性搜索算法确定核苷酸序列的同一性百分比，该算法使用25的空位开放罚分和5的空位延伸罚分。可以使用例如来自TimeLogic的DeCypher硬件加速器来执行这种序列同一性的确定。
如本文所用，术语“同源性”用于通过定位例如β链、螺旋和折叠的共同结构特征和共同空间分布来比较两种或更多种蛋白质。因此，同源蛋白结构由空间分析定义。测量结构同源性涉及计算空间的几何拓扑特征。用于生成和分析三维(3D)蛋白质结构的一种方法是同源性建模(也称为比较建模或基于知识的建模)，其工作原理是根据3D相似性反映2D相似性这一事实来查找相似序列。同源结构并不意味着序列相似性是必要条件。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”旨在包括小鼠、非人类灵长类动物(NHP)、兔、犬科动物和人。示例性犬科动物受试者包括患有疾病或病症(例如，糖尿病或本文所述的另一种疾病或病症)的犬，或正常受试者。示例性人受试者包括患有疾病的个体，例如COVID-19，包括COVID-19或SARS-Co-V-2感染的变体，或另一种病毒，既往患有本文所述的疾病或病症，或正常受试者。
如本文所用，术语“效价”或“产量”是指每体积细胞培养物由生物合成(例如，在哺乳动物细胞中，例如，在HEK293细胞或CHO细胞中)产生的融合蛋白产物(例如，本文所述的Fc融合蛋白)的量。产物的量可以在产生过程的任何步骤(例如，纯化之前或之后)确定，但产量或效价始终以每体积的原始细胞培养物表示。如本文所用，术语“产物产量”或“总蛋白产量”是指由细胞表达并通过至少一个亲和层析步骤(例如，蛋白A或蛋白G)纯化的Fc融合蛋白的总量并且包括Fc融合蛋白单体、Fc融合蛋白的同型二聚体和Fc融合蛋白的同型二聚体的高阶分子聚集体。如本文所用，术语“同型二聚体百分比”或“同型二聚体％”是指作为期望的同型二聚体的融合蛋白产物(例如，本文所述的Fc融合蛋白)的比例。如本文所用，术语“同型二聚体效价”是指蛋白质A纯化步骤后报告的每体积细胞培养物的同型二聚体％和总蛋白质产量的乘积。
如本文所用，患有疾病或病症的受试者的术语“治疗”或“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指为了防止感染的发展或改变感染的病理学而进行的干预。因此，“治疗”是指治疗性治疗和预防性或预防措施。治疗剂可以直接减少感染的病理学或使感染更容易受其他治疗剂或例如宿主免疫系统的治疗。治疗后的改善可表现为此类症状的减少或消除。因此，组合物可用于通过预防可观察到的感染临床症状的发展，和/或减少临床症状的发生率或严重程度和/或感染影响，和/或缩短感染/症状/效果的持续时间来治疗感染。治疗患有疾病或病症的受试者可以指患有疾病或病症的受试者是指使受试者接受治疗方案，例如，施用融合蛋白(例如本文所述的Fc融合蛋白)，或融合蛋白(例如本文所述的Fc融合蛋白)的药物组合物，使得疾病或病症的至少一种症状得到治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善或改进。治疗包括施用有效量以减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响疾病或病症，或疾病或病症的症状。治疗包括施用有效量以在正常受试者或既往患有疾病或病症的受试者中产生针对疾病或病症的抗体。治疗可以抑制疾病或病症的症状恶化或加重。
如本文所用，“预防性疫苗”是指将抗原引入患者的治疗，其目标是患者的免疫系统将产生针对该抗原的抗体并增加或改善受试者对相关疾病或病毒的免疫应答。换言之，与未接种疫苗的受试者相比，接种疫苗的受试者对相关病毒引起的疾病或病状具有更高程度的抵抗力。这种抵抗力可以通过疾病症状的严重程度或持续时间的降低、病毒脱落的减少或消除以及在一些情况下预防疫苗接种受试者中可观察到的感染症状来表现。在实施方式中，用预防性疫苗治疗的患者在用预防性疫苗治疗之前不具有针对该抗原的抗体(另称为，该患者是“抗体空白的”)。
如本文所用，“治疗性疫苗”是指将抗原引入已经患有相关疾病或病毒的患者的治疗，其目标是患者的免疫系统将产生针对该抗原的抗体，使患者的身体能够更努力对抗已经患有的疾病或病毒。
如本文所用，“加强疫苗”是指在患者既往已接受疫苗的初始施用之后，或在患者通过已患有相关疾病或病毒并从相关疾病或病毒恢复而获得抗体之后，额外施用疫苗。在一些实例中，定期需要另外剂量的疫苗以通过增加患者的抗原抗体效价来“增强”患者对疾病或引起抗原的病毒的免疫力。
如本文所用，当提及包括SARS-CoV-2表面糖蛋白的受体结合结构域(RBD)在内的SARS-CoV-2表面糖蛋白的一些部分中的氨基酸时，所引用的氨基酸位置被称为SEQ ID NO:1的SARS-CoV-2表面糖蛋白中氨基酸的位置。例如，提及SARS-CoV-2 RBD的第331位氨基酸突变是指SEQ ID NO:1中第331位的氨基酸，即使在SARS-CoV-2 RBD包含仅部分SEQ ID NO:1时。
如本文所用，“RBD片段”是指SARS-CoV-2-hIgG-Fc融合蛋白的一部分，其包含SEQID NO:1的SARS-CoV-2表面糖蛋白的受体结合结构域(RBD)的一些部分，除非上下文另有说明，否则还可能包括刺突蛋白(SP)的邻近残基。在实例中，SARS-CoV-2表面糖蛋白的RBD片段部分与Fc片段连接，如图2所示。
Fc融合蛋白疫苗的基本原理
如上所述，相对于灭活或减毒活病毒和基于核酸载体的疫苗形式，基于重组蛋白的亚单位疫苗方法具有安全性和多次加强剂量的优势，此外还实现选择性使用最优势表位以产生有效的中和抗体效价。此外，这种基于蛋白质的疫苗在大批量生产时更具成本效益，并且在温和的温度下稳定，便于运输和储存。然而，考虑到重组SARS-CoV-2SP亚单位疫苗在免疫学空白人群中诱导强保护性免疫应答的挑战，SP抗原必须经修饰和/或配制以具有另外的免疫增强特征，用于克服初始T细胞和B细胞的激活阈值。
犬胰岛素-Fc融合蛋白的实验经验
通过将治疗性蛋白质与免疫球蛋白Fc结构域连接形成的融合蛋白的一个实例是胰岛素-Fc融合蛋白。该结构已用于为糖尿病患者提供超长效基础胰岛素治疗。作为治疗性蛋白质的胰岛素类似物与Fc结构域通过肽接头的组合已显示在体内实现显著更长的活性，以天为单位。用于治疗猫和犬糖尿病的超长效胰岛素-Fc融合蛋白的一个实例描述于WO2020006529A1中。在来自WO 2020006529A1的实例中，示例性胰岛素类似物是：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYC(SEQ ID NO:28)
和用于将治疗性蛋白质(即胰岛素类似物)与Fc结构域连接的示例性接头是：GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO:27)。
适用于糖尿病的超长效治疗的给定物种(例如，犬、猫或人)的胰岛素-Fc融合蛋白分子应该可以在哺乳动物细胞(例如人胚胎肾(HEK，例如HEK293)细胞)中生产，具有期望的同型二聚体产物的可接受效价(例如，来自瞬时转染的HEK细胞的同型二聚体效价大于50mg/L，来自瞬时转染的HEK细胞大于75mg/L，来自瞬时转染的HEK细胞大于100mg/L等)。经验表明，低于50mg/L的同型二聚体效价不太可能在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生商业生产的同型二聚体效价，从而满足兽用产品严格的低生产成本要求。
根据实施例45在HEK细胞中或根据实施例46在CHO细胞中生产WO 2020006529A1(通过引用并入本文)和本文中描述的用于犬的胰岛素-Fc融合蛋白。根据实施例47纯化胰岛素-Fc融合蛋白。使用常规纯化方法，仅包含犬IgGA和犬IgGB免疫球蛋白Fc片段的化合物显示出任何可观的蛋白质产量。根据实施例48通过非还原性和还原性CE-SDS确认胰岛素-Fc融合蛋白的结构，并且根据实施例49通过去除聚糖的LC-MS确认序列。根据实施例50测量纯度(如通过融合蛋白产量的同型二聚体百分比评估的)。犬IgGA形式的胰岛素-Fc融合蛋白高度聚集，具有低水平的生物活性，而犬IgGB形式的胰岛素-Fc融合蛋白表现出低程度的聚集(即高同型二聚体％)，高效价期望的同型二聚体(即，同型二聚体效价大于50mg/L)，以及犬的可观水平的长期葡萄糖降低生物活性。因此，犬IgGB(SEQ ID NO:26)免疫球蛋白Fc片段是用于犬的胰岛素-Fc融合蛋白的优选Fc片段。
DCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:26)
示例性犬超长效胰岛素-Fc融合蛋白包含通过SEQ ID NO:27的肽接头具有SEQ IDNO:26的犬天然IgGB片段的SEQ ID NO:28的胰岛素类似物：
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:29)
根据实施例51评估SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白与Fc(γ)受体I(RI)的结合。由于犬受体I无法商购获得，因此使用人Fc(γ)受体I(即rhFc(γ)受体I)作为替代哺乳动物受体。将与rhFc(γ)受体I与SEQ ID NO:29的结合成比例的OD值与添加到每个的rhFc(γ)受体I的对数浓度作图，以使用GraphPad Prism软件生成结合曲线。结果如图3所示，示出了对于所有Fc(γ)受体，OD450值随SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白剂量的增加而增加。
根据实施例52评价在定期施用根据实施例45在HEK细胞中生产的SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白后的体内药效学(PD)。测试群体由使用四氧嘧啶-链脲菌素化学诱导的患有糖尿病的六只比格犬组成，每只体重大约10kg。根据实施例53，在为SEQ ID NO:29实验室测试的受试者的六只患有化学诱导的糖尿病的比格犬中每周测量抗胰岛素抗体(AIA)效价，持续8周。图4显示了患有化学诱导的糖尿病的六只比格犬，在连续八次每周给药SEQ IDNO:29的胰岛素-Fc融合蛋白的AIA效价。图5显示了从试验的第0天开始，患有化学诱导的糖尿病的六只比格犬经过连续八次每周给药SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白的AIA效价的百分比变化。数据表明，与SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白的八次施用给药相比，比格犬的AIA效价没有显著增加。
基于对化学诱导的糖尿病比格犬的这些阳性实验室测试结果，根据实施例52开始对不同年龄、品种和糖尿病疾病程度的实际客户所有的、天然存在的糖尿病犬进行现场试验。现场试验中的客户犬在试验开始前都一直在用已知的兽用或人胰岛素产品进行胰岛素治疗，并且根据实施例52中所述的方案1或方案2给予SEQ ID NO:29。
在根据实施例54的疗程中，每周再次测量AIA效价。出乎意料的是，与在化学诱导的糖尿病比格犬中获得的结果相比，该“野生”患者群体中的几只(8/20)客户犬表现出抗胰岛素抗体显著增加。0.15的归一化AIA效价被认为是客户犬被认为对SEQ ID NO:29具有免疫原性的最低测量值。对于在治疗开始时具有非零AIA效价的客户犬，如果在用SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白治疗后AIA增加超过一倍，则SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白被认为对该特定客户犬具有免疫原性。图6是每只客户犬的归一化AIA效价图，其中SEQ IDNO:29的胰岛素-Fc融合蛋白被认为具有免疫原性，如在其治疗期间每周测量的(对于每只犬指示了治疗所遵循的实施例52的具体方案)。在图6所示的每只犬中，AIA中和SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白的治疗效果，使其不再能够控制客户所有的糖尿病犬的血糖水平。观察到的免疫原性也是出乎意料的，因为胰岛素-Fc融合蛋白的胰岛素类似物部分是犬的近乎天然的肽。此外，胰岛素-Fc融合蛋白的IgGB Fc片段部分是天然犬Fc片段。结果表明，犬IgGB Fc片段的比活性能够诱导对融合蛋白(即胰岛素)的治疗性蛋白区域特异的抗体效价的显著和持久增加。除了显示中和AIA效价显著增加外，这些犬在其他方面通过重复给药保持健康，并且没有出现任何与治疗相关的过敏反应或细胞因子风暴的体征。
在一些情况下，当客户犬开始表现出高水平的AIA时，SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白的给药被中断，此时AIA效价开始下降(参见例如图4中的犬2)。图7是在每周一次给药的12周期间例如犬2的归一化AIA效价图。可以看出，AIA效价在第4剂(第21天)后开始明显增加，并且AIA效价在第6剂(第35天)后开始急剧增加。第8剂(第49天)后停止给药，并且在第56天或第63天不施用药物。图7示出了AIA效价增长立即减慢，然后AIA效价在第56天后开始下降。在第70天恢复给药方案，在第70天给药，并在第77天再次给药。在第70天恢复给药后的AIA效价增长匹配或超过7周直至停止给药时的最大AIA效价增长，表明与最初连续给药的增进相比，抗药物抗体的效价出人意料地在明显较短的时间内恢复。这种强回忆反应可能表明反应性记忆免疫细胞群。
来自客户拥有的糖尿病犬的现场试验的另一观察结果是，在用根据实施例46在CHO细胞中制备的SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白和根据实施例45在HEK细胞中制备的SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白治疗的犬中存在明显差异，CHO制备的SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白显示出显著较高的抗药物抗体流行率，如图8所示。
每个IgG片段在Fc区每条重链的CH2结构域中包含保守的天冬酰胺(N)-糖基化位点。在本文中，用于指代保守的N-糖基化位点的符号是“cNg”(如图1和图2所示)。在治疗性单克隆抗体中，糖基化在CH2区的保守氨基酸N297处(如图1和图2所示)。对于胰岛素-Fc融合蛋白，cNg位点距胰岛素-Fc融合蛋白B链N-末端的绝对位置取决于胰岛素多肽的长度、接头的长度以及任何在cNg位点之前的Fc片段中删失的氨基酸。在本文中，用于指代给定胰岛素-Fc融合蛋白序列中cNg位点的绝对位置的符号(如从胰岛素-Fc融合蛋白的B链的N-末端开始计数所测量)是“NB(编号)”。例如，如果cNg位点位于从B链N-末端计数的第151个氨基酸位置，则该位点的绝对位置称为cNg-NB151。另例如，如果cNg位点位于从B链N-末端计数的第151个氨基酸位置，并且该位点的天冬酰胺突变为丝氨酸，则该突变标注为“cNg-NB151-S”。
根据实施例45在HEK细胞中重组生产的融合蛋白与根据实施例46在CHO细胞中重组生产的融合蛋白之间的一个可能差异是在cNg位点处附接的寡糖的组成。鉴于犬IgGB亚型与Fc(γ)受体相互作用，重复注射后可能存在非期望的免疫原性风险。一种用于减少Fc(γ)相互作用的方法包括在宿主细胞合成过程中使Fc片段去糖基化或防止其糖基化。由于抗体中和药物的治疗价值，因此构建抗体显然不适合治疗慢性疾病(例如糖尿病)。因此，这导致尝试构建非糖基化的犬胰岛素-Fc融合蛋白。从合成的胰岛素-Fc融合蛋白中去除附接的聚糖的一种方法是突变cNg位点，以在宿主细胞产生过程中完全防止聚糖的附接。在本文中，用于描述cNg突变的符号是cNg-(取代的氨基酸)。例如，如果cNg位点的天冬酰胺突变为丝氨酸，则该突变被标注为“cNg-S”。具有cNg突变的犬IgGB Fc片段的一般表示显示在SEQID NO:30中：
DCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFX1GTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG
其中X1＝S、D、K、Q或A(SEQ ID NO:30)。
设计犬胰岛素-Fc融合蛋白，其包含具有X1＝S(以下粗体残基)的SEQ ID NO:30的IgGB Fc片段、SEQ ID NO:27的接头和以下胰岛素类似物：
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYC(SEQ ID NO:31)
所得胰岛素-Fc融合蛋白如下所示：
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(SEQ ID NO:32)
根据实施例45在HEK细胞中或根据实施例46在CHO细胞中生产SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白。根据实施例47纯化胰岛素-Fc融合蛋白。根据实施例48通过非还原和还原CE-SDS确认胰岛素-Fc融合蛋白的结构，并且根据实施例49通过去除聚糖的LC-MS确认序列。根据实施例50测量纯度(如通过融合蛋白产量的同型二聚体百分比评估的)。
该融合蛋白表现出与SEQ ID NO:29相似的期望体外和体内特性。如图3所示，唯一的区别是与SEQ ID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白相比，SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白的Fc(γ)RI结合亲和力显著降低。对五只不同年龄、品种和糖尿病疾病程度的糖尿病客户犬进行现场试验。现场试验中的五只客户犬在试验开始前都一直在用已知的兽用或人胰岛素产品的胰岛素治疗，并且每周一次给予SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白。
根据实施例54，在疗程中每周或尽可能频繁地再次测量AIA效价。与接受SEQ IDNO:29的胰岛素-Fc融合蛋白的犬相比，当给予SEQ ID NO:32的非糖基化胰岛素Fc融合蛋白时，该“野生”患者群体中的客户犬均未表现出胰岛素抗药物抗体。0.15的归一化AIA效价被认为是客户犬被认为对SEQ ID NO:32具有免疫原性的最低测量值。对于在治疗开始时具有非零AIA效价的客户犬，如果在用SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白治疗后AIA增加超过一倍，则认为客户犬具有免疫原性。图9是在其治疗持续期间测量的每只客户犬的归一化AIA效价图，表明在该“野生”患者群体中的五只客户犬中，当给予它们SEQ ID NO:32的非糖基化胰岛素-Fc融合蛋白时，没有一只表现出胰岛素抗药物抗体。如图10所示，这与接受SEQID NO:29的胰岛素-Fc融合蛋白的犬形成对比，其中总共有十二只犬表现出胰岛素抗药物抗体，相比于没有一只接受非糖基化的SEQ ID NO:32的胰岛素-Fc融合蛋白的犬表现出胰岛素抗药物抗体。
总之，结果表明，出乎意料的是，在实验室动物群体之外，某些Fc融合蛋白具有诱导针对治疗性肽或蛋白质组分的高效价抗体的潜力，并且这种应答可能在随后呈递治疗性肽或蛋白质组分。此外，这些初步数据表明，在已经对特定治疗性蛋白质或肽产生免疫应答的个体中更有可能诱导抗治疗性蛋白质或肽抗体。这些结果与许多已公开的结果形成对比，这些结果显示Fc融合蛋白有可能诱导对融合的治疗性肽或蛋白质的免疫耐受，并且当与IgG载体化学偶联时，半抗原如DNP、核苷或青霉噻唑基团(peniciloyl group)是高度耐受性半抗原载体缀合物。
对于用于治疗慢性疾病(即糖尿病)的治疗性蛋白质，例如胰岛素，抗胰岛素抗体使治疗无效。然而，上述结果导致了人们如何有效地设计Fc融合蛋白以诱导针对例如病毒抗原的抗体以中和其活性的独特见解。基于现场实验，期望的Fc融合蛋白应至少是靶受试者天然的(例如，人受试者的人Fc或hFc，犬受试者的犬Fc或dFc)，在Fc-cNg位点进行适当糖基化，并且能够结合Fc(γ)I受体。这些发现为开发针对例如新型冠状病毒SARS-CoV-2的新型治疗性Fc融合蛋白提供了机会。
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白
COVID-19的爆发对公众健康构成了严重威胁。迫切需要安全有效的解决方案来预防其病原体SARS-CoV-2病毒的感染。已识别表面糖蛋白(包括SARS-CoV-2刺突蛋白(SP)的受体结合结构域(RBD))，并且已发现SARS-CoV-2SP/RBD与人和蝙蝠血管紧张素-转化酶2(ACE2)受体有强结合力。SARS-CoV-2SP/RBD是外来抗原，是包含该抗原和糖基化人免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白(本文称为SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白或SP/RBD-Fc融合蛋白)，它是构建可以放大患者体内现有的抗体效价或在对SARS-CoV-2无或低免疫应答的患者中诱导新的抗体效价的融合蛋白的有前景的方法。具体地，制备和使用用于预防或加强疫苗的融合蛋白的方法可以有效地使患者产生针对SARS-CoV-2病毒的抗病毒抗体，从而满足这一紧迫需求，并将具有重要的公共卫生价值。
因此，目标是构建Fc融合蛋白，其含有SARS-CoV-2表面糖蛋白(或其类似物)的一些部分和含有倾向于糖基化以构建可生产的缀合物的位点或残基的人Fc片段(例如，人IgG1或hIgG1)，其以新的方式呈递抗原(SARS-CoV-2-SP/RBD)，使患者快速产生高效价的抗SARS-CoV-2抗体。
SP/RBD-Fc融合蛋白包含与人IgG1 Fc部分重组融合的SP/RBD的二价类似物，如图2所示，其将(i)促进将SP/RBD Ag集中递送至通过Fc(γ)受体使SP/RBD-Fc内化的局部APC，然后如图12所示，加工和呈递SP/RBD片段至CD4+Th细胞，这反过来促进(“帮助”)B细胞激活和抗SARS-CoV-2SP/RBD IgG(即Ab)的产生，如图12所示。此外，更直接和独特的机制可能是SP/RBD-Fc融合蛋白通过其Ag特异性B细胞受体(BCR)与现有的SARS-CoV-2特异性记忆B细胞直接结合。这种结合通过SEQ ID NO:19的SP/RBD二价特征在BCR交联时触发激活信号，导致在不存在CD4+Th细胞的情况下增强增殖和抗SARS-CoV-2IgG产生，如图12所示。此外，SP/RBD-Fc融合蛋白的Fc片段应增强SP/RBD的半衰期和对更多APC的生物暴露，因为细胞上表达的新生儿FcR(FcRn)受体结合能够延长大多数单克隆抗体(mAb)治疗剂的血清半衰期。
SARS-CoV-2的完整表面糖蛋白如下所示(GenBank：QHD43416.1)：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO:1)
根据GenBank QHD43416.1，SARS-CoV-2表面糖蛋白的刺突蛋白受体结合结构域(SP/RBD)包含表面糖蛋白从氨基酸330至氨基酸583的部分，如下所示：
PNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLE(SEQ ID NO:2)。
刺突蛋白的RBD包含SARS-CoV-2表面糖蛋白的氨基酸331至524，如下所示：
NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV(SEQ ID NO:8)
先前对胰岛素-Fc融合蛋白的研究，如WO 2018107117A1和WO 2020006529A1中所述，已证明蛋白质序列、接头序列和Fc结构域组成的选择均可能影响蛋白质产量、纯度和生物活性。
在为SARS-CoV-2-RBD-IgG-Fc融合蛋白选择病毒蛋白时，可以想象，可以选择包括SP/RBD的一些部分的表面糖蛋白子集。SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的病毒蛋白可以包含SARS-CoV-2表面糖蛋白的全部或部分SP/RBD。SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的病毒蛋白可以包含SARS-CoV-2表面糖蛋白的全部或部分非SP/RBD部分。在实例中，SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的病毒蛋白包含SARS-CoV-2表面糖蛋白的全部或部分RBD和SARS-CoV-2表面糖蛋白的全部或部分非SP/RBD部分。SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的SP/RBD片段中的一些氨基酸从其天然状态发生突变。
基于生产胰岛素-Fc融合蛋白的经验，不同病毒蛋白设计将导致SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的蛋白质产量不同。例如，可以选择SEQ ID NO:8的SP/RBD序列的更大或更短部分，并任选地突变某些氨基酸，以产生Fc融合蛋白的期望病毒部分。当选择的病毒蛋白附接至Fc片段时产生的蛋白质产量可以通过实验确定。此外，将选定的病毒蛋白连接至Fc片段的接头的长度和组成将类似地对蛋白质产量有影响，Fc片段和连接至病毒蛋白的Fc片段铰链区域的部分的选择也是如此。
图2显示了根据本公开的示例性SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的图示。SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白可以包含接头，例如肽接头。SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的SP/RBD片段可以与Fc片段直接连接，即不存在接头。在实例中，SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的SP/RBD片段中的一些氨基酸从其天然状态发生突变。包含部分SARS-CoV-2表面糖蛋白的治疗性蛋白位于Fc片段的N-末端侧。融合蛋白包含从N-末端到C-末端的以下方向的结构域：(N-末端)--治疗性蛋白--接头--Fc片段--(C-末端)(例如，(N-末端)--SARS-CoV-2肽--接头--Fc片段--(C-末端))。可以删失接头，以使融合蛋白包含以下从N-末端到C-末端的以下方向的结构域：(N-末端)--治疗性蛋白--Fc片段--(C-末端)(例如，(N-末端)--SARS-CoV-2肽--Fc片段--(C-末端))。作为在宿主细胞中重组生产的融合蛋白的一部分，图2所示融合蛋白的SP/RBD片段可能很好地表达或可能不很好地表达(即，在根据实施例1的HEK细胞中、在根据实施例2的瞬时CHO细胞中、或在根据实施例3的稳定的CHO细胞中生产)。
在以下所有描述中，所引用的氨基酸位置是指氨基酸在SEQ ID NO:1的SARS-CoV-2表面糖蛋白中的位置。作为构建SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的第一次尝试，SEQ IDNO:2的主要病毒SARS-CoV-2 RBD被缩短，消除了第一氨基酸(第330位)。所得的SEQ ID NO:8的SARS-CoV-2RBD的SP/RBD片段包含氨基酸331至524。然后在SP/RBD片段中产生新突变。首先，将第331和343位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺(一般突变在图2中图示)。进行这些突变是为了减少SP/RBD片段中糖基化位点的数量，因为当根据实施例1(HEK细胞)、实施例2(瞬时CHO-SETM细胞)或实施例3(CHO细胞)重组生产Fc融合蛋白时，认为具有太多糖基化位点可能导致较低生产产量。分子SP/RBD片段上的聚糖可能掩蔽开发抗体所需的关键表位。在实施方式中，SP/RBD片段位于Fc片段的N-末端侧，如图2所示。
在SP/RBD片段的第391位进行进一步的新突变，从半胱氨酸突变成甲硫氨酸。进行这种突变是为了消除未配对的半胱氨酸，以防止在HEK或CHO细胞的重组生产过程中出现非期望的蛋白质折叠和非期望的伪影。所得的SEQ ID NO:1的SARS-CoV-2表面糖蛋白类似物SP/RBD片段如下所示：
QITNLCPFGEVFQATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLMFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV(SEQ ID NO:9)。
使用Clustal Omega对SEQ ID NO:2的SARS-CoV-2天然SP/RBD和类似物SP/RBD片段(SEQ ID NO:9)进行并排比较，如图13所示。“*”表示给定序列位置处所有序列的完全同源性。“:”(冒号)表示在Gonnet PAM 250矩阵中评分大于0.5的具有高度相似属性的基团之间的保守性。“-”(破折号)表示序列空位，表示在序列的某个范围内在特定的比较集中不存在局部同源性。
使用接头GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO:4)将类似物SP/RBD片段(SEQ IDNO:9)连接到包含以下序列的天然人IgGl Fc片段：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:6)
如以上SEQ ID NO:6所示，人IgG1片段上的N-末端赖氨酸被消除，以尝试提高生产产量和纯度。此外，人IgG1片段上cNg位点的天冬酰胺被保存，以在宿主细胞中产生融合蛋白期间保留聚糖附接。所得的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白如下所示：
QITNLCPFGEVFQATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLMFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ IDNO:11)
根据实施例1在HEK293细胞中生产或根据实施例4纯化SEQ ID NO:11的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白。出乎意料的是，这产生高度聚集的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，其同型二聚体效价极低，低于5mg/L。
在构建SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的第二次尝试中，主要SARS-CoV-2 RBD(SEQ ID NO:2)序列被缩短，并消除前103个氨基酸(SEQ ID NO:1的第330-43位的氨基酸)。所得的SEQ ID NO:1的RBD片段包含氨基酸433至524，并且根据3D模型被认为在结构上是连续的。
所得的类似物SP/RBD片段如下所示：
VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV(SEQ ID NO:10)
使用Clustal Omega对SARS-CoV-2天然SP/RBD(SEQ ID NO:2)和类似物SP/RBD片段(SEQ ID NO:10)进行并排比较，如图14所示。“*”表示给定序列位置处所有序列的完全同源性。“:”(冒号)表示在Gonnet PAM 250矩阵中评分大于0.5的具有高度相似属性的基团之间的保守性。“-”(破折号)表示序列空位，表示在序列的某个范围内在特定的比较集中不存在局部同源性。
SEQ ID NO:10的类似物SP/RBD片段通过与SEQ ID NO:11的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白中使用的相同接头——GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO:4)——与包含以下序列的天然人IgG1 Fc片段连接：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:6)
如以上SEQ ID NO:6所示，人IgG1片段上的N-末端赖氨酸被消除，以尝试提高生产产量和纯度。此外，人IgG1片段上cNg位点的天冬酰胺被保存，以在宿主细胞中产生融合蛋白期间保留聚糖附接。所得的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白如下所示：
VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:12)
根据实施例1在HEK293细胞中生产或根据实施例4纯化SEQ ID NO:12的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白。出乎意料的是，这产生高度聚集的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，其同型二聚体效价极低，低于1mg/L。
在进一步尝试产生SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，而不是进一步缩短SARS-CoV-2 RBD，SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的SP/RBD片段通过延伸SP/RBD序列的N-末端和C-末端以包含SEQ ID NO:1的氨基酸319至541来选择，以构建可能更好地表达、更好地折叠和更好地实现半胱氨酸配对的序列。所得的SEQ ID NO:14的类似物SP/RBD片段如下所示：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF(SEQ ID NO:14)。
使用Clustal Omega对SARS-CoV-2天然SP/RBD(SEQ ID NO:2)和SP/RBD片段(SEQID NO:14)进行并排比较，如图15所示。“*”表示给定序列位置处所有序列的完全同源性。“:”(冒号)表示在Gonnet PAM 250矩阵中评分大于0.5的具有高度相似属性的基团之间的保守性。“-”(破折号)表示序列空位，表示在序列的某个范围内在特定的比较集中不存在局部同源性，而“:”、“.”或空格分别指在给定序列位置的序列中的保守、适度或非常不同的氨基酸突变。
在一次尝试中，接头也被缩短并在组成上改变成GGGSGGG(SEQ ID NO:3)，并恢复人IgG1 Fc片段上的铰链区和C-末端赖氨酸，产生SEQ ID NO:7的Fc片段。
PKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:7)
人IgG1片段上cNg位点的天冬酰胺被保存，以在宿主细胞中产生融合蛋白期间保留聚糖附接。所得的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:17)如下所示。
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFGGGSGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:17)
根据实施例9测量根据实施例1在HEK293细胞中生产的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白与Fc(γ)受体I的结合。预期Fc(γ)受体I、Fc(γ)受体IIA、Fc(γ)受体IIB、Fc(γ)受体III、FcRn和ACE2受体结合的OD450测量值将作为SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白浓度的函数增加。
在进一步的尝试中，保留SEQ ID NO:14的SARS-CoV-2 RBD片段和SEQ ID NO:3的接头，并再次去除人IgG1 Fc片段上的C-末端赖氨酸，产生SEQ ID NO:33的Fc片段。
PKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:33)
人IgG1片段上cNg位点的天冬酰胺被保存，以在宿主细胞中产生融合蛋白期间保留聚糖附接。所得的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白如下所示。
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFGGGSGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:16)
根据实施例2在瞬时转染的CHO细胞中重组产生SEQ ID NO:16的Fc融合蛋白。SEQID NO:16的Fc融合蛋白按照实施例5进行纯化。SEQ ID NO:16的融合蛋白结构按照实施例6进行确认，并且按照实施例7进行序列识别。为了获得生产的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的同型二聚体效价，按照实施例8测量同型二聚体％，并通过将同型二聚体％乘以重组生产的融合蛋白的蛋白质效价来计算同型二聚体效价。计算SEQ ID NO:16的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的同型二聚体效价为139mg/L。
根据实施例9测量在根据实施例2的瞬时转染的CHO细胞或根据实施例3的CHO细胞中生产的SEQ ID NO:16的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的Fc(γ)受体I结合。预期Fc(γ)受体I、Fc(γ)受体IIA、Fc(γ)受体IIB、Fc(γ)受体III、FcRn和ACE2受体结合的OD450测量值将作为SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白浓度的函数增加。
在产生SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的进一步尝试中，SEQ ID NO:14的SARS-CoV-2SP/RBD片段通过与SEQ ID NO:11的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白中使用的相同接头——GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO:4)——与包含SEQ ID NO:6的人IgG1Fc片段连接。所得的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白如下所示。
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:18)
根据实施例2在瞬时转染的CHO细胞中重组生产SEQ ID NO:18的Fc融合蛋白并根据实施例5纯化。在实例中，SEQ ID NO:18的融合蛋白结构按照实施例6进行确认，并且按照实施例7进行序列识别。为了获得生产的SEQ ID NO:18的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的同型二聚体效价，按照实施例8测量同型二聚体％，并通过将同型二聚体％乘以重组生产的融合蛋白的蛋白质效价来计算同型二聚体效价。计算SEQ ID NO:18的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的同型二聚体效价为124mg/L。
根据实施例9测量在根据实施例2的瞬时转染的CHO细胞或根据实施例3的CHO细胞中生产的SEQ ID NO:18的SARS-CoV-2Fc Hu融合蛋白的Fc(γ)受体I结合。预期Fc(γ)受体I、Fc(γ)受体IIA、Fc(γ)受体IIB、Fc(γ)受体III、FcRn和ACE2受体结合的OD450测量值将作为SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白浓度的函数增加，并且在给定浓度下，OD450测量值大于参考标准。
在进一步尝试产生SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，而不是进一步缩短SARS-CoV-2SP/RBD，SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的SP/SP/RBD片段通过延伸SP/RBD序列的N-末端和C-末端以包含如以下SEQ ID NO:15中所示的SEQ ID NO:1的氨基酸319至541来选择，以构建可能更好地表达、更好地折叠和更好地实现半胱氨酸配对的序列。
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVK(SEQID NO:15)
使用Clustal Omega对SARS-CoV-2天然SP/RBD(SEQ ID NO:2)和SEQ ID NO:15的SP/RBD片段进行并排比较，如图16所示。“*”表示给定序列位置处所有序列的完全同源性。“:”(冒号)表示在Gonnet PAM 250矩阵中评分大于0.5的具有高度相似属性的基团之间的保守性。“-”(破折号)表示序列空位，表示在序列的某个范围内在特定的比较集中不存在局部同源性，而“:”、“.”或空格分别指在给定序列位置的序列中的保守、适度或非常不同的氨基酸突变。
接头也被缩短并在组成上改变成GGGSGGGS(SEQ ID NO:5)，并用于将SP/RBD片段连接到包含SEQ ID NO:6的人IgGl Fc片段。所得的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白如下所示。
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKGGGSGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:20)
根据实施例2在瞬时转染的CHO细胞中重组生产SEQ ID NO:20的Fc融合蛋白并根据实施例4纯化。在实例中，SEQ ID NO:20的融合蛋白结构按照实施例6进行确认，并且按照实施例7进行序列识别。为了获得生产的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的同型二聚体效价，按照实施例8测量SEQ ID NO:20的同型二聚体％，并通过将同型二聚体％乘以重组生产的融合蛋白的蛋白质效价来计算同型二聚体效价。计算SEQ ID NO:20的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的同型二聚体效价为134mg/L。
根据实施例9测量在根据实施例2的瞬时转染的CHO细胞或根据实施例3的CHO细胞中生产的SEQ ID NO:20的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的Fc(γ)受体I结合。预期Fc(γ)受体I、Fc(γ)受体IIA、Fc(γ)受体IIB、Fc(γ)受体III、FcRn和ACE2受体结合的OD450测量值将作为SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白浓度的函数增加，并且在给定浓度下，OD450测量值大于参考标准。
在进一步尝试产生SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白时，保留SEQ ID NO:15的SP/RBD片段，而不是进一步缩短SARS-CoV-2SP/RBD。消除接头，并且SEQ ID NO:15的SP/RBD片段与SEQ ID NO:6的人IgG1 Fc片段直接连接。所得的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白如下所示。
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQID NO:21)
根据实施例2在瞬时转染的CHO细胞中重组生产SEQ ID NO:21的Fc融合蛋白并根据实施例4纯化。在实例中，SEQ ID NO:21的融合蛋白结构按照实施例6进行确认，并且按照实施例7进行序列识别。为了获得生产的SEQ ID NO:21的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的同型二聚体效价，按照实施例8测量同型二聚体％，并通过将同型二聚体％乘以重组生产的融合蛋白的蛋白质效价来计算同型二聚体效价。蛋白质效价为156mg/L，同型二聚体％为98.7％，导致SEQ ID NO:21的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的同型二聚体效价为154mg/L。
根据实施例9测量在根据实施例2的瞬时转染的CHO细胞或根据实施例3的CHO细胞中生产的SEQ ID NO:21的SARS-CoV-2Fc Hu融合蛋白的Fc(γ)受体I结合。预期Fc(γ)受体I、Fc(γ)受体IIA、Fc(γ)受体IIB、Fc(γ)受体III、FcRn和ACE2受体结合的OD450测量值将作为SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白浓度的函数增加，并且在给定浓度下，OD450测量值大于参考标准。
在进一步尝试产生SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白中，通过延伸SP/RBD序列的C-末端使得SP/RBD包含如以下SEQ ID NO:13所示的SEQ ID NO:1的氨基酸319至591，以选择SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的SP/RBD片段。
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS(SEQ ID NO:13)
使用Clustal Omega对SARS-CoV-2天然SP/RBD(SEQ ID NO:2)和SP/RBD片段(SEQID NO:13)进行并排比较，如图17所示。“*”表示给定序列位置处所有序列的完全同源性。“:”(冒号)表示在Gonnet PAM 250矩阵中评分大于0.5的具有高度相似属性的基团之间的保守性。“-”(破折号)表示序列空位，表示在序列的某个范围内在特定的比较集中不存在局部同源性，而“:”、“.”或空格分别指在给定序列位置的序列中的保守、适度或非常不同的氨基酸突变。
GGGSGGGS(SEQ ID NO:5)的缩短接头用于将SEQ ID NO:13的SP/RBD片段与SEQ IDNO:6的人IgG1 Fc片段连接。所得的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白如下所示。
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSGGGSGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:19)
根据实施例2在瞬时转染的CHO细胞中重组生产SEQ ID NO:19的Fc融合蛋白并根据实施例5纯化。在实例中，SEQ ID NO:19的融合蛋白结构按照实施例6进行确认，并且按照实施例7进行序列识别。为了获得生产的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的同型二聚体效价，按照实施例8测量同型二聚体％，并通过将同型二聚体％乘以重组生产的融合蛋白的蛋白质效价来计算同型二聚体效价。计算SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的同型二聚体效价为204mg/L。
在实施方式中，根据实施例3在稳定转染的CHO细胞中重组产生SEQ ID NO:19的Fc融合蛋白。根据实施例5纯化SEQ ID NO:19的Fc融合蛋白。在实例中，SEQ ID NO:19的融合蛋白结构按照实施例6进行确认，并且按照实施例7进行序列识别。为了获得生产的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的同型二聚体效价，按照实施例8测量同型二聚体％，并通过将同型二聚体％乘以重组生产的融合蛋白的蛋白质效价来计算同型二聚体效价。计算SEQID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的同型二聚体效价为大于750mg/L。
根据实施例9测量根据实施例3在CHO细胞中生产的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白与Fc(γ)受体I的结合。如实施例16所述和图19、图20、图21、图22和图23所示，人Fc(γ)受体I、Fc(γ)受体IIA、Fc(γ)受体IIB、Fc(γ)受体III、FcRn和ACE2受体结合的OD450测量值作为SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白浓度的函数增加。
使用Clustal Omega对SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的SP/RBD结构域进行并排比较，如图80所示。“*”表示给定序列位置处所有序列的完全同源性。“:”(冒号)表示在Gonnet PAM 250矩阵中评分大于0.5的具有高度相似属性的基团之间的保守性。“-”(破折号)表示序列空位，表示在序列的某个范围内在特定的比较集中不存在局部同源性，而“:”、“.”或空格分别指在给定序列位置的序列中的保守、适度或非常不同的氨基酸突变。
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白用作初级疫苗
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白可用作初级疫苗。在一个或多个实施方式中，SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白以药物组合物的形式提供。注射任何蛋白均可以诱导免疫应答，其幅度和类型高度依赖于相应免疫系统的“状态”。例如，相对于自身抗原注射外来抗原(Ag)将在维持中枢和外周耐受机制的免疫系统中诱导更强的免疫应答。此外，将外来Ag施用于已先前暴露于相应Ag(例如病毒感染)而初免的免疫系统，将产生相对于Ag空白系统更快速和更高的免疫应答。这种初免的免疫学基础有两个方面：1)Ag空白免疫系统具有初始B和T淋巴细胞，其激活阈值比Ag初免的免疫系统的Ag初免“记忆”细胞高得多，使得呈递Ag的抗原呈递细胞(APC)需要更少的Ag来激活初免的记忆T细胞，以及2)由于在Ag初免暴露期间记忆T细胞的扩增，在再次暴露于注射的Ag时，这种细胞的数量本来就更多。请注意，优势APC是树突细胞(DC)和巨噬细胞，它们将Ag与其表面上的主要组织相容性复合物(MHC)分子复合地呈递至T细胞Ag受体。
APC可以影响对Ag应答的“幅度”和“类型”。B细胞通过体液免疫(抗体产生)直接参与免疫应答，并且还作为选择性捕获抗原并将抗原呈递至T细胞的特异性APC参与T细胞免疫应答。这两种功能均通过激活表面B细胞受体(BCR)来实现，BCR本质上是与特定抗原特异性结合的膜结合抗体。多价可溶性抗原，例如含有特定抗原的Fc融合同型二聚体，可以被BCR识别并激活它们。因此，SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc蛋白同型二聚体可以通过抗原特异性BCR激活来激活B细胞，从而导致抗体产生增加，以及特异性针对RBD的T细胞活性增加。因此，这些融合蛋白在施用后激活体液免疫和细胞免疫。更具体地，诱导的Th1型(细胞)免疫激活身体的细胞杀伤机制，如细胞毒性T细胞、NK细胞和巨噬细胞，它们靶向已经感染病毒的细胞。同时，在Th2型免疫中，T辅助细胞刺激B细胞增殖并分化为分泌抗原特异性抗体的浆细胞。这些抗体通过抗体定向细胞毒性(ADC)有助于控制感染，当抗体结合感染细胞表面呈递的抗原并指导NK细胞破坏它们时，发生这种情况。抗体还通过阻止病毒与细胞的相互作用并最终通过Fc指导的吞噬作用清除病毒来有助于结合和中和病毒。
佐剂
在一些实例中，Th1细胞应答是清除大多数病毒和细菌感染所必需的，其中病毒样或细菌样物质(本质上非Ag)使APC表达关键细胞因子和表面共刺激分子，在Ag呈递期间，其驱动T细胞成为Th1型。事实上，这种APC激活是许多称为佐剂的免疫增强物质的概念基础。疫苗佐剂的一般机制如图18所示。请注意，优势APC是树突细胞(DC)和巨噬细胞，它们将Ag与其表面上的主要组织相容性复合物(MHC)分子复合地呈递至T细胞Ag受体(图1)。这些APC可以影响对Ag应答的“幅度”和“类型”。一些佐剂旨在诱使免疫系统对注射的疫苗Ag做出反应，如同它是持续感染的一部分(即，感染原提供了这种天然的病毒或细菌佐剂物质)。因此，佐剂激活APC以获得更大的Ag呈递能力，这是克服初始T细胞的高激活阈值所必需的，此外还可以将其发展为Th1应答以有效清除相应的感染。请注意，此类T细胞为B细胞提供了关键帮助，这些B细胞特异性结合相应的Ag以产生Ag特异性抗体(Ab)效价(图12)。
用作初级疫苗的Fc融合蛋白可以与佐剂共同施用以增强或以其他方式改变靶受试者的免疫应答。因此，佐剂激活APC以获得更大的Ag呈递能力，这是克服初始T细胞的高激活阈值所必需的，此外还可以将其发展为Th1应答以有效清除相应的感染。在实例中，已知佐剂可用于SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的药物组合物中，以增强抗SARS-CoV-2抗体的诱导。已知的佐剂包括用于呼吸道病毒感染的佐剂，包括过去十年人类临床研究中的三价或单价流感疫苗，大流行性H1N1、H5N1和SARS-CoV疫苗。
可用于本文公开的药物组合物的佐剂的实例包括但不限于水包油、无定形羟基磷酸铝硫酸盐(AAHS)、氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾(Alum)、弗氏佐剂(完全和/或不完全)、角鲨烯、AS02、AS03、AS04、MF59、AS01B、QS-21、CpG 1018、ISCOMS、MontanideTM ISA-51、MontanideTM ISA-720、聚乳酸共乙交酯(PLG)、单磷酰脂质A(MPL)、Detox、AGP[RC-529]、DC_Chol、OM-174(脂质A衍生物)、CpG基序(含有免疫刺激CpG基序的合成寡核苷酸)、修饰的LT和CT、hGM-CSF、hIL-12、Immudaptin、惰性溶媒，例如金颗粒以及来自诸如Advax(澳大利亚)等来源的各种实验性佐剂，例如AddaVax(Invivogen)或其他基于Advax的疫苗佐剂。
在一些实例中，选择的佐剂可以是MF59(Novartis)和AS-03(GlaxoSmithKline)。MF59(Novartis)的定制制剂或等同物，例如AddaVax(Invivogen)或来自Vaxine Pvt Ltd.(澳大利亚)的其他基于Advax的疫苗佐剂可用于SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的药物组合物中。在优选的实施方式中，SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白与MontanideTM ISA-720佐剂共同施用以增强或以其他方式改变靶受试者的免疫应答。用于呼吸道病毒感染的许多不同佐剂在澳大利亚的季节性三价流感疫苗和大流行性H1N1和H5N1疫苗(ProteinSciences)中以及最近在美国Sanofi Pasteur进行的NIH支持的人流感疫苗试验中进行了广泛检测，并且可用于SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的药物组合物中。
在一个或多个实施方式中，SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白制剂在现场制备用于施用。在一方面，SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在无菌混合条件下与佐剂现场混合。在一方面，将SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白和佐剂充分混合和/或乳化以制备用于施用于受试者的均质乳剂。通过皮下(s.c.)注射或肌内(i.m.)注射将Fc融合蛋白的佐剂制剂或其药物组合物施用于患者，由于皮下和肌内空间有更多树突细胞(DC)，所以s.c.或i.m.注射部位更有可能诱导强抗体应答。
在将本公开的示例性SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白或其药物组合物的一种或多于一种治疗施用于抗体空白患者后，抗SARS-CoV-2抗体根据实施例11进行测量并根据实施例13评估其中和能力。预期用本公开的示例性SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白或其药物组合物对既往抗体空白的患者进行一种或多于一种的治疗将在治疗后提取的血清中诱导可测量的抗SARS-CoV-2抗体效价。
如上所述，在一些情况下，在药物组合物中使用佐剂以增加根据实施例11测量的抗SARS-CoV-2抗体效价和/或根据实施例13测量的抗SARS-CoV-2抗体效价的病毒中和能力可能是有利的。对于对病毒或SP/RBD不具有潜在免疫应答的抗体空白的患者，佐剂的使用可能特别有利。此外，佐剂可能对随年龄的增长而对免疫能力出现变化的老年受试者有利，即所谓的免疫衰老，这是免疫系统多个水平随时间发生变化的结果。一旦患者具有可测量的抗体，在再次受SARS-CoV-2病毒攻击时，患者将表现出非常快速的抗SARS-CoV-2抗体发展，以建立自己对COVID-19的防御。
在小鼠中评价的初级SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合疫苗
根据实施例12中的程序，本公开的示例性SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白或其药物组合物的有效性已针对它们使用不同的给药策略诱导高效价中和AB应答的能力在小鼠免疫研究中初步评价了。BALB/c小鼠是已广泛用于疫苗的临床前免疫原性评估的相关动物模型。当用佐剂和非佐剂候选疫苗免疫时，该菌株产生强Ab应答。此外，小鼠特异性试剂可广泛用于评价对疫苗接种的各种免疫应答的动力学和特征，包括相关的Ab亚型和T细胞应答(例如，Th1相比于Th2应答)。因此，选择BALB/c小鼠模型来评估SP/RBD-Fc疫苗在Ag剂量、佐剂增强作用、施用途径和实现最佳Ab应答所需的给药频率方面的免疫原性。
简言之，靶小鼠(例如，BALB/c小鼠)以预定的时间间隔(例如，每三周)至多注射三次SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白(有或没有佐剂)或药物其组合物，并定期收集血清。根据实施例10中的程序或实施例11中的程序测量血清抗SARS-CoV-2抗体效价，并根据实施例13评估它们抑制ACE2-SP/RBD结合的效力。实验变量包括SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白组成和剂量水平、注射次数和佐剂类型。
如实施例17中详细描述的，显示1至100μg剂量水平的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在单次注射后21天和第二次注射后14天诱导显著的抗SP/RBD Ab效价，分别如图25和图26所示。在1、2和3剂后对从1μg至100μg不等的剂量水平的动力学应答，即应答持续时间，显示出在所有剂量水平上抗SP/RBD Ab效价增加，直至疫苗接种后至少56天，如图27所示。结果强调，每次给药后14天均可见抗SP/RBD IgG Ab效价应答的可测量增加，并且对于所有剂量水平，SP/RBD IgG Ab效价应答随每个另外的剂量继续增加。
在实施例18中，重要地表明SEQ ID NO:17的非佐剂SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的Fc片段对于诱导显著的抗SP/RBD IgG Ab效价是必需的，如事实证明，SEQ ID NO:2的SP/RBD单体Ag(缺乏Fc)在第21天测量的免疫原性应答方面无效。诱导的包括Fc片段的SEQ ID NO:17的抗SP/RBD IgG Ab效价应答甚至在初始给药后14天达到接近最大效价，如图28所示，而没有Fc片段的SEQ ID NO:2的SP/RBD单体Ag即使在21天后也几乎没有诱导抗SP/RBD IgG Ab效价应答。Fc部分的这一第21天效果非常强，因为它维持在几个剂量水平。这两种非佐剂化材料之间的免疫原性差异表明融合蛋白Ag的Fc部分具有显著的“内置佐剂”能力。
如前所述，佐剂激活APC以获得更大的Ag呈递能力，这是克服初始T细胞的高激活阈值所必需的，此外还可以将其发展为Th1应答以有效清除相应的感染。在实施例19中显示，含有10μg剂量水平的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的一些但不是所有的佐剂化制剂在一次(在第21天测量-如图29所示)、两次(在第35天测量-如图30所示)和三次(在第56天测量-如图31所示)给药后增强免疫原性约3至5倍，证明了佐剂中的一系列有效性。值得注意的是，在第三次给药后32天(即，在第88天测量，如图32所示)，所有制剂诱导的效价仍显著升高，证明了甚至在第一次注射后三个月仍具有对SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的免疫原性应答的持久性。
ACE2-SP/RBD结合的抑制效力计算为ID50值，该值代表血清样本达到50％的ACE2结合的稀释度的倒数。如实施例20中所述，ACE2-SP/RBD结合的诱导抑制效力在第0天单次注射后第21天、第0天和第21天注射后第42天，以及在第0天、第21天和第42天注射后第56天和第88天计算。来自用SEQ ID NO:17的3次给药免疫的小鼠的免疫血清的计算ID50值显示出抑制效力的应答维持至末次注射后32天(图36)。此外，MontanideTM ISA 720佐剂在每个时间点始终诱导最高效力。MontanideTM ISA 720结果特别有意思和出乎意料，因为使用该佐剂获得的总IgG效价相对于其他佐剂化制剂并非特别有效，因此表明使用MontanideTMISA 720诱导每个IgG分子的内在效力更大。这些数据强烈支持选择MontanideTM ISA 720作为该疫苗开发计划的主要佐剂候选物。
发现60岁以上的个体对COVID-19导致的重度疾病具有更高易感性和更高死亡率。因此，重要的是评估SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白制剂在老年小鼠中诱导免疫应答的能力，这些小鼠的免疫系统是老年人衰老免疫系统的可靠模型。
按照实施例21的程序，用SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白免疫8-10月龄的BALB/c小鼠。由于8月龄的小鼠自然死亡率较高，因此每个研究组分配了约15只小鼠。虽然10、30和100μg剂量水平的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在没有佐剂的情况下1次给药(在第21天测量)、2次给药(在第35天)和3次给药(在第56天测量)后诱导显著的IgG效价，但佐剂在含有10μg的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的制剂中强烈增强了这种免疫原性，如图37、图38和图39所示。与年轻小鼠的免疫原性特征相似，相对于在第56天测量的没有佐剂获得的水平，佐剂MontanideTM ISA 720的使用显著且出乎意料地增强了SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的抑制效力(ID50)17倍。此外，使用MontanideTM ISA 720获得的抑制效力(ID50)再次优于其他佐剂。重要的是，由有和没有佐剂的SEQ ID NO:17的SARS-COV-2-RBD-HIGG-FC融合蛋白诱导的这种抑制效力高于人恢复血清(见图33、图34、图34、图35和图36)，证明了这种SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白疫苗具有有前景的有效性。
总之，在上述BALB/c小鼠中的结果表明，SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白显著诱导IgG效价，其具有显著抑制SARS-CoV-2病毒SP/RBD与ACE2结合的的潜力。此外，由于使用MontanideTM ISA 720进行免疫接种显示出最大抑制效力，并且因为对其进行配制可降低人体的反应原性，因此它被选为主要开发候选佐剂以进行进一步评估。
使用更高产量SEQ ID NO:19的的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白进行类似的研究。如实施例22中更详细描述的，如根据实施例11的改进的ELISA形式所测量的，在不存在佐剂的情况下，SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在1μg和10μg剂量水平下在小鼠中诱导大量IgG效价，与上述SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的免疫原性特征一致，在第1次(第14天)和第2次(第35天)给药后在两个剂量水平之间显示出明显的剂量-反应(图40、图41和图42)。正如预期，根据实施例22测量，与在不存在佐剂的情况下每次给药后相比，用不同佐剂配制的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白诱导显著更高的效价(～第一次给药和第2次给药后3至10倍)，并且MontanideTM ISA720在每次给药后的有效性与Ad-Vax-2相似，而MontanideTM ISA 51效果较差。此外，根据实施例23测量，每次给药后SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白诱导了强ACE2-SP/RBD抑制效力(ID50值)，显著高于人恢复期的血清(图43、图44和图45)。请注意，MontanideTM ISA 720在第三次给药后达到最高效力。
实施例24证实SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白与所有佐剂均诱导显著的Th1促进的IgG2a、IgG2b和IgG3亚型效价，其中MontanideTM ISA 720在所有时间点始终显示出强增强(图48、图49和图50)。此外，Th2促进的亚型IgG1效价比Th1相关的亚型低大约10倍(图47)。这些结果表明，当与SEQ ID NO:19一起递送时，MontanideTM ISA 720佐剂保持强增强效果，特别是通过促进期望的Th1应答转变，支持其剂量节省特性和作为临床先导佐剂的选择。
Fc片段在其对SP/RBD-Fc融合蛋白疫苗免疫原性的贡献中的作用在小鼠中进行了进一步研究，试图了解在小鼠中使用人IgG Fc构建体可能如何影响效力。小鼠IgG2a是人IgG1的功能类似物。实施例25中描述的实验旨在确定i)Fc种类错配是否可能是SP/RBD-Fc融合蛋白潜在免疫原性的原因和ii)动物模型中人IgG Fc构建体的结果是否适用于预测人体中的表现。
在第一次或第二次给药后14天(即，如图51所示的第14天和图52所示的第35天)，用SEQ ID NO:19(人Fc)和含有包含小鼠IgG2a的鼠Fc而没有佐剂的SEQ ID NO:23进行免疫显示在诱导抗SP/RBD IgG Ab效价方面没有显著差异，证明在BALB/c小鼠免疫原性模型中人Fc抗原序列与天然小鼠Fc序列没有任何差异。此外，用没有佐剂的SEQ ID NO:19和SEQID NO:23免疫在第一次或第二次给药后14天(即图53所示的第14天和如图54所示的第35天)，证明人Fc抗原序列在BALB/c小鼠免疫原性模型中与天然小鼠Fc序列没有任何差异。SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23均表现出比人恢复期血清(HCS)更高的ACE2-SP/RBD结合抑制效力，即使在仅一次给药之后。鉴于小鼠形式的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白(SEQID NO:23)在小鼠中显示出相对于裸SP/RBD蛋白(SEQ ID NO:2)增强的免疫原性，极有可能人形式将在人体中表现出增强的免疫原性。
在进一步开展此类转化研究中，根据实施例15的程序，这种破坏重组ACE2和SP/RBD生化相互作用的抑制效力在噬斑减少中和试验(PRNT)中通过中和感染活VERO-E6细胞的活SARS-CoV-2病毒得到证实，并如图46所示。
在冷藏温度或室温下储存和/或运输疫苗的能力对于疫苗的有效分发非常重要，特别是在缺乏先进的冷链运输和储存基础设施的国家。实施例26描述了比较新制备的SEQID NO:19/ISA 720乳剂的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白与制备后在4℃和25℃下储存一天和七天的相同乳剂产生SP/RBD IgG Ab效价应答的有效性的体内研究。
实施例13中描述的ACE2结合抑制测定的结果表明，在注射新鲜制备的乳剂相比于在4℃和25℃下储存1天和7天的乳剂后，SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在小鼠血清中诱导相似的抑制效力(ID50值)。如图55所示，注射新鲜配制的乳剂相比于任何老化的乳剂的动物之间的ID50值没有显著差异(p>0.05)。
为了了解SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白疫苗与佐剂MontanideTM ISA 720是否对SARS-CoV-2病毒的变体有效，使用来自根据实施例22用2次给药有佐剂MontanideTM ISA 720的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白免疫小鼠的第56天血清样本分析UK N501Y病毒变体(SEQ ID NO:24)的类似物RBD片段和南非E484K病毒变体(SEQ ID NO:25)。图66显示了SEQ ID NO:2的SARS-CoV-2天然RBD与UKN501Y病毒变体(SEQ ID NO:24)和南非E484K病毒变体(SEQ ID NO:25)的类似物RBD片段的并排比较，使用Clustal Omega进行，其中“*”表示给定序列位置处所有序列的完全同源性。“:”(冒号)表示在Gonnet PAM 250矩阵中评分大于0.5的具有高度相似属性的基团之间的保守性。“-”(破折号)表示序列空位，表示在序列的某个范围内在特定的比较集中不存在局部同源性。
将血清样本添加到塑料结合的重组RBD野生型(Lake Pharma，Worcester，MA)或突变体N501Y(UK变体，由Sino Biological，Wayne，PA提供)或E484K(南非变体，由AcroBiosystems，Newark，DE提供)。用标记的抗小鼠IgG二级抗体检测结合的RBD特异性IgG，并通过小鼠ELISA参考血清标准曲线确定IgGμg/mL效价值。图65所示的结果表明来自小鼠的此类免疫血清结合重组RBD突变体N501Y和E484K，以及或大于野生型RBD分子，表明英国(N501Y)和南非(E484K)病毒变体不太可能逃逸SEQ ID NO:19诱导的免疫。
在非人灵长类动物中评价的初级SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合疫苗
为了将小鼠的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白免疫原性结果转化为人临床研究，根据实施例27和实施例28，在MontanideTM ISA 720中配制的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在基因更相关的NHP物种食蟹猴中进行检测。用MontanideTM ISA720配制的10μg和30μg剂量水平的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白根据实施例11测量有效诱导IgG效价，其中30μg剂量水平在第一次和第二次给药后的所有时间点显示出比10μg剂量水平更大的免疫原性(图60)。此外，该IgG效价免疫原性特征与抑制ACE2-SP/RBD结合的效力一致，该效力远高于根据实施例13测量的10μg和30μg剂量水平的人恢复期血清的效力(图61)。在进一步开展此类转化研究中，根据实施例28的程序并如图62所示，这种破坏重组ACE2和SP/RBD生化相互作用的抑制效力在噬斑减少中和试验(PRNT)中通过中和感染活VERO-E6细胞的活SARS-CoV-2病毒得到证实。这些结果证明了在NHP中检测疫苗接种的值，并为人体转化提供了有价值的指导。
为了进一步证实有佐剂MontanideTM ISA 720的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白疫苗对SARS-CoV-2病毒的变体有效，来自用根据实施例27的有佐剂MontanideTM ISA的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白2次给药免疫的五只NHP的血清样本在第42天提取，并将血清样本加入塑料结合的重组RBD野生型或突变体N501Y或E484K。图64中所示的结果表明，类似于小鼠研究，来自NHP和小鼠的免疫血清结合重组RBD突变体N501Y和E484K，以及或大于野生型RBD分子。
使用SARS-CoV-2的恒河猴攻击模型在实施例27的免疫NHP中评价了SEQ ID NO:19疫苗的有效性。在第0天用SARS-CoV-2病毒攻击两组NHP(一组根据实施例27接种疫苗并进行加强注射，另一组为空白)。在攻击前和第7天收集血液。在攻击前以及第2、4和7天进行鼻拭子、口腔拭子和BAL液收集。在第7天进行终止后尸检。
与具有可忽略或检测不到水平的空白对照NHP相比，用与MontanideTM ISA-720的SEQ ID NO:19免疫的NHP在病毒攻击之前显示出显著的抗SP/RBD IgG效价和ACE2抑制ID50值。攻击后鼻拭子(图78)和BAL样本(图79)中SARS-CoV-2病毒基因组(实施例39)和亚基因组RNA效价(实施例40)的可忽略水平证明疫苗在预防COVID-19方面的有效性。低亚基因组RNA(sgRNA)计数特别令人鼓舞，因为它们是复制中间体，因此，它们的丰度与病毒复制活性和宿主感染的严重程度有关。总之，这些数据最终证明有MontanideTM ISA-720的SEQ IDNO:19可预防COVID-19，并且在NHP中不存在COVID-19疾病恶化的风险。
在兔中评价的初级SARS-CoV-2-RBD-IgG-Fc融合疫苗
使用新西兰白兔的临床前GLP毒理学IND启用研究由Sinclair Research，LLC(Auxvasse，MO)进行，如实施例30、实施例31、实施例32、实施例33和实施例34中更详细描述。使用兔是因为该物种已被广泛用于可导致强抗体应答的疫苗诱导的免疫原性的临床前研究。此外，兔还表达SARS-CoV-2病毒受体ACE2，它使得病毒结合并感染动物，引起与人COVID-19疾病相似的疾病症状。
如实施例31中所述，在兔中以30μg和100μg的剂量水平注射有MontanideTM ISA720佐剂的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，在第一次、第二次和第三次注射后诱导显著特异性IgG效价(图70和图71)。如实施例13中所述，还评价了血清样本的功能抑制效力。在该ACE2抑制测定中，SEQ ID NO:19的佐剂化SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在30μg和100μg剂量水平之间的抑制效力具有明显剂量效应，其升高并在第二次给药后14天变得相似(图72)。两个时间点的效力值均明显高于人恢复期血清所获得的效力值。这种抑制效力通过根据实施例15的程序在噬斑减少中和试验(PRNT)中中和感染活VERO-E6细胞的活SARS-CoV-2病毒得到进一步证实，如图73所示。
在兔获得的结果表明，在ISA 720中乳化的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在从COVID-19感染和疾病中恢复的人中诱导功能性免疫原性水平，这将这些毒理学结果置于临床环境中，有利于对明显安全性特征的期望。在主要研究终止时未观察到与供试品相关的死亡率或器官重量变化。轻度影响，例如纤维蛋白原的增加，很可能是由于在给药阶段使用了MontanideTM ISA 720佐剂，而在恢复阶段消退。预期的宏观和微观瞬时注射部位AE也可能是由于佐剂所致。考虑到这项毒理学研究中相关的临床免疫原性水平，得出的结论是，不存在引起对进入临床试验的担忧的安全问题。
根据实施例33使用桥接研究评价了肌内(i.m.)递送途径与皮下(s.c.)递送途径的比较。在第15天、第29天和第36天的分析表明，如根据实施例13所测量的，s.c.和i.m.施用MontanideTM ISA 720中的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白(100μg剂量水平)之间的抗RBD Ab效价(图74)或ACE2抑制效力(图75)没有统计学上的显著差异，这支持临床试验中任一施用途径的评价。
使用在第15天(一次给药后)、第29天(两次给药后)和第36天(三次给药后)测量的关于ACE2-SP/RBD结合抑制效力(IC50)结果(根据实施例13测量)的亚组研究分析了新鲜制备的乳剂与在冷藏温度下储存24小时后的相同乳剂之间的差异。再次，如上文针对小鼠免疫原性研究(实施例26)所述，新鲜和储存乳剂之间的抑制效力没有统计学差异，表明佐剂化的SEQ ID NO:19制剂性能在制备后至少24小时是稳定的，如图76(皮下给药)和图77(肌内给药)所示。
SARS-CoV-2-RBD-IgG-Fc融合蛋白用作加强疫苗
在实例中，SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白可用作加强疫苗。将融合蛋白施用于已经对SARS-CoV-2抗原具有低但可测量的抗体水平的受试者，以放大他们的抗体效价，从而增加他们的抗病毒保护。与SEQ ID NO:2的天然SARS-CoV-2SP/RBD相比，合成了SP/RBD片段变体以最大化抗原性，而Fc区延长抗原停留时间。不希望受限于任何特定的机制理论，认为在较长的体内停留时间期间，天然糖基化的人Fc片段将SARS-CoV-2 RBD类似物抗原呈递给抗原产生细胞(APC)，其预期将对SARS-CoV-2 RBD抗原产生强免疫应答。具体地，APC通过Fc(γ)受体将SARS-CoV-2 RBD抗原内化，然后加工并呈递RBD片段(图12)给CD4+Th细胞，CD4+Th细胞反过来促进(“有助于”)B细胞激活和抗SARS-CoV-2 RBD IgG(即，Ab)产生(图12)。
详细描述图12，抗原呈递细胞可以是例如能够通过Fc受体介导的吞噬作用(例如，通过SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的Fc区与免疫细胞中的Fc(γ)受体结合)内化SEQID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白分子的树突细胞(DC)、单核细胞或巨噬细胞。例如，DC的子集(例如cDC2S)对SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的Fc介导的摄取通过分泌IL-10和IL-33促进抗SARS-CoV-2 T辅助细胞2(Th2)细胞的发展。抗SARS-CoV-2 Th2细胞激活抗SARS-CoV-2B细胞，例如通过交联其抗原受体使B细胞吸引Th2细胞。B细胞抗原受体(BCR)介导的摄取与SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白分子的SARS-CoV-2 RBD片段结合，然后将SARS-CoV-2抗原递送至其细胞内位点，将其降解并作为与MHC II类分子结合的肽返回B细胞表面。肽MCH II类复合物可以被SARS-CoV-2特异性辅助T细胞识别，模拟它们制造蛋白质，进而导致B细胞增殖，其后代分化成分泌抗SARS-CoV-2抗体的B细胞。由于Fc的存在，SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白可将SARS-CoV-2SP/RBD片段直接暴露于产生抗原的细胞持续延长的时间段。此外，如前所述，预期根据SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白中的糖基化Fc片段诱导针对融合蛋白的治疗或抗原部分的非常强的免疫应答。这些特性结合起来显著增加了抗病毒抗体的量，同时也减少了产生所需免疫应答所需的抗原量。
在实例中，治疗包括用SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白或其药物组合物治疗患者，可以作为加强疫苗施用于已经对SARS-CoV-2抗体呈阳性的COVID-19恢复患者，作为放大其抗体效价和亲和力的手段，因此当这些接受治疗的患者随后遇到病毒时，他们将有足够的免疫力来预防感染和/或与感染SARS-CoV-2病毒相关的严重症状。此外，治疗包括用SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白或其药物组合物治疗患者，可作为加强疫苗施用于先前已用针对SARS-CoV-2病毒的疫苗免疫的受试者以增强其抗体效价和针对SP/RBD的特异性亲和力。在疫苗不是100％有效和/或诱导的抗体效价随时间减弱的情况下，这种疗法至关重要。在实例中，SEQID NO:19、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白或其药物组合物可以通过皮下注射(s.c.)或肌内(i.m.)施用于患者，由于皮下和肌内空间有更多的树突细胞(DC)，所以s.c.或i.m.注射部位更有可能诱导强抗体应答。
在小鼠和NHP中评价的加强SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合疫苗
如实施例12中更详细描述的，在小鼠中评价加强疫苗使用的有效性。BALB/c小鼠以预定的时间间隔(例如每三周)至多注射3次SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白或其药物组合物，并定期收集血清。根据实施例10或实施例11中的程序测量血清SARS-CoV-2SP/RBDIgG抗体效价，并根据实施例13评估它们的中和能力。实验变量包括SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白组成和剂量水平、注射次数和佐剂类型。预期免疫后的小鼠可能不再接受治疗30-60天，直至它们的抗体水平下降到基线/最低水平，然后再连续注射SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白或其药物组合物以评价回忆(记忆)免疫应答。
在分析使用有MontanideTM ISA 720作为加强剂的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白时，如实施例27中所述，首先向NHP注射10μg或30μg剂量的融合蛋白并定期收集蛋白质和血清。在它们的抗体水平下降时，在三至四个半月后，向NHP注射30μg剂量水平的加强疫苗(第三次注射)。如图63所示，在所有情况下，加强疫苗均引发强记忆免疫应答。
Fc融合蛋白产生
在实施方式中，融合蛋白可以由细胞表达，如实施例部分中更详细描述。
表达和纯化
Fc融合蛋白可以重组表达，例如在真核细胞中，例如哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞。用于表达的示例性哺乳动物细胞包括HEK细胞(例如HEK293细胞)或CHO细胞。CHO细胞可细分为各种株或亚类(例如，CHO DG44、CHO-M、CHO-SETM和CHO-K1)，其中一些细胞株可进行基因工程化，以与特定类型的核酸分子(例如，包含DNA的载体)或实施例部分中描述的特定细胞生长培养基组合物一起最佳使用。可以用编码Fc融合蛋白的核酸分子(例如载体)转染细胞(例如，其中整个Fc融合蛋白由单个核酸分子编码)。可以用编码Fc融合蛋白的载体转染HEK293细胞，但该过程仅导致Fc融合蛋白暂时表达一段时间(例如，3天、4天、5天、7天、10天、12天、14天或更长时间)，然后宿主细胞停止表达可观水平的Fc融合蛋白(即瞬时转染)。用编码Fc融合蛋白的核酸序列瞬时转染的HEK293细胞通常实现更快速地产生重组蛋白，这有助于制备和筛选多种Fc融合蛋白候选物。在实例中，用编码Fc融合蛋白的载体转染CHO-SETM(LakePharma，Belmont，CA)细胞，但该过程仅导致Fc融合蛋白暂时表达一段时间(例如，3天、4天、5天、7天、10天、12天、14天或更长时间)，然后宿主细胞停止表达可观水平的Fc融合蛋白(即瞬时转染)。用编码Fc融合蛋白的核酸序列瞬时转染的CHO-SETM(LakePharma，Belmont，CA)细胞通常允许更快速地产生重组蛋白，这有助于制备和筛选多种候选Fc融合蛋白。CHO细胞可以用永久掺入宿主细胞DNA的载体转染，只要细胞被适当培养，可导致Fc融合蛋白的一致和永久表达(即稳定转染)。用编码Fc融合蛋白的核酸稳定转染的CHO细胞和CHO细胞系通常需要更长的时间来开发，但它们通常产生更高的蛋白质产量并且更适合生产低成本产品(例如，用于兽药市场的产品)。可以使用本领域的标准方法培养细胞和细胞系。
在实例中，Fc融合蛋白可以从细胞中纯化或分离(例如，通过细胞的裂解)。Fc融合蛋白由细胞分泌，可以从细胞生长的细胞培养基中纯化或分离。Fc融合蛋白的纯化可以包括使用柱层析(例如亲和层析)或使用基于对某些分子的大小、电荷和/或亲和力差异的其他分离方法。Fc融合蛋白的纯化涉及选择或富集含有Fc片段的蛋白质，例如，通过使用蛋白A珠粒或蛋白A柱使含有Fc片段的蛋白质变成在中性溶液pH下以高亲和力与蛋白A结合，该蛋白A与蛋白质A珠粒缀合。然后可以通过溶液变量的变化(例如，溶液pH值的降低)从蛋白A珠粒洗脱结合的Fc融合蛋白。其他分离方法例如离子交换色谱法和/或凝胶过滤色谱法也可以可选地或另外地使用。Fc融合蛋白的纯化可以进一步包括过滤或离心蛋白质制剂、渗滤、超滤和通过各种尺寸的多孔膜过滤，以及有赋形剂的最终制剂。
可以使用多种方法表征纯化的Fc融合蛋白，例如纯度、蛋白质产量、结构和/或活性，例如在280nm处的吸光度(例如，以确定蛋白质产量)、尺寸排阻或毛细管电泳(例如，确定分子量、聚集百分比和/或纯度)、质谱(MS)和/或液相色谱法(LC-MS)(例如，确定纯度和/或糖基化)和/或ELISA(例如，确定与SARS-CoV-2抗体或ACE2的结合程度，例如亲和力)。示例性表征方法也在实施例部分中描述。
在瞬时转染的HEK细胞中产生和蛋白A纯化后Fc融合蛋白的蛋白质产量可以大于5mg/L、10mg/L或20mg/L，或更优选大于50mg/L(例如，大于60mg/L、大于70mg/L、大于80mg/L、大于90mg/L、大于100mg/L)。在瞬时转染的HEK细胞中产生和蛋白A纯化后，Fc融合蛋白的同型二聚体百分比大于70％(例如，大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％)。在瞬时转染的HEK细胞中产生和蛋白A纯化后的Fc融合蛋白的同型二聚体效价，计算为Fc融合蛋白产量和同型二聚体％之间的乘积，可以大于50mg/L(例如，大于60mg/L、大于70mg/L、大于80mg/L、大于90mg/L、大于100mg/L)。
在实例中，在瞬时转染的CHO-SETM(LakePharma，Belmont，CA)细胞中产生和蛋白A纯化后，Fc融合蛋白的蛋白产量大于5mg/L或10mg/L。在优选的实施方式中，在瞬时转染的CHO-SETM(LakePharma，Belmont，CA)细胞中产生和蛋白A纯化后的Fc融合蛋白的蛋白产量大于20mg/L(例如，大于30mg/L、大于40mg/L、大于50mg/L、大于60mg/L、大于70mg/L、大于80mg/L、大于90mg/L、大于100mg/L)。在瞬时转染的CHO-SETM(LakePharma，Belmont，CA)细胞中产生和蛋白A纯化后，Fc融合蛋白的同型二聚体％可以大于70％(例如，大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％)。在实施方式中，在瞬时转染的CHO-SETM(LakePharma，Belmont，CA)细胞中产生和蛋白A纯化后Fc融合蛋白的同型二聚体效价，计算为Fc融合蛋白产率和同型二聚体％之间的乘积，大于20mg/L(例如，大于30mg/L、大于40mg/L、大于50mg/L、大于60mg/L、大于70mg/L、大于80mg/L、大于90mg/L、大于100mg/L)。
在稳定转染的CHO细胞(例如，CHO细胞系或CHO细胞克隆)中产生和蛋白A纯化后，Fc融合蛋白的蛋白质产量可以大于100mg Fc融合蛋白/L(例如，mg/L培养基)。在实施方式中，在稳定转染的CHO细胞(例如，CHO细胞系或CHO细胞克隆)中产生和蛋白A纯化后，Fc融合蛋白的蛋白质产量大于50mg Fc融合蛋白/L培养基(例如，大于100mg/L、大于200mg/L、大于300mg/L、大于400mg/L、大于500mg/L、大于600mg/L或更多)。在稳定转染的CHO细胞(例如，CHO细胞系或CHO细胞克隆)中产生和蛋白A纯化后，Fc融合蛋白的同型二聚体％可以大于70％(例如，大于80％、大于85％、大于大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％)。在实施方式中，在稳定转染的CHO细胞(例如CHO细胞系或CHO细胞克隆)中产生和蛋白A纯化后，Fc融合蛋白的同型二聚体效价，计算为Fc融合蛋白产率和同型二聚体％之间的乘积，大于150mg/L(例如大于200mg/L、大于300mg/L、大于400mg/L、大于500mg/L、大于600mg/L或更多)。
药物组合物和施用途径
药物组合物中Fc融合蛋白的量和浓度，以及施用于受试者的药物组合物的量，可以基于临床相关因素，例如受试者的医学相关特征(例如，年龄、体重、性别、其他医学状况等)、化合物在药物组合物中的溶解度、化合物的效力和活性以及药物组合物的施用药方式进行选择。
本公开的制剂包括那些适合肠胃外施用的制剂。如本文所用，短语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”是指除肠内和外用施用之外的施用方式，通常通过静脉内、肌内或皮下注射。
可用于本公开的药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、盐水、乙醇、盐、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油，例如橄榄油，和可注射的有机酯，例如油酸乙酯，缓冲剂，例如磷酸钾和/或磷酸钠，pH缓冲剂，例如盐酸和/或氢氧化钠等。例如，通过使用包衣或乳化剂材料(例如卵磷脂)，通过在分散体的情况下保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，例如吐温样表面活性剂，可以保持适当的流动性。在一些实例中，药物组合物(例如，如本文所述)包含吐温样表面活性剂，例如聚山梨醇酯-20、吐温-20或吐温-80。在一些实例中，药物组合物(例如，如本文所述)包含浓度为约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.1％或约0.01％至约0.5％的吐温样表面活性剂，例如吐温-80。
Fc融合蛋白可以作为推注、输注或静脉推注施用，或通过注射器注射、泵、笔、针头或留置导管施用。Fc融合蛋白可以通过皮下推注施用。在实例中，Fc融合蛋白或其药物组合物通过皮下注射(s.c.)或肌内(i.m.)施用于患者，由于皮下和肌内空间有更多树突细胞(DC)，所以s.c.或i.m.注射部位更有可能诱导强抗体应答。引入方法还可以通过可充电或可生物降解的装置来提供。近年来，已经开发出各种缓释聚合物装置并在体内进行检测，用于药物的受控递送，包括蛋白质生物药物。多种生物相容性聚合物(包括水凝胶)，包括可生物降解的和不可降解的聚合物，可用于形成在特定靶部位缓释化合物的植入物。用于组合物中的其他药学上可接受的成分包括缓冲剂、盐、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗生素、等渗剂等。
剂量
在使用中，向有需要的受试者施用治疗有效量的Fc融合蛋白。施用Fc融合蛋白在受试者中引发免疫应答，更具体地是针对冠状病毒感染的免疫应答，更具体地说针对SARS-CoV-2或变体的免疫应答。免疫应答将通过缺乏可观察到的临床症状或受感染受试者通常表现出的临床症状减少、病毒脱落减少、感染恢复时间更快和/或感染持续时间减少来证明。在另一个实施方式中，提供了在感染或疾病部位激活免疫细胞的方法，包括向哺乳动物施用治疗有效量的Fc融合蛋白。在另一个方面，提供了增加受试者中抗体产生的方法，包括向哺乳动物施用治疗有效量的Fc融合蛋白。
应当理解，本文所述的治疗和预防方法适用于人以及任何合适的温血动物，包括但不限于犬、猫和其他伴侣动物，以及啮齿动物、灵长类动物、马、牛、绵羊、猪等。这些方法还可以应用于临床研究和/或研究。
如本文所用，短语“有效量”或“治疗有效量”意指将适用于本公开的实施方式的Fc融合蛋白的治疗或预防量，其当根据期望的治疗方案施用时，将引发期望的治疗或预防效果或反应，包括减轻部分或全部此类感染症状或降低感染易感性。本领域技术人员认识到，即使该病状没有完全根除或预防，但其或其症状和/或效果在受试者中得到部分改善或减轻，该量也可被认为是治疗上“有效的”。Fc融合肽的治疗有效剂量可根据受试者的体型和物种以及施用方式而变化。
可以改变Fc融合蛋白的实际剂量水平以获得有效实现特定受试者所需治疗反应的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所用特定融合蛋白或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所使用的特定融合蛋白联合使用的其他药物、化合物和/或材料、接受治疗的受试者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域熟知的类似因素。通常，合适剂量的Fc融合蛋白将是有效产生治疗效果的最低剂量的量。这种有效剂量通常取决于上述因素。
在各个方面，以单位剂型提供免疫原性制剂，以便于施用和剂量的均匀性。如本文所用，“单位剂型”是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理离散单位，计算每个单位含有预定量的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，以产生与期望的药物载体相关的期望治疗效果。剂量单位形式的质量标准取决于并直接取决于赋形剂和治疗剂的独特特性以及待达到的特定生物效应。在一个或多个实施方式中，制剂以用于向受试者施用SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的组分的试剂盒提供。分散在合适载体中的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白以单位剂型(例如小瓶)提供。在一个或多个实施方式中，该试剂盒还包括含有佐剂和/或其他载体系统的离散单位剂型(例如，小瓶)，用于现场混合用于施用的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白。在一个或多个实施方式中，该试剂盒包含一个或多个乳化针头和注射器，用于现场混合免疫原性制剂以进行施用。在一个或多个实施方式中，该试剂盒包含一个或多个给药注射器，用于将制备的免疫学组合物施用于受试者。在一个或多个实施方式中，该试剂盒还包含用于制备免疫原性组合物和/或施用免疫原性组合物的说明书。
在按照上述程序的实例和以下实施例中，在小鼠和兔单次注射后21天显示1μg至100μg剂量水平的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白诱导显著的抗SP/RBD Ab效价。在实例中，10μg和30μg的剂量水平在非人灵长类动物中有效(参见图60、图61和图62)。兔的反应动力学表明，在第1、2和3次给药后(均没有佐剂-参见图69，以及有MontanideTM ISA-720佐剂-参见图71)，100μg的剂量水平诱导最高免疫原性(如IgG Ab效价)。
根据实施例17，在施用没有佐剂的0.05、0.1、0.3、1、3、10、30或100μg的SEQ IDNO:17或有佐剂的3μg或10μg SEQ ID NO:17的6至8周龄雌性BALB/c小鼠中进行SEQ ID NO:17免疫原性的初步评估，如表1所示(所有SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白：佐剂混合物为50％:50％v/v，但SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白：MontanideTM ISA 720以30％/70％v/v混合除外)。此外，评估缺少Fc融合部分的SEQ ID NO:2以研究Fc片段的免疫原性贡献。
Figure BDA0003950764700000701
本公开设想了在任何上述药物组合物和制剂中的Fc融合蛋白制剂。此外，本公开设想了通过任何上述施用途径施用。本领域技术人员可以基于所治疗的病状以及所治疗患者的整体健康状况、年龄和体型来选择合适的制剂、剂量水平和施用途径。
实施例
通过以下实施例进一步说明本技术。然而，应当理解，这些实施例是通过说明的方式提供的，并且其中的任何内容均不应被视为对本技术的总体范围的限制。
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的合成、纯化和验证的一般实例
实施例1：在HEK293细胞中合成和制备SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的方法。
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白合成如下。使用专有软件(LakePharma，Belmont，CA)构建目的基因序列，并将其克隆到高表达哺乳动物载体中。HEK293细胞在转染前24小时接种在摇瓶中，并使用无血清化学成分限定的培养基生长。使用(LakePharma，Belmont，CA)瞬时转染标准操作程序，将编码目的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的DNA表达构建体瞬时转染到HEK293细胞的悬浮液中。20小时后，对细胞进行计数以确定活力和活细胞计数，并通过
Figure BDA0003950764700000711
(Pall FortéBio LLC，Fremont，CA)测量效价。在整个瞬时转染产生运行过程中获取另外的读数。在第5天或之后收获培养物。
实施例2：在瞬时转染的CHO细胞中合成和制备SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的方法。
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白合成如下。使用专有软件(LakePharma，Belmont，CA)构建目的基因序列，并将其克隆到人Fc融合蛋白特异性高表达载体中。CHO-SETM(LakePharma，Belmont，CA)细胞在转染前24小时接种在摇瓶中，并使用无血清化学成分限定的培养基(MEDNA Bio)生长。使用瞬时转染的标准操作程序(LakePharma，Belmont，CA)将编码目的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的DNA表达构建体瞬时转染到CHO-SE细胞的悬浮液中。近24小时后，对细胞进行计数以确定活力和活细胞计数，并通过
Figure BDA0003950764700000721
(Pall FortéBio LLC，Fremont，CA)测量效价。在整个瞬时转染产生运行过程中获取另外的读数。在第7天或之后收获培养物。
实施例3：在稳定转染的CHO细胞中合成和制备SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的方法。
CHO细胞系最初来源于CHO-K1(LakePharma，Belmont，CA)，并且使用本领域已知的方法通过重组技术敲除内源性谷氨酰胺合成酶(GS)基因。针对CHO表达和GS选择设计和优化了稳定表达DNA载体，并将其整合到高表达哺乳动物载体(LakePharma，Belmont，CA)中。在开始放大实验之前，确认每个完成的构建体的序列。在化学成分限定的培养基(CDOptiCHO；Invitrogen，Carlsbad，CA)中，在37℃的加湿5％CO2培养箱中培养适应悬浮液的CHO细胞。没有血清或其他动物来源的产品用于培养CHO细胞。
使用
Figure BDA0003950764700000722
系统(MaxCyte，Inc.，Gaithersburg，MD)通过电穿孔用80μg DNA转染在指数生长期期间在CD OptiCHO培养基中生长的约8000万个悬浮适应的CHO细胞，以构建每种SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的稳定CHO细胞系(DNA构建体含有SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的全长序列)。24小时后，对转染的细胞进行计数并选择稳定整合SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合基因。将转染的细胞接种到含有0-100μM甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)的CD OptiCHO选择培养基中，细胞密度为0.5×106个细胞/mL，置于摇瓶中，并在37℃和5％CO2下孵育。在选择过程中，每2-3天将细胞离心并重悬于新鲜的选择培养基中，直到CHO稳定池恢复其生长速率和活力。监测细胞培养物的生长和效价。
细胞生长至2.5×106个细胞/mL。在细胞库收获时，活力超过95％。然后将细胞离心，将细胞沉淀重悬于含有7.5％二甲亚砜(DMSO)的CD OptiCHO培养基中，使细胞计数达到15×106个细胞/mL/小瓶。将小瓶冷冻保存在液氮中储存。
如下使用CHO细胞进行小规模生产。将细胞放大以在37℃下在含有100μM MSX的CDOptiCHO生长培养基中生产，并根据需要每2-4天补液一次，CD OptiCHO生长培养基根据需要补充有葡萄糖和另外的氨基酸，持续大约14-21天。通过离心机旋转澄清从稳定池生产运行中收获的条件培养基上清液。蛋白质在用结合缓冲液预平衡的蛋白质A(MabSelect，GEHealthcare，Little Chalfont，英国)柱上运行。然后将洗涤缓冲液通过柱，直至测量到OD280值(NanoDrop，Thermo Scientific)处于或接近背景水平。使用低pH缓冲液洗脱SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，收集洗脱级分，记录各级分的OD280值。合并含有靶SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的级分，并任选使用0.2μM膜过滤器进一步过滤。
细胞系可以任选地进一步亚克隆为单克隆，并且任选地使用有限稀释法(本领域技术人员已知的方法)进一步选择高效价SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc-融合蛋白表达克隆。在获得高效价的单克隆SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白表达细胞系后，如上所述在没有MSX的生长培养基中，或任选地在含有MSX的生长培养基中，完成SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的产生，以获得含有重组的CHO制备的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的细胞培养上清液。MSX浓度可以随时间任选地增加以对能够产生更高产品效价的克隆施加另外的选择性。
实施例4：在HEK293细胞中生产的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的纯化。
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的纯化如下进行。从瞬时转染的HEK293生产运行中收集含有分泌的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的条件培养基上清液，并通过离心进行澄清。将含有期望的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的上清液流经蛋白A柱，使用低pH梯度进行洗涤和洗脱。之后，将含有期望的蛋白质的洗脱级分合并，并将缓冲液交换到200mM HEPES、100mM NaCl、50mM NaOAc，pH 7.0缓冲液中。使用0.2μm膜过滤器进行最终过滤步骤。最终蛋白质浓度由溶液在280nm处的光密度计算。根据需要通过离子交换层析(例如，使用阴离子交换珠粒树脂或阳离子交换珠粒树脂)、凝胶过滤层析或其他方法进行进一步任选的纯化。
实施例5：在CHO细胞中生产的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的纯化。
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的纯化如下进行。从瞬时转染的CHO或稳定转染的CHO生产运行中收集含有分泌的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的条件培养基上清液，并通过离心进行澄清。将含有期望的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的上清液流经蛋白A柱，使用低pH梯度进行洗涤和洗脱。之后，将含有期望的蛋白质的洗脱级分合并，并将缓冲液交换到200mM HEPES、100mM NaCl、50mM NaOAc，pH 7.0缓冲液中。使用0.2μm膜过滤器进行最终过滤步骤。最终蛋白质浓度由溶液在280nm处的光密度计算。根据需要通过离子交换层析(例如，使用阴离子交换珠粒树脂或阳离子交换珠粒树脂)、凝胶过滤层析或其他方法进行进一步任选的纯化。
实施例6：通过非还原和还原CE-SDS确认SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白结构。
毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS)分析在
Figure BDA0003950764700000741
GXII(Perkin Elmer，Waltham，MA)中对溶解在200mM HEPES、100mM NaCl，50mM NaOAc，pH 7.0缓冲液中的纯化SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白溶液进行，并绘制电泳图。在非还原条件下，样本根据已知分子量(MW)蛋白质标准运行，洗脱峰代表SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白同型二聚体的“表观”分子量。
在还原条件下(例如，使用β-巯基乙醇破坏SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白同型二聚体的二硫键)，所得SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的表观分子量将蛋白单体与SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白同型二聚体的一半分子量进行比较，以确定SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的结构纯度是否为可能是正确的。
实施例7：SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白序列通过去除聚糖的LC-MS进行鉴定。
为了通过质谱(MS)获得对SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白质量的准确估计，首先对样本进行处理以去除可能干扰MS分析的天然聚糖。使用Zeba脱盐柱(Pierce，ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)，首先将溶解于200mM HEPES、100mM NaCl、50mMNaOAc，pH 7.0缓冲溶液中的100μL的2.5mg/mL SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白缓冲交换成含有5mM EDTA的0.1M Tris，pH 8.0缓冲液。向该溶液添加1.67μL的PNGase F酶(Prozyme N-glycanase)以去除融合蛋白中存在的N-连接聚糖(例如，连接到位于cNg-N位点的天冬酰胺侧链的聚糖)，以及混合物在培养箱中于37℃培养过夜。然后通过LC-MS(NovaBioassays，Woburn，MA)分析样本，得到分子的分子量，该分子质量对应于没有聚糖的期望同型二聚体。然后进一步校正该质量，因为用于从cNg-天冬酰胺切割聚糖的酶促过程也使天冬酰胺侧链脱氨基形成天冬氨酸，并且在如此进行时，酶促处理的同型二聚体总体获得2Da，对应于质量同型二聚体中存在的每条链1Da。因此，实际分子量是测量质量减去2Da，以校正分析样本中SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白结构的每个酶修饰。
实施例8：通过尺寸排阻色谱法分析SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的同型二聚体％。
使用与波长为280nm的2998光电二极管阵列连接的Waters 2795HT HPLC(WatersCorporation，Milford，MA)对SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白进行尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)。将100μL或更少的含有目的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的样本注射至MAbPacSEC-1、5μm、4×300mm色谱柱(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)，运行流速为0.2mL/min，流动相包含50mM磷酸钠、300mM NaCl和0.05％w/v叠氮化钠，pH 6.2。MAbPac SEC-1色谱柱根据分子大小分离的原理工作。因此，较大的可溶性SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc聚集体(例如，SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白同型二聚体的多聚体)在较早的保留时间洗脱，并且非聚集的同型二聚体在之后的保留时间洗脱。在通过分析型SEC-HPLC将同型二聚体混合物与聚集的多聚同型二聚体分离时，确定SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白溶液的纯度(以非聚集同型二聚体的百分比计)。
实施例9：SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的体外Fc(γ)、FcRn和ACE2受体结合亲和力。
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在pH 7.4下与Fc(γ)受体的结合使用如下ELISA测定进行。人Fc(γ)受体I、IIa、IIb、III和FcRn受体用作哺乳动物受体。将SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在pH 9.6的碳酸氢钠缓冲液中稀释至10μg/mL，并在4℃下在Maxisorp(Nunc)微量滴定板上包被过夜，然后用PBST(PBS/0.05％吐温-20)缓冲液洗涤微孔板条5次，并用Superblock封闭试剂(ThermoFisher)封闭。在PBST/10％Superblock缓冲液中制备从6000ng/mL至8.2ng/mL的生物素化rhFc(γ)受体(重组人Fc(γ)RI、Fc(γ)RIIa、Fc(γ)RIIb、Fc(γ)RIII、FcRn；R&D Systems)的系列稀释液并以100μL/孔负载到包被SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的微孔板条上。重组人ACE2受体购自R&D systems，并使用已知的缀合程序进行生物素化，然后在PBST/10％Superblock缓冲液中从6000ng/mL至8.2ng/mL制备，并以100μL/孔负载到包被SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的微孔板条上。将微量滴定板在室温下孵育1小时，然后用PBST洗涤微孔板条5次，然后负载100μL/孔的在PBST/10％Superblock缓冲液中以1:10000稀释的链霉亲和素-HRP。孵育45min后，用PBST再次洗涤微孔板条5次。添加TMB以显示结合的Fc(γ)、FcRn或ACE2受体蛋白，并用ELISA终止试剂(Boston Bioproducts)终止。板在ELISA酶标仪中在450nm处读取，OD值(与每个rhFc(γ)、FcRn或ACE2受体与SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的结合成正比)使用GraphPadPrism软件针对添加到每个孔中的每个rhFc(γ)受体或FcRn或ACE2受体的对数浓度作图，以生成结合曲线。
用于评价血清中SARS-CoV-2 RBD-hIgG-Fc融合蛋白作用的体内血清学测定的一般实例
实施例10：用于评价人或小鼠血清中SARS-CoV-2 RBD IgG抗体效价的体内定量ELISA。
定量SARS-CoV-2SP/RBD特异性IgG ELISA用于测量人或小鼠血清和血浆样本(包括热灭活血清或热灭活血浆)中的抗SP/RBD IgG Ab效价。ELISA方法使用固定在96孔微量滴定ELISA板的塑料孔上的重组SP/RBD(如图81所示)作为在微孔板孔中孵育时结合血清样本中抗SP/RBD特异性抗体(IgG)的捕获抗原。洗涤步骤去除所有未结合的蛋白质，使抗SP/RBD IgG与板结合。取决于血清样本的物种来源，通过添加与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人或抗小鼠IgG抗体(与IgM不发生交叉反应)来检测抗SP/RBD抗体。在第二次洗涤以去除未结合的HRP抗体缀合物后，将3,3',5,5'-三甲基联苯胺(TMB)添加到由HRP酶催化的每个孔中，导致与结合的HRP抗体缀合物的量成正比的比色变化。通过添加酸停止显色，并使用分光光度酶标仪测量每个孔的颜色密度，使用SoftMax Pro或Gen 5软件获取吸光度数据并使用标准曲线分析每个样本的效价值。使用直接与塑料孔结合的已知量的纯化人或小鼠IgG样本(即μg/mL)的连续稀释生成标准曲线(即，该孔不包含结合的SP/RBD或任何血清样本)，并且与上述血清样本开发相同。每个血清样本的SP/RBD特异性抗体的数量(即效价值)表示为μg/mL单位，该单位通过适当的软件(例如SoftMaxPro或Gen 5)使用4参数曲线拟合模型从标准曲线得到。
实施例11：改进的体内定量ELISA，用于评价小鼠和NHP血清中的SARS-CoV-2 RBDIgG抗体效价。
定量SARS-CoV-2SP/RBD特异性IgG ELISA用于测量小鼠或NHP血清和血浆样本(包括热灭活血清或热灭活血浆)中的抗SP/RBD IgG Ab效价。ELISA方法使用固定在96孔微量滴定ELISA板的塑料孔上的重组SP/RBD(Lake Pharma)(如图81所示)作为在微孔板孔中孵育时结合血清样本中抗SP/RBD特异性抗体(IgG)的捕获抗原。
SPD/RBD蛋白(Lake Pharma，Belmont CA)在Carb/Bicarb包被缓冲液pH 9.6中稀释至2.5μg/mL，涡旋混合。使用多通道移液器将100μL/孔的包被溶液添加到MaxisorbELISA板的所有孔中。用板密封剂覆盖板并在2-8℃下孵育过夜。使用洗板机(300μL/孔/洗)用PBST洗板5次，以去除所有未结合的蛋白质。将300μL Superblock封闭溶液添加到每个孔中，并将板在室温下孵育1小时以上。
将标准小鼠血清或NHP血清稀释以根据物种特异性测定形式创建标准曲线。为了创建第一标准品，已知具有高抗SP/RBD效价的小鼠血清或NHP血清样本以1:10的比例稀释(每个样本20μL加上180μL样本稀释缓冲液)并通过涡旋彻底混合。剩余标准品通过1:10样本的2倍连续稀释产生。标准小鼠或NHP样本的每次稀释在每个板上以100μL/孔重复运行。
血清或血浆样本以1:100稀释(每个样本4μL加上396μL样本稀释缓冲液)并通过涡旋彻底混合。从板孔中倒出封闭溶液，并使用洗板机(100μL PBST/孔/洗涤)将板用PBST洗涤5次。将100μL稀释的标准样本负载到每个板的第1列和第2列的每个孔中。将100μL稀释的检测血清样本添加到剩余的孔中。检测板用密封带覆盖并在室温下孵育1小时。
通过涡旋充分混合10μL抗小鼠或抗NHP IgG-Fc HRP和9.99mL 1×HRP ConjugateStock Stabilizer，形成1:1000的储备溶液。将300μL的1:1000溶液与11.7mL的PBST/SB一起涡旋以产生1:40,000的稀释度，从而进一步稀释储备溶液。将板用300μL PBST/孔/洗涤用洗板机洗涤5次，然后用纸巾将板拍干。
每孔加入100μL 1:40,000稀释的抗小鼠或抗NHP IgG-Fc HRP，并将板在室温下避光孵育1小时。然后用300μL PBST/孔/洗涤用洗板机洗板5次，用dH2O手动洗涤一次(300μLdH2O/孔/洗涤)。然后将板在纸巾上拍干。TMB溶液以100μL/孔一次加入一列，以从第1列至第12列等时间间隔的有序方式添加，然后在黑暗中孵育10-20分钟，同时监测显色。通过以相同的顺序从第1列开始向第12列并以与之前对TMB底物溶液相同的时间间隔添加100μL/孔终止试剂以终止显色。每个孔的颜色密度在30分钟内使用分光光度酶标仪在450nM下测量，SoftMax Pro或Gen 5软件用于获取吸光度数据并使用标准曲线分析每个样本的效价值。
使用浓度(标准小鼠或NHP样本的1/稀释度的对数)相对于OD值生成标准曲线。通过标准曲线上导致最高R2值的10-12个点通过线性回归分析样本中的抗体效价。值报告为RBD特异性IgG效价(参考(Ref.)效价单位)。
实施例12：SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc制剂在小鼠中诱导抗SP/RBD IgG Ab效价应答的有效性的体内一般临床前评估。
如下在小鼠中进行了评价不同SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白制剂有效性的体内研究。
将6至8周龄雌性BALB/c小鼠或8至10月龄雌性BALB/c小鼠(JacksonLaboratories，Bar Harbor，ME)适应环境至少7天，然后称重，然后分配到研究组用于给药。老年小鼠用于模拟SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白制剂在老年人(例如70岁以上)中的有效性。每6至8周龄组使用N＝5只小鼠，每8至10月龄组使用N＝15只小鼠，并将小鼠随机分配到每个研究组中。将小鼠饲养在自动通风的架子中，每笼5只动物，并自由提供标准辐照饲料和过滤水。按照标准操作程序(SOP)和特定研究方案，小鼠耳朵被单独标记以进行识别，研究笼上贴有动物ID、研究名称和研究组标识以及研究记录，包括个体和组剂量表、血液/血清收集表、体重测量和健康观察记录。
向小鼠施用至多三次给药的在根据实施例1的瞬时转染的HEK293细胞、根据实施例2的瞬时转染的CHO细胞或根据实施例3的稳定转染的CHO细胞或从商业来源获得的SARS-CoV-2刺突蛋白RBD中合成的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白。通过皮下(s.c.)、肌内(i.m.)或皮内(i.d.)注射，相隔三周(第0天、第21天和第42天)给药。剂量施用后观察小鼠一至三个小时以观察任何即时反应，然后每天观察小鼠的一般健康状况。所有小鼠在第一次免疫前7至14天，然后在每次剂量施用后12至14天通过颌下静脉穿刺进行非终末采血，以获得用于SARS-CoV-2 RBD IgG Ab效价评估的血清样本。使收集的血液凝结，通过离心微量采血管分离血清，并分装和冷冻用于根据实施例10或实施例11中描述的方法通过ELISA进行的抗体分析。
在第三次免疫后12至14天(即第54至56天)的末次血清收集后，表现出显著抗体应答的小鼠组和未免疫的对照组可以保留用于进一步评价。对于饲养的小鼠，在第三次给药后的第30天和第60天(分别为第72天和第102天)通过颌下静脉穿刺法从每只小鼠采集血液，使其凝结，并通过离心微量真空采血管分离血清，并分装和冷冻用于根据实施例10、实施例11和实施例13中描述的方法通过ELISA进行的抗体分析。
由于表现出明显的抗体应答而被保留的小鼠在第102天通过s.c.、i.m.或i.d.注射加强剂量的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白。施用后观察小鼠一至三个小时以观察任何即时反应，然后每天观察小鼠的一般健康状况。在末次加强给药后12至14天，通过颌下静脉穿刺法从每只小鼠收集血液，使其凝结，并通过离心微型真空采血管分离血清，并分装和冷冻用于根据实施例10、实施例11和实施例13描述的方法通过ELISA进行的抗体分析，以评价这些组中的回忆(记忆)免疫应答。
不同的佐剂(例如，Advax-2、Advax-3、VacAdx、MontanideTM ISA-51、MontanideTMISA-720或替代品)可以与SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白组合进行检测。适当的v/v比的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白和佐剂在施用于小鼠之前即时混合/乳化。
实施例13：用于评价血清中SARS-CoV-2抗体中和ACE2与SARS-CoV-2-刺突蛋白-RBD结合的有效性的体内一般血清学测定。
ACE2抑制酶联免疫吸附测定(ELISA)旨在测量血清中抑制重组人ACE2与重组SP/RBD结合的抑制性抗SP/RBD IgG效价水平。测定中血清样本的连续稀释将产生50％的抑制稀释度(ID50)，这是该样本的效价值，代表50％的总ACE2结合信号发生时的稀释度。该测定可用于评估来自多个物种的样本，例如人、NHP、小鼠和兔，这样任何样本ID50值均可以与任何其他样本的值进行比较，从而实现跨物种和单独实验之间进行此类比较。
该测定是竞争性抑制ELISA，其中将连续稀释的血清样本和生物素化人ACE2(生物素-huACE2,R&D Systems,Minneapolis,MN)添加到与96孔板塑料孔结合的重组SP/RBD蛋白中，以竞争与SP/RBD的结合。血清样本中存在的抑制性(即中和性)IgG(即抗体)的水平将与生物素-huACE2与SP/RBD结合的抑制程度相关。洗去血清和生物素-huACE2后，添加链霉亲和素-HRP(Thermo Fisher，Waltham，MA)，其与任何与SP/RBD结合的生物素-huACE2结合，然后通过添加TMB底物进行洗涤和显色。通过添加终止试剂(1％H2SO4)终止HRP(酶)/TMB(底物)反应，并通过酶标仪在450nm波长处测量颜色强度(光密度，OD)。使用GraphPad Prism软件，将每个样本的ID50效力值计算为对应于OD450值的倒数稀释度，该值恰好是通过4参数曲线拟合(对数抑制剂与响应，可变斜率)算法得到的非竞争性生物素-huACE2获得的总信号的50％(即最大OD450值，100％)。
实施例14：用于评价SARS-CoV-2 RBD制剂在兔GLP毒理学研究中诱导抗SP/RBDIgG Ab效价应答的有效性的体内一般定量ELISA。
评价SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白制剂的毒理学的体内研究如下在兔中进行。
SEQ ID NO:19诱导的免疫原性测定是ELISA，其中兔非临床研究血清样本中存在的抗SP/RBD抗体使用包被在微量滴定孔上的SARS-CoV-2SP/RBD捕获，然后通过HRP-酶缀合的抗兔IgG H+L-HRP二级抗体，然后使用TMB底物系统进行检测。使用加标到含有与样本稀释水平匹配的正常兔血清百分比的缓冲液的SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike RBD抗体兔pAb生成标准曲线(1000ng/mL至1.37ng/mL)。(例如，在检测1:100稀释的样本时，使用1％正常血清缓冲液制作标准曲线。)通过使用SoftMax软件在4参数标准曲线拟合上插值来分析血清样本中的抗SP/RBD抗体浓度。通过将兔pAb加标至缓冲液中制备三个阳性测定对照(高QC、中QC、低QC)和阴性对照(阴性QC)，并在-20℃下冷冻保存，作为单次解冻使用的等分试样。(这些QC还用于验证分析以评价准确度和精密度。)通过将兔多克隆抗SP/RBD抗体直接加标到兔血清中来制备用于特定验证检测(例如短期稳定性、冻融稳定性)的额外样本。出于验证的目的，在验证期间使用的血清样本在样本稀释缓冲液中的最低要求稀释度(MRD)为1:100，以匹配用于实际研究血清样本的MRD。尽管大多数需要血清样本或含血清缓冲液的验证工作均使用复溶的正常兔血清进行，但也使用合并的正常兔血清(BioIVT)检测选定的参数，例如线性和定量限，以更好地代表实际研究血清样本。
正如在验证过程中所确定的，在所有三个非零QC水平上，该测定的测定内和测定间准确度范围为88-117％，在所有QC水平上测定间和测定间精度分别为6-10％和1-11％。使用合并的血清，LLOQ测定为2ng/mL，相比于正常血清中为1ng/mL。发现ULOQ在合并的血清中为500ng/mL，相比于在正常血清中为1000ng/mL。由于合并的血清更接近于代表研究样本，LLOQ和ULOQ分别设置为2ng/mL和500ng/mL。尽管在高于～1000ng/mL观察到显著的钩子效应，但发现该测定在这些定量限之间呈线性关系。在极高的加标抗体浓度下，发现测得的值低至192ng/mL。(基于此结果，在研究样本分析期间测量值高于192ng/mL的任何样本均在更高的稀释水平下重新检测。)加标回收率在11个不同的血清样本之间是准确的，在高加标水平(400ng/mL)下的回收率范围为74-105％，在中等加标水平(80ng/mL)下为91-117％，和在低加标水平(10ng/mL)下为86-98％。经过至少3x冻融循环(93-118％回收率)、4℃下长达1周(90-93％回收率)和室温下4小时(92-106％回收率)，发现加标血清样本是稳定的。这些验证结果表明SEQ ID NO:19免疫原性ELISA具有高度准确度和可重复性，并且符合目的。
实施例15：噬斑减少中和试验(PRNT)。
中和抗体(nAb)效价由噬斑减少中和试验(PRNT)确定。简言之，血清在56摄氏度下热灭活30min，然后在微量滴定板中连续稀释2倍。将稀释的病毒悬浮液以1:1(v/v)的比例添加到稀释的样本中，并在37摄氏度下孵育1h，以使血清IgG与病毒结合。然后将这种血清-病毒混合物添加到经过组织培养处理的塑料板上以80％汇合的Vero E6细胞单层上1小时，以使游离病毒感染细胞(这些细胞表达高水平的SP靶蛋白，huACE2)。此时，以1:1:1(v/v/v)的比例添加完整的DMEM培养基、2XMEM和1.5％琼脂糖的覆盖层。细胞孵育48小时，然后用10％中性缓冲福尔马林固定至少30min。去除琼脂糖覆盖层并用0.5％结晶紫染色细胞。洗去染色剂后，将细胞在环境温度下干燥过夜并计数噬菌斑。阴性和阳性对照nAb(SinoBiological，Wayne，PA)用于将样本稀释曲线的吸光度值转换为中和百分比值，从中得出每个样本的ID50中和效力值。
说明SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的体外和体内性能的实例
实施例16：SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的体外人Fc(γ)和ACE2受体结合亲和力。
根据实施例9的程序进行SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在pH7.4与人Fc(γ)和ACE2受体的体外结合。根据实施例9的程序进行人IgG与人FcRn在pH 7.4的体外结合。
板在ELISA酶标仪中在450nm处读取，OD值(与每个rhFc(γ)受体与SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的结合成比例)使用GraphPad Prism软件针对添加到每个孔中的每个rhFc(γ)受体的对数浓度作图以生成结合曲线。
如图19所示，人Fc(γ)RI与SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白结合的EC50为33.86ng/mL。如图20所示，人Fc(γ)RIIa与SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白结合的EC50为2282ng/mL。如图21所示，人Fc(γ)RIIb与SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白结合的EC50为2053ng/mL。如图22所示，人Fc(γ)RIIIaF176与SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白结合的EC50为95.54ng/mL，人Fc(γ)RIIIa V176与SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白结合的EC50为24.61ng/mL，以及人Fc(γ)RIIIb与SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的EC50为为11674ng/mL。如图23所示，人ACE2与SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白结合的EC50为87.00ng/mL。
如图24所示，人FcRn与SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白结合的EC50为39.46ng/mL，而人FcRn与人IgG(用作对照)结合的EC50为29.23ng/mL，表明与人IgG对照相比，使用SEQ ID NO:19保留了FcRn受体结合。
实施例17：体内筛选在没有佐剂的情况下SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在小鼠中的有效性。
根据实施例1合成SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，并根据实施例4进行纯化。根据实施例6通过非还原性和还原性CE-SDS确认融合蛋白结构，并且通过根据实施例7去除聚糖的LC-MS确认融合蛋白序列鉴定。
根据实施例12的程序，8组，每组N＝5，根据表2在第0天、第21天和第42天以100μL体积在没有佐剂的情况下，以0.05μg/剂量至100μg/剂量不等的剂量水平通过皮下注射向6-8周龄雌性BALB/c小鼠施用SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白。所有小鼠在每次注射后14天和21天通过颌下静脉穿刺进行非终末采血，以获得用于抗SP/RBD Ab效价评估的血清样本。根据实施例10测量在没有佐剂的情况下施用SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白后诱导的抗SP/RBD IgG Ab效价应答(通过IgG ELISA标准曲线的平均IgGμg/mL)，并在第21天(如图25所示)和第35天(如图26所示)在第二次给药之前以μg为单位绘制施用的剂量水平。
Figure BDA0003950764700000841
数据显示，1μg和100μg之间的剂量水平导致诱导的抗SP/RBD IgG Ab效价应答显著增加，第35天的最佳应答发生在1μg、10μg和100μg剂量水平。SEQ ID NO:17在1、2和3次给药后对1μg、3μg、10μg、30μg和100μg剂量水平的动力学响应如图27所示，强调每次给药后14天可以看到抗SP/RBD IgG Ab效价应答的可测量增加，并且对于所有剂量水平，SP/RBD IgGAb效价应答随每个另外剂量继续增加。
实施例18：体内筛选在没有佐剂的情况下SEQ ID NO:2的SP-RBD在小鼠中的有效性。
SEQ ID NO:2的SARS-CoV-2SP/RBD(没有Fc)获自商业来源(商品号46438；LakePharma，Inc.，San Mateo，CA)，用于比较含有SP/RBD-Fc蛋白的Fc产生的Ab应答增强，SEQID NO:17，根据实施例1合成，根据实施例4纯化，根据实施例6通过非还原性和还原性CE-SDS进行结构确认，并且根据实施例7通过去除聚糖的LC-MS确认结构鉴定。基于SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白和SEQ ID NO:2的SP/RBD之间的等摩尔量的SP/RBDAg对相对剂量水平进行归一化。
根据实施例12的程序，每组N＝5，通过皮下注射向6至8周龄雌性BALB/c小鼠：以100μL体积以5μg/剂量、15μg/剂量和40μg/剂量的剂量水平施用SEQ ID NO:2的SP/RBD，或根据表3，在没有佐剂的情况下，在第0天、第21天和第42天以100μL体积以1μg/剂量、3μg/剂量、5μg/剂量、30μg/剂量和100μg/剂量的剂量水平施用没有佐剂的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白。向一组小鼠施用盐水对照。所有小鼠在每次注射后14天和21天通过颌下静脉穿刺进行非终末采血，以获得用于抗SP/RBD Ab效价评估的血清样本。根据实施例10，在第14天和第21天测量在施用SEQ ID NO:2的SP/RBD或每个剂量水平的没有佐剂的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白之后诱导的抗SP/RBD IgG Ab效价应答(平均IgGμg/mL，通过IgG ELISA标准曲线)，并如图28所示。
重要的是，基于分子量和对SEQ ID NO:17二价物的考虑，在SEQ ID NO:2(27kDa单体)和SEQ ID NO:17(104kDa二聚体)的SP/RBD之间存在大约0.5的相对“表位剂量”差异；即，SEQ ID NO:17的二价SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白包含两个部分的SP/RBD表位，总分子量为约2个SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白单体(即分别为104kDa和54kDa)的两倍。例如，10μg的SEQ ID NO:17二聚体相当于～5μg的SEQ ID NO:17单体。
Figure BDA0003950764700000851
Figure BDA0003950764700000861
Fc部分的作用在第14天和第21天均得到证实。诱导的包括Fc片段的SEQ ID NO:17的抗SP/RBD IgG Ab效价应答甚至在初始给药后14天达到接近最大效价，如图28所示，而没有Fc片段的SP/RBD即使在21天后也几乎没有诱导抗SP/RBD IgG Ab效价应答。这两种非佐剂化材料之间的免疫原性差异表明融合蛋白Ag的Fc部分具有显著的“内置佐剂”能力。
实施例19：体内筛选在有佐剂的情况下SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在小鼠中的有效性。
根据实施例1合成SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，并根据实施例4进行纯化。根据实施例6通过非还原性和还原性CE-SDS确认融合蛋白结构，并且通过根据实施例7去除聚糖的LC-MS确认融合蛋白序列鉴定。SEQ ID NO:2的SARS-CoV-2SP/RBD(不含Fc)获自商业来源(商品号46438；Lake Pharma，Inc.，San Mateo，CA)。
根据实施例12的程序，每组N＝5，向6至8周龄雌性BALB/c小鼠以表4和表5中给出的剂量水平和佐剂施用SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，以及在第0天、第21天和第42天以5μg/剂量的剂量水平施用SEQ ID NO:2的SP/RBD。根据实施例10，在第21天(如图29所示)、第35天(如图30所示)、第56天(如图31所示)和第88天(如图32所示)测量在施用SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白和SEQ ID NO:2的SP/RBD后诱导的抗SP/RBD IgG Ab效价应答(平均IgGμg/mL，通过IgG ELISA标准曲线)。
Figure BDA0003950764700000871
Figure BDA0003950764700000872
Figure BDA0003950764700000881
一些(但不是全部)含有10μg剂量水平的佐剂化制剂在一次(第21天)、两次(第35天)和三次(第56天)给药后增强免疫原性约3至5倍，证明了佐剂之间具有一系列有效性。值得注意的是，在第三次给药后32天(即第88天)，所有制剂诱导的效价仍然显著升高，这表明即使在第一次注射后3个月对SEQ ID NO:17的应答也具有持久性(图32)。此外，SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的Fc部分对于在前2次给药后诱导显著的抗SP/RBDIgG Ab效价是必要的，因为SEQ ID NO:2(缺少Fc片段)相对于SEQ ID NO:17在第21天无效并且在第35天仅适度有效。
实施例20：在有和没有佐剂的情况下SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在小鼠中诱导的ACE2结合抑制效力的体内评价。
对ACE2结合抑制效力的有效性进行体内评价，以确定通过Ag结合ELISA测量的疫苗诱导的IgG效价是否与免疫血清的病毒中和能力相关，特别是抑制SARS-CoV-2病毒的SP/RBD与内源性人靶蛋白ACE2的结合。进行以ELISA形式的免疫血清抑制重组SP/RBD与重组ACE2结合的效力，其中SP/RBD与板和添加或不添加系列稀释的免疫血清的标记重组人ACE2结合。
根据实施例12中描述的一般方法，在6至8周龄Balb/c小鼠(JacksonLaboratories,Bar Harbor,ME)中进行体内研究以进一步评价SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的有效性。根据实施例1合成SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，并根据实施例4进行纯化。根据实施例6通过非还原性和还原性CE-SDS确认融合蛋白结构，并且通过根据实施例7去除聚糖的LC-MS确认融合蛋白序列鉴定。根据表6，在第0天、第21天和第42天皮下施用没有佐剂的以10μg/剂量的剂量水平的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白和有多种佐剂的以10μg/剂量的剂量水平的SEQ IDNO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白。
Figure BDA0003950764700000891
每次给药后21天(和下一次给药前)，通过颌下静脉穿刺法从每只小鼠中采集血液，使其凝结，通过离心微量采血管分离血清，并分装和冷冻用于根据实施例10中描述的方法通过ELISA进行的抗体分析。来自实施例13中描述的血清学测定的结果评估了抑制重组SP/RBD与结合的重组人ACE2结合的效力。使用GraphPad Prism软件对合并的血清样本进行连续稀释，从中得出抑制稀释50％(ID50)值(即，混合特定组中每只小鼠的等体积血清，并评价该合并样本)。ID50值表示血清样本达到50％的ACE2结合时稀释度的倒数。在第0天单次注射后第21天计算的作为ID 50测量的ACE2SP/RBD结合的抑制效力如图33所示。在第0天和第21天注射后第42天计算的ID50如图34所示。在第0天、第21天和第42天注射后第56天计算的ID50如图35所示，在第88天计算的最终ID50如图36所示。
来自用SEQ ID NO:17的3次给药免疫的小鼠的免疫血清的此类ID50值显示这样的应答，其中抑制效力维持至末次注射后32天(第88天)(图36)。此外，MontanideTM ISA 720佐剂在每个时间点始终诱导最高效力。MontanideTM ISA 720结果特别有意思和出乎意料，因为使用该佐剂获得的总IgG效价相对于其他佐剂制剂并非特别有效，因此表明使用ISA 720诱导每个IgG分子的内在效力更大。这些数据强烈支持选择MontanideTM ISA 720作为该疫苗开发计划的主要佐剂候选物。
实施例21：在有和没有佐剂的情况下SEQ ID NO:17的SSARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在老年小鼠中的有效性和诱导的ACE2结合抑制效力的体内筛选。
在当前的COVID-19爆发期间，发现60岁以上的个体对重度疾病的易感性更高，死亡率更高。因此，重要的是评估疫苗制剂在老年小鼠中诱导免疫应答的能力，这些小鼠的免疫系统是老年人衰老免疫系统的可靠模型。由于8月龄的小鼠自然死亡率较高，因此每个研究组分配了约15只小鼠。
根据实施例12中描述的一般方法，在8至10月龄雌性BALB/c小鼠(JacksonLaboratories,Bar Harbor,ME)中进行体内研究以评价有或没有佐剂的SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的有效性。根据实施例1合成SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，并根据实施例4进行纯化。根据实施例6通过非还原性和还原性CE-SDS确认融合蛋白结构，并且通过根据实施例7去除聚糖的LC-MS确认融合蛋白序列鉴定。
每组N＝15，在第0天、第21天和第42天，向8至10月龄雌性BALB/c小鼠以100μL体积根据表7在有或没有佐剂的情况下以10μg/剂量的剂量水平皮下施用SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白。每次给药后21天(和下一次给药前)，通过颌下静脉穿刺法从每只小鼠中采集血液，使其凝结，通过离心微量采血管分离血清，并分装和冷冻用于根据实施例10中描述的方法通过ELISA进行的抗体分析。
Figure BDA0003950764700000901
根据实施例10，测量在以100μL体积根据表7施用SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白之后诱导的抗SP/RBD IgG Ab效价应答(平均IgGμg/mL，通过IgGELISA标准曲线)，并制图。在第21天测量的SP/RBD IgG Ab效价应答如图37所示。在第35天测量的SP/RBD IgG Ab效价应答如图38所示。在第56天测量的SP/RBD IgG Ab效价应答如图39所示。
佐剂在具有10μg/剂量的SEQ ID NO:17的制剂中强烈增强这种免疫原性。与年轻小鼠中的免疫原性特征相似，相对于在第56天没有佐剂获得的水平，MontanideTM ISA 720显著增强了SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的抑制效力ID50(根据实施例13测量)17倍。重要的是，由SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在有和没有佐剂的情况下诱导的这种抑制效力高于人恢复期血清，证明了这种SP/RBD-Fc疫苗具有有前景的有效性。因此，SEQ ID NO:17的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在存在和不存在佐剂的情况下在老化免疫系统中保持具有足够效力的抗SP/RBD IgG效价的免疫原性，从而提供在老年受试者中检测这种疫苗的有力理由。
实施例22：体内筛选在有和没有佐剂的情况下SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在小鼠中的有效性。
进行体内研究以评价SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在产生SP/RBD IgG Ab效价应答中的有效性。根据实施例3合成SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，并根据实施例5进行纯化。根据实施例6通过非还原性和还原性CE-SDS确认融合蛋白结构，并且通过根据实施例7去除聚糖的LC-MS确认融合蛋白序列鉴定。
根据实施例12的程序，每组N＝5，在第0天、第21天和第42天，向6至8周龄雌性BALB/c小鼠(Jackson Laboratories)以100μL体积根据表8在有或没有佐剂的情况下以1μg和10μg的剂量水平通过皮下注射施用SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白。
Figure BDA0003950764700000921
每次给药后14天(即第14天、第35天和第56天)，通过颌下静脉穿刺法从每只小鼠中采集血液，使其凝结，通过离心微量采血管分离血清，并分装和冷冻用于ELISA分析。
根据实施例11在第14天(图40)、第35天(图41)和第56天(图42)测量诱导的SP/RBDIgG Ab效价应答(平均IgGμg/mL，通过IgG ELISA标准曲线)。
SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在不存在佐剂的情况下以1和10μg剂量水平诱导大量IgG效价，与实施例17中SEQ ID NO:17的免疫原性特征一致，显示了在第1次(第14天)和第2次(第35天)剂量后两个剂量水平之间具有显著剂量-效应。正如预期，与在不存在佐剂的情况下每次给药后相比，用不同佐剂配制的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白诱导显著更高的效价(第一次给药和第2次给药后～3至10倍)，并且MontanideTM ISA 720在每次给药后的有效性与Ad-Vax-2相似，而MontanideTMISA 51效果较差。
实施例23：在有和没有佐剂的情况下SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在小鼠中诱导的ACE2结合抑制效力和噬斑减少中和试验(PRNT)的体内评价。
进行体内研究以评价在有和没有佐剂的情况下SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在小鼠中诱导的ACE2结合抑制效力的有效性。
根据实施例3合成SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，并根据实施例5进行纯化。根据实施例6通过非还原性和还原性CE-SDS确认融合蛋白结构，并且通过根据实施例7去除聚糖的LC-MS确认融合蛋白序列鉴定。
根据实施例12的程序，每组N＝5，在第0天、第21天和第42天，向6至8周龄雌性BALB/c小鼠(Jackson Laboratories)以100μL体积根据表8在有或没有佐剂的情况下以1μg和10μg的剂量水平通过皮下注射施用SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白。
每次给药后14天(即第14天、第35天和第56天)，通过颌下静脉穿刺法从每只小鼠中采集血液，使其凝结，通过离心微量采血管分离血清，并分装和冷冻用于ELISA分析。
来自实施例13中描述的血清学测定的结果评估了抑制重组SP/RBD与结合的重组人ACE2结合的效力。使用GraphPad Prism软件对合并的血清样本进行连续稀释，从中得出抑制稀释50％(ID50)值(即，混合特定组中每只小鼠的等体积血清，并评价该合并样本)。ID50值表示血清样本达到50％的ACE2结合时稀释度的倒数。在第0天单次注射后第14天计算的作为ID 50测量的ACE2 SP/RBD结合的抑制效力如图43所示。在第0天和第21天注射后第35天计算的ID50如图44所示。在第0天、第21天和第42天注射后第56天计算的ID50如图45所示。
每次给药后SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白诱导了强ACE2-SP/RBD抑制效力(ID50值)，显著高于人恢复期的的血清(图43、图44和图45)。请注意，与MontanideTM ISA720佐剂一起配制的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在第3次给药后达到最高效力。在所有情况下，更高剂量的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白产生更高亲和力的抗体，这些抗体更有可能抑制SARS-CoV-2病毒进入患者细胞。与预期相反，实施例13中描述的ACE2结合抑制测定的结果表明，与MontanideTM ISA720佐剂一起配制的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白产生所有佐剂制剂的最高抑制性抗体，尽管当如实施例11所述测量时诱导最低水平的抗RBD IgG抗体效价之一。MontanideTM ISA 720佐剂可能非常有利于增加SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的皮下停留时间和抗原呈递潜力，从而产生最高亲和力的病毒中和抗体。
根据实施例15使用表8中描述的队列3和队列4进行噬斑减少中和试验(PRNT)(以1μg和10μg的剂量水平施用有MontanideTM ISA 720佐剂的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白)。在小鼠血清样本中诱导的SARS-CoV-2病毒中和效力如图46所示。有意思的是，根据实施例12的程序，用有MontanideTM ISA 720佐剂的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白免疫的小鼠也显示出强PRNT中和效力，其遵循预期从一次给药到两次给药渐进升高，使得第一次给药后的效力低于人血清的效力，但第二次给药后源自血清的效力比人恢复期血清的效力高得多(～10倍)。这如图46所示。中和效力显示出与ACE2抑制效力相似的特征。
实施例24：体内筛选在有和没有佐剂的情况下SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在小鼠中诱导抗SP/RBD IgG2a、IgG2b和IgG3亚型效价的有效性。
进行体内研究以比较在有或没有佐剂的情况下SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在小鼠中产生抗SP/RBD IgG2a、IgG2b和IgG3亚型效价的有效性。根据实施例3合成SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，并根据实施例5进行纯化。根据实施例6通过非还原性和还原性CE-SDS确认融合蛋白结构，并且通过根据实施例7去除聚糖的LC-MS确认融合蛋白序列鉴定。
根据实施例12的程序，每组N＝5，第0天、第21天和第42天，向6至8周龄雌性BALB/c小鼠(Jackson Laboratories)根据表9在有或没有佐剂的情况下通过皮下注射施用SEQ IDNO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白。
Figure BDA0003950764700000951
每次注射后14天，通过颌下静脉穿刺法从每只小鼠中采集血液，使其凝结，通过离心微量采血管分离血清，并分装和冷冻用于根据实施例11中描述的方法通过ELISA进行的抗体分析。SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白与所有佐剂均诱导显著的Th1促进的IgG2a、IgG2b和IgG3亚型效价，其中MontanideTM ISA 720在所有时间点始终显示出强增强(参见图48、图49和图50)。此外，Th2促进的亚型IgG1效价比Th1相关的亚型低大约10倍(图47)。这些结果表明，当与SEQ ID NO:19一起递送时，MontanideTM ISA 720佐剂保持强增强效果，特别是通过促进期望的Th1应答转变，支持其剂量节省特性和作为临床先导佐剂的选择。
实施例25：体内筛选在有和没有佐剂的情况下SEQ ID NO:23的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在小鼠中诱导抗SP/RBD IgG亚型效价的有效性。
Fc片段在其对SP/RBD-Fc融合蛋白疫苗免疫原性的贡献中的作用在小鼠中进行了进一步研究，试图了解在小鼠中使用人IgG Fc构建体可能如何影响效力。小鼠IgG2a(SEQID NO:22)是人IgG1的功能类似物。
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:22)
实验旨在确定i)Fc种类错配是否可能是SP/RBD-Fc融合蛋白潜在免疫原性的原因和ii)动物模型中人IgG Fc构建体的结果是否适用于预测人体中的表现。
因此，构建了SEQ ID NO:23的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，其包含SEQ IDNO:14的SP/RBD和SEQ ID NO:5的接头和SEQ ID NO:22的小鼠IgG2a Fc片段。
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFGGGSGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:23)
进行体内研究以比较SEQ ID NO:23的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白产生SP/RBD IgG亚型效价应答的有效性与SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白和SEQ ID NO:2的SP/RBD产生SP/RBD IgG亚型效价应答的有效性。
根据实施例2合成SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，并根据实施例5进行纯化。根据实施例6通过非还原性和还原性CE-SDS确认融合蛋白结构，并且通过根据实施例7去除聚糖的LC-MS确认融合蛋白序列鉴定。SEQ ID NO:23的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白获自商业来源(货号SPD-C5259，ACRO Biosystems，Newark，DE)。SEQ IDNO:2的SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合结构域(SP/RBD)(不含Fc)获自商业来源(货号46438；Lake Pharma，Inc.，San Mateo，CA)。
根据实施例12的程序，每组N＝5，在第0天和第21天，向6至8周龄雌性BALB/c小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)根据表10给出的剂量水平通过皮下注射施用SEQID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白、SEQ ID NO:23的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白或SEQ ID NO:2的SP/RBD。
Figure BDA0003950764700000971
每次注射后14天，通过颌下静脉穿刺法从每只小鼠中采集血液，使其凝结，通过离心微量采血管分离血清，并分装和冷冻用于根据实施例11中描述的方法通过ELISA进行的抗体分析以及根据实施例13描述的方法的ACE2-SP/RBD结合抑制效力。
免疫接种没有佐剂含有包含小鼠IgG2a的鼠Fc的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23(表10中的队列1、2、5和6)在第一次给药或第二次给药后14天显示IgG效价的诱导没有显著差异(即，如图51所示的第14天和如图52所示的第35天)，证明在BALB/c小鼠免疫原性模型中人Fc抗原序列与天然小鼠Fc序列没有任何差异。与使用SEQ ID NO:17获得的结果相似，没有Fc片段的SEQ ID NO:2(表10的队列9和10)在第一次给药和第二次给药后的免疫原性不如在不存在佐剂的情况下的SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:19。鉴于小鼠形式的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:23)在小鼠中显示出相对于裸SP/RBD蛋白(SEQ IDNO:2)增强的免疫原性，极有可能人形式将在人体中表现出增强的免疫原性。
免疫接种有佐剂含有包含小鼠IgG2a的鼠Fc的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23(表10中的队列1、2、5和6)在第一次给药或第二次给药后14天显示ACE2-SP/RBD结合抑制效力没有显著差异(即，如图53所示的第14天和如图54所示的第35天)，证明在BALB/c小鼠免疫原性模型中人Fc抗原序列与天然小鼠Fc序列未表现出差异。SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23均表现出比人恢复期血清(HCS)更高的ACE2-SP/RBD结合抑制效力，即使在仅一次给药之后。与使用SEQ ID NO:17获得的结果相似，没有Fc片段的SEQ ID NO:2在第一次给药和第二次给药后在ACE2-SP/RBD结合抑制方面的强度不如甚至在不存在佐剂的情况下的SEQ IDNO:23或SEQ ID NO:ID NO:19。鉴于小鼠形式的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白(SEQ IDNO:23)在小鼠中显示出相对于裸SP/RBD蛋白(SEQ ID NO:2)增强的免疫原性，极有可能人形式将在人体中表现出增强的免疫原性。
实施例26：体内筛选在有MontanideTM ISA-720佐剂的情况下SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在储存后在小鼠中的有效性。
体内研究比较新制备的有MontanideTM ISA 720乳剂的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白与在制备后在4℃和25℃下储存一天和七天的相同乳剂产生SP/RBD IgG Ab效价应答的有效性。根据实施例3合成SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，并根据实施例5进行纯化。根据实施例6通过非还原性和还原性CE-SDS确认融合蛋白结构，并且通过根据实施例7去除聚糖的LC-MS确认融合蛋白序列鉴定。
根据实施例12的程序，每组N＝5，向6至8周龄雌性BALB/c小鼠(JacksonLaboratories,Bar Harbor,ME)以10μg的剂量水平通过皮下注射施用与MontanideTM ISA720佐剂30％/70％v/v新鲜混合或在4℃和25℃下储存1天或7天后的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白。
在注射后第14天，通过颌下静脉穿刺法从每只小鼠中采集血液，使其凝结，通过离心微量采血管分离血清，并分装和冷冻用于根据实施例13中描述的方法通过ELISA进行的抗体分析。
实施例13中描述的ACE2结合抑制测定的结果表明，在注射新鲜制备的乳剂相比于在4℃和25℃下储存1天和7天的乳剂后，SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在小鼠血清中诱导相似的抑制效力(ID50值)。如图55所示，注射新鲜配制的乳剂相比于任何老化的乳剂的动物之间的ID50值没有显著差异(p>0.05)。
实施例27：有佐剂MontanideTM ISA 720的SEQ ID NO:19在非人灵长类动物(NHP；即食蟹猴)中诱导的ACE2结合抑制效力的初步给药有效性和功效。
为了将这种来自小鼠的人IgG1 Fc融合蛋白免疫原性知识转化为人临床研究，有或没有佐剂(MontanideTM ISA 720)的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在与NHP基因更相关的物种食蟹猴上进行检测。食蟹猴IgG1-Fc区序列与人IgG1-Fc序列和食蟹猴IgG效应子功能高度相似，人IgG1在食蟹猴中确实有活性，但效力有所降低。因此，在具有人IgG1-Fc融合蛋白的食蟹猴中获得的有效性结果可能略微低估了人IgG1-Fc融合蛋白在人中的性能。最后，通过证明SEQ ID NO:19的人IgG Fc片段能够以与人FcR和FcRn受体相似的效力结合食蟹猴FcR和FcRn同源物，证实了食蟹猴结果的可译性。将不同浓度的带His标签的人和食蟹猴FcR同源分子添加到塑料结合的SEQ ID NO:19。洗去未结合的分子后，用标记的抗His二级抗体检测结合的分子，并通过分光光度计测定吸光度(OD 450)进行比色显色。如图56、图57、图58和图59所示，通过证明SEQ ID NO:19的人IgG Fc片段能够以与人FcR和FcRn受体相似的效力结合食蟹猴FcR和FcRn同源物，证实了食蟹猴结果的可译性，因此确定了NHP模型的临床相关性。
根据实施例2或实施例3合成SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，并根据实施例5进行纯化。根据实施例6通过非还原性和还原性CE-SDS确认融合蛋白结构，并且通过根据实施例7去除聚糖的LC-MS确认融合蛋白序列鉴定。
每组N＝3，根据表11在第0天和第21天，向雄性和雌性食蟹猴通过单次皮下注射皮下施用以30％/70％(v/v)的在MontanideTM ISA 720佐剂中的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白。在第二次注射后约3个月至4 1/2个月之间，向六只猴中的五只施用加强注射以30％/70％(v/v)在MontanideTM ISA 720佐剂中的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白。
Figure BDA0003950764700001001
从每只NHP收集血液，使其凝结，并通过离心微型真空采血管分离血清，并分装和冷冻用于根据实施例11中描述的方法通过ELISA进行的抗体分析。
根据实施例11，在一次给药后第0天、一次给药后第14天、一次给药后第20天、两次给药后第35天和两次给药后第42天测量以10μg和30μg的剂量水平的用MontanideTM ISA720佐剂配制的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的诱导的抗SP/RBD IgGAb效价应答(平均IgGμg/mL，通过IgG ELISA参考血清标准曲线)，揭示了有效诱导的IgG Ab效价，其中在第0天和第21天给药后的所有时间点，30μg的较高剂量水平比10μg的较低剂量水平显示出更高免疫原性，如图60所示。
对于在抗SP/RBD IgG Ab效价下降后第102天或第154天接受加强(第三次)给药的动物，单次加强给药后诱导的抗SP/RBD IgG Ab效价应答是显著的，如图61所示，表示具有强的记忆回忆。
此外，这些IgG Ab效价免疫原性特征与由SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白诱导并根据实施例13测量的ACE2结合抑制效力(ID50)一致，其是远高于人恢复期血清(HCS)的效力，如图61所示，其中ID50值表示血清样本达到50％的ACE2结合的稀释度的倒数，在10μg和100μg剂量水平下，在1次给药后第21天和2次给药后第42天计算。
实施例28：噬斑减少中和试验以确认在非人灵长类动物(NHP；即食蟹猴)中破坏SEQ ID NO:19的重组ACE2和SP/RBD与佐剂MontanideTM ISA 720的生化相互作用的抑制效力。
在进一步开展此类转化研究中，这种破坏重组ACE2和SP/RBD生化相互作用的抑制效力在噬斑减少中和试验(PRNT)中通过中和感染活VERO-E6细胞的活SARS-CoV-2病毒得到证实。
每组N＝3，根据表11在第0天和第21天，向雄性和雌性食蟹猴皮下施用以30％/70％(v/v)的在MontanideTM ISA 720佐剂中的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白。从每只NHP收集血液，使其凝结，并通过离心微型真空采血管分离血清，分装并冷冻用于分析。
根据实施例15进行噬斑减少中和试验。SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在NHP血清样本中诱导的SARS-CoV-2病毒中和效力如图62所示。中和效力显示出与ACE2抑制效力相似的特征，尽管这种PRNT ID50值与人恢复期血清的相似。
这些结果证明了在NHP中检测疫苗接种的价值，并且为设计第一次人体临床试验提供了有价值的指导，并为向人体的转化设定了预期。
实施例29：有佐剂MontanideTM ISA 720的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白疫苗在小鼠和非人灵长类动物(NHP；即食蟹猴)中对抗SARS-CoV-2的英国变体(N501Y)和南非变体(E484K)的有效性。
进行分析以尝试了解有佐剂MontanideTM ISA 720的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白是否对SARS-CoV-2病毒的变体(特别是英国和南非病毒变体)有效。
图66显示了SEQ ID NO:2的SARS-CoV-2天然SP/RBD与UK N501Y病毒变体(SEQ IDNO:24)和南非E484K病毒变体(SEQ ID NO:25)的类似物SP/RBD片段的并排比较，使用Clustal Omega进行，其中“*”表示给定序列位置处所有序列的完全同源性。“:”(冒号)表示在Gonnet PAM 250矩阵中评分大于0.5的具有高度相似属性的基团之间的保守性。“-”(破折号)表示序列空位，表示在序列的某个范围内在特定的比较集中不存在局部同源性。
PNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLE(SEQ ID NO:24)
PNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLE(SEQ ID NO:25)
在第42天从动物1、2、3、5和6中提取来自根据实施例27给药的NHP的血清样本。在第56天提取来自根据实施例22给药的小鼠的血清样本。NHP和小鼠均已用2次给药有佐剂MontanideTM ISA 720的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白疫苗进行免疫。
将血清样本添加到塑料结合的重组RBD野生型(Lake Pharma,San Mateo,CA)或突变体N501Y(英国变体，由SINO Biological,Wayne PA提供)或E484K(南非变体，由AcroBiosystems，Newark，DE提供)。用标记的抗NHP或抗小鼠IgG二级抗体检测结合的RBD特异性IgG，并通过比色法显色(OD450值)。通过NHP或小鼠ELISA参考血清标准曲线确定IgGμg/mL效价值，并报告平均值(N＝4)。
结果如图64和图65所示，表明来自NHP和小鼠的此类免疫血清结合重组RBD突变体N501Y和E484K，以及或大于野生型RBD分子，表明英国(N501Y)和南非(E484K)病毒变体不太可能逃逸SEQ ID NO:19诱导的免疫。
说明SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的毒性研究结果的实例。
实施例30：SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白疫苗在新西兰白兔中的重复给药毒性研究，恢复期为2周。
使用新西兰白兔进行毒理学IND研究。选择兔是因为该物种已被广泛用于可导致强抗体应答的疫苗诱导的免疫原性的临床前研究。此外，兔还表达SARS-CoV-2病毒受体ACE2，它使得病毒结合并感染动物，引起与人COVID-19相似的疾病症状。疫苗抗原亚基是与人IgG1 Fc分子融合的SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的ACE2受体结合结构域，其可以直接结合兔体内的ACE2(在肺、上皮、神经元上表达)并引起病理。
使用疫苗制剂每14天皮下注射一次，共3次注射，评价有或没有MontanideTM ISA720佐剂的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的安全性、毒性、毒代动力学和免疫原性特征，并在14天的无治疗恢复期评价任何毒性体征的可逆性。积极的14天注射计划是为了确保在人体临床研究中预期的不太积极的28天注射计划得到动物毒理学的充分支持。研究终点包括临床观察、体重增加/减少、摄食量、临床病理学和终末大体尸检、器官重量和组织病理学。
根据实施例3合成SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，并根据实施例5进行纯化。根据实施例6通过非还原性和还原性CE-SDS确认融合蛋白结构，并且通过根据实施例7去除聚糖的LC-MS确认融合蛋白序列鉴定。
研究的受试者是雄性和雌性新西兰的空白无特定病原体的3至4个月龄体重2至4kg的白兔。将兔单独或成组饲养在不锈钢移动笼中，并在给药前经历14天的适应期。
每个主要研究治疗组的5只雄性和5只雌性兔以及每个恢复治疗组的3只雄性和3只雌性兔接受30μg或100μg剂量的用MontanideTM ISA 720佐剂配制的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白，或溶媒阴性对照(盐水)。包括恢复组，以研究在治疗期间观察到的任何不良反应的可逆性，并筛选任何可能的延迟不良反应。兔重复给药毒理学研究的具体详情见表12。
Figure BDA0003950764700001041
SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的靶产品特征包括不超过2次人体免疫注射，因此采用“临床给药+1次”策略，其中3次疫苗给药在第1、15和29天皮下施用(第15天和第29天毒代动力学注射设计为分别存在由第1天和第15天注射诱导的抗SP/RBD效价)。对s.c.和i.m施用途径进行评价。
实施例31：兔的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白的血清水平、抗SP/RBD IgG的血清水平和GLP毒理学研究中的观察和定量安全性评估。
PK/TK测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)，其中存在于兔血清研究样本中的SEQ IDNO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白被包被在微量滴定孔上的山羊抗人IgG(Fc)抗体捕获，然后通过抗人IgG-Fc生物素缀合物进行定量，然后与高灵敏度的Streptavidin-HRP检测抗体反应，然后是TMB底物系统。纯化的SEQ ID NO:19用于制备用于测定的标准曲线以及用于制作测定对照。四种QC(高QC、中QC、低QC和阴性QC)通过将纯化的SEQ ID NO:19储备溶液加标到正常兔血清(Jackson Immuno)中以10×制备，并在多次运行中检测以确定它们的标称值并储存在-20℃冷冻，作为小体积等分试样用于单次解冻使用。这些QC在验证分析中用作加标验证样本，以评价准确度、精密度、定量限、稀释线性、加标回收率和短期稳定性。
在预验证期间，1:10的最小所需稀释度(MRD)被确定为该ELISA的最佳稀释度，并且该稀释度用于验证运行。因此，将10％的正常兔血清(Jackson Immuno；在H2O中复溶的冻干正常兔血清)添加到用于在初步验证运行期间制作标准曲线的稀释缓冲液中。当用实际的正常兔血清(BioIVT)检测加标回收率时，由于正常兔血清未见的基质效应，观察到加标值的回收率显著不足。
基于这些结果，确定在制备标准曲线时应使用合并的兔血清而不是正常兔血清，以更好地表示非临床兔血清样本中SEQ ID NO:19的回收率。使用标准曲线缓冲液中的10％合并的正常兔血清(BioIVT)重新检测选定的参数，例如准确度和精密度、线性以及加标和回收率。
使用合并的血清标准曲线时，在所有三个非零QC水平下，测定内和测定间准确度范围为93-105％。发现该测定在2ng/mL和100ng/mL之间呈线性，并且发现这些值分别是定量下限(LLOQ)和定量上限(ULOQ)。使用合并的血清标准曲线时，11个不同血清样本的加标回收率非常准确，在高加标水平(70ng/mL)下的回收率为100-117％，在中等加标水平下为107-116％(40ng/mL)，并且在低加标水平(10ng/mL)下为108-123％。经过至少3次冻融循环(95-103％回收率)、4℃下长达一周(97-100％恢复)和室温下4小时(91-98％恢复)，发现加标血清样本具有稳定性。验证结果表明SEQ ID NO:19PK/TK ELISA具有高度准确度和可重复性，并且符合目的。
进行4个时间点的TK研究，其中同一只动物在给药前，第1次、第2次和第3次注射后6h、24h和48h采血，其中每次采血获得适当体积的血液除了免疫原性分析外，还用于TK分析。
通过在第1次给药之前以及在第1次给药和末次给药后大约2-3天、主要研究撤除时以及撤除(takedown)恢复组，通过引流淋巴结和进行血液学和血清化学，评价对免疫系统的全身性影响，并且包括绝对和相对差异白细胞(WBC)计数(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、异常细胞)、白蛋白/球蛋白比、酶和电解质。评价血清样本的疫苗特异性抗体效价和TK水平。
每日临床观察包括在注射后高达三天和之后每周检查注射部位的局部炎症反应(这些观察包括肿胀、触摸疼痛反应、运动受损和肉芽肿结节)。还进行每日健康状况观察(嗜睡、缺乏运动、行走困难、不进食等)。禁食大约12小时后，在研究终止时监测和评估每周体重和摄食量(食欲不振、厌食)。
在研究结束时，收集血液样本用于血清化学、血液学和免疫学研究，同时进行完整的大体尸检，检查大体损伤和器官重量。对组织进行组织病理学检查，特别注意免疫器官(局部和远端淋巴结、脾脏、骨髓和派尔氏斑(Peyer’s patches))、关键器官(肺、肝脏、肾脏、脑和生殖器官)和疫苗接种部位。局部毒性(在疫苗施用部位)评估包括炎症反应(例如，软肉芽肿结节、硬纤维结节、溃疡等)和切除部位的评估，并进行组织病理学检查。特别评价了肺组织中的嗜酸性粒细胞增多。
根据表12配制和制备剂量。在给药前旋转给药部位，在给药前剪掉，并用不可磨灭的标记进行标记，并在第1、15和29天对兔进行皮下给药，在每次给药之前和之后1小时以及每天两次、每天一次和每周一次对兔进行详细的临床观察。在每次给药后24、48和72小时进行Draize评分以评估注射部位炎症。如果在给药后72小时获得非零评分，则每七天对该部位进行一次评分，直至发现缓解或处死动物。
在每次给药前以及每次给药后6小时和24小时测量体温。如果体温超过40℃，则每24小时进行另外的测量，直至数值恢复正常，或处死动物。在第一次给药前、第一次给药后24和48小时、每周和每次计划尸检之前记录体重。在适应环境期检查兔的死亡率一次，然后每天两次检查死亡率。每天定量测量摄食量。在第一次给药之前和每次计划尸检之前进行一次眼科检查。
在第一次给药前、第一次和末次给药后48小时、在主要研究组的尸检时对所有动物以及在恢复期结束时对剩余动物进行一次临床化学和血液学检查。在第一次给药前、每次给药后3天、在主要研究组的尸检时对所有动物以及在恢复期结束时对剩余动物进行凝血检查。
在第一次给药前、每次给药后3天、在主要研究组的尸检时对所有动物以及在恢复期结束时对剩余动物，从所有动物收集血液用于检测C-反应蛋白一次。在第一次给药前和每次给药后14天(末次给药除外)、主要研究组的尸检时对所有动物以及恢复期结束时对剩余动物，从所有动物收集血液用于通过ELISA的ADA。研究中每只动物的4点毒代动力学(TK)血液样本在第1、2和3次给药时收集；即，在给药前第1天以及每次给药后6h、24h和48h采血，然后在第36天针对主要研究撤除和在第43天针对恢复动物的另外取样；通过ELISA进行血清SEQ ID NO:19浓度分析。
在第36天(主要研究)和第43天(恢复期)进行全面尸检，在每次计划尸检中对所有动物进行完整的组织收集和标准器官称重。通过处理成载玻片的组织进行组织病理学检查，并对所有主要研究和恢复期动物以及任何发现的死亡动物和在极端情况下实施安乐死的动物进行评估。
如毒理学研究的结果所示，没有死亡。在给药阶段期间，从给药阶段第4天开始给予有MontanideTM ISA 720的100μg SEQ ID NO:19，和从给药阶段第32天开始给予有MontanideTM ISA 720的30或100μg SEQ ID NO:19的雄性中，以及从给药阶段第18天开始给予有MontanideTM ISA 720的100μg 100μg SEQ ID NO:19，和从给药阶段第32天开始给予有MontanideTM ISA 720的30或100μg 100μg SEQ ID NO:19的雌性中的纤维蛋白原增加通常具有统计学显著性，并且可能与供试品和慢性活动性炎症的微观发现有关。在恢复阶段，纤维蛋白原的差异被认为已恢复。在雌性中存在纤维蛋白原的统计学显著差异，但与适应值相当，并且被认为可能与供应品无关并且由于生物学变异所致。在计划的收集中没有其他与供试品相关的临床病理学变化。
丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、钙、乳酸脱氢酶、钾、氯化物、淋巴细胞百分比、激活部分促凝血酶原激酶时间(仅雄性)和钠(仅雌性)的统计学显著差异被认为是由于生物学变异且与供试品无关。雄性和雌性在葡萄糖、球蛋白或白蛋白/球蛋白比、嗜异性和百分比、凝血酶原时间方面的统计学显著差异与适应值相当或在研究之间不一致。这些差异很小，在雄性中不存在，或者值与适应时的值相当，并且被认为与供试品无关并且由于生物学变异所致。在主要或恢复期终止时没有器官重量差异。小差异在统计学上不显著，与剂量无关，或在性别之间不一致，并且被认为与供试品施用无关。
在毒代动力学(TK)研究中，测量SEQ ID NO:19诱导的兔中对SP/RBD Ag特异的抗药物抗体(ADA)IgG效价。将兔分为N＝10只动物/组，在14天时间隔接受3次给药：PBS溶媒(第1组)、30μg SEQ ID NO:19(第2组)、100μg SEQ ID NO:19(第3组)、有MontanideTM ISA720的30μg的SEQ ID NO:19(第4组)，或有MontanideTM ISA 720的100μg的SEQ ID NO:19(第5组)。根据实施例14，在指定时间后收集血清样本并评价抗SP/RBD IgG Ab效价(IgGμg/mL平均值，通过ELISA使用兔IgG标准曲线)。
在所有时间点，没有佐剂的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白(即，如图68和图69中所示的第2组和第3组)显示可忽略至弱抗SP/RBD特异性IgG效价，其在溶媒对照组1的范围内(如图67所示)；即，低于10μg/mL。然而，在第1天(第15天)、第2天(第29天)和第3次(第43天)注射之后，在存在MontanideTM ISA 720佐剂和30μg和100μg的SEQID NO:19剂量(分别为第4组和第5组)的情况下诱导了明显的特异性IgG效价，这远高于(～10倍)在人恢复期血清第2和第3次给药后的结果，如图70和图71所示。在用有佐剂MontanideTM ISA 720的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白治疗的第4组和第5组中，在30μg和100μg剂量水平之间有轻微的剂量效应趋势(无统计学显著性)。
实施例32：从兔GLP毒理学研究中收集的兔血清样本的功能抑制效力结果。
根据实施例15的方法，在噬斑减少中和试验(PRNT)中，在指定时间后收集用于TK和ADA主要终点的血清样本并评价抑制ACE2-SP/RBD结合(根据实施例13的方法)和抑制活SARS-CoV-2病毒感染VERO-E6细胞的效力(ID50值)。如实施例31中所述，N＝10只动物/组在14天时接受两次给药，分别为有MontanideTM ISA 720的30μg的SEQ ID NO:19(第4组)或有ISA 720的100μg的SEQ ID NO:19(第5组)。由于期望的SEQ ID NO:19疫苗的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白包括含有MontanideTM ISA 720佐剂的制剂，因此在两种功能测定中仅评估了第4组和第5组。ID50值表示血清样本达到50％测定信号时的稀释度的倒数。
在实施例13的ACE2抑制测定中，如图72所示，在30μg和100μg剂量水平之间存在明显的抑制效力剂量效应，该剂量水平在第2次给药后14天升高并变得相似。在两个时间点的这些效力值明显高于人恢复期血清获得的效力值。对抑制活病毒感染细胞的能力的评价表明，在30μg和100μg剂量水平下均具有强效力，如图73所示，在第二次给药后(即第35天)显示出更高效力的趋势，并且这种效力与人恢复期血清的效力相似。这些结果表明，在该项GLP毒理学研究中，在MontanideTM ISA 720中乳化的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在从COVID-19感染和疾病中恢复的人中诱导功能性免疫原性水平，这将这些毒理学结果置于临床环境中，有利于对明显安全性特征的期望。
实施例33：SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在新西兰白兔中的重复给药毒性研究，以桥接皮下途径的毒理学结果与肌内途径的毒理学结果。
大多数获得许可的疫苗通过肌内(i.m.)注射施用，但有些获批用于皮下(s.c.)或皮内(i.d.)使用，主要是因为s.c.的理论原理，并且i.d.是含有更多数量的APC的部位，其可以以比i.m.途径更有效的方式将疫苗Ag递送至引流淋巴结。肌内施用通常是优选的，因为它易于执行并且通常耐受性良好，在注射部位发生不良反应的风险低。然而，与肌肉相比，将疫苗递送至皮肤作为免疫活性较高的部位长期以来一直被认为是放大疫苗应答的策略。在一些情况下，例如黄热病或流感病毒疫苗，s.c.优于i.m.注射导致健康个体的免疫原性增强，特别是在无应答者或低应答者中。在一些情况下，s.c.疫苗导致在注射部位更有效地激活APC(与i.m.相比)，伴随瞬时更高水平的疫苗特异性T细胞应答和Ab效价。然而，通常，在与几种已批准的疫苗(例如用于乙型和甲型肝炎病毒、带状疱疹病毒、流感、白喉毒素、麻疹、腮腺炎、风疹和水痘以及蜱传脑炎病毒的疫苗)的比较临床研究中，证明了s.c.和i.m.途径之间的免疫原性差异的风险很小。尽管如此，相对于i.m.免疫个体，通过皮下注射的轻微注射部位不良事件的发生率似乎略微升高,这有利于i.m.接种疫苗作为期望的递送途径。
在与实施例32中使用的相同研究设计和一般方案下使用新西兰白兔进行研究。研究设计在表13和表14中描述。在第1天、第15天和第29天s.c.或i.m.施用在ISA 720佐剂中乳化的100μg剂量的SEQ ID NO:19(100)的雄性(N＝5)和雌性(N＝5)兔中抑制ACE2结合的抗SP/RBD IgG效价的诱导(根据实施例14测量)，并且在第0天、第15天(第2次给药施用之前)、第29天(第3次给药施用之前)和第36天收集血清用于根据实施例13测量的结合抑制分析。ID50值表示血清样本达到50％的ACE2结合时稀释度的倒数。
分析表明，在任何测量日，s.c.和i.m.施用在MontanideTM ISA 720中的100μg剂量的SEQ ID NO:19之间的IgG效价或ACE2抑制效力效价没有统计学上的显著差异(图74和图75)，这支持临床试验中任一施用途径的评价。
Figure BDA0003950764700001111
Figure BDA0003950764700001112
Figure BDA0003950764700001121
a在第1、15和29天s.c.或i.m.注射给药，共注射3次；撤除在第36天主要研究中的动物。
b研究中每只动物在第1、第2和第3次给药(即第1天给药前，每次给药前后6、24、48小时)的4点TK取样曲线，然后在第36天撤除时进行1次另外取样；Sponsor通过ELISA分析血清AKS-452浓度
c相同的血液样本将用于TK和免疫原性。
实施例34：SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白在新西兰白兔中的亚组分析，以分析新鲜制备的乳剂相比于具有佐剂的老化的乳剂的效果。
由于在兔中进行的GLP重复给药毒性研究(实施例30)中必须对如此多的动物给药的后勤问题，一半动物(雄性兔)在制备有MontanideTM ISA 720乳剂的SEQ ID NO:19的当天给药(T＝0)，并且另一半动物(雌兔)在2-8℃储存乳剂后24小时(T＝24)给药。因此，可以对在第15天(一次给药后)、第29天(2次给药后)和第36天(三次给药后)测量的ACE2-SP/RBD结合抑制效力(IC50)结果(根据实施例13测量)进行亚组分析，以确定新鲜制备的和储存的乳剂之间的性能是否具有任何差异。再次，如上文针对小鼠免疫原性研究(实施例26)所述，新鲜和储存乳剂之间的抑制效力没有统计学差异，表明佐剂化的SEQ ID NO:19制剂性能在制备后至少24小时是稳定的，如图76(皮下给药)和图77(肌内给药)所示。
用有佐剂MontanideTM ISA 720的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白疫苗免疫NHP的NHP SARS-CoV-2病毒攻击模型中的有效性检测的实例
实施例35：NHP SARS-CoV-2病毒攻击模型中SEQ ID NO:19+ISA 720有效性检测的组分配。
使用SARS-CoV-2的恒河猴攻击模型在实施例27的免疫NHP中评价了SEQ ID NO:19疫苗的有效性。攻击后，通过收集和分析支气管肺泡灌洗(BAL)液、鼻洗液以及鼻和口咽拭子，通过实验监测SARS-CoV-2载荷。尸检后在组织中评估病毒载量。
如下表15所示，对两组N＝5食蟹猴进行攻击。一组由6只食蟹猴中的5只组成，这些食蟹猴已根据实施例27用有佐剂MontanideTM ISA 720的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白疫苗免疫，然后在第一次注射后三个月至四个半月之间注射有佐剂MontanideTM ISA 720的SEQ ID NO:19的SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白疫苗的加强疫苗(第三次注射)，剂量水平为30μg。第二组由5只未经处理的食蟹猴组成。
Figure BDA0003950764700001131
两组在第0天接受SARS-CoV-2病毒的攻击。在攻击前和第7天收集血液。在攻击前以及第2、4和7天进行鼻拭子、口腔拭子和BAL液收集。在第7天进行终止后尸检。研究时间表在表16中给出。
Figure BDA0003950764700001132
Figure BDA0003950764700001141
实施例36：NHP SARS-CoV-2病毒攻击模型中SEQ ID NO:19+ISA 720有效性检测的病毒接种。
通过在PBS中连续稀释制备病毒接种物，以达到2mL中1×105TCID50的预期剂量水平。在氯胺酮镇静下进行病毒施用。如下进行鼻内(IN)途径施用。使用校准的P1000移液器，将0.5mL病毒接种物滴入每个鼻孔，每只动物1.0mL。将麻醉后的NHP仰面置于手术台上。技术人员将动物的头向后倾斜，使鼻孔指向天花板。技术人员将注射器的尖端置入第一鼻孔，慢慢压下柱塞，将接种物注入鼻腔，然后取出注射器。对第二鼻孔重复此操作。将动物的头部向后倾斜约20秒，然后返回其饲养单元并进行监测，直至完全恢复。
如下进行气管内(IT)途径施用。使用法国橡胶导管/饲管，尺寸10，无菌，(切割4”-6”长度)将一(1)mL稀释的病毒在气管内递送。将规定剂量的接种物吸入注射器。在将带有接种物的注射器插入导管之前，技术人员将注射器拉回，使1.5cc的空气进入注射器。这种空气推动所有接种物通过导管。将麻醉动物置于在手术中，并由助手张开嘴巴。将含有接种物的注射器连接到无菌法国导管或饲管上。一旦看到会厌并打开声门，将饲管的小端插入声门。一旦到位，技术人员将接种物注入气管，然后从气管中取出导管。每只动物均使用新的或消毒的设备。将研究动物送回其饲养单元并进行监测，直至完全恢复。
通过噬斑或TCID50测定对攻击接种物进行回滴定，以验证适当的剂量水平。剩余的接种物也被分装到2mL冷冻管中，并储存在低于-70℃的温度下，用作病毒载量测定中的阳性对照。
实施例37：NHP SARS-CoV-2病毒攻击模型中SEQ ID NO:19+ISA 720有效性检测的样本收集。
使用棉签(COPAN植绒棉签)在镇静的NHP上收集黏膜分泌物。将拭子插入鼻腔并轻轻旋转。收集后，将拭子放入含有1mL PBS的收集瓶(2个/样本)中用于qPCR分析。在病毒载量检测之前，所有小瓶均储存在低于-70℃的温度下。
通过“椅子法”对麻醉动物进行支气管肺泡灌洗(BAL)程序。对于这个程序，一名技术人员执行实际的BAL洗涤程序，另一名技术人员将手放在动物的胸部。这是为了减少或避免在手术过程中可能因咳嗽引起的任何动物运动，以尽量减少任何可能的标本污染。将NHP置于在椅子通道的背卧位。椅子底座上的把手向上滑到动物身上，以防止动物滑下椅子通道。一旦手柄处于支撑动物体重的位置，然后将手柄拧紧到位。放置前预先测量并标记红色橡胶进料管。动物的头在椅子通道边缘下方向后和向下倾斜。然后在吸气期间通过喉镜将红色橡胶饲管插入动物的气管。将管置于正确的位置并执行BAL洗涤程序。总共10mL流过管。样本完成后，松开椅子底部的把手，将动物从椅子上移开。
记录从每只动物滴注和回收的体积，以及BAL样本中是否存在任何血液。将收集到的BAL样本立即放在湿冰上并进行处理以分离流体(例如，用于病毒载量分析)。对于此过程，将管在4℃下离心(8min，300-400×g)，去除上清液。制备并冷冻保存以下BAL等分试样，直至病毒载量(VL)或其他检测：3×0.2mL用于VL检测；3×1mL用于其他检测和存储。
实施例38：NHP SARS-CoV-2病毒攻击模型中SEQ ID NO:19+ISA 720有效性检测的血液采集。
根据表16在麻醉下收集血液。使用连接到Vacutainer采血管的Vacutainer 21g x1"采血针或Abbott Butterfly 23g x 3/4"管，通过股静脉穿刺从麻醉动物抽取血液。将血液收集到含有EDTA抗凝剂的BD
Figure BDA0003950764700001161
试管中，并使用内部IDEXX BioResearch分析仪进行分析。分析以下常规面板：CBC：WBC、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、NRBC、中性粒细胞SEG、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、绝对中性粒细胞SEG、绝对淋巴细胞、绝对嗜酸性粒细胞、绝对嗜碱性粒细胞。
进行预定尸检用于肺组织收集。对动物称重，记录体温，然后从胸腔取出肺。捕获并记录动物和肺的总体评价以及肺的数字图像。通过从左右尾叶和头叶(共8块)收集两小块(每块0.1-0.2克)对组织进行取样用于病毒载量测定。在收集组织进行病毒分析后，将肺吹入并浸入10％中性缓冲福尔马林NBF。收集的肺和其他组织将保存在NBF中，用于组织学处理和分析。
对于病毒载量测定，将组织称重，放入预先标记的Sarstedt冷冻管中(2个/样本)，然后在干冰上速冻(速冻时间以重量单位记录)。在病毒载量测定检测之前，使用手持式组织匀浆器(SOP BV-035；Omni International,Kennesaw,GA)将组织在0.5mL冷培养基(DMEM/10％FBS/庆大霉素)或RNA-Stat(用于基于PCR的测定)中匀浆大约20秒。然后将样本离心以去除碎片和分离的上清液用于病毒载量测定。
实施例39：NHP SARS-CoV-2病毒攻击模型中SARS-CoV-2的SEQ ID NO:19+ISA 720有效性检测的定量RT-PCR测定。
使用qRT-PCR测定法确定每mL体液或每克组织的RNA拷贝量。qRT-PCR检测利用专门设计用于扩增和结合冠状病毒核衣壳基因保守区域的引物和探针。将信号与已知标准曲线进行比较并计算得到每mL的拷贝数。对于qRT-PCR测定，首先使用Qiagen MinElute病毒旋转试剂盒(货号57704)从鼻腔冲洗液中分离病毒RNA。对于组织，用RNA-STAT 60(Tel-test“B”)/氯仿提取，沉淀并重悬于无RNAse的水中。为了产生扩增反应的对照，使用相同的程序从适用的病毒储备液中分离RNA。RNA的量由在260处的O.D.读数确定，使用A260处的1.0OD等于40μg/mL RNA的估计值。在已知碱基数和RNA的平均碱基重340.5g/mole的情况下，然后计算拷贝数，并相应地稀释对照。然后将每3μL 108个拷贝的最终稀释液分成10μL的一次性等分试样。这些储存在-80℃直到需要。随机选择几个等分试样并与之前的对照进行比较以验证一致性。对于主混合物的制备，将2.5mL含有Taq-聚合酶的2X缓冲液(从TaqMan RT-PCR试剂盒(Bioline货号BIO-78005)获得)添加到15mL管中。从该试剂盒，还添加了50μL的RT和100μL的RNAse抑制剂。然后以1.5mL的体积添加2μM浓度的引物对。最后，添加0.5mL水和350μL浓度为2μM的探针并涡旋管。对于反应，将45μL主混合物和5μL样本RNA添加到96孔板的孔中。所有样本进行检测，重复三次。这些板用塑料片密封。
对于对照曲线的制备，对照RNA样本从–80℃冰箱中获得。将对照RNA制备为每3μL含有106至107个拷贝。通过将5μL对照添加到45μL水中并重复7次稀释，使用无RNAse水制备八(8)个10倍系列稀释的对照RNA。这给出了范围为1至107个拷贝/反应的标准曲线。如上所述制备每种稀释的重复样本。如果拷贝数超过检测上限，则根据需要稀释样本。对于扩增，将板置于Applied Biosystems 7500序列检测器中并使用以下程序进行扩增：48℃持续30分钟，95℃持续10分钟，然后95℃持续15秒和55℃持续1分钟进行40个循环。通过从标准曲线外推并乘以0.2mL提取体积的倒数来计算每mL的RNA拷贝数。这为洗鼻液提供了每mL 50至5×108个RNA拷贝的实用范围，而对于组织，病毒载量以每克给出。
实施例40：NHP SARS-CoV-2病毒攻击模型中SARS-CoV-2的SEQ ID NO:19+ISA 720有效性检测的亚基因组mRNA测定。
sgRNA的RT-PCR分析利用专门设计用于扩增和结合来自冠状病毒的E基因信使RNA区的引物和探针。这没有被包装到病毒粒子中。将该信号与包含部分信使RNA序列(包括不在病毒中的部分)的质粒的已知标准曲线进行比较，并计算得到用于qRT-PCR测定的每mL拷贝数。为了生成扩增反应的对照，需要使用含有一部分E基因信使RNA的质粒。然后将每3μL106个拷贝的最终稀释液分成10μL的一次性等分试样。这些储存在-80℃直到需要。
随机选择几个等分试样并与之前的对照进行比较以验证一致性。然后对提取的病毒RNA样本进行扩增以提取sgRNA。将对照DNA制备为每3μL含有107个拷贝。使用AVE通过将5μL对照添加到45μL水中并重复7次稀释来制备七(7)个10倍系列稀释的对照RNA。这给出了范围为1至106个拷贝/反应的标准曲线。如上所述制备每种稀释的重复样本。如果拷贝数超过检测上限，则根据需要稀释样本。对于扩增，将板置于Applied Biosystems 7500序列检测器中并使用以下程序进行扩增：48℃持续30分钟，95℃持续10分钟，然后95℃持续15秒和55℃持续1分钟进行40个循环。通过从标准曲线外推并乘以0.2mL提取体积的倒数来计算每mL的RNA拷贝数。这为洗鼻液提供了每mL 50至5×107个RNA拷贝的实用范围，而对于组织，病毒载量以每克给出。
实施例41：在NHP SARS-CoV-2病毒攻击模型中有MontanideTM ISA 720的SEQ IDNO:19的SARS-CoV-2刺突蛋白的抗体ELISA。
进行标准间接ELISA以分析血清样本中与SARS-CoV-2刺突蛋白结合的抗体，作为动物的预筛选。该测定使用包被抗原和IgG二级抗体。对于该测定，Nunc MaxiSorp 96孔板(Thermo Scientific，货号439454)包被有在1x碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(CBB，Sigma，货号C3041-50CAP)中稀释至2μg/mL的50μL的SARS-CoV-2刺突蛋白(Sino Biological，货号40589-V08B1)。将板在2-8℃下静置孵育过夜。通过用200μL PBS+0.05％吐温-20洗涤5次，去除每个孔中未结合的包被抗原。用100μL PBS+1％BSA封闭板。将检测和阳性对照样本在测定稀释剂(PBS-吐温20-1％BSA)中稀释至1:20的起始稀释度，然后使用U底稀释板连续稀释四倍。
封闭完成后，通过倒置去除封闭缓冲液并铺板每个样本。将板在室温下静置孵育1小时，然后用200μL PBS+0.05％吐温-20洗涤5次以去除未结合的血清。以1:10,000的稀释度添加50μL二级检测抗体(山羊抗猴IgG(H+L)二级抗体，HRP，Invitrogen，PA1-84631)，并将板在室温下孵育60分钟。随后通过用200μL PBS+0.05％吐温-20洗涤5次和用200μL PBS洗涤1次来去除未结合的抗体。为了显影，将100μL 1-Step Ultra TMB底物(SERA CARE，KPL货号5120-0075)添加到每个孔中，并对板进行显影。～10min后用50μL的TMB终止溶液(SERACARE，货号5150-0020)终止反应。使用Thermo Labsystems Multiskan分光光度计在450nm处在30min内读取板。
实施例42：在NHP SARS-CoV-2病毒攻击模型中有MontanideTM ISA 720的SEQ IDNO:19的SARS-CoV-2有效性检测的噬斑减少中和试验(PRNT)。
对血清样本进行PRNT测定以进行预筛选。对于该测定，将Vero E6细胞(ATCC，货号CRL-1586)以在MEM+10％FBS+庆大霉素中175,000个细胞/孔接种于24孔板中。将板在37℃、5.0％CO2下孵育，直至第二天细胞达到80-100％汇合。在测定当天，将血清样本在56℃下热灭活30分钟。测定设置如下进行：在96深孔板中，将405μL稀释剂(DMEM+2％FBS+庆大霉素)添加到第1列，并将300μL稀释剂添加到第3、5、7、9和11列。在第一列(1:10稀释)中加入四十五(45)μL热灭活血清样本。添加完所有样本后，使用P200移液器将孔中的内容物上下混合～5次，然后将150μL转移到第3列进行1:3倍稀释。对板下至第11列的下一组孔重复此操作。对于病毒阳性对照，在第1、3、5、7、9和11列中添加300μL稀释液，而在第1行中添加600μL稀释液，作为阴性对照。制备30pfu/孔浓度的病毒并保持在冰上直至使用。
如上所述制备滴定板后，向所有样本和阳性对照孔中添加300μL的30pfu/孔病毒稀释液。这使样本稀释倍数加倍(第一孔以1:20开始)。然后用板密封剂覆盖板并在37℃、5.0％CO2下孵育1小时。孵育完成后，从24孔板中取出培养基，并使用多通道移液器从滴定板中添加250μL滴定样本，重复两次。一次仅制备一快板以避免细胞变干。将24孔板在37℃、5.0％CO2下孵育1小时以进行病毒感染。在此期间，0.5％甲基纤维素培养基在37℃水浴中加热。孵育1小时后，将1mL 0.5％甲基纤维素培养基添加到每个孔中，并将板在37℃、5％CO2下孵育3天。除去甲基纤维素培养基，用1mL PBS洗涤板一次。将板用每孔400μL冰冷甲醇在-20℃下固定30分钟。固定后，弃去甲醇，用每孔250μL的0.2％结晶紫(20％MeOH，80％dH2O)在室温下将单层细胞染色30分钟。最后将板用PBS或dH2O洗涤一次，并让其干燥～15min。记录每个孔中的噬斑，并根据病毒对照孔中检测到的平均噬斑数计算IC50和IC90效价。
实施例43：在NHP SARS-CoV-2病毒攻击模型中有MontanideTM ISA 720的SEQ IDNO:19的SARS-CoV-2有效性测试的感染病毒载量测定(TCID50)。
Vero E6细胞(ATCC货号CRL-1586)以25,000个细胞/孔接种在DMEM+10％FBS+庆大霉素中，并在37℃、5.0％CO2下孵育培养物。第二天细胞应80-100％汇合。吸出培养基并用180μL DMEM+2％FBS+庆大霉素换液。将二十(20)μL样本添加到顶行并使用P200移液器混合5次，重复四次。使用移液器，将20μL转移到下一行，并沿板(A-H列)向下重复，代表10倍稀释。每行布置吸头并重复直至最后一行。阳性(测定中已知感染效价的病毒储备液)和阴性(仅培养基)对照孔包括在每个测定设置中。将板在37℃、5.0％CO2下孵育4天。目视检查细胞单层的CPE。未感染的孔具有清晰的汇合细胞层，而感染的细胞具有细胞圆形。CPE的存在在实验室表格上标记为+，CPE的缺失标记为-。使用Read-Muench公式计算TCID50值。
实施例44：在NHP SARS-CoV-2病毒攻击模型中有MontanideTM ISA 720的SEQ IDNO:19有效性检测的结果。
如表17中所示，与具有可忽略或检测不到水平的空白对照NHP相比，用有ISA-720的SEQ ID NO:19免疫的五只NHP在病毒攻击之前显示出显著的抗SP/RBD IgG效价和ACE2抑制ID50值。图78所示的攻击后结果是有ISA-720的SEQ ID NO:19疫苗在预防COVID-19感染方面的有效性的鲜明证明，在根据实施例37的程序获得的鼻拭子中SARS-CoV-2病毒基因组和病毒亚基因组RNA效价可忽略或检测不到水平(根据实施例39的程序测量)就证明了这一点。类似地，图79显示了根据实施例37的程序获得的BAL样本中SARS-CoV-2病毒基因组和病毒亚基因组RNA效价的可忽略或不可检测水平(根据实施例40的程序测量)。低亚基因组RNA(sgRNA)计数特别令人鼓舞，因为它们是复制中间体，因此，它们的丰度与病毒复制活性和宿主感染的严重程度有关。总之，这些数据最终证明有ISA-720的SEQ ID NO:19可预防COVID-19，并且在NHP中不存在COVID-19疾病恶化的风险。
Figure BDA0003950764700001211
对主要器官/组织进行组织病理学检查，特别是肝脏、肺、呼吸道、脾脏、肾脏、脑和淋巴结。SARS-CoV-2已被证明可感染肝细胞并引起人肝炎，因此进行组织病理学检查以评估肝炎的严重程度，以及与接种疫苗和未接种疫苗的对照的攻击相关的肝炎严重程度。检查肺部和呼吸道是否存在与重度感染和肺炎相关的病变。
犬胰岛素-Fc融合蛋白的合成、纯化和验证的一般实例
实施例45：在HEK293细胞中制备胰岛素-Fc融合蛋白的合成和方法。
如下合成胰岛素-Fc融合蛋白。使用专有软件(LakePharma，Belmont，CA)构建目的基因序列，并将其克隆到高表达哺乳动物载体中。HEK293细胞在转染前24小时接种在摇瓶中，并使用无血清化学成分限定的培养基生长。使用用于瞬时转染的(LakePharma，Belmont，CA)标准操作程序将编码目的胰岛素-Fc融合蛋白的DNA表达构建体瞬时转染到HEK293细胞的悬浮液中。20小时后，对细胞进行计数以确定活力和活细胞计数，并通过
Figure BDA0003950764700001221
(Pall FortéBio LLC，Fremont，CA)测量效价。在整个瞬时转染产生运行过程中获取另外的读数。在第5天或之后收获培养物。
实施例46：在CHO细胞中制备胰岛素-Fc融合蛋白的合成和方法。
CHO细胞系最初来源于CHO-K1(LakePharma，Belmont，CA)，并且使用本领域已知的方法通过重组技术敲除内源性谷氨酰胺合成酶(GS)基因。针对CHO表达和GS选择设计和优化了稳定表达DNA载体，并将其整合到高表达哺乳动物载体(LakePharma，Belmont，CA)中。在开始放大实验之前，确认每个完成的构建体的序列。在化学成分限定的培养基(CDOptiCHO；Invitrogen，Carlsbad，CA)中，在37℃的加湿5％CO2培养箱中培养适应悬浮液的CHO细胞。没有血清或其他动物来源的产品用于培养CHO细胞。
使用
Figure BDA0003950764700001222
系统(MaxCyte，Inc.，Gaithersburg，MD)通过电穿孔用80μg DNA转染在指数生长期期间在CD OptiCHO培养基中生长的约8000万个悬浮适应的CHO细胞，以构建每种胰岛素-Fc融合蛋白的稳定CHO细胞系(DNA构建体含有胰岛素-Fc融合蛋白的全长序列)。24小时后，对转染的细胞进行计数并选择稳定整合胰岛素-Fc融合基因。将转染的细胞接种到含有0-100μM甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)的CD OptiCHO选择培养基中，细胞密度为0.5×106个细胞/mL，置于摇瓶中，并在37℃和5％CO2下孵育。在选择过程中，每2-3天将细胞离心并重悬于新鲜的选择培养基中，直到CHO稳定池恢复其生长速率和活力。监测细胞培养物的生长和效价。
细胞生长至2.5×106个细胞/mL。在细胞库收获时，活力超过95％。然后将细胞离心，将细胞沉淀重悬于含有7.5％二甲亚砜(DMSO)的CD OptiCHO培养基中，使细胞计数达到15×106个细胞/mL/小瓶。将小瓶冷冻保存在液氮中储存。
如下使用CHO细胞进行小规模生产。将细胞放大以在37℃下在含有100μM MSX的CDOptiCHO生长培养基中生产，并根据需要每2-4天补液一次，CD OptiCHO生长培养基根据需要补充有葡萄糖和另外的氨基酸，持续大约14-21天。通过离心机旋转澄清从稳定池生产运行中收获的条件培养基上清液。蛋白质在用结合缓冲液预平衡的蛋白质A(MabSelect，GEHealthcare，Little Chalfont，英国)柱上运行。然后将洗涤缓冲液通过柱，直至测量到OD280值(NanoDrop，Thermo Scientific)处于或接近背景水平。使用低pH缓冲液洗脱胰岛素-Fc融合蛋白，收集洗脱级分，记录各级分的OD280值。合并含有靶胰岛素-Fc融合蛋白的级分，并任选使用0.2μM膜过滤器进一步过滤。
细胞系任选地进一步亚克隆为单克隆，并且任选地使用有限稀释法(本领域技术人员已知的方法)进一步选择高效价胰岛素-Fc-融合蛋白表达克隆。在获得高效价的单克隆胰岛素-Fc融合蛋白表达细胞系后，如上所述在没有MSX的生长培养基中，或任选地在含有MSX的生长培养基中，完成胰岛素-Fc融合蛋白的产生，以获得含有重组的CHO制备的胰岛素-Fc融合蛋白的细胞培养上清液。MSX浓度随时间任选地增加以对能够产生更高产品效价的克隆施加另外的选择性。
实施例47：胰岛素-Fc融合蛋白的纯化。
胰岛素-Fc融合蛋白的纯化如下进行。从瞬时或稳定转染的HEK生产运行中收集含有分泌的胰岛素-Fc融合蛋白的条件培养基上清液，并通过离心进行澄清。将含有期望的胰岛素-Fc融合蛋白的上清液流经蛋白A柱，并使用低pH梯度进行洗脱。之后，将含有期望的蛋白质的洗脱级分合并，并将缓冲液交换到200mM HEPES、100mM NaCl、50mM NaOAc，pH 7.0缓冲液中。使用0.2μm膜过滤器进行最终过滤步骤。最终蛋白质浓度由溶液在280nm处的光密度计算。根据需要通过离子交换层析(例如，使用阴离子交换珠粒树脂或阳离子交换珠粒树脂)、凝胶过滤层析或其他方法进行进一步任选的纯化。
实施例48：通过非还原和还原CE-SDS确认胰岛素-Fc融合蛋白结构。
毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS)分析在
Figure BDA0003950764700001231
GXII(Perkin Elmer，Waltham，MA)中对溶解在200mM HEPES、100mM NaCl，50mM NaOAc，pH 7.0缓冲液中的纯化胰岛素-Fc融合蛋白溶液进行，并绘制电泳图。在非还原条件下，样本根据已知分子量(MW)蛋白质标准运行，洗脱峰代表胰岛素-Fc融合蛋白同型二聚体的“表观”分子量。
在还原条件下(例如，使用β-巯基乙醇破坏胰岛素-Fc融合蛋白同型二聚体的二硫键)，所得胰岛素-Fc融合蛋白的表观分子量将蛋白单体与胰岛素-Fc融合蛋白同型二聚体的一半分子量进行比较，以确定胰岛素-Fc融合蛋白的结构纯度是否为可能是正确的。
实施例49：胰岛素-Fc融合蛋白序列通过去除聚糖的LC-MS进行鉴定。
为了通过质谱(MS)获得对胰岛素-Fc融合蛋白质量的准确估计，首先对样本进行处理以去除可能干扰MS分析的天然聚糖。使用Zeba脱盐柱(Pierce，ThermoFisherScientific，Waltham，MA)，首先将溶解于200mM HEPES、100mM NaCl、50mM NaOAc，pH 7.0缓冲溶液中的100μL的2.5mg/mL胰岛素-Fc融合蛋白缓冲交换成含有5mM EDTA的0.1M Tris，pH8.0缓冲液。向该溶液添加1.67μL的PNGase F酶(Prozyme N-glycanase)以去除胰岛素-Fc融合蛋白中存在的N-连接聚糖(例如，连接到位于cNg-N位点的天冬酰胺侧链的聚糖)，并将混合物在培养箱中于37℃培养过夜。然后通过LC-MS(NovaBioassays，Woburn，MA)分析样本，得到分子的分子量，该分子质量对应于没有聚糖的期望同型二聚体。然后进一步校正该质量，因为用于从cNg-天冬酰胺切割聚糖的酶促过程也使天冬酰胺侧链脱氨基形成天冬氨酸，并且在如此进行时，酶促处理的同型二聚体总体获得2Da，对应于质量同型二聚体中存在的每条链1Da。因此，实际分子量是测量质量减去2Da，以校正分析样本中胰岛素-Fc融合蛋白结构的酶修饰。
实施例50：通过尺寸排阻色谱测定胰岛素-Fc融合蛋白的同型二聚体％。
使用与波长为280nm的2998光电二极管阵列连接的Waters 2795HT HPLC(WatersCorporation，Milford，MA)对胰岛素-Fc融合蛋白进行尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)。将100μL或更少的含有目的胰岛素-Fc融合蛋白的样本注射至MAbPac SEC-1、5μm、4×300mm色谱柱(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)，运行流速为0.2mL/min，流动相包含50mM磷酸钠、300mM NaCl和0.05％w/v叠氮化钠，pH 6.2。MAbPac SEC-1色谱柱根据分子大小分离的原理工作。因此，较大的可溶性胰岛素-Fc聚集体(例如，胰岛素-Fc融合蛋白同型二聚体的多聚体)在较早的保留时间洗脱，并且非聚集的同型二聚体在之后的保留时间洗脱。在通过分析型SEC-HPLC将同型二聚体混合物与聚集的多聚同型二聚体分离时，确定胰岛素-Fc融合蛋白溶液的纯度(以非聚集同型二聚体的百分比计)。
实施例51：胰岛素-Fc融合蛋白的体外Fc(γ)受体I结合亲和力测定。
胰岛素-Fc融合蛋白在pH 7.4下与Fc(γ)受体I的结合使用如下ELISA测定进行。由于犬Fc(γ)受体I无法商购获得，因此使用人Fc(γ)受体I(即rhFc(γ)受体I)作为替代哺乳动物受体。将胰岛素-Fc化合物在pH 9.6的碳酸氢钠缓冲液中稀释至10μg/mL，并在4℃下在Maxisorp(Nunc)微量滴定板上包被过夜，然后微孔板条用PBST(PBS/0.05％吐温-20)缓冲液洗涤5次，并用Superblock封闭试剂(ThermoFisher)封闭。在PBST/10％Superblock缓冲液中制备6000ng/mL至8.2ng/mL的生物素化rhFc(γ)受体I(重组人Fc(γ)R-I；R&DSystems)的系列稀释液，并以100μL/孔负载到包被胰岛素-Fc融合蛋白的微孔板条。将微量滴定板在室温下孵育1小时，然后用PBST洗涤微孔板条5次，然后负载100μL/孔的链霉亲和素-HRP，其在PBST/10％Superblock缓冲液中以1:10000稀释。孵育45min后，用PBST再次洗涤微孔板条5次。添加TMB以显示结合的Fc(γ)受体I蛋白，并用ELISA终止试剂(BostonBioproducts)终止。板在ELISA酶标仪中在450nm处读取，OD值(与每个rhFc(γ)受体与胰岛素-Fc融合蛋白的结合成比例)使用GraphPad Prism软件针对添加到每个孔中的每个rhFc(γ)受体的对数浓度作图以生成结合曲线。
实施例52：在客户拥有的犬中定期施用胰岛素Fc融合蛋白后的体内药效学(PD)。
生物活性胰岛素-Fc融合同型二聚体构建体根据实施例45或实施例46合成并根据实施例47纯化，如下评估其对空腹血糖水平的影响。
方案1是公开的、自我控制的、单臂试验性现场疗效研究，用胰岛素-Fc融合蛋白治疗被诊断患有糖尿病的客户拥有的犬。通过比较血糖控制(基于临床体征、果糖胺水平和使用连续血糖监测装置(CGMS)的间质葡萄糖浓度)来评估药物的效果，同时基于标准胰岛素治疗(持续一周)相比于使用递增剂量的胰岛素-Fc融合蛋白治疗持续8周。以0.1mg/kg开始皮下给药剂量，然后根据CGMS结果和临床体征，连续每周增加至最大0.5mg/kg。表18给出了用于一些犬的方案1研究时间表。
Figure BDA0003950764700001261
方案2是公开的、自我控制的、单臂试验性现场疗效研究，用胰岛素-Fc融合蛋白治疗被诊断患有糖尿病的客户拥有的犬。通过比较血糖控制(基于临床体征、果糖胺水平和使用连续血糖监测装置(CGMS)的间质葡萄糖浓度)来评估药物的效果，同时基于标准胰岛素治疗(持续一周)相比于使用递增剂量的胰岛素-Fc融合蛋白治疗持续5周。以0.1mg/kg开始皮下给药剂量，然后根据CGMS结果和临床体征，连续每周增加至最大0.5mg/kg。表19给出了用于一些犬的方案2研究时间表。
Figure BDA0003950764700001271
完成上述任一方案后，可选择进行长达一年的“家庭使用”评价。在此阶段，兽医根据具体情况对每只犬进行治疗，如同对待任何其他使用常规胰岛素的患者一样。在整个研究阶段，使用连续葡萄糖监测装置(CGMS)监测临床体征和间质葡萄糖浓度。此外，尽可能频繁地采集血液样本以评估果糖胺水平、血液化学和血细胞计数，并检测抗药物和抗胰岛素抗体的存在。
实施例53：在犬中定期施用胰岛素-Fc融合蛋白后的体内抗胰岛素抗体(AIA)效价测量——方案1。
Maxisorp ELISA板(Nunc)用以30μg/mL稀释在包被缓冲液(pH＝9.6碳酸盐-生物碳酸盐缓冲液)中的纯化RHI包被在4℃下过夜。然后将板用PBST(PBS+0.05％吐温20)洗涤5次，并用SuperBlock封闭溶液(ThermoFisher)封闭≥1小时(或过夜)。为了计算犬IgG单位的AIA，条直接用在pH＝9.6Carb-Biocarb包被缓冲液中1:2连续稀释的犬IgG(JacksonImmunoresearch)包被，浓度为300-4.69ng/mL，在4℃下过夜，然后用于创建7点伪标准曲线。标准条板也用SuperBlock封闭溶液清洗和封闭≥1小时(或过夜)。
将检测血清样本在PBST/SB/20％HS样本稀释缓冲液(PBS+0.1％吐温20+10％SuperBlock+20％马血清)中稀释至≥1:100(通常检测为1:200)并添加RHI包被的条，以100μL/孔重复。还将犬IgG包被的标准条的重复条添加到每个板中，并填充PBST/SB(PBS+0.1％吐温20+10％SuperBlock)缓冲液100μL/孔。将板在室温下孵育1小时。孵育后，用PBST洗涤板5次。为了检测AIA，将与犬IgG发生交叉反应的HRP缀合的山羊抗犬IgG F(ab')2(JacksonImmunoresearch)在PBST/SB中稀释至1:10,000，样本孔和标准孔中均加入100μL/孔，并在室温下避光孵育45分钟。将板用PBST洗涤5次，并通过在黑暗中在室温下添加100μL/孔TMB底物(Invitrogen)15-20分钟来显色。然后通过添加100μL/孔的ELISA终止溶液(BostonBioproducts)停止显色，并在30分钟内使用SpectraMax酶标仪在450nm处读取吸光度。通过使用SoftMax Pro软件在4-PL伪标准曲线中插入OD值来确定抗药物抗体浓度。
实施例54：在犬中定期施用胰岛素-Fc融合蛋白后的体内抗胰岛素抗体(AIA)效价测量——方案2。
一般程序如下所示：将带有标记抗原的血清在有和没有冷胰岛素的情况下孵育过夜。抗体结合的标记抗原在96孔板中用蛋白A/G琼脂糖(Sepharose)沉淀，每种血清重复检测。洗涤96孔板以去除未结合的标记抗原。每个孔均用96孔板β计数器计数。结果表示为指数，该指数针对特定测定中阳性和阴性对照血清的delta cpm校正检测血清的每分钟delta计数(cpm)。
具体程序包括如下制备两种缓冲液：缓冲液1(150mM NaCl、20mM Tris-HCl、1％BSA、0.15％吐温-20、0.1％叠氮化钠pH 7.4)和缓冲液2(与缓冲液1相同，除了用0.1％BSA代替1％BSA)。必要时将每个血清样本离心以去除纤维蛋白凝块。然后通过将10μCi的125I-胰岛素粉末溶解在1mL的5％BSA PBS中来制备放射性标记胰岛素的储备溶液。使用3040μL缓冲液1和160μL放射性标记胰岛素原液制备“热”胰岛素抗原溶液。使用2784μL缓冲液1、160μL放射性标记胰岛素原液和256μL 
Figure BDA0003950764700001291
溶液(Eli Lilly，IN)制备“冷抑制”胰岛素抗原溶液。所有溶液在使用前均保存在冰上。在PCR管中，将6μL每个血清样本与30μL“热”胰岛素抗原溶液混合，将每个血清样本6μL与30μL“冷抑制”胰岛素抗原溶液混合。所得混合物在4℃下孵育过夜。然后通过向每个孔中添加150μL缓冲液1，然后在铝箔盖下在室温下孵育过夜，然后洗涤并去除洗涤缓冲液，使板包被BSA。蛋白-A/G琼脂糖混合物分两部分制备。蛋白-A琼脂糖溶液在缓冲液1中以62.5％的体积浓度制备。蛋白-G琼脂糖溶液在缓冲液1中以40％的体积浓度制备。最后，通过将蛋白-A和蛋白-G琼脂糖溶液以4:1的比例混合来制备蛋白-A/G琼脂糖混合物(最终浓度：50％蛋白-A/8％蛋白-G琼脂糖)。为了进行检测，将50μL蛋白A/G-琼脂糖混合物和30μL过夜孵育的血清溶液添加到每个孔中，一式二份。将板在4℃下在板振荡器上混合45分钟，然后使用Millipore洗板设备洗涤7次，每孔加入200μL洗涤缓冲液，然后置于37℃培养箱中干燥15分钟。将50μL闪烁混合物(Microscint-20)添加到每个孔中，并使用96孔板计数器对板进行计数以确定每个孔的cpm。
等同物
在权利要求书中，冠词例如“一种(a、an)”和“该”可以表示一个或多个，除非有相反的指示或从上下文中明显看出。如果一个、多于一个或所有组成员存在于给定产品或过程中、在给定产品或过程中使用，或以其他方式与给定产品或过程相关，除非有相反的指示或从上下文中显而易见的，否则认为在一个组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述。本公开包括其中该组中的一个成员恰好存在于给定产品或过程中、在其中使用或以其他方式与给定产品或过程相关的实施方式。本公开包括其中多于一个或所有组成员存在于给定产品或过程中、在其中使用或以其他方式与给定产品或过程相关的实施方式。
此外，本公开包括所有变化、组合和排列，其中将来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款和描述性术语引入另一权利要求。例如，可以修改从属于另一权利要求的任何权利要求以包括在从属于相同基本权利要求的任何其他权利要求中发现的一个或多个限制。在元素以列表形式呈现的情况下，例如以马库什组形式，元素的每个子组也被公开，并且可以从组中删除任何元素。应当理解，通常，在本公开或本公开的方面被称为包含特定元素和/或特征的情况下，本公开的某些实施方式或本公开的方面由此类元素和/或特征组成或基本上由其组成。为了简化目的，这些实施方式并未在本文中具体阐述。还应注意，术语“包含(comprise(s)、comprising)”和“含有(contain(s)、containing)”旨在是开放式的，并且其使用允许包含另外的元素或步骤。在给出范围的地方，包括端点。此外，除非另有说明或从上下文和本领域普通技术人员的理解中以其他方式显而易见，表示为范围的值可以假定在本公开的不同实施方式中所述范围内的任何特定值或子范围，至范围下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。
在阅读本文的公开和下面的工作实例后，本技术的各种实施方式的其他优点对于本领域技术人员而言将是显而易见的。应当理解，除非本文另有说明，否则本文所述的各种实施方式不一定是相互排斥的。例如，一个实施方式中描述或描绘的特征还可以包括在其他实施方式中，但不是必须被包括。因此，本发明涵盖本文所述的特定实施方式的多种组合和/或整合。
本说明书还使用数值范围来定量与本发明的各种实施方式有关的某些参数。应当理解，当提供数值范围时，这些范围将被解释为为仅列举范围的下限值的权利要求限制以及仅列举范围的上限值的权利要求限制提供文字支持。例如，所公开的约10至约100的数值范围为记载“大于约10”(没有上限)的权利要求和记载“小于约100”(没有下限)的权利要求提供了文字支持。
序列表
<110> 阿卡斯通生物科学公司（AKSTON BIOSCIENCES CORPORATION）
<120> COVID-19融合蛋白的抗原特异性免疫疗法和使用方法
<130> PPI22171815US
<160> 33
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1273
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2表面糖蛋白
<400> 1
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1               5                   10                  15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
            20                  25                  30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
        35                  40                  45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
    50                  55                  60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65                  70                  75                  80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
                85                  90                  95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
            100                 105                 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
        115                 120                 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
    130                 135                 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
                165                 170                 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
            180                 185                 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
        195                 200                 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
    210                 215                 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
                245                 250                 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
            260                 265                 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
        275                 280                 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
    290                 295                 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305                 310                 315                 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
                325                 330                 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
            340                 345                 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
        355                 360                 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
    370                 375                 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385                 390                 395                 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
                405                 410                 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
            420                 425                 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
        435                 440                 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
    450                 455                 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465                 470                 475                 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
                485                 490                 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
            500                 505                 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
        515                 520                 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
    530                 535                 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545                 550                 555                 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
                565                 570                 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
            580                 585                 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
        595                 600                 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
    610                 615                 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625                 630                 635                 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
                645                 650                 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
            660                 665                 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
        675                 680                 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
    690                 695                 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705                 710                 715                 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
                725                 730                 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
            740                 745                 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
        755                 760                 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
    770                 775                 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785                 790                 795                 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
                805                 810                 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
            820                 825                 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
        835                 840                 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
    850                 855                 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865                 870                 875                 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
                885                 890                 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
            900                 905                 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
        915                 920                 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
    930                 935                 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945                 950                 955                 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
                965                 970                 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
            980                 985                 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
        995                 1000                1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
    1010                1015                1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
    1025                1030                1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
    1040                1045                1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
    1055                1060                1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
    1070                1075                1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
    1085                1090                1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
    1100                1105                1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
    1115                1120                1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
    1130                1135                1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
    1145                1150                1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
    1160                1165                1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
    1175                1180                1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
    1190                1195                1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
    1205                1210                1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
    1220                1225                1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
    1235                1240                1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
    1250                1255                1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
    1265                1270
<210> 2
<211> 254
<212> PRT
<213> SARS-Cov-2 RBD
<400> 2
Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr
1               5                   10                  15
Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys
            20                  25                  30
Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe
        35                  40                  45
Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr
    50                  55                  60
Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln
65                  70                  75                  80
Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu
                85                  90                  95
Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu
            100                 105                 110
Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg
        115                 120                 125
Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr
    130                 135                 140
Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr
145                 150                 155                 160
Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr
                165                 170                 175
Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro
            180                 185                 190
Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys
        195                 200                 205
Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr
    210                 215                 220
Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile
225                 230                 235                 240
Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu
                245                 250
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头
<400> 3
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1               5
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Gly Gly
            20
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头
<400> 5
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1               5
<210> 6
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成Fc片段
<400> 6
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
            20                  25                  30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
        35                  40                  45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
    50                  55                  60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
                85                  90                  95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
            100                 105                 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
        115                 120                 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
    130                 135                 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145                 150                 155                 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
                165                 170                 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
            180                 185                 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
        195                 200                 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
    210                 215                 220
Pro Gly
225
<210> 7
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成Fc片段
<400> 7
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1               5                   10                  15
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
            20                  25                  30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
        35                  40                  45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
    50                  55                  60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65                  70                  75                  80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
                85                  90                  95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
        115                 120                 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
    130                 135                 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145                 150                 155                 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
                165                 170                 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
            180                 185                 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
        195                 200                 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
    210                 215                 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210> 8
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SARS-Cov-2 RBD类似物
<400> 8
Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg
1               5                   10                  15
Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
            20                  25                  30
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
        35                  40                  45
Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn
    50                  55                  60
Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile
65                  70                  75                  80
Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro
                85                  90                  95
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp
            100                 105                 110
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys
        115                 120                 125
Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
    130                 135                 140
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe
145                 150                 155                 160
Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
                165                 170                 175
Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala
            180                 185                 190
Thr Val
<210> 9
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SARS-Cov-2 RBD类似物
<400> 9
Gln Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Gln Ala Thr Arg
1               5                   10                  15
Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
            20                  25                  30
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
        35                  40                  45
Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Met Phe Thr Asn
    50                  55                  60
Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile
65                  70                  75                  80
Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro
                85                  90                  95
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp
            100                 105                 110
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys
        115                 120                 125
Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
    130                 135                 140
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe
145                 150                 155                 160
Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
                165                 170                 175
Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala
            180                 185                 190
Thr Val
<210> 10
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SARS-Cov-2 RBD类似物
<400> 10
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
1               5                   10                  15
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
            20                  25                  30
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
        35                  40                  45
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
    50                  55                  60
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
65                  70                  75                  80
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
                85                  90
<210> 11
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白
<400> 11
Gln Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Gln Ala Thr Arg
1               5                   10                  15
Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
            20                  25                  30
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
        35                  40                  45
Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Met Phe Thr Asn
    50                  55                  60
Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile
65                  70                  75                  80
Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro
                85                  90                  95
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp
            100                 105                 110
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys
        115                 120                 125
Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
    130                 135                 140
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe
145                 150                 155                 160
Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
                165                 170                 175
Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala
            180                 185                 190
Thr Val Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly
        195                 200                 205
Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
    210                 215                 220
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225                 230                 235                 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
                245                 250                 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
            260                 265                 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
        275                 280                 285
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
    290                 295                 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305                 310                 315                 320
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
                325                 330                 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
            340                 345                 350
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
        355                 360                 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385                 390                 395                 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
                405                 410                 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
            420                 425                 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        435                 440
<210> 12
<211> 339
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白
<400> 12
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
1               5                   10                  15
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
            20                  25                  30
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
        35                  40                  45
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
    50                  55                  60
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
65                  70                  75                  80
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Gly Gly Gly Gly
                85                  90                  95
Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly
            100                 105                 110
Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
        115                 120                 125
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
    130                 135                 140
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
145                 150                 155                 160
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
                165                 170                 175
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
            180                 185                 190
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
        195                 200                 205
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
    210                 215                 220
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
225                 230                 235                 240
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
                245                 250                 255
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
            260                 265                 270
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
        275                 280                 285
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
    290                 295                 300
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
305                 310                 315                 320
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
                325                 330                 335
Ser Pro Gly
<210> 13
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SARS-Cov-2 RBD类似物
<400> 13
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1               5                   10                  15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
            20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
        35                  40                  45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
    50                  55                  60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
                85                  90                  95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
            100                 105                 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
        115                 120                 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
    130                 135                 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145                 150                 155                 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
            180                 185                 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
        195                 200                 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn
    210                 215                 220
Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys
225                 230                 235                 240
Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp
                245                 250                 255
Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys
            260                 265                 270
Ser
<210> 14
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SARS-Cov-2 RBD类似物
<400> 14
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1               5                   10                  15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
            20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
        35                  40                  45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
    50                  55                  60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
                85                  90                  95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
            100                 105                 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
        115                 120                 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
    130                 135                 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145                 150                 155                 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
            180                 185                 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
        195                 200                 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
    210                 215                 220
<210> 15
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SARS-Cov-2 RBD类似物
<400> 15
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1               5                   10                  15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
            20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
        35                  40                  45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
    50                  55                  60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
                85                  90                  95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
            100                 105                 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
        115                 120                 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
    130                 135                 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145                 150                 155                 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
            180                 185                 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
        195                 200                 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys
    210                 215
<210> 16
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白
<400> 16
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1               5                   10                  15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
            20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
        35                  40                  45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
    50                  55                  60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
                85                  90                  95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
            100                 105                 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
        115                 120                 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
    130                 135                 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145                 150                 155                 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
            180                 185                 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
        195                 200                 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Gly
    210                 215                 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
225                 230                 235                 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
                245                 250                 255
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
            260                 265                 270
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
        275                 280                 285
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
    290                 295                 300
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
305                 310                 315                 320
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
                325                 330                 335
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
            340                 345                 350
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
        355                 360                 365
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
    370                 375                 380
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
385                 390                 395                 400
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
                405                 410                 415
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
            420                 425                 430
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
        435                 440                 445
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
    450                 455                 460
<210> 17
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白
<400> 17
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1               5                   10                  15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
            20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
        35                  40                  45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
    50                  55                  60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
                85                  90                  95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
            100                 105                 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
        115                 120                 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
    130                 135                 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145                 150                 155                 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
            180                 185                 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
        195                 200                 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Gly
    210                 215                 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
225                 230                 235                 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
                245                 250                 255
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
            260                 265                 270
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
        275                 280                 285
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
    290                 295                 300
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
305                 310                 315                 320
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
                325                 330                 335
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
            340                 345                 350
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
        355                 360                 365
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
    370                 375                 380
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
385                 390                 395                 400
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
                405                 410                 415
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
            420                 425                 430
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
        435                 440                 445
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    450                 455                 460
<210> 18
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白
<400> 18
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1               5                   10                  15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
            20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
        35                  40                  45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
    50                  55                  60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
                85                  90                  95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
            100                 105                 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
        115                 120                 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
    130                 135                 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145                 150                 155                 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
            180                 185                 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
        195                 200                 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Gly
    210                 215                 220
Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly
225                 230                 235                 240
Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
                245                 250                 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
            260                 265                 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
        275                 280                 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
    290                 295                 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305                 310                 315                 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
                325                 330                 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
            340                 345                 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
        355                 360                 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
    370                 375                 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385                 390                 395                 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
                405                 410                 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
            420                 425                 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
        435                 440                 445
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    450                 455                 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465                 470
<210> 19
<211> 507
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白
<400> 19
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1               5                   10                  15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
            20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
        35                  40                  45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
    50                  55                  60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
                85                  90                  95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
            100                 105                 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
        115                 120                 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
    130                 135                 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145                 150                 155                 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
            180                 185                 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
        195                 200                 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn
    210                 215                 220
Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys
225                 230                 235                 240
Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp
                245                 250                 255
Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys
            260                 265                 270
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
        275                 280                 285
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
    290                 295                 300
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
305                 310                 315                 320
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
                325                 330                 335
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
            340                 345                 350
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
        355                 360                 365
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
    370                 375                 380
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
385                 390                 395                 400
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
                405                 410                 415
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
            420                 425                 430
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
        435                 440                 445
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
    450                 455                 460
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
465                 470                 475                 480
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
                485                 490                 495
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
            500                 505
<210> 20
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白
<400> 20
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1               5                   10                  15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
            20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
        35                  40                  45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
    50                  55                  60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
                85                  90                  95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
            100                 105                 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
        115                 120                 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
    130                 135                 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145                 150                 155                 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
            180                 185                 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
        195                 200                 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
    210                 215                 220
Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
                245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
            260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
        275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
    290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
                325                 330                 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
            340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
        355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
    370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
                405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
            420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
        435                 440                 445
Ser Pro Gly
    450
<210> 21
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc融合蛋白
<400> 21
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1               5                   10                  15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
            20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
        35                  40                  45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
    50                  55                  60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
                85                  90                  95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
            100                 105                 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
        115                 120                 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
    130                 135                 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145                 150                 155                 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
            180                 185                 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
        195                 200                 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
    210                 215                 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225                 230                 235                 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
                245                 250                 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
            260                 265                 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
        275                 280                 285
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
    290                 295                 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305                 310                 315                 320
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
                325                 330                 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
            340                 345                 350
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
        355                 360                 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
    370                 375                 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385                 390                 395                 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
                405                 410                 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
            420                 425                 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        435                 440
<210> 22
<211> 233
<212> PRT
<213> 小鼠IgG2a Fc片段
<400> 22
Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro
1               5                   10                  15
Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
            20                  25                  30
Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val
        35                  40                  45
Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe
    50                  55                  60
Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu
65                  70                  75                  80
Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
                85                  90                  95
Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
            100                 105                 110
Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser
        115                 120                 125
Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met
    130                 135                 140
Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro
145                 150                 155                 160
Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn
                165                 170                 175
Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met
            180                 185                 190
Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser
        195                 200                 205
Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr
    210                 215                 220
Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
225                 230
<210> 23
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成SARS-CoV-2-RBD-小鼠-IgG2a-Fc融合蛋白
<400> 23
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1               5                   10                  15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
            20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
        35                  40                  45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
    50                  55                  60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
                85                  90                  95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
            100                 105                 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
        115                 120                 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
    130                 135                 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145                 150                 155                 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
                165                 170                 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
            180                 185                 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
        195                 200                 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Gly
    210                 215                 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro
225                 230                 235                 240
Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser
                245                 250                 255
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu
            260                 265                 270
Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro
        275                 280                 285
Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala
    290                 295                 300
Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val
305                 310                 315                 320
Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe
                325                 330                 335
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr
            340                 345                 350
Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu
        355                 360                 365
Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys
    370                 375                 380
Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn
385                 390                 395                 400
Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp
                405                 410                 415
Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys
            420                 425                 430
Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly
        435                 440                 445
Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
    450                 455                 460
<210> 24
<211> 254
<212> PRT
<213> SARS-Cov-2 RBD英国变体(N501Y)
<400> 24
Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr
1               5                   10                  15
Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys
            20                  25                  30
Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe
        35                  40                  45
Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr
    50                  55                  60
Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln
65                  70                  75                  80
Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu
                85                  90                  95
Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu
            100                 105                 110
Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg
        115                 120                 125
Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr
    130                 135                 140
Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr
145                 150                 155                 160
Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr
                165                 170                 175
Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro
            180                 185                 190
Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys
        195                 200                 205
Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr
    210                 215                 220
Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile
225                 230                 235                 240
Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu
                245                 250
<210> 25
<211> 254
<212> PRT
<213> SARS-Cov-2 RBD南非变体(E484K)
<400> 25
Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr
1               5                   10                  15
Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys
            20                  25                  30
Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe
        35                  40                  45
Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr
    50                  55                  60
Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln
65                  70                  75                  80
Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu
                85                  90                  95
Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu
            100                 105                 110
Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg
        115                 120                 125
Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr
    130                 135                 140
Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr
145                 150                 155                 160
Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr
                165                 170                 175
Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro
            180                 185                 190
Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys
        195                 200                 205
Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr
    210                 215                 220
Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile
225                 230                 235                 240
Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu
                245                 250
<210> 26
<211> 224
<212> PRT
<213> 犬天然IgGB
<400> 26
Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val
1               5                   10                  15
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr
            20                  25                  30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu
        35                  40                  45
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys
    50                  55                  60
Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser
65                  70                  75                  80
Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr
                85                  90                  95
Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile
            100                 105                 110
Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro
        115                 120                 125
Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu
    130                 135                 140
Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn
145                 150                 155                 160
Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu
                165                 170                 175
Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys
            180                 185                 190
Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu
        195                 200                 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
    210                 215                 220
<210> 27
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成接头
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Gly Gly
            20
<210> 28
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成胰岛素类似物 (B-C-A)
<400> 28
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1               5                   10                  15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
        35                  40                  45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys
    50                  55
<210> 29
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成犬胰岛素-Fc融合蛋白
<400> 29
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1               5                   10                  15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
        35                  40                  45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
    50                  55                  60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys
65                  70                  75                  80
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
                85                  90                  95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
            100                 105                 110
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
        115                 120                 125
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
    130                 135                 140
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145                 150                 155                 160
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
                165                 170                 175
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
            180                 185                 190
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
        195                 200                 205
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
    210                 215                 220
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
225                 230                 235                 240
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
                245                 250                 255
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
            260                 265                 270
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
        275                 280                 285
His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
    290                 295                 300
<210> 30
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成Fc片段
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> Xaa = S, Q, D, K, A
<400> 30
Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val
1               5                   10                  15
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr
            20                  25                  30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu
        35                  40                  45
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys
    50                  55                  60
Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Xaa Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser
65                  70                  75                  80
Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr
                85                  90                  95
Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile
            100                 105                 110
Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro
        115                 120                 125
Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu
    130                 135                 140
Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn
145                 150                 155                 160
Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu
                165                 170                 175
Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys
            180                 185                 190
Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu
        195                 200                 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
    210                 215                 220
<210> 31
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成胰岛素类似物 (B-C-A)
<400> 31
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1               5                   10                  15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
        35                  40                  45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys
    50                  55
<210> 32
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成犬胰岛素-Fc融合蛋白
<400> 32
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala
1               5                   10                  15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys
        35                  40                  45
Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly
    50                  55                  60
Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys
65                  70                  75                  80
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
                85                  90                  95
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu
            100                 105                 110
Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln
        115                 120                 125
Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln
    130                 135                 140
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
145                 150                 155                 160
Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys
                165                 170                 175
Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
            180                 185                 190
Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser
        195                 200                 205
Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys
    210                 215                 220
Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
225                 230                 235                 240
Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu
                245                 250                 255
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg
            260                 265                 270
Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu
        275                 280                 285
His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
    290                 295                 300
<210> 33
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成Fc片段
<400> 33
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1               5                   10                  15
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
            20                  25                  30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
        35                  40                  45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
    50                  55                  60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65                  70                  75                  80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
                85                  90                  95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
        115                 120                 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
    130                 135                 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145                 150                 155                 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
                165                 170                 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
            180                 185                 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
        195                 200                 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
    210                 215                 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225                 230

Claims (46)

1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含病毒受体结合结构域和Fc片段，其中所述病毒受体结合结构域和所述Fc片段通过任选的接头诸如肽接头连接，其中所述病毒受体结合结构域包含以下序列或其功能片段：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS(SEQ ID NO:13)；或
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF(SEQ ID NO:14)；或
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVK(SEQ IDNO:15)。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述Fc片段包含以下序列或其功能片段：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:6)；或
PKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:33)。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述接头，如果存在，包含以下序列：GGGSGGGS(SEQ ID NO:5)或GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(SEQ ID NO:27)。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含以下序列或其功能片段：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFGGGSGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:16)；或
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:18)；或
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSGGGSGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:19)；或
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5.根据权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白是同型二聚体。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，其中所述Fc片段被糖基化。
7.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含根据权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，进一步包含佐剂。
9.根据权利要求8所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂是MontanideTMISA-720。
10.根据权利要求8或9所述的免疫原性组合物，其中将所述融合蛋白与所述佐剂一起乳化。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物是可注射制剂。
12.根据权利要求7-11中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物适用于皮下施用。
13.根据权利要求7-12中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物适用于预防性疫苗接种。
14.根据权利要求7-12中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物适用于治疗性疫苗接种。
15.根据权利要求7-14中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述融合蛋白分散在所述载体中。
16.一种用于增加受试者中针对抗原剂的抗体产生的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求7-14中任一项所述的免疫原性组合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中在施用所述融合蛋白或免疫原性组合物之前，所述受试者具有针对所述抗原剂的可测量的抗体效价。
18.根据权利要求16所述的方法，其中在施用所述融合蛋白或免疫原性组合物之前，所述受试者是抗体空白的。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白或免疫原性组合物通过注射施用。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述融合蛋白或免疫原性组合物经皮下或肌内施用。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白或免疫原性组合物作为单位剂型提供。
22.根据权利要求16-20中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白或免疫原性组合物与佐剂共同施用。
23.根据权利要求16-20中任一项所述的方法，进一步包括制备所述融合蛋白或免疫原性组合物用于施用，其中所述制备包括在所述施用之前将所述融合蛋白或免疫原性组合物与佐剂预混合。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述预混合包括乳化所述佐剂和所述融合蛋白以产生乳剂，并且向所述受试者施用所述乳剂。
25.一种在受试者中诱导针对病毒感染，优选SARS-CoV-2病毒，更优选COVID-19的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求7-14中任一项所述的免疫原性组合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中在施用所述融合蛋白或免疫原性组合物之前，所述受试者具有针对所述病毒感染的可测量的抗体效价。
27.根据权利要求25所述的方法，其中在施用所述融合蛋白或免疫原性组合物之前，所述受试者是抗体空白的。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白或免疫原性组合物通过注射施用。
29.根据权利要求29所述的方法，其中所述融合蛋白或免疫原性组合物经皮下或肌内施用。
30.根据权利要求25-29中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白或免疫原性组合物作为单位剂型提供。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白或免疫原性组合物与佐剂共同施用。
32.根据权利要求25-31中任一项所述的方法，进一步包括制备所述融合蛋白或免疫原性组合物用于施用，其中所述制备包括在所述施用之前将所述融合蛋白或免疫原性组合物与佐剂预混合。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述预混合包括乳化所述佐剂和所述融合蛋白，并且向所述受试者施用所述乳剂。
34.一种产生根据权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白的方法，所述方法包括将编码所述融合蛋白的核酸瞬时转染到HEK293或CHO-SE细胞中，其中所述转染的HEK293或CHO-SE细胞表达所述融合蛋白，或将编码所述融合蛋白的核酸稳定转染到CHO细胞中，其中所述重组CHO细胞表达所述融合蛋白。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述融合蛋白由所述细胞分泌到细胞培养基中，进一步包括从所述培养基中纯化或分离所述融合蛋白，其中在任何前述表达系统中纯化的或分离的融合蛋白的产量大于20mg/L。
36.一种经工程化以表达根据权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白的细胞。
37.根据权利要求36所述的细胞，其中所述细胞用编码所述融合蛋白的核酸转染。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的细胞，其中所述细胞是HEK293细胞或CHO细胞。
39.一种编码根据权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白的cDNA。
40.一种包含根据权利要求39所述的cDNA的表达载体。
41.根据权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求7-14中任一项所述的免疫原性组合物用于治疗和/或作为药物的用途。
42.根据权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求7-14中任一项所述的免疫原性组合物用于增加受试者的抗体产生的用途。
43.根据权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求7-14中任一项所述的免疫原性组合物用于治疗和/或预防病毒感染，优选SARS-CoV-2病毒，更优选COVID-19的用途。
44.根据权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求7-14中任一项所述的免疫原性组合物用于根据权利要求34作为预防、治疗和/或加强疫苗的用途。
45.一种融合蛋白或其药物组合物用于治疗和/或预防病毒感染，优选SARS-CoV-2病毒，更优选COVID-19的用途，所述融合蛋白选自由以下组成的组：SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。
46.根据权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求7-14中任一项所述的免疫原性组合物在制备用于治疗和/或预防病毒感染的药物中的用途。
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