JP2023522597A - Ｃｏｖｉｄ－１９に対する抗原特異的免疫療法、融合タンパク質、およびその使用方法 - Google Patents

Ｃｏｖｉｄ－１９に対する抗原特異的免疫療法、融合タンパク質、およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、２０１９ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＣＯＶＩＤ－１９）に関連した使用のための、ヒトＦｃ断片に結合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ）断片またはそのアナログを含む、組み換え作製された融合タンパク質を提供する。実施形態には、ＣＯＶＩＤ－１９から回復した患者にブースターワクチンとして当該融合タンパク質を投与すること、抗体未感作患者に当該融合タンパク質を投与して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する抗体を産生させて当該患者を回復期血漿ドナーにすること、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染し、およびＣＯＶＩＤ－１９に感染した患者に投与して、感染範囲を限定し、疾患を改善させること、および予防用ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンとして投与することを含む。例示的なＦｃ融合タンパク質、および例示的なＦｃ融合タンパク質の医薬製剤が提供され、それに加えて使用方法と作製方法も提供される。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／００８，４９７号明細書、２０２０年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／００８，５０３号明細書、２０２０年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／００８，５０９号明細書、２０２０年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／００８，５１５号明細書、２０２０年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／０４１，５７４号明細書、２０２０年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／０４１，５７９号明細書、２０２０年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／０４１，５８２号明細書、２０２０年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／０４１，５８４号明細書、２０２０年７月７日に出願された米国仮特許出願第６３／０４８，９３９号明細書、２０２０年８月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０６８，７７５号明細書、２０２０年８月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０６８，８０５号明細書、２０２０年８月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０６８，８４３号明細書、２０２０年８月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０６８，８９４号明細書、および２０２０年８月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０６８，９１１号明細書の優先権の利益を主張するものである。それら出願はすべて「ＣＯＶＩＤ－１９に対する抗原特異的免疫療法、融合タンパク質、およびその使用方法（ＡＮＴＩＧＥＮ ＳＰＥＣＩＦＩＣ ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ ＦＯＲ ＣＯＶＩＤ－１９ ＦＵＳＩＯＮ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ）」という発明の名称であり、各々がその全体で参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、コンピューター読み取り可能なフォーマット（ＣＲＦ）の配列表を含む。当該配列表は２０２１年４月９日に作成され、「ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿０４４」というタイトルのＡＳＣＩＩフォーマットのテキストファイルであり、サイズは８３ＫＢである。ＣＲＦの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本技術は、ヒトＦｃ断片に結合された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ）を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質の短縮型またはそのアナログを含む融合タンパク質、および２０１９ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＣＯＶＩＤ－１９）に関連したその使用に関するものである。
以下の背景技術に関する記載は、本発明技術の理解の補助として単に提供されているにすぎず、本発明技術に対する先行技術を記述する、または先行技術を構成すると認識されるものではない。
Ｆｃ融合タンパク質
Ｆｃ融合タンパク質は、種特異的なイムノグロビンＦｃドメインから構成され、当該Ｆｃドメインは、例えば治療剤としての可能性があるタンパク質またはペプチドなどの別のペプチドに結合される。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」および「Ｆｃ融合タンパク質」という用語は、例えば異なる源（例えば異なるタンパク質、ポリペプチド、細胞など）に由来する複数の部分を含むタンパク質を指し、それら複数の部分はペプチド結合を介して共有結合される。Ｆｃ融合タンパク質は、好ましくは、（ｉ）各部分をコードする遺伝子を単一核酸分子へと連結することにより、および（ｉｉ）当該核酸分子がコードするタンパク質を宿主細胞（例えば、ＨＥＫ細胞またはＣＨＯ細胞）で発現させることにより、共有結合される。治療用タンパク質とＦｃ断片を別々に合成して、その後、化学的にコンジュゲートする方法よりも、すべて組み換え合成による方法が好ましい。化学的コンジュゲートの工程、そしてそれに続く精製プロセスがあると、製造上の煩雑さが増し生産歩留まりが低下しコストが増大する。
「Ｆｃ断片」、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」、または「Ｆｃポリペプチド」という用語は、本明細書において、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ断片、Ｆｃ領域、Ｆｃドメイン、またはＦｃポリペプチドは、天然配列のＦｃ領域であってもよく、またはバリアント／変異型のＦｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、一般的に、重鎖のヒンジ領域の一部またはすべて、重鎖のＣＨ２領域、および重鎖のＣＨ３領域を含む。Ｆｃ断片（例えば、イヌ科のＦｃ断片またはヒトのＦｃ断片）のヒンジ領域は、重鎖のＣＨ１ドメインを重鎖のＣＨ２ドメインに連結するアミノ酸配列を含み、および１つ以上のシステインを含んで、１つ以上の重鎖間ジスルフィド結合を形成する。それによって、同一であるが、別個の２つのＦｃ融合タンパク質単量体からＦｃ融合タンパク質のホモ二量体が形成される。ヒンジ領域は、天然のアミノ酸配列のすべて、または一部を含んでもよく、または非天然のアミノ酸配列を含んでもよい。
Ｆｃドメインが存在することによって、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用が発生し、それに加えて分子サイズが大きくなることでＦｃ融合タンパク質の腎クリアランスも遅くなり、血漿半減期が増加する。その結果、当該分子のインビボリサイクルが発生して、結合されたペプチドの活性が長期化し、Ｆｃ融合タンパク質分子の可溶性と安定性が改善される。また、Ｆｃドメインによって、Ｆｃ融合タンパク質と、免疫細胞上のＦｃ受容体が相互作用することが可能になる。例として、治療用タンパク質または治療用ペプチドは、リンカーを介してイムノグロビンＦｃドメインに結合される。治療用タンパク質または治療用ペプチド、およびリンカーは、抗体の可変領域を効率的に置き換えながら、Ｆｃ領域はそのままの状態で維持する。
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）とは、抗体のＦｃ断片またはＦｃ領域に結合する受容体を指す。ある例では、ＦｃＲは、イヌ科ＦｃＲまたはヒトＦｃＲの天然配列であり、そしてＦｃＲは、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片またはＦｃ領域に結合するＦｃＲ（ガンマ受容体）であり、限定されないが、Ｆｃ（ガンマ）受容体Ｉ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩａ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩｂ、およびＦｃ（ガンマ）受容体ＩＩＩサブクラスの受容体が挙げられ、これら受容体のアレルバリアントや、代替的スプライシング型も含まれる。「ＦｃＲ」には、胎児性受容体のＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎによって、母のＩｇＧ分子が胎児へと移行する。またＦｃＲｎによって、抗体およびＦｃ融合タンパク質のインビボ排泄半減期が延長される。ある例では、インビトロでヒト起源のＦｃＲが使用され（例えば、アッセイで使用され）、任意の哺乳動物起源のＦｃ断片を含むＦｃ融合タンパク質の結合が測定されて、ＦｃＲの結合性能が評価される。当業者であれば、１つの種に由来する哺乳動物ＦｃＲ（例えば、ヒト起源のＦｃＲ）が、第二の種に由来するＦｃ断片（例えば、イヌ科起源のＦｃＲ）にインビトロで結合する能力を有する場合があることを理解するであろう。
本明細書において、融合タンパク質が記載され、各融合タンパク質は、それぞれのウイルス受容体結合ドメインとＦｃ断片を含み、この場合において当該ウイルス受容体結合ドメインとＦｃ断片は、例えばペプチドリンカーなどの任意選択的なリンカーによって連結される。１つ以上の実施形態では、ウイルス受容体結合ドメインは、配列番号１を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質のＲＢＤ断片、またはその機能的断片、アナログもしくはバリアント／変異型を含む。１つ以上の実施形態では、ウイルス受容体結合ドメインは、配列番号２または配列番号８を含むＳＰ／ＲＢＤ断片もしくはＲＢＤ断片、またはその機能的断片、アナログもしくはバリアント／変異型を含む。１つ以上の実施形態では、ウイルス受容体結合ドメインは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５の配列またはその機能的断片を含む。１つ以上の実施形態では、Ｆｃ断片は、配列番号６、配列番号７もしくは配列番号３３の配列または機能的断片を含む。１つ以上の実施形態では、リンカーは、もし存在する場合には、以下の配列を含む：配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号２７。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、もしくは配列番号２１、またはそれらの機能的断片の配列を含む（それらから本質的になる、またはそれらからなる）。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質は、ホモ二量体である。１つ以上の実施形態では、Ｆｃ断片は、グリコシル化される。
本明細書において、本明細書に記載されるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせによる融合タンパク質と、薬学的に許容可能な担体とを含む、またはそれらからなる免疫原性組成物も記載される。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質は、担体中に分散される。１つ以上の実施形態では、組成物は、アジュバントをさらに含む。１つ以上の実施形態では、アジュバントは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ－７２０である。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質は、アジュバントと乳化される。１つ以上の実施形態では、乳化物質は、投与前に現地で調製される。１つ以上の実施形態では、調製された乳化物質は、冷蔵（４℃）または室温で少なくとも８時間、好ましくは最大２４時間安定である。１つ以上の実施形態では、組成物は、注射製剤である。１つ以上の実施形態では、組成物は、皮下投与用に適合される。１つ以上の実施形態では、組成物は、予防ワクチン用に適合される。１つ以上の実施形態では、組成物は、治療ワクチン用に適合される。
本明細書において、対象において、抗原に対する抗体産生を増加させるための様々な方法も提供される。方法は概して、本明細書に記載されるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせによる融合タンパク質または免疫原性組成物の治療有効量を対象に投与することを含む。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質または免疫原性組成物の投与前、対象は、抗原に対して、測定可能な抗体価を有する。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質または免疫原性組成物の投与前、対象は、抗体未感作である。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質または免疫原性組成物は、注射を介して投与される。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質または免疫原性組成物は、皮下投与され、または筋肉内投与される。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質または免疫原性組成物は、単位剤形として提供される。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質または免疫原性組成物は、アジュバントと同時投与される。１つ以上の実施形態では、方法は、投与用に前記融合タンパク質または免疫原性組成物を調製することをさらに含み、当該調製は、投与前に、融合タンパク質または免疫原性組成物とアジュバントを予め混合することを含む。１つ以上の実施形態では、予め混合することは、アジュバントと融合タンパク質を乳化して、エマルションを得ること、および当該エマルションを対象に投与することを含む。１つ以上の実施形態では、調製された乳化物質は、調整後、冷蔵（４℃）または室温で少なくとも８時間、好ましくは最大２４時間安定である。
本明細書において、対象において、ウイルス感染、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染、より好ましくはＣＯＶＩＤ－１９感染に対する免疫反応を誘導する方法も提供される。方法は概して、本明細書に記載されるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせによる融合タンパク質または免疫原性組成物の治療有効量を対象に投与することを含む。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質または免疫原性組成物の投与前、対象は、ウイルス感染に対して、測定可能な抗体価を有する。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質または免疫原性組成物の投与前、対象は、抗体未感作である。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質または免疫原性組成物は、注射を介して投与される。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質または免疫原性組成物は、皮下投与され、または筋肉内投与される。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質または免疫原性組成物は、単位剤形として提供される。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質または免疫原性組成物は、アジュバントと同時投与される。１つ以上の実施形態では、方法は、投与用に前記融合タンパク質または免疫原性組成物を調製することをさらに含み、当該調製は、投与前に、融合タンパク質または免疫原性組成物とアジュバントを予め混合することを含む。１つ以上の実施形態では、予め混合することは、アジュバントと融合タンパク質を乳化して、エマルションを得ること、および当該エマルションを対象に投与することを含む。１つ以上の実施形態では、調製された乳化物質は、調整後、冷蔵（４℃）または室温で少なくとも８時間、好ましくは最大２４時間安定である。
本明細書において、本明細書に記載されるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせによる融合タンパク質の作製方法も記載される。当該方法は、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ－ＳＥ細胞に、融合タンパク質をコードする核酸を一過性にトランスフェクトすることであって、当該トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ－Ｓ細胞は、当該融合タンパク質を発現すること、またはＣＨＯ細胞に、当該融合タンパク質をコードする核酸を安定的にトランスフェクトすることであって、当該組み換えＣＨＯ細胞は、当該融合タンパク質を発現することを含む。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質は細胞によって細胞培養培地内に分泌され、当該培地から融合タンパク質を精製する、または単離することをさらに含む。精製された融合タンパク質または単離された融合タンパク質の収量は、前述の発現系のいずれかにおいて、２０ｍｇ／Ｌより多い。
本明細書において、本明細書に記載されるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせによる融合タンパク質を発現するよう操作された細胞も記載される。１つ以上の実施形態では、細胞は融合タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされる。１つ以上の実施形態では、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である。
本明細書において、本明細書に記載されるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせによる融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子も記載される。本開示は、本明細書に記載されるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせによる融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターおよび／またはＤＮＡ発現構築物にも関する。
本明細書において、本明細書に記載されるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせによる融合タンパク質または免疫原性組成物は、治療に使用されてもよく、および／または医薬品として使用されてもよい。
本明細書において、本明細書に記載されるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせによる融合タンパク質または免疫原性組成物は、対象において抗体産生を増加させるために使用されてもよい。
本明細書において、本明細書に記載されるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせによる融合タンパク質または免疫原性組成物は、ウイルス感染、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染、より好ましくはＣＯＶＩＤ－１９感染の治療および／または予防に使用されてもよい。
本明細書において、本明細書に記載されるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせによる融合タンパク質または免疫原性組成物は、予防用ワクチン、治療用ワクチン、および／またはブースターワクチンとして使用されてもよい。
特定の実施形態は、ウイルス感染、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染、より好ましくはＣＯＶＩＤ－１９感染の治療および／または予防に使用するための、以下からなる群から選択される融合タンパク質またはそれらの医薬組成物に関する：配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１。
本明細書において、本明細書に記載されるいずれかの実施形態または実施形態の組み合わせによる融合タンパク質または免疫原性組成物は、ウイルス感染の治療／および／または予防のための医薬品の製造に使用されてもよい。
例えば、配列番号１９は、ＩＳＡ ７２０アジュバントと乳化され、免疫原性と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質（ＳＰ）に結合し、中和する抗体（Ａｂ）の産生を誘導する能力についてＢＡＬＢ／ｃマウスで最初に評価された。ＳＰの受容体結合ドメイン（ＳＰ／ＲＢＤ）に結合すると、これらワクチンに誘導されたＡｂは、宿主標的タンパク質であるＡＣＥ２にウイルスが結合することを防ぐ。ＡＣＥ２は、肺の内皮細胞、血管およびニューロンを含む様々なタイプの細胞上に発現される。アジュバントのＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０中で、１μｇ～１００μｇの配列番号１９を単回注射した後でさえ、マウス、ＮＨＰ、およびウサギにおいて相当量の中和Ａｂが誘導された。当該中和Ａｂは、１）組み換えＳＰ／ＲＢＤに結合した、２）組み換えＡＣＥ２が、組み換えＳＰ／ＲＢＤに結合することを阻害した、および３）ＡＣＥ２を自然発現するＶＥＲＯ－Ｅ６生細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが感染することを防いだ。注目すべきは、上記の動物モデルのそれぞれで配列番号１９ワクチンが中和Ａｂを誘導するという能力である。この能力は大抵、回復期のＣＯＶＩＤ－１９対象から得られたヒト血清の中和能力と同等か、または上回っていた。このことから、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバント中での配列番号１９は、ヒトにおいても充分な防御を誘導するはずであるという期待が生じる。本明細書に記載されるアッセイおよび動物モデルを使用して、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバント中での配列番号１９の最適な用量レベルは３０μｇ～１００μｇの範囲であったこと、皮下（ｓ．ｃ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）のいずれかでの２回投与で最大の免疫原性反応が誘導されたこと、そしてＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０中での１００μｇの配列番号１９を１４日間隔で３回投与しても、ウサギでのＧＬＰ毒性試験で毒性または重篤な有害事象は示されなかったことが実証された。予測されたように、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントによって、軽度で一過性の注射部位反応が観察された。
図１は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の概略図を示す。 図２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の概略図を示す。 図３は、配列番号２９および配列番号３２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ（ガンマ）受容体Ｉ結合を示す。 図４は、化学的に誘導された糖尿病の６匹のビーグル犬について、一連の配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の８回投与で、ＲＨＩに対する抗インスリン抗体（ＡＩＡ）の力価は、平均して２００倍希釈を超えていたことを示す。 図５は、化学的に誘導された糖尿病の６匹のビーグル犬について、一連の配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の８回の週１回投与でのＲＨＩに対する抗インスリン抗体（ＡＩＡ）の力価における試験０日目からの変化割合パーセントを示す。 図６は、実施例５２のプロトコル１またはプロトコル２に従い、配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質で糖尿病の治療がされた８匹のクライアント犬の正規化されたＡＩＡ力価を示す。 図７は、治療が中断された、配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質で糖尿病の治療がされた１匹の犬の正規化されたＡＩＡ力価を示す。 図８は、ＨＥＫ一過性細胞プールまたはＣＨＯ安定的細胞プールのいずれかで作製された配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質で糖尿病の治療がされた後にＡＩＡを示した犬の数に関するグラフを示す。 図９は、配列番号３２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質で糖尿病の治療がされた８匹の犬の正規化されたＡＩＡ力価を示す。 図１０は、配列番号２９または配列番号３２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質で糖尿病の治療がされた後にＡＩＡを示した犬の数に関するグラフを示す。 図１１は、Ｆｃ（ガンマ）受容体を介したＦｃ融合タンパク質のＡＰＣプロセスを示す。 図１２は、Ｂ細胞活性化の促進と、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ産生を示す。 図１３は、配列番号２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伸長型ＳＰ／ＲＢＤ）および配列番号９（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面糖タンパク質の新規短縮型）の並列配列比較を示す。 図１４は、配列番号２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伸長型ＳＰ／ＲＢＤ）および配列番号１０（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面糖タンパク質の新規短縮型）の並列配列比較を示す。 図１５は、配列番号２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伸長型ＳＰ／ＲＢＤ）および配列番号１４（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面糖タンパク質の新規短縮型）の並列配列比較を示す。 図１６は、配列番号２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伸長型ＳＰ／ＲＢＤ）および配列番号１５（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面糖タンパク質の新規短縮型）の並列配列比較を示す。 図１７は、配列番号２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伸長型ＳＰ／ＲＢＤ）および配列番号１３（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面糖タンパク質の新規短縮型）の並列配列比較を示す。 図１８は、ワクチンアジュバントの一般的な作用機序を示す。 図１９は、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質へのヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩの結合に関するＥＣ５０を示す。 図２０は、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質へのヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩＩａの結合に関するＥＣ５０を示す。 図２１は、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質へのヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩＩｂの結合に関するＥＣ５０を示す。 図２２は、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質へのヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩＩＩの結合に関するＥＣ５０を示す。 図２３は、配列番号１９およびヒトＩｇＧのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質へのヒトＡＣＥ２の結合に関するＥＣ５０を示す。 図２４は、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質へのヒトＦｃＲｎ受容体の結合に関するＥＣ５０を示す。 図２５は、様々な用量レベルでの配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の単回投与から２１日後の６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を示す。 図２６は、様々な用量レベルで配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を０日目および２１日目に注射した後、３５日目での６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を示す。 図２７は、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を０日目、２１日目、および４２日目に注射した後、１μｇ、３μｇ、１０μｇ、３０μｇ、および１００μｇの用量レベルに対する動態反応を示す。 図２８は、様々な用量レベルで配列番号２のＳＰ／ＲＢＤまたは配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をアジュバントを伴わずに６～８週齢のマウスに投与した後、誘導された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を示す。力価は、０日目で１回投与された後、１４日目および２１日目に測定された。 図２９は、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を１０μｇの用量レベルで含有する様々なアジュバント化製剤を０日目で１回投与してから２１日目での、６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を示す。 図３０は、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を１０μｇの用量レベルで含有する様々なアジュバント化製剤を０日目および２１日目で注射してから３５日目での、６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を示す。 図３１は、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を１０μｇの用量レベルで含有する様々なアジュバント化製剤を０日目、２１日目および４２日目で注射してから５６日目での、６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を示す。 図３２は、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を１０μｇの用量レベルで含有する様々なアジュバント化製剤を０日目、２１日目および４２日目で注射してから８８日目での、６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を示す。 図３３は、６～８週齢のマウスにおいて、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をアジュバントとともに、およびアジュバントを含まずに０日目で単回注射してから２１日目で算出されたＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）を示し、ヒト回復期血清と比較された。 図３４は、６～８週齢のマウスにおいて、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をアジュバントとともに、およびアジュバントを含まずに０日目および２１日目に注射してから３５日目で算出されたＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）を示し、ヒト回復期血清と比較された。 図３５は、６～８週齢のマウスにおいて、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をアジュバントとともに、およびアジュバントを含まずに０日目、２１日目および４２日目に注射してから５６日目で算出されたＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）を示し、ヒト回復期血清と比較された。 図３６は、６～８週齢のマウスにおいて、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をアジュバントとともに、およびアジュバントを含まずに０日目、２１日目および４２日目に注射してから８８日目で算出されたＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）を示し、ヒト回復期血清と比較された。 図３７は、様々な用量レベルで配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をアジュバントとともに８～１０カ月齢のマウスに投与した後に誘導された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ反応と、ＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）を示し、１回投与された後に２１日目で測定された。 図３８は、様々な用量レベルで配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をアジュバントとともに８～１０カ月齢のマウスに投与した後に誘導された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ反応と、ＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）を示し、０日目および２１日目で注射された後、３５日目に測定された。 図３９は、様々な用量レベルで配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をアジュバントとともに８～１０カ月齢のマウスに投与した後に誘導された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ反応と、ＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）を示し、０日目、２１日目および４２日目で注射された後、５６日目に測定された。 図４０は、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を様々なアジュバントとともに、および伴わずに１μｇまたは１０μｇの用量レベルのいずれかで投与された６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、１回投与された後１４日目での抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を示す。 図４１は、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を様々なアジュバントとともに、および伴わずに１μｇまたは１０μｇの用量レベルのいずれかで投与された６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、０日目および２１日目に注射された後３５日目での抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を示す。 図４２は、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を様々なアジュバントとともに、および伴わずに１μｇまたは１０μｇの用量レベルのいずれかで投与された６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、０日目、２１日目および４２日目に注射された後５６日目での抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を示す。 図４３は、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を様々なアジュバントとともに、および伴わずに１μｇまたは１０μｇの用量レベルのいずれかで投与された６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、１回注射された後１４日目でのＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）を示す。 図４４は、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を様々なアジュバントとともに、および伴わずに１μｇまたは１０μｇの用量レベルのいずれかで投与された６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、０日目および２１日目に注射された後３５日目でのＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）を示し、ヒト回復期血清と比較された。 図４５は、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を様々なアジュバントとともに、および伴わずに１μｇまたは１０μｇの用量レベルのいずれかで投与された６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、０日目、２１日目および４２日目に注射された後５６日目でのＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）を示し、ヒト回復期血清と比較された。 図４６は、１μｇまたは１０μｇの用量レベルのいずれかの配列番号１９を０日目および２１日目に投与された６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに由来する血清サンプルにおいて、２１日目および３５日目に測定された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＰＲＮＴ中和効力の誘導を示す。 図４７は、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をアジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０を含む）とともに、および伴わずに１０μｇの用量レベルで投与された６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、０日目、２１日目および４２日目に注射された後、１４日目、３５日目および５６日目で測定された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ１力価反応を示す。 図４８は、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をアジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０を含む）とともに、および伴わずに１０μｇの用量レベルで投与された６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、０日目、２１日目および４２日目に注射された後、１４日目、３５日目および５６日目で測定された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ２ａ力価反応を示す。 図４９は、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をアジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０を含む）とともに、および伴わずに１０μｇの用量レベルで投与された６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃにおける、０日目、２１日目および４２日目に注射された後、１４日目、３５日目および５６日目で測定された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ２ｂ力価反応を示す。 図５０は、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をアジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０を含む）とともに、および伴わずに１０μｇの用量レベルで投与された６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、０日目、２１日目および４２日目に注射された後、１４日目、３５日目および５６日目で測定された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ３力価反応を示す。 図５１は、１μｇもしくは１０μｇの用量レベルの配列番号１９または配列番号２３（マウスＩｇＧ２ａ－Ｆｃを含む）のいずれかを０日目に単回投与された、または０．５μｇもしくは５μｇの用量レベルの配列番号２のいずれかを０日目に単回投与された、６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、１４日目に測定された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ力価を示す。 図５２は、１μｇもしくは１０μｇの用量レベルの配列番号１９または配列番号２３（マウスＩｇＧ２ａ－Ｆｃを含む）のいずれかを投与された、または０．５μｇもしくは５μｇの用量レベルの配列番号２のいずれかを投与された、６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、０日目および２１日目に注射された後３５日目に測定された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ力価を示す。 図５３は、１μｇもしくは１０μｇの用量レベルの配列番号１９または配列番号２３（マウスＩｇＧ２ａ－Ｆｃを含む）のいずれかを投与された、または０．５μｇもしくは５μｇの用量レベルの配列番号２のいずれかを投与された、６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて誘導されたＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）を示し、１４日目に測定され、ヒト回復期血清と比較された。 図５４は、１μｇもしくは１０μｇの用量レベルの配列番号１９または配列番号２３（マウスＩｇＧ２ａ－Ｆｃを含む）のいずれかを投与された、または０．５μｇもしくは５μｇの用量レベルの配列番号２のいずれかを投与された、６～８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて誘導されたＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）を示し、０日目および２１日目に注射された後３５日目に測定され、ヒト回復期血清と比較された。 図５５は、新たに作成されたエマルションを注射してから１４日目に測定されたものと、４℃および２５℃で１日間ならびに７日間保管されたエマルションを注射してから１４日目に測定されたものとで比較された、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のマウスにおいて誘導されたＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害を示す。 図５６は、ヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩ受容体に対する配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の結合を示し、カニクイザルのＦｃ（ガンマ）ＲＩ受容体と比較された。 図５７は、ヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩＩａ受容体に対する配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の結合を示し、カニクイザルのＦｃ（ガンマ）ＲＩＩａ受容体と比較された。 図５８は、ヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩＩＩ受容体に対する配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の結合を示し、カニクイザルのＦｃ（ガンマ）ＲＩＩＩ受容体と比較された。 図５９は、ヒトＦｃＲｎ受容体に対する配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の結合を示し、カニクイザルのＦｃＲｎ受容体と比較された。 図６０は、３０％／７０％（ｖ／ｖ）でＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントとともに製剤化された配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を１０μｇまたは３０μｇの用量レベルのいずれかで投与されたオスおよびメスのカニクイザルにおける、０日目および２１日目に注射された後、０日目、１４日目、２１日目、３５日目、および４２日目での抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を示す。 図６１は、３０％／７０％（ｖ／ｖ）でＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントとともに製剤化された配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を１０μｇまたは３０μｇの用量レベルのいずれかで投与されたオスおよびメスのカニクイザルにおける、０日目および２１日目に注射された後、２１日目および４２日目で誘導されたＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）を示す。 図６２は、０日目および２１日目に注射された後のＮＨＰ血清サンプルにおける、２１日目および４２日目に測定された配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質により誘導されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス中和効力を示し、配列番号１９は３０％／７０％（ｖ／ｖ）でＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントとともに製剤化され、ヒト回復期血清と比較された。 図６３は、ブースター注射を受けた後の接種ＮＨＰにおける抗ＳＰ／ＲＢＤ反応を示す。 図６４は、配列番号１９で処理されたＮＨＰに由来する免疫血清は、野生型ＳＰ／ＲＢＤ分子と同様か、またはそれ以上に組み換えＮ５０１ＹおよびＥ４８４Ｋ ＳＰ／ＲＢＤ変異体に結合したことを示す。 図６５は、配列番号１９で処理されたマウスに由来する免疫血清は、野生型ＲＢＤ分子と同様か、またはそれ以上に組み換えＮ５０１ＹおよびＥ４８４Ｋ ＲＢＤ変異体に結合したことを示す。 図６６は、配列番号２のＳＰ／ＲＢＤ、ならびに配列番号２４および配列番号２５のＳＰ／ＲＢＤバリアントの並列配列比較を示す。 図６７は、１日目、１５日目および２９日目にＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントとともにビヒクル対照を皮下投与されたニュージーランド白ウサギにおける、１回目投与の前、２回目投与の前、および３回目投与の前、および３回目投与の後に測定された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価を示す。 図６８は、１日目、１５日目および２９日目にアジュバントを伴わずに３０μｇの用量レベルの配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を投与されたニュージーランド白ウサギにおける、１回目投与の前、２回目投与の前、および３回目投与の前、および３回目投与の後に測定された実質的な抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価を示す。 図６９は、１日目、１５日目および２９日目にアジュバントを伴わずに１００μｇの用量レベルの配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を投与されたニュージーランド白ウサギにおける、１回目投与の前、２回目投与の前、および３回目投与の前、および３回目投与の後に測定された実質的な抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価を示す。 図７０は、１日目、１５日目および２９日目にＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントとともに、３０μｇの用量レベルの配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を投与されたニュージーランド白ウサギにおける、１回目投与の前、２回目投与の前、および３回目投与の前、および３回目投与の後に測定された実質的な抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価を示す。 図７１は、１日目、１５日目および２９日目にＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントとともに、１００μｇの用量レベルの配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を投与されたニュージーランド白ウサギにおける、１回目投与の前、２回目投与の前、および３回目投与の前、および３回目投与の後に測定された実質的な抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価を示す。 図７２は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡとともに３０μｇまたは１００μｇの用量レベルの配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を投与されたニュージーランド白ウサギにおいて誘導された、０日目および２１日目に注射された後、１５日目および２９日目で測定されたＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）を示す。 図７３は、２１日目および３５日目に測定された、ニュージーランド白ウサギ血清サンプルにおける、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質によって誘導されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス中和効力を示し、配列番号１９はＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントで乳化され、０日目および２１日目に投与されて、ヒト回復期血清と比較された。 図７４は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントとともに１００μｇの用量レベルの配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を皮下（ＳＣ）注射により投与された、または筋肉内注射（ＩＭ）により投与されたニュージーランド白ウサギにおける、０日目および２１日目の注射後１５日目、２９日目および３６日目に測定された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価を示す。 図７５は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントとともに１００μｇの用量レベルの配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を皮下（ＳＣ）注射により投与された、または筋肉内注射（ＩＭ）により投与されたニュージーランド白ウサギにおいて誘導された、０日目および２１日目の注射後１５日目、２９日目および３６日目に測定されたＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）を示す。 図７６は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む１００μｇの用量レベルの配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の新たに作製されたエマルション、および２～８℃で２４時間保管されたエマルションを皮下（ＳＣ）注射により投与されたニュージーランド白ウサギにおける、０日目および２１日目の注射後１５日目、２９日目および３６日目に測定された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価を示す。 図７７は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む１００μｇの用量レベルの配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の新たに作製されたエマルション、および２～８℃で２４時間保管されたエマルションを筋肉内（ＩＭ）注射により投与されたニュージーランド白ウサギにおける、０日目および２１日目の注射後１５日目、２９日目および３６日目に測定された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価を示す。 図７８は、未感作ＮＨＰと、実施例３６に従い、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０とともに配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質で免疫化されたＮＨＰから採取された鼻腔ぬぐい液１ｍＬ当たりのゲノムまたはサブゲノムのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡコピー数を示す。 図７９は、未感作ＮＨＰと、実施例３６に従い、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０とともに配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質で免疫化されたＮＨＰから採取された気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液１ｍＬ当たりのゲノムまたはサブゲノムのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡコピー数を示す。 図８０は、配列番号８（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ）と、配列番号９、配列番号１０、配列番号１４および配列番号１５（すべて新規変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ）との並行配列比較を示す。 図８１は、９６ウェルのマイクロプレートを示しており、当該プレートは、血清中に既存のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体価を評価する一般的な血清学的アッセイに使用され得る。
発明の具体的説明
新型コロナウイルス感染症２０１９
新型コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが原因で発生する重度で急性の呼吸器系疾患である。最初のＣＯＶＩＤ－１９症例は２０１９年１２月に中国の武漢で報告されており、２０２０年１１月１８日の時点で世界でおよそ５６００万人の症例が報告されている（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと確定された症例、および非確定だが「推定」とされた症例を数値化）。このうち１８５０万件が治療中の症例であり、３６００万件が回復済みの症例、そして１３０万件がＣＯＶＩＤ－１９による死亡症例である（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊ．Ｈ．， ＣＯＶＩＤ－１９ Ｄａｓｈｂｏａｒｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＣＳＳＥ）ａｔ Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ； ｗｗｗ．ｃｏｖｉｄｔｒａｃｋｅｒ．ｃｏｍ／）。２０２０年末ではＰｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンであるＢＮＴ１６２ｂ２のみが、ＣＯＶＩＤ－１９に対する緊急使用に関する世界保健機構（ＷＨＯ）の緊急使用リスト（ＥＵＬ：Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｕｓｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ）手順の下で承認されている。第二のワクチンはＭｏｄｅｒｎａ社（ｍＲＮＡ－１２７３）であり、２０２１年２月末までには、ＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチン緊急使用に関するＷＨＯ ＥＵＬ手順の下で承認されると期待されている。専門家の間では、充分なレベルの免疫が集団で得られない限り、および得られるまでは、社会が通常状態に戻ることはできないと意見が一致している。自然発生的な集団免疫を得るためには、集団の少なくとも７０％が感染していることが必要と推定されるが、これは世界で数百万人が死亡するということであり、倫理的に受け容れられるものではない。
ＡＣＥ２受容体
アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）は宿主細胞の受容体であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染介在を担っている（すなわち、この受容体にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が結合して細胞が感染する）ＡＣＥ２は１型膜貫通型メタロカルボキシペプチダーゼである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析により、ＡＣＥ２は肺上皮細胞、血管内皮細胞および特定の神経細胞に発現していることが示されており、これら細胞がそれぞれ肺、心血管および神経の合併症を含むＣＯＶＩＤ－１９の主要な臨床症状の主要因と考えられている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶとの間の受容体結合ドメインの配列類似性に基づき、研究者らは、ヒト細胞の表面上に発現されたＡＣＥ２をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が使用して、ＡＣＥ２を発現するＨｅＬａ細胞に侵入することができたことを実証した。
ウイルス患者の治療に対する回復期血清
世界中の臨床医と研究者が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２により引き起こされたパンデミックを緩和するための様々な解決法の開発に勤しんでいる。科学者らは、ＣＯＶＩＤ－１９を予防することができるワクチン、そしてこの感染症の重症度と症状を低減するための抗ウイルス治療法の開発を行っている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を治療するためのワクチン、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）または薬剤の開発が続けられている。多くの臨床医は、ヒト回復期血清が、ＣＯＶＩＤ－１９の予防と治療に使用することができる選択肢であると考えていた。
回復期血清とは、あるタイプの受動的抗体療法である。感染し、そして回復した個体の抗ウイルス抗体含有血清がこの治療法によって感受性個体または感染個体に輸液され、疾患を予防する、または疾患の重症度を低減する相当レベルの免疫が当該個体に付与される。この治療法はワクチンとは異なる。ワクチンは個体の中で免疫応答を誘導して、ウイルスに対する自身の抗体を当該個体に産生させるよう作用する。２００２年のＳＡＲＳ－ＣｏＶのアウトブレイク、そして２００９～２０１０年のＨ１Ｎ１インフルエンザのアウトブレイクから得られた経験から、ウイルスに感染し、そして回復した患者の血清（ヒト回復期血清）は、ウイルスを中和する能力を有する抗体を含むこと、そして重度の疾患症状がある個体に対する介入として有用であり、または予防用ワクチンとして有用であることが実証されている。
ヒト回復期血清の使用にはリスクと制限がある。第一に、一人の人間から別の人間への血液物質の移入には、別の感染症の不注意な感染リスク、ならびに他の血清構成要素に対する反応リスクが伴う。回復期血清の使用におけるもう１つの課題は、ウイルス疾患から回復した患者の一部は、高力価の中和血清を有していないということである。別のヒトコロナウイルスである中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）に関する一例では、韓国の３名の患者が回復期血清で治療されたが、レシピエントうち２名だけが血清中に中和抗体があった。ウイルス感染から回復した後に中和血清を有する患者のうち、一部は有望なドナーとなるのに充分な高力価の中和抗体を有していない場合がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶに関するさらなる調査によって、ＳＡＲＳ患者の９９個の回復期血清サンプルのうち、８７個が中和抗体を有し、幾何平均力価は１：６１であったことが判明した。これらの研究や他の様々な研究から、少数の患者が高力価の反応をし、そして中和抗体価は時とともに減少することが示唆されている。多くの企業が、回復患者の血清に頼るかわりに組み換え抗体を作製することによって、この課題を克服することを検討している。しかし製造スケールが不充分であり、数週から数カ月ごとに患者に有効な用量を投与するのに必要な医学的介入、最も可能性が高いのは静脈内注射や点滴であるが、これを行うのは非常に大変なことである。
もっと重大な制限は、ＣＯＶＩＤ－１９エピデミックで提唱されている回復期血清の使用は、高力価のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の作製に依存していることである。高力価のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の作製には、疾患から回復し、回復期血清を提供することができる多数のドナー集団が必要である。誰がすでに疾患にかかり、何らかの免疫を発現しているのかを決定するという課題に直面する。ＣＯＶＩＤ－１９は様々な重症度の症状を呈し、軽症例の多くの個体は、自身が疾患にかかったことすら知らない場合もある。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を測定するために、簡単に入手可能で低コストの試験キットも必要となる。
しかし高力価の中和抗体を有する回復患者を特定することができたとしても、一人の患者の血漿が、数名よりも多くの患者を治療できるという可能性は低い。ゆえに、回復期血清治療の現行のアプローチでは、少数の患者でＣＯＶＩＤ－１９を予防または治療することができるが、この解決法ではこのパンデミックの最中、そしてその後の人類にとってのさらに大きなニーズに対処できるものではない。
現行ワクチンの概略と課題
世界中の臨床医と研究者が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスにより引き起こされたパンデミックを緩和するための様々な解決法の開発に勤しんでいる。そうした解決法には、ＣＯＶＩＤ－１９を予防することができるワクチン、そしてこの感染症の重症度と症状を低減するための抗ウイルス治療法が含まれてる。予測できる未来に対する見込みとしては、自然免疫そしてワクチン誘導性の免疫は長くは続かない可能性が高いこと、したがってコストに優れ、安全なワクチンが、必要に応じて集団内に安定的な免疫を維持するために６カ月ごとの頻度で投与することが必要とされる。ゆえに効果的な予防用ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンにとって重要な設計特性は、以下である：ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを中和するＩｇＧ価と、強い１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞反応を、好ましくは単回投与後に誘導する強力な性能、ｉｉ）特に反応源性（全身的作用）と注射部位（局所作用）により引き起こされる炎症に関する許容可能な安全性と忍容性プロファイル、製造可能性に関する好ましい商品原価（ＣＯＧ）、投与頻度と用量レベルに影響を与えるワクチン効力、ならびに充分な保存可能期間および安定的な試験品の作製および投与手順を含む好適なサプライチェーン経路。
弱毒化された生きた全ウイルスまたは不活化された全ウイルスのワクチンは、古典的戦略の代表である。全ウイルスワクチンの主な利点は、その本来の免疫原性と、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７／８、およびＴＬＲ９を含むトール様受容体（ＴＬＲ）を刺激する能力である。しかし生きたウイルスワクチンはしばしば、その安全性の確認のために詳細な追加試験が必要となる。生きた、または死んだＳＡＲＳコロナウイルスの全ウイルスワクチンで免疫化された後、感染性が増加したという発見を踏まえると、コロナウイルスワクチンにとってこれは特に問題である。Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ社は、自社のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株技術で製造されたＪａｎｓｓｅｎ’ｓ ＡｄＶａｃ（登録商標）アデノウイルスベクターを採用してリードワクチンであるＪＮＪ－７８４３６７３５を作製しており、最近になり第ＩＩＩ相試験を完了して、米国での緊急使用に対して承認を受けている。この技術は、全ウイルスと、意図的に無害化されたアデノウイルスベクターとを置き換えるウイルスベクターを作製する試みであり、当該ベクターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの一部を担持している。しかし、ＪＮＪ－７８４３６７３５を使用したところ、非常に重篤な有害事象（ＳＡＥ）が発生し、臨床試験が停止した。
ＳＡＲＳコロナウイルスワクチンの早期開発における、さらなる２つのハードルは、以下の発見である：１）Ｔｈ２介在性の好酸球浸潤という形での望ましくない免疫増強があること、そして２）ＡＤＥにより誘導されるウイルス感染性の増加があること。ＡＤＥは、全ウイルスワクチンと完全ＳＰワクチンを用いた免疫化の後のチャレンジ感染の後に発生したことが注目されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染におけるＴｈ２介在性の好酸球浸潤と肺病状のリスクはまだ調査中であるが、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）でチャレンジされた、または全ＲＳＶワクチンで免疫化された幼児および動物においてリスクが見出されている。
ＡＤＥは、元々のＳＡＲＳ－ＣｏＶ、デングウイルス、およびジカウイルス感染に対するワクチンを含む、他のウイルスワクチンの有害特性である。この特性において、ワクチンに誘導されたＡｂの濃度やアフィニティは、ウイルス感染の中和には低すぎ、むしろウイルスとの免疫複合体を形成する。当該免疫複合体は、ＡｂのＦｃドメインを介して骨髄細胞表面上のＦｃγ受容体と相互作用する傾向がある。そのようなＡｂはウイルス感染を中和せず、Ｆｃγ介在性のウイルス排除（Ｌｉ）も誘導しないが、Ｆｃγ受容体によるウイルス取り込みを直接増加させることによってウイルス感染を補助するか、または自然免疫とアンタゴナイズする下流経路を活性化することにより細胞内でのウイルス複製をブースターして、ウイルス感染を補助する（Ｓｕｎに概要が記載）。ＡＤＥとＴｈ２免疫増強の両方において、ネコ科のＩｇＧ２ａ ｍＡｂ（おそらくＴｈ２アイソタイプ）は、両方の有害な状態を介在し得ること、一方でＩｇＧ１ ｍＡｂ（強力なエフェクター機能、すなわちＴｈ１アイソタイプを有することが知られている）は、そのような効果を防ぐことが実証されている。
ＡＤＥおよび／またはＴｈ２免疫増強のリスクに加えて、ウイルスベクターワクチンには比較的製造可能スループットが低いという別の問題もあり、ゆえに鶏卵製造または細胞発現系製造による商品原価が高くなる（Ｅｗｅｒ）。
代替法として、ＣＯＶＩＤ－１９の核酸発現ベクターワクチンプラットフォームが、主要なコロナウイルス標的抗原（Ａｇ）であるスパイクタンパク質（ＳＰ）をコードするものがあり、当該抗原は、宿主受容体のＡＣＥ２へのその結合を介して、ウイルスの感染メカニズムを介在する。第ＩＩＩ相試験にまで進行したワクチンの２例は、ＢｉｏＮＴｅｃｈ／ＰｆｉｚｅｒのＢＮＴ１６２ｂ２と、Ｍｏｄｅｒｎａ社のｍＲＮＡ－１２７３により開発された全長ＳＰをコードするｍＲＮＡワクチンである。両ワクチンとも、非常にポジティブな第ＩＩＩ相試験結果が報告されており、症候性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染からの保護において、９０％を超える有効性を有していたことから、最近、米国ＦＤＡにより緊急使用承認（ＥＵＡ）を得ている。ＲＮＡまたはＤＮＡによる免疫化のコンセプトは、１９９３年のマウスにおける有望な実験結果から始まっており、インフルエンザに対する保護免疫が示されたが、ここ数十年、ヒトでは同様の結果となり得なかった。さらに、これら非複製型のＲＮＡ発現ベクターワクチンおよびＤＮＡ発現ベクターワクチンの多くが、目的とする免疫反応の誘導後にも標的ウイルスＡｇを内因的に産生し続け、最終的には当該ウイルスに対する免疫寛容が生じ得るという側面に対する懸念が大きくなり、これが現行のＣＯＶＩＤ－１９ ｍＲＮＡワクチンの現実的なリスクとなる可能性がある。これら核酸ワクチンに関する他の問題は反応の持続性の低さであり、頻繁な投与と、化学合成による面倒な製造性を原因とする好ましくないＣＯＧが必要となる場合がある。さらに、ＲＮＡ固有の不安定さに起因して、製品は凍結状態を維持し、輸送されなければならない。このため世界のほとんどの地域では利用することが非常に困難である。
さらなる代替法としての組み換えサブユニットワクチンは、ＳＰに対する免疫応答を惹起させて、宿主標的タンパク質のＡＣＥ２とのドッキングを阻害することに依存している。そのようなワクチンにはタンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡではなくＳＰのすべて、または一部が含まれており、その後にアジュバントと混合されて、免疫反応が強化される。ＲＮＡやＤＮＡと比べてタンパク質に本来備わる安定性のゆえに、サブユニットワクチンの保管と輸送の要件の厳密性は低い。組み換えサブユニットワクチンを開発している企業としてはＮｏｖａｖａｘ社とＣｌｏｖｅｒ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社が挙げられる。Ｎｏｖａｖａｘ社はＳＰの組み換え発現に基づく免疫原性ウイルス様ナノ粒子であるＮＶＸ－Ｃｏｖ２３７３を開発及び製造しており、サポニン系アジュバントシステムであるＭａｔｒｉｘ－Ｍ（商標）とともに製剤化されている。Ｃｌｏｖｅｒ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社は、自身が特許保有するＴｒｉｍｅｒ－Ｔａｇ（登録商標）技術を使用した三量体化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰからなるサブユニットワクチンを開発している。しかしＡｇを標的とする全長ＳＰは、細胞発現系では発現量が低いことが知られており、ＳＡＲＳワクチンで使用された際には、ＳＰの非中和エピトープに対する抗ＳＰ ＩｇＧ価を誘導することが判明している。そのような抗ＳＰ ＩｇＧは、ウイルスの感染性増加（すなわち、ＡＤＥ）、および肺好酸球により生じる炎症（すなわち、Ｔｈ２介在性免疫増強、以下に検討される）を介在する可能性がある。ＳＡＲＳ ＳＰの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）のみから構成されるサブユニットワクチンが、これら安全性に関する課題を軽減する可能性を秘めている。
Ｔｅｘａｓ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｔ Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅによるコンソーシアムは、ＳＡＲＳ ＳＰの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）のみから構成されるサブユニットワクチンを開発し、試験した。ミョウバンと製剤化された場合、ＲＢＤを基にしたワクチンは、同種ウイルスのチャレンジ時に高レベルの防御的免疫を誘導することができ、それに加えて、ＡＤＥと免疫増強も回避した。ＳＡＲＳとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤは、８０％を超えるアミノ酸類似性を呈しており、同じＡＣＥ２標的に結合するという初期の発見から、サブユニットワクチンとしていずれかタンパク質Ａｇを開発することとなった。実際に、かかるサブユニットワクチンの概念実証には成功しており、ＭＥＲＳ感染およびＳＡＲＳ感染のコロナウイルスＳＰ／ＲＢＤ Ａｇで実証されている。
これら特性の全てではないが一部は最終的にはＣＯＶＩＤ－１９に対する防御的ワクチンとして有望になり得る生ウイルス、核酸および組み換えタンパク質サブユニットを含む現在開発中の１７０を超えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン候補において実装されている。しかし各ワクチン戦略は、製造、安全性および効率に関して固有の利点と課題があり、それらは最適な方法で同時に管理されなければならない。
本開示は、中程度の温度で輸送及び保管することができるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの組み換えサブユニットワクチンを費用効率よく大量に製造することを可能にする新規融合タンパク質を作製する方法および使用する方法に関するものである。本開示は、具体的には、患者にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する抗ウイルス抗体を産生させるのに有効な予防ワクチン、治療ワクチンまたはブースターワクチンにおいて使用するための融合タンパク質の作製方法および使用方法に関するものである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を使用して、患者にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）部分を標的とする内因性抗体を産生させることによって、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療抗体を組み換え作製して患者に注射するよりも費用効率が非常に高くなることが予測される。
例としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を含むブースターワクチンを、抗体増幅治療（ＡＡＴ：ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）としてＣＯＶＩＤ－１９から回復した患者に投与して、患者の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体価を増加させてもよい。それによって、当該患者が提供する血清を回復期血清治療として使用して、より多くの人々を治療することができる。回復患者は、新たに血清提供を行う数週間前に、このＡＡＴを数週間受けてもよく、それによって抽出される血清の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体価は大きく上昇し、各提供血清で治療することができるウイルス感染患者の数も大きく増加し得る。
例としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、個人から抽出された血清中の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の検出に使用されてもよい。血清中の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の存在と濃度を信頼性を持って判定するための重要な試薬としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を使用する試験キットを作製することにより、医師は、どの患者がウイルスに罹り、そして回復したかを判定することが可能となる。これは、患者の症状が少ない場合、または症状が無かった場合に特に重要である。例としては、かかる試験キットは、抽出されたワクチン接種後血清中の、宿主によって産生された抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の存在と濃度を迅速に、および費用効率よく決定することができるため、これを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する新たなワクチン候補の性能を評価することができるであろう。かかる試験キットを広範に配置することで、潜在的な回復期血清ドナーの数が劇的に増加することが予測される。
例としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染し、そしてＣＯＶＩＤ－１９を発症した患者に投与され、当該感染の範囲を限定し、当該疾患を改善する。複数例において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、ＡＣＥ２受容体に結合し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）のさらなる取り込みを妨害しながら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを中和する抗体も産生させ、宿主細胞に曝されるＲＢＤを少なくする。
例としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染していない個体に対し、ＣＯＶＩＤ－１９予防ワクチンとして投与され、その結果、当該個体は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス抗体の自身のプールを産生し、免疫が生成される。
均等および定義
本明細書で使用される場合、冠詞の「ａ」および「ａｎ」は、当該冠詞の文法上の目的語の１つ、または複数、例えば、少なくとも１つを指す。本明細書において、「含む」という用語と併せて使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という文言の使用は、「１つ」を意味する場合があるが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つ、または複数」という意味とも矛盾しない。本明細書で使用される場合、２つ以上の項目のリストにおいて使用される場合の「および／または」という文言は、当該列記される項目のいずれか１つを単独で採用してもよく、または列記される項目の２つ以上の任意の組み合わせを採用してもよいことを意味する。例えば、構成要素のＡ、Ｂおよび／またはＣを含む、または除外するとして組成物が記載される場合、組成物は、Ａを単独で、Ｂを単独で、Ｃを単独で、ＡおよびＢを組み合わせで、ＡおよびＣを組み合わせで、ＢおよびＣを組み合わせで、またはＡ、ＢおよびＣを組み合わせで含んでもよく、または除外してもよい。
本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」とは概して、尺度の性質または精度を考慮して、測定された量に対して許容される程度の誤差を意味する。
本明細書で使用される場合、障害（例えば、本明細書に記載される障害）を治療するのに有効な分子、化合物、コンジュゲートまたは物質の量である、「治療有効量」または「有効量」とは、対象に単回用量で投与されたときに、または複数用量で投与されたときに、対象の治療において、または障害（例えば、本明細書に記載される障害）を有する対象の治癒、緩和、軽減または改善において、かかる治療が無い場合に予測されるものを超えて、有効である、分子、化合物、コンジュゲートまたは物質の量を指す。
本明細書で使用される場合、「アナログ」という用語は、別の化合物またはコンジュゲートと類似した化学構造を有するが、少なくとも１つの特徴において異なっている化合物またはコンジュゲート（例えば、ＲＢＤなどの本明細書に記載される化合物またはコンジュゲート）を指す。
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、患者の免疫システムに、当該抗原に対する抗体を産生させる任意の物質を指す。抗原は、例えば化学物質、細菌、ウイルスまたは花粉などの環境由来の物質であってもよく、または抗原は、身体内で形成されてもよい。抗原の例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである。
本明細書で使用される場合、「抗体」または「抗体分子」という用語は、免疫グロブリン分子（Ｉｇ）または免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と免疫反応するなど、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。本明細書で使用される場合、「抗体ドメイン」という用語は、免疫グロブリンの可変領域または定常領域を指す。当分野において、例えば哺乳動物（例えば、ヒトおよびイヌ）の場合ではＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＧなど、ヒト抗体はいくつかのクラスを含むことが実証されている。哺乳動物のＩｇＧ免疫グロブリンのクラスはさらに、例えばイヌについてはＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣおよびＩｇＧＤ、ヒトについてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４など、異なるアイソタイプへと分類される場合もある。当業者であれば、所与の免疫グロブリンのクラスの免疫グロブリンのアイソタイプは、互いに異なるアミノ酸配列、アミノ酸構造、および構造特性（例えば、Ｆｃ（ガンマ）受容体またはＡＣＥ２受容体に対して異なる結合アフィニティ）を含むと認識している。「特異的に結合する」または「～と免疫反応する」とは、抗体が、所望の抗原の１つ以上の抗原性決定基と反応すること、および抗体が、他のポリペプチドに対しては低いアフィニティを有しており、例えば他のポリペプチドとは反応しないことを意味する。
本明細書で使用される場合、「二量体」という用語は、共有結合的に結合された２つのポリペプチドを含むタンパク質または融合タンパク質を指す。実施形態において、２つの同一のポリペプチドが共有結合的に結合され（例えばジスルフィド結合を介して結合され）、「ホモ二量体」（参考としてのインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の図が図１に、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の図が図２に示されている）を形成する。図１をより詳細に参照すると、インスリンポリペプチド（インスリンＢ鎖アナログが、Ｃ鎖ペプチドを介してインスリンＡ鎖アナログに接続されている）は、天然インスリンから１つ以上のアミノ酸変異を含む場合がある。インスリンペプチドは、リンカーを介してＦｃ断片に接続されている。ジスルフィド結合（実際のジスルフィド結合の合計数は、図１に示される数よりも大きい場合もあり、または小さい場合もある）によって、２つの同一のＦｃ融合タンパク質からホモ二量体が形成される。図２をより詳細に参照すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ断片は、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質の一部を含む場合がある。ＲＢＤ断片は、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質から１つ以上のアミノ酸変異を有する場合がある。ＲＢＤ断片は、任意選択的なリンカーを使用してＦｃ断片に接続されている（例として、ＲＢＤ断片は、リンカーを用いずに共有結合的に直接Ｆｃ断片に結合されている）。ジスルフィド結合によって、２つの同一のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質からホモ二量体が形成される（実際のジスルフィド結合の合計数は、図２に示される数よりも大きい場合もあり、または小さい場合もある）。Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体は、単一の核酸分子によってコードされてもよく、この場合において、当該ホモ二量体は、Ｆｃ融合タンパク質単量体を最初に形成させ、次いで細胞内でさらなる処理が行われる際に２つの同一のＦｃ融合タンパク質単量体をホモ二量体へとアセンブリすることによって、細胞内で組み換え作製される。
本明細書で使用される場合、「多量体」、「多量体の」、または「多量体状態」という用語は、非共有結合的に関連付けられたＦｃ融合タンパク質二量体の形態を指し、当該形態は、Ｆｃ融合タンパク質二量体と平衡状態である場合もあり、またはＦｃ融合タンパク質二量体の恒久的凝集型として振舞う場合もある（例えば、Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の二量体、Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の三量体、Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の四量体、または５つ以上のＦｃ融合タンパク質ホモ二量体を含む高次凝集体）。Ｆｃ融合タンパク質の多量体形態は、融合タンパク質ホモ二量体とは異なる物理的活性、安定性または薬理活性を有する場合がある。
本明細書で使用される場合、ＲＢＤ－Ｆｃ融合タンパク質およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質（これら用語は、相互交換可能に使用され得る）とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＳＰ）受容体結合ドメイン（ＳＰ／ＲＢＤまたはＲＢＤ）に結合したヒト免疫グロブリンＦｃドメイン、またはそのアナログを指し、これらはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に特異的に結合する抗体の作製に有用である。参照し易いように、「ＲＢＤ」および／または「ＳＰ／ＲＢＤ」という用語は本明細書において相互交換可能に使用される場合があり、文脈において別段の示唆が無い限り、受容体結合ドメインそれ自体、受容体結合ドメインの小さな断片、または受容体結合ドメインとスパイクタンパク質セグメントからの隣接残基を含む大きなバリアントからなるタンパク質残基を包含するが、ただし、当該断片および／または大きなバリアントは、ＲＢＤの活性を保持するものとする（例えば、スパイクタンパク質受容体に結合する能力を保持する）。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」および「Ｆｃ融合タンパク質」という一般用語は、例えば異なる源（例えば異なるタンパク質、ポリペプチド、細胞など）に由来する複数の部分を含むタンパク質を指し、それら複数の部分はペプチド結合を介して共有結合される。Ｆｃ融合タンパク質は、（ｉ）各部分をコードする遺伝子を、単一核酸分子へと連結することにより、および（ｉｉ）当該核酸分子がコードするタンパク質を宿主細胞（例えば、ＨＥＫ細胞またはＣＨＯ細胞）で発現させることにより、共有結合される。治療用タンパク質とＦｃ断片を別々に合成して、その後、化学的にコンジュゲートする方法よりも、すべて組み換え合成による方法が好ましい。化学的コンジュゲートの工程、そしてそれに続く精製プロセスがあると、製造上の煩雑さが増し、生産歩留まりが低下し、コストが増大する。
本明細書で使用される場合、「生物活性」、「活性」、「生物学的活性」、「効力」、「生物活性効力」、または「生物学的効力」という用語は、Ｆｃ融合タンパク質が、細胞受容体に結合、もしくは細胞受容体を活性化し、および／または天然物質もしくは外来性物質を産生させる、または減少させる程度を指す。本明細書で使用される場合、「インビトロ活性」または「受容体活性」とは、Ｆｃ融合タンパク質が細胞受容体に結合するアフィニティを指し、典型的には、Ｆｃ融合タンパク質が、その最大結合の半分に達するＦｃ融合タンパク質濃度によって測定される（すなわち、ＥＣ５０値）。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の「生物活性」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質が、細胞アッセイにおいて、または標的対象において、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の産生を誘導する程度を指す。
本明細書で使用される場合、「生合成」、「組み換え合成」または「組み換え作製された」という用語は、Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子（例えば、ベクター）（例えば、Ｆｃ融合タンパク質全体が、単一核酸分子によってコードされる）で細胞をトランスフェクトすることによって、宿主細胞内で融合タンパク質が発現されるプロセスを指す。宿主細胞の例としては、例えばＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞が挙げられる。細胞は、当分野で標準的な方法を使用して培養することができ、発現されたＦｃ融合タンパク質は、当分野で標準的な方法を使用して細胞培養物から回収され、精製されてもよい。
本明細書で使用される場合、「細胞表面受容体」という用語は、概して細胞膜の外表面上に存在し、例えば血液供給において循環する分子などの可溶性分子と相互作用する、例えばタンパク質などの分子を指す。一部の実施形態では、細胞表面受容体には、宿主細胞受容体（例えば、ＡＣＥ２受容体）または抗体のＦｃ断片もしくはＦｃ領域に結合するＦｃ受容体（例えば、Ｆｃ（ガンマ）受容体、例えばＦｃ（ガンマ）受容体ＩまたはＦｃ胎児性受容体、例えばＦｃＲｎ）が含まれ得る。本明細書で使用される場合、「インビトロ活性」または「Ｆｃ（ガンマ）受容体活性」または「Ｆｃ（ガンマ）受容体結合」または「ＦｃＲｎ受容体活性」または「ＦｃＲｎ結合」とは、Ｆｃ融合タンパク質が、Ｆｃ受容体（例えば、Ｆｃ（ガンマ）受容体またはＦｃＲｎ受容体）に結合するアフィニティを指し、典型的には、Ｆｃ融合タンパク質が、マイクロプレートリーダー上で測定された際にＯＤ４５０ｎｍの値を使用してアッセイ（例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等のアッセイ）で測定されたとき、その最大結合の半分に達するＦｃ融合タンパク質濃度（すなわち、ＥＣ５０値）によって測定される。
本明細書で使用される場合、「免疫原性の」または「免疫原性」という用語は、所与の分子（例えば、本発明のＦｃ融合タンパク質）が、標的対象の免疫システムを刺激する能力を指し、当該能力によって、当該分子の投与後、対象は当該分子のすべてまたは特定の部分に結合することができる抗体（すなわち、抗薬剤抗体またはＡＤＡ）を発現する。本明細書で使用される場合、「中和する」、「中和抗体」または「中和抗薬剤抗体」という用語は、標的対象において、Ｆｃ融合タンパク質の生物活性のすべて、または一部に干渉する抗体の能力を指す。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合分子がヒトに投与される場合、当該分子のｈＩｇＧ－Ｆｃ部分はヒトにとって内因性であり、ゆえに抗ｈＩｇＧ－Ｆｃ抗体が惹起される可能性は低いことから、免疫原性とは、当該分子のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ部分に結合する抗体を指す。同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤとＡＣＥ２受容体の間の結合を当該抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ抗体が阻害する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合分子の投与によって産生される抗体は中和抗体である。当該結合は、対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの生物活性と直接関連するものである。
本明細書で使用される場合、「単量体」という用語は、単一のポリペプチドを含むタンパク質または融合タンパク質を指す。実施形態で、「単量体」は、ＲＢＤポリペプチドとＦｃ断片ポリペプチドを含む、例えば単一ポリペプチドなどのタンパク質または融合タンパク質であり、この場合において当該ＲＢＤとＦｃ断片ポリペプチドは、ペプチド結合により結合され、単一ポリペプチドを形成する。実施形態では、単量体は、単一の核酸分子によってコードされる。
本明細書で使用される場合、図１および図２に示されるように、「Ｎ末端」とは、アミノ酸のアルファ－アミノ基である遊離アミン基を含有するアミノ酸によって開始されるタンパク質またはポリペプチドの始まりを指す（例えば、第二の炭素原子に隣接する１つの炭素原子に共有結合された遊離アミノであり、当該第二の炭素原子は、アミノ酸のカルボニル基の一部である）。本明細書で使用される場合、図１および図２に示されるように、「Ｃ末端」とは、カルボン酸基を含有するアミノ酸によって終結するタンパク質またはポリペプチドの末端を指し、当該カルボン酸基の炭素原子は、アミノ酸のアルファ－アミノ基に隣接する。
本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、希釈剤、賦形剤、ビヒクルなどを指すために本明細書において使用され、担体中でＦｃ融合タンパク質は分散され、乳化され、または封入されて投与されてもよい。好適な担体は、薬学的に許容可能なものである。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能」という用語は、生物学的に、または別段により望ましくないものではなく、過度の毒性、刺激またはアレルギー反応を伴わずに対象に投与することができ、許容できない生物学的効果をもたらさず、またはそれが含まれる組成物の他の構成要素のいずれかと有害な様式で相互作用しない。当業者には公知であるように、薬学的に許容可能な担体は、化合物または他の剤の何らかの分解が最小限になるように、および対象における何らかの有害な副作用が最小限になるように必然的に選択されるものである。薬学的に許容可能な成分としては、獣医学的な用途ならびにヒトの薬学的な用途に対して許容可能なものが挙げられ、投与経路に依存する。賦形剤およびＦｃ融合タンパク質と適合可能な任意の担体を使用することができる。
本明細書で使用される場合、「薬理学」または「ＰＤ」とは概して、対象におけるＦｃ融合タンパク質の生物学的効果を指す。例として、本明細書において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のＰＤとは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の投与後の対象における経時的な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体価の尺度を指す。
本明細書で使用される場合、「薬物動態」または「ＰＫ」とは概して、吸収、分布、代謝および排泄に関する、Ｆｃ融合タンパク質と対象身体の特徴的な相互作用を指す。例として、本明細書において、ＰＫとは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の投与後の所与のときにおける対象の血液中または血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質濃度を指す。本明細書で使用される場合、「半減期」とは、対象の血液中または血清中のＦｃ融合タンパク質の濃度が、元々の値の半分に達するまでかかる時間を指し、薬剤排泄に関する一次指数関数的減衰から計算される。「半減期」の値が大きいＦｃ融合タンパク質は、標的対象中での作用期間が長いことを示す。
本明細書で使用される場合、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列において、「配列同一性」、「配列相同性」、「相同性」または「同一の」という用語は、バリアントのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の特定の連続的なセグメントが、参照配列のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して並べられ、比較されたときに、様々な配列内および参照配列内で、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在することを記載するものである。配列アライメントの方法、および配列間の同一性を決定する方法は当分野で公知であり、類似性に関して配列を整頓し、並べ、そして比較するＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａの使用などが挙げられ、当該ソフトウェアは、各配列の位置を強調して、当該位置での全ての配列で比較を行い、以下のスコアのうちの１つを割り当てる：単一の完全に保存された残基である配列位置については、「＊」（アスタリスク）。「：」（コロン）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリクスで０．５よりも大きいスコアを有する非常に類似した特性を有する群間で保存されていることを示す。「．」（ピリオド）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリクスで０．５以下のスコアを有する、類似性が弱い群間で保存されていることを示す。「－」（ダッシュ）は、配列のギャップを示しており、これは特定の配列範囲内の比較の特定の組み合わせ内に局所的な相同が存在しないことを意味する。「 」（空のスペース）は、比較された配列全体で特定の位置に配列相同性がほとんど無いか、または無いことを示す。
２つのヌクレオチド配列の最適アライメントに関して、バリアントヌクレオチド配列の連続的セグメントに、参照ヌクレオチド配列と比較してヌクレオチドを追加またはヌクレオチドを欠失させてもよい。同様に、２つのアミノ酸配列の最適アライメントを目的として、バリアントアミノ酸配列の連続的セグメントに、参照アミノ酸配列と比較してアミノ酸残基を追加またはアミノ酸残基を欠失させてもよい。一部の実施形態では、参照ヌクレオチド配列または参照アミノ酸配列との比較に使用される連続的セグメントは、少なくとも６、１０、１５または２０個の連続的なヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含み、３０、４０、５０、１００個またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基であってもよい。バリアントヌクレオチド配列またはバリアントアミノ酸配列にギャップを含ませたことに関連して増加した配列同一性に対する補正は、ギャップペナルティを割り当てることによって行うことができる。配列アライメントの方法は、当分野で公知である。
実施形態では、２つの配列間の同一性割合または「相同性」割合の決定は、数学アルゴリズムを使用して行われる。例えば、アミノ酸配列の同一性割合は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定され、１２のギャップオープンペナルティ、２のギャップ伸長ペナルティ、ＢＬＯＳＵＭマトリクス６２を用いたアフィン６ギャップ検索が使用される。実施形態では、ヌクレオチド配列の同一性割合は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して決定され、２５のギャップオープンペナルティ、および５のギャップ伸長ペナルティが使用される。そのような配列同一性の決定は、例えば、ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ社のＤｅＣｙｐｈｅｒ Ｈａｒｄｗａｒｅ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒを使用して実施することができる。
本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、例えばベータ鎖、ヘリックスおよび畳み込みなどの共通の構造特性や共通の空間分布を位置づけることにより、２つ以上のタンパク質を比較するために使用される。したがって、空間解析によって相同なタンパク質構造が規定される。構造上の相同性の測定には、空間の幾何学的トポロジー特性をコンピューター計算することが含まれる。三次元（３Ｄ）タンパク質構造を作成し、解析するために使用される１つの方法は、相同性モデリング（比較モデリングまたは知識ベースのモデリングとも呼ばれる）である。当該方法は、３Ｄ相同性は、２Ｄの相同性を反映しているという事実を基に、類似した配列を発見することによって機能する。相同な構造は、必要条件としての配列類似性を示唆するものではない。
本明細書で使用される場合、「対象」や「患者」という用語は、マウス、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、ウサギ、イヌおよびヒトを含むことが意図される。例示的なイヌ科対象としては、糖尿病、または本明細書に記載される別の疾患もしくは障害などの疾患または障害を有するイヌ、または正常な対象が挙げられる。例えばヒト対象の例としては、例えばＣＯＶＩＤ－１９またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のバリアントを含む、ＣＯＶＩＤ－１９等の疾患、または別のウイルスの疾患を有する個人、または本明細書に記載される疾患または障害を過去に有していた個人、または正常な対象が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「力価」または「収量」という用語は、細胞培養物の体積当たりの（例えばＨＥＫ２９３細胞やＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞中で）生合成から産生された融合タンパク質産物（例えば、本明細書に記載されるＦｃ融合タンパク質）の量を指す。産生物の量は、産生プロセスの任意の工程で決定してもよい（例えば、精製の前後など）。しかし収量または力価は常に元の細胞培養物の体積当たりで提示される。本明細書で使用される場合、「産生物の収率」または「総タンパク質収量」という用語は、細胞によって発現され、少なくとも１回のアフィニティクロマトグラフィー工程（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）によって精製されたＦｃ融合タンパク質の合計量を指し、Ｆｃ融合タンパク質の単量体、Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体、およびＦｃ融合タンパク質のホモ二量体の高次分子凝集物を含む。本明細書で使用される場合、「ホモ二量体のパーセント」または「ホモ二量体％」という用語は、所望のホモ二量体である融合タンパク質産物（例えば、本明細書に記載されるＦｃ融合タンパク質）の割合を指す。本明細書で使用される場合、「ホモ二量体価」という用語は、ホモ二量体％と、細胞培養物の体積当たりで報告されるプロテインＡ精製工程後の総タンパク質収量の積を指す。
本明細書で使用される場合、疾患または障害を有する対象に関して、「治療する」または「治療すること」または「治療」という用語は、感染症の発現の予防または感染症の病状を変化させることを意図して行われる介入を指す。したがって、「治療」とは、治療的処置、ならびに予防的手段または防止的手段の両方を指す。治療剤は、感染症の病状を直接低下させてもよく、または他の治療剤による治療に対する感染症の感受性を高めてもよく、または宿主の免疫系などに対する感染症の感受性を高めてもよい。治療後の改善は、そのような症状の減少または消失として現れ得る。ゆえに組成物は、観察可能な感染症の臨床症状の発現を予防することによって、ならびに／または感染症の臨床症状および／もしくは感染症の作用の発生率または重症度を低下させることによって、ならびに／または感染症／症状／作用の期間を短縮化させることによって、感染症の治療に有用である。疾患または障害を有する対象の治療とは、疾患または障害を有する対象にレジメンを受けさせることによって、疾患または障害の少なくとも１つの症状を治癒すること、治すこと、軽減すること、緩和すること、変化させること、矯正すること、向上させること、または改善することを指す場合があり、例えば当該レジメンは、本明細書に記載されるＦｃ融合タンパク質などの融合タンパク質を投与すること、または本明細書に記載されるＦｃ融合タンパク質などの融合タンパク質の医薬組成物を投与することである。治療には、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状を軽減すること、緩和すること、変化させること、矯正すること、向上させること、改善すること、またはそれらに作用するのに有効な量を投与することを含む。治療には、正常な対象において、または過去に疾患または障害を有していた対象において、抗体を産生させるのに有効な量を投与することを含む。治療は、疾患または障害の症状の憎悪または悪化を阻害し得る。
本明細書で使用される場合、「予防ワクチン」とは、患者の免疫系に抗原に対する抗体を産生させること、および関連する病気またはウイルスに対する対象の免疫反応を増加または改善させることを目的として、患者に抗原を導入する処置を指す。言い換えると、ワクチン接種された対象は、ワクチン接種されていない対象と比較して、関連するウイルスに由来する病気または疾患に対して高度な抵抗性を有する。この抵抗性は、病気の症状の重症度または期間の低下、ウイルス出芽の減少または消失、および一部の症例ではワクチン接種された対象における観察可能な感染症の症状の予防によって明白となり得る。実施形態では、予防ワクチンで処置された患者は、予防ワクチンを用いた処置の前、当該抗原に対する抗体を有していない（言い換えると、患者は、「抗体未感作」である）。
本明細書で使用される場合、「治療ワクチン」とは、患者の免疫系に抗原に対する抗体を産生させて、患者身体が、すでにある病気またはウイルスとより激しく戦うことができるようにすることを目的として、すでに関連する病気またはウイルスを有する患者に抗原を導入する処置を指す。
本明細書で使用される場合、「ブースターワクチン」とは、すでに患者がワクチンの初回投与を受けた後の、または患者が関連する病気もしくはウイルスにすでに罹り、回復したことによって抗体を獲得した後の、追加的なワクチン投与を指す。例として、患者の抗原抗体価を上昇させることによって、抗原を生じさせる病気またはウイルスに対する患者の免疫を「ブースト」させるために、ワクチンの追加投与が定期的に必要となる。
本明細書で使用される場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質の一部分の中のアミノ酸という言及がある場合、引用されるアミノ酸の位置は、配列番号１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質中のアミノ酸の位置として言及される。例として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの３３１位のアミノ酸の変異という言及は、たとえ当該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤが、配列番号１の一部しか含まない場合であっても、配列番号１の３３１番目の位置のアミノ酸を指す。
本明細書で使用される場合、「ＲＢＤ断片」とは、配列番号１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）のいくつかの部分を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の一部を指し、文脈により異なることが示唆されないかぎり、スパイクタンパク質（ＳＰ）の隣接残基を含む場合もある。例として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質のＲＢＤ断片部分は、図２に示されるようにＦｃ断片に結合される。
Ｆｃ融合タンパク質ワクチンの論理的根拠
上記で検討されるように、組み換えタンパク質を基にしたサブユニットワクチン法は、強力な中和抗体Ａｂ価を生じさせるのに最も優勢なエピトープを選択的に使用できることに加えて、不活化ウイルスまたは生きた弱毒化ウイルス、および核酸ベクターを基にしたワクチン形式と比較して、安全性と多重的なブースター投与に関する利点がある。さらに、そのようなタンパク質を基にしたワクチンは、より費用効率良く大量製造され、中程度の温度で安定的であるため、輸送と保管が容易である。しかし組み換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰサブユニットワクチンが免疫学的に未感作のヒト集団において強力な防御的免疫反応を誘導させることの困難さを考慮すると、未感作のＴ細胞およびＢ細胞の活性化閾値を乗り越えるために追加の免疫強化特性とともに改変および／または製剤化しなければならない。
イヌ科においてインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を用いた実験結果
治療用タンパク質を免疫グロブリンＦｃドメインに結合させることにより形成された融合タンパク質の１つの例は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質である。この構築物は、糖尿病患者に対する超長期作用型の基礎インスリン治療を提供するために使用されている。ペプチドリンカーを介して治療用タンパク質としてインスリンアナログを、Ｆｃドメインと組み合わせることによって、インビボで日レベルで有意に長い活性が実現されることが示されている。ネコおよびイヌの糖尿病治療に使用するための超長期作用型のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の例は、ＷＯ２０２０００６５２９Ａ１に記載されている。ＷＯ２０２０００６５２９Ａ１の例において、インスリンアナログの例は、以下である：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ（配列番号２８）
および治療用タンパク質（すなわち、インスリンアナログ）をＦｃドメインに結合させるために使用されたリンカーの例は以下である：ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号２７）。
所与の種（例えば、イヌ、ネコまたはヒト）の糖尿病に対する超長期作用型の治療に適したインスリン－Ｆｃ融合タンパク質分子は、所望のホモ二量体産物が許容可能な力価で、哺乳動物細胞、例えばヒト胎児腎臓（ＨＥＫ、例えばＨＥＫ２９３）細胞中で製造可能でなければならない（例えば、一過性トランスフェクトされたＨＥＫ細胞から、５０ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体価、一過性トランスフェクトされたＨＥＫ細胞から７５ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体価、一過性トランスフェクトされたＨＥＫ細胞から１００ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体価、など）。実験結果から、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、５０ｍｇ／Ｌ未満のホモ二量体価では、動物用製品の厳しい低製造コスト要件を満たす商業生産的なホモ二量体価が得られる可能性は低いことが示されている。
ＷＯ２０２０００６５２９Ａ１（参照により本明細書に組み込まれる）および本明細書に記載されるイヌ用のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例４５でＨＥＫ細胞において製造され、実施例４６でＣＨＯ細胞で製造された。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例４７で精製された。従来的な精製方法を使用したところ、イヌ科ＩｇＧＡとイヌ科ＩｇＧＢの免疫グロブリンＦｃ断片を含む化合物のみが、相当量のタンパク質収量を示した。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構造は、実施例４８で非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳにより確認され、配列は、実施例４９でグリカン除去を伴いＬＣ－ＭＳにより確認された。純度（融合タンパク質収量のホモ二量体割合パーセントにより評価された）は、実施例５０で測定された。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のイヌ科ＩｇＧＡ型はかなり凝集し、生物活性は低レベルであった。一方でインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のイヌ科ＩｇＧＢ型は、低度の凝集（すなわち、ホモ二量体％は高い）、高力価の所望のホモ二量体（すなわち、５０ｍｇ／Ｌを超えるホモ二量体価）、およびイヌにおいて相当レベルで長期間のグルコース低減生物活性を示した。したがって、イヌ科ＩｇＧＢ（配列番号２６）免疫グロブリンＦｃ断片が、イヌにおいて使用される、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の好ましいＦｃ断片である。
ＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号２６）
配列番号２７のペプチドリンカーを介して配列番号２８のインスリンアナログと配列番号２６のイヌ科天然ＩｇＧＢ断片を含む、イヌ科の超長期作用型のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の例は、以下である：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＮＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号２９）
Ｆｃ（ガンマ）受容体Ｉ（ＲＩ）への配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の結合は、実施例５１で評価された。イヌ科の受容体Ｉは市販されていなかったため、ヒトＦｃ（ガンマ）受容体Ｉ（すなわち、ｒｈＦｃ（ガンマ）受容体Ｉ）をサロゲート哺乳動物受容体として使用した。ＯＤ値は、配列番号２９へのｒｈＦｃ（ガンマ）受容体Ｉの結合に比例し、それぞれに添加されたｒｈＦｃ（ガンマ）受容体Ｉの対数濃度に対してプロットされ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結合曲線が作成された。結果を図３に示す。図において、すべてのＦｃ（ガンマ）受容体について、配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の用量が増えるにつれて、ＯＤ４５０値も増加したことが示される。
実施例４５でＨＥＫ細胞中で製造された配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を定期的に投与した後のインビボでの薬理（ＰＤ）は、実施例５２で評価された。被験集団は、アロキサン－ストレプトゾトシンを使用して化学的に誘導された糖尿病の６匹のビーグル犬からなり、それぞれの体重はおよそ１０ｋｇであった。抗インスリン抗体（ＡＩＡ）力価は、化学的に誘導された糖尿病の６匹のビーグル犬について、８週にわたり毎週測定され、実施例５３での配列番号２９に関する試験の対象となった。図４は、化学的に誘導された糖尿病の６匹のビーグル犬について、一連の配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の８回の週１回投与でのＡＩＡ力価を示す。図５は、一連の配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の８回の毎週投与にわたる、化学的に誘導された糖尿病の６匹のビーグル犬に関する、試験０日目からのＡＩＡ力価における変化割合パーセントを示す。データから、ビーグル犬のＡＩＡ力価は、配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の８回投与用量で、実質的に増加しなかったことを示す。
化学的に誘導された糖尿病ビーグル犬を用いたこれらのポジティブな試験結果を基に、実際のクライアントが所有する年齢、品種および糖尿病の程度が様々な自然発生の糖尿病犬を用いたフィールド試験を、実施例５２で開始した。フィールド試験でのクライアント犬はすべて、公知の獣医学インスリン製品またはヒトインスリン製品を用いたインスリン治療を試験開始時点まで受け、実施例５２に記載されるようにプロトコル１またはプロトコル２に従い、配列番号２９を与えられた。
ＡＩＡ力価は再度、実施例５４で治療経過にわたり毎週測定された。予想外なことに、化学的に誘導された糖尿病ビーグル犬で得られた結果とは対照的に、この「野生の」患者集団中の数匹（８／２０）のクライアント犬は、抗インスリン抗体の著しい増加を示した。正規化されたＡＩＡ力価の０．１５は、クライアント犬が配列番号２９に対して免疫原性であるとみなされる最小の測定値とされた。治療開始時にＡＩＡ力価がゼロではなかったクライアント犬については、配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質で治療された後、ＡＩＡが２倍よりも高くなった場合に、配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質が、特定のクライアント犬において免疫原性であるとみなされた。図６は、各クライアント犬の正規化ＡＩＡ力価のプロットであり、配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質はその治療期間中、毎週測定されており、免疫原性であるとみなされた（治療に関し、従った実施例５２の具体的なプロトコルを、各イヌについて示す）。図６に示される各イヌにおいて、ＡＩＡは配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の治療効果を中和し、もはやクライアント所有の糖尿病犬の血中グルコースレベルを制御することはできなくなった。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインスリンアナログ部分は、ほぼ天然のイヌのペプチドであるため、観察された免疫原性はさらに予想外であった。さらにインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＩｇＧＢ Ｆｃ断片部分は、天然のイヌ科Ｆｃ断片である。この結果から、イヌのＩｇＧＢ Ｆｃ断片の特異的活性は、融合タンパク質の治療タンパク質の領域（すなわち、インスリン）に特異的な抗体価を、顕著に、そして継続的に増加誘導するものであったことが示される。中和ＡＩＡ力価の顕著な増加を示したこと以外には、反復投与でもイヌは健康を維持し、治療に関連したアナフィラキシーやサイトカインストームの何らかの兆候はなかった。
一部の症例では、クライアント犬は、高レベルのＡＩＡを示し始め、配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の投与が中断された。中断された時点でＡＩＡ力価は減少し始めた（図４のイヌ２の例を参照）。図７は、週１回投与で１２週間にわたる、イヌ２の実施例の正規化ＡＩＡ力価のプロットである。ＡＩＡ力価は、４回目の投与（２１日目）の後に、測定可能に上昇し始めたこと、そして６回目の投与（３５日目）の後に、ＡＩＡ力価は急こう配で増加し始めたことが分かる。８回目の投与（４９日目）の後に投与は中止され、５６日目と６３日目ではイヌに投与は行われなかった。図７は、ＡＩＡ力価の上昇は即座に減速し、その後、５６日目の後には下降し始めたことを示す。投与レジメンは、７０日目に再開され、７０日目に投与され、７７日目にも再度投与された。７０日目の投与開始後のＡＩＡ力価の上昇は、投与中止までの７週間での最大のＡＩＡ力価上昇と合致したか、またはそれを超えた。このことから、抗薬剤抗体の力価は、最初の一連の投与により蓄積したものよりもかなり短期間で、予想外に回復したことが示される。この安定的なリコール反応は、反応性メモリー免疫細胞集団を示す可能性がある。
クライアント所有の糖尿病犬でのフィールド試験から得られたもう１つの結果は、図８に示されるように、実施例４６によりＣＨＯ細胞で作製された配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質で治療されたイヌ、および実施例４５によりＨＥＫ細胞で作製された配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質で治療されたイヌで、明白な差異があったこと、ＣＨＯで作製された配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、著しく高い抗薬剤抗体の保有率を示すことであった。
各ＩｇＧ断片は、Ｆｃ領域の各重鎖のＣＨ２ドメインに、保存されたアスパラギン（Ｎ）－グリコシル化部位を含有する。本明細書において、保存されたＮ－グリコシル化部位を指すために使用される表記は、「ｃＮｇ」である（図１および図２に示される）。治療用モノクローナル抗体において、グリコシル化は、ＣＨ２領域の保存されたアミノ酸Ｎ２９７で起こる（図１および図２に示される）。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質については、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＢ鎖のＮ末端からのｃＮｇ部位の絶対位置は、インスリンポリペプチドの長さ、リンカーの長さ、そしてｃＮｇ部位の前のＦｃ断片中で省略された任意のアミノ酸に応じて変化する。本明細書において、所与のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質配列中のｃＮｇ部位の絶対位置（インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＢ鎖のＮ末端から数を数えることにより測定される）を指すために使用される表記は、「ＮＢ（数）」である。例えば、ｃＮｇ部位が、Ｂ鎖のＮ末端から数えて、１５１番目のアミノ酸位置にある場合、この部位の絶対位置は、ｃＮｇ－ＮＢ１５１とされる。さらなる例として、ｃＮｇ部位が、Ｂ鎖のＮ末端から数えて１５１番目のアミノ酸位置にあり、この部位のアスパラギンがセリンに変異している場合、この変異は、「ｃＮｇ－ＮＢ１５１－Ｓ」と表される。
実施例４５のＨＥＫ細胞で組み換え作製された融合タンパク質と、実施例４６のＣＨＯ細胞で組み換え作製された融合タンパク質の間に差異があったことの１つの可能性は、当該ｃＮｇ部位で付加されるオリゴ糖の組成である。イヌ科のＩｇＧＢアイソタイプは、Ｆｃ（ガンマ）受容体と相互作用することを考慮すると、反復投入後に望ましくない免疫原性リスクが発生する可能性がある。Ｆｃ（ガンマ）相互作用を低下させる１つの方法は、宿主細胞での合成中に、Ｆｃ断片を脱グリコシル化すること、またはグリコシル化を阻害することである。抗体は薬剤の治療価値を中和するため、例えば糖尿病などの慢性疾患の治療に関し、抗体が生成されてしまうことは明白に有害である。ゆえに、非グリコシル化イヌ科インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生成が試みられた。合成されたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質から、付加グリカンを取り除くための１つの方法は、宿主細胞で産生中にグリカンの付加を完全に阻害するようｃＮｇ部位を変異させることである。本明細書において、ｃＮｇ変異を記述するために使用される表記は、ｃＮｇ－（置換アミノ酸）である。例えば、ｃＮｇ部位のアスパラギンがセリンに変異している場合、この変異は、「ｃＮｇ－Ｓ」と表される。ｃＮｇ変異を有するイヌ科ＩｇＧＢ Ｆｃ断片の全体的な表記を、配列番号３０に示す：
ＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＸ１ＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ
式中、Ｘ１＝Ｓ、Ｄ、Ｋ、Ｑ、またはＡ（配列番号３０）。
イヌ科インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｘ１＝Ｓ（以下の太字残基）を有する配列番号３０のＩｇＧＢ Ｆｃ断片、配列番号２７のリンカー、および以下のインスリンアナログを含むように設計された。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣ（配列番号３１）
得られたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、以下に示す：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＬＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＬＤＰＥＤＰＥＶＱＩＳＷＦＶＤＧＫＱＭＱＴＡＫＴＱＰＲＥＥＱＦＳＧＴＹＲＶＶＳＶＬＰＩＧＨＱＤＷＬＫＧＫＱＦＴＣＫＶＮＮＫＡＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＡＲＧＱＡＨＱＰＳＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＬＳＫＮＴＶＳＬＴＣＬＩＫＤＦＦＰＰＤＩＤＶＥＷＱＳＮＧＱＱＥＰＥＳＫＹＲＴＴＰＰＱＬＤＥＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＤＫＳＲＷＱＲＧＤＴＦＩＣＡＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＥＳＬＳＨＳＰＧ（配列番号３２）
配列番号３２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例４５でＨＥＫ細胞中で、または実施例４６でＣＨＯ細胞中で作製された。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例４７で精製された。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構造は、実施例４８で非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳにより確認され、配列は、実施例４９でグリカン除去を伴いＬＣ－ＭＳにより確認された。純度（融合タンパク質収量のホモ二量体割合パーセントにより評価された）は、実施例５０で測定された。
この融合タンパク質は、配列番号２９と類似した望ましいインビトロ性能およびインビボ性能を示した。図３に示されるように、唯一の違いは、配列番号３２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ（ガンマ）ＲＩ結合アフィニティは、配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質と比較して非常に低かったことである。年齢、品種および糖尿病の程度が様々な５匹の糖尿病クライアント犬で、フィールド試験が開始された。フィールド試験での５匹のクライアント犬はすべて、公知の獣医学インスリン製品またはヒトインスリン製品を用いたインスリン治療を試験開始時点まで受けており、週に１度をベースに、配列番号３２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を投与された。
ＡＩＡ力価は再度、実施例５４により治療経過にわたって毎週、または出来るだけの頻度で測定された。配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を投与されたイヌと比較して、この「野生型」患者集団でのクライアント犬は、配列番号３２の非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を投与されたときにインスリン抗薬剤抗体を示さなかった。正規化されたＡＩＡ力価の０．１５は、クライアント犬が配列番号３２に対して免疫原性であるとみなされる最小の測定値とされた。治療開始時にＡＩＡ力価がゼロではなかったクライアント犬については、配列番号３２のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質で治療された後、ＡＩＡが２倍よりも高くなった場合に、当該クライアント犬は免疫原性であるとみなされた。図９は、治療期間にわたり測定された、各クライアント犬の正規化ＡＩＡ力価のプロットである。この「野生型」患者集団中の５匹のクライアント犬は、配列番号３２の非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を投与されたときにインスリン抗薬剤抗体を示さなかったことを示している。図１０に示されるように、配列番号２９のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を投与されたイヌとは対照的であり、それら合計で１２匹のイヌはインスリン抗薬剤抗体を示した一方で、配列番号３２の非グリコシル化インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を投与されたイヌは抗薬剤抗体を示さなかった。
まとめると、結果から、実験動物集団は別として、特定のＦｃ融合タンパク質は予想外なことに、治療用ペプチド成分または治療用タンパク質成分に対する高力価抗体を誘導する可能性があること、そしてこの反応は、当該治療用ペプチド成分または治療用タンパク質成分のその後の投与で、急速にそして安定的に再誘導され得ることが示された。さらに、これら予備的なデータから、抗治療用タンパク質抗体または抗治療用ペプチド抗体の誘導は、すでに当該特定の治療用タンパク質または治療用ペプチドに対する免疫反応を発現していた個体において、より可能性が高くなることが示唆される。数多くの公開論文において、Ｆｃ融合タンパク質が、融合された治療用ペプチドまたは融合された治療用タンパク質に対する免疫寛容を誘導する可能性が示されており、そしてＤＮＰ、ヌクレオシドまたはペニシロイル基などのハプテンは、ＩｇＧ担体と化学的に結合されたとき、高度に寛容原性のハプテン－担体コンジュゲートになったという結果であったが、今回の結果は、それとは正反対である。
慢性疾患（すなわち、糖尿病）の治療に使用されるインスリンなどの治療用タンパク質にとって、抗インスリン抗体は、当該治療を無効化するものである。それでもなお、前述の結果から、例えばウイルス抗原に対する抗体を誘導し、その活性を中和するＦｃ融合タンパク質を効率的に設計する方法についてのユニークな洞察がもたらされた。フィールド試験に基づくと、望ましいＦｃ融合タンパク質は、最低でも、標的対象に対して本来のものでなければならず（例えば、ヒト対象についてはヒトＦｃまたはｈＦｃ、イヌ対象についてはイヌＦｃまたはｄＦｃ）、Ｆｃ－ｃＮｇ部位で適切にグリコシル化されなければならず、そしてＦｃ（ガンマ）Ｉ受容体に結合する能力を有していなければならない。これらの発見によって、例えば新規コロナウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する新規治療用Ｆｃ融合タンパク質を開発する機会が与えられた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質
ＣＯＶＩＤ－１９のアウトブレイクは、公衆衛生上の重大な脅威である。原因病原体であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を予防するための安全で効果的な解決法に対する差し迫ったニーズが存在する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＳＰ）の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む表面糖タンパク質が特定されており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰ／ＲＢＤは、ヒトおよびコウモリのアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体に強く結合することが判明している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰ／ＲＢＤは外来性抗原であり、この抗原とグリコシル化ヒト免疫グロブリンＦｃ断片を含む融合タンパク質（本明細書において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質またはＳＰ／ＲＢＤ－Ｆｃ融合タンパク質と呼称される）は、患者の既存抗体価を増幅することができる融合タンパク質、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して免疫反応がない、もしくは低い患者に新たな抗体価を誘導することができる融合タンパク質を生成するための有望なアプローチである。具体的には、患者にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する抗ウイルス抗体を産生させるのに有効な予防ワクチンまたはブースターワクチンにおいて使用するための融合タンパク質の作製方法および使用方法が、この差し迫ったニーズを満たすものであり、公衆衛生上の重要な価値を有する。
ゆえに目的は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質（またはそのアナログ）の一部、およびグリコシル化する傾向を有する部位または残基を含有するヒトＦｃ断片（例えば、ヒトＩｇＧ１またはｈＩｇＧ１）とを含むＦｃ融合タンパク質を生成して、新たな様式で、患者に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を高力価で迅速に産生させる抗原（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳＰ／ＲＢＤ）を提示する、製造可能性のあるコンジュゲートを生成することである。
図２に示されるように、ＳＰ／ＲＢＤ－Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分に組み換え融合されたＳＰ／ＲＢＤの二価アナログを含み、（ｉ）図１２に示されるように、局所ＡＰＣへのＳＰ／ＲＢＤ Ａｇの集中的な送達を促進し、ＡＰＣはＦｃ（ガンマ）受容体を介してＳＰ／ＲＢＤ－Ｆｃを内部移行させ、次いで処理し、ＳＰ／ＲＢＤ断片をＣＤ４＋Ｔｈ細胞に提示する。そして今度は図１２に示されるようにＢ細胞の活性化と、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ（すなわち、Ａｂ）の産生を促進（補助）する。さらに、より直接的でユニークな機序によって、ＳＰ／ＲＢＤ－Ｆｃ融合タンパク質を、Ａｇ－特異的Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を介して、既存のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的メモリーＢ細胞へと直接結合させる可能性もある。図１２に示されるように、かかる結合は、配列番号１９のＳＰ／ＲＢＤの二価性を介してＢＣＲをクロスリンクさせて、活性化シグナルを誘発し、その結果、ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の非存在下でも増殖と抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩｇＧ産生の強化がもたらされる。さらに、細胞上で発現された胎児性ＦｃＲ（ＦｃＲｎ）受容体へ結合することによって、多くのモノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）治療剤が、血清半減期を長期化することが可能になるため、ＳＰ／ＲＢＤ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ断片は、半減期を長期化させ、より多くのＡＰＣに対するＳＰ／ＲＢＤの生体暴露を強化するはずである。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全な表面糖タンパク質を、以下に示す（ＧｅｎＢａｎｋ：ＱＨＤ４３４１６．１）：
ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＲＲＡＲＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＫＶＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱＹＩＫＷＰＷＹＩＷＬＧＦＩＡＧＬＩＡＩＶＭＶＴＩＭＬＣＣＭＴＳＣＣＳＣＬＫＧＣＣＳＣＧＳＣＣＫＦＤＥＤＤＳＥＰＶＬＫＧＶＫＬＨＹＴ（配列番号１）
ＧｅｎＢａｎｋ ＱＨＤ４３４１６．１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の表面糖タンパク質のスパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＳＰ／ＲＢＤ）は、以下に示されるように、アミノ酸３３０～アミノ酸５８３の表面糖タンパク質の一部を含む：
ＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥ（配列番号２）。
スパイクタンパク質のＲＢＤは、以下に示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質のアミノ酸３３１～５２４を含む。
ＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶ（配列番号８）
例えばＷＯ２０１８１０７１１７Ａ１およびＷＯ２０２０００６５２９Ａ１に記載される、過去に行われたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の研究によって、タンパク質配列、リンカー配列、およびＦｃドメイン組成の選択はすべて、潜在的にタンパク質の収量、純度および生体活性に影響を及ぼす可能性があることが実証されている。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のウイルスタンパク質の選択において、ＳＰ／ＲＢＤの一部分を含む表面糖タンパク質のサブセットを選択する可能性が想定される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質のＳＰ／ＲＢＤのすべて、または一部を含んでもよい。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質のＳＰ／ＲＢＤではない部分のすべて、または一部を含んでもよい。例として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質のＲＢＤのすべて、または一部、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質のＳＰ／ＲＢＤではない部分のすべて、または一部を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のＳＰ／ＲＢＤ断片中のいくつかのアミノ酸は、本来の状態から変異される。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の製造経験に基づくと、ウイルスタンパク質設計が異なると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のタンパク質収量も異なってくるであろう。例えば、配列番号８のＳＰ／ＲＢＤ配列の大きな部分、または小さな部分を選択し、および任意選択的に特定のアミノ酸を変異させることで、Ｆｃ融合タンパク質にとって望ましいウイルス部分が生成される可能性がある。選択されたウイルスタンパク質をＦｃ断片に結合させたときに得られるタンパク質収量は、実験的に決定することができる。さらに、選択されたウイルスタンパク質とＦｃ断片を結合させるリンカーの長さと組成も同様に、タンパク質の収量に影響を及ぼすであろう。Ｆｃ断片と、ウイルスタンパク質に結合されるＦｃ断片ヒンジ領域部分の選択も同様である。
図２は、本開示による例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の図を示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、例えばペプチドリンカーなどのリンカーを含んでもよい。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のＳＰ／ＲＢＤ断片は、Ｆｃ断片に直接結合されてもよく、すなわち、この場合、リンカーは存在しない。例として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のＳＰ／ＲＢＤ断片中のいくつかのアミノ酸は、本来の状態から変異される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質の一部を含む治療用タンパク質は、Ｆｃ断片のＮ末端側に位置づけられる。融合タンパク質は、以下のＮ末端からＣ末端に向かう方向性でドメインを含む：（Ｎ末端）－治療用タンパク質－リンカー－Ｆｃ断片－（Ｃ末端）（例えば、（Ｎ末端）－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチド－リンカー－Ｆｃ断片－（Ｃ末端））。リンカーは省略されてもよく、その場合、融合タンパク質は、以下のＮ末端からＣ末端に向かう方向性でドメインを含む：（Ｎ末端）－治療用タンパク質－Ｆｃ断片－（Ｃ末端）（例えば、（Ｎ末端）－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチド－Ｆｃ断片－（Ｃ末端））。図２に示される融合タンパク質のＳＰ／ＲＢＤ断片は、宿主細胞において組み換え産生される融合タンパク質の一部として良好に発現されても、されなくてもよい（すなわち、実施例１でＨＥＫ細胞において産生され、実施例２でＣＨＯ細胞において一過性に産生され、または実施例３でＣＨＯ細胞において安定的に発現される）。
以下の全ての記述において、引用されるアミノ酸の位置は、配列番号１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質中のアミノ酸の位置を基準とする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を生成する最初の試みにおいて、配列番号２の主要なウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤを短縮化し、最初のアミノ酸（３３０位）を排除した。得られた配列番号８のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤのＳＰ／ＲＢＤ断片は、アミノ酸３３１～５２４を含むものであった。次いで、ＳＰ／ＲＢＤ断片に新たな変異を導入した。最初に、３３１位と３４３位のアスパラギンを、グルタミンに変異させた（全体的な変異を、図２に示す）。グリコシル化部位が多すぎると、Ｆｃ融合タンパク質を実施例１（ＨＥＫ細胞）、実施例２（一過性ＣＨＯ－ＳＥ（商標）細胞）、または実施例３（ＣＨＯ細胞）により組み換え製造するときに、製造収量の低下につながると考えられたため、これらの変異を導入して、ＳＰ／ＲＢＤ断片中のグリコシル化部位を減少させた。当該分子のＳＰ／ＲＢＤ断片上のグリカンは、抗体発現に必要とされる可能性がある重要なエピトープを隠蔽する場合がある。実施形態において、ＳＰ／ＲＢＤ断片は、図２に示されるようにＦｃ断片のＮ末端側に位置する。
さらに新たな変異をＳＰ／ＲＢＤ断片の３９１位に導入して、システインからメチオニンに変異させた。この変異は、対形成しないシステインを除去して、望ましくないタンパク質のフォールディングを防ぎ、ＨＥＫ細胞またはＣＨＯ細胞で組み換え産生する間の望ましくないアーティファクトを防ぐために行われた。その結果得られた配列番号１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２表面糖タンパク質のＳＰ／ＲＢＤ断片アナログを以下に示す：
ＱＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＱＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＭＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶ（配列番号９）。
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して、配列番号２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然型のＳＰ／ＲＢＤと、ＳＰ／ＲＢＤ断片アナログ（配列番号９）を並べて比較したものを、図１３に示す。「＊」は、所与の配列位置での、全配列にわたる完全な相同を表す。「：」（コロン）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリクスで０．５よりも大きいスコアを有する非常に類似した特性を有する群間で保存されていることを示す。「－」（ダッシュ）は、配列のギャップを示しており、これは特定の配列範囲内の比較の特定の組み合わせ内に、局所的な相同が存在しないことを意味する。
ＳＰ／ＲＢＤ断片アナログ（配列番号９）は、リンカーＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号４）を使用して、以下の配列を含む天然型のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片に結合された：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号６）
ヒトＩｇＧ１断片上のＮ末端リシンは、上述のように、製造収量と純度を改善する試みで、配列番号６では除去されている。さらに、ヒトＩｇＧ１断片のｃＮｇ部位のアスパラギンは保存されて、宿主細胞中での融合タンパク質産生の間のグリカン付加が維持された。得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を以下に示す：
ＱＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＱＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＭＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１１）
配列番号１１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例１でＨＥＫ２９３細胞中で作製され、実施例４で精製された。予想外なことに、これにより高度に凝集したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質が生じ、ホモ二量体価は極めて低く、５ｍｇ／Ｌ未満であった。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を作製するための２番目の試みで、主要なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（配列番号２）配列を短縮化し、最初の１０３アミノ酸（配列番号１の３３０～４３２位のアミノ酸）を除去した。得られた配列番号１のＲＢＤ断片は、４３３～５２４位のアミノ酸を含み、３Ｄモデルにより、構造的に連続しているとみなされた。
得られたＳＰ／ＲＢＤ断片アナログを以下に示す：
ＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶ（配列番号１０）
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然型のＳＰ／ＲＢＤ（配列番号２）と、ＳＰ／ＲＢＤ断片アナログ（配列番号１０）を並べて比較したものを、図１４に示す。「＊」は、所与の配列位置での、全配列にわたる完全な相同を表す。「：」（コロン）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリクスで０．５よりも大きいスコアを有する非常に類似した特性を有する群間で保存されていることを示す。「－」（ダッシュ）は、配列のギャップを示しており、これは特定の配列範囲内の比較の特定の組み合わせ内に、局所的な相同が存在しないことを意味する。
配列番号１０のＳＰ／ＲＢＤ断片アナログは、配列番号１１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質で使用されたものと同じリンカーである、ＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号４）を介して、以下の配列を含む天然型のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片に結合された：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号６）
ヒトＩｇＧ１断片上のＮ末端リシンは、上述のように、製造収量と純度を改善しようと試みて、配列番号６では除去されている。さらに、ヒトＩｇＧ１断片のｃＮｇ部位のアスパラギンは保存されて、宿主細胞中での融合タンパク質産生の間のグリカン付加が維持された。得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を以下に示す：
ＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１２）
配列番号１２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例１でＨＥＫ２９３細胞中で作製され、実施例４で精製された。予想外なことに、これにより高度に凝集したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質が生じ、ホモ二量体価は極めて低く、１ｍｇ／Ｌ未満であった。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を作製するさらなる試みにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤをさらに短縮化する代わりに、配列番号１のアミノ酸３１９～５４１位を含むようにＳＰ／ＲＢＤ配列のＮ末端およびＣ末端を伸長させることによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のＳＰ／ＲＢＤ断片を選択し、より良く発現され、フォールディングされ、そしてシステインと対形成することができる配列を生成した。得られた配列番号１４のＳＰ／ＲＢＤ断片アナログを以下に示す：
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦ（配列番号１４）
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然型のＳＰ／ＲＢＤ（配列番号２）と、ＳＰ／ＲＢＤ断片（配列番号１４）を並べて比較したものを、図１５に示す。「＊」は、所与の配列位置での全配列にわたる完全な相同を表す。「：」（コロン）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリクスで０．５よりも大きいスコアを有する非常に類似した特性を有する群間で保存されていることを示す。「－」（ダッシュ）は、配列のギャップを示しており、これは特定の配列範囲内の比較の特定の組み合わせ内に、局所的な相同が存在しないことを意味する。一方で、「：」、「．」、またはスペースは、配列全体でのそれぞれ所与の配列位置で、保存的アミノ酸変異、中程度のアミノ酸変異、または非常に異なるアミノ酸変異を指す。
１つの試みにおいて、リンカーも短縮化され、組成もＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号３）へと変えられた。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片のヒンジ領域およびＣ末端リシンは元に戻され、配列番号７のＦｃ断片が作製された。
ＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７）
ヒトＩｇＧ１断片のｃＮｇ部位のアスパラギンは保存されて、宿主細胞中での融合タンパク質産生の間のグリカン付加が維持された。得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質（配列番号１７）を以下に示す：
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＧＧＧＳＧＧＧＳＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１７）
実施例１でＨＥＫ２９３細胞中で作製された配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ（ガンマ）受容体Ｉの結合は、実施例９で測定される。Ｆｃ（ガンマ）受容体Ｉ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＡ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＢ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＩ、およびＡＣＥ２受容体の結合のＯＤ４５０測定値は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度の関数として増加することが予測される。
さらなる試みにおいて、配列番号１４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ断片、および配列番号３のリンカーが維持され、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片のＣ末端リシンが再度除去されて、配列番号３３のＦｃ断片が作製された。
ＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号３３）
ヒトＩｇＧ１断片のｃＮｇ部位のアスパラギンは保存されて、宿主細胞中での融合タンパク質産生の間のグリカン付加が維持された。得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を以下に示す：
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＧＧＧＳＧＧＧＳＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１６）
配列番号１６のＦｃ融合タンパク質は、実施例２で一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞中で組み換え作製された。配列番号１６のＦｃ融合タンパク質は、実施例５で精製された。配列番号１６の融合タンパク質の構造は、実施例６で確認され、配列特定は、実施例７で実施された。作製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体価を得るために、ホモ二量体％を、実施例８で測定した。ホモ二量体価は、ホモ二量体％と、組み換え作製された融合タンパク質のタンパク質価を掛け合わせることによって計算された。配列番号１６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体価は、１３９ｍｇ／Ｌであると計算された。
実施例２で一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞中で作製された、または実施例３でＣＨＯ細胞中で作製された配列番号１６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ（ガンマ）受容体Ｉの結合は、実施例９で測定される。Ｆｃ（ガンマ）受容体Ｉ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＡ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＢ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＩ、およびＡＣＥ２受容体の結合のＯＤ４５０測定値は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度の関数として増加することが予測される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を作製するためのさらなる試みにおいて、配列番号１４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰ／ＲＢＤ断片が、配列番号１１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質で使用されたものと同じリンカーであるＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号４）を介して、配列番号６を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片に結合された。得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を以下に示す：
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１８）
配列番号１８のＦｃ融合タンパク質は、実施例２で一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞中で組み換え作製され、実施例５で精製された。実施例において、配列番号１８の融合タンパク質の構造は、実施例６で確認され、配列特定は、実施例７で実施された。作製された配列番号１８のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体価を得るために、ホモ二量体％を、実施例８で測定した。ホモ二量体価は、ホモ二量体％と、組み換え作製された融合タンパク質のタンパク質価を掛け合わせることによって計算された。配列番号１８のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体価は、１２４ｍｇ／Ｌであると計算された。
実施例２で一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞中で作製された、または実施例３でＣＨＯ細胞中で作製された配列番号１８のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｆｃ Ｈｕ融合タンパク質のＦｃ（ガンマ）受容体Ｉの結合は、実施例９で測定される。Ｆｃ（ガンマ）受容体Ｉ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＡ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＢ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＩ、およびＡＣＥ２受容体の結合のＯＤ４５０測定値は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度の関数として増加すること、および所与の濃度でＯＤ４５０測定値が参照標準よりも高くなることが予測される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を作製するためのさらなる試みにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰ／ＲＢＤをさらに短縮化する代わりに、配列番号１５において以下に示されるように、配列番号１のアミノ酸３１９～５４１位を含むようにＳＰ／ＲＢＤ配列のＮ末端およびＣ末端を伸長させることによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のＳＰ／ＲＢＤ断片を選択し、より良く発現され、フォールディングされ、そしてシステインと対形成することができる配列を生成した。
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫ（配列番号１５）
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然型のＳＰ／ＲＢＤ（配列番号２）と、配列番号１５のＳＰ／ＲＢＤ断片を並べて比較したものを、図１６に示す。「＊」は、所与の配列位置での全配列にわたる完全な相同を表す。「：」（コロン）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリクスで０．５よりも大きいスコアを有する非常に類似した特性を有する群間で保存されていることを示す。「－」（ダッシュ）は、配列のギャップを示しており、これは特定の配列範囲内の比較の特定の組み合わせ内に、局所的な相同が存在しないことを意味する。一方で、「：」、「．」、またはスペースは、配列全体でのそれぞれ所与の配列位置で、保存的アミノ酸変異、中程度のアミノ酸変異、または非常に異なるアミノ酸変異を指す。
リンカーも短縮化され、組成をＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５）に変更した。そしてこのリンカーを使用して、ＳＰ／ＲＢＤ断片を、配列番号６を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片へと結合させた。得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を以下に示す：
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＧＧＧＳＧＧＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２０）
配列番号２０のＦｃ融合タンパク質は、実施例２で一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞中で組み換え作製され、実施例４で精製された。実施例において、配列番号２０の融合タンパク質の構造は、実施例６で確認され、配列特定は、実施例７で実施された。作製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体価を得るために、配列番号２０のホモ二量体％を、実施例８で測定した。ホモ二量体価は、ホモ二量体％と、組み換え作製された融合タンパク質のタンパク質価を掛け合わせることによって計算された。配列番号２０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体価は、１３４ｍｇ／Ｌであると計算された。
実施例２で一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞中で作製された、または実施例３によりＣＨＯ細胞中で作製された配列番号２０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ（ガンマ）受容体Ｉの結合は、実施例９で測定される。Ｆｃ（ガンマ）受容体Ｉ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＡ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＢ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＩ、およびＡＣＥ２受容体の結合のＯＤ４５０測定値は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度の関数として増加すること、および所与の濃度でＯＤ４５０測定値が参照標準よりも高くなることが予測される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を作製するためのさらなる試みにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰ／ＲＢＤをさらに短縮化する代わりに、配列番号１５のＳＰ／ＲＢＤ断片が保持された。リンカーは除去され、配列番号１５のＳＰ／ＲＢＤ断片は、配列番号６のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片に直接結合された。得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を以下に示す：
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２１）
配列番号２１のＦｃ融合タンパク質は、実施例２で一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞中で組み換え作製され、実施例４で精製された。実施例において、配列番号２１の融合タンパク質の構造は、実施例６で確認され、配列特定は、実施例７で実施された。作製された配列番号２１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体価を得るために、ホモ二量体％を、実施例８で測定した。ホモ二量体価は、ホモ二量体％と、組み換え作製された融合タンパク質のタンパク質価を掛け合わせることによって計算された。タンパク質価は１５６ｍｇ／Ｌであり、ホモ二量体％は、９８．７％であった。これにより、配列番号２１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体価は、１５４ｍｇ／Ｌとなった。
実施例２で一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞中で作製された、または実施例３でＣＨＯ細胞中で作製された配列番号２１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｆｃ Ｈｕ融合タンパク質のＦｃ（ガンマ）受容体Ｉの結合は、実施例９で測定される。Ｆｃ（ガンマ）受容体Ｉ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＡ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＢ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＩ、およびＡＣＥ２受容体の結合のＯＤ４５０測定値は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度の関数として増加すること、および所与の濃度でＯＤ４５０測定値が参照標準よりも高くなることが予測される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を作製するためのさらなる試みにおいて、配列番号１３において以下に示されるように、ＳＰ／ＲＢＤが配列番号１のアミノ酸３１９～５９１位を含むように、ＳＰ／ＲＢＤ配列のＣ末端を伸長させることによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のＳＰ／ＲＢＤ断片を選択した。
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳ（配列番号１３）
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然型のＳＰ／ＲＢＤ（配列番号２）と、ＳＰ／ＲＢＤ断片（配列番号１３）を並べて比較したものを、図１７に示す。「＊」は、所与の配列位置での全配列にわたる完全な相同を表す。「：」（コロン）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリクスで０．５よりも大きいスコアを有する非常に類似した特性を有する群間で保存されていることを示す。「－」（ダッシュ）は、配列のギャップを示しており、これは特定の配列範囲内の比較の特定の組み合わせ内に、局所的な相同が存在しないことを意味する。一方で、「：」、「．」、またはスペースは、配列全体でのそれぞれ所与の配列位置で、保存的アミノ酸変異、中程度のアミノ酸変異、または非常に異なるアミノ酸変異を指す。
短縮化リンカーのＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５）を使用して、配列番号１３のＳＰ／ＲＢＤ断片を、配列番号６のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片に結合させた。得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を以下に示す：
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＧＧＧＳＧＧＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１９）
配列番号１９のＦｃ融合タンパク質は、実施例２で一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞中で組み換え作製され、実施例５で精製された。実施例において、配列番号１９の融合タンパク質の構造は、実施例６で確認され、配列特定は、実施例７で実施された。作製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体価を得るために、ホモ二量体％を、実施例８で測定した。ホモ二量体価は、ホモ二量体％と、組み換え作製された融合タンパク質のタンパク質価を掛け合わせることによって計算された。配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体価は、２０４ｍｇ／Ｌであると計算された。
ある実施形態で、配列番号１９のＦｃ融合タンパク質は、実施例３で安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中で組み換え作製された。配列番号１９のＦｃ融合タンパク質は、実施例５で精製された。実施例において、配列番号１９の融合タンパク質の構造は、実施例６で確認され、配列特定は、実施例７で実施された。作製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体価を得るために、ホモ二量体％を、実施例８で測定した。ホモ二量体価は、ホモ二量体％と、組み換え作製された融合タンパク質のタンパク質価を掛け合わせることによって計算された。配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体価は、７５０ｍｇ／Ｌよりも高いと計算された。
実施例３でＣＨＯ細胞中で作製された配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ（ガンマ）受容体Ｉの結合は、実施例９で測定される。実施例１６に記載され、図１９、図２０、図２１、図２２、および図２３で示されるように、ヒトのＦｃ（ガンマ）受容体Ｉ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＡ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＢ、Ｆｃ（ガンマ）受容体ＩＩＩ、およびＡＣＥ２受容体の結合のＯＤ４５０測定値は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度の関数として増加する。
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１４、および配列番号１５のＳＰ／ＲＢＤドメインを並べて比較したものを、図８０に示す。「＊」は、所与の配列位置での全配列にわたる完全な相同を表す。「：」（コロン）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリクスで０．５よりも大きいスコアを有する非常に類似した特性を有する群間で保存されていることを示す。「－」（ダッシュ）は、配列のギャップを示しており、これは特定の配列範囲内の比較の特定の組み合わせ内に、局所的な相同が存在しないことを意味する。一方で、「：」、「．」、またはスペースは、配列全体でのそれぞれ所与の配列位置で、保存的アミノ酸変異、中程度のアミノ酸変異、または非常に異なるアミノ酸変異を指す。
一次ワクチンとしての使用のためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、一次ワクチンとして使用されてもよい。１つ以上の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、医薬組成物中で提供される。任意のタンパク質を注射することによって免疫反応を誘導することができる。反応の大きさとタイプは、各免疫システムの「状況」に高度に依存する。例えば、自己抗原（Ａｇ）と比較して、外来性Ａｇを注射した場合、免疫システムにより大きな免疫反応が誘導され、中枢および末梢の耐性機構が維持される。さらに、各Ａｇ（例えば、ウイルス感染）に過去に暴露されてプライミングがされた免疫系に外来性Ａｇを投与すると、Ａｇ未感作の免疫系と比較して、より急速で高い免疫反応が惹起される。このプライミングの免疫学的な基盤は、以下の２つの要素からなる：１）Ａｇ未感作の免疫系は、未感作のＢリンパ球とＴリンパ球を有し、それらはＡｇでプライミングされた免疫系のＡｇでプライミングされた「メモリー」細胞よりも、活性化の閾値が非常に高い。それゆえ、プライミングされたメモリーＴ細胞を活性化するためにＡｇを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）が必要とするＡｇはずっと少ない。および２）Ａｇプライミング暴露の間にメモリーＴ細胞が拡張するため、注入されたＡｇに再暴露された際、当該細胞の数は本来的により多くなる。主要なＡＰＣは、樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージであり、自身の表面上の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子との複合体においてＡｇをＴ細胞Ａｇ受容体に提示する事に留意されたい。
ＡＰＣは、Ａｇへの反応の「程度」と「タイプ」の両方に影響を及ぼすことができる。Ｂ細胞は、液性免疫（抗体産生）によって直接免疫反応に関与し、さらに選択的捕捉とＴ細胞への抗原提示を行う特異的ＡＰＣとして、Ｔ細胞の免疫反応にも関与する。これら両方の機能は、細胞表面のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）の活性化を通じて発揮される。ＢＣＲは本質的に膜結合型抗体であり、特定の抗原に特異的に結合する。例えば特異的抗原を含有するＦｃ融合ホモ二量体などの多価可溶性抗原は、ＢＣＲによって認識され、ＢＣＲを活性化することができる。ゆえに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃタンパク質ホモ二量体は、抗原特異的ＢＣＲの活性化を通じてＢ細胞を活性化させることができ、それによって、抗体の産生が増加し、ＲＢＤに特異的な指向性を有するＴ細胞の活性が増大する。したがって、これら融合タンパク質は、投与後、液性免疫と細胞性免疫の両方を活性化する。より具体的には、誘導されたＴｈ１型（細胞性）免疫は、すでにウイルスに感染している細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫ細胞やマクロファージなどの身体の細胞殺傷機構を活性化する。同時に、Ｔｈ２型免疫では、Ｔヘルパー細胞がＢ細胞を刺激して、増殖およびプラズマ細胞へと分化させ、抗原特異的な抗体を分泌させる。これら抗体は、抗体誘導型細胞性障害（ＡＤＣ）による感染制御を補助する。ＡＤＣは、感染細胞の表面上に提示された抗原に抗体が結合したときに発生し、ＮＫ細胞を誘導して、感染細胞を破壊させる。さらに抗体は、ウイルスに結合し、そして細胞とウイルスの相互作用を妨害して、最終的にはＦｃ誘導型ファゴサイトーシスを介してウイルスを排除することによって、ウイルスの中和を補助する。
アジュバント
例として、大部分のウイルス感染および細菌感染を除去するために、Ｔｈ１細胞反応が必要される。この場合、ウイルス様物質または細菌様物質（非Ａｇ性物質）が、ＡＰＣの条件を整え、重要なサイトカインおよび表面共刺激性分子を発現させて、Ａｇ提示中に、Ｔ細胞をＴｈ１型になるように誘導する。実際に、このＡＰＣ活性化は、アジュバントと呼ばれる多くの免疫強化物質の概念的基礎となっている。図１８において、ワクチンアジュバントの一般的な機序を示す。主要なＡＰＣは、樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージであり、自身の表面上の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子との複合体においてＡｇをＴ細胞Ａｇ受容体に提示する事に留意されたい（図１）。これらのＡＰＣは、Ａｇへの反応の「程度」と「タイプ」の両方に影響を及ぼすことができる。いくつかのアジュバントは、免疫系を騙して、注入されたワクチンＡｇが現在進行中の感染症の一部であるかのように反応させるように設計される（すなわち、感染性実体は、そのような天然ウイルスアジュバント物質または細菌アジュバント物質を提供する）。したがって、アジュバントはＡＰＣを活性化して、未感作Ｔ細胞の活性化閾値を超えるのに必要なより高いＡｇ提示能力をＡＰＣに持たせ、それに加えて、各感染体を効率的に除去するためにＴｈ１反応へとその分化を方向付ける。そのようなＴ細胞が、Ｂ細胞にとって重要な補助を提供し、Ｂ細胞は、各Ａｇに特異的に結合して、Ａｇ特異的抗体（Ａｂ）力価を生成することに留意されたい（図１２）。
一次ワクチンとして使用されるＦｃ融合タンパク質は、アジュバントと同時投与されて、標的対象の免疫反応を強化または別方向に変更させ得る。アジュバントはＡＰＣを活性化して、未感作Ｔ細胞の活性化閾値を超えるのに必要なより高いＡｇ提示能力を持たせ、それに加えて、各感染体を効率的に除去するためにＴｈ１反応へとその分化を方向付ける。例として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の医薬組成物において公知のアジュバントを使用して、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の誘導を強化してもよい。公知のアジュバントとしては、過去１０年間、ヒト臨床試験中である三価または一価のインフルエンザワクチンであるパンデミックＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶワクチンを含む呼吸器系ウイルス感染症に使用されるアジュバントが挙げられる。
本明細書に開示される医薬組成物において採用され得るアジュバントの例としては、限定されないが、水中油、非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩（ＡＡＨＳ）、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、カリウムアルミニウム硫酸塩（Ａｌｕｍ）、フロイントアジュバント（完全および／または不完全）、スクアレン、ＡＳ０２、ＡＳ０３、ＡＳ０４、ＭＦ５９、ＡＳ０１Ｂ、ＱＳ－２１、ＣｐＧ １０１８、ＩＳＣＯＭＳ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ－５１、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ－７２０、ポリラクチドコグリコリド（ＰＬＧ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、Ｄｅｔｏｘ、ＡＧＰ ［ＲＣ－５２９］、ＤＣ＿Ｃｈｏｌ、ＯＭ－１７４（リピドＡ誘導体）、ＣｐＧモチーフ（免疫刺激性ＣｐＧモチーフを含有する合成オリゴヌクレオチド）、修飾ＬＴおよびＣＴ、ｈＧＭ－ＣＳＦ、ｈＩＬ－１２、Ｉｍｍｕｄａｐｔｉｎ、Ｉｎｅｒｔ ｖｅｈｉｃｌｅｓ、例えば金粒子、ならびに例えばＡｄｖａｘ（オーストラリア）などのソースに由来する様々な実験用アジュバント、例えばＡｄｄａＶａｘ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）または他のＡｄｖａｘ系ワクチンアジュバントが挙げられる。
例として、選択されるアジュバントは、ＭＦ５９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）やＡＳ－０３（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）であってもよい。ＭＦ５９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）のカスタム製剤、または例えばＡｄｄａＶａｘ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）などの同等物、またはＶａｘｉｎｅ Ｐｖｔ Ｌｔｄ．（オーストラリア）の他のＡｄｖａｘ系のワクチンアジュバントを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の医薬組成物中に使用してもよい。好ましい実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ－７２０と同時投与されて、標的対象の免疫反応を強化する、または別方向に変化させる。オーストラリアにおいて、呼吸器系ウイルス感染症に使用される他の様々なアジュバントが、季節性三価インフルエンザワクチンにおいて、そしてパンデミックＨ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１ワクチン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）とともに広く試験されており、最近では米国においてＮＩＨにサポートされ、Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ社により実施されるヒトインフルエンザワクチン試験でも検証されている。それらアジュバントをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の医薬組成物で使用してもよい。
１つ以上の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質製剤は、投与の現場で調製される。１つの態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、滅菌混合条件下で、現場でアジュバントと混合される。１つの態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質とアジュバントは、完全に混合され、および／または乳化されて、均質なエマルションが調製され、対象に投与される。皮下空間および筋肉内空間にはより多くの樹状細胞（ＤＣ）が存在するため、皮下（ｓ．ｃ．）注射または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射の部位は強力な抗体反応を誘導する可能性が高く、そのため、Ｆｃ融合タンパク質またはその医薬組成物のアジュバント化製剤は、皮下（ｓ．ｃ．）注射または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって患者に投与される。
本開示の例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質またはその医薬組成物の治療を１回、または複数回、抗体未感作患者に投与した後、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を実施例１１で測定し、その中和能力を実施例１３で評価した。本開示の例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質またはその医薬組成物を用いて、過去に抗体未感作だった患者を１回、または複数回の治療を行うと、治療後の抽出血清において、測定可能な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体力価が誘導されることが予測される。
本明細書に記載されるように、例として、実施例１１で測定されるように抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の量を増加させるために、および／または実施例１３で測定されるように抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体力価のウイルス中和能力を増加させるために、医薬組成物中にアジュバントを使用することが有益である場合がある。アジュバントの使用は、ウイルスに対して、またはＳＰ／ＲＢＤに対して基盤となる免疫反応を保有していない抗体未感作患者において特に有益となる可能性がある。さらに、アジュバントは、時とともに免疫系の複数レベルで変化した結果である、加齢に伴い免疫能力が変化した、いわゆる免疫老化を経た老齢対象において有益である可能性がある。いったん患者が測定可能な抗体を有すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスで再チャレンジされた際、当該患者は非常に迅速な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の発現を呈し、ＣＯＶＩＤ－１９に対する自身の防御を向上させる。
マウスにおいて評価された一次ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合ワクチン
本開示の例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質またはその医薬組成物の有効性は、実施例１２の手順に従い、マウス免疫化試験において様々な投与戦略を使用して、高力価の中和ＡＢ反応を誘導するその能力について最初に評価された。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ワクチンの前臨床免疫原性評価に広く使用されている関連動物モデルである。この系統は、アジュバント化ワクチン候補および非アジュバント化ワクチン候補で免疫化された際に、安定的なＡｂ反応を生じさせる。さらに、関連するＡｂアイソタイプやＴ細胞反応（例えば、Ｔｈ１反応とＴｈ２反応の比較など）をはじめとするワクチン接種に対する様々な免疫反応の動態と特性を評価するための、マウス特異的な試薬が幅広く利用可能である。ゆえにＢＡＬＢ／ｃマウスモデルを選択して、最適なＡｂ反応を得るために必要なＡｇ用量、アジュバントによる強化、投与経路および投与頻度に関して、ＳＰ／ＲＢＤ－Ｆｃワクチンの免疫原性を評価した。
簡潔に述べると、標的マウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス）に、所定の間隔（例えば、３週ごと）で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質（アジュバントを含む、または含まない）またはその医薬組成物を最大で３回注射し、血清を定期的な間隔で採取した。血清抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の力価は、実施例１０の手順または実施例１１の手順に従い測定され、ＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合を阻害する効力は、実施例１３で評価された。実験的な変数としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の組成および用量レベル、注射回数、ならびにアジュバントのタイプが含まれた。
実施例１７に詳述されるように、１～１００μｇの用量レベルの配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質によって、単回注射から２１日後、および２回目の注射から１４日後、有意な抗ＳＰ／ＲＢＤ Ａｂ力価が誘導されたことが示された。それぞれ図２５および図２６に示される。１μｇ～１００μｇに変化する用量レベルに対する、１回、２回および３回投与後の動態反応、すなわち反応期間は、図２７に示されるように、ワクチン接種から少なくとも５６日まで全ての用量レベルで、抗ＳＰ／ＲＢＤ Ａｂ力価の上昇を示した。この結果によって、各投与から１４日後、抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応の測定可能な上昇が認められること、および全ての用量レベルについて、ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応はそれぞれの追加投与が行われることで上昇し続けたことが強調される。
実施例１８において、配列番号２のＳＰ／ＲＢＤ単量体Ａｇ（Ｆｃを欠く）は、２１日目で測定される免疫原性反応に関して有効ではなかったという事実から示されるように、有意な抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価を誘導するためには、配列番号１７の非アジュバント化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ断片が必要であったという重要な結果が示された。図２８に示されるように、誘導されたＦｃ断片を含む配列番号１７の抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応は、最初の投与から１４日目であってもほぼ最大力価に達していた。一方でＦｃ断片を欠く配列番号２のＳＰ／ＲＢＤ単量体Ａｇは、２１日後であっても事実上、抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を誘導しなかった。Ｆｃ部分の２１日目での効果は、いくつかの用量レベルで維持されていたという点で、非常に安定的である。これら２つの非アジュバント化物質の間での免疫原性の差異から、融合タンパク質ＡｇのＦｃ部分の「内蔵式アジュバント」能力の重要性が示される。
すでに検討されているように、アジュバントはＡＰＣを活性化して、未感作Ｔ細胞の活性化閾値を超えるのに必要なより高いＡｇ提示能力を持たせ、それに加えて、各感染体を効率的に除去するためにＴｈ１反応へとその分化を方向付ける。実施例１９において、すべてではないがいくつかの１０μｇの用量レベルの配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を含有するアジュバント化製剤が、１回の投与（図２９に示されるように２１日目で測定された）、２回の投与（図３０に示されるように３５日目に測定された）、および３回の投与（図３１に示されるように５６日目に測定された）の後、およそ３～５倍にまで免疫原性を高めたことが示されており、このことから、アジュバント間で幅のある有効性が示唆される。特に３回目の投与から３２日後（すなわち図３２に示されるように８８日目に測定された）、全ての製剤で誘導された力価が有意に上昇を維持しており、このことから、最初の注射から３カ月の時点であっても、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質に対する免疫原性反応が持続していることが示唆される。
ＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合の阻害効力は、ＩＤ５０値として計算される。この値は、血清サンプルによってＡＣＥ２結合の５０％が達成される希釈の逆数を表す。実施例２０に記載されるように、誘導されたＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合の阻害効力は、０日目の単回注射後２１日目に、０日目および２１日目の注射後４２日目に、ならびに０日目、２１日目および４２日目の注射後、５６日目および８８日目に計算された。配列番号１７の３回投与で免疫化されたマウスの免疫血清に関して計算されたＩＤ５０値から、阻害効力が、最後の注射から３２日後まで維持されていたという事実が示された（図３６）。さらにＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントは一貫して、各時点で上位の効力を誘導した。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０の結果は特に興味深く、このアジュバントで得られた総ＩｇＧ力価は、他のアジュバント化製剤と比較してもそれほど強力ではなかったことを考慮すると予想外であり、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０を用いることで、ＩｇＧ分子当たり高い固有効力が誘導されたことが示唆される。これらのデータは、このワクチン開発プログラムに対し、リードアジュバント候補としてＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０を選択することを強くサポートするものである。
６０歳を超える人々は、より重症疾患に罹り易く、ＣＯＶＩＤ－１９による死亡率が高いことが判明した。ゆえに、老齢マウスにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の免疫反応誘導能力を評価することが重要である。老齢マウスの免疫系は、高齢者の老齢化した免疫系に対する信頼性のあるモデルである。
実施例２１の手順に従い、８～１０カ月齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を用いて免疫化した。８カ月齢より高齢のマウスでは自然死亡率が高くなるため、およそ１５匹のマウスを各試験群に割り当てた。１０、３０および１００μｇの用量レベルの配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、アジュバントを伴わずに１回投与後（２１日目に測定された）、２回投与後（３５日目に測定された）、および３回投与後（５６日目に測定された）、有意なＩｇＧ力価を誘導した。一方で、図３７、図３８、および図３９に示されるように、アジュバントは、１０μｇの配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を含む製剤におけるこの免疫原性を、強力に向上させた。若いマウスにおける免疫原性プロファイルと同様に、アジュバントのＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０を使用することで、５６日目に測定したところ、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の阻害効力（ＩＤ５０）は劇的に、および予想外に、アジュバントを含まないもので得られたレベルと比較して１７倍まで強化された。さらに、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ－７２０で得られた阻害効力（ＩＤ５０）は他のアジュバントよりも優れていたことが再度確認された。重要なことは、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質によって誘導されたこの阻害効力は、アジュバントを含んでも含まなくても、ヒト回復期血清を上回ったことである（図３３、図３４、図３５、および図３６を参照のこと）。このことから、当該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質ワクチンの有望な有効性が示される。
まとめると、上述のＢＡＬＢ／ｃマウスの結果から、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳＰ／ＲＢＤがＡＣＥ２に結合することを阻害するという重要な可能性を有するＩｇＧ力価を充分に誘導することが実証された。さらに、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ－７２０を用いた免疫化が、最も高い阻害効力を示したこと、およびこのアジュバントは、ヒトにおける反応原性の低下に対して策定されたものであることから、これをさらなる評価のリード開発候補アジュバントとして選択した。
配列番号１９の高収量ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を使用して、同様の試験を行った。実施例２２で詳述されるように、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例１１の改善されたＥＬＩＳＡフォーマットに従い測定されたとき、アジュバントの非存在下でも１μｇおよび１０μｇの用量レベルで、マウスにおいて相当のＩｇＧ力価を誘導した。これは上述の配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性プロファイルと一致しており、このことから、１回目（１４日目）および２回目（３５日目）の投与後の２つの用量レベル間での顕著な用量応答性が示される（図４０、図４１および図４２）。予測されたように、異なるアジュバントで製剤化された配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、アジュバント非存在下のものと比較して、各投与後、実施例２２で測定されたときに相当に高い力価を誘導した（１回目および２回目の投与後、約３～１０倍）。そしてＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０は、各投与後、Ａｄ－Ｖａｘ－２と同様の有効性であり、一方でＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ５１の有効性は低かった。さらに、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例２３で測定されたとき、強力なＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ阻害効力（ＩＤ５０値）を誘導した。この阻害効力は、各投与後で、ヒト回復期血清よりも有意に高かった（図４３、図４４および図４５）。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０は、３回目の投与後、最も高い効力を達成したことに留意されたい。
実施例２４において、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、すべてのアジュバントで、相当なＴｈ１促進性のＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３アイソタイプ力価を誘導したことが立証された。この実施例において、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０は一貫して、全ての時点で強力な増強を示した（図４８、図４９および図５０）。それに加えて、Ｔｈ２促進性のアイソタイプであるＩｇＧ１力価は、Ｔｈ１関連アイソタイプよりもおよそ１０倍低い力価であった（図４７）。これらの結果から、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントは、配列番号１９とともに送達された際、特にＴｈ１反応への望ましいシフトを促進することによって、強力な増強効果を維持したことが実証される。このことから、投与回数を控えることができるという特徴が支持され、臨床リードアジュバントとしての選択が推奨される。
マウスにおいてヒトＩｇＧ Ｆｃ構築物を使用することで有効性がどのように影響を受け得るかについて解明を試みることにより、ＳＰ／ＲＢＤ－Ｆｃ融合タンパク質ワクチンの免疫原性に対する寄与という点でのＦｃ断片の役割について、さらにマウスで調査した。マウスのＩｇＧ２ａは、ヒトＩｇＧ１の機能性アナログである。実施例２５に記載される実験は、ｉ）Ｆｃ種のミスマッチが、ＳＰ／ＲＢＤ－Ｆｃ融合タンパク質の基盤となる免疫原性の原因となり得るかどうか、およびｉｉ）動物モデルにおいてヒトＩｇＧ Ｆｃ構築物から得られた結果が、ヒトでの性能予測に適切であるかどうか、の決定を目的とした。
配列番号１９（ヒトＦｃ）、およびマウスＩｇＧ２ａを備えたマウスＦｃを含有する配列番号２３を、アジュバントを含まずに用いて免疫化したところ、最初の投与または２回目の投与から１４日後の抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価の誘導に有意な差は示されなかった（１４日目は図５１に示され、３５日目は図５２に示される）。このことから、ＢＡＬＢ／ｃマウス免疫原性モデルにおいて、ヒトＦｃ抗原性配列は、天然型マウスＦｃ配列と何も変わらず機能することが実証された。さらに、配列番号１９、および配列番号２３を、アジュバントを含まずに用いて免疫化したところ、最初の投与または２回目の投与から１４日後のＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力に有意な差は示されなかった（１４日目は図５３に示され、３５日目は図５４に示される）。このことから、ＢＡＬＢ／ｃマウス免疫原性モデルにおいて、ヒトＦｃ抗原性配列は、天然型マウスＦｃ配列と何も変わらず機能することが実証された。配列番号１９と配列番号２３の両方ともが、たった１回の投与後であっても、ヒト回復期血清（ＨＣＳ）よりも高いＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力を示した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質（配列番号２３）のマウス型が、マウスにおいて、そのままのＳＰ／ＲＢＤタンパク質（配列番号２）と比較して免疫原性の強化を示したことを考慮すると、ヒト型は、ヒトにおいて、免疫原性の強化を示す可能性が高い。
そのようなトランスレーショナルリサーチの促進において、組み換えＡＣＥ２とＳＰ／ＲＢＤの生化学的相互作用を妨害するこの阻害効力は、実施例１５の手順に従い、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ：Ｐｌａｑｕｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ）において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生ウイルスがＶＥＲＯ－Ｅ６生細胞に感染することを中和することで確認された。その結果を図４６に示す。
冷蔵温度または室温でワクチンを保管し、および／または輸送する能力は、特に高度なコールドチェーン輸送と保管のインフラが無い国々におけるワクチンの効果的な分配に非常に重要である。実施例２６は、新たに作製された配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質／ＩＳＡ ７２０エマルションのＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を生じさせる有効性と、調製後、１日間および７日間、４℃および２５℃で保管された同エマルションとを比較したインビボ試験を記載する。
実施例１３に記載されるＡＣＥ２結合阻害アッセイの結果から、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、１日間および７日間、４℃および２５℃で保管されたエマルションの注射後と、新たに作製されたエマルションの注射後とを比較しても、マウスにおいて同様の阻害効力を誘導した。図５５に示されるように、新たに作製されたエマルションを注射された動物と、古くなったエマルションのいずれかを注射された動物との間で、ＩＤ５０値に有意差は無かった（ｐ＞０．０５）。
アジュバントのＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０を含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質ワクチンが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのバリアントに対しても有効であるかどうかを理解する試みにおいて、ＵＫ Ｎ５０１ＹウイルスバリアントのＲＢＤアナログ断片（配列番号２４）と、南アフリカＥ４８４ＫウイルスバリアントのＲＢＤアナログ断片（配列番号２５）を、実施例２２でアジュバントのＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０を含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質ワクチンを２回投与されて免疫化されたマウスの５６日目の血清サンプルを使用して分析した。図６６は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して実施された、配列番号２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然型ＲＢＤと、ＵＫ Ｎ５０１ＹウイルスバリアントのＲＢＤアナログ断片（配列番号２４）と、南アフリカＥ４８４ＫウイルスバリアントのＲＢＤアナログ断片（配列番号２５）とを並べて比較したものを示す。「＊」は、所与の配列位置での全配列にわたる完全な相同を表す。「：」（コロン）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリクスで０．５よりも大きいスコアを有する非常に類似した特性を有する群間で保存されていることを示す。「－」（ダッシュ）は、配列のギャップを示しており、これは特定の配列範囲内の比較の特定の組み合わせ内に、局所的な相同が存在しないことを意味する。
血清サンプルを、プラスチックに結合した組み換えＲＢＤ野生型（Ｌａｋｅ Ｐｈａｒｍａ社、マサチューセッツ州ウースター）または変異体Ｎ５０１Ｙ（ＵＫバリアント、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、ペンシルバニア州ウェーンから提供）またはＥ４８４Ｋ（南アフリカバリアント、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、デラウェア州ニューアークから提供）に添加した。結合したＲＢＤ特異的ＩｇＧは、標識された抗マウスＩｇＧ二次抗体を用いて検出された。ＩｇＧのμｇ／ｍＬ力価は、マウスＥＬＩＳＡ参照血清の標準曲線から決定された。図６５に示される結果から、マウスの免疫血清は、野生型ＲＢＤ分子と同様に、またはそれ以上に、組み換えＲＢＤ変異体のＮ５０１ＹとＥ４８４Ｋに結合したことが示される。このことから、ＵＫ（Ｎ５０１Ｙ）および南アフリカ（Ｅ４８４Ｋ）のウイルスバリアントが、配列番号１９誘導性の免疫を回避する可能性は低いことが示唆される。
非ヒト霊長類において評価された一次ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合ワクチン
マウスから得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性の結果を、ヒト臨床試験へと転換するために、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０中で製剤化された配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を、より遺伝的に関連性のあるＮＨＰ種であるカニクイザルにおいて、実施例２７および実施例２８で試験した。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０とともに製剤化された１０μｇおよび３０μｇの用量レベルの配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例１１で測定されたとき、強力にＩｇＧ価を誘導した。当該実施例において、１回目および２回目の投与後、全ての時点で３０μｇの用量レベルは１０μｇの用量レベルよりも強い免疫原性を示した（図６０）。さらに、このＩｇＧ価の免疫原性プロファイルは、実施例１３で測定された１０μｇおよび３０μｇの両方の用量レベルについて、ＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合の阻害効力が、ヒト回復期血清の効力を上回ったという結果（図６１）と一致した。そのようなトランスレーショナルリサーチの促進において、組み換えＡＣＥ２とＳＰ／ＲＢＤの生化学的相互作用を妨害するこの阻害効力は、実施例２８の手順に従い、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ：Ｐｌａｑｕｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ）において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生ウイルスがＶＥＲＯ－Ｅ６生細胞に感染することを中和することで確認され、その結果を図６２に示す。これらの結果から、ＮＨＰでワクチン接種を試験することの意義が実証され、ヒトへのトランスレーションにとって価値あるガイダンスを提供する。
さらに、アジュバントのＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０を含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質ワクチンが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのバリアントに対しても効果的であったことを確認するために、実施例２７で、アジュバントのＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡを含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質ワクチンの２回投与で免疫化された５匹のＮＨＰの血清サンプルを、４２日目に抽出し、その血清サンプルを、プラスチックに結合した組み換えＲＢＤの野生型、または変異体のＮ５０１ＹもしくはＥ４８４Ｋに添加した。図６４に示される結果から、マウス試験と同様に、ＮＨＰおよびマウスの免疫血清は、野生型のＲＢＤ分子以上に、組み換えＲＢＤの変異体のＮ５０１ＹおよびＥ４８４Ｋに結合した。
配列番号１９のワクチンの有効性を、アカゲザルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジモデルを使用した実施例２７の免疫化ＮＨＰにおいて評価した。０日目、２群のＮＨＰ（１群は実施例２７でワクチン接種され、ブースター注射を投与された。もう１つの群は未感作とされた）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスをチャレンジさせた。チャレンジ前、および７日目に血液を採取した。鼻腔ぬぐい液、口腔ぬぐい液およびＢＡＬ液の収集は、チャレンジ前、ならびに２、４および７日目に行われた。終了後の剖検は、７日目に実施された。
Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ－７２０を含む配列番号１９で免疫化されたＮＨＰは、ウイルスチャレンジ直前に、未感作対照ＮＨＰと比較して、有意な抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ価とＡＣＥ２阻害のＩＤ５０値を示した。未感作対照は、両アッセイとも僅かな、または検出不可能なレベルであった。鼻ぬぐい液（図７８）およびＢＡＬサンプル（図７９）において、チャレンジ後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノム価（実施例３９）およびサブゲノムＲＮＡ価（実施例４０）はごくわずかなレベルであったことから、ＣＯＶＩＤ－１９に対する防御における当該ワクチンの有効性が示される。サブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は複製中間体であり、その存在数はウイルス複製の活性や宿主感染の重症度と関連していることを踏まえると、その数が少ないことは特に有望性を示す。まとめると、データから、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ－７２０を含む配列番号１９は、ＣＯＶＩＤ－１９から防御し、ＮＨＰにおいてＣＯＶＩＤ－１９疾患の悪化リスクはないことが結論付けられる。
ウサギにおいて評価された一次ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合ワクチン
ニュージーランド白ウサギを使用した前臨床ＧＬＰ毒性ＩＮＤ－ｅｎａｂｌｉｎｇ試験は、Ｓｉｎｃｌａｉｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ＬＬＣ（ミズーリ州オーバース）により実施された。実施例３０、実施例３１、実施例３２、実施例３３および実施例３４に詳細が記載される。ウサギは、安定的なＡｂ反応を生じさせ、ワクチン誘導型の免疫原性の前臨床試験に広く使用されている種であり、これを使用した。さらにウサギは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの受容体であるＡＣＥ２を発現しているため、ウイルスはこれに結合し、動物に感染して、ヒトＣＯＶＩＤ－１９疾患に類似した疾患症状を発生させることができる。
実施例３１に記載されるように、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を３０μｇおよび１００μｇの用量レベルで注射されたウサギにおいて、１回目、２回目および３回目の注射の後に相当の特異的ＩｇＧ価が誘導された（図７０および図７１）。実施例１３に記載されるように、機能的阻害効力についても血清サンプルを評価した。このＡＣＥ２阻害アッセイにおいて、アジュバント化された配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の３０μｇと１００μｇの用量レベルでの阻害効力に明白な用量応答性が存在した。効力は上昇し、２回目の投与から１４日後には同等となった（図７２）。両時点での効力値は、ヒト回復期血清で得られた値を実質的に超えていた。この阻害効力は、実施例１５の手順に従い、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ：Ｐｌａｑｕｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ）において、ＶＥＲＯ－Ｅ６生細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生ウイルスが感染することを中和することでさらに確認され、その結果を図７３に示す。
ウサギで得られた結果から、ＩＳＡ ７２０中で乳化された配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＯＶＩＤ－１９感染から回復したヒトにおいて見出されるレベルの機能的免疫原性を誘導したことが示された。これらの毒性試験結果を、公平な安全性プロファイルの見込みが求められる臨床へとあてはめた。主要試験の終了時に、被験物質に関連した死亡事例または臓器重量の変化は観察されなかった。投与フェーズの間の例えばフィブリノーゲンの増加などの軽度な作用は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントによる可能性が最も高く、回復フェーズの間に治まった。予測された肉眼的および顕微鏡的な一過性の注射部位ＡＥも、アジュバントによる可能性が高い。この毒性試験における免疫原性関連の臨床レベルを考慮すると、臨床試験への移行に際して懸念が生じ得る安全性の問題はないと結論付けられた。
皮下（Ｓ．Ｃ．）送達経路と筋肉内（ｉ．ｍ．）送達経路を比較して、実施例３３によりブリッジング試験で評価された。実施例１３で測定された際、１５日目、２９日目および３６日目の解析から、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０での配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質（１００μｇの用量レベル）のｓ．ｃ．投与とｉ．ｍ．投与との間に、抗ＲＢＤ Ａｂ価（図７４）またはＡＣＥ２－阻害効力（図７５）の統計的有意差は示されなかった。このことから、臨床試験においていずれか投与経路の評価を行うことが支持される。
新たに作製されたエマルションと、冷蔵温度で２４時間保管された後の同エマルションとの間の差異は、１５日目（１回投与後）、２９日目（２回投与後）および３６日目（３回投与後）に測定されたＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）の結果（実施例１３で測定された）での下位集団試験を使用して分析された。マウス免疫原性試験（実施例２６）に関して上述された結果と同じように、新たなエマルションと保管後エマルションとの間に阻害効力において統計的な差異はなかった。このことから、アジュバント化配列番号１９製剤の性能は、図７６（皮下投与）および図７７（筋肉内投与）で示されるように、調製後少なくとも２４時間は安定であることが示唆される。
ブースターワクチンとしての使用のためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質
例として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、ブースターワクチンとして使用されてもよい。すでにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対して、低いが測定可能な抗体価を有する対象に融合タンパク質を投与して、その抗体価を増幅させることによって、対象の抗ウイルス防御が増強される。ＳＰ／ＲＢＤ断片バリアントを合成して抗原性を最大化させつつ、配列番号２の天然型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰ／ＲＢＤと比較して、Ｆｃ領域によって抗原の滞留時間を延長させる。任意の特定の機序仮説に拘束されることは望まないが、インビボでの長時間の滞留の間に、天然型グリコシル化ヒトＦｃ断片が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤアナログ抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に提示すると考えられる。その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ抗原に対する強力な免疫反応が生じることが予測される。具体的には、ＡＰＣがＦｃ（ガンマ）受容体を介してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ抗原を内部移行させ、次いで処理を行い、ＲＢＤ断片（図１２）をＣＤ４＋Ｔ細胞に提示する。そして今度は当該Ｔ細胞が、Ｂ細胞の活性化と抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ ＩｇＧ（すなわち、Ａｂ）の産生を促進（補助）する（図１２）。
図１２に詳細に記載されるように、抗原提示細胞は例えば、樹状細胞（ＤＣ）、単球またはマクロファージであってもよく、それら細胞は、Ｆｃ受容体介在性のファゴサイトーシスを介して、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質分子を内部移行させることができる（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ領域の免疫細胞中のＦｃ（ガンマ）受容体への結合を介して）。例えばＤＣサブセット（例えばｃＤＣ２Ｓ）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ介在性取り込みによって、ＩＬ－１０やＩＬ－３３の分泌を介した抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞の発現が促進される。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔｈ２細胞は、例えば抗原受容体をクロスリンクして、Ｂ細胞にＴｈ２細胞を誘引させることによって、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ細胞を活性化することができる。Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）介在性の取り込みを行うことによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ断片が結合され、次いでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が細胞内部位に送達される。細胞内部位で抗原は分解され、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合したペプチドとしてＢ細胞表面に戻る。ペプチドＭＨＣクラスＩＩ複合体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ヘルパーＴ細胞によって認識され、それら細胞を刺激してタンパク質を生成させる。次にＢ細胞が増殖され、その子孫細胞が、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を分泌するＢ細胞へと分化する。配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ断片の存在によって長期間、抗原提示細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰ／ＲＢＤ断片を直接露出させ得る。さらに、および上述のように、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質中のグリコシル化Ｆｃ断片は、当該融合タンパク質の治療部分または抗原部分に対する非常に強力な免疫反応を誘導すると予測される。これら特性を組み合わることによって、抗ウイルス抗体の量が大幅に増加しながら、一方で求められる免疫反応を生じさせるために必要な抗原量が減少する。
例として、配列番号１９、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、または配列番号２１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質、またはその医薬組成物を用いた患者の治療を含む治療法は、すでにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体陽性である、ＣＯＶＩＤ－１９の回復患者に、抗体価とアフィニティを増幅させるための手段としてのブースターワクチンとして投与されてもよく、それによって、これら治療が為された患者はその後に当該ウイルスに直面したとき、感染を防ぎ、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に関連した重篤な症状を防ぐのに充分な免疫を有する。さらに、配列番号１９、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、または配列番号２１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質、またはその医薬組成物を用いた患者の治療を含む治療法は、過去にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンで免疫化されている対象に、抗体価とＳＰ／ＲＢＤに対する特異的アフィニティを増幅させるための手段としてのブースターワクチンとして投与されてもよい。そのような治療法は、ワクチンが１００％有効ではない場合に重要であり、および／または誘導された抗体価が時間とともに減衰する場合に重要である。皮下空間や筋肉内空間にはより多くの樹状細胞（ＤＣ）が存在するため、ｓ．ｃ．注射部位またはｉ．ｍ．注射部位には強い抗体反応が誘導される可能性が高いことから、例として、配列番号１９、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、または配列番号２１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質、またはその医薬組成物は、皮下注射（ｓ．ｃ．）または筋肉内注射（ｉ．ｍ．）によって患者に投与されてもよい。
マウスおよびＮＨＰにおいて評価されたブースターＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合ワクチン
ブースターワクチン使用の有効性を、マウスにおいて評価した。詳細は実施例１２に記載される。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、所定の間隔（例えば、３週ごと）で、いくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質またはその医薬組成物を最大で３回注射し、血清を定期的な間隔で採取した。血清ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ抗体価は、実施例１０および実施例１１の手順に従い測定された。その中和能力は、実施例１３により評価された。実験的な変数としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の組成および用量レベル、注射回数、ならびにアジュバントのタイプが含まれた。免疫化されたマウスは、抗体価が基準値／最低値に減衰するまでさらに３０～６０日間、未処置のまま置かれ、その後、追加の一連のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質またはその医薬組成物の注射を受けて、リコール（メモリー）免疫反応が評価され得ることが予測される。
Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０を含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のブースターとしての使用に関する分析において、最初に１０μｇまたは３０μｇの用量の融合タンパク質をＮＨＰに注射し、実施例２７に記載される定期的な間隔で血清を採取する。抗体価が減衰した３カ月～４か月半後、ＮＨＰに、３０μｇの用量レベルでブースターワクチン（３回目の注射）を注射した。図６３に示されるように、すべての場合で、ブースターワクチンは強力なメモリー免疫反応を誘発させた。
Ｆｃ融合タンパク質の作製
実施形態において、実施例の項に詳細に記載されるように、融合タンパク質を細胞に発現させることができる。
発現および精製
Ｆｃ融合タンパク質は、例えば哺乳動物細胞や非哺乳動物細胞などの真核細胞において組み換え発現することができる。発現に使用される哺乳動物細胞の例としては、ＨＥＫ細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）またはＣＨＯ細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞は様々な株やサブクラス（例えばＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｍ、ＣＨＯ－ＳＥ（商標）およびＣＨＯ－Ｋ１）に再分類されることができ、これら細胞株の一部は、実施例の項に記載されるように、特定のタイプの核酸分子（例えばＤＮＡを含有するベクター）または特定の細胞増殖培地組成での最適使用のために遺伝子操作されてもよい。細胞は、Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸分子（例えば、ベクター）をトランスフェクトされてもよい（例えば、Ｆｃ融合タンパク質全体が、１つの核酸分子によってコードされる）。ＨＥＫ２９３細胞に、Ｆｃ融合タンパク質をコードするベクターをトランスフェクトしてもよいが、このプロセスはＦｃ融合タンパク質の一定期間の一時的な発現（例えば、３日、４日、５日、７日、１０日、１２日、１４日またはそれ以上）のみを発生させるものであり、その後、宿主細胞は適切なレベルのＦｃ融合タンパク質の発現を停止させる（すなわち、一過性トランスフェクション）。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸配列を用いて一過性にトランスフェクトすることによって、より速く組み換えタンパク質を作製できることが多く、このため、複数のＦｃ融合タンパク質候補を作製し、スクリーニングすることが容易になる。例として、ＣＨＯ－ＳＥ（商標）（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）細胞に、Ｆｃ融合タンパク質をコードするベクターをトランスフェクトするが、このプロセスはＦｃ融合タンパク質の一定期間の一時的な発現（例えば、３日、４日、５日、７日、１０日、１２日、１４日またはそれ以上）のみを発生させるものであり、その後、宿主細胞は適切なレベルのＦｃ融合タンパク質の発現を停止させる（すなわち、一過性トランスフェクション）。ＣＨＯ－ＳＥ（商標）（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）細胞を、Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸配列を用いて一過性にトランスフェクトすることによって、より速く組み換えタンパク質を作製できることが多く、このため、複数のＦｃ融合タンパク質候補を作製し、スクリーニングすることが容易になる。宿主細胞ＤＮＡ内に永続的に組み込まれるベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクトしてもよく、それにより、当該細胞が適切に培養される限り、Ｆｃ融合タンパク質の一貫した永続的な発現（すなわち安定的トランスフェクション）がもたらされる。Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞およびＣＨＯ細胞株はしばしば開発まで時間がかかるが、多くの場合、それら細胞は高収量のタンパク質を産生し、低コスト製品の製造により適している（例えば、獣医薬品市場で使用される製品）。細胞および細胞株は、当分野で標準的な方法を使用して培養することができる。
例として、Ｆｃ融合タンパク質は、（例えば、細胞を溶解させることによって）細胞から精製され、または単離され得る。Ｆｃ融合タンパク質は細胞によって分泌され、そして細胞が増殖した細胞培養培地から精製され、または単離され得る。Ｆｃ融合タンパク質の精製には、カラムクロマトグラフィー（例えばアフィニティクロマトグラフィー）の使用、またはサイズ、電荷および／もしくは特定の分子に対するアフィニティにおける差異に応じて他の分離方法の使用が含まれ得る。Ｆｃ融合タンパク質の精製には、例えば、プロテインＡビーズまたはプロテインＡカラムを使用することによって、Ｆｃ断片を含むタンパク質を選択または濃縮する工程が含まれる。当該プロテインＡビーズまたはプロテインＡカラムは、中性溶液ｐＨで、Ｆｃ断片を含むタンパク質を、プロテインＡビーズに共有結合されたプロテインＡに高いアフィニティで結合させる。次いで結合したＦｃ融合タンパク質は、溶液変数を変化させる（例えば溶液ｐＨを低下させる）ことによって、プロテインＡビーズから溶出され得る。例えばイオン交換クロマトグラフィーおよび／またはゲルろ過クロマトグラフィーなどの他の分離方法も、代替的に、または追加的に採用され得る。Ｆｃ融合タンパク質の精製は、タンパク質調製物のろ過または遠心分離、様々なサイズの多孔質膜を通した透析ろ過、限外ろ過およびろ過、ならびに賦形剤を用いた最終製剤化をさらに含んでもよい。
精製されたＦｃ融合タンパク質は、様々な方法を使用して純度、タンパク質収量、構造および／または活性について特徴解析されてもよい。方法としては、例えば２８０ｎｍでの吸光度（例えばタンパク質収量を決定するため）、サイズ排除電気泳動もしくはキャピラリー電気泳動（例えば、分子量、凝集率および／または純度を決定するため）、質量分析（ＭＳ）および／もしくは液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ）（例えば、純度および／またはグリコシル化を決定するため）、ならびに／またはＥＬＩＳＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体またはＡＣＥ２に対するアフィニティなどの結合の程度を決定するため）が挙げられる。特徴解析方法の例も、実施例の項に記載される。
一過性トランスフェクトされたＨＥＫ細胞での産生と、プロテインＡ精製の後のＦｃ融合タンパク質のタンパク質収量は、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、または２０ｍｇ／Ｌより高くてもよく、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌより高くてもよい（例えば、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌより高い）。一過性トランスフェクトされたＨＥＫ細胞での産生と、プロテインＡ精製の後のＦｃ融合タンパク質のホモ二量体％は、７０％よりも高い（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％よりも高い）。一過性トランスフェクトされたＨＥＫ細胞での産生と、プロテインＡ精製の後のＦｃ融合タンパク質のホモ二量体価は、Ｆｃ融合タンパク質収量とホモ二量体％の積として計算され、５０ｍｇ／Ｌより高くてもよい（例えば、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌより高い）。
例として、一過性トランスフェクトされたＣＨＯ－ＳＥ（商標）（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）細胞における産生とプロテインＡ精製の後のＦｃ融合タンパク質のタンパク質収量は、５ｍｇ／Ｌまたは１０ｍｇ／Ｌよりも高い。好ましい実施形態では、一過性トランスフェクトされたＣＨＯ－ＳＥ（商標）（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）細胞における産生とプロテインＡ精製の後のＦｃ融合タンパク質のタンパク質収量は、２０ｍｇ／Ｌよりも高い（例えば、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌよりも高い）。一過性トランスフェクトされたＣＨＯ－ＳＥ（商標）（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）細胞での産生と、プロテインＡ精製の後のＦｃ融合タンパク質のホモ二量体％は、７０％よりも高くてもよい（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％よりも高くてもよい）。実施形態において、一過性トランスフェクトされたＣＨＯ－ＳＥ（商標）（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）細胞での産生と、プロテインＡ精製の後のＦｃ融合タンパク質のホモ二量体価は、Ｆｃ融合タンパク質収量とホモ二量体％の積として計算され、２０ｍｇ／Ｌより高い（例えば、３０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌより高い）。
安定的トランスフェクトされたＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株またはＣＨＯ細胞クローン）における産生と、プロテインＡ精製の後のＦｃ融合タンパク質のタンパク質収量は、Ｆｃ融合タンパク質１００ｍｇ／Ｌよりも高くてもよい（例えば、ｍｇ／培養培地Ｌ）。実施形態において、安定的トランスフェクトされたＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株またはＣＨＯ細胞クローン）での産生と、プロテインＡ精製の後のＦｃ融合タンパク質のタンパク質収量は、５０ｍｇＦｃ融合タンパク質／培養培地Ｌよりも高い（例えば、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌまたはそれ以上）。安定的トランスフェクトされたＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株またはＣＨＯ細胞クローン）での産生と、プロテインＡ精製の後のＦｃ融合タンパク質のホモ二量体％は、７０％よりも高くてもよい（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％よりも高くてもよい）。実施形態において、安定的トランスフェクトされたＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株またはＣＨＯ細胞クローン）での産生と、プロテインＡ精製の後のＦｃ融合タンパク質のホモ二量体価は、Ｆｃ融合タンパク質収量とホモ二量体％の積として計算され、１５０ｍｇ／Ｌよりも高い（例えば、２００ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌまたはそれ以上）。
医薬組成物および投与経路
医薬組成物中のＦｃ融合タンパク質の量および濃度、ならびに対象に投与される医薬組成物の量は、例えば対象の医学的に関連性のある特性（例えば年齢、体重、性別、他の医学的状態など）、医薬組成物中の化合物の可溶度、化合物の効力と活性、および医薬組成物の投与様式などの臨床上関連性のある因子に応じて選択することができる。
本開示の製剤は、非経口投与に適した製剤を含む。「非経口投与」および「非経口投与される」という文言は、本明細書で使用される場合、腸内投与および局所投与以外の投与様式を意味し、通常は静脈内注射、筋肉内注射または皮下注射による投与様式を意味する。
本開示の医薬組成物において採用され得る適切な水性担体および非水性担体の例としては、水、生理食塩水、エタノール、塩、ポリオール類（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、例えばオリーブ油などの植物油、ならびに例えばオレイン酸エチルなどの注射用有機エステル、例えばリン酸カリウムおよび／またはリン酸ナトリウムなどの緩衝剤、例えば塩酸および／または水酸化ナトリウムなどのｐＨ緩衝剤などが挙げられる。例えばレシチンなどのコーティング物質や乳化物質の使用により、分散液の場合には必要とされる粒子サイズを維持することにより、および例えばＴｗｅｅｎなどの界面活性剤などの界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。例として、（例えば、本明細書に記載される）医薬組成物は、Ｔｗｅｅｎなどの界面活性剤、例えばポリソルベート－２０、Ｔｗｅｅｎ－２０またはＴｗｅｅｎ－８０を含む。例として、（例えば、本明細書に記載される）医薬組成物は、Ｔｗｅｅｎなどの界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ－８０を、約０．００１％～約２％、または約０．００５％～約０．１％、または約０．０１％～約０．５％の濃度で含む。
Ｆｃ融合タンパク質は、ボーラスとして、点滴として、または静注として投与されてもよく、またはシリンジ注射、ポンプ、ペン、針、もしくは留置カテーテルを介して投与されてもよい。Ｆｃ融合タンパク質は、皮下ボーラス注射によって投与されてもよい。皮下空間および筋肉内空間にはより多くの樹状細胞（ＤＣ）が存在するため、皮下（ｓ．ｃ．）注射または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射の部位は強力な抗体反応を誘導する可能性が高く、そのため複数の実施例では、Ｆｃ融合タンパク質またはその医薬組成物は、皮下（ｓ．ｃ．）注射または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって患者に投与される。導入方法は、再充填可能なデバイスまたは生分解性デバイスによって提供されてもよい。タンパク質性のバイオ医薬品をはじめとする薬剤の送達制御に関して、近年、様々な徐放性ポリマーデバイスが開発され、インビボで試験されている。生分解性ポリマーや非分解性ポリマーの両方を含む、様々な生体適合性ポリマー（ヒドロゲルを含む）を使用してインプラントを形成し、特定の標的部位で化合物を持続的に放出させることができる。組成物中で使用される薬学的に許容可能な追加的成分としては、緩衝剤、塩、安定剤、希釈剤、保存剤、抗生物質、等張剤などが挙げられる。
用量
使用の際、治療有効量のＦｃ融合タンパク質が、その必要のある対象に投与される。Ｆｃ融合タンパク質を投与することによって、対象において免疫反応が惹起され、より具体的にはコロナウイルス感染、より具体的にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはバリアントに対する免疫反応が惹起される。免疫反応は、観察可能な臨床症状の消失、もしくは通常感染対象によって呈される臨床症状の低下、ウイルス出芽の減少、感染から回復までの時間が速くなること、および／または感染期間が短くなることによって示される。別の実施形態では、感染部位または疾患部位で免疫細胞を活性化させる方法が提供され、当該方法は、治療有効量のＦｃ融合タンパク質を哺乳動物に投与することを含む。別の態様では、対象において抗体産生を増加させる方法が提供され、当該方法は、治療有効量のＦｃ融合タンパク質を哺乳動物に投与することを含む。
本明細書に記載される治療法および予防法は、ヒトならびに限定されないが、イヌ、ネコおよび他のコンパニオン動物、ならびにげっ歯類、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタを含む任意の適切な温血動物に適用可能であることが理解される。当該方法は、臨床試験および／または研究にも適用可能である。
本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という文言は、望ましい治療レジメンに従い投与されたとき、感染症状の一部もしくはすべてを軽減する、または感染傾向を減少させることを含む、望ましい治療的もしくは予防的な効果または作用を惹起させる、本開示に適するであろうＦｃ融合タンパク質の治療量または予防量を指すことを意味する。その状態が完全には消失または防止されなくても、状態もしくは状態による症状、および／または状態による作用が対象において部分的に改善され、または軽減されれば、当業者は、治療的に「有効」とみなされ得る量と認識する。Ｆｃ融合タンパク質の治療有効用量は、対象の大きさや種に応じて、および投与様式に従って変化し得る。
Ｆｃ融合タンパク質の実際の用量レベルは、特定の対象にとって望ましい治療反応を発生させるのに有効な活性成分の量を取得するために変化する可能性がある。選択された用量レベルは、採用された特定の融合タンパク質、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、採用された特定の化合物の排出速度、治療期間、他の薬剤、採用された特定の融合タンパク質と併用して使用される化合物および／または物質、治療される対象の年齢、性別、体重、状態、一般健康状態および既往歴、ならびに医学分野に公知の類似因子をはじめとする様々な因子に依存する。一般的に、Ｆｃ融合タンパク質の適切な用量は、治療効果を生じさせるのに有効な最低用量である量である。そのような有効量は概して、上述の因子に依存する。
様々な態様において、投与を容易にするために、および用量の均一性のために、単位剤形で免疫原性製剤が提供される。本明細書で使用される場合、「単位剤形」とは、治療される対象に対する単位的な用量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を含有する。単位剤形の仕様は、賦形剤および治療剤に固有の特徴、ならびに実現される特定の生物学的効果に影響を受け、およびそれらに直接的に依存する。１つ以上の実施形態では、製剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を対象に投与するための構成要素のキットとして提供される。１つ以上の実施形態では、適切な担体中に分散されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を含む医薬組成物は、単位剤形（例えば、バイアル）で提供される。１つ以上の実施形態では、キットはさらに、投与用のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を現場で混合するためのアジュバントおよび／または他の担体系を含む別個の単位剤形（例えば、バイアル）を含む。１つ以上の実施形態では、キットは、投与用の免疫製剤を現場で混合するための１つ以上の乳化用の針およびシリンジを含む。１つ以上の実施形態では、キットは、対象に調製済みの免疫原性組成物を投与するための１つ以上の投与用シリンジを含む。１つ以上の実施形態では、キットはさらに、免疫原性組成物の調製に関する説明書、および／または免疫原性組成物の投与に関する説明書を含む。
上述の手順による例において、および以下の実施例において、１μｇ～１００μｇの用量レベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質が、マウスおよびウサギにおいて単回注射から２１日後、顕著な抗ＳＰ／ＲＢＤ Ａｂ価を誘導したことが示された。例として、１０μｇ～３０μｇの用量レベルが、非ヒト霊長類において有効であった（図６０、図６１および図６２を参照のこと）。ウサギにおける反応動態から、１００μｇの用量レベルによって、１回目、２回目および３回目の投与後、最も高い免疫原性（ＩｇＧ Ａｂ価として）が誘導されたことが実証された（アジュバントを含まない場合は図６９を参照、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ－７２０アジュバントを含む場合は図７１を参照）。
配列番号１７の免疫原性に関する初回の評価は、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、実施例１７で実施された。当該マウスは、表１に示されるように、アジュバントを含まず配列番号１７を０．０５、０．１、０．３、１、３、１０、３０または１００μｇ投与され、またはアジュバントを含み、配列番号１７を３μｇまたは１０μｇ投与された（すべてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質：アジュバント混合物は、５０％：５０％であった。ただし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質：Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０は、３０％／７０％ ｖ／ｖで混合された）。それに加えて、Ｆｃ融合部分がない配列番号２を、免疫原性へのＦｃ断片の寄与を調べるために評価した。
Figure 2023522597000002
本開示は、前述の医薬組成物または医薬調製物のいずれかでのFc融合タンパク質の製剤を予期するものである。さらに本開示は、前述の投与経路のいずれかを介した投与を予期するものである。当業者であれば、適切な製剤、用量レベルおよび投与経路を、治療される状態、ならびに治療される患者の全般的な健康状態、年齢および身長に応じて選択することができる。
本発明技術は、以下の実施例によってさらに解説される。しかしこれら実施例は、例示を目的として提供されるものであり、本発明技術の全体的な範囲に対する限定と解釈されるべきものはないことを理解されたい。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の合成、精製およびバリデーションに関する一般的な実施例
実施例１：ＨＥＫ２９３細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の合成および作製方法
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、以下のように合成された。対象の遺伝子配列は、独自のソフトウェア（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）を使用して構築され、高発現哺乳動物ベクターにクローニングされた。ＨＥＫ２９３細胞を振とうフラスコに播種し、その２４時間後、トランスフェクションを行い、無血清既知組成培地を使用して増殖させた。対象のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ発現構築物を、一過性トランスフェクションに関する（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）標準操作手順を使用してＨＥＫ２９３細胞の懸濁液内に、一過性にトランスフェクションした。２０時間後、細胞を数え、生存率および生きている細胞数を決定し、力価をＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＬＬＣ、カリフォルニア州フレモント）により測定した。一過性トランスフェクション生産が行われている間、追加で読み取りを行った。培養物を、５日目以降に回収した。
実施例２：一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の合成および作製方法
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、以下のように合成された。対象の遺伝子配列は、独自のソフトウェア（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）を使用して構築され、ヒトＦｃ融合タンパク質特異的な高発現ベクターにクローニングされた。ＣＨＯ－ＳＥ（商標）（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）細胞を振とうフラスコに播種し、その２４時間後、トランスフェクションを行い、無血清既知組成培地（ＭＥＤＮＡ Ｂｉｏ社）を使用して増殖させた。対象のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ発現構築物を、一過性トランスフェクションに関する標準操作手順（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）を使用してＣＨＯ－ＳＥ細胞の懸濁液内に、一過性にトランスフェクションした。ほぼ２４時間後、細胞を数え、生存率および生きている細胞数を決定し、力価をＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＬＬＣ、カリフォルニア州フレモント）により測定した。一過性トランスフェクション生産が行われている間、追加で読み取りを行った。培養物を、７日目以降に回収した。
実施例３：安定的トランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の合成および作製方法
ＣＨＯ細胞株は元々ＣＨＯ－Ｋ１（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）から誘導された株であり、内因性のグルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子が、当分野に公知の方法を使用した組み換え技術によってノックアウトされた。安定的発現ＤＮＡベクターはＣＨＯ発現とＧＳ選択に対して設計および最適化されており、高発現哺乳動物ベクター（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）に組み込まれた。スケールアップ実験を開始する前に、それぞれ完了構築物の配列が確認された。懸濁液に適合したＣＨＯ細胞は、既知組成培地（ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）中、加湿５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で培養された。ＣＨＯ細胞の培養において、血清や他の動物由来産物は使用されていない。
指数関数的増殖相の間にＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地中で増殖した約８０００万個の懸濁液適合ＣＨＯ細胞を、ＭａｘＣｙｔｅ（登録商標）ＳＴＸ（登録商標）システム（ＭａｘＣｙｔｅ， Ｉｎｃ．、メリーランド州ゲイサーズバーグ）を使用して、 ８０μｇのＤＮＡをエレクトロポレーション法によりトランスフェクトし、各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質（ＤＮＡ構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の全長配列を含む）の安定的ＣＨＯ細胞株を作製した。２４時間後、トランスフェクトされた細胞を計数し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合遺伝子の安定的統合に関する選択圧下で播種した。トランスフェクトされた細胞を、振とうフラスコ中、０．５×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で、０～１００μＭのメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を含有するＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ選択培地内に播種し、３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。ＣＨＯ安定的プールが増殖速度と生存率を取り戻すまで、選択プロセスの間、２～３日ごとに細胞をスピンダウンし、新鮮な選択培地中に再懸濁させた。細胞培養物は、増殖と力価についてモニタリングされた。
細胞は、１ｍＬ当たり２．５×１０６ 細胞まで増殖した。細胞貯蔵のために回収した時点で、生存率は９５％を超えていた。次いで細胞を遠心分離し、細胞沈殿物を、７．５％ ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地中で、１バイアル、１ｍＬ当たり１５×１０６細胞の細胞数まで再懸濁した。バイアルは、液体窒素中で貯蔵用に凍結保存された。
小規模なスケールアップ生産を、以下のようにＣＨＯ細胞を使用して実施した。３７℃で１００μＭ ＭＳＸを含有するＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ増殖培地における生産のために、細胞をスケールアップして、およそ１４～２１日間、必要に応じて２～４日ごとに、グルコースと必要に応じて追加アミノ酸を補充されたＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ増殖培地を供給した。安定的プール生産から回収された馴化培地の上清を、遠心分離により清浄化させた。結合緩衝液で予め平衡化されたプロテインＡ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、英国リトルチャルフォント）カラムにタンパク質を流した。次いで、ＯＤ２８０値（ＮａｎｏＤｒｏｐ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）が、バックグラウンド値かほぼその近傍値に測定されるまで、洗浄緩衝液をカラムに通した。低ｐＨ緩衝液を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を溶出させ、溶出分画を集め、各分画のＯＤ２８０値を記録した。標的のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を含む分画をプールし、任意で０．２μＭの膜フィルターを使用してろ過した。
任意で細胞株をさらにモノクローナルになるまでサブクローニングしてもよく、および任意でさらに高力価ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ－融合タンパク質を発現するクローンを、当分野に公知の方法である限界希釈法を使用して選択してもよい。高力価のモノクローナル性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を発現する細胞株を取得した後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の産生は、上述のようにＭＳＸを含まない増殖培地中で行われ、または任意でＭＳＸを含む増殖培地中で行われ、ＣＨＯで産生された組み換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を含有する細胞培養上清を得た。高い産生量能力を有するクローン株に対してさらに選択を行うために、任意でＭＳＸ濃度を経時的に上昇させてもよい。
実施例４：ＨＥＫ２９３細胞で産生されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の精製
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の精製は、以下のように行われた：分泌されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を含有する馴化培地の上清を、一過性トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞産物から回収し、遠心分離で清浄化させた。所望のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を含む上清をプロテインＡカラムに流し、洗浄して、低ｐＨ勾配を使用して溶出した。その後、所望のタンパク質を含む溶出分画をプールし、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０緩衝液に緩衝液交換した。最終ろ過工程は、０．２μｍの膜フィルターを使用して行われた。最終タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの溶液光学密度から計算された。必要に応じて、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、アニオン交換ビーズ樹脂またはカチオン交換ビーズ樹脂を使用）、ゲルろ過クロマトグラフィーまたは他の方法によって追加の任意選択的な精製が行われた。
実施例５：ＣＨＯ細胞で産生されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の精製
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の精製は、以下のように行われた：分泌されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を含有する馴化培地の上清を、一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞または安定的トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の産物から回収し、遠心分離で清浄化させた。所望のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を含む上清をプロテインＡカラムに流し、洗浄して、低ｐＨ勾配を使用して溶出した。その後、所望のタンパク質を含む溶出分画をプールし、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０緩衝液に緩衝液交換した。最終ろ過工程は、０．２μｍの膜フィルターを使用して行われた。最終タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの溶液光学密度から計算された。必要に応じて、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、アニオン交換ビーズ樹脂またはカチオン交換ビーズ樹脂を使用）、ゲルろ過クロマトグラフィーまたは他の方法によって追加の任意選択的な精製が行われた。
実施例６：非還元ＣＥ－ＳＤＳまたは還元ＣＥ－ＳＤＳによる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の構造確認
キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）解析を、ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、マサチューセッツ州ウォルサム）において、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０の緩衝液に溶解されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ精製融合タンパク質に対して行い、電気泳動図がプロットされた。非還元条件下では、サンプルは分子量（ＭＷ）が判明しているタンパク質標準に対して流され、溶出ピークは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の「見かけ上の」ＭＷを表している。
還元条件下（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体のジスルフィド結合を壊すためにベータ－メルカプトエタノールを使用）で、得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質単量体の見かけ上のＭＷを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の分子量の半分と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の構造純度が正確である可能性が高いことを判定する１つの手段とした。
実施例７：グリカン除去を用いたＬＣ－ＭＳによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の配列特定
質量分析法（ＭＳ）を介してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の質量の正確な推定値を得るために、最初にサンプルを処理して、自然発生的なグリカンを除去する。当該グリカンは、ＭＳ分析に干渉する可能性がある。２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０緩衝液に溶解させた２．５ｍｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の１００μＬを最初に、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ社、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０緩衝液へと緩衝液交換する。１．６７μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素（Ｐｒｏｚｙｍｅ Ｎ－ｇｌｙｃａｎａｓｅ）をこの溶液に加えて、融合タンパク質中に存在するＮ結合型グリカン（例えば、ｃＮｇ－Ｎ部位に位置するアスパラギンの側鎖に結合したグリカン）を除去して、混合物を３７℃で一晩、インキュベーター中でインキュベートする。次いでサンプルをＬＣ－ＭＳ（ＮｏｖａＢｉｏａｓｓａｙｓ社、マサチューセッツ州ウォバーン）により分析して、当該分子の質量を得る。この質量は、グリカンを含まない所望のホモ二量体に相当する。ｃＮｇ－アスパラギンからグリカンを除去するために使用された酵素プロセスは、アスパラギン側鎖からアミノ基も除去してアスパラギン酸を形成する。その際、酵素処理されたホモ二量体は全体で２Ｄａ増加し、ホモ二量体中に存在する各鎖については１Ｄａの質量に相当するため、次いでこの質量をさらに補正する。したがって、分析サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質構造のそれぞれの酵素修飾を補正するため、実際の分子の質量は、測定された質量から２Ｄａを差し引いたものとなる。
実施例８：サイズ排除クロマトグラフィーによる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体％
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）は、２８０ｎＭの波長で２９９８光ダイオードに接続されたＷａｔｅｒｓ ２７９５ＨＴ ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、マサチューセッツ州ミルフォード）を使用して実施された。１００μＬ以下の対象ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質含有サンプルを、ＭＡｂＰａｃ ＳＥＣ－１、５μｍ、４×３００ｍｍカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）に注入し、当該装置は０．２ｍＬ／分の流量で操作され、移動相は、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０５％ ｗ／ｖ アジ化ナトリウム、ｐＨ６．２を含有した。ＭＡｂＰａｃ ＳＥＣ－１カラムは、分子サイズ分離の原理に基づき動作する。したがって、大きな可溶性のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ凝集体（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の多量体）は速い保持時間で溶出され、非凝集体のホモ二量体は遅い保持時間で溶出される。分析的ＳＥＣ－ＨＰＬＣを介して凝集した多量体型ホモ二量体からホモ二量体混合物を分離する際、非凝集型ホモ二量体の割合％を単位としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質溶液の純度も確認された。
実施例９：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のインビトロでのＦｃ（ガンマ）受容体、ＦｃＲｎ受容体、およびＡＣＥ２受容体の結合アフィニティ
ｐＨ７．４でのＦｃ（ガンマ）受容体に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の結合は、以下のようにＥＬＩＳＡアッセイを使用して実施された。哺乳動物受容体として、ヒトＦｃ（ガンマ）受容体のＩ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩおよびＦｃＲｎ受容体を使用した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を希釈して、ｐＨ９．６の重炭酸ナトリウム緩衝液中、１０μｇ／ｍＬとした。これをＭａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ社）マイクロタイタープレートに一晩４℃でコーティングした。その後、マイクロプレートストリップをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）緩衝液を用いて５回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を用いてブロッキングした。ビオチニル化ｒｈＦｃ（ガンマ）受容体（組み換えヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩ、Ｆｃ（ガンマ）ＲＩＩａ、Ｆｃ（ガンマ）ＲＩＩｂ、Ｆｃ（ガンマ）ＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）の連続希釈を、ＰＢＳＴ／１０％ Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液中で、６０００ｎｇ／ｍＬから８．２ｎｇ／ｍＬに調製し、１００μＬ／ウェルで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質でコーティングされたマイクロプレートストリップ上へとローディングした。組み換えヒトＡＣＥ２受容体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、公知のコンジュゲート手段を使用してビオチニル化する。次いでＰＢＳＴ／１０％ Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液中で６０００ｎｇ／ｍＬから８．２ｎｇ／ｍＬに調製し、１００μＬ／ウェルを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をコーティングしたマイクロプレートストリップ上にローディングする。マイクロタイタープレートを室温で１時間インキュベートし、その後、マイクロタイタープレートをＰＢＳＴで５回洗浄して、次いでＰＢＳＴ／１０％ Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液中で１：１００００希釈されたストレプトアビジン－ＨＲＰを１００μＬ／ウェルでローディングする。４５分間インキュベートした後、マイクロプレートストリップをＰＢＳＴで５回再度洗浄する。ＴＭＢを添加して、結合したＦｃ（ガンマ）受容体、ＦｃＲｎ受容体またはＡＣＥ２受容体タンパク質を明らかにし、ＥＬＩＳＡ停止試薬（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社）で停止させる。４５０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいてプレートを読み取り、ＯＤ値（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質へのｒｈＦｃ（ガンマ）受容体、ＦｃＲｎ受容体またはＡＣＥ２受容体のそれぞれの結合に比例する）を、各ウェルに添加されたｒｈＦｃ（ガンマ）受容体、ＦｃＲｎ受容体またはＡＣＥ２受容体のそれぞれの対数濃度に対してプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結合曲線を作成する。
血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の作用を評価するためのインビボ血清アッセイに関する一般的な実施例
実施例１０：ヒト血清またはマウス血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ ＩｇＧ抗体価を評価するためのインビボ定量的ＥＬＩＳＡ
定量的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰ／ＲＢＤ特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを使用して、ヒトもしくはマウスの血清または血漿（熱不活化血清または熱不活化血漿を含む）中の抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ価を測定する。ＥＬＩＳＡ法は、９６ウェルのマイクロタイターＥＬＩＳＡプレートのプラスチックウェルに固定された組み換えＳＰ／ＲＢＤを捕捉抗原として使用する（図８１参照）。当該抗原は、マイクロプレートウェル中でインキュベートされた際、血清サンプル中の抗ＳＰ／ＲＢＤ特異的抗体（ＩｇＧ）に結合する。洗浄工程を行って結合していないタンパク質をすべて除去し、プレートに結合した抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧはそのままの状態におく。抗ＳＰ／ＲＢＤ抗体は、血清サンプルの種起源に応じて、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされた抗ヒトまたは抗マウス ＩｇＧ抗体（ＩｇＭとの交差反応性はない）の添加によって検出される。結合していないＨＲＰ抗体コンジュゲートを取り除くために２回目の洗浄を行った後、３，３’，５，５’－トリメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに添加する。ＴＭＢはＨＲＰ酵素によって触媒されて比色変化を起こす。当該変化は、結合したＨＲＰ抗体コンジュゲートの量に比例する。酸を添加して色の発現を停止させ、各ウェルの色密度を分光光度マイクロプレートリーダーを使用して測定する。ＳｏｆｔＭａｘ ＰｒｏソフトウェアまたはＧｅｎ ５ソフトウェアを、吸光データの獲得と、標準曲線を使用した各サンプル値の分析に使用する。標準曲線は、プラスチックウェルに直接結合され（すなわち、ウェルは結合したＳＰ／ＲＢＤを含まず、血清サンプルも含まない）、血清サンプルについて上述されるように発色された、量が判明している（μｇ／ｍＬ）精製ヒトＩｇＧサンプルまたは精製マウスＩｇＧサンプルの連続希釈を使用して作成される。各血清サンプルのＳＰ／ＲＢＤ特異的抗体の量（すなわち、力価）は、μｇ／ｍＬの単位で表され、標準曲線から、適切なソフトウェア（例えば、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏまたはＧｅｎ ５）による４パラメーター曲線適合モデルを使用して導かれる。
実施例１１：マウス血清およびＮＨＰ血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ ＩｇＧ抗体価を評価するためのインビボ定量的ＥＬＩＳＡの改善
定量的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰ／ＲＢＤ特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを使用して、マウスもしくはＮＨＰの血清または血漿（熱不活化血清または熱不活化血漿を含む）中の抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ価を測定する。ＥＬＩＳＡ法は、９６ウェルのマイクロタイターＥＬＩＳＡプレートのプラスチックウェルに固定された組み換えＳＰ／ＲＢＤ（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社）を捕捉抗原として使用する（図８１参照）。当該抗原は、マイクロプレートウェル中でインキュベートされた際、血清サンプル中の抗ＳＰ／ＲＢＤ特異的抗体（ＩｇＧ）に結合する。
ＳＰＤ／ＲＢＤタンパク質（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）を、Ｃａｒｂ／Ｂｉｃａｒｂコーティング緩衝液ｐＨ９．６中で２．５μｇ／ｍＬに希釈し、ボルテックスして混合する。１００μＬ／ウェルのコーティング溶液をマイクロチャンネルピペットを使用してＭａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレートの全ウェルに添加する。プレートをプレートシーラーで覆い、一晩２～８℃でインキュベートした。プレート洗浄機を使用してプレートをＰＢＳＴで５回洗浄し（３００μＬ／ウェル／洗浄）、全ての非結合タンパク質を取り除く。３００μＬのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング溶液を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間超インキュベートする。
標準的なマウス血清またはＮＨＰ血清を希釈して、種特異的なアッセイ様式に応じて標準曲線を作成する。第一標準を作成するために、高力価抗ＳＰ／ＲＢＤで陽性であることが判明しているマウス血清サンプルまたはＮＨＰ血清サンプルを１：１０に希釈し（２０μＬの各サンプルに、１８０μＬのサンプル希釈緩衝液を加える）、ボルテックスにより完全に混合する。残りの標準は、１：１０サンプルの２倍連続希釈により作成する。標準マウスサンプルまたは標準ＮＨＰサンプルの各希釈を、各プレートにデュプリケイトで１００μＬ／ウェルで入れる。
血清サンプルまたは血漿サンプルを１：１００に希釈し（４μＬの各サンプルに、３９６μＬのサンプル希釈緩衝液を加える）、ボルテックスにより完全に混合する。ブロッキング溶液をプレートのウェルから廃棄して、プレートをプレート洗浄機を使用してＰＢＳＴで５回洗浄する（１００μＬ ＰＢＳＴ／ウェル／洗浄）。１００μＬの希釈標準サンプルを、各プレートの列１および列２の各ウェルに入れる。１００μＬの希釈被験血清サンプルを、残りのウェルに加える。被験プレートをシーリングテープで覆い、室温で１時間インキュベートする。
１０μＬの抗マウスまたは抗ＮＨＰのＩｇＧ－Ｆｃ ＨＲＰと、９．９９ｍＬの１ Ｘ ＨＲＰコンジュゲートストック安定液をボルテックスにより良く混合して、１：１０００のストック溶液を作製する。さらに、３００μＬの１：１０００希釈と１１．７ｍＬのＰＢＳＴ／ＳＢをボルテックスすることによって、ストック溶液をさらに希釈し、１：４０，０００希釈を作製する。プレート洗浄機を用いて、３００μＬ ＰＢＳＴ／ウェル／洗浄で５回プレートを洗浄し、プレートを紙タオルでパッティングして乾かした。
１ウェル当たり、１００μＬの１：４０，０００希釈の抗マウスまたは抗ＮＨＰのＩｇＧ－Ｆｃ ＨＲＰを加え、プレートを室温、暗所で１時間インキュベートする。次いでプレート洗浄機を用いてプレートを３００μＬ ＰＢＳＴ／ウェル／洗浄で５回洗浄し、ｄＨ２Ｏ（３００μＬ ｄＨ２Ｏ／ウェル／洗浄）で手動で１回洗浄する。次いでプレートを紙タオル上でパッティングして乾かす。ＴＭＢ溶液を、１００μＬ／ウェルで一度に一列ずつ、列１から始まり列１２までの順序で等しい時間間隔で順番に加え、次いで発色をモニタリングしながら暗所で１０～２０分間インキュベートする。ＴＭＢ基質溶液で前に行われたのと同じ列１から始まり列１２までの順序で、同じ時間間隔で、１００μＬ／ウェルの停止試薬を加えることによって発色を停止させる。各ウェルの色密度を、４５０ｎＭで分光光度マイクロプレートリーダーを使用して３０分以内に測定する。ＳｏｆｔＭａｘ ＰｒｏソフトウェアまたはＧｅｎ ５ソフトウェアを、吸光データの獲得と、標準曲線を使用した各サンプル値の分析に使用する。
ＯＤ値と比較した濃度（１／標準マウスサンプルまたはＮＨＰサンプルの希釈の対数）を使用して、標準曲線を作成する。サンプル中の抗体価は、最も高いＲ２値を生じさせた標準曲線上の１０～１２点を通る直線回帰によって分析される。値は、ＲＢＤ－特異的ＩｇＧ価として報告される（参照（Ｒｅｆ．）力価単位）。
実施例１２：マウスでの抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応の誘導における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ製剤の有効性に関するインビボの一般的な前臨床評価
様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質製剤の有効性を評価するためのインビボ試験は、以下のようにマウスにおいて実施される：
６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス、または８～１０週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、メーン州バーハーバー）を少なくとも７日間馴化させ、その後体重を測定し、投与の試験群に割り当てる。高齢のマウスを使用して、高齢者（例えば、７０歳超）におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質製剤の有効性のモデルとする。６～８週齢の群当たり、Ｎ＝５匹のマウスを使用し、８～１０週齢の群当たり、Ｎ＝１５匹のマウスを使用する。マウスは各試験群に無作為に割り当てられる。自動的に換気されるラックにおいて、１ケージ当たり５匹でマウスは維持され、標準的な照射済み食品とろ過水を自由に与えられる。識別用にマウスの耳にタグを付け、試験ケージは動物ＩＤ、試験名および試験群識別名でラベルされる。標準操作手順書（ＳＯＰ）および特定の試験プロトコルに従い、個々の投与シートおよび群の投与シート、血液／血清収集シート、体重測定および健康観察記録を含む試験の記録が行われる。
実施例１で一過性トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞、実施例２で一過性トランスフェクトされたＣＨＯ細胞、もしくは実施例３で安定的トランスフェクトされたＣＨＯ細胞で合成されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質、または購入して得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ＲＢＤを最大で３つの用量で投与する。皮下（ｓ．ｃ．）注射または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射を介して、投与は３週間離して行われる（０日目、２１日目および４２日目）。何等かの即時型反応について、用量投与から１～３時間マウスを観察し、その後は全般的な健康状態について毎日観察する。全てのマウスに、最初の免疫化の７～１４日前、その後は各用量投与から１２日～１４日後、顎下腺静脈穿刺を介して非末梢採血を行い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ ＡｇＧ Ａｂ力価評価のための血清サンプルを得る。採取された血液を凝固させ、マイクロバキュテイナ管を遠心分離することにより血清を分離させ、分注し、実施例１０または実施例１１に記載される方法によるＥＬＩＳＡで抗体分析することを目的に凍結する。
３回目の免疫から１２日後または１４日後に最後の血清採取をした後（すなわち、５４～５６日目）、実質的な抗体反応を示したマウス群、および非免疫化対照群を維持して、さらなる評価を行ってもよい。維持されたマウスについて、３回目の投与から３０日後および６０日後（それぞれ７２日目および１０２日目）に、顎下腺静脈穿刺法により各マウスから血液を採取し、凝固させ、マイクロバキュテイナ管を遠心分離することにより血清を分離させ、分注し、実施例１０、実施例１１および実施例１３に記載される方法によるＥＬＩＳＡで抗体分析することを目的に凍結する。
実質的な抗体反応を示したことにより維持されるマウスには、ｓ．ｃ．注射、ｉ．ｍ．注射またはｉ．ｄ．注射により１０２日目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のブースター投与を行う。何等かの即時型反応について、投与から１～３時間マウスを観察し、その後は全般的な健康状態について毎日観察する。最後のブースター投与から１２日～１４日後に、顎下腺静脈穿刺法により各マウスから血液を採取し、凝固させ、マイクロバキュテイナ管を遠心分離することにより血清を分離させ、分注し、実施例１０、実施例１１および実施例１３に記載される方法によるＥＬＩＳＡで抗体分析を行い、各群におけるリコール（メモリー）免疫反応を評価することを目的に凍結する。
様々なアジュバント（例えば、Ａｄｖａｘ－２、Ａｄｖａｘ－３、ＶａｃＡｄｘ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ－５１、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ－７２０またはその代用品）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質と組み合わされて検証されてもよい。適切なｖ／ｖ比のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質とアジュバントを、マウスに投与する直前に混合／乳化する。
実施例１３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイクタンパク質－ＲＢＤへのＡＣＥ２の結合の中和における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の有効性を評価するためのインビボの一般的な血清学的アッセイ
組み換えＳＰ／ＲＢＤへの組み換えヒトＡＣＥ２の結合を阻害する、血清中に存在する阻害性抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ力価のレベルを測定するようにＡＣＥ２阻害に関する酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を設計する。アッセイにおいて血清サンプルを連続希釈することにより、サンプルの効力値である阻害希釈５０％（ＩＤ５０）が得られる。この値は、ＡＣＥ２結合シグナル全体の５０％が発生する希釈を表す。アッセイを使用して、例えばヒト、ＮＨＰ、マウスおよびウサギなどの複数の種に由来するサンプルを評価することができる。その結果、任意のサンプルのＩＤ５０値を任意の他のサンプル値と比較して、種間での比較や、個別の実験間での比較が行えるようになる。
このアッセイは競合阻害ＥＬＩＳＡであり、連続希釈された血清サンプルとビオチニル化ヒトＡＣＥ２（ビオチン－ｈｕＡＣＥ２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州ミネアポリス）を、９６ウェルプレートのプラスチックウェルに結合した組み換えＳＰ／ＲＢＤタンパク質に添加して、ＳＰ／ＲＢＤに対する競合結合が行われる。血清サンプル中に存在するＩｇＧ（すなわち抗体）の阻害（すなわち中和）のレベルは、ＳＰ／ＲＢＤに対するビオチン－ｈｕＡＣＥ２結合の阻害の程度と相関する。血清とビオチン－ｈｕＡＣＥ２を洗い流した後、ＳＰ／ＲＢＤに結合したビオチン－ｈｕＡＣＥ２に結合するストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、マサチューセッツ州ウォルサム）を添加する。その後洗浄し、ＴＭＢ基質の添加を行って発色させる。ＨＲＰ（酵素）／ＴＭＢ（基質）の反応を、停止試薬（１％ Ｈ２ＳＯ４）の添加により停止させ、色強度（光学密度、ＯＤ）を、４５０ｎｍの波長でマイクロプレートリーダーにより測定する。各サンプルのＩＤ５０効力値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用し、４パラメーター曲線適合（対数－阻害剤と反応の比較、変動のある傾斜）アルゴリズムを介して、非競合ビオチン－ｈｕＡＣＥ２によって得られる合計シグナル（すなわち最大ＯＤ４５０値、１００％）のちょうど５０％に相当する希釈の逆数として計算される。
実施例１４：ウサギにおける、ＧＬＰ毒性試験に対する抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応の誘導における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ製剤の有効性を評価するためのインビボの一般的な定量ＥＬＩＳＡ
配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質製剤の毒性を評価するためのインビボ試験は、以下のようにウサギにおいて実施される：
配列番号１９誘導性の免疫原性アッセイはＥＬＩＳＡであり、当該ＥＬＩＳＡにおいて、ウサギ非臨床試験血清サンプル中に存在する抗ＳＰ／ＲＢＤ抗体は、マイクロタイターウェル上にコーティングされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰ／ＲＢＤを使用して捕捉され、次いでＨＲＰ酵素コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ Ｈ＋Ｌ－ＨＲＰ二次抗体により検出され、その後ＴＭＢ基質システムが行われる。標準曲線（１０００ｎｇ／ｍＬ～１．３７ｎｇ／ｍＬ）は、サンプル希釈レベルに合致して正常ウサギ血清を一定割合で含有する緩衝液内に添加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）スパイクＲＢＤ抗体ウサギｐＡｂを使用して作成される。（例えば、被験サンプルが１：１００に希釈される場合、１％正常血清緩衝液を使用して、標準曲線が作成される）。血清サンプル中の抗ＳＰ／ＲＢＤ抗体濃度は、ＳｏｆｔＭａｘソフトウェアを使用した４－パラメーター標準曲線適合に内挿することによって、分析される。３つの陽性アッセイ対照（高ＱＣ、中ＱＣ、低ＱＣ）および陰性対照（陰性ＱＣ）は、ウサギｐＡｂを緩衝液内に添加することによって調製され、単回融解用途の分注物として－２０℃で凍結保存された。（これらＱＣは、正確さと精度を評価するためのバリデーションアッセイでも使用された。）特定のバリデーション試験（例えば、短期安定性、凍結／融解安定性）のための追加サンプルは、ウサギポリクローナル抗ＳＰ／ＲＢＤ抗体を直接ウサギ血清内に添加することによって調製された。バリデーションを目的として、サンプル希釈緩衝液において、最低必要希釈（ＭＲＤ）を１：１００とし、バリデーションを行う間に使用される血清サンプルにこれを使用して、実際の試験血清サンプルに使用されるＭＲＤと合致させた。血清サンプルを必要とする、または血清含有緩衝液を必要とするほとんどのバリデーション作業は、再構築された正常ウサギ血清を使用して実施されたが、実際の試験血清サンプルをより良く表すために、プールされた正常ウサギ血清（ＢｉｏＩＶＴ）も使用して、直線性や定量限界などの選択パラメーターが試験された。
バリデーションの間に判定されるように、当該アッセイのアッセイ内およびアッセイ間の正確性は、ゼロ以外の３つすべてのＱＣ値で８８～１１７％の範囲であり、アッセイ内およびアッセイ間の精度は、すべてのＱＣ値でそれぞれ６～１０％および１～１１％の範囲である。プールされた血清を使用した場合、ＬＬＯＱは、２ｎｇ／ｍＬであると決定され、それに対して正常血清では１ｎｇ／ｍＬと決定された。ＵＬＯＱは、プールされた血清では５００ｎｇ／ｍＬであることが判明し、一方で正常血清では１０００ｎｇ／ｍＬであった。プール血清がより近く被験サンプルを表しているため、ＬＬＯＱとＵＬＯＱは、それぞれ２ｎｇ／ｍＬと５００ｎｇ／ｍＬで設定された。当該アッセイは、これら定量限界の間で直線的であることが判明したが、約１０００ｎｇ／ｍＬを超えると顕著なフック効果が観察された。抗体が非常に高濃度で添加されたときに測定される値は、１９２ｎｇ／ｍＬという低さであることが判明した。（この結果に基づき、試験サンプルの分析中に１９２ｎｇ／ｍＬを超えて測定されたサンプルはすべて希釈レベルを上げて再試験された）添加回収試験は、１１個の異なる血清サンプル間で正確であり、回収は高添加レベル（４００ｎｇ／ｍＬ）で７４～１０５％の範囲、中添加レベル（８０ｎｇ／ｍＬ）で９１～１１７％の範囲、低添加レベル（１０ｎｇ／ｍＬ）で８６～９８％の範囲であった。添加された血清サンプルは、少なくとも３回の凍結融解サイクル（９３～１１８％の回収）、４℃で最大で１週間（９０～９３％の回収）、および室温で４時間（９２～１０６％の回収）を通じて安定的であることが判明した。これらのバリデーションの結果から、配列番号１９の免疫原性ＥＬＩＳＡは、正確性が高く、再現性があり、目的に適合していることが示された。
実施例１５：プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）
中和Ａｂ（ｎＡｂ）力価は、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって判定される。簡潔に述べると、血清は３０分間、５６℃で熱不活化され、次いでマイクロタイタープレート中で２倍連続希釈される。希釈されたウイルス懸濁液を希釈サンプルに１：１（ｖ／ｖ）の比率で添加し、１時間、３７℃でインキュベートして、血清ＩｇＧをウイルスに結合させる。次いでこの血清－ウイルス混合物を、組織培養処理プラスチックプレート上の８０％コンフルエンシーのＶｅｒｏ Ｅ６細胞の単層上に１時間添加して、遊離ウイルスを細胞に感染させる（これら細胞は高レベルのＳＰ標的タンパク質であるｈｕＡＣＥ２を発現する）。この時点で、完全ＤＭＥＭ培地、２ＸＭＥＭ、および１．５％アガロースのオーバーレイを、１：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）の比率で加える。細胞を４８時間インキュベートして、その後、１０％中性緩衝ホルマリンで少なくとも３０分間固定する。アガロースオーバーレイのプラグを取り除き、細胞を０．５％ クリスタルバイオレットで染色する。染色液を洗い流した後、細胞を一晩、大気温度で乾燥させ、プラークを数える。陰性対照Ａｂおよび陽性対照Ａｂ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ペンシルバニア州ウェーン）を使用して、サンプル希釈曲線の吸光度を、中和割合％へと変換し、それからＩＤ５０中和効力値を各サンプルについて導出する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のインビトロおよびインビボでの性能を示す実施例
実施例１６：配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のインビトロでの人Ｆｃ（ガンマ）受容体およびＡＣＥ２受容体の結合アフィニティ
ｐＨ７．４でのヒトＦｃ（ガンマ）受容体およびＡＣＥ２受容体への配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のインビトロ結合は、実施例９の手順に従い実施された。ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎへのヒトＩｇＧのインビトロ結合は、実施例９の手順に従い実施された。
４５０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいてプレートを読み取り、ＯＤ値（配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質へのｒｈＦｃ（ガンマ）受容体のそれぞれの結合に比例する）を、各ウェルに添加されたｒｈＦｃ（ガンマ）受容体のそれぞれの対数濃度に対してプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結合曲線を作成する。
図１９に示されるように、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質へのヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩの結合に関するＥＣ５０は、３３．８６ｎｇ／ｍＬである。図２０に示されるように、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質へのヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩＩａの結合に関するＥＣ５０は、２２８２ｎｇ／ｍＬである。図２１に示されるように、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質へのヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩＩｂの結合に関するＥＣ５０は、２０５３ｎｇ／ｍＬである。図２２に示されるように、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質へのヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩＩＩａ Ｆ１７６の結合に関するＥＣ５０は、９５．５４ｎｇ／ｍＬであり、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質へのヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩＩＩａ Ｖ１７６の結合に関するＥＣ５０は、２４．６１ｎｇ／ｍＬであり、そして配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質へのヒトＦｃ（ガンマ）ＲＩＩＩｂの結合に関するＥＣ５０は、１１６７４ｎｇ／ｍＬである。図２３に示されるように、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質へのヒトＡＣＥ２の結合に関するＥＣ５０は、８７．００ｎｇ／ｍＬである。
図２４に示されるように、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質へのヒトＦｃＲｎの結合に関するＥＣ５０は、３９．４６ｎｇ／ｍＬであり、一方でヒトＩｇＧ（対照として使用）へのヒトＦｃＲｎの結合に関するＥＣ５０は、２９．２３ｎｇ／ｍＬである。このことから、配列番号１９を使用したＦｃＲｎ受容体の結合は、ヒトＩｇＧ対照と比較して保存されていることが示唆される。
実施例１７：マウスにおける、アジュバントを含まない配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の有効性に関するインビボスクリーニング
配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例１で合成され、実施例４で精製された。融合タンパク質の構造は、実施例６で非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳにより確認され、融合タンパク質の配列特定は、実施例７でグリカン除去を伴いＬＣ－ＭＳにより確認された。
実施例１２の手順に従い、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスでＮ＝５の８群に、皮下注射を介して配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を、表２に従い、１００μＬの体積でアジュバントを含まず、０．０５μｇ／用量～１００μｇ／用量の用量レベルで、０日目、２１日目および４２日目に投与した。各注射から１４日後および２１日後に顎下腺静脈穿刺によって全てのマウスから非末梢採血を行い、抗ＳＰ／ＲＢＤ Ａｂ力価評価のための血清サンプルを取得した。アジュバントを含まず配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を投与された後に誘導された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応（ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ標準曲線による平均ＩｇＧμｇ／ｍＬ）は、実施例１０で測定され、図２５に示されるように２１日に２回目の投与が行われる直前、および図２６に示されるように３５日目に、投与された用量レベルに対してμｇ単位でプロットされた。
Figure 2023522597000003
データから、１μｇ～１００μｇの用量レベルによって、誘導された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応に顕著な増加が生じたこと、１μｇ、１０μｇ、および１００μｇの用量レベルに対し、３５日目で最も強い反応があったことが示される。１回、２回および３回投与後の１μｇ、３μｇ、１０μｇ、３０μｇ、および１００μｇの配列番号１７の用量レベルに対する動態反応を、図２７に示す。この図では、各投与から１４日後、抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応の測定可能な上昇が認められること、および全ての用量レベルについて、ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応はそれぞれの追加投与が行われることで上昇し続けたことが強調される。
実施例１８：マウスにおける、アジュバントを含まない配列番号２のＳＰ－ＲＢＤの有効性に関するインビボスクリーニング
配列番号２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰ／ＲＢＤ（Ｆｃを含まない）は、市販されていたものを購入し（商品番号４６４３８、Ｌａｋｅ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンマテオ）、これを使用して、配列番号１７のＦｃ含有ＳＰ／ＲＢＤ－Ｆｃタンパク質によるＡｂ反応の強化を比較した。当該タンパク質は実施例１で合成され、実施例４で精製され、実施例６で非還元および還元ＣＥ－ＳＤＳにより構造的に確認され、実施例７でグリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳにより構造特定が確認された。ＳＰ／ＲＢＤ Ａｇのモル量が等しいことに基づき、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質と、配列番号２のＳＰ／ＲＢＤとの間で相対的な用量レベルを標準化した。
実施例１２の手順に従い、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスでＮ＝５匹の群に、１００μＬの体積で、配列番号２のＳＰ／ＲＢＤを５μｇ／用量、１５μｇ／用量、および４０μｇ／用量の用量レベルで、または１００μＬの体積で、アジュバントを含まない配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を、１μｇ／用量、３μｇ／用量、５μｇ／用量、３０μｇ／用量、および１００μｇ／用量の用量レベルで、表３に従い、アジュバントを用いずに０日目、２１日目および４２日目に皮下注射を介して投与した。１つの群のマウスには、生理食塩水対照を投与した。各注射から１４日後および２１日後に顎下腺静脈穿刺によって全てのマウスから非末梢採血を行い、抗ＳＰ／ＲＢＤ Ａｂ力価評価のための血清サンプルを取得した。各用量レベルでの、配列番号２のＳＰ／ＲＢＤ、または配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をアジュバントを用いずに投与された後に誘導された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応（ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ標準曲線による平均ＩｇＧ μｇ／ｍＬ）は、実施例１０により１４日目および２１日目に測定された。結果を図２８に示す。
重要なことは、配列番号１７の二価性に関する式量およびその対価に基づき、配列番号２のＳＰ／ＲＢＤ（２７ｋＤａの単量体）と、配列番号１７のＳＰ／ＲＢＤ（１０４ｋＤａの二量体）の間には約０．５の相対的な「エピトープ用量」の差が存在することである。すなわち、配列番号１７の二価のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、２部分のＳＰ／ＲＢＤエピトープを含んでおり、合計式量は、２つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質単量体のおよそ２倍である（すなわち、それぞれ１０４ｋＤａと５４ｋＤａ）。例えば、配列番号１７の二量体１０μｇは、配列番号１７の単量体約５μｇに相当する。
Figure 2023522597000004
Ｆｃ部分の効果は、１４日目および２１日目の両方で示された。図２８に示されるように、誘導されたＦｃ断片を含む配列番号１７の抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応は、最初の投与から１４日目であってもほぼ最大力価に達した。一方でＦｃ断片を欠くＳＰ／ＲＢＤは、２１日後であっても事実上、抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を誘導しなかった。これら２つの非アジュバント化物質の間での免疫原性の差異から、融合タンパク質ＡｇのＦｃ部分の「内蔵式アジュバント」能力の重要性が示される。
実施例１９：マウスにおける、アジュバントを含む配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の有効性に関するインビボスクリーニング
配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例１で合成され、実施例４で精製された。融合タンパク質の構造は、実施例６で非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳにより確認され、融合タンパク質の配列特定は、実施例７でグリカン除去を伴いＬＣ－ＭＳにより確認された。配列番号２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＰ／ＲＢＤ（Ｆｃを含まない）は、市販品から取得した（商品番号４６４３８、Ｌａｋｅ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンマテオ）。
実施例１２の手順に従い、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスでＮ＝５の群に、表４および表５に示される用量レベルとアジュバントで、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を、および５μｇ／用量の用量レベルで配列番号２のＳＰ／ＲＢＤを、０日目、２１日目および４２日目に投与した。配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質および配列番号２のＳＰ／ＲＢＤを投与された後に誘導された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応（ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ標準曲線による平均ＩｇＧ μｇ／ｍＬ）は、実施例１０により２１日目（図２９に示される）３５日目（図３０に示される）、５６日目（図３１に示される）、および８８日目（図３２に示される）に測定された。
Figure 2023522597000005
Figure 2023522597000006
１０μｇの用量レベルを含む、すべてではないが一部のアジュバント化製剤は、１回（２１日目）、２回（３５日目）および３回目（５６日目）の投与後に免疫原性を約３～５倍まで強化したことから、アジュバント間での広範な有効性が示唆される。特に３回目の投与から３２日後（すなわち８８日目）、全ての製剤で誘導された力価が有意に上昇を維持しており、このことから、最初の注射から３カ月の時点であっても、配列番号１７に対する反応が持続していることが示唆される（図３２）。また、配列番号２（Ｆｃ断片を欠く）が、配列番号１７と比較して２１日目では有効ではなく、３５日目でやや有効であったことから、最初の２回投与後に有意に抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価を誘導するためには、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分が必要である。
実施例２０：マウスにおける、アジュバントを含む、および含まない配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質により誘導されたＡＣＥ２結合阻害効力の有効性に関するインビボ評価
ＡＣＥ２結合阻害効力の有効性に関するインビボ評価は、Ａｇ結合ＥＬＩＳＡにより測定されたワクチン誘導性のＩｇＧ力価が、免疫血清のウイルス中和能力に関連しているかを判定するため、特に内因性ヒト標的タンパク質のＡＣＥ２に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳＰ／ＲＢＤの結合の阻害に関して判定するために実施された。組み換えＡＣＥ２に対する組み換えＳＰ／ＲＢＤの結合を阻害する免疫血清の効力を、ＥＬＩＳＡ形式で実施した。当該ＥＬＩＳＡは、プレートに結合したＳＰ／ＲＢＤと、免疫血清の連続希釈とともに、または伴わずに添加された標識組み換えヒトＡＣＥ２を用いた。
配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の有効性をさらに評価するためのインビボ試験を、実施例１２に記載される一般的な方法に従い６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、メーン州バーハーバー）で実施した。配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例１で合成され、実施例４で精製された。融合タンパク質の構造は、実施例６で非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳにより確認され、融合タンパク質の配列特定は、実施例７でグリカン除去を伴いＬＣ－ＭＳにより確認された。アジュバントを含まない１０μｇ／用量の用量レベルの配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質、および様々なアジュバントを含む１０μｇ／用量の用量レベルの配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を、表６に従い、０日目、２１日目、および４２日目に皮下投与した。
Figure 2023522597000007
顎下腺静脈穿刺法により、各投与から２１日後（および次の投与の前に）各マウスから血液を採取し、凝固させ、マイクロバキュテイナ管を遠心分離することにより血清を分離させ、分注し、実施例１０に記載される方法によるＥＬＩＳＡでの抗体分析を目的として凍結した。実施例１３に記載される血清学的アッセイの結果によって、結合した組み換えヒトＡＣＥ２への組み換えＳＰ／ＲＢＤの結合を阻害する効力が評価された。プールされた血清サンプルの連続希釈を行い、そこから阻害希釈５０％（ＩＤ５０）値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して導出した（すなわち、特定の群の各マウスからの等量の血清を混合して、このプールサンプルを評価した）。ＩＤ５０値は、血清サンプルによってＡＣＥ２結合の５０％が達成される希釈の逆数を表す。ＡＣＥ２ ＳＰ／ＲＢＤ結合の阻害効力は、０日目の単回注射から２１日目で計算されるＩＤ５０として測定された。結果を図３３に示す。０日目および２１日目の注射後、４２日目に計算されたＩＤ５０を、図３４に示す。０日目、２１日目および４２日目の注射後、５６日目に計算されたＩＤ５０を、図３５に示す。８８日目に計算された最後のＩＤ５０を、図３６に示す。
配列番号１７の３回投与で免疫化されたマウスの免疫血清のＩＤ５０値から、阻害効力が、最後の注射から３２日後まで維持されていたという事実が示された（８８日目）（図３６）。さらにＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントは一貫して、各時点で上位の効力を誘導した。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０の結果は特に興味深く、このアジュバントで得られた総ＩｇＧ力価は、他のアジュバント化製剤と比較してもそれほど強力ではなかったことを考慮すると予想外であり、ＩＳＡ ７２０を用いることで、ＩｇＧ分子当たり高い固有効力が誘導されたことが示唆される。これらのデータは、このワクチン開発プログラムに対し、リードアジュバント候補としてＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０を選択することを強くサポートするものである。
実施例２１：老齢マウスにおける、アジュバントを含む、または含まない配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質により誘導されたＡＣＥ２結合阻害効力の最適条件下および現実的条件下での有効性（ＥｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓおよびＥｆｆｉｃａｃｙ）に関するインビボスクリーニング
現在進行中のＣＯＶＩＤ－１９アウトブレイクの間、６０歳を超える人々は、より重症疾患に罹り易く、死亡率が高いことが判明した。ゆえに老齢マウスにおける、ワクチン製剤の免疫反応誘導能力を評価することが重要である。老齢マウスの免疫系は、高齢者の老齢化した免疫系に対する信頼性のあるモデルである。８カ月齢より高齢のマウスでは自然死亡率が高くなるため、およそ１５匹のマウスを各試験群に割り当てた。
アジュバントを含む、または含まない配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の有効性を評価するためのインビボ試験を、実施例１２に記載される一般的な方法に従い８～１０カ月齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、メーン州バーハーバー）で実施した。配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例１で合成され、実施例４で精製された。融合タンパク質の構造は、実施例６で非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳにより確認され、融合タンパク質の配列特定は、実施例７でグリカン除去を伴いＬＣ－ＭＳにより確認された。
８～１０カ月齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスでＮ＝１５の群に、アジュバントを含む、およびアジュバントを含まない配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を、表７に従い、１００μＬの体積で、１０μｇ／用量の用量レベルで、０日目、２１日目および４２日目に皮下投与した。顎下腺静脈穿刺法により、各投与から２１日後（および次の投与の前に）各マウスから血液を採取し、凝固させ、マイクロバキュテイナ管を遠心分離することにより血清を分離させ、分注し、実施例１０に記載される方法によるＥＬＩＳＡでの抗体分析を目的として凍結した。
Figure 2023522597000008
表７に従い、１００μＬの体積で、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を投与された後に誘導された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応（ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ標準曲線による平均ＩｇＧ μｇ／ｍＬ）は、実施例１０で測定されプロットされた。２１日目で測定されたＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を図３７に示す。３５日目で測定されたＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を、図３８に示す。５６日目で測定されたＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を図３９に示す。
１０μｇ／用量の配列番号１７を用いた製剤において、アジュバントはこの免疫原性を強力に増強した。若いマウスにおける免疫原性プロファイルと同様に、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０は、５６日目で、アジュバントを含まず得られたレベルと比較し、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の阻害効力ＩＤ５０を劇的に１７倍まで強化した（実施例１３で測定された）。重要なことは、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質によって誘導されたこの阻害効力は、アジュバントを含んでも含まなくても、ヒト回復期血清を上回ったことである。このことから、当該ＳＰ／ＲＢＤ－Ｆｃワクチンの有望な有効性が示される。ゆえに、配列番号１７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、アジュバントが存在してもしなくても、老齢化した免疫系において、充分な効力をもって抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ力価の免疫原性を維持しており、これによって、高齢者において当該ワクチンを試験することについての強い論理的根拠が提唱される。
実施例２２：マウスにおける、アジュバントを含む、および含まない配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の有効性に関するインビボスクリーニング
ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応における、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の有効性を評価するためのインビボ試験を実施した。配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例３で合成され、実施例５で精製された。融合タンパク質の構造は、実施例６で非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳにより確認され、融合タンパク質の配列特定は、実施例７でグリカン除去を伴いＬＣ－ＭＳにより確認された。
実施例１２の手順に従い、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスでＮ＝５の群に、皮下注射を介して配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を、表８に従い、１００μＬの体積でアジュバントを含み、および含まず、１μｇおよび１０μｇの用量レベルで、０日目、２１日目および４２日目に投与した。
Figure 2023522597000009
顎下腺静脈穿刺法により、各投与から１４日後（すなわち１４日目、３５日目および５６日目）に各マウスから血液を採取し、凝固させ、マイクロバキュテイナ管を遠心分離することにより血清を分離させ、分注し、ＥＬＩＳＡでの分析を目的として凍結した。
誘導されたＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応（ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ標準曲線による平均ＩｇＧ μｇ／ｍＬ）は、１４日目（図４０）、３５日目（図４１）および５６日目（図４２）に実施例１１により測定された。
アジュバントの非存在下でも、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、１および１０μｇの用量レベルで充分なＩｇＧ力価を誘導した。これは実施例１７の配列番号１７の免疫原性プロファイルを一致しており、１回目（１４日目）および２回目（３５日目）の投与後、２つの用量レベル間で顕著な用量応答性が示された。予測されたように、異なるアジュバントで製剤化された配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、アジュバント非存在下のものと比較して、各投与後、充分に高い力価を誘導した（１回目および２回目の投与後、約３～１０倍）。そしてアジュバントのＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０は、各投与後、Ａｄ－Ｖａｘ－２と同様の有効性であり、一方でＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ５１の有効性は低かった。
実施例２３：マウスにおける、アジュバントを含む、および含まない配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質により誘導されるＡＣＥ２結合阻害効力およびプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）の有効性に関するインビボ評価
マウスにおける、アジュバントを含む、および含まない配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質により誘導されるＡＣＥ２結合阻害効力の有効性に関するインビボ評価が実施された。
配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例３で合成され、実施例５で精製された。融合タンパク質の構造は、実施例６で非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳにより確認され、融合タンパク質の配列特定は、実施例７でグリカン除去を伴いＬＣ－ＭＳにより確認された。
実施例１２の手順に従い、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスでＮ＝５の群に、皮下注射を介して配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を、表８に従い、１００μＬの体積でアジュバントを含み、および含まず、１μｇおよび１０μｇの用量レベルで、０日目、２１日目および４２日目に投与した。
顎下腺静脈穿刺法により、各投与から１４日後（すなわち１４日目、３５日目および５６日目）に各マウスから血液を採取し、凝固させ、マイクロバキュテイナ管を遠心分離することにより血清を分離させ、分注し、ＥＬＩＳＡでの分析を目的として凍結した。
実施例１３に記載される血清学的アッセイの結果によって、結合した組み換えヒトＡＣＥ２への組み換えＳＰ／ＲＢＤの結合を阻害する効力が評価された。プールされた血清サンプルの連続希釈を行い、そこから阻害希釈５０％（ＩＤ５０）値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して導出した（すなわち、特定の群の各マウスからの等量の血清を混合して、このプールサンプルを評価した）。ＩＤ５０値は、血清サンプルによってＡＣＥ２結合の５０％が達成される希釈の逆数を表す。ＡＣＥ２ ＳＰ／ＲＢＤ結合の阻害効力は、０日目の単回注射から１４日目で計算されるＩＤ５０として測定されこれを図４３に示す。０日目および２１日目の注射後、３５日目に計算されたＩＤ５０を、図４４に示す。０日目、２１日目および４２日目の注射後、５６日目に計算されたＩＤ５０を図４５に示す。
配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、強力なＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ阻害効力（ＩＤ５０値）を誘導した。この阻害効力は、各投与後で、ヒト回復期血清よりも有意に高かった（図４３、図４４および図４５）。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む製剤において、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、３回目の投与後、最も高い効力を達成したことに留意されたい。ほとんどの場合において、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の用量が高くなると、産生される抗体アフィニティも高くなる。抗体のアフィニティが高くなると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが患者細胞内に侵入することを阻害する可能性も高くなる。予想に反して、実施例１３に記載されるＡＣＥ２結合阻害アッセイの結果から、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む製剤での配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例１１で測定された際には最低レベルの抗ＲＢＤ ＩｇＧ抗体価のうちの１つを誘導したにもかかわらず、すべてのアジュバント製剤のうちで最高レベルの阻害性抗体を産生したことが示された。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントは、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の皮下滞留時間と抗原提示の潜在力を増加させて、最も高いアフィニティのウイルス中和抗体を産生させるのに非常に有益な可能性がある。
プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）は、表８に記載されるようにコホート３およびコホート４を使用して実施例１５で実施された（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、１μｇおよび１０μｇの用量レベルで投与された）。マウス血清サンプル中の誘導されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス中和効力を、図４６に示す。興味深いことに、実施例１２の手順によりＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を用いてマウスを免疫化した場合も、予測された１回投与から２回投与への漸進的な上昇に従い、強いＰＲＮＴ中和効力が示された。最初の投与後の効力は、ヒト回復期血清を下回ったが、２回目の投与後の血清から導かれた効力は、ヒト回復期血清よりもずっと高かった（約１０倍）。この結果を図４６に示す。中和効力は、ＡＣＥ２阻害効力と類似したプロファイルを示した。
実施例２４：マウスにおいて、抗－ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３アイソタイプ力価を誘導する、アジュバントを含む、および含まない配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の有効性に関するインビボスクリーニング
マウスにおいて、アジュバントを含む、および含まない配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質が、抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３アイソタイプ力価を産生する有効性を比較するインビボ試験を実施した。配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例３で合成され、実施例５で精製された。融合タンパク質の構造は、実施例６で非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳにより確認され、融合タンパク質の配列特定は、実施例７でグリカン除去を伴いＬＣ－ＭＳにより確認された。
実施例１２の手順に従い、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）でＮ＝５の群に、皮下注射を介して、アジュバントを含む、または含まない配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を、表９に従い、０日目、２１日目および４２日目に投与した。
Figure 2023522597000010
各注射から１４日後に顎下腺静脈穿刺法により各マウスから血液を採取し、凝固させ、マイクロバキュテイナ管を遠心分離することにより血清を分離させ、分注し、実施例１１に記載される方法によるＥＬＩＳＡでの抗体分析を目的として凍結した。配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、すべてのアジュバントで、顕著なＴｈ１促進性のＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３アイソタイプ力価を誘導した。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０は一貫して、全ての時点で強力な増強を示した（図４８、図４９および図５０を参照）。それに加えて、Ｔｈ２促進性のアイソタイプであるＩｇＧ１力価は、Ｔｈ１関連アイソタイプよりもおよそ１０倍低い力価であった（図４７）。これらの結果から、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントは、配列番号１９とともに送達された際、特にＴｈ１反応への望ましいシフトを促進することによって、強力な増強効果を維持したことが実証される。このことから、投与回数を控えることができるという特徴が支持され、臨床リードアジュバントとしての選択が推奨される。
実施例２５：マウスにおいて、抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧアイソタイプ力価を誘導する、アジュバントを含む、および含まない配列番号２３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の有効性に関するインビボスクリーニング
マウスにおいてヒトＩｇＧ Ｆｃ構築物を使用することで有効性がどのように影響を受け得るかについて解明を試みることにより、ＳＰ／ＲＢＤ－Ｆｃ融合タンパク質ワクチンの免疫原性に対する寄与という点でのＦｃ断片の役割について、さらにマウスで調査した。マウスのＩｇＧ２ａ（配列番号２２）は、ヒトＩｇＧ１の機能性アナログである。
ＥＰＲＧＰＴＩＫＰＣＰＰＣＫＣＰＡＰＮＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＩＫＤＶＬＭＩＳＬＳＰＩＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＬＲＶＶＳＡＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＡＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＳＶＲＡＰＱＶＹＶＬＰＰＰＥＥＥＭＴＫＫＱＶＴＬＴＣＭＶＴＤＦＭＰＥＤＩＹＶＥＷＴＮＮＧＫＴＥＬＮＹＫＮＴＥＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＭＹＳＫＬＲＶＥＫＫＮＷＶＥＲＮＳＹＳＣＳＶＶＨＥＧＬＨＮＨＨＴＴＫＳＦＳＲＴＰＧＫ（配列番号２２）
実験は、ｉ）Ｆｃ種のミスマッチが、ＳＰ／ＲＢＤ－Ｆｃ融合タンパク質の基盤となる免疫原性の原因となり得るかどうか、およびｉｉ）動物モデルにおいてヒトＩｇＧ Ｆｃ構築物から得られた結果が、ヒトでの性能予測に適切であるかどうか、の決定を目的とした。
そこで配列番号５のリンカーを伴う配列番号１４のＳＰ／ＲＢＤと、配列番号２２のマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ断片を含む配列番号２３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を構築した。
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＧＧＧＳＧＧＧＳＥＰＲＧＰＴＩＫＰＣＰＰＣＫＣＰＡＰＮＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＩＫＤＶＬＭＩＳＬＳＰＩＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＬＲＶＶＳＡＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＡＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＳＶＲＡＰＱＶＹＶＬＰＰＰＥＥＥＭＴＫＫＱＶＴＬＴＣＭＶＴＤＦＭＰＥＤＩＹＶＥＷＴＮＮＧＫＴＥＬＮＹＫＮＴＥＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＭＹＳＫＬＲＶＥＫＫＮＷＶＥＲＮＳＹＳＣＳＶＶＨＥＧＬＨＮＨＨＴＴＫＳＦＳＲＴＰＧＫ（配列番号２３）
配列番号２３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質がＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧアイソタイプ力価反応を生じさせる有効性と、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質がＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧアイソタイプ力価反応を生じさせる有効性、および配列番号２のＳＰ／ＲＢＤがＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧアイソタイプ力価反応を生じさせる有効性とを比較するインビボ試験を実施した。
配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例２で合成され、実施例５で精製された。融合タンパク質の構造は、実施例６で非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳにより確認され、融合タンパク質の配列特定は、実施例７でグリカン除去を伴いＬＣ－ＭＳにより確認された。配列番号２３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、市販品から取得した（カタログ番号ＳＰＤ－Ｃ５２５９、ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、デラウェア州ニューアーク）。配列番号２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＳＰ／ＲＢＤ）（Ｆｃを含まない）は、市販品から取得した（商品番号４６４３８、Ｌａｋｅ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンマテオ）。
実施例１２の手順に従い、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）でＮ＝５の群に、皮下注射を介して、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質、配列番号２３のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質、または配列番号２のＳＰ／ＲＢＤを、表１０に記載される用量レベルに従い、０日目および２１日目に投与した。
Figure 2023522597000011
各注射から１４日後に顎下腺静脈穿刺法により各マウスから血液を採取し、凝固させ、マイクロバキュテイナ管を遠心分離することにより血清を分離させ、分注し、実施例１１に記載される方法によるＥＬＩＳＡでの抗体分析、および実施例１３に記載される方法によるＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力による抗体分析を目的として凍結した。
配列番号１９、およびマウスＩｇＧ２ａを備えたマウスＦｃを含有する配列番号２３を、アジュバントを含まずに用いて免疫化したところ（表１０のコホート１、２、５および６）、最初の投与または２回目の投与から１４日後のＩｇＧ力価の誘導に有意な差は示されなかった（１４日目は図５１に示され、３５日目は図５２に示される）。このことから、ＢＡＬＢ／ｃマウス免疫原性モデルにおいて、ヒトＦｃ抗原性配列は、天然型マウスＦｃ配列と何も変わらず機能することが実証された。配列番号１７を使用して得られた結果と同様に、Ｆｃ断片を含まない配列番号２（表１０のコホート９および１０）は、アジュバント非存在下で、配列番号２３または配列番号１９と比較して、１回目の投与および２回目の投与の後に免疫原性を示さなかった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質（配列番号２３）のマウス型が、マウスにおいて、そのままのＳＰ／ＲＢＤタンパク質（配列番号２）と比較して免疫原性の強化を示したことを考慮すると、ヒト型は、ヒトにおいて、免疫原性の強化を示す可能性が高い。
配列番号１９、およびマウスＩｇＧ２ａを備えたマウスＦｃを含有する配列番号２３を、アジュバントとともに用いて免疫化したところ（表１０のコホート３、４、７および８）、最初の投与または２回目の投与から１４日後のＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力において有意な差は示されなかった（１４日目は図５３に示され、３５日目は図５４に示される）。このことから、ＢＡＬＢ／ｃマウス免疫原性モデルにおいて、ヒトＦｃ抗原性配列は、天然型マウスＦｃ配列と何も変わらず機能することが実証された。配列番号１９と配列番号２３の両方ともが、たった１回の投与後であっても、ヒト回復期血清（ＨＣＳ）よりも高いＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力を示した。配列番号１７を使用して得られた結果と同様に、Ｆｃ断片を含まない配列番号２は、アジュバント非存在下であっても、配列番号２３または配列番号１９と比較して、１回目の投与および２回目の投与の後のＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害に関してそれほど効果が無かった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質（配列番号２３）のマウス型が、マウスにおいて、そのままのＳＰ／ＲＢＤタンパク質（配列番号２）と比較して免疫原性の強化を示したことを考慮すると、ヒト型は、ヒトにおいて、免疫原性の強化を示す可能性が高い。
実施例２６：マウスにおける、保管後のＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の有効性に関するインビボスクリーニング
新たに作製されたＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０を含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質エマルションのＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応を生じさせる有効性と、調製後、１日間および７日間、４℃および２５℃で保管された同エマルションの有効性とを比較したインビボ試験が実施された。配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例３で合成され、実施例５で精製された。融合タンパク質の構造は、実施例６で非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳにより確認され、融合タンパク質の配列特定は、実施例７でグリカン除去を伴いＬＣ－ＭＳにより確認された。
実施例１２の手順に従い、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、メーン州バーハーバー）でＮ＝５の群に、皮下注射を介して、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバント ３０％／７０％ ｖ／ｖと新たに混合された、または４℃および２５℃で１日間もしくは７日間保管された後に混合された配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を、１０μｇの用量レベルで投与した。
注射から１４日後に顎下腺静脈穿刺法により各マウスから血液を採取し、凝固させ、マイクロバキュテイナ管を遠心分離することにより血清を分離させ、分注し、実施例１３に記載される方法によるＥＬＩＳＡでの抗体分析を目的として凍結した。
実施例１３に記載されるＡＣＥ２結合阻害アッセイの結果から、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、１日間および７日間、４℃および２５℃で保管されたエマルションの注射後と、新たに作製されたエマルションの注射後とを比較しても、マウスにおいて同様の阻害効力を誘導した。図５５に示されるように、新たに作製されたエマルションを注射された動物と、古くなったエマルションのいずれかを注射された動物との間で、ＩＤ５０値に有意差は無かった（ｐ＞０．０５）。
実施例２７：非ヒト霊長類（ＮＨＰ、すなわちカニクイザル）における、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む配列番号１９により誘導されたＡＣＥ２－結合阻害効力に関する、予備的投与の最適条件下および現実的条件下での有効性（ＥｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓおよびＥｆｆｉｃａｃｙ）
マウスから得られたヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質の免疫原性に関する知見を、ヒト臨床試験へと転換するために、アジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０）を含み、または含まずに製剤化された配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を、より遺伝的に関連性のあるＮＨＰ種であるカニクイザルにおいて試験した。カニクイザルのＩｇＧ１－Ｆｃ領域配列はヒトＩｇＧ１－Ｆｃ配列と非常に類似しており、カニクイザルのＩｇＧエフェクター機能とヒトＩｇＧ１は実際にカニクイザルにおいて活性があったが、いくらかの効力の低下があった。ゆえに、ヒトＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質を用いてカニクイザルで得られた効力に関する結果は、ヒトにおける当該ヒトＩｇＧ１－Ｆｃ融合タンパク質の性能を若干下方に予測する可能性がある。最後に、カニクイザルでの結果の転換可能性は、配列番号１９のヒトＩｇＧ Ｆｃ断片が、ヒトＦｃＲ受容体およびヒトＦｃＲｎ受容体で得られる効力と同程度の効力で、カニクイザルのＦｃＲおよびＦｃＲｎホモログに結合できることが実証されたことによって確認された。様々な濃度のＨｉｓタグ付けヒトＦｃＲおよびカニクイザルＦｃＲホモログ分子を、プラスチックに結合した配列番号１９に添加した。非結合分子を洗い流した後、標識抗Ｈｉｓ二次抗体を用いて結合分子を検出し、発色させ、吸光度（ＯＤ４５０）を分光光度計で決定した。図５６、図５７、図５８および図５９に示されるように、カニクイザルでの結果の転換可能性は、配列番号１９のヒトＩｇＧ Ｆｃ断片が、ヒトＦｃＲ受容体およびヒトＦｃＲｎ受容体で得られる効力と同程度の効力で、カニクイザルのＦｃＲおよびＦｃＲｎホモログに結合できることが実証されたことによって確認され、これによりＮＨＰモデルの臨床的関連性が確立された。
配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例２または実施例３で合成され、実施例５で精製された。融合タンパク質の構造は、実施例６で非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳにより確認され、融合タンパク質の配列特定は、実施例７でグリカン除去を伴いＬＣ－ＭＳにより確認された。
オスおよびメスのカニクイザルのＮ＝３の群に、単回皮下注射を介して、表１１に従い０日目および２１日目に、３０％／７０％（ｖ／ｖ）の配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質とＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを皮下投与した。６匹のサルのうち５匹が、２回目の注射からおよそ３か月～４か月半の間に、３０％／７０％（ｖ／ｖ）の配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質とＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントのブースター注射を投与された。
Figure 2023522597000012
各ＮＨＰから血液を採取し、凝固させ、マイクロバキュテイナ管を遠心分離することにより血清を分離させ、分注して、実施例１１に記載される方法によるＥＬＩＳＡで抗体分析することを目的に凍結する。
１０μｇおよび３０μｇの用量レベルのＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントとともに製剤化された配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質により誘導された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応（ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ参照血清標準曲線からの平均ＩｇＧ μｇ／ｍＬ）は、実施例１１により、１回投与後の０日目、１回投与後の１４日目、１回投与後の２０日目、２回投与後の３５日目、２回投与後の４２日目に測定された。これにより、ＩｇＧ Ａｂ力価が強く誘導されたことが明らかとなり、図６０に示されるように、０日目および２１日目の投与後の全ての時点で、３０μｇの高用量レベルは、１０μｇの低用量レベルより高い免疫原性を示した。
抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価が低下した後、１０２日目または１５４日目のいずれかでブースター（３回目）投与を受けた動物について、単回ブースター投与後に誘導された抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価反応は、図６１に示されるように顕著であり、強いメモリーリコールが示唆される。
さらにこれらＩｇＧ Ａｂ力価の免疫原性プロファイルは、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質により誘導され、実施例１３で測定されたＡＣＥ２－結合阻害効力（ＩＤ５０）と合致し、図６１に示されるようにヒト回復期血清の効力を上回っていた。ＩＤ５０値は、血清サンプルによってＡＣＥ２結合の５０％が実現される希釈の逆数を表しており、１０μｇおよび１００μｇの両方の用量レベルに対し、１回投与後の２１日目、２回投与後の４２日目に計算された。
実施例２８：非ヒト霊長類（ＮＨＰ、すなわちカニクイザル）における、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む配列番号１９の、組み換えＡＣＥ２とＳＰ／ＲＢＤの生化学的相互作用を妨害する阻害効力を確認するためのプラーク減少中和試験
かかるトランスレーショナルリサーチの促進において、組み換えＡＣＥ２とＳＰ／ＲＢＤの生化学的相互作用を妨害する当該阻害効力は、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）において、ＶＥＲＯ－Ｅ６生細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生ウイルスが感染することを中和することで確認された。
オスおよびメスのカニクイザルのＮ＝３の群に、表１１に従い０日目および２１日目に、３０％／７０％（ｖ／ｖ）の配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質とＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを皮下投与した。各ＮＨＰから血液を採取し、凝固させ、マイクロバキュテイナ管を遠心分離することにより血清を分離させ、分注して分析用に凍結した。
プラーク減少中和試験は、実施例１５で実施された。ＮＨＰ血清サンプルにおいて配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質が誘導したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス中和効力を、図６２に示す。中和効力は、ＡＣＥ２阻害効力と類似したプロファイルを示したが、ＰＲＮＴ ＩＤ５０値は、ヒト回復期血清の値と類似していた。
これらの結果から、ＮＨＰでワクチン接種を試験することの意義が実証され、ヒトで行う初めての臨床試験の設計に価値あるガイダンスを提供し、およびヒトへのトランスレーションに期待が持てる。
実施例２９：マウスおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ、すなわちカニクイザル）における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＵＫバリアント（Ｎ５０１Ｙ）および南アフリカバリアント（Ｅ４８４Ｋ）に対する、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質ワクチンの有効性
Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのバリアント、特にＵＫウイルスバリアントと南アフリカウイルスバリアントに対しても有効であるかを解明する試みで分析が行われた。
図６６は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して実施された、配列番号２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然型ＳＰ／ＲＢＤと、ＵＫ Ｎ５０１ＹウイルスバリアントのＳＰ／ＲＢＤアナログ断片（配列番号２４）と、南アフリカＥ４８４ＫウイルスバリアントのＳＰ／ＲＢＤアナログ断片（配列番号２５）とを並べて比較したものを示す。「＊」は、所与の配列位置での全配列にわたる完全な相同を表す。「：」（コロン）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリクスで０．５よりも大きいスコアを有する非常に類似した特性を有する群間で保存されていることを示す。「－」（ダッシュ）は、配列のギャップを示しており、これは特定の配列範囲内の比較の特定の組み合わせ内に、局所的な相同が存在しないことを意味する。
ＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＹＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥ（配列番号２４）
ＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＫＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥ（配列番号２５）
実施例２７で投与されたＮＨＰの血清サンプルは、動物１、２、３、５および６から４２日目に抽出された。実施例２２で投与されたマウスの血清サンプルは、５６日目に抽出された。ＮＨＰとマウスの両方とも、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質ワクチンを２回投与して免疫化された。
血清サンプルを、プラスチックに結合した組み換えＲＢＤ野生型（Ｌａｋｅ Ｐｈａｒｍａ社、カリフォルニア州サンマテオ）または変異体Ｎ５０１Ｙ（ＵＫバリアント、ＳＩＮＯ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、ペンシルバニア州ウェーンから提供）または変異体Ｅ４８４Ｋ（南アフリカバリアント、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、デラウェア州ニューアークから提供）に添加した。結合したＲＢＤ特異的ＩｇＧは、標識抗ＮＨＰ二次抗体または抗マウスＩｇＧ二次抗体で検出され、発色された（ＯＤ４５０値）。ＩｇＧ μｇ／ｍＬの力価は、ＮＨＰまたはマウスのＥＬＩＳＡ参照血清標準曲線より決定され、平均（Ｎ＝４）が報告された。
図６４および図６５に示される結果から、ＮＨＰおよびマウスの免疫血清は、野生型ＲＢＤ分子と同様に、またはそれ以上に、組み換えＲＢＤ変異体のＮ５０１ＹとＥ４８４Ｋに結合したことが示される。このことから、ＵＫ（Ｎ５０１Ｙ）および南アフリカ（Ｅ４８４Ｋ）のウイルスバリアントが、配列番号１９誘導性の免疫を回避する可能性は低いことが示唆される。
配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の毒性試験の結果を示す実施例
実施例３０：ニュージーランド白ウサギにおける、２週間の回復期間を伴う、配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ 融合タンパク質ワクチンの反復投与毒性試験
ニュージーランド白ウサギを使用したＩＮＤ－ｅｎａｂｌｉｎｇ毒性試験が実施された。ウサギは、安定的なＡｂ反応を生じさせ、ワクチン誘導型の免疫原性の前臨床試験に広く使用されている種であり、これを選択した。さらにウサギは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの受容体であるＡＣＥ２を発現しているため、ウイルスはこれに結合し、ウサギに感染して、ヒトＣＯＶＩＤ－１９に類似した疾患症状を発生させることができる。ワクチン抗原性サブユニットは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ分子に融合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質のＡＣＥ２受容体結合ドメインであり、ウサギにおいてＡＣＥ２（肺、上皮、ニューロンに発現）に直接結合し、病態を生じさせ得る。
Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む、または含まない配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の安全性、毒性、トキシコキネティクスおよび免疫原性のプロファイルは、１４日ごとに皮下注射され、合計で３回注射されたワクチン製剤を使用して評価され、１４日間の無処置回復期間中の何らかの毒性兆候に関する可逆性も評価された。積極的な１４日間の注射スケジュールは、ヒト臨床試験で行われるやや積極性の劣る２８日環の注射スケジュールを動物毒性試験によって確実に充分にサポートするためである。試験のエンドポイントには、臨床観察、体重増加／減少、食物消費、臨床病理および最終的な全身剖検、臓器重量、ならびに組織病理が含まれる。
配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、実施例３で合成され、実施例５で精製された。融合タンパク質の構造は、実施例６で非還元ＣＥ－ＳＤＳおよび還元ＣＥ－ＳＤＳにより確認され、融合タンパク質の配列特定は、実施例７でグリカン除去を伴いＬＣ－ＭＳにより確認された。
試験対象は、３～４カ月齢で体重２～４ｋｇ、未感作で、特定病原体未感染のオスおよびメスのニュージーランド白ウサギである。ウサギはステンレススチールのモバイルケージ中で、単独で、または群で飼育され、投与前に１４日間の馴化期間を置いた。
主要試験治療群１つ当たり５匹のオスと５匹のメスのウサギとし、回復治療群１つ当たり３匹のオスと３匹のメスのウサギとした。それら群にＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含み、またはアジュバントを含まずに製剤化された配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を３０μｇまたは１００μｇのいずれかの用量で、またはビヒクル陰性対照（生理食塩水）を投与した。回復群は、処置期間中に観察された何らかの有害作用の可逆性を調査するため、および何らかの可能性のある遅延型有害作用をスクリーニングするために含められた。ウサギにおける反復投与毒性試験に関する具体的な詳細を表１２に示す。
Figure 2023522597000013
配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の標的産物プロファイルには、ヒトにおける２回以下の免疫化注射が含まれており、ゆえに「臨床投与＋１」戦略が使用された。この場合において３つのワクチン用量が、１日目、１５日目および２９日目に皮下投与された（１５日目および２９日目のトキシコキネティクス注射は、それぞれ１日目および１５日目の注射から誘導された抗ＳＰ／ＲＢＤ力価の存在下であるように設計されている）。ｓ．ｃ．経路およびｉ．ｍ．経路の両方の投与経路が評価された。
実施例３１：ウサギでのＧＬＰ毒性試験における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の血清レベル、抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧの血清レベル、ならびに観測的および定量的な安全性評価
ＰＫ／ＴＫアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）であり、ウサギ血清試験サンプル中に存在する配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を、マイクロタイターウェル上にコーティングされたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）によって捕捉して、次いで抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃビオチンコンジュゲートにより定量化するものである。次いでコンジュゲートは高感度のストレプトアビジン－ＨＲＰ検出抗体と反応して、続いてＴＭＢ基質システムが行われる。アッセイの標準曲線作成、およびアッセイ対照の作製に、精製された配列番号１９を使用する。精製された配列番号１９のストック溶液を正常なウサギ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ社）に添加することによって、４つのＱＣ（高ＱＣ、中ＱＣ、低ＱＣ、および陰性ＱＣ）が１０倍で調製され、複数回の実験で試験されて公称値が確立される。少量の分注物として－２０℃で凍結保存され、単回の溶解で使用される。これらのＱＣは、バリデーションアッセイにおいて添加バリデーションサンプルとして使用され、正確性、精度、定量限界、希釈の線形性、添加回収、および短期安定性が評価された。
プレバリデーションが行われる間、最低限必要とされる希釈（ＭＲＤ）である１：１０は、このＥＬＩＳＡの最適値として決定されたものであり、バリデーション実行にあたりこの希釈が使用された。したがって１０％の正常ウサギ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ社、Ｈ２Ｏで再構成される凍結乾燥正常ウサギ血清）が希釈緩衝液に添加され、一次バリデーション実行中に標準曲線が作成された。実際の正常ウサギ血清（ＢｉｏＩＶＴ社）で添加回収が試験された際、正常ウサギ血清では見られないマトリクス効果が原因で、添加値を大幅に下回る回収値が観察された。
これらの結果に基づき、非臨床ウサギ血清サンプルにおける配列番号１９の回収をより良く表すためには、正常ウサギ血清ではなくプールされたウサギ血清を標準曲線の作成に使用すべきだと決定した。例えば正確性および精度、線形性ならびに添加回収などの選択パラメーターは、標準曲線緩衝液中、１０％のプールされた正常ウサギ血清（ＢｉｏＩＶＴ社）を使用して再試験された。
プールされた血清の標準曲線を使用した際の、アッセイ内およびアッセイ間の正確性は、ゼロ以外の３つすべてのＱＣレベルで９３～１０５％の範囲であった。２ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬでアッセイは線形性であることが判明した。これらの値はそれぞれ定量下限（ＬＬＯＱ）および定量上限（ＵＬＯＱ）であることが判明した。プールされた血清の標準曲線を使用した際の添加回収は、１１個の異なる血清サンプル間で非常に正確であり、回収は高添加レベル（７０ｎｇ／ｍＬ）で１００～１１７％の範囲、中添加レベル（４０ｎｇ／ｍＬ）で１０７～１１６％の範囲、低添加レベル（１０ｎｇ／ｍＬ）で１０８～１２３％の範囲であった。添加血清サンプルは、少なくとも３回の凍結融解サイクル（９５～１０３％の回収）、４℃で最大で１週間（９７～１００％の回収）、および室温で４時間（９１～９８％の回収）を通じて安定的であることが判明した。バリデーションの結果から、配列番号１９のＰＫ／ＴＫ ＥＬＩＳＡは、正確性が高く、再現性があり、目的に適合していることが示された。
４時点のＴＫ試験が実施された。この試験において、１回目、２回目および３回目の注射の前、６時間後、２４時間後、および４８時間後に同じ動物が採血された。適切な量の血液が各採血で取得され、免疫原性分析に加えてＴＫ分析でも各血液が使用された。
１回目の投与前、および１回目と最後の投与から約２～３日後、主要試験の取り下げ時、および回復群の取り下げ時にリンパ節をドレーンし、血液検査と血清化学検査を行うことによって、免疫系に対する全身作用が評価された。検査には絶対的および相対的な白血球（ＷＢＣ）百分率（リンパ球、単球、顆粒球、異常細胞）、アルブミン／グロブリン比、酵素ならびに電解質が含まれた。血清サンプルは、ワクチン特異的なＡｂ力価とＴＫ値に関して評価された。
毎日の臨床観察には、注射後最大３日間、およびその後週１回の注射部位の局所的炎症反応の検査が含まれた（かかる観察には、腫脹、触ることに対する疼痛反応、運動障害、および肉芽腫性結節が含まれた）。健康状態に関する毎日の観察（嗜眠状態、動かない、歩行困難、食べないなど）も実施された。毎週の体重、および食物消費（食欲無し、食欲不振）も試験終了時、およそ１２時間の絶食期間後に監視され、評価された。
試験終了時、血液サンプルが採取され、血清化学検査、血液検査および免疫学的調査が行われ、その際、完全全身剖検が実施されて、肉眼的病変および臓器重量が検査された。組織病理検査が実施され、免疫臓器（局所リンパ節および遠位リンパ節の両方、脾臓、骨髄およびパイエル板）、中枢臓器（肺、肝臓、腎臓、脳、および生殖器）およびワクチン投与部位に特に注意が払われた。局所毒性（ワクチン投与部位）評価には、炎症反応（例えば軟性肉芽腫用結節、硬性線維性結節、潰瘍など）の評価、部位切除と組織病理検査の実施が含まれた。肺組織中の好酸球増多が特に評価された。
表１２に従い、用量が策定され、調製された。投与部位はローテーションされた。投与前に毛を刈られ、消えないマーカーで印をつけられた。１日目、１５日目および２９日目にウサギに皮下投与した。ウサギには各投与の前および１時間後、ならびに１日２回を毎日および毎週で、詳細な臨床観察が行われた。注射部位の炎症を評価するためのドレイズ（Ｄｒａｉｚｅ）スコアリングが、各投与後２４時間、４８時間および７２時間で実施された。投与後７２時間でゼロではないスコアがあった場合、当該所見が解消するまで、または動物が安楽死されるまで、７日ごとに当該部位がスコアリングされた。
各投与前、および各投与後６時間および２４時間で体温が測定された。体温が４０℃を超えた場合、値が正常に戻るまで、または動物が安楽死されるまで２４時間ごとに追加測定が行われた。最初の投与前、最初の投与後２４時間および４８時間、毎週、および予定された各剖検の前で体重が記録された。ウサギは馴化期間中に１回、その後は１日２回、死亡率について検査された。食物消費は、毎日定量的に測定された。眼科検査は１回目の投与前に１回、および予定された各剖検前に１回行われた。
臨床化学検査および血液検査は、最初の投与前に１回、最初の投与と最後の投与から４８時間後、主要試験群の剖検時に全ての動物に対して、および回復期間終了時に残りの動物に対して行われた。凝固検査は、最初の投与前に１回、各投与から３日後、主要試験群の剖検時に全ての動物に対して、および回復期間終了時に残りの動物に対して行われた。
Ｃ反応性タンパク質検査のために、１回目の投与前に１回、各投与から３日後に全ての動物、主要試験群の剖検時に全ての動物、および回復期間終了時に残りの動物から血液が採取された。ＥＬＩＳＡを介したＡＤＡのために、最初の投与前、および各投与から１４日後（最後の投与時は除く）に全ての動物、主要試験群の剖検時に全ての動物、および回復期間終了時に残りの動物から血液が採取された。試験中の各動物に対し、４点トキシコキネティクス（ＴＫ）血液サンプリングが、１回目、２回目および３回目の投与時に行われた。すなわち、１日目の投与前、ならびに各投与から６時間後、２４時間後および４８時間後に血液採取され、次いで主要試験群については３６日目の取り下げ時、および回復動物群については４３日目に１回の追加サンプリングが行われた。配列番号１９の血清濃度分析は、ＥＬＩＳＡで行われた。
３６日目（主要試験群）および４３日目（回復群）に対する完全剖検は、予定された各解剖時に全ての動物に対する全組織採取と標準臓器重量測定をもって行われた。組織病理検査は、スライド加工された組織で行われ、すべての主要試験動物および回復試験動物、ならびに任意の死亡が確認された動物および非常時に安楽死された動物に対して評価された。
毒性試験の結果として死亡した個体はなかった。投与フェーズの間、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０とともに１００μｇの配列番号１９を与えられたオスにおいて投与フェーズの４日目から、およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０とともに３０μｇまたは１００μｇの配列番号１９を与えられたオスにおいて投与フェーズの３２日目から、およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０とともに１００μｇの配列番号１９を与えられたメスにおいて投与フェーズの１８日目から、およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０とともに３０μｇまたは１００μｇの配列番号１９を与えられたメスにおいて投与フェーズの３２日目からフィブリノーゲンの増加が概して統計的に有意であり、これは被験物質に関連している可能性が高く、慢性活性炎症の顕微鏡所見とも関連する可能性が高かった。回復期間中のフィブリノーゲンにおける差異は、回復とみなされた。メスにおいてフィブリノーゲンにおける統計的有意差があったが、馴化値と同等であり、被験物質との関連性は無い可能性が高く、生物学的変動が原因とみなされた。予定された採取時に他の被験物質関連の臨床病理的変化はなかった。
オスにおいてのみ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、カルシウム、乳酸デヒドロゲナーゼ、カリウム、塩化物、リンパ球割合、活性化部分トロンボプラスチン時間において統計的有意差があり、およびメスにおいてのみナトリウムに統計的有意差があったが、生物学的変動が原因で、被験物質には関連性が無いとみなされた。オスおよびメスでのグルコース、グロブリン、またはアルブミン／グロブリン比、ヘテロフィルおよびヘテロフィル割合、プロトロンビン時間における統計的有意差は、馴化値と同等であるか、またはセッション間で不一致であった。これらの差異は小さく、オスでは存在していないか、または馴化時の値と同等であり、被験物質とは関連性がなく、生物学的変動が原因とみなされた。主要試験終了時または回復期間終了時に臓器重量の差はなかった。小さな差異は統計的に有意ではなく、投与には無関係であるか、または性別間で不一致であり、被験物質の投与とは関連性が無いとみなされた。
トキシコキネティクス（ＴＫ）試験において、ウサギにおいて配列番号１９によって誘導されたＳＰ／ＲＢＤ Ａｇ特異的な抗薬剤抗体（ＡＤＡ）ＩｇＧ力価が測定された。ウサギをＮ＝１０匹の動物／群に分け、ＰＢＳビヒクル（群１）、３０μｇの配列番号１９（群２）、１００μｇの配列番号１９（群３）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０を含む３０μｇの配列番号１９（群４）、またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０を含む１００μｇの配列番号１９（群５）を１４日間あけて３回投与を受けた。血清サンプルは、指定された時間の後に採取され、実施例１４に従い抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ Ａｂ力価（ウサギＩｇＧ標準曲線を使用したＥＬＩＳＡによる平均ＩｇＧ μｇ／ｍＬ）を評価した。
アジュバントを含まない配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ（図６８および図６９に示される群２および３）は、全ての時点で無視できるほどに弱い抗ＳＰ／ＲＢＤ特異的ＩｇＧ力価を示し、その範囲は、ビヒクル対照群１の力価範囲（図６７に示される）であり、すなわち１０μｇ／ｍＬを下回っていた。しかしＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントの存在下では、３０μｇおよび１００μｇ（それぞれ群４および群５）の配列番号１９の用量で、１回目の注射後（１５日目）、２回目の注射後（２９日目）および３回目の注射後（４３日目）、顕著な特異的ＩｇＧ力価が誘導された。その力価は、図７０および図７１に示されるように、２回目および３回目の投与後、ヒト回復期血清を上回っていた（約１０倍）。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質で処置された群４および群５において、３０μｇと１００μｇの用量レベルの間に、若干（統計的に有意ではない）の用量応答性が存在した。
実施例３２：ウサギにおける、ＧＬＰ毒性試験から収集されたウサギ血清サンプルの機能的阻害効力の結果
ＴＫおよびＡＤＡの主要エンドポイントに使用された血清サンプルは、指定された時点の後に収集され、（実施例１３の方法により）ＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合を阻害する効力（ＩＤ５０値）、および実施例１５の方法によりプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生ウイルスがＶＥＲＯ－Ｅ６細胞に感染することを阻害する効力が評価された。実施例３１に記載されるように、Ｎ＝１０匹の動物／群に、１４日間をあけて、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む３０μｇの配列番号１９（群４）、またはＩＳＡ ７２０を含む１００μｇの配列番号１９（群５）を２回投与した。望ましい配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質ワクチンは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む製剤を含むため、群４と群５のみを、２つの機能性アッセイで評価した。ＩＤ５０値は、血清サンプルによって５０％のアッセイシグナルが達成される希釈の逆数を表す。
実施例１３のＡＣＥ２阻害アッセイにおいて、３０μｇと１００μｇの用量レベルの間に阻害効力において明白な用量応答性が存在した。効力は図７２に示されるように上昇し、２回目の投与から１４日後には同等であった。両時点でのこれら効力値は、ヒト回復期血清で得られた値を実質的に超えていた。生ウイルスが細胞に感染することを阻害する能力を評価したところ、図７３に示されるように３０μｇと１００μｇの両方の用量レベルで強い効力が実証された。２回目の投与後（すなわち３５日目）には効力はより高くなる傾向があり、ヒト回復期血清の効力と同等であったことが示された。これらの結果から、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０中で乳化された配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質は、このＧＬＰ毒性試験において、ＣＯＶＩＤ－１９感染から回復したヒトにおいて見出されるレベルの機能的免疫原性を誘導することが示された。このことから、これらの毒性試験結果を、公平な安全性プロファイルの見込みが求められる臨床へとあてはめた。
実施例３３：皮下経路の毒性試験結果を筋肉内経路にブリッジングするためのニュージーランド白ウサギにおける配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の反復投与毒性試験
認可を受けたワクチンの大部分は、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射により投与されているが、一部は皮下（ｓ．ｃ．）または皮内（ｉ．ｄ．）での使用で承認を受けている。その主な理由は、ｓ．ｃ．とｉ．ｄ．は、より多数のＡＣＥを含有する部位であり、ｉ．ｍ．経路よりも効率的にワクチンＡｇを流入領域リンパ節へと送達するすることができるという論理的根拠である。筋肉内投与は、実施するのが容易であり、概して忍容性良好であり、注射部位の有害反応のリスクが低いという理由で、好まれる場合が多い。しかし筋肉と比較して高い免疫能力を有する部位としての皮膚へのワクチン送達は、ワクチン反応を増幅させるための戦略として長い間検討されてきた。例えば黄熱やインフルエンザウイルスワクチンなどの一部の例では、ｓ．ｃ．注射はｉ．ｍ．注射よりも優れており、健康な個体、特に非レスポンダーや低レスポンダーにおいて免疫原性の向上をもたらした。例として、ｓ．ｃ．でのワクチン接種は、（ｉ．ｍ．と比較して）注射部位でのＡＰＣ活性化がより効率的であり、それに伴い、一過性の高レベルなワクチン特異的Ｔ細胞応答やＡｂ力価が発生した。しかし概して、ｓ．ｃ．経路とｉ．ｍ．経路で免疫原性に差異が生じるリスクはほとんどないようであり、例えばＢ型肝炎ウイルスやＡ型肝炎ウイルス、帯状疱疹ウイルス、インフルエンザ、ジフテリア毒素、麻疹、おたふく風邪、風疹よおび水痘、ならびにダニ媒介性脳炎など、いくつかの承認済みワクチンを用いた比較臨床試験において実証されている。それでもなお、ｉ．ｍ．ワクチン接種個体と比較して、ｓ．ｃ．は軽度の注射部位有害事象の発生率が若干上昇するようであり、そのため、望ましい送達経路としてｉ．ｍ．ワクチン接種が勧められる。
実施例３２で使用されたものと同じ試験設計および汎用プロトコルの下で、ニュージーランド白ウサギを試験に利用した。試験設計を表１３および表１４に記載する。オス（Ｎ＝５）およびメス（Ｎ＝５）のウサギにおいて、１日目、１５日目および２９日目にｓ．ｃ．またはｉ．ｍ．のいずれかで投与されるＩＳＡ ７２０アジュバント中で乳化された１００μｇの用量の配列番号１９（１００）を用いて、ＡＣＥ２結合を阻害する抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ力価（実施例１４に従い測定）を誘導し、血清を、０日目、１５日目（２回目投与の前）、２９日目（３回目投与の前）および３６日目に採取して、実施例１３に従い結合阻害分析を測定した。ＩＤ５０値は、血清サンプルによってＡＣＥ２結合の５０％が達成される希釈の逆数を表す。
分析を行ったところ、測定日のいずれでもＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０中での１００μｇ用量の配列番号１９は、ｓ．ｃ．投与およびｉ．ｍ．投与の間で、ＩｇＧ力価もＡＣＥ２阻害効力も統計的有意差は示されず（図７４および図７５）、このことから、臨床試験においていずれか投与経路の評価を行うことが支持される。
Figure 2023522597000014
Figure 2023522597000015
実施例３４：アジュバントを用いて新たに作製されたエマルションと古くなったエマルションの効果を分析するためのニュージーランド白ウサギにおける配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質の下位群分析
ウサギでのＧＬＰ反復投与毒性試験（実施例３０）において、非常に多くの動物に投与しなければならないというロジスティクスに起因して、半数の動物（オスウサギ）には当日にＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０エマルションを調製して配列番号１９を投与した（Ｔ＝０）。もう半分の動物（メスウサギ）には、２～８℃でエマルションを保管して２４時間後に投与した（Ｔ＝２４）。したがって、１５日目（１回投与後）、２９日目（２回投与後）および３６日目（３回投与後）に測定されたＡＣＥ２－ＳＰ／ＲＢＤ結合阻害効力（ＩＤ５０）の結果（実施例１３により測定）に対して下位群解析を行って、新たに作製されたエマルションと、保管されたエマルションとの間に、何らかの性能の差異があるかどうかを判定することが可能であった。マウス免疫原性試験（実施例２６）に関して上述された結果と同じように、新たなエマルションと保管後エマルションとの間に阻害効力において統計的な差異はなかった。このことから、アジュバント化配列番号１９製剤の性能は、図７６（皮下投与）および図７７（筋肉内投与）で示されるように、調製後少なくとも２４時間は安定であることが示唆される。
Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質ワクチンで免疫化されたＮＨＰに対する、ＮＨＰ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジモデルにおける有効性試験の実施例
実施例３５：ＮＨＰ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジモデルにおける、配列番号１９＋ＩＳＡ ７２０の有効性試験に対する群の割り当て
配列番号１９のワクチンの有効性を、アカゲザルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジモデルを使用した実施例２７の免疫化ＮＨＰにおいて評価する。チャレンジ後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２負荷を、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、鼻洗浄液、ならびに鼻腔ぬぐい液および口腔咽頭ぬぐい液の収集と分析による実験を通じてモニタリングする。ウイルス量は、剖検後の組織において評価される。
Ｎ＝５のカニクイザルの２群に、以下の表１５に示されるようにチャレンジを行った。１つの群は、実施例２７によるＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質で免疫化され、その後、最初の注射から３カ月～４カ月半の間に３０μｇの用量レベルでＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む配列番号１９のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質ワクチンのブースターワクチンを注射された（３回目の注射）６匹のカニクイザルのうち５匹から構成された。２つ目の群は、処置されていない５匹のカニクイザルから構成された。
Figure 2023522597000016
０日目、この２つの群に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスをチャレンジした。チャレンジ前、および７日目に血液を採取した。鼻腔ぬぐい液、口腔ぬぐい液およびＢＡＬ液の収集は、チャレンジ前、ならびに２、４および７日目に行われた。終了後の剖検は、７日目に実施された。試験スケジュールを表１６に示す。
Figure 2023522597000017
実施例３６：ＮＨＰ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジモデルにおける、配列番号１９＋ＩＳＡ ７２０の有効性試験に関するウイルス接種
ウイルス接種物は、目的とする２ｍＬ中、１ｘ１０５ ＴＣＩＤ５０のの用量レベルに到達するまでＰＢＳ中で連続希釈することによって調製した。ウイルス投与は、ケタミン沈静下で行われた。鼻内（ＩＮ）経路での投与は、以下のように実施された。較正済みＰ１０００ピペッターを使用して、０．５ｍＬのウイルス接種物をそれぞれの鼻孔内に滴下して投与して、動物１匹当たり１．０ｍＬとした。作業台の上に麻酔をかけたＮＨＰを仰向けで保持した。技師が動物の頭を後ろに傾け、鼻孔を天井に向けた。技師が、最初の鼻孔内にシリンジのチップを置き、ゆっくりとプランジャーを押し下げて、鼻腔内に接種物を注入し、その後シリンジを取り除いた。２番目の鼻孔にもこの手順を繰り返した。動物の頭を約２０秒間後ろに傾けた後、収容ユニットに戻し、完全に回復するまでモニタリングした。
気管内（ＩＴ）経路での投与は、以下のように実施された。フレンチゴム製カテーテル／フィーディングチューブ、サイズ１０、滅菌済み（４～６インチ（約１０～１５センチ）の長さにカット）を使用して、１ｍＬの希釈ウイルスを気管内送達した。規定用量の接種物を、シリンジ内に引き込んだ。カテーテルに接種物を入れたシリンジを挿入する前に、技師はシリンジを引き戻し、シリンジ内に１．５ｃｃの空気を入れた。この空気によって、全ての接種物がカテーテルに押し出される。麻酔された動物を、手順のために配置して、アシスタントに口を開けさせた。接種物が入ったシリンジを、滅菌フレンチカテーテルまたはフィーディングチューブに取り付ける。咽頭蓋が見えたら、声門を開けさせ、フィーディングチューブの小さな末端を声門内に挿入する。配置したら、技師が気管内に接種物を注入し、次いで気管からカテーテルを外す。新たな器具または滅菌された器具を、各動物に使用した。試験動物は、収容ユニットに戻され、完全に回復するまでモニタリングされた。
チャレンジ接種物は、適切な用量レベルの確認のために、プラークアッセイまたはＴＣＩＤ５０アッセイによって戻し力価測定された。残りの接種物を２ｍＬのクライオバイアルに分注し、－７０℃未満の温度で保管して、ウイルス量アッセイの陽性対照として使用した。
実施例３７：ＮＨＰ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジモデルにおける、配列番号１９＋ＩＳＡ ７２０の有効性試験のためのサンプル採取
粘膜分泌物の採取は、綿棒（ＣＯＰＡＮ ｆｌｏｃｋｅｄ ｓｗａｂ）を使用して、沈静状態のＮＨＰに行った。綿棒を鼻腔内に挿入し、優しく回転させた。採取後、ぬぐい液を、１ｍＬ ＰＢＳが入ったコレクションバイアル（２／検体）内に入れて、ｑＰＣＲを行った。全てのバイアルは、ウイルス量試験まで－７０℃未満の温度で保管された。
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）の手順は、「椅子法」によって麻酔下の動物に行われた。この手順のために、１名の技師が実際のＢＡＬ洗浄手順を行い、もう１名の技師が手を動物の胸部に置いた。これは、手順の間に咳をすることにより生じる動物の動きを減少させ、または回避して、検体汚染の可能性を最小限にするためである。ＮＨＰは、椅子の溝に背臥位で置かれた。動物が椅子の溝を滑り落ちないように、椅子の基部のハンドルを動物に対して上にスライドさせた。ハンドルが動物の体重を支える位置におさまった時点で、ハンドルを所定位置に締めた。配置前に赤色のゴム製フィーディングチューブを予め計測し、印をつけた。動物の頭を後ろに傾け、椅子の溝の縁よりも下に傾ける。次いで赤色のゴム製フィーディングチューブを、吸気中に喉頭鏡で動物の気管内に挿入する。チューブを正しい位置に置き、ＢＡＬ洗浄手順を実施した。合計で１０ｍＬを、チューブを通じて洗い流した。サンプル採取が完了したら、椅子基部のハンドルを緩めて動物を椅子から外す。
注入され、各動物から収集された量、ならびにＢＡＬサンプル中の血液の存在を記録した。採取されたＢＡＬサンプルを直ちに湿らせた氷上に置き、液体単離の処理を行った（ウイルス量分析のため）。この手順のため、４℃でチューブを遠心分離（８分、３００～４００ｘｇ）して、上清を取り出した。以下のＢＡＬ分注物を調製し、ウイルス量（ＶＬ）試験または他の試験まで凍結保存した：ＶＬ試験用に３ｘ０．２ｍＬ、他のアッセイとバンキング用に３ｘ１ｍＬ。
実施例３８：ＮＨＰ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジモデルにおける、配列番号１９＋ＩＳＡ ７２０の有効性試験のための血液採取
血液は、表１６に従い、麻酔下で採取された。バキュテイナ ２１ｇ ｘ １インチ血液採取針、またはバキュテイナ採血管に取り付けられたＡｂｂｏｔｔ Ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ ２３ ｇ ｘ ３／４インチチューブを使用して、大腿静脈穿刺により麻酔下の動物から血液を引き出した。血液は、ＥＤＴＡ抗凝固剤が入ったＢＤバキュテイナ（登録商標）管に採取され、社内のＩＤＥＸＸ ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ分析器を使用して分析された。以下のルーチンパネルが分析された：ＣＢＣ：ＷＢＣ、ＲＢＣ、ＨＧＢ、ＨＣＴ、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、ＮＲＢＣ、好中球、ＳＥＧ、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、絶対好中球ＳＥＧ、絶対リンパ球数、絶対好酸球数、絶対好塩基球数。
予定通りに解剖が実施され、肺組織が採取された。動物の体重を計測し、体温を記録して、胸腔から肺を取り出した。動物と肺の肉眼的評価を行い、肺のデジタル画像とともに記録した。２つの小片（それぞれ０．１～０．２グラム）を左および右の尾状葉ならびに前葉から採取し、ウイルス量アッセイ用に組織をサンプリングした（合計で８片）。ウイルス分析用の組織採取後、肺に１０％中性緩衝ホルマリンＮＢＦをかけて、これに浸した。採取された肺と他の組織は、ＮＢＦ中に保存され、組織処理と分析が行われた。
ウイルス量アッセイのために、組織の重量を計測し、前もってラベル添付したＳａｒｓｔｅｄｔクライオバイアル（２／サンプル）内に入れ、ドライアイス上で瞬間凍結させた（瞬間凍結の時間は、体重ｈａｒｔｓに記載した）。ウイルス量アッセイで試験を行う前に、組織は０．５ｍＬの冷培地（ＤＭＥＭ／１０％ ＦＢＳ／ゲンタマイシン）またはＲＮＡ－Ｓｔａｔ（ＰＣＲ系アッセイ用）中でおよそ２０秒間、携帯型組織ホモジナイザー（ＳＯＰ ＢＶ－０３５； Ｏｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、ジョージア州ケネソー）を使用してホモジナイズされた。次いでサンプルをスピンダウンして、残渣を取り除き、上清を単離させてウイルス量決定が行われた。
実施例３９：ＮＨＰ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジモデルにおける、配列番号１９＋ＩＳＡ ７２０の有効性試験に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の定量的ＲＴ－ＰＣＲアッセイ
体液１ｍＬ当たり、または組織１グラム当たりのＲＮＡコピー数を、ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイを使用して決定した。ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイは、コロナウイルスのヌクレオカプシド遺伝子の保存領域を増幅し、結合するように特異的に設計されたプライマーとプローブを使用する。公知の標準曲線とシグナルを比較し、計算を行って、１ｍＬ当たりのコピー数を得る。ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイのために、ウイルスＲＮＡは最初にＱｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｖｉｒｕｓ ｓｐｉｎ ｋｉｔ（カタログ番号５７７０４）を使用して鼻洗浄液から単離された。組織については、ＲＮＡ－ＳＴＡＴ ６０（Ｔｅｌ－Ｔｅｓｔ「Ｂ」）／クロロホルムで抽出され、沈殿されて、ＲＮＡｓｅ非含有水中に再懸濁された。増幅反応の対照を作製するために、同じ手順を使用して適切なウイルスストックからＲＮＡを単離した。ＲＮＡ量は２６０ｎｍでのＯ．Ｄ．読み取り値から決定された。Ａ２６０でのＯＤ値１．０は、４０μｇ／ｍＬのＲＮＡに相当すると推定される。判明している塩基数、および平均ＲＮＡ塩基の重量が３４０．５ｇ／モルであることから、コピー数を計算して、それに伴い対照を希釈した。３μＬ当たり１０８コピーの最終希釈を、１０μＬの単回使用分注物に分割した。これら分注物は、必要となるまで－８０℃で保管された。いくつかの分注物を無作為に選択し、過去の対照と比較して、一貫性を確認した。マスターミックス調製については、ＴａｑＭａｎ ＲＴ－ＰＣＲキット（Ｂｉｏｌｉｎｅ社、カタログ番号 ＢＩＯ－ ７８００５）から取得したＴａｑポリメラーゼを含有する２Ｘ緩衝液を２．５ｍＬ、１５ｍＬチューブに入れた。キットから、５０μＬのＲＴと、１００μＬのＲＮＡｓｅ阻害剤も加えた。２μＭの濃度のプライマー対も、１．５ｍＬの体積で加えた。最後に、０．５ｍＬの水、２μＭの濃度のプローブ３５０μＬを加えて、チューブをボルテックスした。反応については、４５μＬのマスターミックスと、５μＬのサンプルＲＮＡを９６ウェルプレートのウェルに加えた。全てのサンプルがトリプリケートで検証された。プレートは、プラスチックシートで密封された。
対照曲線の調製については、対照ＲＮＡのサンプルを、－８０℃の冷凍庫から取得した。対照ＲＮＡは、３μＬ当たり、１０６～１０７コピーを含有するように調製された。対照ＲＮＡの８つの１０倍連続希釈は、ＲＮＡ非含有水を使用し、５μＬの対照を４５μＬの水に加えて、これを７回繰り返すことにより調製された。この工程により、１～１０７コピー数／反応の範囲の標準曲線が得られた。上述のようにして各希釈のデュプリケイトサンプルも調製された。コピー数が検出上限を超えた場合、必要に応じてサンプルが希釈された。増幅を行うために、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ検出器にプレートを置き、以下のプログラムを使用して増幅させた。４８℃で３０分間、９５℃で１０分間、次いで９５℃で１５分間、そして５５℃で１分間を４０サイクル。１ｍＬ当たりのＲＮＡコピー数は、標準曲線から外挿し、０．２ｍＬの抽出量の逆数を掛けることにより計算された。この工程により、鼻腔ぬぐい液については１ｍＬ当たり５０～５ｘ１０８ＲＮＡコピー数の実用的な範囲が得られ、組織については１グラム当たりのウイルス量が得られた。
実施例４０：ＮＨＰ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジモデルにおける、配列番号１９＋ＩＳＡ ７２０の有効性試験に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のサブゲノムｍＲＮＡアッセイ
ｓｇＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲアッセイは、コロナウイルスのＥ遺伝子メッセンジャーＲＮＡの領域を増幅し、結合するように特異的に設計されたプライマーとプローブを使用する。これはビリオン内にはパッケージングされなかった。ウイルス中にはない部分を含むメッセンジャーＲＮＡ部分の配列を含むプラスミドの判明している標準曲線とシグナルを比較し、計算を行って、ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイの１ｍＬ当たりのコピー数を得た。増幅反応の対照を作製するためのＥ遺伝子メッセンジャーＲＮＡの一部を含有するプラスミド。３μＬ当たり１０６コピーの最終希釈を、１０μＬの単回使用分注物に分割した。これら分注物は、必要となるまで－８０℃で保管された。
いくつかの分注物を無作為に選択し、過去の対照と比較して、一貫性を確認した。次いでウイルスＲＮＡ用に抽出されたサンプルを増幅して、ｓｇＲＮＡを取り出した。対照ＤＮＡは、３μＬ当たり、１０７コピーを含有するように調製された。対照ＲＮＡの７つの１０倍連続希釈は、ＡＶＥを使用し、５μＬの対照を４５μＬの水に加えて、これを７回繰り返すことにより調製された。この工程により、１～１０６コピー数／反応の範囲の標準曲線が得られた。上述のようにして各希釈のデュプリケイトサンプルも調製された。コピー数が検出上限を超えた場合、必要に応じてサンプルが希釈された。増幅を行うために、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ検出器にプレートを置き、以下のプログラムを使用して増幅させた。４８℃で３０分間、９５℃で１０分間、次いで９５℃で１５分間、そして５５℃で１分間を４０サイクル。１ｍＬ当たりのＲＮＡコピー数は、標準曲線から外挿し、０．２ｍＬの抽出量の逆数を掛けることにより計算された。この工程により、鼻腔ぬぐい液については１ｍＬ当たり５０～５ｘ１０７ＲＮＡコピー数の実用的な範囲が得られ、組織については１グラム当たりのウイルス負荷が得られた。
実施例４１：ＮＨＰ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジモデルにおける、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む配列番号１９の有効性試験のための、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の抗体ＥＬＩＳＡ
動物のプレスクリーニングとして、標準的な間接的ＥＬＩＳＡを実施して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質への抗体の結合について血清サンプルを分析した。このアッセイは、コーティングされた抗原と、ＩｇＧ二次抗体を使用した。このアッセイについて、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号４３９４５４）に、１ｘ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ－Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＣＢＢ、Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号 Ｃ３０４１－５０ＣＡＰ）中で２μｇ／ｍＬに希釈された５０μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、カタログ番号４０５８９－Ｖ０８Ｂ１）をコーティングした。静かにプレートを一晩２～８℃でインキュベートした。各ウェル中の非結合コーティング抗原を、２００μＬのＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を用いて５回洗浄することにより取り除いた。１００μＬのＰＢＳ＋１％ ＢＳＡを用いてプレートをブロッキングした。被験サンプルおよび陽性対照サンプルを、アッセイ希釈液（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０－１％ ＢＳＡ）中で、開始希釈の１：２０まで希釈して、次いでＵ底希釈プレートを使用して４倍連続希釈を行った。
ブロッキングが完了したら、ひっくり返してブロッキング緩衝液を取り除き、各サンプルを入れた。静かに室温で１時間、プレートをインキュベートし、次いで２００μＬ ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を用いて５回洗浄し、非結合血清を取り除いた。５０μＬの二次検出抗体（ヤギ抗サルＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、ＨＲＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＰＡ１－８４６３１）を１：１０，０００希釈で添加し、室温で６０分間、プレートをインキュベートした。続いて非結合抗体を、２００μＬのＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０で５回洗浄し、２００μＬのＰＢＳで１回洗浄することによって取り除いた。発色させるために、１００μＬの１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳＥＲＡ ＣＡＲＥ、ＫＰＬ カタログ番号 ５１２０－００７５）を各ウェルに添加し、プレートを発色させた。約１０分後に、５０μＬのＴＭＢ停止溶液（ＳＥＲＡ ＣＡＲＥ、カタログ番号 ５１５０－００２０）を用いて反応を停止させた。Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ分光光度計を用いて３０分以内に４５０ｎｍでプレートを読み取った。
実施例４２：ＮＨＰ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジモデルにおける、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む配列番号１９の有効性試験のためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のプラーク減少中和試験
プレスクリーニングのためにＰＲＮＴアッセイを血清サンプルに行った。このアッセイのために、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号 ＣＲＬ－１５８６）を、ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋ゲンタマイシン中、１７５，０００細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。翌日、細胞が８０～１００％コンフルエンシーに達するまで、３７℃、５．０％ ＣＯ２でプレートをインキュベートした。アッセイの当日、血清サンプルは、５６℃で３０分間、熱不活化された。アッセイの設定は、以下のように行われた：９６深ウェルプレートにおいて、４０５μＬの希釈物（ＤＭＥＭ ＋ ２％ ＦＢＳ ＋ ゲンタマイシン）を、列１に添加し、３００μＬの希釈物を列３、５、７、９および１１に添加した。４５μＬの熱不活化血清サンプルを、最初の列に添加した（１：１０希釈）。全てのサンプルが添加された時点で、ウェルの内容物をＰ２００ピペッターを使用して約５分間、上下に混合し、１５０μＬを列３に移して１：３倍希釈とした。これを次のウェルセットからプレートの下の列１１まで繰り返した。ウイルス陽性対照については、３００μＬの希釈物を列１、３、５、７、９および１１に添加し、一方で６００μＬの希釈物を行１に添加する。これは陰性対照となる。３０ｐｆｕ／ウェルのウイルス濃度を調整し、使用するまで氷上で維持する。
上述のように力価測定プレートが準備された後、３０ｐｆｕ／ウェルのウイルス希釈物を３００μＬ、全てのサンプルと陽性対照に添加した。これにより、サンプルの希釈計数が２倍となった（最初のウェルは１：２０から始まる）。次いでプレートをプレートシーラーで覆い、１時間、３７℃、５．０％ ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーションが完了した後、２４ウェルプレートから培地を取り除き、力価測定プレートから２５０μＬの力価測定サンプルをマルチチャンネルピペットを使用してデュプリケイトで加えた。細胞が乾燥することを防ぐため、一度に一枚のプレートのみを準備した。２４ウェルプレートを、１時間、３７℃、５．０％ ＣＯ２でインキュベートし、ウイルスを感染させた。この間に０．５％メチルセルロース培地を３７℃の水槽中で加熱した。１時間のインキュベーション後、１ｍＬの０．５％メチルセルロース培地を各ウェルに添加し、プレートを３日間、３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。メチルセルロース培地を取り除き、１ｍＬ ＰＢＳを用いてプレートを１回洗浄した。１ウェル当たり４００μＬの氷冷メタノールを用いてプレートを３０分間、－２０℃で固定した。固定後、メタノールを廃棄して、１ウェル当たり２５０μＬの０．２％ クリスタルバイオレット（２０％ ＭｅＯＨ、８０％ ｄＨ２Ｏ）を用いて室温で３０分間、単層を染色した。最後にＰＢＳまたはｄＨ２Ｏを用いてプレートを１回洗浄し、約１５分間乾燥させた。各ウェル中のプラークを記録し、ＩＣ５０力価およびＩＣ９０力価を、ウイルス対照ウェルで検出された平均プラーク数を基に計算した。
実施例４３：ＮＨＰ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジモデルにおける、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０アジュバントを含む配列番号１９の有効性試験のためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染性ウイルス量アッセイ（ＴＣＩＤ５０）
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－１５８６）を、２５，０００細胞／ウェルでＤＭＥＭ ＋ １０％ ＦＢＳ ＋ ゲンタマイシン中に播種し、培養液を３７℃、５．０％ ＣＯ２でインキュベートした。細胞は翌日に８０～１００％コンフルエントになるはずである。培地を吸引し、１８０μＬのＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋ゲンタマイシンと置き換えた。２０μＬのサンプルをクアドラプリケートで一番上の行に加えて、Ｐ２００ピペッターを使用して５回混合した。ピペッターを使用して２０μＬを新たな行に移し、それをプレートの下（Ａ列～Ｈ列）へと繰り返し、１０倍希釈とした。各行ごとにチップを廃棄し、最後の行まで繰り返した。各アッセイの設定には、陽性対照（アッセイにおいて感染力価が判明しているウイルスストック）および陰性対照（培地のみ）のウェルが含まれた。プレートを３７℃で４日間、５．０％ ＣＯ２でインキュベートした。細胞単層をＣＰＥについて目視検証した。非感染ウェルには綺麗なコンフルエント細胞層があり、一方で感染細胞は、細胞が丸くなっている。ＣＰＥがあれば、実験室フォームに＋として印をつけ、ＣＰＥが無ければ、－と印をつける。ＴＣＩＤ５０値は、Ｒｅａｄ－Ｍｕｅｎｃｈ式を使用して計算された。
実施例４４：ＮＨＰ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスチャレンジモデルにおける、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ７２０を含む配列番号１９の有効性試験の結果
表１７に示されるように、ＩＳＡ－７２０を含む配列番号１９で免疫化された５匹のＮＨＰは、ウイルスチャレンジ直前に、５匹の未感作対照ＮＨＰと比較して、有意な抗ＳＰ／ＲＢＤ ＩｇＧ価とＡＣＥ２阻害のＩＤ５０値を示した。未感作対照は、両アッセイとも僅かな、または検出不可能なレベルであった。図７８に示されるチャレンジ後の結果は、ＣＯＶＩＤ－１９感染に対する防御におけるＩＳＡ ７２０を含む配列番号１９のワクチンの有効性を明白に示し、実施例３７の手順により得られた鼻腔ぬぐい液において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムおよびウイルスサブゲノムＲＮＡ力価（実施例３９の手順で測定された）のレベルが僅か、または検出不可能であったことで証明される。同様に、図７９は、実施例３７の手順により得られたＢＡＬサンプルにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムおよびウイルスサブゲノムＲＮＡ力価（実施例４０の手順で測定された）のレベルが僅か、または検出不可能であったことを示す。サブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は複製中間体であり、その存在数はウイルス複製の活性や宿主感染の重症度と関連していることを踏まえると、その数が少ないことは特に有望性を示す。まとめると、データから、ＩＳＡ－７２０を含む配列番号１９は、ＣＯＶＩＤ－１９から防御し、ＮＨＰにおいてＣＯＶＩＤ－１９疾患の悪化リスクはないことが結論付けられる。
Figure 2023522597000018
主要臓器／組織、特に肝臓、肺、気道、脾臓、腎臓、脳およびリンパ節に対し、組織病理学的検査が実施された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒトにおいて肝臓細胞に感染し、肝炎を生じさせることが示されている。そこで、組織病理学的検査を実施して、肝炎の重症度を評価し、およびワクチン接種対象と非ワクチン化対照におけるチャレンジ関連でのその減少度合を評価した。肺および気道は、重度感染および肺炎に関連する病変について検査された。
イヌ科インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の合成、精製およびバリデーションに関する一般的な実施例
実施例４５：ＨＥＫ２９３細胞におけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の合成および作製方法
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、以下のように合成された。対象の遺伝子配列は、独自のソフトウェア（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）を使用して構築され、高発現哺乳動物ベクターにクローニングされた。ＨＥＫ２９３細胞を振とうフラスコに播種し、その２４時間後、トランスフェクションを行い、無血清既知組成培地を使用して増殖させた。対象のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ発現構築物を、一過性トランスフェクションに関する（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）標準操作手順を使用してＨＥＫ２９３細胞の懸濁液内に、一過性にトランスフェクションした。２０時間後、細胞を数え、生存率および生きている細胞数を決定し、力価をＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ（登録商標）（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＬＬＣ、カリフォルニア州フレモント）により測定した。一過性トランスフェクション生産が行われている間、追加で読み取りを行った。培養物を、５日目以降に回収した。
実施例４６：ＣＨＯ細胞におけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の合成および作製方法
ＣＨＯ細胞株は元々ＣＨＯ－Ｋ１（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）から誘導されたものであり、内因性のグルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子が当分野に公知の方法を使用した組み換え技術によってノックアウトされた。ＣＨＯ発現とＧＳ選択に対して安定的な発現ＤＮＡベクターが設計され、最適化されており、高発現哺乳動物ベクター（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ社、カリフォルニア州ベルモント）に組み込まれた。構築完了物の各々の配列が確認され、その後にスケールアップ実験が開始された。懸濁液に適合されたＣＨＯ細胞を、既知組成培地（ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）中、加湿された５％ ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で培養した。血清が無い、または他の動物由来の物がない製品を、ＣＨＯ細胞の培養に使用した。
指数関数的増殖相の間にＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地中で増殖した約８０００万個の懸濁液適合ＣＨＯ細胞を、ＭａｘＣｙｔｅ（登録商標）ＳＴＸ（登録商標）システム（ＭａｘＣｙｔｅ， Ｉｎｃ．、メリーランド州ゲイサーズバーグ）を使用して、８０μｇのＤＮＡをエレクトロポレーション法によりトランスフェクトし、各インスリン－Ｆｃ融合タンパク質（ＤＮＡ構築物は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の全長配列を含む）の安定的ＣＨＯ細胞株を作製した。２４時間後、トランスフェクトされた細胞を計数し、インスリン－Ｆｃ融合遺伝子の安定的統合に関する選択圧下で播種した。トランスフェクトされた細胞を、０～１００μＭ メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を含有するＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ選択培地に、０．５ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞密度で、振とうフラスコにおいて播種し、３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。ＣＨＯ安定的プールが増殖速度と生存率を回復させるまで、選択プロセスを行う間、２～３日ごとに細胞をスピンダウンし、新鮮な選択培地中に再懸濁した。細胞培養物は、増殖と力価についてモニタリングされた。
細胞を、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬまで増殖させた。細胞バンキング用の採取の時点で、生存率は９５％を超えていた。次いで細胞を遠心分離し、細胞沈殿物を、７．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地中に再懸濁して、１５ｘ１０６細胞／ｍＬ／バイアルの細胞数とした。保管用にバイアルを液体窒素中で凍結保存した。
以下のようにＣＨＯ細胞を使用して、小規模なスケールアップ生産を実施した。３７℃で１００μＭ ＭＳＸを含有するＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ増殖培地中での生産のために、細胞をスケールアップして、およそ１４～２１日間、必要に応じて２～４日ごとに、グルコースと必要に応じて追加アミノ酸を補充されたＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ増殖培地を供給した。安定的プール生産から回収した馴化培地上清を、遠心分離により浄化した。結合緩衝液を用いて予め平衡化されたプロテインＡ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、英国リトルチャルフォント）カラムにタンパク質を流した。次いで、ＯＤ２８０値（ＮａｎｏＤｒｏｐ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）が、バックグラウンド値かほぼその近傍値に測定されるまで、洗浄緩衝液をカラムに通した。低ｐＨ緩衝液を使用してインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を溶出させ、溶出分画を集め、各分画のＯＤ２８０値を記録した。標的のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含む分画をプールし、任意で０．２μＭの膜フィルターを使用してろ過した。
任意選択で細胞株をさらにモノクローナルになるまでサブクローニングし、および任意でさらに高力価インスリン－Ｆｃ－融合タンパク質を発現するクローンを、当分野に公知の方法である限界希釈法を使用して選択した。高力価のモノクローナル性インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を発現する細胞株を取得した後、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の産生は、上述のようにＭＳＸを含まない増殖培地中で行われ、または任意でＭＳＸを含む増殖培地中で行われて、ＣＨＯで産生された組み換えインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含有する細胞培養上清を得た。高い産生能力を有するクローン株をさらに選択するために、任意でＭＳＸ濃度を経時的に上昇させた。
実施例４７：インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の精製
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の精製は、以下のように行われた：分泌されたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含有する馴化培地の上清を、一過性または安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞の産物から回収し、遠心分離で清浄化させた。所望のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を含む上清をプロテインＡカラムに流し、低ｐＨ勾配を使用して溶出させた。その後、所望のタンパク質を含む溶出分画をプールし、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０緩衝液に緩衝液交換した。最終ろ過工程は、０．２μｍの膜フィルターを使用して行われた。最終タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの溶液光学密度から計算された。必要に応じて、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、アニオン交換ビーズ樹脂またはカチオン交換ビーズ樹脂を使用）、ゲルろ過クロマトグラフィーまたは他の方法によって追加の任意選択的な精製が行われた。
実施例４８：非還元ＣＥ－ＳＤＳまたは還元ＣＥ－ＳＤＳによる、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構造確認
キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）解析を、ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、マサチューセッツ州ウォルサム）において、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０の緩衝液に溶解されたインスリン－Ｆｃ精製融合タンパク質に対して行い、電気泳動図がプロットされた。非還元条件下では、サンプルは分子量（ＭＷ）が判明しているタンパク質標準に対して流され、溶出ピークは、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の「見かけ上の」ＭＷを表す。
還元条件下（インスリン－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体のジスルフィド結合を壊すためにベータ－メルカプトエタノールを使用）で、得られたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質単量体の見かけ上のＭＷを、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の分子量の半分と比較して、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構造純度が正確である可能性が高いことを判定する１つの手段とした。
実施例４９：グリカン除去を用いたＬＣ－ＭＳによるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の配列特定
質量分析法（ＭＳ）を介してインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の質量の正確な推定値を得るために、最初にサンプルを処理して、自然発生的なグリカンを除去した。グリカンは、ＭＳ分析に干渉する可能性がある。２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０緩衝液に溶解させた２．５ｍｇ／ｍＬ インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の１００μＬを最初に、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ社、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０緩衝液へと緩衝液交換した。１．６７μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素（Ｐｒｏｚｙｍｅ Ｎ－ｇｌｙｃａｎａｓｅ）をこの溶液に加えて、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質中に存在するＮ結合型グリカン（例えば、ｃＮｇ－Ｎ部位に位置するアスパラギンの側鎖に結合したグリカン）を除去して、混合物を３７℃で一晩、インキュベーター中でインキュベートした。次いでサンプルをＬＣ－ＭＳ（ＮｏｖａＢｉｏａｓｓａｙｓ社、マサチューセッツ州ウォバーン）により分析して、当該分子の質量を得た。この質量は、グリカンを含まない所望のホモ二量体に相当する。ｃＮｇ－アスパラギンからグリカンを除去するために使用された酵素プロセスは、アスパラギン側鎖からアミノ基も除去してアスパラギン酸を形成する。その際、酵素処理されたホモ二量体は全体で２Ｄａ増加し、ホモ二量体中に存在する各鎖については１Ｄａの質量に相当するため、次いでこの質量をさらに補正した。したがって、分析サンプル中のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質構造の酵素修飾を補正するため、実際の分子の質量は、測定された質量から２Ｄａを差し引いたものとした。
実施例５０：サイズ排除クロマトグラフィーによる、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のホモ二量体％
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）は、２８０ｎＭの波長で２９９８光ダイオードに接続されたＷａｔｅｒｓ ２７９５ＨＴ ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、マサチューセッツ州ミルフォード）を使用して実施された。１００μＬ以下の対象インスリン－Ｆｃ融合タンパク質含有サンプルを、ＭＡｂＰａｃ ＳＥＣ－１、５μｍ、４×３００ｍｍカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）に注入し、当該装置は０．２ｍＬ／分の流量で操作され、移動相は、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０５％ ｗ／ｖ アジ化ナトリウム、ｐＨ６．２を含有した。ＭＡｂＰａｃ ＳＥＣ－１カラムは、分子サイズ分離の原理に基づき動作する。したがって、大きな可溶性のインスリン－Ｆｃ凝集体（例えば、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質ホモ二量体の多量体）は速い保持時間で溶出され、非凝集体のホモ二量体は遅い保持時間で溶出される。分析的ＳＥＣ－ＨＰＬＣを介して凝集した多量体型ホモ二量体からホモ二量体混合物を分離する際、非凝集型ホモ二量体の割合％を単位としてインスリン－Ｆｃ融合タンパク質溶液の純度も確認された。
実施例５１：インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のインビトロＦｃ（ガンマ）受容体Ｉ結合アフィニティアッセイ
ｐＨ７．４でのＦｃ（ガンマ）受容体Ｉに対するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の結合は、以下のようにＥＬＩＳＡアッセイを使用して実施された。イヌ科のＦｃ（ガンマ）受容体Ｉは市販されていなかったため、ヒトＦｃ（ガンマ）受容体Ｉ（すなわち、ｒｈＦｃ（ガンマ）受容体Ｉ）をサロゲート哺乳動物受容体として使用した。インスリン－Ｆｃ化合物を希釈して、ｐＨ９．６の重炭酸ナトリウム緩衝液中、１０μｇ／ｍＬとした。これをＭａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ社）マイクロタイタープレート上に一晩４℃でコーティングした。その後、マイクロプレートストリップをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）緩衝液を用いて５回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を用いてブロッキングした。ビオチニル化ｒｈＦｃ（ガンマ）受容体Ｉ（組み換えヒトＦｃ（ガンマ）Ｒ－Ｉ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）の連続希釈を、ＰＢＳＴ／１０％ Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液中で、６０００ｎｇ／ｍＬから８．２ｎｇ／ｍＬに調製し、１００μＬ／ウェルで、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質でコーティングされたマイクロプレートストリップ上へとローディングした。マイクロタイタープレートを室温で１時間インキュベートし、その後、マイクロタイタープレートをＰＢＳＴで５回洗浄して、次いでＰＢＳＴ／１０％ Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液中で１：１００００希釈されたストレプトアビジン－ＨＲＰを１００μＬ／ウェルでローディングした。４５分間インキュベートした後、マイクロプレートストリップをＰＢＳＴで５回再度洗浄した。ＴＭＢを添加して、結合したＦｃ（ガンマ）受容体Ｉタンパク質を明らかにし、ＥＬＩＳＡ停止試薬（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社）で停止させる。４５０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいてプレートを読み取り、ＯＤ値（インスリン－Ｆｃタンパク質へのｒｈＦｃ（ガンマ）受容体Ｉの結合に比例する）を、各ウェルに添加されたｒｈＦｃ（ガンマ）受容体Ｉの対数濃度に対してプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して結合曲線を作成する。
実施例５２：クライアント所有犬における、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の定期的投与後のインビボ薬理（ＰＤ）
生物活性のあるインスリン－Ｆｃ融合ホモ二量体構築物を、実施例４５または実施例４６で合成し、実施例４７で精製した。これを、以下のように絶食血中グルコース値に対する作用について評価した。
プロトコル１は、糖尿病と診断されたクライアント所有犬をインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を用いて治療する、顕在化、自制型で単群でのパイロットフィールド有効性試験である。イヌへの効果は、標準的なインスリン治療（１週間）を受けながら血糖コントロールを受けるもの（臨床兆候、フルクトサミン値、および連続的グルコースモニタリングユニット（ＣＧＭＳ）を使用した間質グルコース濃度に基づく）と、８週間にわたりインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の用量を漸増させて治療されるものとを比較することにより評価される。用量は、０．１ｍｇ／ｋｇで開始して皮下投与され、その後、ＣＧＭＳの結果と臨床兆候に基づいて最大０．５ｍｇ／ｋｇまで毎週連続して増加させる。一部のイヌに使用されたプロトコル１試験のタイムラインを表１８に示す。
Figure 2023522597000019
プロトコル２は、糖尿病と診断されたクライアント所有犬をインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を用いて治療する、顕在化、自制型で単群でのパイロットフィールド有効性試験である。イヌへの効果は、標準的なインスリン治療（１週間）を受けながら血糖コントロールを受けるもの（臨床兆候、フルクトサミン値、および連続的グルコースモニタリングユニット（ＣＧＭＳ）を使用した間質グルコース濃度に基づく）と、５週間にわたりインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の用量を漸増させて治療されるものとを比較することにより評価される。用量は、０．１ｍｇ／ｋｇで開始して皮下投与され、その後、ＣＧＭＳの結果と臨床兆候に基づいて最大０．５ｍｇ／ｋｇまで毎週連続して増加させる。一部のイヌに使用されたプロトコル２試験のタイムラインを表１９に示す。
Figure 2023522597000020
上述のプロトコルのいずれかが完了した後、任意選択の最大１年間の「家での使用」の評価がある。このフェーズの間、従来のインスリン治療を受けている他の患者と同様に、獣医師はケースバイケースで各イヌを治療する。臨床兆候、および連続的グルコースモニタリングユニット（ＣＧＭＳ）を使用した間質グルコース濃度が、当該試験のフェーズの間モニタリングされる。それに加えて、可能な限り頻繁に血液サンプルを収集して、フルクトサミン値、血液化学検査、および血球数を評価し、抗薬剤抗体および抗インスリン抗体の存在について試験する。
実施例５３：イヌ科における、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の定期的な投与後のインビボ抗インスリン抗体（ＡＩＡ）力価測定－プロトコル１
Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社）を、コーティング緩衝液（ｐＨ＝９．６ 炭酸－重炭酸緩衝液）中で希釈された精製ＲＨＩを用いて３０μｇ／ｍＬで一晩、４℃でコーティングした。次いでプレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ ＋ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で５回洗浄し、≧１時間（または一晩）、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を用いてブロッキングした。イヌＩｇＧ単位でのＡＩＡの計算について、３００～４．６９ｎｇ／ｍＬの濃度のイヌＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）のｐＨ＝９．６ Ｃａｒｂ－Ｂｉｏｃａｒｂコーティング緩衝液中の１：２連続希釈を用いてストリップを一晩、４℃で直接コーティングし、これを使用して、７点の擬似標準曲線を作成した。標準ストリッププレートも洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング溶液を用いて≧１時間（または一晩）ブロッキングした。
被験血清サンプルを、ＰＢＳＴ／ＳＢ／２０％ＨＳのサンプル希釈緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０＋１０％ ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ＋２０％ウマ血清）中、≧１：１００（典型的には、１：２００で試験された）まで希釈し、ＲＨＩコーティング済みストリップに１００μＬ／ウェルでデュプリケイトで添加した。イヌＩｇＧコーティング標準ストリップもデュプリケイトで各プレートに添加し、１００μＬ／ウェルでＰＢＳＴ／ＳＢ（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０＋１０％ ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ）で満たした。プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。ＡＩＡの検出について、イヌＩｇＧと交差反応性であるＨＲＰコンジュゲートヤギ抗イヌＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）を、ＰＢＳＴ／ＳＢ中、１：１０，０００に希釈して、サンプルと標準のウェルの両方に１００μＬ／ウェルで添加し、４５分間、室温、暗所でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、室温、暗所で１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）を１５～２０分間添加することにより発色させた。次いで、１００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ停止溶液（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を添加することにより発色を停止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを使用して、３０分以内に４５０ｎｍで吸光度を読み取る。抗薬剤抗体の濃度は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用して４－ＰＬ擬似標準曲線にＯＤ値を内挿することによって決定した。
実施例５４：イヌ科における、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の定期的な投与後のインビボ抗インスリン抗体（ＡＩＡ）力価測定－プロトコル２
一般的手順は以下の通りである：標識抗原を含む血清を、冷インスリンとともに、または伴わずに一晩インキュベートする。抗体が結合した標識抗原を、９６ウェルプレート様式においてプロテインＡ／Ｇ セファロースを用いて沈殿させ、各血清をデュプリケイトで試験した。９６ウェルプレートを洗浄し、非結合の標識抗原を取り除いた。各ウェルを、９６ウェルプレートベータカウンターを用いて計数する。結果は、特定のアッセイにおける陽性対照と陰性対照の１分当たりの数（ｃｐｍ：ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ）の差分に対し、被験血清のｃｐｍの差分を調整する指標として表される。
具体的な手順は、以下のように２つの緩衝液の調製を含む：緩衝液１（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１％ＢＳＡ、０．１５％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１％アジ化ナトリウム ｐＨ ７．４）および緩衝液２（１％ＢＳＡの代わりに０．１％ＢＳＡである点を除き、緩衝液１と同じ）。各血清サンプルをスピンダウンして、必要に応じてフィブリン塊を取り除く。次いで、１ｍＬの５％ＢＳＡのＰＢＳ溶液に、１２５Ｉ－インスリン粉末の１０μＣｉを溶解させることにより、放射性標識インスリンのストック溶液を調製する。「ホット」インスリン抗原溶液は、３０４０μＬの緩衝液１と、１６０μＬの放射性標識インスリンストック溶液を使用して調製される。「コールド阻害」インスリン抗原溶液は、２７８４μＬの緩衝液１と、１６０μＬの放射性標識インスリンストック溶液と、２５６μＬのＨｕｍｕｌｉｎ（登録商標）溶液（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社、インディアナ州）を使用して調製される。使用するまで全ての溶液を氷上で維持する。ＰＣＲチューブにおいて、６μＬの各血清サンプルと、３０μＬの「ホット」インスリン抗原溶液を混合し、そして６μＬの各血清サンプルと３０μＬの「コールド阻害」インスリン抗原溶液を混合する。得られた混合液を一晩、４℃でインキュベートする。次いで、１５０μＬの緩衝液１を各ウェルに添加し、続いて一晩、アルミニウムホイルのカバーの下、室温でインキュベートする。その後洗浄して、洗浄緩衝液を取り除くことにより、プレートをＢＳＡでコーティングする。プロテイン－Ａ／Ｇセファロース混合物は、２つに分けて調製される。プロテイン－Ａセファロース溶液は、６２．５％の体積濃度で緩衝液１中で調製される。プロテイン－Ｇセファロース溶液は、４０％の体積濃度で緩衝液１中で調製される。最後に、プロテイン－Ａ／Ｇセファロース混合物は、４：１の比率でプロテイン－Ａセファロース溶液と、プロテイン－Ｇセファロース溶液とを混合することにより調製される（最終濃度：５０％ プロテイン－Ａ／８％ プロテイン－Ｇ セファロース）。アッセイを実施するために、５０μＬのプロテインＡ／Ｇセファロース混合物と、３０μＬの一晩インキュベートされた血清溶液を、各ウェルにデュプリケイトで添加する。プレート振とう器上で４５分間、４℃でプレートを混合し、次いでＭｉｌｌｉｐｏｒｅプレート洗浄機を使用して１ウェル当たり２００μＬの洗浄緩衝液を用いて７回プレートを洗浄し、その後、３７℃のインキュベーター中に１５分間置いて乾燥させる。５０μＬのシンチレーションカクテル（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ－２０）を各ウェルに添加し、９６ウェルプレートカウンターを使用してプレートを計数し、各ウェルのｃｐｍを決定する。
等価
請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対であることが示唆されない限り、または文脈から明白でない限り、１つ、または１つよりも多いことを意味し得る。反対であることが示唆されない限り、または文脈から明白でない限り、群の１つ以上の構成員の間に「または」を含む請求の範囲または明細書は、群の１つ、複数、またはすべての構成員が、所与の産物またはプロセスに存在する、採用される、または別手段により関連する場合を成立させるとみなされる。本開示は、群の正確に１つの構成員が、所与の産物またはプロセスに存在する、採用される、または別手段により関連する実施形態を含む。本開示は、群の複数またはすべての構成員が、所与の産物またはプロセスに存在する、採用される、または別手段により関連する実施形態を含む。
さらに本開示は、列記される請求の範囲の１つ以上に由来する１つ以上の限定、要素、節、および記述に関する用語を、別の請求の範囲に導入するバリエーション、組み合わせ、および並び替えをすべて包含する。例えば別の請求の範囲に依存する任意の請求の範囲を、同じ基礎となる請求の範囲に依存する任意の他の請求の範囲にある１つ以上の限定を含むように改変する場合がある。要素が例えばマーカッシュ群形式などのリストとして提示される場合、当該要素の下位群のそれぞれも開示されており、そして任意の要素が当該群から取り除かれ得る。概して、本開示または本開示の態様が、特定の要素および／または特性を含むものとして言及されている場合、本開示の特定の実施形態または本開示の特定の態様は、そのような要素および／または特性からなるか、または本質的にそれらからなることを理解されたい。簡易さを目的として、それら実施形態は、その通りの文言で本明細書に具体的には記述されない。また、「含む」、「含むこと」、「含有する」、および「含有すること」という用語は、オープンであることが意図され、その使用によって、追加の要素または工程の含有が容認されることに留意されたい。範囲が記載される場合、終点が含まれる。さらに、別段の示唆が無い限り、または文脈や当業者の理解から明白でない限り、範囲として表されている値は、別段であることが文脈で明白に指示されない限り、本開示の異なる実施形態において規定される任意の特定の値、または当該範囲内の下位範囲を、当該範囲の下限の１０分の１の単位まで想定する場合がある。
本発明技術の様々な実施形態の追加的な利点は、本明細書に記載される開示内容および実施例を再検討することで当業者には明白である。本明細書に記載される様々な実施形態は、本明細書に別段の示唆が無い限り、必ずしも相互的に排他的ではないことを認識されたい。例えば１つの実施形態において記載される、または示される特性は、他の実施形態でも含まれる場合があるが、必ず含まれるわけではない。したがって本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態の様々な組み合わせおよび／または統合を包含する。
本明細書は、本発明の様々な実施形態に関連する特定のパラメーターを定量化するために、数値的な範囲も使用する。数値的な範囲が提供される場合、当該範囲は、当該範囲の下位値のみを列挙する請求の範囲の限定、ならびに当該範囲の上位値のみを列挙する請求の範囲の限定に対する逐語的なサポートを提供するものとみなされることを理解されたい。例えば、約１０～約１００という数値範囲が開示される場合、「約１０よりも大きい」（上限が無い）を列挙する請求の範囲、および「約１００よりも小さい」（下限が無い）を列挙する請求の範囲に対する逐語的なサポートが提供される。
１つの試みにおいて、リンカーも短縮化され、組成もＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号３）へと変えられた。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片のヒンジ領域およびＣ末端リシンは元に戻され、配列番号７のＦｃ断片が作製された。
ＳＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７）
さらなる試みにおいて、配列番号１４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ断片、および配列番号３のリンカーが維持され、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片のＣ末端リシンが再度除去されて、配列番号３３のＦｃ断片が作製された。
ＳＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号３３）
本開示は、前述の医薬組成物または医薬調製物のいずれかでのFc融合タンパク質の製剤を予期するものである。さらに本開示は、前述の投与経路のいずれかを介した投与を予期するものである。当業者であれば、適切な製剤、用量レベルおよび投与経路を、治療される状態、ならびに治療される患者の全般的な健康状態、年齢および身長に応じて選択することができる。
本発明は以下の通りである。
［１］ウイルス受容体結合ドメインおよびＦｃ断片を含む融合タンパク質であって、前記ウイルス受容体結合ドメインおよび前記Ｆｃ断片が、ペプチドリンカーなどの任意選択的なリンカーにより連結され、前記ウイルス受容体結合ドメインが、以下の配列：
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳ（配列番号１３）、もしくは
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦ（配列番号１４）、もしくは
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫ（配列番号１５）、
またはその機能的断片を含む、融合タンパク質。
［２］前記Ｆｃ断片が、以下の配列：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号６）、もしくは
ＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号３３）、
またはその機能的断片を含む、上記［１］に記載の融合タンパク質。
［３］前記リンカーが、存在する場合、以下の配列：ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５）、またはＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号２７）を含む、上記［１］または［２］に記載の融合タンパク質。
［４］前記融合タンパク質が、以下の配列：
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＧＧＧＳＧＧＧＳＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１６）、もしくは
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１８）、もしくは
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＧＧＧＳＧＧＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１９）、もしくは
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＧＧＧＳＧＧＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２０）、もしくは
ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２１）、
またはその機能的断片を含む、上記［１］に記載の融合タンパク質。
［５］前記融合タンパク質がホモ二量体である、上記［１］～［４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［６］前記Ｆｃ断片がグリコシル化されたものである、上記［１］～［５］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［７］上記［１］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質、および薬学的に許容可能な担体を含む、免疫原性組成物。
［８］アジュバントをさらに含む、上記［７］に記載の免疫原性組成物。
［９］前記アジュバントがＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ－７２０である、上記［８］に記載の免疫原性組成物。
［１０］前記融合タンパク質が前記アジュバントで乳化されたものである、上記［８］または［９］に記載の免疫原性組成物。
［１１］前記組成物が注射製剤である、上記［７］～［１０］のいずれかに記載の免疫原性組成物。
［１２］前記組成物が皮下投与用に適合される、上記［７］～［１１］のいずれかに記載の免疫原性組成物。
［１３］前記組成物が予防ワクチン用に適合される、上記［７］～［１２］のいずれかに記載の免疫原性組成物。
［１４］前記組成物が治療ワクチン用に適合される、上記［７］～［１２］のいずれかに記載の免疫原性組成物。
［１５］前記融合タンパク質が前記担体中に分散されたものである、上記［７］～［１４］のいずれかに記載の免疫原性組成物。
［１６］対象において抗原に対する抗体産生を増加させる方法であって、上記［１］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質、または上記［７］～［１４］のいずれかに記載の免疫原性組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
［１７］前記融合タンパク質または免疫原性組成物の投与前に、前記対象が前記抗原に対して測定可能な抗体価を有する、上記［１６］に記載の方法。
［１８］前記融合タンパク質または免疫原性組成物の投与前に、前記対象が抗体未感作である、上記［１６］に記載の方法。
［１９］前記融合タンパク質または免疫原性組成物が注射を介して投与される、上記［１６］～［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］前記融合タンパク質または免疫原性組成物が、皮下投与される、または筋肉内投与される、上記［１９］に記載の方法。
［２１］前記融合タンパク質または免疫原性組成物が単位剤形として提供される、上記［１６］～［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］前記融合タンパク質または免疫原性組成物がアジュバントと同時投与される、上記［１６］～［２０］のいずれかに記載の方法。
［２３］投与用に前記融合タンパク質または免疫原性組成物を調製することをさらに含み、前記調製が前記投与前に前記融合タンパク質または免疫原性組成物とアジュバントを予め混合することを含む、上記［１６］～［２０］のいずれかに記載の方法。
［２４］前記予め混合することが、前記アジュバントと前記融合タンパク質を乳化してエマルションを得ること、および前記エマルションを前記対象に投与することを含む、上記［２３］に記載の方法。
［２５］対象においてウイルス感染（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染、より好ましくはＣＯＶＩＤ－１９感染）に対する免疫反応を誘導する方法であって、上記［１］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質、または［７］～［１４］のいずれかに記載の免疫原性組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
［２６］前記融合タンパク質または免疫原性組成物の投与前に、前記対象が前記ウイルス感染に対して測定可能な抗体価を有する、上記［２５］に記載の方法。
［２７］前記融合タンパク質または免疫原性組成物の投与前に、前記対象が抗体未感作である、上記［２５］に記載の方法。
［２８］前記融合タンパク質または免疫原性組成物が注射を介して投与される、上記［２５］～［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］前記融合タンパク質または免疫原性組成物が、皮下投与される、または筋肉内投与される、上記［２９］に記載の方法。
［３０］前記融合タンパク質または免疫原性組成物が単位剤形として提供される、上記［２５］～［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］前記融合タンパク質または免疫原性組成物がアジュバントと同時投与される、上記［２５］～［３０］のいずれかに記載の方法。
［３２］投与用に前記融合タンパク質または免疫原性組成物を調製することをさらに含み、前記調製が前記投与前に前記融合タンパク質または免疫原性組成物とアジュバントを予め混合することを含む、上記［２５］～［３１］のいずれかに記載の方法。
［３３］前記予め混合することが、前記アジュバントと前記融合タンパク質を乳化すること、および前記エマルションを前記対象に投与することを含む、上記［３２］に記載の方法。
［３４］上記［１］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質の製造方法であって、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ－ＳＥ細胞に前記融合タンパク質をコードする核酸を一過性にトランスフェクトすることを含み、前記トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ－Ｓ細胞が前記融合タンパク質を発現する、またはＣＨＯ細胞に前記融合タンパク質をコードする核酸を安定的にトランスフェクトすることを含み、前記組み換えＣＨＯ細胞が前記融合タンパク質を発現する、方法。
［３５］前記融合タンパク質が前記細胞によって細胞培養培地内に分泌され、前記培地から前記融合タンパク質を精製または単離することをさらに含み、前記精製された融合タンパク質または単離された融合タンパク質の収量が、前述の発現系のいずれかにおいて２０ｍｇ／Ｌより多い、上記［３４］に記載の方法。
［３６］上記［１］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質を発現するように操作された、細胞。
［３７］前記細胞が前記融合タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされたものである、上記［３６］に記載の細胞。
［３８］前記細胞がＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である、上記［３６］または［３７］に記載の細胞。
［３９］上記［１］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする、ｃＤＮＡ。
［４０］上記［３９］に記載のｃＤＮＡを含む、発現ベクター。
［４１］治療に使用するための、および／または医薬品として使用するための、上記［１］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質、または上記［７］～［１４］のいずれかに記載の免疫原性組成物。
［４２］対象の抗体産生の増加に使用するための、上記［１］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質、または上記［７］～［１４］のいずれかに記載の免疫原性組成物。
［４３］ウイルス感染（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染、より好ましくはＣＯＶＩＤ－１９感染）の治療および／または予防に使用するための、上記［１］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質、または上記［７］～［１４］のいずれかに記載の免疫原性組成物。
［４４］予防ワクチン、治療ワクチン、および／またはブースターワクチンとしての上記［３４］に記載の使用のための、上記［１］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質、または上記［７］～［１４］のいずれかに記載の免疫原性組成物。
［４５］ウイルス感染（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染、より好ましくはＣＯＶＩＤ－１９感染）の治療および／または予防における使用のための、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１からなる群から選択される、融合タンパク質、またはそれらの医薬組成物。
［４６］ウイルス感染の治療および／または予防のための医薬品の製造における、上記［１］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質の使用、または上記［７］～［１４］のいずれかに記載の免疫原性組成物の使用。

Claims (46)

  1. ウイルス受容体結合ドメインおよびＦｃ断片を含む融合タンパク質であって、前記ウイルス受容体結合ドメインおよび前記Ｆｃ断片が、ペプチドリンカーなどの任意選択的なリンカーにより連結され、前記ウイルス受容体結合ドメインが、以下の配列：
    ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳ（配列番号１３）、もしくは
    ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦ（配列番号１４）、もしくは
    ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫ（配列番号１５）、
    またはその機能的断片を含む、融合タンパク質。
  2. 前記Ｆｃ断片が、以下の配列：
    ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号６）、もしくは
    ＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号３３）、
    またはその機能的断片を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記リンカーが、存在する場合、以下の配列：ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５）、またはＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号２７）を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  4. 前記融合タンパク質が、以下の配列：
    ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＧＧＧＳＧＧＧＳＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１６）、もしくは
    ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＧＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１８）、もしくは
    ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＧＧＧＳＧＧＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１９）、もしくは
    ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＧＧＧＳＧＧＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２０）、もしくは
    ＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２１）、
    またはその機能的断片を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  5. 前記融合タンパク質がホモ二量体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  6. 前記Ｆｃ断片がグリコシル化されたものである、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、および薬学的に許容可能な担体を含む、免疫原性組成物。
  8. アジュバントをさらに含む、請求項７に記載の免疫原性組成物。
  9. 前記アジュバントがＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ－７２０である、請求項８に記載の免疫原性組成物。
  10. 前記融合タンパク質が前記アジュバントで乳化されたものである、請求項８または９に記載の免疫原性組成物。
  11. 前記組成物が注射製剤である、請求項７～１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  12. 前記組成物が皮下投与用に適合される、請求項７～１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  13. 前記組成物が予防ワクチン用に適合される、請求項７～１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  14. 前記組成物が治療ワクチン用に適合される、請求項７～１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  15. 前記融合タンパク質が前記担体中に分散されたものである、請求項７～１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  16. 対象において抗原に対する抗体産生を増加させる方法であって、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項７～１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
  17. 前記融合タンパク質または免疫原性組成物の投与前に、前記対象が前記抗原に対して測定可能な抗体価を有する、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記融合タンパク質または免疫原性組成物の投与前に、前記対象が抗体未感作である、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記融合タンパク質または免疫原性組成物が注射を介して投与される、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記融合タンパク質または免疫原性組成物が、皮下投与される、または筋肉内投与される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記融合タンパク質または免疫原性組成物が単位剤形として提供される、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記融合タンパク質または免疫原性組成物がアジュバントと同時投与される、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. 投与用に前記融合タンパク質または免疫原性組成物を調製することをさらに含み、前記調製が前記投与前に前記融合タンパク質または免疫原性組成物とアジュバントを予め混合することを含む、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記予め混合することが、前記アジュバントと前記融合タンパク質を乳化してエマルションを得ること、および前記エマルションを前記対象に投与することを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 対象においてウイルス感染（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染、より好ましくはＣＯＶＩＤ－１９感染）に対する免疫反応を誘導する方法であって、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項７～１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
  26. 前記融合タンパク質または免疫原性組成物の投与前に、前記対象が前記ウイルス感染に対して測定可能な抗体価を有する、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記融合タンパク質または免疫原性組成物の投与前に、前記対象が抗体未感作である、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記融合タンパク質または免疫原性組成物が注射を介して投与される、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記融合タンパク質または免疫原性組成物が、皮下投与される、または筋肉内投与される、請求項２９に記載の方法。
  30. 前記融合タンパク質または免疫原性組成物が単位剤形として提供される、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記融合タンパク質または免疫原性組成物がアジュバントと同時投与される、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 投与用に前記融合タンパク質または免疫原性組成物を調製することをさらに含み、前記調製が前記投与前に前記融合タンパク質または免疫原性組成物とアジュバントを予め混合することを含む、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記予め混合することが、前記アジュバントと前記融合タンパク質を乳化すること、および前記エマルションを前記対象に投与することを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質の製造方法であって、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ－ＳＥ細胞に前記融合タンパク質をコードする核酸を一過性にトランスフェクトすることを含み、前記トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ－Ｓ細胞が前記融合タンパク質を発現する、またはＣＨＯ細胞に前記融合タンパク質をコードする核酸を安定的にトランスフェクトすることを含み、前記組み換えＣＨＯ細胞が前記融合タンパク質を発現する、方法。
  35. 前記融合タンパク質が前記細胞によって細胞培養培地内に分泌され、前記培地から前記融合タンパク質を精製または単離することをさらに含み、前記精製された融合タンパク質または単離された融合タンパク質の収量が、前述の発現系のいずれかにおいて２０ｍｇ／Ｌより多い、請求項３４に記載の方法。
  36. 請求項１～６のいずれかに記載の融合タンパク質を発現するように操作された、細胞。
  37. 前記細胞が前記融合タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされたものである、請求項３６に記載の細胞。
  38. 前記細胞がＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項３６または請求項３７に記載の細胞。
  39. 請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、ｃＤＮＡ。
  40. 請求項３９に記載のｃＤＮＡを含む、発現ベクター。
  41. 治療に使用するための、および／または医薬品として使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項７～１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  42. 対象の抗体産生の増加に使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項７～１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  43. ウイルス感染（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染、より好ましくはＣＯＶＩＤ－１９感染）の治療および／または予防に使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項７～１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  44. 予防ワクチン、治療ワクチン、および／またはブースターワクチンとしての請求項３４に記載の使用のための、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項７～１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  45. ウイルス感染（好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染、より好ましくはＣＯＶＩＤ－１９感染）の治療および／または予防における使用のための、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１からなる群から選択される、融合タンパク質、またはそれらの医薬組成物。
  46. ウイルス感染の治療および／または予防のための医薬品の製造における、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用、または請求項７～１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
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