JP7170332B2 - インスリンとｆｃの融合物および使用方法 - Google Patents

インスリンとｆｃの融合物および使用方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月９日に出願した米国出願第６２／４３２，２６８号、２０１７年６月２日に出願した米国出願第６２／５１４，４２７号、２０１７年６月２日に出願した米国出願第６２／５１４，４４９号、および２０１７年６月２日に出願した米国出願第６２／５１４，４６０号の恩恵ならびに優先権を主張し、それらの内容は、全体が参照により本明細書に取り込まれる。
技術分野
本テクノロジーは、インスリンとＦｃ（例えば、プロインスリンとＦｃ）の融合タンパク質の組成物および自己免疫疾患、例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病を処置するためのそれらの使用に関する。
本テクノロジーの背景の以下の記載は、本テクノロジーの理解の助けとして単に提供され、本テクノロジーの先行技術を記載するかまたは構成するとは認められない。
自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、免疫系が、膵臓のインスリン産生β細胞を攻撃し、破壊する、糖尿病の形態である。結果として生じるインスリン欠如は、患者の血液および尿中のグルコースの増大したレベルを導き、心疾患、腎疾患、脳卒中、神経障害、皮膚潰瘍、および失明を含む多数の重篤な長期的な合併症に関与する（Diabetes Care (2013) 36, 1033-1044）。糖尿病の全世界の有病率は、年齢１８歳を超える成人の間でおよそ９％であると推定され、２０３０年までに世界中の成人集団の１０％に増えると予測される（Diabetes Voice, Global Perspective on Diabetes, 2011）。米国において、１５，０００人より多くの小児および１５，０００人の成人が、毎年Ｉ型糖尿病と診断される。米国において、Ｔ１Ｄは、１型および２型を含む診断された糖尿病の経済的負担のほぼ９％を占めること（Dall, T. M. et al, Popul Health Manag (2009) 12, 103-110）、または直接的な医療コストおよび間接的なコストにおいておよそ１年当たり２００億ドルを占める（Diabetes Care 36 (2013), 1033-1044）と推定されている。
現在の処置は、血液グルコースレベルを正常にすることに失敗し、これが、多数の糖尿病の合併症を導く。それ故、この疾患について、コスト上より有効でかつあまり負担とならない処置選択肢が必要である。
１つの態様において、本開示は、Ｆｃドメインに融合されたインスリンポリペプチドを含むインスリンとＦｃの融合タンパク質であって、インスリンポリペプチドが、Ｂ鎖ペプチド、Ｃ鎖ペプチド、およびＡ鎖ペプチドを含み、Ｃ鎖ペプチドのアミノ酸配列がＡＡＫである、インスリンとＦｃの融合タンパク質を提供する。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、競合的結合アッセイにおいてヒトインスリン受容体にＩＣ５０＞５，０００ｎＭで結合する。加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、インスリン＋Ｂ細胞受容体のインスリンへのインビトロでの結合をＩＣ５０≦１００ｎＭで阻害する。加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、Ｔ細胞を活性化して、組換えヒトインスリンにより活性化されたＴ細胞において観察されたものと比較して、低減されたＩＬ－２レベルを分泌する。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、Ｔ細胞を活性化して、３，０００ｐｇ／ｍｌ未満であるＩＬ－２レベルを分泌する。
ある特定の実施形態において、インスリンポリペプチドは、プロインスリンポリペプチドまたはプレプロインスリンポリペプチドである。インスリンとＦｃの融合タンパク質のある実施形態において、Ａ鎖ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１９を含む。インスリンポリペプチドは、ペプチドリンカーを介してＦｃフラグメントに融合されていてもよい。ペプチドリンカーの例は、配列番号２０および配列番号２１を含む。あるいは、ペプチドリンカーが、インスリンとＦｃの融合タンパク質のインスリンポリペプチドとＦｃドメインの間に存在しなくてもよい（例えば、インスリンポリペプチドのＣ末端領域が、ＦｃドメインのＮ末端領域に共有結合（例えば、ペプチド結合を介して）されるか、またはインスリンポリペプチドのＮ末端領域が、ＦｃドメインのＣ末端領域に共有結合（例えば、ペプチド結合を介して）される、例えば、配列番号７）。加えてまたは代わりに、インスリンとＦｃの融合タンパク質のある実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１の野生型Ｆｃフラグメントを含む。ある特定の実施形態において、Ｆｃドメインのアミノ酸配列は、配列番号２２を含む。
加えてまたは代わりに、インスリンとＦｃの融合タンパク質の上記の実施形態のいずれかにおいて、Ｎ末端からＣ末端へのインスリンポリペプチドの配向性は、（Ｎ末端）－Ｂ鎖ペプチド－－Ｃ鎖ペプチド－－Ａ鎖ペプチド－（Ｃ末端）である。インスリンポリペプチドは、ＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端に位置してもよい。
加えてまたは代わりに、インスリンとＦｃの融合タンパク質の上記の実施形態のいずれかにおいて、Ｂ鎖ペプチドは、アミノ酸配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＸ１ＡＬＸ２ＬＶＣＧＥＸ３ＧＦＦＹＴＰＫ（配列番号２８）（式中、Ｘ１は、ＥまたはＱであり、Ｘ２は、ＹまたはＡであり、Ｘ３は、ＲまたはＥである）を含む。ある特定の実施形態において、Ｘ２はＡである。
１つの態様において、本開示は、Ｆｃドメインに融合されたインスリンポリペプチドを含むインスリンとＦｃの融合タンパク質であって、インスリンポリペプチドが、Ｂ鎖ペプチド、Ｃ鎖ペプチド、およびＡ鎖ペプチドを含み、Ｂ鎖ペプチドが、アミノ酸配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＸ１ＡＬＸ２ＬＶＣＧＥＸ３ＧＦＦＹＴＰＫ（配列番号２８）（式中、Ｘ１は、ＥまたはＱであり、Ｘ２は、ＹまたはＡであり、およびＸ３は、ＲまたはＥである）を含み、Ｃ鎖ペプチドのアミノ酸配列がＡＡＫである、インスリンとＦｃの融合タンパク質を提供する。ある実施形態において、Ｘ２はＡである。
インスリンとＦｃの融合タンパク質のある特定の実施形態において、インスリンポリペプチドは、プロインスリンポリペプチドまたはプレプロインスリンポリペプチドである。インスリンとＦｃの融合タンパク質のある実施形態において、Ａ鎖ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１９を含む。インスリンポリペプチドは、ペプチドリンカーを介してＦｃフラグメントに融合されてもよい。ペプチドリンカーの例は、配列番号２０および配列番号２１を含む。あるいは、ペプチドリンカーは、インスリンとＦｃの融合タンパク質のインスリンポリペプチドとＦｃドメインの間に存在しなくてもよい。加えてまたは代わりに、インスリンとＦｃの融合タンパク質のある実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１の野生型Ｆｃフラグメントを含む。ある特定の実施形態において、Ｆｃドメインのアミノ酸配列は、配列番号２２を含む。
加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８である。
加えてまたは代わりに、インスリンとＦｃの融合タンパク質の上記の実施形態のいずれかにおいて、Ｎ末端からＣ末端へのインスリンポリペプチドの配向性は、（Ｎ末端）－Ｂ鎖ペプチド－－Ｃ鎖ペプチド－－Ａ鎖ペプチド－（Ｃ末端）である。インスリンポリペプチドは、ＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端に位置してもよい。
別の態様において、本開示は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択されるインスリンとＦｃの融合タンパク質をコードする組換え核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ）、または配列番号１、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６の核酸配列を提供する。
１つの態様において、本開示は、本明細書において開示される組換え核酸配列を含むベクター、ならびにかかるベクターを含む操作された真核生物の細胞（例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質をコードする組換え核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ）でトランスフェクトされた）を提供する。
別の態様において、本開示は、対象に有効量の本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質を投与することを含む、それを必要とする対象において自己免疫性糖尿病を処置または予防する方法を提供する。自己免疫性糖尿病は、１型糖尿病、若年性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、または潜在性自己免疫性糖尿病を含み得る。
本明細書において開示される方法のある実施形態において、対象は、自己免疫性糖尿病と診断されたか、またはそのリスクがある。ある実施形態において、対象は、自己免疫性糖尿病と３ヶ月未満、６ヶ月未満、９ヶ月未満、１年未満、または１．５年未満の間診断されている。
加えてまたは代わりに、本明細書において開示される方法のある実施形態において、対象は、検出可能なレベルの少なくとも１つの自己免疫抗体を有するが、高血糖を有しない。ある実施形態において、少なくとも１つの自己免疫抗体は、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）、抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）抗体、および抗膵島抗原２（ＩＡ－２）抗体からなる群から選択される。他の実施形態において、対象は、検出可能なレベルのインスリン自己抗体（ＩＡＡ）、抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）抗体、および抗膵島抗原２（ＩＡ－２）抗体を欠く。
加えてまたは代わりに、本明細書において開示される方法のある実施形態において、対象は、検出可能なレベルの病原性Ｂ細胞集団または疾患を引き起こすＢ細胞集団（例えば、抗インスリンＢ細胞、インスリン特異的Ｂ細胞、もしくはインスリン＋Ｂ細胞）を有する。他の実施形態において、対象は、検出可能なレベルの病原性Ｂ細胞集団または疾患を引き起こすＢ細胞集団（例えば、抗インスリンＢ細胞、インスリン特異的Ｂ細胞、もしくはインスリン＋Ｂ細胞）を欠く。
加えてまたは代わりに、本明細書において開示される方法のある実施形態において、対象は、（ａ）ＤＲＢ１＊０３０１－ＤＱＡ１＊０５０１－ＤＱＢ１＊０２０１；（ｂ）ＤＲＢ１＊０４０５－ＤＱＡ１＊０３０１－ＤＱＢ１＊０３０２；（ｃ）ＤＲＢ１＊０４０１－ＤＱＡ１＊０３０１－ＤＱＢ＊０３０２；（ｄ）ＤＲＢ１＊０４０２－ＤＱＡ１＊０３０１－ＤＱＢ１＊０３０２；（ｅ）ＤＲＢ１＊０４０４－ＤＱＡ１＊０３０１－ＤＱＢ１＊０３０２；および（ｆ）ＤＲＢ１＊０８０１－ＤＱＢ１＊０４０１－ＤＱＢ１＊０４０２からなる群から選択される１つまたは複数のヒト白血球抗原（HＬＡ）ハプロタイプを持つ。
加えてまたは代わりに、本明細書において開示される方法のある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、非経口、静脈内または皮下投与される。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、注射可能なデポ製剤として投与される。他の実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、ボーラス注入または静脈内プッシュとして投与される。ある特定の実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、注射器注射、ポンプ、ペン、針、または留置カテーテルを通じて投与される。インスリンとＦｃの融合タンパク質は、１回用量としてまたは複数回用量で投与されてもよい。ある特定の実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、毎日、１日２回、１週間に２回、または少なくとも毎週、対象に投与される。
加えてまたは代わりに、本明細書において開示される方法のある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与は、投与に先立ち対象において観察されたものと比較して、対象において（例えば、血液または脾臓において）低減した数の抗インスリンＢ細胞（例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上の低減）をもたらす。インスリンとＦｃの融合タンパク質は、１回または複数回投与されてもよい。ある特定の実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与は、抗インスリンＢ細胞以外のＢ細胞の数を実質的に低減しない。本明細書において開示される方法のある実施形態において、対象は、投与に先立ち対象において観察されたものと比較して、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、２週間後、３週間以上後に、抗インスリンＢ細胞の数の低減を示す。
加えてまたは代わりに、本明細書において開示される方法のある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与は、投与に先立ち対象において観察されたものと比較して、対象において減少したレベルのインスリン自己抗体（例えば、循環ＩＡＡ）をもたらす（例えば、少なくとも５％の減少）。本明細書において開示される方法のある実施形態において、対象は、投与に先立ち対象において観察されたものと比較して、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、２週間後、３週間以上後に減少したレベルのインスリン抗体を示す。インスリンとＦｃの融合タンパク質は、１回または複数回投与されてもよい。
加えてまたは代わりに、本明細書において開示される方法のある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与後の対象の血液グルコースレベルは、投与に先立ち対象において観察されたものと同等である。本明細書において開示される方法のある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、２週間後、３週間以上後の対象の血液グルコースレベルは、投与に先立ち対象において観察されたものと同等である。インスリンとＦｃの融合タンパク質は、１回または複数回投与されてもよい。
上記の実施形態において、対象は、参照標準、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質での処置前と比べて、（ｉ）０．２５ｎｍｏｌ／Ｌ以上より高いかまたは等しい（例えば、０．４、０．６、１、１．５ｎｍｏｌ／Ｌ以上より高いかもしくは等しい）；および／あるいは（ｉｉ）約９０％、５０％、２５％、もしくは１０％より高いかまたは等しい、例えば、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与前の、内在性Ｃペプチドレベルを有する。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質のグルコース低下活性は、ヒトインスリンのような参照標準より低い。
本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質、および使用のための説明書を含むキットも、本明細書において開示される。
典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質の図式表現を示す。それぞれのインスリンとＦｃの融合タンパク質は、Ｂ鎖のＣ末端領域とリンカーペプチドを有するＡ鎖のＮＨ２末端の間で場合により結合されているインスリンＢ鎖およびインスリンＡ鎖、ならびにＡ鎖のＣ末端領域およびリンカーを有するＦｃ鎖アミノ末端を含有し、インスリンとＦｃの融合タンパク質の配列がＦｃ－ＣＨ３－Ｃ末端領域で終結するプロインスリン様インスリン分子を含む。 インスリンホルモン受容体と相互作用しないが、インスリン特異的Ｂ細胞受容体に結合し、抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を通じてそれらの破壊を指示する能力がある、インスリンとＦｃの融合タンパク質を描く説明を示す。 ＨＥＫ細胞においておよびＣＨＯ細胞において作られた、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質についてのタイター濃度を描くグラフを示す。示したタイターは、タンパク質Ａの精製工程後に観察されたタイターである。 分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）を使用して計算した、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質についてのホモダイマーパーセンテージを描くグラフを示す。 典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）を、２ｍｇ／ｋｇでＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与したときの、経時的インスリンとＦｃの融合タンパク質濃度を描くグラフを示す。 典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与したときの、経時的血清空腹時血液グルコースレベル（ＦＢＧＬ）を描くグラフである。 ＲＨＩ（ＩＣ５０＝３ｎＭ）および典型的なインスリンとＦｃタンパク質（配列番号３）（ＩＣ５０＝１０ｎＭ）についての、ラジオイムノアッセイを介した、１２５Ｉ標識組換えインスリン（ＲＨＩ）の前糖尿病のＩＡＡ陽性ヒト対象の血清中のインスリン自己抗体（ＩＡＡ）への結合の阻害を描くグラフを示す。 ビークルで処理した１２５Ｔｇ脾細胞／ラットＡＭ共培養液由来の％インスリン＋Ｂ細胞についての代表的なＦＡＣＳドットプロットを描くグラフを示す。 典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）で処理した１２５Ｔｇ脾細胞／ラットＡＭ共培養液由来の％インスリン＋Ｂ細胞についての代表的なＦＡＣＳドットプロットを描くグラフを示す。 １２５Ｔｇ脾細胞／ラットＡＭ共培養液由来のインスリン＋Ｂ細胞の除去における典型的なインスリンとＦｃタンパク質（配列番号３）とその対応する活性の用量応答曲線を示す。 ＶＨ１２５ＮＯＤマウスにおける典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）の２週間の投与計画後のインビボでの細胞低減データを示す一連のグラフである。図７Ａは、ビークルで処置した対照のパーセントとしての血中インスリン＋Ｂ細胞を示すグラフであり；図７Ｂは、対照のパーセントとしての血中インスリン（－）Ｂ細胞を示すグラフであり；図７Ｃは、対照のパーセントとしての脾臓（全膵臓区画）におけるインスリン＋Ｂ細胞を示すグラフであり；図７Ｄは、辺縁帯脾臓集団（ＣＤ２１高ＣＤ２３高）におけるインスリン＋Ｂ細胞を示し；図７Ｅは、濾胞性脾臓集団（ＩｇＭ中ＣＤ２１中）におけるインスリン＋Ｂ細胞を示し；図７Ｆは、Ｔ１脾臓集団（ＣＤ２１低ＣＤ２３低）におけるインスリン＋Ｂ細胞を示し；図７Ｇは、Ｔ２脾臓集団（ＩｇＭ高ＣＤ２１中）におけるインスリン＋Ｂ細胞を示し；図７Ｈは、前辺縁帯脾臓集団（ＩｇＭ高ＣＤ２１高）におけるインスリン＋Ｂ細胞を示す。 インビボでのインスリン＋Ｂ細胞の低減データを示すグラフである。図８Ａは、ＶＨ１２５ＮＯＤマウスにおける典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）の３４週間の投与計画後の骨髄区画におけるインビボでのＩｇＭ高インスリン＋Ｂ細胞の低減データを示し；図８Ｂは、ＶＨ１２５ＮＯＤマウスにおける典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）の３４週間の投与計画後のリンパ節区画におけるインビボでのＩｇＭ高インスリン＋Ｂ細胞の低減データを示す。 本テクノロジーのいくつかのインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、および１０）ならびに組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）対照についてのＩＬ－２介在性５ＫＣ－３－４Ｔ細胞株刺激のＥＬＩＳＡデータを示すグラフである。 複数濃度に渡る典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）ならびに様々な対照的なインスリン－Ｆｃ融合タンパク質（配列番号９および１０）ならびに対照についてのＴ細胞刺激性化合物により誘導されるＩＬ－２分泌の競合的阻害を示すグラフである。 対照としてのＲＨＩに加えていくつかのインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、および１０）についてのインスリン特異的１２５ＴｇＢ細胞除去の有効性の定性的スコアリングを示すグラフである。 対照としてのＲＨＩに加えていくつかのインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、および１０）についてのクローニングされたインスリン特異的Ｂ細胞受容体（ｍＡｂ１２５）の抗体形態へのビオチン標識インスリン結合の阻害を示すグラフである。 典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）で処置したメスの３週齢の野生型ＮＯＤマウス（それぞれの処置群においてｎ＝１５）におけるＴ１Ｄの発症についてのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。 典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）で処置したメスの３週齢の野生型ＮＯＤマウス（それぞれの処置群においてｎ＝２０）におけるＴ１Ｄの発症についてのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。 典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号２）で処置したメスの３週齢の野生型ＮＯＤマウス（それぞれの処置群においてｎ＝２０）におけるＴ１Ｄの発症についてのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。 典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号４）で処置したメスの３週齢の野生型ＮＯＤマウス（それぞれの処置群においてｎ＝１８）におけるＴ１Ｄの発症についてのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。
本方法のある特定の態様、様式、実施形態、バリエーションおよび特性が、本テクノロジーの実質的な理解をもたらすために、様々なレベルの詳細さで以下に記載されることは、理解されるべきである。
本方法の実施において、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学および組換えＤＮＡにおける多くの従来技術が使用される。例えば、Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition；シリーズのAusubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology；シリーズのMethods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach；Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition；Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis;米国特許第４，６８３，１９５号；Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization；Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986))；Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)；およびHerzenberg et al. eds (1996) Weir 's Handbook of Experimental Immunologyを参照。
本開示は、インスリンとＦｃの融合タンパク質（例えば、プロインスリンとＦｃの融合タンパク質）の組成物および自己免疫疾患、例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病を処置または予防するためのそれらの使用に関する。本明細書に記載される通り、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質は、自己抗原特異的Ｂ細胞（例えば、インスリン特異的Ｂ細胞）に選択的に結合し、これにより、全てのＢ細胞の非特異的な包括的な排除と関連する弱点（例えば、免疫不全状態）を回避する。加えて、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質は、インスリンホルモン受容体に結合するインスリンに対する結合親和性を欠くので、それらは、インスリンホルモン受容体を発現する全ての細胞を非特異的に除去することを回避する。理論に束縛されるものではないが、ある実施形態において、本明細書に記載される融合タンパク質が、自己抗原特異的ＢＣＲ（例えば、インスリン特異的ＢＣＲ）に結合すると信じられる。
本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質は、ビオチン標識インスリンのＩＭ－９のインスリンホルモン受容体への結合と干渉せず、それ故、ＩＭ－９細胞上に存在するインスリン受容体に非常に弱く結合するか、または全く結合せず、インビボでの血糖を下げるそれらの機会を最小にする。これは、正常またはわずかに上昇した血糖レベルを有し得、本明細書に記載されるインビトロでの結合アッセイにおいて、インスリン受容体にＩＣ５０値＜３，０００ｎＭで、またはタンパク質にＩＣ５０値＜１，０００ｎＭでのより高い結合親和性でさえ結合することができるインスリンとＦｃの融合タンパク質での治療により誘導された可能性のある低血糖（例えば、低い血糖）のリスクが疑われる、自己免疫疾患を有する患者（例えば、前糖尿病患者、インスリン自己抗体を有する患者、または最近発症した１型糖尿病患者）を処置するのに有利な特性である。従って、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質は、それらのインビボ血液グルコースレベルを下げることなく、対象において自己免疫１型糖尿病を処置または予防するのに有用である。
定義
別段定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、一般に、本テクノロジーが属する当該技術分野における当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書および添付の請求の範囲において使用される通り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が別段明確に示さない限り、複数の参照物を含む。例えば、「１個の細胞」への言及は、２個以上の細胞の組合せなどを含む。一般に、本明細書において使用される命名法、ならびに以下に記載される細胞培養における実験室の手法、分子遺伝学、有機化学、分析化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションは、当該技術分野において周知であり、一般的に利用されるものである。
用語「インスリン＋」、「Ｉｎｓ＋」、「インスリン特異的」および「抗インスリン」は、本明細書において互換的に使用される。
本明細書において使用される、ＥＣ５０は、インビトロでのインスリン特異的Ｂ細胞の除去についての最大応答の半分が観察される、インスリンとＦｃの融合タンパク質の濃度（例えば、インスリン＋Ｂ細胞受容体が半分低減される濃度）を指す。
本明細書において使用される、ＩＣ５０は、所定の生物学的機能または生化学的プロセス（例えば、結合）が半分阻害される、インスリンとＦｃの融合タンパク質の濃度を指す。ある実施形態において、ＩＣ５０は、インスリンのヒトインスリン受容体への結合が半分低減される、インスリンとＦｃの融合タンパク質の濃度を指す。ある実施形態において、ＩＣ５０は、インスリンのインスリン特異的Ｂ細胞への結合が半分低減される、インスリンとＦｃの融合タンパク質の濃度を指す。ある実施形態において、ＩＣ５０は、参照標準により誘導されるＴ細胞活性化が半分低減される、インスリンとＦｃの融合タンパク質の濃度である。
本明細書において使用される、数に関する用語「約」は、一般に、（かかる数が、可能性のある値の０％未満であるか、もしくは１００％を超える場合を除き）別段規定されるか、または文脈から別段明らかでない限り、数のいずれかの向きの（より大きいかもしくはより小さい）１％、５％、１０％、あるいは２０％の範囲内にある数を含むとみなされる。
本明細書において使用される、対象への薬剤または薬物の「投与」は、その意図される機能を果たすために対象に化合物を導入またはデリバリーする任意の経路を含む。投与は、経口、経鼻、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、もしくは皮下）、直腸性、くも膜下腔内、経皮、または局所を含むが、これらに限定されない任意の適当な経路により行うことができる。投与は、自己投与および別のものによる投与を含む。
本明細書において使用される、用語「類似体」は、少なくとも１つの態様において、別の化合物もしくは結合体のものと類似する化学構造を有するが、それとは異なる化合物または結合体（例えば、化合物、本明細書に記載される結合体、例えば、インスリン）を指す。
本明細書において使用される、用語「自己抗体」は、個体自身のタンパク質、細胞、組織、もしくは器官の１つまたは複数を標的にする、および／あるいは反応する抗体を指す。本明細書において使用される、用語「自己抗原」は、免疫応答（例えば、液性もしくは細胞介在性免疫応答）の標的である正常な組織、細胞、タンパク質、ペプチド、またはＤＮＡを含む抗原を指す。自己抗原は、自己免疫疾患の場合には、自己抗体により標的にされるか、またはそれと反応し得る。
本明細書において使用される、「自己免疫性糖尿病」は、膵臓のインスリン産生β細胞の破壊により特徴付けられる糖尿病を指す。
本明細書において使用される、用語「細胞表面受容体」は、細胞膜の外部表面において一般にみられ、例えば、血液供給において循環する可溶性分子と相互作用するタンパク質のような分子を指す。細胞表面受容体はまた、可溶性形態で細胞外空間に分泌され得るか、または細胞の外部表面から脱落し得る。ある実施形態において、細胞表面受容体は、抗原、または抗原受容体を含んでもよい。他の実施形態において、Ｂ細胞とも呼ばれるＢリンパ球は、「Ｂ細胞受容体」もしくは「ＢＣＲ」、またはある場合には、「ＩｇＭ」受容体と呼ばれる、細胞表面受容体を有する。
本明細書において使用される、「対照」は、比較目的で実験において使用される代替試料である。対照は、「陽性」または「陰性」であり得る。例えば、実験の目的が、特定のタイプの疾患についての処置用治療剤の有効性の相関を決定することである場合、陽性対照（所望の治療効果を発揮することが知られた化合物または組成物）および陰性対照（治療を受けていないか、もしくはプラセボを受けた対象または試料）が、典型的には利用される。
本明細書において使用される、用語「有効量」は、所望の治療および／または予防効果を達成するのに十分な量、例えば、本明細書に記載される疾患または状態、あるいは本明細書に記載される疾患もしくは状態と関連する１種もしくは複数の兆候または症状の予防、あるいは減少をもたらす量を指す。治療または予防適用の文脈において、対象に投与される組成物の量は、組成物、疾患の程度、タイプ、および重症度、ならびに一般的な健康、年齢、性別、体重および薬物に対する抵抗性のような個々の特徴に依存して変動する。当業者は、これらおよび他の要因に依存して適当な投薬量を決定することができる。組成物はまた、１種または複数のさらなる治療化合物と組合せて投与することができる。本明細書に記載される方法において、医薬組成物は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の１種もしくは複数の兆候または症状を有する対象に投与されてもよい。本明細書において使用される、組成物の「治療上有効量」は、本明細書に記載される疾患または状態の生理的作用が、改善されるか、または排除される組成物レベルを指す。治療上有効量は、１回または複数回の投与で与えることができる。本明細書において使用される、組成物の「予防上有効量」は、本明細書に記載される疾患もしくは状態の少なくとも１つの症状の開始を予防または遅延させる組成物レベルを指す。予防上有効量は、１回または複数回の投与で与えることができる。
本明細書において使用される、用語「内在性Ｃペプチド」レベルは、処置、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質処置に先立つ、対象におけるＣペプチドのレベルを指す。
本明細書において使用される、用語「融合タンパク質」、例えば、「インスリンとＦｃ融合物」タンパク質は、ペプチド結合を通じて共有結合されている、例えば、典型的には、異なる供給源（例えば、異なるタンパク質、ポリペプチド、細胞など）由来の１つより多くのドメインを含むタンパク質を指す。ある実施形態において、融合タンパク質は、組換え産生される。ある実施形態において、融合タンパク質のドメインは、それぞれのドメインをコードする遺伝子配列を単一の核酸分子と結びつけることにより、共有結合される。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、インスリンおよびＦｃフラグメントポリペプチドをペプチド結合により結合させて、単一のポリペプチドを形成する、インスリンポリペプチド（例えば、プロインスリンポリペプチド）およびＦｃフラグメントポリペプチドを含むタンパク質、例えば、単一のポリペプチドである。
本明細書において使用される、用語「インスリン」は、成熟インスリン、プレプロインスリン、およびプロインスリン、ならびに天然に生じるインスリンまたはその類似体（例えば、プロインスリン類似体）を包含する。ある実施形態において、インスリンポリペプチド、例えば、プロインスリンポリペプチドは、全長インスリン（例えば、全長プロインスリン）ポリペプチドまたはそのフラグメントであり得る。ある実施形態において、インスリンポリペプチド（例えば、プロインスリンポリペプチド）は、天然に生じるインスリン（例えば、プロインスリン）由来の１種もしくは複数のフラグメントまたはドメイン、および／あるいは天然に生じないインスリン（例えば、プロインスリン）由来の１種もしくは複数のフラグメントまたはドメインを含む。
本明細書において使用される、用語「個体」、「患者」、または「対象」は、個々の生物、脊椎動物、哺乳類、またはヒトであり得る。ある実施形態において、個体、患者または対象は、ヒトである。典型的なヒト対象は、障害、例えば、本明細書に記載される障害を有するヒト患者、または正常対象を含む。
本明細書において使用される、用語「非経口投与」および「非経口投与される」は、通常注射による、経腸および局所投与以外の投与の様式を指し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内注射ならびに注入を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される、用語「医薬的に許容される」は、合理的な恩恵／リスクの比と釣り合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なく、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適当な正当な医療判断の範囲内である化合物、物質、組成物、ならびに／あるいは投薬形態を指す。
本明細書において使用される、用語「医薬的に許容される担体」は、ある器官もしくは身体の一部から別の器官もしくは身体の一部に本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質を運ぶか、または輸送するのに関与する、液体あるいは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒あるいは封入物質のような、医薬的に許容される物質、組成物あるいはビークルを意味する。それぞれの担体は、製剤の他の成分と適合可能であり、患者に有害でないという意味で、「許容される」なければならない。
本明細書において使用される、障害もしくは状態の「予防」または「予防すること」は、統計試料において、処置されていない対照試料と比べて処置された試料における障害もしくは状態の出現を低減するか、あるいは処置されていない対照試料と比べて障害もしくは状態の１つまたは複数の症状の開始を遅らせる化合物を指す。本明細書において使用される、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を予防することは、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の症状の開始を予防するか、または遅らせることを含む。本明細書において使用される、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の予防はまた、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の１つもしくは複数の兆候または症状の再発を予防することを含む。
本明細書において使用される、用語「試料」は、対象の生きている細胞からもたらされた生物学的試料材料を意味する。生物学的試料は、対象から単離された組織、細胞、タンパク質または細胞の膜抽出物、および生体体液（例えば、腹水または脳脊髄液（ＣＳＦ））、ならびに対象内に存在する組織、細胞および液体（血液、血漿、唾液、尿、血清など）を含み得る。
本明細書において使用される、用語「別の」治療上の使用は、異なる経路による同時または実質的に同時の少なくとも２種の有効成分の投与を指す。
本明細書において使用される、アミノ酸もしくはヌクレオチド配列の文脈における用語「配列同一性」または「同一」は、クエリー配列のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の特定された連続セグメントが、整列され、参照配列のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較されるとき、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基が、特定のクエリー配列および参照配列内で見られることを意味する。配列アライメントの方法および配列間の同一性の決定方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19 (Greene Publishing and VViley-Interscience, New York)；およびＡＬＩＧＮプログラム（Dayhoff (1978) in Atlas of Polypeptide Sequence and Structure 5: Suppl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.))を参照。２つのヌクレオチド配列の最適なアライメントに関して、クエリーヌクレオチド配列の連続するセグメントは、参照ヌクレオチド配列に関して追加のヌクレオチドまたは削除されたヌクレオチドを有してもよい。同様に、２つのアミノ酸配列の最適なアライメントの目的のため、クエリーアミノ酸配列の連続するセグメントは、参照アミノ酸配列に関して追加のアミノ酸残基または削除されたアミノ酸残基を有してもよい。ある実施形態において、参照ヌクレオチド配列または参照アミノ酸配列との比較のため使用される連続するセグメントは、少なくとも６、１０、１５、もしくは２０個の連続するヌクレオチド、またはアミノ酸残基を含み、３０、４０、５０、１００個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基であってもよい。クエリーヌクレオチド配列またはアミノ酸配列におけるギャップの組み入れと関連する増大した配列同一性についての補正は、ギャップペナルティを評価することにより成され得る。配列アライメントの方法は、当該技術分野において公知である。
ある特定の実施形態において、２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成される。例えば、アミノ酸配列のパーセント同一性は、ギャップオープンペナルティ１２およびギャップ伸長ペナルティ２、ＢＬＯＳＵＭマトリックス６２でのアフィン６ギャップ検索を使用するスミス・ウォーターマン相同性検索アルゴリズムを使用して決定される。スミス・ウォーターマン相同性検索アルゴリズムは、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math 2:482-489に記載され、参照により本明細書に取り込まれる。ある実施形態において、ヌクレオチド配列のパーセント同一性は、ギャップオープンペナルティ２５およびギャップ伸長ペナルティ５を使用するスミス・ウォーターマン相同性検索アルゴリズムを使用して決定される。配列同一性のかかる決定は、例えば、ＴｉｍｅＬｏｇｉｃのＤｅＣｙｐｈｅｒハードウエアアクセラレータを使用して行うことができる。
本明細書において使用される、用語「連続的な」治療上の使用は、異なる時間、同一または異なる投与経路での少なくとも２つの有効成分の投与を指す。より具体的には、連続的な使用は、他の投与または他が始まる前の有効成分の１つの投与全体を指す。従って、他の有効成分もしくは複数の有効成分を投与する数分、数時間、または数日前に渡り有効成分の１つを投与することが可能である。この場合には、同時処置は存在しない。
本明細書において使用される、用語「同時の」治療上の使用は、同じ経路による、同時または実質的に同時の少なくとも２つの有効成分の投与を指す。
本明細書において使用される、「特異的に結合する」または「選択的に結合する」は、（ｉ）免疫グロブリン分子（例えば、抗インスリン免疫グロブリン）とインスリンもしくは本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質、（ｉｉ）Ｂ細胞受容体（例えば、抗インスリン免疫グロブリン）とインスリンもしくは本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質、または（ｉｉｉ）Ｂ細胞受容体を発現するＢ細胞（例えば、抗インスリン免疫グロブリン）とインスリンもしくは本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質の間に生じるタイプの非共有結合の相互作用を指す。結合相互作用、例えば、免疫学的結合の相互作用もしくは特異的な結合の相互作用の強さ、または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）に関して表されることができ、Ｋｄが小さいほど、高い親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的または特異的な結合特性は、当該技術分野において公知の方法を使用して定量することができる。１つのかかる方法は、リガンドとリガンド受容体の複合体（例えば、抗原と抗原受容体の複合体；インスリン抗体とインスリンの複合体；またはインスリン抗体とインスリンとＦｃの融合タンパク質の複合体）形成および解離の比を測定することを必要とし、それらの比は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方の向きで比に等しく影響する幾何学的パラメーターに依存する。従って、「結合速度定数」（ｋｏｎ）と「解離速度定数」（ｋｏｆｆ）の両方は、濃度の計算ならびに結合および解離の実際の比により決定することができる。例えば、Nature 361:186-87(1993)を参照。ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比により、親和性と関連しない全てのパラメーターの取り消しが可能になり、解離定数Ｋｄと等しい。（一般に、Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473を参照）。ある実施形態において、本明細書に記載される融合タンパク質は、平衡結合定数（Ｋｄ）が、例えば、放射性リガンド結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、平衡結合アッセイ、または当業者に公知の同様のアッセイのようなアッセイにより測定された、１μΜ以下、例えば、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１００ｐＭ以下、または約１ｐＭ以下のとき、抗インスリン抗体免疫グロブリン、ＢＣＲ（例えば、抗インスリン免疫グロブリンを含むＢＣＲ）、および／またはＢ細胞、例えば、インスリン特異的Ｂ細胞のような自己抗原特異的Ｂ細胞に特異的に結合する。
本明細書において使用される、用語「全身投与」、「全身投与される」、「末梢血投与」および「末梢投与される」は、それらが患者のシステムに入り、これにより、代謝および他の同様のプロセスの対象にされるような、直接中枢神経系に以外のインスリンとＦｃの融合タンパク質の投与、例えば、皮下投与を意味する。
本明細書において使用される、「処置すること」または「処置」は、ヒトのような対象における、本明細書に記載される疾患または障害の処置をカバーし、（ｉ）疾患または障害を阻害すること、すなわち、その発症を抑止すること；（ｉｉ）疾患または障害を軽減すること、すなわち、障害の退縮を引き起こすこと；（ｉｉｉ）障害の進行を遅らせること；および／あるいは（ｉｖ）疾患もしくは障害の１つまたは複数の症状を阻害すること、軽減すること、あるいは遅らせることを含む。ある実施形態において、処置は、疾患と関連する症状が、例えば、緩和されるか、低減されるか、治癒されるか、または寛解状態に置かれることを意味する。
本明細書に記載される疾患または障害の処置の様々な様式が、トータルの処置を含むが、トータルの処置未満も含む「実質的」を意味することが意図され、ここで、いくらかの生物学的または医療上関連する結果が達成されることも理解されるべきである。処置は、慢性疾患のための継続的長期処置、または急性状態の処置のための１回、もしくは数回の投与であってもよい。
Ｉ型糖尿病の管理
Ｔ１Ｄに付随する辛苦を低減するか、または排除するための３つの主なアプローチ、１）より良好な疾患管理、例えば、改良されたインスリン、スマートポンプ、および継続的グルコースモニター；２）疾患の逆転、例えば、膵臓または膵島移植、β細胞の再生、全身またはＴ細胞特異的免疫調節；ならびに３）疾患の予防、例えば、環境上のトリガーの回避、抗原特異的ワクチン接種、抗原非特異的免疫療法が存在する。Ｔ１Ｄ患者は自己免疫を発症するので、彼らのβ細胞機能は衰退し、故に、介入の可能性のある治療恩恵を衰退させる（Rewers, M and Gottlieb, P. Diabetes Care (2009), 32, 1769-1782）。加えて、自己免疫プロセスが始まると、それは、変更するのがより漸進的に困難になり得る。これらの理由から、および遅い段階での介入と比べて推定されるコスト上の利点のため、長期間の、Ｔ１Ｄの最も早も早い可能性のある段階での疾患の予防が理想である。
有効な疾患の予防は、Ｔ１Ｄ自己免疫プロセスの深い理解、ならびに明白な高血糖の発病の十分前にＴ１Ｄを発症するリスクを実際に診断するか、または予想することができるツールを必要とする。膵島自己免疫の開始後、大抵のＴ１Ｄ患者は、臨床的糖尿病への進行を止めるための処置の機会を与える長い前臨床期間を有する。膵島自己免疫の発病の主要な特徴は、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼのアイソフォーム６５（抗ＧＡＤ６５）、タンパク質チロシンホスファターゼ様タンパク質（ＩＡ２）、および亜鉛輸送体８（ＺｎＴ８）を含む、膵島自己抗原に特異的な循環抗体の存在である。事実、診断時に、Ｔ１Ｄ患者の９０％より多くが、少なくとも１種の膵島特異的抗体を提示し、若年（ＤＡＩＳＹ）コホートでのプロスペクティブ糖尿病自己免疫研究において、糖尿に進行した小児の８９％が、２種以上の膵島特異的自己抗体を発現していた。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、β細胞への最終的な攻撃に関与するが、病原性の役割のＢ細胞（例えば、抗インスリンＢ細胞、インスリン特異的Ｂ細胞、またはインスリン＋Ｂ細胞）が近年明らかになり、これが、なぜ抗体およびＴ細胞が、同じ膵島特異的自己抗原に特異的であるか、ならびに膵島特異的自己抗原の出現と完全なＴ細胞介在性β細胞破壊の間のタイムラグであるかを説明するのを助け得る。Ｂ細胞は、膵島抗原を取り込み、それらをヘルパーＴ細胞に提示し、抗原提示細胞による抗原取り込みを増強する抗体分泌形質細胞に分化させることができ、これが、β細胞破壊のための細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を最終的に導く。
例えば、リツキシマブのようなＢ細胞抗原抗体による包括的なＢ細胞枯渇が、自己免疫疾患、例えば、Ｔ１Ｄのための処置として提案されてきた。例えば、Pescovitz et al., N. England J. Med. 361.22(2009):2143-52を参照。しかしながら、包括的なＢ細胞枯渇は、正常な機能のため免疫系により通常必要とされる健常／非自己免疫Ｂ細胞の非特異的排除（例えば、病原体のクリアランス）に起因して、対象において免疫不全状態を引き起こすことが示されている。
従って、健常な細胞の破壊により引き起こされる副作用を回避する、Ｔ１Ｄのような自己免疫疾患のための処置および予防が必要である。
Ｆｃドメイン
本明細書において使用される、用語「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃフラグメント」は、哺乳類のＦｃ（ガンマ）またはＦｃ（Ｒｎ）受容体、例えば、ヒトＦｃ（ガンマ）もしくはＦｃ（Ｒｎ）受容体に結合する能力がある、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、抗体のＦｃフラグメントまたはＦｃ領域に結合する受容体を指す。ある特定の実施形態において、ＦｃＲは、天然のヒトＦｃＲ配列である。ある実施形態において、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合し、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的スプライシングフォームを含む、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、それらの細胞質ドメインにおいて主に異なる同様のアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「受容体を活性化する」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「受容体を阻害する」）を含む。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92；Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34；およびde Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41において記載されている。「ＦｃＲ」はまた、新生児の受容体ＦｃＲｎを含み、これは、移行ＩｇＧの胎児への移動に関与し（Guyer et al., 1976 J. Immunol., 117:587；およびKim et al., 1994, J. Immunol., 24:249）、インビボでの抗体およびＦｃ融合タンパク質の長期インビボ排除の半減期に寄与する。
Ｆｃフラグメント、領域、またはドメインは、天然配列のＦｃ領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は、変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０からそのカルボキシ末端まで伸展すると定義される。Ｆｃ領域における残基のナンバリングは、ＫａｂａｔのようなＥＵ指標のものである。Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。
ある実施形態において、Ｆｃフラグメントは、哺乳類のＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧのＦｃ領域（例えば、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含むか、またはからなる。ある特定の実施形態において、Ｆｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（例えば、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含むか、またはからなる。ある実施形態において、Ｆｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（例えば、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
ある実施形態において、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域は、以下のアミノ酸配列：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２２）を含む。
ある特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域は、一方または両方の末端に追加アミノ酸を含む。ある実施形態において、この追加アミノ酸は、荷電した側鎖（例えば、正に荷電したアミノ酸、例えば、リジンまたはアルギニン）を含む。ある特定の実施形態において、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域は、以下のアミノ酸配列：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２３）を含む。
インスリンおよびインスリン類似体
インスリンは、膵臓内のランゲルハンス膵島中のβ細胞により産生されるペプチドホルモンである。インスリンは、血液からのグルコースの吸収を制御することにより機能する。増大したタンパク質およびグルコースレベルのような、刺激に曝露されたとき、インスリンは、β細胞から放出され、インスリン受容体に結合し、ヒトの代謝の多くの態様に影響するシグナル伝達カスケードを開始する。このプロセスの破壊は、いくつかの疾患、自己免疫性糖尿病（例えば、１型糖尿病）、インスリノーマ、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、および多嚢胞性卵巣症候群と直接関連する。インスリンのアミノ酸配列は、進化を通じて、特に、脊椎動物において強固に保存され、ジスルフィド結合を通じて結合されている、ＡおよびＢ鎖と呼ばれる、２つのポリペプチド鎖からなる。ヒトプロインスリンの配列は、アミノ酸配列：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号２４）により表される。
インスリンは、プレプロインスリンと呼ばれる不活性な前駆体としてまず合成される。一連の高度に協調した、酵素制御工程を通じて、プレプロインスリンは、成熟インスリンに変換される。小胞体でのプレプロインスリンのシグナルペプチドの切断、続いて酸化およびシャペロン支持フォールディングにより、プロインスリンを生じ、それが、トランスゴルジネットワークに運ばれる。次に、プロインスリンは、さらなるタンパク分解性処理工程の対象にされ、Ｃペプチドと呼ばれるフラグメントの放出および成熟インスリンの形成をもたらし、それが、不活性な６量体としてβ細胞中の亜鉛（Ｚｎ２＋）およびカルシウム（Ｃａ２＋）リッチな分泌小胞内に保存される。刺激への曝露後、分泌小胞は、細胞膜と融合し、インスリンを放出し、活性なインスリン単量体への６量体の解離を促進する。ある実施形態において、本開示のインスリンは、単量体である。ある実施形態において、インスリンは、非共有結合性の多量体（例えば、２量体、４量体、６量体、またはより大きなオーダーの多量体、例えば、２量体の３量体）である。ある実施形態において、インスリンは、単量体または非共有結合性の多量体（例えば、２量体、４量体、６量体、またはより大きなオーダーの多量体、例えば、２量体の３量体）であってもよい。
ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンは、１本鎖インスリンである。ある実施形態において、インスリンは、プレプロインスリンまたはプロインスリン、例えば、成熟インスリンのプロホルモン前駆体である。インスリンおよびインスリン類似体（例えば、プロインスリンおよびプロインスリン類似体）の全ての塩形態および非塩形態が、本開示の範囲により包含される。
ある実施形態において、本開示のインスリンは、インスリン類似体（例えば、プロインスリン類似体）を含む。ヒトインスリンのいくつかの類似体は、治療上の使用のため市販されている。ある実施形態において、本テクノロジーのインスリン類似体は、単量体である。ある実施形態において、インスリン類似体は、非共有結合性の多量体（例えば、２量体、４量体、６量体、またはより大きなオーダーの多量体、例えば、２量体の３量体）である。
インスリン類似体は、ヒトインスリンの構造と密接に関連し、修飾（例えば、構造上の修飾）をさらに含有して、ある特定の機能的態様を増強してもよい。ある実施形態において、インスリン類似体は、ヒトインスリンの構造とアミノ酸置換のみで異なってもよい。ある実施形態において、インスリン類似体は、ヒトインスリンの構造とアミノ酸欠失のみで異なってもよい。ある実施形態において、インスリン類似体は、ヒトインスリンの構造とアミノ酸付加のみで異なってもよい。ある実施形態において、インスリン類似体は、インスリンのバリアントまたは変異体を含む（例えば、配列番号２４により記載されるインスリンの配列）。ある実施形態において、インスリン類似体は、インスリンと比べてアミノ酸置換、欠失、または付加を含む（例えば、配列番号２４により記載されるインスリンの配列）。ある実施形態において、インスリン類似体は、インスリンと比べて少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、もしくは少なくとも５０個のアミノ酸置換、欠失、または付加を含む（例えば、配列番号２４により記載されるインスリンの配列）。
ある実施形態において、インスリンまたはインスリン類似体は、Ａ鎖、Ｂ鎖、およびＣ鎖のエレメントを含む３つの鎖のペプチドである。ある実施形態において、インスリンまたはインスリン類似体は、例えば、哺乳類（例えば、ヒトもしくはマウス）由来の野生型インスリンＢ、Ａ、および／またはＣ鎖ペプチドを含む。
ヒトインスリンＡ鎖およびＢ鎖の配列は、それぞれ、配列番号１９および配列番号２５により表される：ヒトインスリンＡ鎖：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号１９）；ヒトインスリンＢ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２５）。
ある実施形態において、インスリンあるいはインスリン類似体の配列に対する修飾（例えば、アミノ酸置換、欠失、もしくは付加、または化学的修飾）は、インスリンのＡ鎖、インスリンのＢ鎖のいずれか、またはその任意の組合せに対するものであってもよい。ある実施形態において、インスリンまたはインスリン類似体が、１つより多くのＡ鎖、Ｂ鎖、および／またはＣ鎖を含む非共有結合性の多量体であるとき、インスリンに対する修飾（例えば、アミノ酸置換、欠失、もしくは付加、または化学的修飾）は、非共有結合性の多量体におけるＡ鎖、Ｂ鎖のいずれか、または両方に対するものであってもよい。
本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質
１つの態様において、本開示は、Ｆｃドメインに融合したインスリンポリペプチドを含むインスリンとＦｃの融合タンパク質であって、インスリンポリペプチドが、Ｂ鎖ペプチド、Ｃ鎖ペプチド、およびＡ鎖ペプチドを含み、Ｃ鎖ペプチドのアミノ酸配列がＡＡＫである、インスリンとＦｃの融合タンパク質を提供する。加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、競合的結合アッセイにおいてＩＣ５０＞５，０００ｎＭでヒトインスリン受容体に結合する。ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、低い生物活性を有するか、または実質的に代謝上不活性であり、例えば、それらは、投与の際に対象において血液グルコースレベルを実質的に下げない。
加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、インスリン＋Ｂ細胞受容体のインスリンへのインビトロでの結合をＩＣ５０＜３００ｎＭ、＜２００ｎＭ、＜１５０ｎＭ、＜１００ｎＭ、または＜７５ｎＭで阻害する。加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、Ｔ細胞を活性化して、組換えヒトインスリンにより活性化されたＴ細胞において観察されたものと比較して、低減されているＩＬ－２レベルを分泌する。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、Ｔ細胞を活性化して、３，０００ｐｇ／ｍｌ未満、１，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、３００ｐｇ／ｍＬ未満、または１００ｐｇ／ｍｌ未満であるＩＬ－２レベルを分泌する。
ある特定の実施形態において、インスリンポリペプチドは、プロインスリンポリペプチドまたはプレプロインスリンポリペプチドである。インスリンとＦｃの融合タンパク質のある実施形態において、Ａ鎖ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１９を含む。インスリンポリペプチドは、ペプチドリンカーを介してＦｃフラグメントに融合されてもよい。ペプチドリンカーの例は、配列番号２０および配列番号２１を含む。あるいは、ペプチドリンカーは、インスリンとＦｃの融合タンパク質のインスリンポリペプチドとＦｃドメインの間に存在しなくてもよい（例えば、インスリンポリペプチドのＣ末端領域が、（例えば、ペプチド結合を介して）ＦｃドメインのＮ末端領域に共有結合されるか、またはインスリンポリペプチドのＮ末端領域が、（例えば、ペプチド結合を介して）ＦｃドメインのＣ末端領域に共有結合される）。加えてまたは代わりに、インスリンとＦｃの融合タンパク質のある実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１の野生型Ｆｃフラグメントを含む。ある特定の実施形態において、Ｆｃドメインのアミノ酸配列は、配列番号２２を含む。
加えてまたは代わりに、インスリンとＦｃの融合タンパク質の上記の実施形態のいずれかにおいて、Ｎ末端からＣ末端へのインスリンポリペプチドの配向性は、（Ｎ末端）－Ｂ鎖ペプチド－－Ｃ鎖ペプチド－－Ａ鎖ペプチド－（Ｃ末端）である。インスリンポリペプチドは、ＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端に位置してもよい。
加えてまたは代わりに、インスリンとＦｃの融合タンパク質の上記の実施形態のいずれかにおいて、Ｂ鎖ペプチドは、アミノ酸配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＸ１ＡＬＸ２ＬＶＣＧＥＸ３ＧＦＦＹＴＰＫ（配列番号２８）（式中、Ｘ１は、ＥまたはＱであり、Ｘ２は、ＹまたはＡであり、Ｘ３は、ＲまたはＥである）を含む。ある特定の実施形態において、Ｘ２はＡである。
１つの態様において、本開示は、Ｆｃドメインに融合したインスリンポリペプチドを含むインスリンとＦｃの融合タンパク質であって、インスリンポリペプチドが、Ｂ鎖ペプチド、Ｃ鎖ペプチド、およびＡ鎖ペプチドを含み、Ｂ鎖ペプチドが、アミノ酸配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＸ１ＡＬＸ２ＬＶＣＧＥＸ３ＧＦＦＹＴＰＫ（配列番号２８）（式中、Ｘ１は、ＥまたはＱであり、Ｘ２は、ＹまたはＡであり、Ｘ３は、ＲまたはＥである）を含み、Ｃ鎖ペプチドのアミノ酸配列がＡＡＫである、インスリンとＦｃの融合タンパク質を提供する。ある実施形態において、Ｘ２はＡである。
インスリンとＦｃの融合タンパク質のある特定の実施形態において、インスリンポリペプチドは、プロインスリンポリペプチドまたはプレプロインスリンポリペプチドである。インスリンとＦｃの融合タンパク質のある実施形態において、Ａ鎖ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１９を含む。インスリンポリペプチドは、ペプチドリンカーを介してＦｃフラグメントに融合されていてもよい。ペプチドリンカーの例は、配列番号２０および配列番号２１を含む。あるいは、ペプチドリンカーは、インスリンとＦｃの融合タンパク質のインスリンポリペプチドとＦｃドメインの間に存在しなくてもよい。加えてまたは代わりに、インスリンとＦｃの融合タンパク質のある実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１の野生型Ｆｃフラグメントを含む。ある特定の実施形態において、Ｆｃドメインのアミノ酸配列は、配列番号２２を含む。
加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８である。
図１Ａは、本テクノロジーの典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質の図式表現を示す。本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、（ｉ）可溶性抗インスリン抗体（例えば、細胞に結合しない抗インスリン抗体）；（ｉｉ）例えば、Ｂ細胞（例えば、抗インスリンＢ細胞）上のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）に結合した抗インスリン免疫グロブリン；および／もしくは（ｉｉｉ）抗インスリンＢ細胞の１つまたは複数に特異的に結合するという利点を有するが、インスリン－ホルモン受容体と相互作用しない。図１Ｂを参照。
１つの態様において、本開示は、Ｆｃドメインに融合したインスリンポリペプチドを含むインスリンとＦｃの融合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態において、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質のインスリンポリペプチドは、以下のＮ末端からＣ末端の配向性：（Ｎ末端）－Ｂ鎖ペプチド－－Ｃ鎖ペプチド－－Ａ鎖ペプチド－（Ｃ末端）でドメインを含む。加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、以下のＮ末端からＣ末端の配向性：（Ｎ末端）－インスリンポリペプチド－場合によりリンカー－Ｆｃドメイン－（Ｃ末端）（例えば、（Ｎ末端）－Ｂ鎖ペプチド－－Ｃ鎖ペプチド－－Ａ鎖ペプチド－－場合によりリンカー－Ｆｃドメイン－（Ｃ末端））でドメインを含む。ある特定の実施形態において、リンカー（例えば、本明細書に記載されるペプチドリンカー）は、インスリンポリペプチドとＦｃドメインの間に位置する。他の実施形態において、リンカー（例えば、ペプチドリンカー）は、インスリンポリペプチドとＦｃドメインの間に存在しない。典型的なリンカー（例えば、ペプチドリンカー）は、本明細書におけるリンカーの節においてより詳細に記載される。
典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（例えば、プロインスリンとＦｃの融合タンパク質）およびそれらのドメイン配列が、表Ａに示される。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、例えば、抗インスリンＢ細胞の除去および／またはインスリン特異的Ｔ細胞活性化の阻害のような特性を導く、修飾された変異体を含む。
本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質は、約３～５個のアミノ酸長であるＣ鎖ペプチドを含み、アラニンおよびリジンの中から選択されるアミノ酸を含む。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質のＣ鎖ペプチドは、アラニンおよびリジン以外のアミノ酸を含まない。ある特定の実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質のＣ鎖ペプチドは、ＡＡＫのアミノ酸配列を含むか、またはからなる。表Ａを参照。
加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質のＡ鎖ペプチドは、野生型ヒトプロインスリンのＡ鎖ペプチドのアミノ酸配列、もしくは野生型ヒトプロインスリンのＡ鎖ペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはからなる。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質のＡ鎖ペプチドは、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号１９）のアミノ酸配列、もしくは配列番号１９に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質のＢ鎖ペプチドは、野生型ヒトプロインスリンのＢ鎖ペプチドのアミノ酸配列、もしくは野生型ヒトプロインスリンのＢ鎖ペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはからなる。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質のＢ鎖ペプチドは、表Ａに挙げられるＢ鎖ペプチドのアミノ酸配列、もしくは表Ａに挙げられるＢ鎖ペプチドに対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはからなる。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質のＢ鎖ペプチドは、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２５）のアミノ酸配列、もしくは配列番号２５に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
加えてまたは代わりに、ある実施形態において、変異を、インスリンとＦｃの融合タンパク質のＢ鎖ペプチドに導入して、例えば、配列および／または長さを変動させてもよい。インスリンのＢ鎖の特定のアミノ酸残基での変異は、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおいてＴ細胞刺激を抑止することが示された（Nakayama, M. et al. Science (2005) 435:220-223；Nakayama, M. et al Ann NY Acad Sci (2006) 1079: 122-129）。理論に束縛されるものではないが、ある特定のインスリン変異体が、Ｔ細胞受容体によるインスリンペプチドエピトープとＭＨＣ－ＩＩの複合体の認識を破壊させ得、順に、膵島細胞へのＴ細胞活性化を防ぐと信じられている。インスリンまたはインスリン類似体の配列に対する典型的な修飾は、例えば、配列番号２５の残基１６でのアミノ酸置換（例えば、Ｙ１６Ａ置換）を含んでもよい。従って、ある実施形態において、インスリンもしくはインスリン類似体のＢ鎖上に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または付加（例えば、配列番号２５と比べて）を含むインスリンとＦｃの融合タンパク質は、インスリンフラグメントもしくはインスリン類似体フラグメントを生じるＭＨＣ－ＩＩ複合体に対するＴ細胞の低減した親和性、および／またはインビボでの低減したＴ細胞活性化をもたらしてもよい。従って、ある特定の実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質のＢ鎖ペプチドは、アミノ酸残基１６での変異（例えば、Ｙ１６Ａ置換）を有する変異誘発されたＢ鎖を含む。ある特定の実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質のＢ鎖ペプチドは、配列番号１１～１５のいずれか１つの配列を有する。
Ｆｃドメインに作動可能に結合されたインスリンポリペプチドを含むインスリンとＦｃの融合タンパク質が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態において、インスリン融合タンパク質は、本明細書に記載されるＦｃドメインを含む。インスリンとＦｃの融合タンパク質のある実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列、もしくは配列番号２２に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはからなる。インスリンとＦｃの融合タンパク質の他の実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列、もしくは配列番号２３に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質の全長配列が、以下に提供される。
配列番号２
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡＡＫＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号３
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡＡＫＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号４
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＱＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡＡＫＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号５
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＥＧＦＦＹＴＰＫＡＡＫＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号６
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＥＧＦＦＹＴＰＫＡＡＫＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号７
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡＡＫＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号８
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡＡＫＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＳＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号９
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡＡＡＫＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号１０
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＡＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡＡＡＡＫＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
Figure 0007170332000001
Figure 0007170332000002
Figure 0007170332000003
表Ａは、リーダー配列を含まない。ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、Ｎ末端においてリーダー配列を含まない。他の実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、例えば、Ｎ末端においてリーダー配列を含む。典型的なリーダー配列は、アミノ酸配列ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号２６）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、例えば、細胞（例えば、真核生物、例えば、哺乳類細胞）における発現（例えば、組換え発現）のため、リーダー配列を含む核酸分子によりコードされる。ある特定の実施形態において、リーダー配列は、発現中、例えば、細胞培養液において切断される。リーダー配列をコードする典型的な核酸配列は、核酸配列ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣ（配列番号２７）を含む。他の実施形態において、本明細書に記載される融合タンパク質は、リーダー配列を含まない核酸分子によりコードされる。
配列番号２～１０のインスリンとＦｃの融合タンパク質をコードする核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ）も、本明細書において開示される。
ある実施形態において、核酸配列は、
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＧＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＣＴＣＧＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴＣＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＡＴＣＴＧＣＡＧＡＣＡＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＣＣＣＧＧＣＡＧＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＡＴＴＧＴＧＧＡＴＧＴＡＡＧＣＣＴＴＧＣＡＴＡＴＧＴＡＣＡＧＴＣＣＣＡＧＡＡＧＴＡＴＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＴＡＣＴＣＴＧＡＣＴＣＣＴＡＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴＡＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＣＧＣＡＡＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＡＡＣＴＴＣＣＣＡＴＣＡＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＡＴＧＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣＡＧＴＧＣＡＧＣＴＴＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＣＣＧＡＡＧＧＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧＧＡＴＡＡＡＧＴＣＡＧＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＴＧＡＴＡＡＣＡＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＴＣＴＴＡＣＴＴＣＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＴＧＴＴＡＣＡＴＧＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＣＡＴＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＡＣＴＣＴＣＣＴＧＧＴＴＡＧ（配列番号１）である。
ある実施形態において、核酸配列は、
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号２９）である。
ある実施形態において、核酸配列は、
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＡＧＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号３０）である。
ある実施形態において、核酸配列は、
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号３１）である。
ある実施形態において、核酸配列は、
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号３２）である。
ある実施形態において、核酸配列は、
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号３３）である。
ある実施形態において、核酸配列は、
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号３４）である。
ある実施形態において、核酸配列は、
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣＡＡＡＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号３５）である。
ある実施形態において、核酸配列は、
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣＧＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＴＡＧ（配列番号３６）である。
リンカー
ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、例えば、インスリンとＦｃの融合タンパク質の１つもしくは複数のドメインの間、またはインスリンとＦｃの融合タンパク質と結合した分子／部分の間に１つあるいは複数のリンカーを含む。例えば、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、インスリンポリペプチドとＦｃフラグメントの間にリンカーを含む。他の実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、インスリンポリペプチドの１つまたは複数のペプチド（例えば、Ａ鎖、Ｂ鎖、および／もしくはＣ鎖ペプチド）の間にリンカーを含む。
ペプチドリンカーは、天然または非天然のアミノ酸を含んでもよい。ある実施形態において、例えば、単一の核酸分子が、インスリンポリペプチド内の様々なペプチドならびにペプチドリンカーをコードし得るか、またはインスリンポリペプチド、Ｆｃフラグメント、およびペプチドリンカーをコードし得るように、ペプチドリンカーは、核酸分子によりコードされ得る。
ある実施形態において、ペプチドリンカーは、少なくとも５個のアミノ酸残基、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上のアミノ酸残基を含む。ある実施形態において、ペプチドリンカーは、５～９個のアミノ酸残基を含む。ある実施形態において、ペプチドリンカーは、４個以下のアミノ酸または６個以上のアミノ酸長を含む。ある実施形態において、ペプチドリンカーは、０個のアミノ酸を含む（例えば、ペプチドリンカーがない）。ある実施形態において、ペプチドリンカーは、４個以上のグリシン（例えば、４、５、６、７、８個以上のグリシン）を含む。ある実施形態において、ペプチドリンカーは、４個以上の連続したグリシン（例えば、５個以上の連続したグリシン）を含む。ある実施形態において、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号２０）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２１）のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ペプチドリンカーは、エタネルセプト融合タンパク質中のリンカーを含む。例えば、米国特許第８０６３１８２Ｂ１号を参照し、これは、全体が参照により本明細書に取り込まれる。ある実施形態において、ペプチドリンカーは、ヒト免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１）の「ヒンジ」領域（またはそのフラグメント）を含まない。
ヒト免疫グロブリンの「ヒンジ」領域は、しばしば、３つの領域、上部、中部、および下部のヒンジに分けられる。ある実施形態において、免疫グロブリンにおいて、上部のヒンジは、重鎖の第１のドメイン（ＣＨ１）の末端と重鎖間ジスルフィド結合を形成する第１のシステインの間のアミノ酸の数である。中部のヒンジは、プロリンが高く、重鎖間システインジスルフィド結合を含有する。下部のヒンジは、中部のヒンジをＣＨ２ドメインに結び付ける。Sandlie, I. and Michaelsen, T., Chapter 3: Engineering the Hinge Region to Optimize Complement-induced Cytolysis, In Antibody Engineering: A Practical Guide, W. H. Freeman and Co., New York, N.Y.を参照；Hamers-Casterman. C., Naturally Occurring Antibodies Devoid of Light Chains, 363 Nature 446 (1993) and Terskikh, A. V, “Peptabody”: A New Type of High Avidity Binding Protein, 94 Proc. Natl Acad. Sci. USA 1663 (1997)も参照。
本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質の機能的特徴
本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質の対象への投与を含む、自己免疫疾患、例えば、自己免疫性糖尿病の処置または予防方法であって、インスリンとＦｃの融合タンパク質が、抗インスリン抗体に特異的に結合し、抗インスリンＢ細胞に結合し、Ｔ細胞相互作用（ＩＬ－２分泌により決定される）を減少し、および／またはインスリン受容体への弱い結合を示す、方法が、本明細書に記載される。加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、競合的結合アッセイにおいて、ヒトインスリン受容体にＩＣ５０＞３，０００ｎＭ（例えば、４，０００ｎＭ、５，０００ｎＭ以上）で結合する。
加えてまたは代わりに、ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質の投与は、対象においてグルコースレベル（例えば、血液グルコースレベル）に対する実質的な効果（例えば、実質的な低下効果）を有さない。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質のグルコース低下活性は、参照標準より低い（例えば、少なくとも１０％低い、２０％低い、３０％低い、４０％低い、５０％低い、または少なくとも２倍低い、例えば、少なくとも５倍低い、１０倍低い、１５倍低い、２０倍低い、３０倍低い、４０倍低い、５０倍低いなど）。参照標準は、哺乳類、例えば、ヒトまたはマウスから天然に生じるインスリン（例えば、プロインスリンもしくは成熟インスリン）であり得る。参照標準はまた、米国公開第２０１３／００２８９１８Ａ１号または中国公開第１０３５０９１１８Ａ号に記載された融合タンパク質であり得る。
ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、特定の膵島自己抗原と反応するＢ細胞を特異的に標的にし、例えば、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、その特定の膵島自己抗原と反応しないＢ細胞を標的にしない。例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、インスリンと反応するＢ細胞（インスリン特異的Ｂ細胞、インスリン＋Ｂ細胞、インスリン＋Ｂ２２０＋細胞、または抗インスリンＢ細胞とも呼ばれる）を特異的に標的にする。ある実施形態において、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質は、非インスリン特異的Ｂ細胞を標的にしない。従って、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、有利には、特定のＢ細胞、例えば、抗インスリン受容体を発現する自己免疫Ｂ細胞（例えば、抗インスリンＢＣＲ、抗インスリンＢ細胞、またはインスリン＋Ｂ細胞）に対する高い特異性を有する。
ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、特定のタイプのＢ細胞、例えば、自己抗原特異的Ｂ細胞または自己免疫Ｂ細胞（例えば、抗インスリンＢ細胞、インスリン特異的Ｂ細胞、もしくはインスリン＋Ｂ細胞）に結合し、それらを、例えば、マクロファージもしくは樹状細胞による食作用を介した、または抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）もしくは補体介在性細胞傷害活性（ＣＤＣ）を介した排除の標的にする。ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、排除のため非自己抗原特異的Ｂ細胞または非自己免疫Ｂ細胞（例えば、抗インスリンＢ細胞以外の細胞）を標的にしない。自己免疫Ｂ細胞または自己抗原特異的Ｂ細胞、例えば、インスリン特異的Ｂ細胞の排除は、自己免疫応答、自己抗体のレベルを減少し、最終的に、自己免疫（例えば、Ｉ型）糖尿病のような自己免疫疾患を処置または予防し得る。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、特異的な実体、例えば、Ｂ細胞、自己免疫抗体、特異的な免疫グロブリンＢ細胞受容体、または他のタンパク質もしくは細胞を標的にすることにより、機能してもよい。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、Ｂ細胞、例えば、膵島自己抗原に特異的であるＢ細胞、例えば、インスリンに結合するＢ細胞受容体を含有するＢ細胞を標的にすることにより、機能する。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、抗インスリンＢ細胞、例えば、インスリンに結合するＢ細胞受容体を含有するＢ細胞を標的にすることにより、機能する。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、２つのプロインスリンまたはプロインスリン類似体を含有するホモダイマーであり、同じＢ細胞上の複数（例えば、１つより多く）の抗インスリンＢ細胞受容体に同時に結合することができ、インスリンとＦｃの融合タンパク質が飲食運動されるのを引き起こす。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、２つのプロインスリンまたはプロインスリン類似体を含有するホモダイマーであり、同じＢ細胞上の複数（例えば、１つより多く）の抗インスリンＢ細胞受容体に同時に結合することができ、Ｂ細胞内でシグナル伝達現象を引き起こす。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、２つのプロインスリンまたはプロインスリン類似体を含有するホモダイマーであり、同じＢ細胞上の複数（例えば、１つより多く）の抗インスリンＢ細胞受容体に同時に結合することができ、Ｂ細胞がアポトーシスを経験させる。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、２つのプロインスリンまたはプロインスリン類似体を含有するホモダイマーであり、同じＢ細胞上の複数（例えば、１つより多く）の抗インスリンＢに同時に結合し、一方、インスリンとＦｃの融合タンパク質のＦｃ領域上のエピトープは、免疫エフェクター細胞と相互作用して、Ｂ細胞に対する作用（例えば、ＡＤＣＣを通じたアポトーシス）を誘発する。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、初期ステージのＢ細胞である抗インスリンＢ細胞に結合し、受容体編集として公知のプロセスを通じて初期Ｂ細胞がそのＢ細胞受容体を修飾させる。
１つの態様において、対象に本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質を投与することを含む、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病）を処置する方法であって、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与が、参照標準または参照処置と比べて、対象において自己抗原特異的Ｂ細胞レベルの減少をもたらす、方法が、本明細書において提供される。別の態様において、対象に本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質を投与することを含む、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病）を処置する方法であって、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与が、対象において自己抗原特異的Ｂ細胞を誘導して、参照標準または参照処置と比べて増大した受容体編集を経験させる、方法が、本明細書において提供される。ある実施形態において、Ｂ細胞は、自己抗原に特異的である（例えば、Ｂ細胞は、自己抗原、例えば、インスリンに結合する免疫グロブリンを含むＢＣＲを含む）。
ある実施形態において、Ｂ細胞は、疾患を引き起こすＢ細胞または病原性Ｂ細胞（例えば、抗インスリンＢ細胞、インスリン特異的Ｂ細胞、もしくはインスリン＋Ｂ細胞）を含む。ある実施形態において、Ｂ細胞は、抗インスリンＢ細胞を含む。ある実施形態において、Ｂ細胞は、特異的な細胞表面受容体を提示する。ある実施形態において、抗インスリンＢ細胞表面受容体は、Ｂ２２０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ならびに他の同様の細胞表面受容体およびそのアイソフォームを含む。ある実施形態において、抗インスリンＢ細胞は、Ｂ２２０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ならびに他の同様の細胞表面受容体およびそのアイソフォームを含む細胞表面受容体の組合せを提示する。ある実施形態において、抗インスリンＢ細胞は、インスリンに特異的なＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を提示し、例えば、ＢＣＲは、インスリンに特異的な免疫グロブリン、例えば、ＩｇＭ受容体を含む。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与は、インスリンとＦｃの融合タンパク質での処置に先立ち、対象に（例えば、血液または脾臓に）存在するインスリン特異的Ｂ細胞の１０％より高い（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上より高い）排除を導く。加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与は、インスリンとＦｃの融合タンパク質での処置に先立ち、対象に存在する非インスリン特異的／反応性Ｂ細胞の３０％未満（例えば、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２．５％、１％以下の未満）の排除を導く。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与は、インスリンとＦｃの融合タンパク質での処置に先立ち、対象に存在するＢ細胞の総数（インスリン特異的Ｂ細胞と非インスリン特異的Ｂ細胞の両方を含む）の３０％未満（例えば、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２．５％、１％以下の未満）の排除を導く。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与は、処置後少なくとも１日間（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０日間以上、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週間以上）の間、（インスリンとＦｃの融合タンパク質での処置に先立ち観察されるものと比較して）インスリン特異的Ｂ細胞の数の低減を（例えば、少なくとも２倍、例えば、少なくとも２、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００、または１０，０００倍以上で）導く。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、例えば、対象に慢性的に投与されるとき、処置の期間中、およびある場合には、処置の休止後の期間、例えば、処置の休止後少なくとも１日間（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０日間以上、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週間以上）、（インスリンとＦｃの融合タンパク質での処置に先立ち観察されたものと比較して）インスリン特異的Ｂ細胞の数の低減を（例えば、少なくとも２倍、例えば、少なくとも２、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００、または１０，０００倍以上で）導く。
インスリンとＦｃの融合タンパク質での処置により排除された細胞数を決定する典型的な方法が、実施例の節に記載される。例えば、排除された細胞量の決定は、マクロファージ（例えば、ラット肺胞マクロファージ）の抗インスリン抗体フラグメントを発現する導入遺伝子を含有する脾細胞（例えば、ＶＨ－１２５マウス由来の脾細胞）とのインビトロでの共培養を使用して行うことができる。例えば、Hulbert, et al., J. Immunol. 167(2001):5535-38を参照。別の例では、排除された細胞量の決定は、対象の末梢血中のＢ細胞（例えば、自己抗原特異的）のレベルを測定することにより、行うことができる。例えば、処置に先立ち観察されたものと比較した、インスリンとＦｃの融合タンパク質での処置後の自己抗原特異的Ｂ細胞数における低減は、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与が、自己抗原特異的Ｂ細胞の排除を導くことを示す。トータルのＢ細胞または非インスリン特異的Ｂ細胞数におけるわずか（もしくはない）低減は、インスリンとＦｃの融合タンパク質が、Ｂ細胞の包括的非特定的な排除を導かないこと、すなわち、インスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己抗原特異的Ｂ細胞に特異的であることを示す。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、１μΜ以下（例えば、１μΜ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００１ｎＭ以下）のＫｄにより特徴付けられる、抗インスリン抗体（例えば、可溶性、例えば、循環、または受容体に結合した）に対する親和性を有する。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、インスリンホルモン受容体のものより大きい（例えば、少なくとも２倍大きい、例えば、少なくとも２、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００、または１０，０００倍以上大きい）、抗インスリン免疫グロブリンまたはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）（例えば、インスリン特異的Ｂ細胞上の）に対する親和性を有する。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、１μΜ以下
（例えば、１μΜ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００１ｎＭ以下）のＫｄにより特徴付けられる、インスリン特異的Ｂ細胞に対する親和性を有する。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、非インスリン特異的／反応性Ｂ細胞に対するその親和性より低い（例えば、少なくとも２倍より大きい、例えば、少なくとも２、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００、または１０，０００倍以上低い）インスリン特異的Ｂ細胞に対する親和性を有する。
加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、ＩＣ５０＜３００ｎＭ（例えば、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、９５ｎＭ、９０ｎＭ、８５ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６５ｎＭ、６０ｎＭ、５５ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ以下）で、インスリン＋Ｂ細胞受容体のインスリンへのインビトロでの結合を阻害する。
加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、インビトロでインスリン特異的Ｂ細胞を約７０ｐＭのＥＣ５０で除去する。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、ヒトインスリンで観察されるものの少なくとも５％である結合親和性で、インスリン自己抗体に結合する（例えば、インビボまたはインビトロで）能力がある。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、ヒトインスリンで観察されるものの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％である結合親和性で、インスリン自己抗体に結合する（例えば、インビボもしくはインビトロで）能力がある。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、ヒトインスリンで観察されるものの少なくとも５％である結合親和性で、Ｂ細胞受容体に結合する（例えば、インビボまたはインビトロで）能力がある。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、ヒトインスリンで観察されるものの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％である結合親和性で、Ｂ細胞受容体に結合する（例えば、インビボもしくはインビトロで）能力がある。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、抗原提示のプロセスを通じて、その細胞表面上に主要組織適合複合体分子（ＭＨＣ）、例えば、ＭＨＣＩＩ分子と複合体を形成した抗原を提示する細胞である。
ある実施形態において、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質は、ペプチドに抗原提示細胞（ＡＰＣ）により処理される能力がある。次に、これらのＡＰＣにより処理されたペプチドは、Ｔ細胞受容体に結合する能力があるペプチドとＭＨＣＩＩ複合体の形態でＡＰＣ ＭＨＣＩＩ受容体上に提示することができる。ある実施形態において、これらのＡＰＣにより処理されたペプチド－ＭＨＣＩＩ複合体は、ヒトインスリンペプチド－ＭＨＣＩＩ複合体、例えば、ヒトインスリンＢ９：２３ペプチドとＭＨＣＩＩの複合体で観察されるものより、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％または約１００％高い結合親和性で、Ｔ細胞受容体に結合する（例えば、インビボもしくはインビトロで）能力がある。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与は、投与後の対象において、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）（例えば、循環ＩＡＡ）のレベルにおける減少、例えば、少なくとも２倍、例えば、少なくとも２、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００、または１０，０００倍より大きな減少をもたらす。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与は、Ｆｃフラグメントに融合していないインスリンまたはインスリン類似体での処置で観察されるものと比較して、対象においてインスリン自己抗体（ＩＡＡ）（例えば、循環ＩＡＡ）レベルにおける低減をもたらす。
ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、天然に生じるヒトインスリン、例えば、ヒトプロインスリンまたはヒト成熟インスリンと比べて、インビボおよび／またはインビトロで減少したＴ細胞活性化をもたらす。ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、インビトロまたはインビボでＢ細胞と接触させたとき、Ｂ細胞により処理され、ＭＨＣＩＩ複合体中の抗原としてＴ細胞に提示される（例えば、少なくともＢ鎖ペプチドまたはＢ鎖ペプチドの一部が提示される）。
なおさらなる実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞もしくはマクロファージ）とインビトロまたはインビボで接触されたとき、抗原提示細胞により処理され、ＭＨＣＩＩ複合体中の抗原としてＴ細胞に提示される（例えば、少なくともＢ鎖ペプチドまたはＢ鎖ペプチドの一部が提示される）。インスリンとＦｃの融合タンパク質が、Ｙ１６Ａ変異を含むＢ鎖ペプチドを含む、ある実施形態において、Ｔ細胞によるこのＢ鎖ペプチドとＭＨＣＩＩの複合体の認識の程度が、野生型ヒトインスリン（例えば、Ｙ１６を含む）由来のＢ鎖ペプチドを含むインスリンとＦｃの融合タンパク質と比べて低減され、ここで、変異のナンバリングは、Ｎ末端と比べたインスリンＢ鎖の位置を指す。ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、米国公開第２０１３／００２８９１８Ａ１号または中国公開第１０３５０９１１８Ａ号に記載された融合タンパク質と比較して、インビボおよび／またはインビトロであまりＴ細胞活性化をもたらさない。
加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、Ｔ細胞を活性化して、組換えヒトインスリンにより活性化されたＴ細胞において観察されたものと比較して、低減されているＩＬ－２レベルを分泌する。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、Ｔ細胞を活性化して、３，０００ｐｇ／ｍｌ未満（例えば、２７５０ｐｇ／ｍＬ、２５００ｐｇ／ｍＬ、２２５０ｐｇ／ｍＬ、２０００ｐｇ／ｍＬ、１７５０ｐｇ／ｍＬ、１５００ｐｇ／ｍＬ、１２５０ｐｇ／ｍＬ、１０００ｐｇ／ｍＬ、７５０ｐｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ、２５０ｐｇ／ｍＬ、２００ｐｇ／ｍＬ、１７５ｐｇ／ｍｌ、１５０ｐｇ／ｍｌ、１２５ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、９５ｐｇ／ｍｌ、９０ｐｇ／ｍｌ、８５ｐｇ／ｍｌ、８０ｐｇ／ｍｌ、７５ｐｇ／ｍｌ、７０ｐｇ／ｍｌ、６５ｐｇ／ｍｌ、６０ｐｇ／ｍｌ、５５ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、４５ｐｇ／ｍｌ、４０ｐｇ／ｍｌ、３５ｐｇ／ｍｌ以下）であるＩＬ－２レベルを分泌する。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、参照標準により誘導されるＴ細胞活性化を、１００ｎＭ以下（例えば、１００ｎＭ、９５ｎＭ、９０ｎＭ、８５ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６５ｎＭ、６０ｎＭ、５５ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００１ｎＭ以下）のＩＣ５０で阻害し、ここで、参照標準は、配列番号５のアミノ酸配列を有するインスリンとＦｃタンパク質である。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、参照標準により誘導されるＴ細胞活性化を、５ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害し、ここで、参照標準は、配列番号５のアミノ酸配列を有するインスリンとＦｃタンパク質である。
ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、対象に投与されるとき、参照標準と比較して、自己免疫疾患、例えば、自己免疫性糖尿病の発生を減少する。参照標準は、哺乳類、例えば、ヒトまたはマウスから天然に生じるインスリン（例えば、プロインスリンもしくは成熟インスリン）であり得る。
ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、対象に投与されたとき、少なくとも２時間（例えば、少なくとも２時間、５時間、１０時間、１５時間、２０時間、２４時間、３６時間、１日間、１．５日間、２日間、２．２日間、２．５日間、３日間、５日間、７日間以上）の血清半減期を有する。ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、参照標準より長い血清半減期を有する。参照標準は、哺乳類、例えば、ヒトまたはマウスから天然に生じるインスリン（例えば、プロインスリンもしくは成熟インスリン）であり得る。参照標準はまた、ペプチド（例えば、インスリンＢ鎖ペプチド、または１つもしくは複数のアミノ酸変異を含有するインスリンＢ鎖ペプチド）であり得る。参照標準はまた、米国公開第２０１３／００２８９１８Ａ１号または中国公開第１０３５０９１１８Ａ号に記載される融合タンパク質であり得る。
加えてまたは代わりに、本明細書において開示される方法のある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与は、投与に先立ち対象において観察されたものと比較して、対象において（例えば、血液または脾臓において）減少した数の抗インスリンＢ細胞をもたらす（例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上の低減）。ある特定の実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与は、抗インスリンＢ細胞以外のＢ細胞の数を実質的に低減しない。本明細書において開示される方法のある実施形態において、対象は、投与に先立ち対象において観察されたものと比較して、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、２週間後、３週間後、３週間以上後に抗インスリンＢ細胞数における低減を示す。
加えてまたは代わりに、本明細書において開示される方法のある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与は、投与に先立ち対象において観察されたものと比較して、対象において減少したレベルのインスリン自己抗体（例えば、循環ＩＡＡ）をもたらす（例えば、少なくとも５％の減少）。本明細書において開示される方法のある実施形態において、対象は、投与に先立ち対象において観察されたものと比較して、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、２週間後、３週間後、３週間以上後に減少したレベルのインスリン抗体を示す。
加えてまたは代わりに、本明細書において開示される方法のある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与後の対象の血液グルコースレベルは、投与に先立ち対象において観察されたものと同等である。本明細書において開示される方法のある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、２週間後、３週間後、または３週間以上後の対象の血液グルコースレベルは、投与に先立ち対象において観察されたものと同等である。
インスリンとＦｃの融合タンパク質の作製
様々な手法が、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質の産生のため使用され得る。（例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照し、これは、参照により本明細書に組込まれる）。
ベクター。インスリンとＦｃの融合タンパク質は、本明細書に記載される本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列のいずれを含むベクターにより発現され得る。これらは、核酸ベクター、リポソーム、ネイキッドＤＮＡ、アジュバント補助ＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテルなどを含み得る。ベクターは、標的部分（例えば、細胞表面受容体に対するリガンド）を有する、国際公開第９３／６４７０１号に記載されるような化学結合体、および核酸結合部分（例えば、ポリリジン）、ウイルスベクター（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスベクター）、プラスミド、ファージなどを含み得る。ベクターは、染色体、非染色体または合成であり得る。
典型的なベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質および化学結合体を含む。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスを含む。ある実施形態において、ウイルスベクターは、ＤＮＡウイルスベクターである。典型的なＤＮＡベクターは、オルソポックスもしくはトリポックスベクターのようなポックスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター（Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995)；Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover、Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995)；Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993)；Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: USA 87: 1149 (1990)を参照）のようなヘルペスウイルスベクター、アデノウィルスベクター（LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993)；Davidson, et al., Nat. Genet 3 :219 (1993)； Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995）を参照)、ならびにアデノ随伴ウイルスベクター（Kaplitt, M. G. et al., Nat. Genet. 8: 148 (1994)を参照）を含む。
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞質に導入する。トリウイルスベクターは、核酸の短期発現のみをもたらす。ある実施形態において、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、核酸を細胞に導入するために使用される。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（約４ヶ月）より短い発現（約２ヶ月）をもたらし、それは、順に、ＨＳＶベクターより短い。特定のベクターの選択は、標的細胞および処置されている状態に依存する。導入は、標準的な技術、例えば、感染、トランスフェクション、形質導入または形質転換によるものであり得る。遺伝子導入の様式の例は、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、およびウイルスベクターを含む。これらのベクターを使用して、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質を発現することができる。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、実施例の節に記載されるベクターにより発現することができる。
細胞株、発現および精製。本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質を発現するＴ細胞、または本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列のいずれかを含むベクターも、本明細書において開示される。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、例えば、真核生物細胞、例えば、哺乳類の細胞または非哺乳類の細胞において、組換え発現することができる。発現のため使用される典型的な哺乳類の細胞は、ＨＥＫ細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、またはＣＨＯ細胞、当該技術分野において入手可能な他の細胞株の中でも、例えば、抗体フラグメントまたはＦｃ含有タンパク質の発現のため使用される細胞株を含む。ある実施形態において、昆虫細胞のような非哺乳類の細胞、例えば、ＳＦ９またはＳ２細胞、当該技術分野において入手可能な他の細胞株の中でも、例えば、抗体フラグメントまたはＦｃ含有タンパク質の発現のため使用される細胞株が、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質の発現のため使用される。ある実施形態において、細胞は、インスリンとＦｃの融合タンパク質（例えば、インスリンとＦｃの融合タンパク質の全体が、単一核酸分子によりコードされる場合）をコードする、核酸分子、例えば、ベクターでトランスフェクトされる。他の実施形態において、細胞は、それぞれの核酸分子が、インスリンとＦｃの融合タンパク質の異なるドメインをコードする、１つより多くの核酸分子でトランスフェクトされる。例えば、ある核酸分子がインスリンポリペプチドをコードし得、異なる核酸分子が、Ｆｃフラグメントをコードし得る。細胞は、当該技術分野における標準的な方法を使用して培養することができる。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、細胞から（例えば、細胞の溶解により）精製されるか、または単離される。他の実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、細胞により分泌され、例えば、融合タンパク質が、細胞が成長した細胞培養培地から精製されるか、または単離される。インスリンとＦｃの融合タンパク質の精製は、カラムクロマトグラフィー、例えば、親和性クロマトグラフィーを使用すること、またはある特定の分子についてのサイズ、電荷および／もしくは親和性に関する他の分離方法を使用することを含み得る。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の精製は、例えば、タンパク質Ａビーズまたはタンパク質Ａカラムを使用することにより、Ｆｃフラグメントを有するタンパク質を選択／濃縮することを含む。例えば、抗インスリン抗体またはそのフラグメントを使用する、他の親和性分離方法も使用することができる。加えてまたは代わりに、イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはゲルろ過クロマトグラフィーのような他の分離方法を利用することもできる。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の精製は、タンパク質調製物の濾過または遠心分離をさらに含む。
精製された融合タンパク質は、様々な方法、例えば、２８０ｎｍでの吸光度（例えば、収量を決定するため）、サイズ除外またはキャピラリー電気泳動（例えば、分子量および／もしくは純度を決定するため）、質量分析（ＭＳ）ならびに／または液体クロマトグラフィー（ＬＣ）－ＭＳ（例えば、純度および／もしくはグリコシル化を決定するため）、および／またはＥＬＩＳＡ（例えば、抗インスリン抗体への結合、例えば、親和性の程度を決定するため）を使用して、例えば、純度、収量、構造、ならびに／あるいは活性について特徴付けることができる。典型的な特徴決定方法はまた、実施例の節に記載される。
ある実施形態において、細胞、例えば、細胞培養液におけるインスリンとＦｃの融合タンパク質の発現は、培養液１リットル当たりインスリンとＦｃの融合タンパク質（例えば、精製された融合タンパク質）少なくとも５０ｍｇ（例えば、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１１０ｍｇ／Ｌ、１２０ｍｇ／Ｌ以上）を生じる。ある実施形態において、精製されたインスリンとＦｃの融合タンパク質は、例えば、標準的な方法により決定される、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％、９７重量％、９９重量％）の純度を有する。
ある実施形態において、細胞における本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質の発現は、米国公開第２０１３／００２８９１８Ａ１号または中国第１０３５０９１１８Ａ号に記載される融合タンパク質より多い（例えば、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍以上）インスリンとＦｃの融合タンパク質（例えば、精製されたインスリンとＦｃの融合タンパク質）の収量を生じる。
治療および予防方法
以下の考察は、説明の目的のみで提示され、制限することを意図しない。
自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を処置または予防する方法であって、対象に本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質を投与することを含む、方法が、本明細書に記載される。本明細書において開示される方法のある実施形態において、自己免疫疾患は、自己免疫性糖尿病、例えば、糖尿病タイプ１（すなわち、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、若年性糖尿病、もしくはインスリン依存性糖尿病）、または成人の潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）である。遅延発症型１型糖尿病とも呼ばれる、ＬＡＤＡは、成人において生じ、よりゆっくりとした発病経過を提供する糖尿病タイプ１の形態である。非肥満関連２型糖尿病と診断された成人の最大約５０％が、ＬＡＤＡを有し得ると推定される。本明細書において開示される方法のある実施形態において、自己免疫疾患は、参照標準または正常な対照対象と比べて、対象における減少した数の膵臓のインスリン産生β細胞を含む。
本明細書において開示される方法のある実施形態において、対象は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）と診断されている。ある特定の実施形態において、対象は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）と、３ヶ月未満、６ヶ月未満、９ヶ月未満、１年未満、または１．５年未満の間診断されている。
加えてまたは代わりに、本明細書において開示される方法のある実施形態において、対象は、検出可能なレベルの自己免疫抗体を有するが、高血糖のような、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の症状を発症していない。自己免疫抗体は、膵島自己抗原に特異的であってもよい。例えば、ある実施形態において、膵島自己抗原は、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（例えば、アイソフォーム６５、例えば、抗ＧＡＤ６５）、タンパク質チロシンホスファターゼ様タンパク質（ＩＡ２）、または亜鉛輸送体８（ＺｎＴ８）を含む。他の実施形態において、自己免疫抗体は、抗インスリン抗体である。
本明細書において開示される方法のある特定の実施形態において、対象は、検出可能なレベルのインスリン自己抗体を有さず、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の症状を発症しておらず、例えば、高血糖を発症していない。
本明細書において開示される方法のある実施形態において、対象は、検出可能なレベルの病原性Ｂ細胞集団または疾患を引き起こすＢ細胞集団（例えば、抗インスリンＢ細胞、インスリン特異的Ｂ細胞、もしくはインスリン＋Ｂ細胞）を有さず、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の症状を発症しておらず、例えば、高血糖を発症していない。
本明細書において開示される方法のある特定の実施形態において、対象は、検出可能なレベルの病原性Ｂ細胞集団または疾患を引き起こすＢ細胞集団（例えば、抗インスリンＢ細胞、インスリン特異的Ｂ細胞、もしくはインスリン＋Ｂ細胞）を有するが、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の症状を発症しておらず、例えば、高血糖を発症していない。ある実施形態において、Ｂ細胞集団は、インスリン特異的Ｂ細胞を含む。ある実施形態において、インスリン特異的Ｂ細胞は、Ｂ２２０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２のような特異的な細胞表面受容体、または他の同様の細胞表面受容体およびそのアイソフォームを提示する。ある特定の実施形態において、インスリン特異的Ｂ細胞は、Ｂ２２０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２のような２つ以上の細胞表面受容体、および他の同様の細胞表面受容体およびそのアイソフォームを発現する。
加えてまたは代わりに、本明細書において開示される方法のある実施形態において、対象における内在性Ｃペプチドのレベルを評価して、自己免疫性糖尿病（例えば、１型糖尿病または潜在性自己免疫性糖尿病）の診断および程度を助ける。Ｃペプチドは、インスリンと等しい量で産生され、それ故、対象におけるインスリン分泌の総量を表すので、それは、残るβ細胞機能のバイオマーカーとして頻繁に利用される（Jones, A G. and Hattersley, A.T., Diabet Med (2013) 30, 803-817）。対象に存在する任意の外因性インスリンも直接的なインスリンアッセイにおいて検出されるので、対象におけるＣペプチドの測定は、インスリンレベルの決定を指示する際に有用であり得る。健常対象（例えば、自己免疫性糖尿病を有しない対象）は、約０．６ｎｍｏｌ／Ｌ～約０．８ｎｍｏｌ／Ｌの範囲にある（例えば、約０．６５ｎｍｏｌ／Ｌ）内在性Ｃペプチドレベルを有する。対照的に、自己免疫性糖尿病（例えば、１型糖尿病またはＬＡＤＡ）を有する対象は、検出不可能から約０．６ｎｍｏｌ／Ｌまでの範囲にある（例えば、約０．０５ｎｍｏｌ／Ｌ）内在性Ｃペプチドレベルを有する。ある実施形態において、内在性Ｃペプチドレベルは、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質の投与後に、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質のＣペプチドからもたらされるＣペプチドを含まない。
ある実施形態において、対象は、自己免疫性糖尿病（例えば、１型糖尿病）と診断されており、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質での処置前に、約０．０１ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０２ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０３ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０４ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０５ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０６ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０７ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０８ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０９ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．１ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．１２５ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．１５ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．１７５ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．２ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．３ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．４ｎｍｏｌ／Ｌ、もしくは約０．５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、または０．６ｎｍｏｌ／Ｌ未満の内在性Ｃペプチドレベルを有する。
ある実施形態において、対象は、自己免疫性糖尿病（例えば、１型糖尿病）と診断されており、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質での処置前に、約０．１ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０９ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０８ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０７ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０６ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０５ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０４ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０３ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０２ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０１ｎｍｏｌ／Ｌ以下より低いかまたは等しい内在性Ｃペプチドレベルを有する。ある実施形態において、対象は、自己免疫性糖尿病（例えば、１型糖尿病）と診断されており、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質での処置前に、約０．０１ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．００９ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．００８ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．００７ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．００６ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．００５ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．００４ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．００３ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．００２ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．００１ｎｍｏｌ／Ｌ以下より低いかまたは等しい内在性Ｃペプチドレベルを有する。ある実施形態において、対象は、自己免疫性糖尿病（例えば、１型糖尿病）と診断されており、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質での処置前に、約０．００１ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．１ｐｍｏｌ／Ｌ、約０．０１ｐｍｏｌ／Ｌ、約０．００１ｐｍｏｌ／Ｌ以下より低いかまたは等しい内在性Ｃペプチドレベルを有する。ある特定の実施形態において、対象は、自己免疫性糖尿病（例えば、１型糖尿病）と診断されており、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質での処置前に、検出不可能なレベルの内在性Ｃペプチドを有する。
ある実施形態において、対象は、自己免疫性糖尿病（例えば、１型糖尿病）と診断されており、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質での処置前に、参照標準と比べて約９５％以下の内在性Ｃペプチドレベルを有する。ある実施形態において、対象は、自己免疫性糖尿病（例えば、１型糖尿病）と診断されており、参照標準と比べて、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、または約１％以下の内在性Ｃペプチドレベルを有する。
ある実施形態において、内在性Ｃペプチドレベルは、空腹（例えば、グルコースの欠乏した）または摂食時（例えば、グルコースで刺激された）状態の対象において測定され得る。例示の目的で、空腹状態の対象は、内在性Ｃペプチドレベルの解析に先立ち、約３０分間、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１２時間、約１８時間、約２０時間、または約２４時間、食物を控えてもよい。別の例では、摂食状態の対象は、内在性Ｃペプチドレベルの解析の１２時間以内、１０時間以内、６時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、１．５時間以内、１時間以内、３０分以内、１５分以内、または同時に食物を消費してもよい。
ある実施形態において、対象は、空腹（例えば、グルコースの欠乏した）状態にあり、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質での処置に先立ち、検出不可能なレベルの内在性Ｃペプチドを有する。ある実施形態において、対象は、空腹（例えば、グルコースの欠乏した）状態にあり、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質での処置に先立ち、約０．０６ｎｍｏｌ／Ｌ以下の内在性Ｃペプチドレベルを有する。ある実施形態において、対象は、空腹（例えば、グルコースの欠乏した）状態にあり、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質での処置に先立ち、約０．０６ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０７ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０８ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．０９ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．１ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．１２５ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．１５ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．１７５ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．２ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．３ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．４ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．５ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．６ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．７ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．８ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．９ｎｍｏｌ／Ｌ、約１．０ｎｍｏｌ／Ｌ以下の内在性Ｃペプチドレベルを有する。ある実施形態において、対象は、空腹状態にあり、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質での処置に先立ち、約０．２ｎｍｏｌ／Ｌ以下、または約０．５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、または約１．０ｎｍｏｌ／Ｌ以下の内在性Ｃペプチドレベルを有する。
ある実施形態において、対象は、摂食（例えば、グルコースで刺激された）状態にあり、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質での処置に先立ち、検出不可能なレベルの内在性Ｃペプチドを有する。ある実施形態において、対象は、摂食（例えば、グルコースで刺激された）状態にあり、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質での処置に先立ち、約０．２ｎｍｏｌ／Ｌ以下の内在性Ｃペプチドレベルを有する。他の実施形態において、対象は、摂食（例えば、グルコースで刺激された）状態にあり、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質での処置に先立ち、約０．２ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．２５ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．３ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．４ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．５ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．６ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．７ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．８ｎｍｏｌ／Ｌ、約０．９ｎｍｏｌ／Ｌ、約１．０ｎｍｏｌ／Ｌ以上より低いかまたは等しい内在性Ｃペプチドレベルを有する。ある特定の実施形態において、対象は、摂食状態にあり、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質での処置に先立ち、約０．６ｎｍｏｌ／Ｌ以下、または約０．７５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、または約１．０ｎｍｏｌ／Ｌ以下の内在性Ｃペプチドレベルを有する。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、予防的に投与される。ある実施形態において、対象は、検出可能なレベルの自己免疫抗体（例えば、インスリン自己抗体）を有さず、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、予防的に投与される。ある実施形態において、対象は、検出可能なレベルの病原性Ｂ細胞集団または疾患を引き起こすＢ細胞集団（例えば、抗インスリンＢ細胞、インスリン特異的Ｂ細胞、もしくはインスリン＋Ｂ細胞）を有さず、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、予防的に投与される。ある実施形態において、対象は、検出可能なレベルの自己免疫抗体（例えば、インスリン自己抗体）および検出可能なレベルの病原性Ｂ細胞集団または疾患を引き起こすＢ細胞集団（例えば、抗インスリンＢ細胞、インスリン特異的Ｂ細胞、もしくはインスリン＋Ｂ細胞）を有さず、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、予防的に投与される。ある実施形態において、対象は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）と診断されていない。ある実施形態において、対象は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）と診断されておらず、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、予防的に投与される。ある実施形態において、対象は、Ｔ１Ｄを発症するリスクがあり、例えば、対象は、Ｔ１Ｄと診断された人と比べて、第１度を有する。対象は、成人または小児であってもよい。
ある実施形態において、対象は、Ｔ１Ｄを発症するリスクがあり、例えば、対象は、例えば、参照により本明細書に取り込まれる、Erlich, et al., Diabetes. 2008 April; 57(4): 1084-1092に記載される通り、Ｔ１Ｄを発症するより高いリスクと関連するＤＲＢ１、ＤＱＡ１、および／またはＤＱＢ１座に１つまたは複数の対立遺伝子（例えば、ＤＲ－ＤＱハプロタイプ）を有する。ある実施形態において、対象は、次のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ハプロタイプ：
（ａ）ＤＲＢ１＊０３０１－ＤＱＡ１＊０５０１－ＤＱＢ１＊０２０１
（ｂ）ＤＲＢ１＊０４０５－ＤＱＡ１＊０３０１－ＤＱＢ１＊０３０２
（ｃ）ＤＲＢ１＊４０１－ＤＱＡ１＊０３０１－ＤＱＢ＊０３０２
（ｄ）ＤＲＢ１＊０４０２－ＤＱＡ１＊０３０１－ＤＱＢ１＊０３０２
（ｅ）ＤＲＢ１＊０４０４－ＤＱＡ１＊０３０１－ＤＱＢ１＊０３０２；または
（ｆ）ＤＲＢ１＊０８０１－ＤＱＢ１＊０４０１－ＤＱＢ１＊０４０２
の１つまたは複数を有する。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の際、対象は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の症状を発症していない。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の際、対象は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の症状を、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１年間、少なくとも約１．５年間、少なくとも約２年間、少なくとも約３年間、少なくとも約４年間、少なくとも約５年間、少なくとも約１０年間、少なくとも約１５年間、少なくとも約２０年間、少なくとも約２５年間、少なくとも約３０年間、少なくとも約４０年間、少なくとも約５０年間以上発症しない。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の際、対象は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を発症していない。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の際、対象は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１年間、少なくとも約１．５年間、少なくとも約２年間、少なくとも約３年間、少なくとも約４年間、少なくとも約５年間、少なくとも約１０年間、少なくとも約１５年間、少なくとも約２０年間、少なくとも約２５年間、少なくとも約３０年間、少なくとも約４０年間、少なくとも約５０年間以上発症しない。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の際、対象は、参照標準または参照処置と比較して、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の遅延した発病率を有する。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の際、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の発病率は、参照標準または参照処置と比較して、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも１．５年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも１５年、少なくとも２０年、少なくとも２５年、少なくとも３０年、少なくとも４０年、少なくとも５０年以上遅延される。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の際、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の症状の発病率は、参照標準または参照処置と比較して、約２％、約３％、約４％、約５％、約７％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％以上遅延される。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の際、対象は、参照標準または参照処置と比較して、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の遅延した発病率を有する。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の際、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の発病率は、参照標準または参照処置と比較して、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも１．５年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも１５年、少なくとも２０年、少なくとも２５年、少なくとも３０年、少なくとも４０年、少なくとも５０年以上遅延される。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の際、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の発病率は、参照標準または参照処置と比較して、約２％、約３％、約４％、約５％、約７％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％以上遅延される。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、治療的に投与される。ある実施形態において、対象は、検出可能なレベルの自己免疫抗体（例えば、インスリン自己抗体）を有し、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、治療的に投与される。ある実施形態において、対象は、検出可能なレベルの病原性Ｂ細胞集団または疾患を引き起こすＢ細胞集団（例えば、抗インスリンＢ細胞、インスリン特異的Ｂ細胞、もしくはインスリン＋Ｂ細胞）を有し、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、治療的に投与される。ある実施形態において、対象は、検出可能なレベルの自己免疫抗体（例えば、インスリン自己抗体）および検出可能なレベルの病原性Ｂ細胞集団または疾患を引き起こすＢ細胞集団（例えば、抗インスリンＢ細胞、インスリン特異的Ｂ細胞、もしくはインスリン＋Ｂ細胞）を有し、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、治療的に投与される。ある実施形態において、対象は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）と診断されている。ある実施形態において、対象は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）と診断されており、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、治療的に投与される。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与は、投与に先立ち対象において観察されたものと比較して、対象において自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の症状を処置するか、逆転させるか、または改善する。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の際、対象における自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の症状は、投与に先立ち対象において観察されたものと比較して、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも１．５年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも１５年、少なくとも２０年、少なくとも２５年、少なくとも３０年、少なくとも４０年、少なくとも５０年以上処置されるか、逆転されるか、または改善される。ある特定の実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の際、対象における自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の症状は、投与に先立ち対象において観察されたものと比較して、約２％、約３％、約４％、約５％、約７％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％以上処置されるか、逆転されるか、または改善される。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与は、投与に先立ち対象において観察されたものと比較して、対象において自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を処置するか、逆転させるか、または改善する。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の際、対象における自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）は、投与に先立ち対象において観察されたものと比較して、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも１．５年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも１５年、少なくとも２０年、少なくとも２５年、少なくとも３０年、少なくとも４０年、少なくとも５０年以上処置されるか、逆転されるか、または改善される。ある特定の実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の投与の際、対象における自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）は、投与に先立ち対象において観察されたものと比較して、約２％、約３％、約４％、約５％、約７％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％以上処置されるか、逆転されるか、または改善される。
ある実施形態において、対象は、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質の１回の一連の処置を受ける。本明細書において使用される一連の処置は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）が、処置されるか、治癒されるか、緩和されるか、または症状が低減されるまで、対象に提供される、適当な開業医により決定される特定の投薬量または計画を指す。他の実施形態において、対象は、融合タンパク質の１回より多くの一連の処置を受ける。他の実施形態において、対象は、融合タンパク質の複数回の一連の処置を受ける。なお他の実施形態において、対象は、融合タンパク質の複数回の一連の処置を受け、それぞれの一連の処置は、特定の長さの時間（例えば、約１日、約１週、約２週、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約６ヶ月、約１年、約１．５年、約２年、約３年、約４年、約５年、約７．５年、約１０年、約１２．５年、約１５年、約２０年以上）で隔てられる。
ある実施形態において、対象は、成人（例えば、年齢少なくとも１８歳、例えば、年齢少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、または８０～９０歳）である。ある実施形態において、対象は、小児（例えば、年齢１８歳未満、例えば、年齢１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１歳未満）である。ある実施形態において、対象は、男性または女性である。
ある実施形態において、本明細書に記載されるいずれかの方法において使用される参照処置は、インスリンまたはインスリン類似体、例えば、本明細書に記載されるインスリンもしくはインスリン類似体；膵島細胞移植；膵臓移植；あるいはｐａｎ－Ｂ細胞抗原に対する抗体（例えば、細胞傷害性抗体）（例えば、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、または抗ＣＤ１９抗体）を含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、参照処置は、哺乳類、例えば、ヒトまたはマウスから天然に生じるインスリン（例えば、プロインスリンもしくは成熟インスリン）、あるいは米国公開第２０１３／００２８９１８Ａ１号または中国公開第１０３５０９１１８Ａ号に記載される組成物を含み得る。
ある実施形態において、本明細書に記載されるいずれかの方法において使用される参照標準は、自己免疫疾患治療、例えば、１型糖尿病治療の結果、例えば、本明細書に記載される結果を含む。ある実施形態において、例えば、対象が、Ｔ１Ｄを発症するリスクがある（例えば、対象が、Ｔ１Ｄ関して第１度である患者である）場合；対象が前糖尿病である（例えば、対象が、自己抗体陽性である）場合；対象が、Ｔ１Ｄの最近の発病を経験した（例えば、発病からの時間が１２ヶ月未満）場合；対象が、長年Ｔ１Ｄ（例えば、発病からの時間が１２ヶ月以上）を有する場合；または対象が健常対象（例えば、健常な、年齢および／もしくは性別の一致した対象）である場合、参照標準は、治療、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質治療の開始に先立つ、対象におけるマーカーのレベル（例えば、血液グルコースまたはＣペプチドのレベル）である。ある実施形態において、例えば、対象が、Ｔ１Ｄを発症するリスクがある（例えば、対象が、Ｔ１Ｄに関して第１度である患者）場合；対象が前糖尿病である（例えば、対象が、自己抗体陽性である）場合；対象が、Ｔ１Ｄの最近の発病を経験した（例えば、発病からの時間が１２ヶ月未満）場合；対象が、長年Ｔ１Ｄ（例えば、発病からの時間が１２ヶ月以上）を有する場合；または対象が健常対象（例えば、健常な、年齢および／もしくは性別の一致した対象）である場合、参照標準は、治療、例えば、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質治療の開始に先立つ、疾患の存在／進行／重篤度、または疾患の症状の存在／重篤度の測定値である。
医薬組成物
自己免疫疾患、例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病を処置または予防するために使用することができる本明細書に記載される融合タンパク質を含有する医薬組成物が、本明細書において提供される。
医薬組成物における融合タンパク質の量および濃度、ならびに対象に投与される医薬組成物の数量は、対象の医療上関連する特徴（例えば、年齢、体重、性別、他の医療状態など）、医薬組成物中の化合物の溶解性、化合物の効力および活性、ならびに医薬組成物の投与様式などのような臨床上関連する要因に基づき選択することができる。投与経路および投与計画についてのさらなる情報については、Chapter 25.3 in Volume 5 of Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990を参照。
自己免疫疾患、例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病を処置または予防するために使用することができる本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質を含有する医薬組成物が、本明細書において提供される。
本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、単独で投与されるのが可能である一方、ある実施形態において、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質は、インスリンとＦｃの融合タンパク質が、１種もしくは複数の医薬上許容される希釈剤、賦形剤または担体と組合されている、医薬製剤（組成物）として投与されてもよい。本明細書において開示される１つまたは複数のインスリンとＦｃの融合タンパク質を有する医薬組成物は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにその適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る、担体を含むことができる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チオメラソールなどにより達成することができる。グルタチオンおよび他の抗酸化剤を、酸化の防止のため含むことができる。多くの場合において、組成物において、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが有利である。注射可能な組成物の吸収の延長は、例えば、組成物において、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを含むことによりもたらすことができる。
インスリンとＦｃの融合タンパク質は、ヒト医薬における使用のための任意の好都合な方法での投与用に製剤されてもよい。ある特定の実施形態において、医薬調製物において含まれるインスリンとＦｃの融合タンパク質は、それ自体が有効であってもよいか、または例えば、生理学的設定で有効な化合物に変換される能力がある、プロドラッグであってもよい。選択された投与経路に関わらず、適当な水和形態で使用され得る、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質、および／または本テクノロジーの医薬組成物は、本明細書に記載される医薬上許容される投薬形態に、または当業者に公知の他の従来の方法により、製剤される。
別の態様において、本テクノロジーは、１種もしくは複数の医薬上許容される担体（添加剤）および／または希釈剤と一緒に製剤された、治療上有効量または予防上有効量の本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質を含む医薬上許容される組成物を提供する。本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、無菌の溶液もしくは懸濁液としての例えば、皮下、筋肉内または静脈内注射による非経口投与に適合したものを含む、固体あるいは液体形態で投与のため特別に製剤することができる。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、無菌の水に単に溶解されるか、または懸濁され得る。ある実施形態において、医薬調製物は非発熱性である、すなわち、患者の体温を上昇させない。
医薬上許容される担体として働き得る物質のいくつかの例は、（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖；（２）コーンスターチおよびジャガイモデンプンのようなスターチ；（３）ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなセルロースならびにその誘導体；（４）トラガント末；（５）モルト；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバターおよび坐剤ワックスのような賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、ごま油、オリーブオイル、コーン油および大豆油のような油；（１０）プロピレングリコールのようなグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールのようなポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液；（２１）Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）のようなシクロデキストリン；ならびに（２２）医薬製剤において利用される他の無毒性の適合可能な物質を含む。ある実施形態において、担体は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。
ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような湿潤剤、乳化剤ならびに滑沢剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘未剤、香味剤および灌流剤、保存剤ならびに酸化防止剤もまた、組成物に存在することができる。
本明細書に記載される通り、ある特定の実施形態の本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質は、アミンのような塩基性の官能基を含有し、これにより、医薬上許容される酸と医薬的に許容される塩を形成する能力がある。これらの場合での用語「医薬的に許容される塩」は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質の比較的無毒性の、無機酸および有機酸付加塩を指す。これらの塩は、インスリンとＦｃの融合タンパク質の最終的な単離および精製中に、またはその遊離塩基形態の本明細書に記載される精製されたインスリンとＦｃの融合タンパク質を適当な有機酸または無機酸と反応させること、およびこれにより形成された塩を単離することにより、その位置で調製することができる。代表的な塩は、水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリル硫酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリル硫酸塩などを含む（例えば、Berge et al. (1977) “Pharmaceutical Salts”, J. Pharm. Sci. 66: 1-19を参照）。
他の場合には、ある特定の実施形態の本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質は、１つまたは複数の酸官能基を含有し、これにより、医薬上許容される塩基と医薬的に許容される塩を形成する能力がある。これらの場合での用語「医薬的に許容される塩」は、インスリンとＦｃの融合タンパク質の比較的無毒性の、無機酸および有機塩基付加塩を指す。これらの塩は、同様に、インスリンとＦｃの融合タンパク質の最終的な単離および精製中に、またはその遊離酸形態の精製されたインスリンとＦｃの融合タンパク質を、医薬上許容される金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩のような適当な塩基、アンモニアと、または医薬上許容される有機１級、２級もしくは３級アミンと別々に反応させることにより、その位置で調製することができる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属は、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム塩などを含む。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンは、エチレンアミン、ジエチレンアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどを含む（例えば、上の、Berge et al.,を参照）。
医薬上許容される酸化防止剤の例は、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水溶性酸化防止剤；（２）アスコルビルパルミテート、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ－トコフェロールなどのような脂溶性酸化防止剤；および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような金属キレート剤を含む。
医薬組成物は、典型的には、その意図される投与経路に適合可能であるように製剤される。投与経路の例は、非経口（例えば、静脈内、皮内、腹腔内または皮下）、経口、吸入、経皮（局所）、眼内、イオン泳動的および経粘膜投与を含む。非経口、皮内、または皮下適用のため使用される溶液または懸濁液は、以下の成分：注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような無菌の希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝液、および塩化ナトリウムまたはできストロースのような弾力性の調節のための剤を含む。ｐＨは、塩酸もしくは水酸化ナトリウムのような、酸または塩基で調節することができる。非経口調製物は、アンプル剤、ディスポーザブルの注射器またはガラスもしくはプラスチック製の複数回用量のバイアルに封入され得る。患者または処置を行う医師の便宜上、投与製剤は、処置コース（例えば、７日間の処置）のための全ての必要な器具（例えば、薬物のバイアル、希釈剤のバイアル、注射器および針）を含有するキットにおいて提供することができる。
本開示の製剤は、非経口投与に適当なものを含む。製剤は、便宜上、単位投薬形態で提示されてもよく、薬局の当該技術分野において周知の任意の方法により調製されてもよい。担体金属と組合せて、単一投薬形態を作製し得る、有効成分の量は、処置されている対象および特定の投与様式に依存して変動する。担体物質と組合せて、単一投薬形態を作製し得る、有効成分の量は、一般に、治療効果を生じる化合物のその量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、約１パーセント～約９９パーセント、約５パーセント～約７０パーセント、または約１０パーセント～約３０パーセントの有効成分の範囲にある。
非経口投与に適当な本テクノロジーの医薬組成物は、１種または複数の医薬的に許容される無菌の等張水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液もしくは乳液、または酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、意図されるレシピエントの血液と等張な製剤を与える溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含有してもよい、使用の直前に無菌の注射可能な溶液もしくは分散液に再構成され得る無菌の粉末との組合せで、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質を含む。
本テクノロジーの医薬組成物において利用され得る適当な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびその適当な混合物、オリーブオイルのような植物油、ならびにオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルを含む。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティング材料の使用により、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ様界面活性剤の使用により、維持することができる。ある実施形態において、医薬組成物（例えば、本明細書に記載される）は、Ｔｗｅｅｎ様界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ－８０を含む。ある実施形態において、医薬組成物（例えば、本明細書に記載される）は、Ｔｗｅｅｎ様界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ－８０を約０．００１％～約２％、または約０．００５％～約０．１％、または約０．０１％～約０．５％の濃度で含む。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射部位からの薬物の吸収を遅らせることが所望され得る。これは、低い水溶解度を有する結晶または無定形材料の液体懸濁液の使用により達成され得る。次に、薬物の吸収率は、その溶解率に依存し、順に、結晶サイズおよび結晶形態に依存する。あるいは、インスリンとＦｃの融合タンパク質の非経口投与の遅延した吸収は、インスリンとＦｃの融合タンパク質を油性ビークルにおいて溶解または懸濁することにより、達成される。あるいは、薬物の吸収は、濃縮形態のインスリンとＦｃの融合タンパク質の濃縮形態の使用を通じて遅延されてもよい。
ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、ボーラス注入または静脈内プッシュとして投与される。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、注射器注射、ポンプ、ペン、針、または留置カテーテルを通じて投与される。
注射可能な使用に適当な医薬組成物は、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌の注射可能な溶液もしくは分散液の即時調製のための無菌の粉末を含み得る。静脈内投与のため、適当な担体は、生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー州）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、非経口投与用組成物は、無菌でなければならず、容易な注射器通過性が存在する程度まで、流体であるべきである。それは、製造および保存の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保護されなければならない。
無菌の注射可能な溶液は、上で挙げられた成分の１つまたは組合せと共に適当な溶媒中必要とされる量の有効な化合物を取り込むことにより調製することができ、必要であれば、続いて、濾過滅菌される。一般に、分散液は、基本的な分散媒体および上で挙げられたもの由来の必要とされる他の成分を含有する無菌のビークルに有効な化合物を取り込むことにより、調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合、典型的な調製方法は、真空乾燥およびスプレー乾燥を含み、これにより、有効成分および予め無菌的に濾過されたその溶液由来の任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる。
経口組成物は、一般に、不活性な希釈剤または食用可能な担体を含む。経口治療投与の目的で、有効な化合物は、賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物はまた、マウスウォッシュとしての使用のための流体担体を使用して調製することができる。医薬的に適合可能な結合剤、および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含むことができる。錠剤、ピル剤、カプセル剤、トローチ剤などは、次の成分、あるいは同様の性質の化合物：微結晶セルロース、トラガントガムもしくはゼラチンのような結合剤；スターチもしくはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテスのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑剤；スクロースもしくはサッカリンのような甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジフレーバーのような香味剤のいずれかを含有することができる。
吸入による投与のため、化合物は、適当な高圧ガス、例えば、二酸化炭素のようなガスを含有する、加圧容器もしくはディスペンサー、または噴霧吸入器からエアロゾルスプレー形態でデリバリーすることができる。かかる方法は、米国特許第６，４６８，７９８号に記載されるものを含む。
本明細書に記載される治療化合物の全身投与はまた、経粘膜または経皮／局所手段によるものであり得る。経粘膜または経皮／局所投与のため、透過されるべきバリアに適切な浸透剤が、製材において使用される。かかる浸透剤は、一般に、当該技術分野において公知であり、例えば、経粘膜投与のため、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻用スプレーまたは吸入薬の使用を通じて成し遂げられ得る。経皮／局所投与のため、有効な化合物は、当該技術分野において一般に知られた、粉剤、溶液剤、軟膏、ローション剤、ゲル、パッチ、ペースト、膏薬またはクリーム剤に製剤される。有効な化合物は、無菌条件下で医薬上許容される担体と、および任意の保存剤、緩衝液、または必要とされ得る高圧ガスと混合することができる。１つの実施形態において、経皮投与は、イオン導入により行われてもよい。
導入方法は、再充電可能または生分解性装置により提供されてもよい。様々な低速放出ポリマー装置が開発されており、タンパク質生物製剤を含む、薬物の制御されたデリバリーについて近年インビボで試験されている。生分解性と非分解性ポリマーの両方を含む、様々な生体適合ポリマー（ヒドロゲルを含む）を使用して、特定の標的部位での化合物の持続放出のための挿入物を形成することができる。
本テクノロジーは、上述の医薬組成物および調製物のいずれかにおけるインスリンとＦｃの融合タンパク質の製剤を考慮する。さらに、本テクノロジーは、前述の投与経路のいずれかを介した投与を考慮する。当業者は、処置されている状態、ならびに処置されている患者の全体的な健康状態、年齢および大きさに基づき、適切な製剤ならびに投与経路を選択することができる。
有効な投薬量
任意の治療剤の投薬量、毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な医薬手法により決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比は、治療指数であり、それは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が有利である。毒性の副作用を示す化合物が使用され得る一方、影響されない細胞への可能性のある損傷を最小にするために影響された組織の部位にかかる化合物を標的化し、それにより、副作用を低減するデリバリーシステムを設計するケアが取られるべきである。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を公式化する際に使用することができる。かかる化合物の投薬量は、少ない毒性を有するか、または毒性を有さないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であり得る。投薬量は、利用される投薬形態および利用される投薬経路に依存してこの範囲内で変動し得る。方法において使用される任意の化合物について、治療上有効な用量は、細胞培養アッセイからまず推定することができる。用量を動物モデルにおいて公式化して、細胞培養液において決定されたＩＣ５０を含む、循環血漿濃度範囲を達成することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量を正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定されてもよい。
本明細書に記載される医薬組成物におけるインスリンとＦｃの融合タンパク質の実際の投薬量レベルは、患者に毒性ではなく、特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療または予防応答を達成するのに有効である、有効成分の量を得るように、変動することができる。
選択された投薬量レベルは、利用される特定のインスリンとＦｃの融合タンパク質、またはそれらのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、利用されている特定のインスリンとＦｃの融合タンパク質の排泄率、処置の持続、利用される特定のインスリンとＦｃの融合タンパク質と組合せて使用される他の薬物、化合物および／もしくは物質、疾患または障害の重篤度、以前の処置、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態および既往歴、ならびに当該技術分野において周知の同様の要因を含む、様々な要因に依存する。さらに、治療上または予防上有効量の本明細書に記載される医薬組成物での対象の処置は、１回の処置または一連の処置を含み得る。
当業者である医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、規定することができる。例えば、医師は、医薬組成物において利用されるインスリンとＦｃの融合タンパク質の用量を所望の治療または予防効果を達成するために必要とされるものより低いレベルではじめ、所望の効果が達成されるまで、投薬量を徐々に増大させることができる。インスリンとＦｃの融合タンパク質が、医薬として対象に投与されるとき、それは、例えば、医薬上許容される担体と組合せて、例えば、０．１～９９．５％（または０．５～９０％）の有効成分を含有するそれ自体または医薬組成物として与えることができる。
一般に、インスリンとＦｃの融合タンパク質の適当な１日用量は、治療効果を生じるのに有効な最小用量であるインスリンとＦｃの融合タンパク質のその量である。かかる有効用量は、一般に、上記の要因に依存する。典型的には、治療または予防効果を達成するのに十分な、本明細書において開示される１種または複数のインスリンとＦｃの融合タンパク質の有効量は、１日毎に体重１キログラム当たり約０．０００００１ｍｇ～１日毎に体重１キログラム当たり約１０，０００ｍｇの範囲にある。適当には、投薬量範囲は、１日毎に体重１キログラム当たり約０．０００１ｍｇ～１日毎に体重１キログラム当たり約１００ｍｇである。例えば、投薬量は、毎日、２日毎もしくは３日毎に体重１ｋｇ当たり１ｍｇまたは体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ、あるいは毎週、２週間毎もしくは３週間毎に１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。１つの実施形態において、治療化合物の１回投薬量は、体重１ｋｇ当たり０．００１～１０，０００マイクログラムの範囲にある。１つの実施形態において、担体中の１種または複数のインスリンとＦｃの融合タンパク質濃度は、デリバリーされる１ミリリットル当たり０．２～２０００マイクログラムの範囲にある。典型的な処置計画は、１日１回または１週間に１回の投与を必要とする。治療適用において、比較的短い間隔での比較的高い投薬量は、ときに、疾患の進行が低減されるか、もしくは止まるまで、または対象が疾患の症状の部分的もしくは完全な改善を示すまで、必要とされる。その後、患者は、予防計画を投与され得る。ある実施形態において、１種または複数のインスリンとＦｃの融合タンパク質の治療上有効量は、１０－３２～１０－６モル、例えば、およそ１０－７モルの標的組織でのインスリンとＦｃの融合タンパク質の濃度として定義されてもよい。この濃度は、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇの全身用量、または体表面積により均等な用量によりデリバリーされてもよい。投与のスケジュールを最適化して、継続投与（例えば、非経口点滴または経皮適用）も含むが、１回の毎日または毎週の投与によるような、標的組織での治療濃度を維持する。
一般に、患者のためのインスリンとＦｃの融合タンパク質の静脈内および皮下用量は、１日毎に体重１キログラム当たり約０．０００１～約１００ｍｇ、例えば、約０．０００１～約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１～約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１～約０．１ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１～約１ｍｇ／ｋｇ／日、約１～約１０ｍｇ／ｋｇ／日、または約１０～約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にある。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、６０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日以上の用量で投与される。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、７５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日以上、１００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日以上、１５０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日以上、または２００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日以上の用量で投与される。ある特定の実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、１ｍｇ／ｋｇ／日以上、例えば、２ｍｇ／ｋｇ／日、４ｍｇ／ｋｇ／日、８ｍｇ／ｋｇ／日、１６ｍｇ／ｋｇ／日、３２ｍｇ／ｋｇ／日、６４ｍｇ／ｋｇ／日、１００ｍｇ／ｋｇ／日、２００ｍｇ／ｋｇ／日以上の用量で投与される。
インスリンとＦｃの融合タンパク質は、約１００ｍｇ／ｍＬ以下（例えば、１００ｍｇ／ｍＬ以下、例えば、９０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ以下）の濃度で存在してもよい。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、約０．２５ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．２５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．５ｍｇ／ｍＬ）、約０．７５ｍｇ／ｍＬ、または約１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
所望なら、インスリンとＦｃの融合タンパク質の有効な１日用量は、場合により、単位投薬形態で、１日を通じて適当な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６回以上の亜用量として投与することができる。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、１日１回投与される。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、少なくとも１週間に２回投与される。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、少なくとも１週間に１回投与される。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、毎週２回投与される。
インスリンとＦｃの融合タンパク質は、それ自体、または医薬上許容されるおよび／もしくは無菌の担体との混合物中で投与することができ、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシドおよび糖ペプチドのような抗菌剤と併せて投与することもできる。従って、接続的な治療は、第１の投与された治療の治療または予防効果が、続く治療が投与されるとき、依然として検出可能である方法での、インスリンとＦｃの融合タンパク質の連続、同時および別々の投与を含む。
併用療法
ある実施形態において、本明細書において開示される１種または複数のインスリンとＦｃの融合タンパク質は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の予防もしくは処置のための１種または複数のさらなる治療と組合せてもよい。
任意の場合において、複数の治療剤は、任意の順または同時にでさえ投与されてもよい。同時なら、複数の治療剤は、単一の、統合された形態で、または複数の形態で（例示のみの目的で、単一のピル剤としてまたは２つの別々のピル剤としてのいずれかで）提供されてもよい。治療剤の１つは、複数回用量で与えられてもよく、または複数回用量として与えられてもよい。同時でないなら、複数回用量間のタイミングは、０より長い週から４週以下まで変動してもよい。加えて、組合せ方法、組成物および製剤は、２種の薬剤のみの使用に限定されない。
ある実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療を、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質との組合せを含む製剤において投与して、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を処置または予防する。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療は、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質と同時に投与される。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療は、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質より連続して（異なる時間に）投与される。例では、少なくとも１つのさらなる治療は、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質と約５分、約１０分、約３０分、約１時間、約１．５時間、約２時間、約４時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間隔てて投与される。少なくとも１つのさらなる治療は、インスリンとＦｃの融合タンパク質と同じ経路により投与されてもよいか、または投与されなくてもよい。例では、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、１つの方法で（例えば、静脈内または皮下）投与されてもよく、一方少なくとも１つのさらなる治療は、別の方法で（例えば、経口）別々に投与されてもよい。
ある実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療は、インスリン増感剤である。インスリン増感剤（例えば、ビグアニド（例えば、メトホルミン）ならびにグリタゾン（例えば、ロシグリタゾンおよびピオグリタゾン））は、対象の応答をインスリン（またはインスリン類似体）の所定の量まで増加させることにより、作用する。それ故、インスリン増感剤を受け取った患者は、当該インスリン増感剤を受け取っていない患者と比較して、より少ない用量の本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質を必要とし得る。従って、ある特定の実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、インスリン増感剤と組合せて対象に投与される。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、インスリン増感剤の不存在下で必要とされる標準用量の約９５％で、例えば、インスリン増感剤の不存在下で必要とされる標準用量の約９０％で、約８５％で、約８０％で、約７５％で、約７０％で、約６５％で、約６０％で、約５５％で、約５０％で、約５０％で、約４５％で、約４０％で、約３５％で、約３０％で、約２５％で、約２０％で、約１５％で、約１０％で、約５％以下で投与されてもよい。
ある実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療を投与して、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）またはその症状の完全な発病を予防し、健常対象のものと比較して、少なくとも約９０％のβ細胞塊の維持をもたらす。ある実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療を投与して、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の完全な発病を予防し、健常対象のものと比較して、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、少なくとも約１０％、または少なくとも約５％のβ細胞塊の維持をもたらす。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の症状を予防する治療と組合せて対象に投与され、健常対象のものと比較して、少なくとも約９０％のβ細胞塊の維持をもたらす。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の症状を予防する治療と組合せて対象に投与され、健常対象のものと比較して、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、少なくとも約１０％、または少なくとも約５％のβ細胞塊をもたらす。
ある実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療を投与して、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）またはその症状の完全な発病を予防し、健常対象のものと比較して、少なくとも約９０％の内在性Ｃペプチドレベルの維持をもたらす。ある実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療を投与して、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）またはその症状の完全な発病を予防し、健常対象のものと比較して、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、少なくとも約１０％、または少なくとも約５％の内在性Ｃペプチドレベルの維持をもたらす。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の症状を予防する治療と組合せて対象に投与され、健常対象のものと比較して、少なくとも約９０％の内在性Ｃペプチドレベルの維持をもたらす。ある実施形態において、インスリンとＦｃの融合タンパク質は、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の症状を予防する治療と組合せて対象に投与され、健常対象のものと比較して、少なくとも少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、少なくとも約１０％、または少なくとも約５％の内在性Ｃペプチドレベルをもたらす。
キット
本開示はまた、本明細書に記載されるインスリンとＦｃの融合タンパク質の１種または複数を含む、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の予防および／または処置のためのキットを提供する。場合により、本テクノロジーのキットの上記成分は、適当な容器に入れられ、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）の予防および／または処置についてラベルされる。
上述の成分は、水溶液、好ましくは、無菌の水溶液として、または再構成用の凍結乾燥、好ましくは、無菌の製剤として、単位または複数回用量の容器、例えば、密封されたアンプル剤、バイアル、ボトル、注射器、および試験管において保存されてもよい。キットは、より高容量に医薬組成物を希釈するのに適当な希釈剤を保持する第２の容器をさらに含んでもよい。適当な希釈剤は、医薬組成物の医薬上許容される賦形剤および食塩水溶液を含むが、これらに限定されない。さらに、キットは、医薬組成物を希釈するための説明書、および／または希釈されるかどうかに関わらず、医薬組成物を投与するための説明書を含んでもよい。容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成されてもよく、無菌のアクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射針により突き刺され得るストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。キットは、さらに、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液のような医薬上許容される緩衝液を含む、さらなる容器を含んでもよい。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、１種または複数の適当な宿主のための培養培地を含む、市販および使用者の観点から望ましい他の物質をさらに含んでもよい。キットは、例えば、表示、使用、投薬量、製造、投与、禁忌および／またはかかる治療剤もしくは製品の使用に関する注意についての情報を含有する、治療製品の市販のパッケージに慣例的に含まれる説明書を場合により含んでもよい。
キットはまた、例えば、緩衝剤、保存剤または安定化剤を含み得る。キットはまた、アッセイされ、試験試料と比較され得る対照試料または一連の対照試料を含有し得る。キットのそれぞれの構成要素は、個々の容器内に封され、様々な容器の全てが、キットを使用して行われるアッセイの結果を解釈するための説明書と共に、単一パッケージ内にあることができる。本テクノロジーのキットは、キット容器上またはキット容器内に記載された製品を含有してもよい。記載された製品は、キットに含有される試薬の使用方法を記載する。ある特定の実施形態において、試薬の使用は、本テクノロジーの方法に従うものであり得る。
本テクノロジーは、以下の実施例により説明され、それは、いずれかの制限と解釈されるべきではない。
実施例１：ＨＥＫ２９３細胞におけるインスリンとＦｃの融合タンパク質の合成および作製方法
インスリンとＦｃの融合タンパク質を、以下の通り合成した。プロプライエタリ・ソフトウェア（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ、ベルモント、カリフォルニア州）を使用して、目的の遺伝子配列を構築し、高発現哺乳類ベクターにクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、振とうフラスコ内に播種し、血清を含まない化学的に規定した培地を使用して成長させた。一過性トランスフェクションのためのＳｙｄ Ｌａｂｓ（ナティック、マサチューセッツ州）の標準的な操作手法を使用して、ＨＥＫ２９３細胞の懸濁液２Ｌに、目的のインスリンとＦｃの融合タンパク質をコードするＤＮＡ発現コンストラクトを一過性にトランスフェクトした。２０時間後、細胞をカウントして、生存能および生細胞カウントを決定し、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＬＬＣ、フレモント、カリフォルニア州）により、タイターを測定した。さらなる読み取りを、一過性のトランスフェクション作製実行を通じて取得した。５日目またはその後に、培養液を回収した。
表１に示す通り、ＨＥＫ２９３細胞において合成した、本テクノロジーの典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；および配列番号８）は、「ＡＡＫ」Ｃ鎖配列を含有しない他のインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号９および配列番号１０）より有意に高いタイターを示した。
Figure 0007170332000004
実施例２：ＣＨＯ細胞におけるインスリンとＦｃの融合タンパク質の合成および産生方法
ＣＨＯ細胞株は、元々、ＣＨＯ－Ｋ１（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ、ベルモント、カリフォルニア州）に由来し、当該技術分野において公知の方法を使用する組換えテクノロジーにより、内在性グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子をノックアウトした。安定な発現ＤＮＡベクターを設計し、ＣＨＯ発現およびＧＳセレクションに最適化し、高発現哺乳類ベクター（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ、ベルモット、カリフォルニア州）に組込んだ。それぞれの完成したコンストラクトの配列を、スケールアップ実験の開始に先立ち確かめた。加湿５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、３７℃で、化学的に規定した培地（ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）；インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）においてＣＨＯ細胞を培養した。ＣＨＯ細胞の培養において、血清または他の動物由来の製品を使用しなかった。
指数増殖相中にＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地中で成長している、およそ８０００万個の懸濁適合したＣＨＯ細胞を、ＤＮＡ８０μｇでのＭａｘＣｙｔｅ（登録商標）ＳＴＸ（登録商標）システム（ＭａｘＣｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）を使用するエレクトロポレーションによりトランスフェクションして、それぞれのインスリンとＦｃの融合タンパク質について安定なＣＨＯ細胞株を作製した（ＤＮＡコンストラクトは、インスリンとＦｃの融合タンパク質の全長配列を含有する）。２４時間後、トランスフェクトした細胞をカウントし、インスリンとＦｃ融合物遺伝子の安定な組込みについての選択下に置いた。トランスフェクトした細胞を、１００μΜメチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を含有するＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）選択培地に、０．５×１０６個細胞／ｍＬの細胞密度で振とうフラスコにおいて播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。選択プロセス中、細胞をスピンダウンし、プールがその成長率および生存能を回復するまで、２～３日毎に新鮮な選択培地に再懸濁した。成長およびタイターについて、細胞培養液をモニターした。
１ｍＬ当たり２．５×１０６個の細胞まで、細胞を成長させた。細胞を預けるための回収時に、生存能は９５％より高かった。次に、細胞を遠心分離し、細胞ペレットを、７．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地に、１個のバイアル毎に１ｍＬ当たり１５×１０６個の細胞カウントまで再懸濁した。液体窒素中での保存のため、バイアルを凍結保存した。
以下の通り、ＣＨＯ細胞を使用して、スモールスケールアップ産生を行った。３７℃での、１００μΜ ＭＳＸを含有するＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）成長培地における産生のため細胞をスケールアップし、必要に応じて２～４日毎に、グルコースおよび必要に応じてさらなるアミノ酸を添加したＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）成長培地をおよそ１４～２１日間与えた。安定なプール産生実行から回収した条件培地の上清を、遠心分離により清澄化した。タンパク質を、タンパク質Ａ（Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ、ＧＥヘルスケア、リトル・チャルフォント、英国）カラムに通し、ｐＨ勾配を使用して溶出した。０．２μΜメンブレンフィルターを使用して、濾過を行った。
場合により、単クローン性までさらに細胞株をサブクローニングし、場合により、当業者に公知の方法である限界希釈法を使用して、高いタイターのインスリンとＦｃの融合タンパク質を発現するクローンについてさらに選択した。高いタイターの単クローンのインスリンとＦｃの融合タンパク質を発現する細胞株を得た後、インスリンとＦｃの融合タンパク質の産生をＭＳＸを含まない成長培地において、または場合により、ＭＳＸを含有する成長培地において上記の通り行って、組換えＣＨＯ作製インスリンとＦｃの融合タンパク質を含有する細胞培養上清を得た。
実施例３：インスリンとＦｃの融合タンパク質の精製
以下の通り、インスリンとＦｃの融合タンパク質の精製を行った。一過性もしくは安定的にトランスフェクトしたＨＥＫまたはＣＨＯ産生実行から、分泌されたインスリンとＦｃの融合タンパク質を含有する条件培地上清を回収し、遠心分離により清澄化した。所望のインスリンとＦｃの融合タンパク質を含有する上清を、タンパク質Ａカラムに通し、低ｐＨ勾配を使用して溶出した。その後、溶出した所望のタンパク質分画をプールし、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０緩衝液に緩衝液交換した。０．２μｍのメンブレンフィルターを使用して、最終的な濾過工程を行った。２８０ｎｍでの溶液の光学密度から、最終タンパク質濃度を計算した。さらに場合により、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、または他の方法による精製を、必要に応じて行った。タンパク質Ａカラム精製後に得たタイター結果（ｍｇ／Ｌ）を、図２に示す。
実施例４：非還元性および還元性ＣＥ－ＳＤＳによる構造の確認
ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ（パーキンエルマー、ウォルサム、マサチューセッツ州）において、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０緩衝液に溶解した精製したインスリンとＦｃの融合タンパク質の溶液について、ＣＥ－ＳＤＳ解析を行い、電気泳動図をプロットした。非還元条件下で、試料を公知の分子量（ＭＷ）タンパク質標準に対して走らせ、溶出ピークは、インスリンとＦｃの融合タンパク質ホモダイマーの「見かけ」ＭＷを表していた。
還元条件（インスリンとＦｃの融合タンパク質ホモダイマーのジスルフィド結合を壊すためにベータ－メルカプトエタノールを使用する）下で、得られたインスリンとＦｃの融合タンパク質モノマーの見かけＭＷを、インスリンとＦｃの融合タンパク質の構造純度がおそらく正しいことを決定する方法として、インスリンとＦｃの融合タンパク質ホモダイマーの分子量の半分と比較する。
ＨＥＫ２９３細胞において合成させたインスリンとＦｃの融合タンパク質のＣＥ－ＳＤＳ解析を介して見られる非還元および還元の主要ピークを、表２に示す。ＣＨＯ細胞において合成させたインスリンとＦｃの融合タンパク質についてのＣＥ－ＳＤＳ解析を介して見られる非還元および還元の主要ピークを、表３に示し、得られたインスリンとＦｃの融合タンパク質モノマーの２倍の見かけＭＷを、インスリンとＦｃの融合タンパク質ホモダイマーの分子量と比較した。表２および表３における結果は、インスリンとＦｃの融合タンパク質の構造純度が、おそらく正しいことを説明する。
Figure 0007170332000005
Figure 0007170332000006
実施例５：グリカン除去を伴うＬＣ－ＭＳによる配列同一性
質量分析（ＭＳ）を介してインスリン－Ｆｃ質量の正確な推定値を得るために、試料をまず処理して、ＭＳ解析と干渉し得る天然に生じ得るグリカンを除去した。２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ７．０緩衝液溶液に溶解した２．５ｍｇ／ｍＬインスリンとＦｃの融合タンパク質１００μＬを、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ、サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）を使用して、５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０緩衝液にまず交換した。融合タンパク質に存在するＮ結合グリカンを除去するために、ＰＮＧａｓｅＦ酵素（プロザイムＮ－グリカナーゼ）１．６７μＬをこの溶液に加え、混合物を、３７℃で一晩、インキュベーターにおいてインキュベーションした。次に、試料をＬＣ－ＭＳ（ＮｏｖａＢｉｏａｓｓａｙｓ、ワーバン、マサチューセッツ州）を介して解析し、グリカンを含まない所望のホモダイマーに対応する分子の分子質量を得た。次に、アスパラギンからグリカンを切断するために使用される酵素プロセスはまた、アスパラギン側鎖を脱アミノして、アスパラギン酸を形成し、その際に、酵素的に処理したホモダイマーは、ホモダイマーに存在するそれぞれの鎖についての１Ｄａの質量に対応する、２Ｄａ全体を得るので、この質量をさらに補正した。それ故、実際の分子量は、解析試料中のインスリンとＦｃの融合タンパク質構造の酵素修飾について補正するために測定した質量マイナス２Ｄａである。典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質についてのＬＣ－ＭＳ分子量データ、補正質量データ、および理論分子量（Ｅｘｐａｓｙ ＭＷ／ｐＩツールを介して得た）を、表４に示す。
Figure 0007170332000007
実施例６：分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）による％ホモダイマー
２８０ｎｍの波長でのＷａｔｅｒｓ２９９８フォトダイオードアレイを取り付けたＷａｔｅｒｓ２７９５ＨＴ ＨＰＬＣ（ウォーターズコーポレーション、ミルフォード、マサチューセッツ州）を使用して、インスリンとＦｃの融合タンパク質の分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）を行った。目的のインスリンとＦｃの融合タンパク質を含有する試料１００μＬ以下を、０．２ｍＬ／分の流速で作動する、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０５％ｗ／ｖ窒化ナトリウム、ｐＨ６．２を含む移動相を有する、ＭＡｂＰａｃ ＳＥＣ－１、５μｍ、４×３００ｍｍカラム（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）に注入した。ＭＡｂＰａｃ ＳＥＣ－１カラムは、分子サイズ分離の原理に基づき作動する。それ故、可溶性のインスリンとＦｃの凝集物（例えば、インスリンとＦｃの融合タンパク質ホモダイマーの多量体）が大きいほど、短い保持時間で溶出し、凝集していないホモダイマーは、より長い保持時間で溶出した。解析的ＳＥＣ－ＨＰＬＣを介して凝集した多量体ホモダイマーからホモダイマーの混合物を分離する際に、凝集していないホモダイマーのパーセンテージに関してインスリンとＦｃの融合タンパク質溶液の純度を確認した。図３は、ＨＥＫ２９３細胞においておよびＣＨＯ細胞において作られたインスリンとＦｃの融合タンパク質のホモダイマーのパーセンテージを示す。図３は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；および配列番号８）が、ＨＥＫ２９３とＣＨＯ細胞の一方または両方において作られたとき、比較的高いホモダイマーの％を示したことを示す。対照的に、配列番号９および配列番号１０は、ＨＥＫ２９３細胞で作られたとき、比較的低いホモダイマーの％を示した。
実施例７：インスリンとＦｃの融合タンパク質のビオチン結合体
以下の通り、インスリンとＦｃの融合タンパク質をビオチンに結合させた。ＰＢＳ、ｐＨ７．４中０．５ｍｇ／ｍＬのインスリンとＦｃの融合タンパク質１ｍＬ、を、磁気撹拌棒を備えた小さいバイアルに加えた。別に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で３０ｍＭビオチニダーゼ抵抗性ビオチン－ＢＲ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ試薬（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ、ユニオン郡、オハイオ州）を作製した。次に、ビオチン試薬ストック溶液の一部を、緩衝していないｐＨ４．０の脱イオン水中で１０倍希釈し、直後に、希釈したＤＭＳＯ／水ビオチン試薬溶液をインスリン－Ｆｃタンパク質溶液に加えた。インスリンとＦｃタンパク質に対するビオチン試薬のモル比が、１～１００ｍｏｌ／ｍｏｌであるように、断続的に撹拌しながら、希釈したビオチンＤＭＳＯ／水溶液の量を、インスリンとＦｃのタンパク質溶液に少しずつ加えた。典型的なビオチン結合反応は、１２：１のインスリンとＦｃの融合タンパク質に対するビオチン試薬のモル比を標的にする。合わせたビオチン試薬とインスリンとＦｃの融合タンパク質の溶液を、２時間以上、室温（ＲＴ）で反応させ、その後、結合していないビオチン試薬およびＤＭＳＯを、Ｚｅｂａ（商標）１０ｍＬ、７ｋＤａのＰｉｅｒｃｅ（商標）スピンカラム（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）を使用したゲル濾過を介して除去し、エンドトキシンフリーのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に入れた。２８０ｎｍでの吸光度により、溶液の終濃度を決定した。
以下の通り、ＥＬＩＳＡアッセイを介して、ビオチン結合体のプルーフを得た。インスリンとＦｃの融合タンパク質および非ビオチン化マウスＩｇＧ１対照抗体を、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液中の１０μｇ／ｍＬに希釈し、１００μl/ウェルのそれぞれの溶液を、９６ウェルアッセイＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）マイクロプレート（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）のウェルに別々に加え、１時間、ＲＴでインキュベーションして、ウェルをコーティングした。次に、プレートを、０．１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳを含むプレートウォッシャー（Ｂｉｏｔｅｋ（登録商標）、ウィヌースキ、バーモンド州）で洗浄し、ウェル表面を、２５０μl／ウェルのＰｉｅｒｃｅ（商標）ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標）（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）で１時間、室温でブロッキングした。次に、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、試料を、ストック溶液から１：８０００～１：１５，０００に希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰ結合体（Ａｂｅａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）と共に１００μl／ウェルで別々にインキュベーションした。プレートを、そのまま１時間、ＲＴでインキュベーションした。次に、プレートを、ＰＢＳＴを使用したプレートウォッシャーで最終的に洗浄し、次に、２×脱イオン水で再度洗浄した。最終的に、プレートを、１００μl／ウェルＴＭＢ（ライフテクノロジーズ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、カールスバド、カリフォルニア州）と、続いて１００μl／ウェルＥＬＩＳＡ停止溶液（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、アシュランド、マサチューセッツ州）と、適当な時間（典型的には、５分間）インキュベーションして、プレートを開発した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス、サニーベール、カリフォルニア州）でのＯＤ４５０ｎｍにより、プレートの吸光度を定量した。成功したビオチン結合インスリンとＦｃの融合タンパク質でコーティングされたウェルは、典型的には、マウスＩｇＧ１非結合対照またはブランクウェルのものより１．５ＯＤ以上高い、Ａ４５０値を示した。
実施例８：インビボでの薬物動態（ＰＫ）および薬力動態（ＰＤ）パラメーターの測定
以下の通り、ビオチン結合インスリンとＦｃの融合タンパク質および非結合インスリンとＦｃの融合タンパク質を、それらのインビボでの薬物動態について評価した。１群当たりＮ＝４匹のｂａｌｂ／ｃマウス（ジャクソン研究所（ＪＡＸ）、バー・ハーバー、メイン州）を体重測定し、２つのベースラインの血液グルコース測定値を、血糖値測定器（アボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州）を使用して取得し、１つのベースライン血液試料を、顎下静脈を介して後の血清解析のため収集した。次に、マウスに、２ｍｇ／ｋｇインスリンとＦｃの融合タンパク質を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。血清解析用血液グルコース測定および血液回収を、ｔ＝０～ｔ＝２１日の間隔で取得した。血液を凝血させ、凝血した試料の遠心分離後、血清を得て、ポリプロピレン９６ウェルプレートにおいて直ちに凍結し、解析を行うまで、－２０℃で保存した。別の対照実験を、組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）（シグマアルドリッチコーポレーション、セントルイス、ミズーリ州）で行い、インスリンとＦｃの融合タンパク質対ＲＨＩ対照群のグルコース低下活性における差を示す。
ＥＬＩＳＡベースのＰＫアッセイ。以下の通り、ＥＬＩＳＡ解析を介して、薬物動態データを得た。９６ウェルＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレート（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）を、１０μｇ／ｍＬ Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）で、１時間、ＲＴでコーティングし、その後、プレートを洗浄し、２５０μl／ウェルＰｉｅｒｃｅ（商標）ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（商標）（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）で、一晩４℃でブロッキングした。次に、希釈したインビボ血清試料１００μＬ（典型的には、２～２００倍の希釈倍数以上）、かつ別のウェルにおいて、ＰＢＳＴ／ＳＢ中の公知の濃度を有するビオチン結合インスリンとＦｃの融合タンパク質標準をプレートに添加し、標準曲線（３倍連続希釈）を構築し、１時間、ＲＴでインキュベーションした。プレートを、プレートウォッシャー（Ｂｉｏｔｅｋ（登録商標）、ウィヌースキ、バーモンド州）を使用して洗浄し、ＰストックからＢＳＴ／ＳＢに１：１０，０００希釈した適当な２次抗体ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、モントゴメリー、テキサス州）１００μlをプレートに加え、１時間、ＲＴでインキュベーションした。プレートを、プレートウォッシャーを使用して洗浄し、ＴＭＢ溶液（ライフテクノロジーズ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）、カールスバド、カリフォルニア州）１００μlを、プレートのそれぞれのウェルに添加した。プレートを適当な時間発展させたら、停止溶液（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、アシュランド、マサチューセッツ州）１００μＬを、それぞれのウェルに加えた。プレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス、サニーベール、カリフォルニア州）においてＯＤ４５０ｎｍで読み取り、標準について得たＯＤ４５０ｎｍ曲線に対して希釈血清試料のＯＤ４５０ｎｍを比較することにより、血清中のビオチン結合インスリンとＦｃの濃度を得た。次に、さらに以下に記載する通り、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を介して、データを解析した。
場合により、ＭｅｒｃｏｄｉａマウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、ウプサラ、スウェーデン）を使用して、製造元のプロトコールに従い、およびマウスインスリン均等単位の血清試料中のインスリンとＦｃタンパク質の濃度の値を報告するための製造元の標準曲線を使用して、インスリンとＦｃの融合タンパク質のプロインスリン部分の検出を通じて、薬物動態データも取得した。それぞれの試料の濃度を決定し、それらの希釈倍数により戻して増加させ、エクセル（マイクロソフト、シアトル、ワシントン州）およびＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）ソフトウエアを介して解析して、Ｃｍａｘ、ｔｍａｘ、ＡＵＣ、および終結相除去率（半減期）を計算した。
図４Ａは、典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）を腹腔内投与した後の日数である時間の関数として、ｎｇ／ｍＬの血清濃度を説明する。図４Ａに示す通り、試験したインスリンとＦｃの融合タンパク質の血清半減期は、約１日であった。
空腹時血液グルコース（％ＦＢＧＬ）測定の結果は、試験したビオチン結合インスリンとＦｃの融合タンパク質のグルコース低下活性を観察しなかったことを示す。図４Ｂを参照。
実施例９：ヒト血清試料におけるインスリン自己抗体（ＩＡＡ）に対する結合親和性の決定
以下の通り、循環ヒト血清インスリン自己抗体（ＩＡＡ）へのインスリンとＦｃの融合タンパク質の結合親和性を決定した。抗体は、哺乳類におけるＢ細胞受容体の分泌形態であるので、ＩＡＡの起源であるインスリン＋Ｂ細胞に対するインスリンとＦｃの融合タンパク質の親和性の代理として、決定値を使用した。前糖尿病のＩＡＡ陽性対象（Ｂａｒｂａｒａ Ｄａｖｉｓ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ Ｄｉａｂｅｔｅｓ）からのヒト血清試料を、放射標識したインスリン、および連続希釈濃度の非標識組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）またはインスリンとＦｃの融合タンパク質（例えば、配列番号３）のいずれかとインビトロで混合して、ＩＡＡへの１２５Ｉ放射標識ＲＨＩ結合の阻害を測定した。混合物を１時間、ＲＴでインキュベーションした後、混合物を、抗ヒトＩｇＧビーズ（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ、ＧＥヘルスケア、リトル・チャルフォント、英国）の懸濁液に加えた。ビーズを洗浄し、得られたビーズを、シンチレーションカウンター（ガンマ放射線カウンター）を使用して解析した。ヒト血清ＩＡＡへのＲＨＩ対照またはインスリンとＦｃの融合タンパク質の強力な結合は、１２５Ｉ標識インスリンへのＩＡＡ結合を阻害し、これにより、より少ないガンマ放射線カウントをもたらした。ＲＨＩ対照またはインスリンとＦｃの融合タンパク質の結合が弱いほど、多いガンマカウントをもたらした。データを使用して、結合曲線を構築し、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を使用して解析して、ＩＡＡへの放射標識インスリン結合の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）を決定した。図５に示す通り、配列番号３のインスリンとＦｃの融合タンパク質（ＩＣ５０＝１０ｎＭ）は、プールした前糖尿病ヒトＩＡＡ試料についてＲＨＩ（ＩＣ５０＝３ｎＭ）と比較して同様の親和性を有し、これは、配列番号３のインスリンとＦｃの融合タンパク質が、対象において抗インスリンＢ細胞クローンを標的にするのに有用であることを示している。
これらの結果は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を処置または予防する方法において有用であることを示す。
実施例１０：抗インスリンＢ細胞のインビトロでの低減－１２５Ｔｇ ＮＯＤマウス
本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質のインスリン＋Ｂ細胞を特異的に除去する能力を評価するために、１２５Ｔｇ ＮＯＤマウス脾細胞および初代ラット肺胞マクロファージ（ＡＭ、肺洗浄液）またはＡｋｓｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ビビバリー、マサチューセッツ州）で繁殖した動物由来のマウスマクロファージ（骨髄由来のＭＭ）を使用するインビトロアッセイを開発した。脾臓を回収し、赤血球を溶解し、脾細胞をフィコールプレップにより精製して、Ｔ細胞とＢ細胞の精製混合物を得た。１２５Ｔｇ ＮＯＤモデルの利点は、脾細胞のおよそ５０～８０％が、実験的な試験を促進するインスリン＋Ｂ細胞であることである。次に、変動する濃度の典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質および対照に沿って、精製した脾細胞混合物を、ラットＡＭまたはＭＭと共に、３日間に渡り共培養した（１つの９６マイクロタイターウェル当たり５×１０４個のＡＭまたはＭＭと共に約５×１０５個の脾細胞）。インキュベーション後、細胞を繰り返し洗浄し、一晩、新鮮培地中でインキュベーションし、典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質の完全な除去を確認した。次に、細胞を回収し、抗Ｂ２２０－ＰＥｍＡｂ１μｇ、抗ＩｇＭ－ＰＥＣｙ７ｍＡｂ０．７μｇ、およびＲＨＩ－マイクロビーズ（ＲＨＩを使用して作成した（シグマアルドリッチコーポレーション、セントルイス、ミズーリ州））５μＬ、およびＮＨＳ活性化マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）のカクテルで標識した。次に、ビーズを、抗マイクロビーズＡＰＣｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）でさらに標識する。洗浄後、細胞を固定し、ＦＡＣＳにより解析した。
ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウエア（ＢＤバイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア州）を使用して、４色２レーザーＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメトリーにおいて、ＦＡＣＳ解析を行った。生きたリンパ球に、ＦＳＣ対ＳＳＣ散乱でゲートをかけ、４分割スタティックスを使用して、ＦＬ２対ＦＬ４ドットプロットにおいて解析し、Ｂ２２０＋Ｂ細胞およびＢ２２０＋インスリン＋Ｂ細胞（インスリン特異的Ｂ細胞）を確認した。Ｂ２２０（－）インスリン（－）集団レベルおよび阻害対照試料（細胞の標識に先立ち非標識ＲＨＩを加えることにより阻害した）に基づき、インスリン＋およびインスリン（－）集団の４分割のゲートを設定した。ＦＬ２対ＦＬ３ドットプロットにおける抗ＩｇＭ－ＰＥＣｙ７の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を使用して、Ｂ細胞上のＢ細胞受容体密度も推定した。
ＦＡＣＳ解析の結果を、図６Ａ～６Ｂに示す。Ｂ２２０は、複数の細胞タイプの混合物中のトータルのＢ細胞の定量を可能にするＢ細胞表面マーカーである。Ｂ２２０＋は、結合し、フローサイトメトリーにおいてＢ２２０＋Ｂ細胞として蛍光を発する抗Ｂ２２０とフルオロフォアの結合体で標識されている細胞の分画を指す。Ｉｎｓ＋は、フローサイトメトリーにおいて定量される全てのタイプの標識インスリン（またはインスリン結合ビーズ）に結合する細胞の分画を指す。Ｉｎｓ＋およびＢ２２０＋分画を評価することにより、両方のＢ細胞であり、インスリンに結合する能力がある細胞のパーセンテージを確認することが可能である。
配列番号３での標的細胞除去は、Ｂ２２０＋インスリン＋Ｂ細胞に高度に特異的であり、対照と区別できないＢ２２０＋インスリン（－）Ｂ細胞（下側右の４分割、図６Ａおよび６Ｂ）とＢ２２０（－）インスリン（－）細胞集団（下側左の４分割、図６Ａおよび６Ｂ）の両方はそのままであった。インスリン＋Ｂ細胞の配列番号３介在性排除の全体的な用量応答曲線を、図６Ｃに描く。これらのデータは、典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）が、８０ｎＭの濃度での共培養液由来のＢ２２０＋インスリン＋Ｂ細胞において＞９５％の低減を引き起こしたこと、および効果が、約７０ｐＭのＥＣ５０で用量依存性であったことを示す。
これらの結果は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己免疫疾患(例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を処置または予防する方法において有用であることを示す。
実施例１１：抗インスリンＢ細胞のインビボでの低減－ＶＨ１２５ ＮＯＤマウス
オスおよびメスＶＨ１２５ ＮＯＤマウス（１群当たりＮ＝３～６匹のマウス）における２週間の０．４ｍｇ／ｋｇでの１週間に２回の腹腔内注射を介して、典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質、配列番号３、またはビークル対照製剤を使用した実験を行った。投与の２週間後、血液採取中（顎下静脈）イソフルランを使用してマウスを麻酔し、続いて、二酸化炭素窒息し、リンパ節、骨髄、および／または脾臓の回収を無菌条件下で行った。実施例１２～１３に記載する通り、血液および脾臓試料を処理し、解析した。これらの実験の結果を図７Ａ～７Ｈに示し、これは、典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）の、インスリン（－）Ｂ細胞集団を保存しながら、ＶＨ１２５ ＮＯＤマウスにおいて血液および脾臓中のインスリン＋Ｂ細胞を除去する能力を示している。
これらの結果は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を処置または予防する方法において有用であることを示す。
実施例１２：抗インスリンＢ細胞のインビボでの低減－全血液解析（ＶＨ１２５ ＮＯＤマウス）
本明細書に記載される典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質での処置後のＶＨ１２５ ＮＯＤマウスから収集した末梢血中のインスリン特異的Ｂ細胞を解析する手法を開発した。顎下（ＳＭＤ）静脈穿刺により処置したマウスからの血液およそ２００～４００μlを、２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＨＢＳＳ／ゲンタマイシン２ｍＬを含む５ｍＬの微量遠心管に採取し、反転させることにより直ちに混合して、凝血を防いだ。次に、試験管を５００×ｇで７分間遠心分離し、ＨＢＳＳ／ヘパリン緩衝液５ｍＬで、５００×ｇで７分間、２回洗浄した。血液ペレットを、ヘパリンを含む完全ＩＭＤＭ培地（１０％ＦＢＳ、５ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび２－ＭＥ）に再懸濁し、１０ウェルプレートにおいて一晩、３７℃でインキュベーションし、それらに、内在性マウスインスリンまたはインビボでの実験から存在する残りのインスリンとＦｃの融合タンパク質がないように、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）のターンオーバーをさせた。次に、血液細胞を、５ｍＬの試験管に回収し、５００×ｇで７分間、遠心分離し、細胞ペレットを、ＲＢＣ－溶解バッファー５ｍＬに再懸濁し、５分間、室温で維持した。ＲＢＣの溶解後、白血球を、ＨＢＳＳ／２％ＦＢＳで、５００×ｇにて７分間、２回洗浄し、最後に、マウスＦｃＲブロック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）１０μL、ｍＡｂラット抗マウスＢ２２０－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）、サンディエゴ、カリフォルニア州）１μｇ、ラット抗マウスＩｇＭ－ＰＥ／Ｃｙ７ｍＡｂ０．７μｇおよびＲＨＩ結合マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）１００当量（１２．５μL）を含有する冷ＦＡＣＳ染色培地１００μLに懸濁し、３０分間、４℃で維持した。氷冷ＦＡＣＳ洗浄バッファー２ｍＬを加える、５００×ｇで７分間遠心分離することにより、血液細胞を洗浄した。最後に、細胞を、ＦＡＣＳ染色バッファー１００μｌ中の抗マイクロビーズ－ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）６μＬで、２０分間、４℃で標識し、ＦＡＣＳ洗浄バッファー２ｍＬで１回洗浄し、ＦＡＣＳ解析のため、２％パラホルムアルデヒドバッファー１５０μｌに再懸濁した。ＶＨ１２５遺伝子導入マウスについては、血中のインスリン特異的Ｂ細胞の低い頻度のため、ＦＡＣＳ解析前に濃縮手法を行った。濃縮手法のため、血液およそ５００～６００μＬを必要とし、これは、所定の処置群についてＮ＝３以上の個々のマウス血液試料のプールを必要であった。血液標識手法を、実施例１２に記載したインスリン特異的Ｂ細胞濃縮プロトコールと組合せた。ＦＡＣＳ解析前に、ＶＨ１２５ ＮＯＤ脾臓細胞について上で記載した通り、固定および洗浄工程後の標識血液細胞を、ＭＳカラムを使用して濃縮することができる。
図７Ａは、ビークルで処理した対照のパーセントとして血液中のインスリン＋Ｂ細胞を示すグラフであり；図７Ｂは、対照のパーセントとして血液中のインスリン（－）Ｂ細胞を示すグラフである。図７Ａおよび図７Ｂから、典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）が、Ｉｎｓ＋Ｂ細胞を有意に低減し、一方、Ｉｎｓ（－）Ｂ細胞を有意に低減しない（＊は、結果が統計上有意、ｐ値＜０．０５（スチューデントt検定）であることを意味し、ｎ．ｓ．は、結果が統計上有意でない、ｐ値＞０．０５（スチューデントt検定）ことを意味する）ことを見ることができる。
これらの結果は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己免疫疾患(例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を処置または予防する方法において有用であることを示す。
実施例１３：抗インスリンＢ細胞のインビボでの低減－脾臓解析（ＶＨ１２５ ＮＯＤマウス）
ＦＡＣＳ解析のための、マウス脾細胞由来のインスリン特異的Ｂ細胞の濃縮。この手法を、ＶＨＩ１２５ ＮＯＤマウスから新たに単離した脾細胞中のインスリン特異的Ｂ細胞を解析するのに適用することができる。ＶＨ１２５ ＮＯＤマウスにおけるインスリン特異的Ｂ細胞の頻度は、全てのＢ細胞の２～５％であるので、磁性活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）カラム濃縮手法を使用して、トータルの脾細胞からインスリン特異的Ｂ細胞を濃縮し、インビボでのインスリン特異的Ｂ細胞の低減の程度を正しく定量した。それぞれの濃縮手法のため、およそ１０×１０６個の脾臓細胞を標識した。新たに単離したＶＨＩ１２５ ＮＯＤ脾臓細胞を濃縮したとき、細胞を、完全培養培地（１０％ＦＢＳ、５ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび２－メルカプトエタノールを含むＩＭＤＭまたはＤＭＥＭ培地）と共に、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、一晩インキュベーターし、それらが、内在性マウスインスリンまたはインビボでの実験から存在した残りのインスリンとＦｃの融合タンパク質を含まないように、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）のターンオーバーをさせた。細胞を、１５ｍＬの試験管に回収し、細胞をフィコール２．５ｍｌと共に下に敷き、８００×ｇで１５分間遠心分離することにより、フィコール精製した。
ＨＢＳＳ／２％ＦＢＳバッファーを用いて５００×ｇにて１０分間、２回洗浄後、細胞を、ＦＡＣＳ染色バッファー（ＨＢＳＳ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１％Ｎａ－アジド＋４％ウマ血清）２５０μｌに再懸濁し、ブロッキングのため、４℃で２０～３０分間維持した。細胞をカウントし、２５０μＬ体積中１０７個の細胞に調節した。ｍＡｂラット抗マウスＢ２２０－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）３．５μｇ、ラット抗マウスＩｇＭ－ＰＥ／Ｃｙ７ｍＡｂ２．５μｇ、ＢＶ５１０－抗マウスＣＤ２３ １．６μｇ、ＢＶ４２１－抗マウスＣＤ２１ ０．７μｇ、ＰＥ－抗マウスＣＤ４３ １．６μｇおよび均等な（２５μＬ）ＲＨＩ－結合マイクロビーズ（上記）２００ｎｇで、３０分間、４℃で細胞を標識した。氷冷ＦＡＣＳ洗浄バッファー５ｍＬを加え、５００×ｇで７分間遠心分離することにより、細胞を洗浄した。次に、細胞を、抗マイクロビーズ－ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）１０μｌを含有するＦＡＣＳ染色バッファー１００μＬに、２０分間、４℃で再懸濁し、氷冷ＦＡＣＳ洗浄バッファー２～４ｍＬを用いて５００×ｇで７分間、１回洗浄した。次に、細胞を、２１％の新たに調製した超高純度のパラホルムアルデヒド２００ｍＬを用いてＲＴで５分間、固定した。固定後、細胞を、ＦＡＣＳ洗浄バッファーで２回洗浄し、最後に、ＭＡＣＳバッファー（ＨＢＳＳ／０．５％ウマ血清／０．１％アジド／２ｍＭ ＥＤＴＡ）６００μＬに再懸濁した。ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を、磁気分離機に置き、ＭＡＣＳバッファー５００μＬで１回洗浄し、次に、細胞懸濁液をカラムに加えて、通した。濃縮していないトータルの細胞を解析するため、標識細胞懸濁液およそ１００μＬを、ＭＳカラムを通すことなく、維持した。次に、ＭＳカラムを、ＭＡＣＳバッファー３×５００μｌで３回洗浄した。次に、カラム中に保持されたマイクロビーズ標識インスリン特異的Ｂ細胞を、磁石からカラムを取り除き、ＭＡＣＳバッファー１ｍＬを加え、ＭＳカラムを備えたプランジャーを使用して、それらを１．８ｍＬの微量遠心チューブに差し込むことにより、溶出した。次に、濃縮した細胞を、５００×ｇで７分間遠心分離し、ＦＡＣＳ解析のため、ＭＡＣＳバッファー２５０μＬに再懸濁した。
図７Ｃは、全ての脾臓区画におけるインスリン＋Ｂ細胞を描くグラフである。図７Ｃによると、典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）は、全ての脾臓区画において、インスリン＋Ｂ細胞を有意に低減した（＊＊は、ｐ値≦０．０１（統計上有意）を意味する）。
図７Ｄは、辺縁帯脾臓区画（ＣＤ２１高ＣＤ２３高）におけるインスリン＋Ｂ細胞を示す。図７Ｄに示す通り、典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）は、辺縁帯脾臓区画においてインスリン＋Ｂ細胞を有意に低減した（＊は、ｐ値≦０．０５（統計上有意）を意味する）。
図７Ｅは、濾胞性脾臓区画（ＩｇＭ中ＣＤ２１中）におけるインスリン＋Ｂ細胞を示す。図７Ｅによると、典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）は、全ての濾胞性脾臓区画において、インスリン＋Ｂ細胞を有意に低減した（＊は、ｐ値≦０.０５（統計上有意）を意味する）。
図７Ｆは、Ｔ１脾臓区画（ＣＤ２１低ＣＤ２３低）におけるインスリン＋Ｂ細胞を示す。図７Ｆに示す通り、典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）は、Ｔ１区画においてインスリン＋Ｂ細胞を有意に低減した（＊は、ｐ値≦０．０５（統計上有意）を意味する）。
図７Ｇは、Ｔ２脾臓区画（ＩｇＭ高ＣＤ２１中）におけるインスリン＋Ｂ細胞を示す。図７Ｇによると、典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）は、Ｔ２脾臓区画において、インスリン＋Ｂ細胞を有意に低減した（＊は、ｐ値≦０.０５（統計上有意）を意味する）。
図７Ｈは、辺縁帯脾臓区画（ＩｇＭ高ＣＤ２１高）におけるインスリン＋Ｂ細胞を示す。図７Ｇに示す通り、典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）は、前辺縁帯脾臓区画においてインスリン＋Ｂ細胞を有意に低減した（＊は、ｐ値≦０．０５（統計上有意）を意味する）。
これらの結果は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己免疫疾患(例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を処置または予防する方法において有用であることを示す。
実施例１４：抗インスリンＢ細胞のインビボでの低減－骨髄解析（ＶＨ１２５ ＮＯＤマウス）
試料処理および濃縮（骨髄）。この場合では、試験物を、６週齢から３４週齢で週に２回投与することを除き、実施例１１に記載のものと同様のインビボ実験を行った。実施例１１に記載に記載したインビボ実験を行った後、ＶＨＩ１２５ ＮＯＤの脛骨および大腿骨を、周辺筋肉および腱から切断した。無菌のスクレーパーを使用して骨から、筋肉および組織デブリを掻把し、骨を、７０％イソプロパノールで１回、無菌ＰＢＳで２回洗浄した。それぞれの骨の両末端を、無菌のはさみで切断し、２０ｍＬの注射器に充填した無菌のＨＢＳＳ／２％ＦＢＳバッファーおよそ８～１０ｍＬおよび骨の一方の端を通して挿入した２５Ｇ針を挿入することにより、髄を流した。２０μｍの細胞濾過器を通して、骨髄懸濁液を濾過し、次に、５００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を吸引後、ＲＢＣ溶解バッファーを使用して、５分間、室温で、赤血球細胞を溶解し、次に、ＨＢＳＳ／２％ＦＢＳバッファーで２回洗浄した。骨髄細胞懸濁液を、完全培地（ＤＭＥＭ、５％ＢＳＡ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、５×１０－５Ｍベータメルカプトエタノール）に再懸濁し、一晩、３７℃でインキュベーションして、ＢＣＲのターンオーバーをさせた。インキュベーション期間の終わりに、フィコール密度勾配分離を使用して、デブリから骨髄単核細胞を明らかにした。
次に、細胞を、ＦＡＣＳ染色バッファー（ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．１％窒化ナトリウム）およびＦｃブロック（Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）に再懸濁した。ビオチン化インスリンおよび他のＢ細胞マーカーを、氷上の細胞に加えた。３０分後、細胞を洗浄し、２％ＰＦＡを含むＨＢＳＳバッファーに再懸濁した。細胞を再度洗浄し、ストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を含むＦＡＣＳ染色バッファーでの続く染色工程を完了した。次に、場合により陽性濃縮工程（製造元のプロトコールによる）のため、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ（登録商標）６４７マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を使用した。高ＭＦＩインスリン＋Ｂ細胞のゲーティングを用いた試料取得のため、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤバイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア州）を使用した。一色の染色対照を使用して、電位および補正を設定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ、アシュランド、オレゴン州）を使用して、データを解析した。
研究３４週目の骨髄解析を、図８Ａに説明し、これは、配列番号３での処置後のオスとメスのＶＨＩ１２５マウスの両方における抗インスリンＢ細胞の有意な低減を示す。
これらの結果は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己免疫疾患(例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を処置または予防する方法において有用であることを示す。
実施例１５：抗インスリンＢ細胞のインビボでの低減－リンパ節解析（ＶＨ１２５ ＮＯＤマウス）
実施例１４のインビボ実験を行い、所定の動物について、２～４つのリンパ節を１つの試料として一緒にプールし、フィコール精製および溶解バッファー工程を行わなかったことを除き、脾細胞について既に記載した手法と同様の方法で、リンパ節および得られたリンパ節懸濁液を処理し、回収した。得られたリンパ節細胞懸濁液を、上記の骨髄細胞懸濁液について記載したものと同様の方法で標識した。研究３４週目のリンパ節解析を、図８Ｂに説明し、これは、配列番号３での処置後のオスとメスのＶＨＩ１２５マウスの両方における抗インスリンＢ細胞の有意な低減を示す。
これらの結果は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己免疫疾患(例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を処置または予防する方法において有用であることを示す。
実施例１６：Ｔ細胞活性化アッセイ－単一濃度
インスリンＢ鎖エピトープ（インスリンＢ鎖上の位置９～２３）について、反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する５ＫＣ－３－４マウスＩＡｇ７Ｔ細胞ハイブリドーマによるＩＬ－２分泌を測定することにより、インスリンとＦｃの融合タンパク質のＴ細胞を活性化する能力を評価した。抗原提示細胞として使用するため、１２５Ｔｇ ＮＯＤ脾臓からインスリン特異的Ｂ細胞を単離した。脾臓を無菌的に単離し、細胞を、４０μｍの無菌の細胞分離機を通してろ過した２％ＦＢＳを含有する無菌バッファーに単離した。ＡＣＫ溶解バッファー（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）を使用して、赤血球細胞を溶解し、続いて、無菌バッファー中の２％ＦＢＳで２回洗浄した。製造元の指示（マウス膵Ｂ細胞単離キットＩＩ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）に従い、非接触Ｂ細胞単離キットを使用して、脾臓細胞混合物からＢ細胞を単離した。次に、活性化または固定を行うことなく、細胞を抗原提示細胞として使用した。５ＫＣ－３－４細胞とＢ細胞を混合し、ＦＢＳ中それぞれ６．６７×１０６／ｍＬおよび１．３３×１０７／ｍＬで再懸濁した。７ｋＤａのＭＷＣＯ Ｚｅｂａスピンカラムを使用して、試験化合物を、０．００２％Ｔｗｅｅｎ－８０、１ｍＭピルビン酸塩、５５μΜベータ－メルカプトエタノール、およびゲンタマイシンを含有するＩＭＤＭにバッファー交換し、次に、０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＲＨＩ（ＭＷ約５．８ｋＤａ）を、インスリンとＦｃの融合タンパク質（ＭＷ約６３．５ｋＤａ）のものと等モル濃度で比較するように、陽性対照として、０．０１８ｍｇ／ｍＬの組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）を同じ培地中で調製した。細胞懸濁液（１×１０５個の５ＫＣ－３－４および２×１０５個のＢ細胞）１５μＬならびに試験化合物１５０μＬを、９６ウェルの組織培養プレートにおいて合わせた。３７℃で一晩のインキュベーション後、培養培地を回収し、３５００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した。次に、製造元のプロトコールに従い、マウスＩＬ－２Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を介して、ＩＬ－２について上清をアッセイした。
図９は、ｐｇ／ｍＬで、Ｔ細胞刺激実験（ＩＬ－２分泌により示す）ＥＬＩＳＡの結果を示す。図９は、同じインスリンとＦｃの融合タンパク質が、５ＫＣ－３－４細胞（配列番号３－Ｔ細胞刺激＝３２ｐｇ／ｍＬ ＩＬ－２）に関して、非常に低いかまたは非刺激性行動を示し、一方、一部のインスリンとＦｃの融合タンパク質が、Ｔ細胞刺激性（配列番号５－Ｔ細胞刺激＝２１，６３５ｐｇ／ｍＬ ＩＬ－２）であることを示す。ＲＨＩ対照はまた、若干刺激性でもあった（ＲＨＩ－Ｔ細胞刺激＝５，５０３ｐｇ／ｍＬ ＩＬ－２）。
これらの結果は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己免疫疾患(例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を処置または予防する方法において有用であることを示す。
実施例１７：Ｔ細胞活性化アッセイの阻害－複数濃度
インスリンＢ９－２３反応性５ＫＣ－３－４Ｔ細胞を１２５ＴｇＢ細胞と混合し、これが、アッセイにおいて抗原提示細胞として振る舞った。この細胞懸濁液に、固定濃度（１０ｎｇ／ｍＬ）のインスリンとＦｃの融合タンパク質、配列番号５を、１３０～１０，０００ｎｇ／ｍＬの様々な連続希釈濃度の試験化合物と予め混合した刺激性対照として加え、アッセイプレートを、一晩３７℃でインキュベーションした。ＩＬ－２分泌を測定し、データから、ＩＣ５０濃度を決定した。
アッセイのより詳細な記載は以下の通りである。抗原提示細胞として使用するため、１２５Ｔｇ ＮＯＤ脾臓からインスリン特異的Ｂ細胞を単離した。脾臓を無菌的に単離し、細胞を、４０μｍの無菌の細胞分離機を通してろ過した２％ＦＢＳを含有する無菌バッファーに単離した。ＡＣＫ溶解バッファー（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）を使用して、赤血球細胞を溶解し、続いて、無菌のバッファー中の２％ＦＢＳで２回洗浄した。製造元の指示（マウス膵Ｂ細胞単離キットＩＩ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）に従い、非接触Ｂ細胞単離キットを使用して、脾臓細胞混合物からＢ細胞を単離した。次に、活性化または固定を行うことなく、細胞を抗原提示細胞として使用した。５ＫＣ－３－４および１２５ＴｇＢ細胞を、４０％ＦＢＳ（血清フリーの培地中）に、それぞれ１ｍＬ当たり２．６７×１０６および３．６×１０６個の細胞で再懸濁した。試験化合物を、１ｍＭピルビン酸塩、１２５μΜ β－メルカプトエタノール、および０．００２％Ｔｗｅｅｎ－８０を含有するＩＭＤＭにおいて２倍（２０，０００ｎｇ／ｍＬ）に希釈し、７つのさらなる１：５連続希釈液を、同じ培地において調製した。試験したインスリンとＦｃの融合タンパク質に加えて、精製したヒトＩｇＧをまた、非刺激性対照として使用した。インスリンとＦｃの融合タンパク質、配列番号５を、同じ培地において４倍（１０ｎｇ／ｍＬ）に希釈した。細胞懸濁液（１×１０５個の５ＫＣ－３－４および１．４×１０５個の１２５ＴｇＢ細胞を含有する）３７．５μＬ、配列番号５（または培地）３７．５μＬおよび試験化合物（または培地）７５μＬを、９６ウェル組織培養プレートにおいて合わせた。一晩３７℃でインキュベーション後、培養培地を回収し、３５００ｒｐｍで、５分間４℃で遠心分離した。次に、製造元のプロトコールに従い、マウスＩＬ－２Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を介して、ＩＬ－２レベルについて、上清をアッセイした。
図１０は、固定量のインスリン特異的Ｔ細胞刺激性化合物（配列番号５）の存在下でのＩＬ－２分泌の競合的阻害の結果を示す。表５は、ＩＣ５０（ｈＩｇＧ）での、典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３）ならびに様々な対照インスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号９および配列番号１０）ならびにｈＩｇＧ陰性対照についての、Ｔ細胞刺激性化合物により誘導されたＩＬ－２分泌の競合的阻害を示す。ＩＣ５０値が低いほど、ＩＬ－２分泌の強力な阻害剤を示す。
Figure 0007170332000008
表５は、配列番号３が、配列番号９および配列番号１０と比較して、Ｔ細胞活性化の有意に大きな阻害を示す。理論により束縛されるものではないが、配列番号９および配列番号１０のＣ鎖は、（ｉ）インビトロで、それらのインスリン＋Ｂ細胞受容体（ｍＡｂ１２５）に結合する能力を低減すること（実施例１８を参照）、および（ｉｉ）Ｂ細胞受容体のそれらの比較的弱い相互作用のため、恐らく、効率的に処理され、１２５Ｔｇ Ｂ細胞により提示されるのができず、これにより、配列番号３で観察したものと比較して、配列番号５と共培養したインスリンペプチド特異的Ｔ細胞の低減した阻害を説明している、と信じられている。
これらの結果は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己免疫疾患{例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を処置または予防する方法において有用であることを示す。
実施例１８：インビトロでのインスリン＋Ｂ細胞除去アッセイ（１２５Ｔｇ ＮＯＤ細胞）
本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質のインスリン＋Ｂ細胞を特異的に除去する能力を評価するために、１２５Ｔｇ ＮＯＤマウス脾細胞および初代ラット肺胞マクロファージ（ＡＭ、肺洗浄液）またはＡｋｓｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ビビバリー、マサチューセッツ州）で繁殖した動物由来のマウスマクロファージ（骨髄由来のＭＭ）を使用する、インビトロアッセイを開発した。脾臓を回収し、赤血球を溶解し、脾細胞をフィコールプレップにより精製して、Ｔ細胞とＢ細胞の精製混合物を得た。１２５Ｔｇ ＮＯＤモデルの利点は、脾細胞のおよそ３０～８０％がインスリン＋Ｂ細胞であり、これが、実験的な試験を促進することである。次に、変動する濃度の典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質および対照に沿って、精製した脾細胞混合物を、ラットＡＭまたはＭＭと共に、３日間に渡り共培養し（９６マイクロタイターウェル当たり５×１０４個のＡＭまたはＭＭと共に、約５×１０５個の脾細胞）。インキュベーション後、細胞を繰り返し洗浄し、一晩、新鮮培地においてインキュベーションし、典型的なインスリンとＦｃの融合タンパク質の完全な除去を確認した。次に、細胞を回収し、抗Ｂ２２０－ＰＥｍＡｂ１μg、抗ＩｇＭ－ＰＥＣｙ７ｍＡｂ０．７μｇ、およびＲＨＩ－マイクロビーズ（標準的なキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を使用してＲＨＩ（シグマアルドリッチコーポレーション、セントルイス、ミズーリ州）およびＮＨＳ活性化マイクロビーズで（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）で作製した）のカクテルで標識し、続いて、抗マイクロビーズ－ＡＰＣｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）で標識した。洗浄後、細胞を固定し、ＦＡＣＳにより解析した。
ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウエア（ＢＤバイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア州）を使用して、４色２レーザーＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメトリーにおいて、ＦＡＣＳ解析を行った。生きたリンパ球に、ＦＳＣ対ＳＳＣ散乱でゲートをかけ、ゲートをかけたリンパ球をＦＬ２対ＦＬ４ドットプロットにおいて解析し、４分割スタティックスを使用して、Ｂ２２０＋Ｂ細胞およびＢ２２０＋インスリン＋Ｂ細胞（インスリン特異的Ｂ細胞）を確認した。Ｂ２２０（－）インスリン（－）集団レベルおよび阻害対照試料（細胞の標識に先立ち非標識ＲＨＩを加えることにより阻害した）に基づき、インスリン＋およびインスリン（－）集団の４分割ゲーティングを設定した。ＦＬ２対ＦＬ３ドットプロットにおける抗ＩｇＭ－ＰＥＣｙ７の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を使用して、Ｂ細胞上のＢ細胞受容体密度も推定した。
表６は、使用した定性スコアリングスキームを記載する。陰性対照として、ＲＨＩを使用した。
Figure 0007170332000009
図１１Ｈは、インスリン特異的１２５ＴｇＢ細胞の除去における様々なインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号２～１０）の有効性を示す。図１１に示す通り、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号２～８）は、配列番号９および配列番号１０（より長いＣペプチド鎖を含有し、すなわち、「ＡＡＡＫ」および「ＡＡＡＡＫ」対「ＡＡＫ」）より、インスリン特異的Ｂ細胞の除去において有意により有効であった。
これらの結果は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己免疫疾患（例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を処置または予防する方法において有用であることを示す。
実施例１９：インスリン特異的Ｂ細胞受容体結合ＥＬＩＳＡ
モノクローナル抗体ｍＡｂ１２５（クローンＡＥ９Ｄ６ ＡＴＣＣ番号ＨＢ－１２５）は、１２５Ｔｇ遺伝子導入マウスの表面ＩｇＭ（Ｂ細胞受容体）の可溶性バージョンであり、それ故、それを、インスリンまたはインスリンとＦｃの融合タンパク質への結合のため使用して、インスリン特異的Ｂ細胞受容体へのそれらの結合特性を測定することができる。ヌードマウスにおける腹水生成を使用して、ｍＡｂ１２５をインビボで作製し、当該技術分野において公知の方法を使用して、タンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーを介して精製した。ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングしたｍＡｂ１２５を使用して、それらのＩＣ５０値（データをプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を使用して得られた曲線をフィッティングすることにより計算した）により定量した、ｍＡｂ１２５（代替Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ））に結合する相対的効率を決定するための競合的阻害ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、固定量のビオチン標識組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）に対して連続希釈のインスリンとＦｃの融合タンパク質を結合させた。９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１２５で、１時間以上、室温（ＲＴ）でコーティングし、次に、洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング溶液（サーモフィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州）２５０μL／ウェルで、一晩、４℃でブロッキングした。０．１％Ｔｗｅｅｎ－８０および１０％ｖ／ｖＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＢＳＴ／ＳＢ１０）を含有するＰＢＳバッファーにおける試験のため、７５μｇ／ｍＬ～３４ｎｇ／ｍＬの範囲にある、インスリンとＦｃの融合タンパク質の８つの連続希釈液を調製した。それぞれの化合物の連続希釈液１２０μＬを、１．２ｍＬのチューブにおいて１．５ｎｇ／ｍＬビオチン－ＲＨＩ（２０×）６μＬと混合し、これらの混合溶液１００μＬを、複数チャンネルのピペッターを使用して、ｍＡｂ１２５コートプレートに直ちに加えた。プレートを、１時間、ＲＴでインキュベーションし、次に、プレートウォッシャー（バイオテック、ウィヌースキ、バーモンド州）を使用して洗浄して、未結合の試薬を取り除いた。１００μl／ウェルの１：２０，０００希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）をウェルに加え、１時間インキュベーションした。プレートを、プレートウォッシャーを使用して再度洗浄し、１００μＬ／ウェルＴＭＢ溶液（ライフテクノロジーズ、カールスバド、カリフォルニア州）をプレートに加えた。５～１５分後に、ＥＬＩＳＡ停止溶液（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、アシュランド、マサチューセッツ州）１００μＬを全てのウェルに加えることにより、色の発生を停止させた。マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｌ９０、モレキュラーデバイス、サニーベール、ＣＡ）上、ＯＤ４５０ｎｍで、プレートを読み取った。ＯＤ値を使用して、ビオチン－ＲＨＩの％阻害を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、ＩＣ５０値を計算した。
図１２は、いくつかのインスリンとＦｃの融合タンパク質（対照としてのＲＨＩに加えて、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、および１０）について、クローニングされたインスリンＢ細胞受容体（ｍＡｂ１２５）の抗体形態へのビオチン標識インスリン結合の阻害を示すグラフである。図１２に示す通り、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号２～８）は、インスリン特異的Ｂ細胞受容体へのビオチン標識インスリンの結合を有意に阻害し、ある場合では、ＲＨＩ（陽性対照）で観察したものと同等である阻害性活性を示した。対照的に、配列番号９および１０は、インスリン特異的Ｂ細胞受容体へのビオチン標識インスリンの結合の阻害においてあまり有効ではなかった。
これらの結果は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己免疫疾患(例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を処置または予防する方法において有用であることを示す。
実施例２０：インスリン受容体結合アッセイ
インスリン受容体結合アッセイは、ヒトＩＭ－９細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－１５９）の表面に存在するインスリン受容体に結合する、本明細書において開示されるインスリンとＦｃの融合タンパク質の能力を評価するよう設計した競合的結合アッセイである。ＦＡＣＳ染色バッファー中で希釈した７つの連続希釈のインスリンとＦｃの融合タンパク質および対照組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）を、固定濃度のビオチン化ＲＨＩと予め混合し、次に、ＩＭ－９細胞に加え、氷上でインキュベーションして、細胞上に存在するインスリン受容体で生じる競合的結合を可能にした。次に、得られた結合したビオチン化ＲＨＩを、ストレプトアビジン－ＰＥ試薬により標識し、標識した受容体の蛍光強度を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーにおいて解析した。ＩＭ－９細胞を、完全ＲＰＭＩ－１０培地（１０％ウシ胎児血清、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ）において、Ｔ７５培養フラスコにおいて対数成長期で成長させ、５０ｍＬの試験管での培養の日に回収し、２５０×ｇで１０分間遠心分離し、冷ＦＡＣＳ染色培地（ＨＢＳＳ／２ｍＭＥＤＴＡ／Ｎａ－アジド／４％ウマ血清）において濃度２×１０６個の細胞／ｍＬまで再懸濁し、氷上で維持した。
ビオチン化ＲＨＩを、冷ＦＡＣＳ染色培地中の１０μｇ／ｍＬで調製し、この溶液５μＬを、氷上に置いたＶ底の９６ウェルプレート中の１ウェル毎に加えた。試験化合物を、試験管において、７つのモル濃度（７８４ｎＭ、２６１ｎＭ、８７ｎＭ、２９ｎＭ、９．７ｎＭ、３．２ｎＭおよび１．１ｎＭ）まで、冷ＦＡＣＳ染色培地において連続希釈（１：３）した。ＲＨＩを、１９２ｎＭから０．２６ｎＭまで連続希釈した。それぞれの試験化合物の連続希釈液５０μlを、ビオチン化ＲＨＩを含有するウェルに加え、含有物を、プレートシェーカーにおいて混合し、次に、氷上に置いた。次に、複数のチャンネルのピペッターを使用して、２×１０６個の細胞／ｍＬのＦＭ－９細胞懸濁液５０μＬを全てのウェルに加え、含有物をプレートシェーカー上で再度混合し、氷上で３０分間インキュベーションした。次に、３０００ｒｐｍで３分間４℃で遠心分離し、上清を吸引することにより、細胞を冷ＭＡＣＳバッファー（ＨＢＳＳ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／Ｎａ－アジド／０．５％ウマ血清）で２回洗浄した。細胞を、５０μｌ／ウェルの、１：１００希釈したストレプトアビジン－ＰＥを含有する冷ＦＡＣＳ培地において再度再懸濁し、次に、氷上で２０分間インキュベーションした。細胞を、冷ＭＡＣＳバッファーで１回、最後の洗浄をし、次に、３％パラホルムアルデヒドで固定した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーにおいて、細胞を解析し、それぞれの試料試験管についてＦＬ－２ＭＦＩを解析した。ＦＭ－９細胞上のインスリン受容体へのビオチン化ＲＨＩの試験化合物によるパーセント（％）阻害を、それぞれの試験化合物の対数濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）において、ＩＣ５０値を計算した。試験化合物のＩＣ５０値が低いほど、インスリン受容体への強力な結合を反映する。
表７は、いくつかのインスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、および１０）ならびにＲＨＩ（対照）についての、ＩＭ－９インスリン受容体へのビオチン標識インスリン結合の阻害（ＩＣ５０ｎＭ）を示す。表７に示す通り、インスリンとＦｃの融合タンパク質、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８は、ＩＭ－９インスリンとホルモン受容体へのビオチン標識インスリンの結合と干渉せず、それ故、ＩＭ－９細胞上に存在するインスリン受容体に非常に弱く結合するか、または全く結合せず、これは、インビボで血糖を下げるそれらの機会を最小にする。これは、正常またはわずかに上昇した血糖レベルを有し得、このアッセイにおいてＩＣ５０値＜３，０００ｎＭでインスリン受容体に結合することができるインスリンとＦｃの融合タンパク質（例えば、配列番号９、配列番号１０、またはこのアッセイにおいてＩＣ５０値＜１，０００ｎＭでのなおより高い結合親和性を有するタンパク質）での治療により誘導される可能性のある低血糖（例えば、低い血糖）のリスクが疑われる、自己免疫疾患を有する患者（例えば、前糖尿病患者、インスリン自己抗体を有する患者、または最近発症した１型糖尿病患者）を処置するのに有利な特性である。
Figure 0007170332000010
これらの結果は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己免疫疾患(例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を処置または予防する方法において有用であることを示す。
実施例２１：配列番号２～４は野生型ＮＯＤマウスにおいて糖尿病を予防する
この結果は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己免疫疾患(例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を予防する方法において有用であることを示す。
以下の通り、３週齢の野生型ＮＯＤメスマウス（１群当たりｎ＝１５）での研究を開始した。ＮＯＤメスマウスに、インスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号３－処置群）を、またはビークル対照（食塩水＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ－８０）を、およびある場合には、マウスＩｇＧ１アイソトープ対照（細胞株番号ＣＣ９Ｃ１０から分泌させ、精製した）を、週２回（２ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射（ｉ．ｐ．））処置した。処置期間は、試験研究結果に示した。携帯用アルファＴＲＡＫ血糖値測定器（アボット、アボットパーク、イリノイ州）を使用して、少なくとも１週間に１回、血液グルコースレベルを測定した。２回の連続する毎週の血液グルコース読取り値＞２４０ｍｇ／ｄＬ後、Ｔ１Ｄと診断した。
糖尿病発生率データを、カプラン・マイヤー生存曲線フォーマットに変換して、統計上の有意性を示すｐ＜０．０５を有するログランク検定を使用して、処置群と対照群（ビークルおよびＩｇＧ１アイソタイプ対照）の間の糖尿病発生率の統計的比較を行った。
図１３は、対照群（５５％換算）と比較した、配列番号３を受けた処置群（２２％換算）において、４９週齢でのＴ１Ｄ発生の統計上有意（ｐ≦０．０５対ＩｇＧ１アイソタイプ対照；ｐ≦０．００１対ビークル対照）な減少を示す。３４週齢で、投与を停止した。続く盲検研究において、これらの結果を確認した。図１４（２６週齢での、配列番号３を受けた処置群（５６％換算）対対照群（９４％換算）の間での糖尿病予防における統計上有意な差（ｐ≦０．０００１）を示している）を参照。
図１５は、２６週齢での、配列番号２を受けた処置群（４０％換算）対対照群（９４％換算）の間での糖尿病予防における統計上有意な差（ｐ≦０．０００１）を示す。図１６は、配列番号４を受けた処置群（２２％換算）対対照群（８５％換算）における６８週齢でのＴ１Ｄ発症における統計上有意（ｐ≦０．０００１）な減少を示す。この研究において、１８週齢で投与を停止した。
これらの結果は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己免疫疾患{例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を予防する方法において有用であることを示す。
実施例２２：配列番号5～８は野生型ＮＯＤマウスにおいて糖尿病を予防する
この結果は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己免疫疾患(例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を予防する方法において有用であることを示す。
３週齢の野生型ＮＯＤメスマウス（１群当たりｎ＝１５）でさらなる研究を行って、他の典型的な配列を評価した。インスリンとＦｃの融合タンパク質（配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９もしくは配列番号１０の１つ）で、または食塩水もしくはビークル対照で週２回（２ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射（ｉ．ｐ．））で、ＮＯＤメスマウスを処置した。処置期間は、２６～６０週齢に行う。携帯用アルファＴＲＡＫ血糖値測定器（アボット、アボットパーク、イリノイ州）を使用して、少なくとも１週間に１回、血液グルコースレベルを測定した。２回の連続する毎週の血液グルコース読取り値＞２４０ｍｇ／ｄＬ後、Ｔ１Ｄと診断した。糖尿病発生率データを、カプラン・マイヤー生存曲線フォーマットに変換して、統計上の有意性を示すｐ＜０．０５でのログランク検定を使用して、処置群と対照群（ビークルまたは食塩水対照）の間の糖尿病発生率の統計的比較を行った。
配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８は、配列番号２（図１５）、配列番号３（図１３および図１４）ならびに配列番号４（図１６）で観察したものと同様のＴ１Ｄ表現型を予防することが予想される。配列番号９および配列番号１０は、Ｔ１Ｄの予防においてあまり有効でないことも予想される。
これらの結果は、本テクノロジーのインスリンとＦｃの融合タンパク質が、自己免疫疾患{例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、１型糖尿病）を予防する方法において有用であることを示す。
均等物
本テクノロジーは、本出願に記載される特定の実施形態に関して制限されるべきではなく、それは、本テクノロジーの個々の態様の１つの説明と意図される。本テクノロジーの多くの修飾およびバリエーションは、当業者に明らかである、その精神および範囲から逸脱することなく、なされ得る。本明細書において挙げられたものに加えて、本テクノロジーの範囲内の機能的に均等な方法および装置は、前述の記載から当業者に明らかである。かかる修飾およびバリエーションは、本テクノロジーの範囲内にあることが意図される。本テクノロジーは、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物学的システムに限定されないこと、そしてそれらは、もちろん変動し得ることは理解されるべきである。明細書において使用される専門用語は、ただ、特定の実施形態の記載の目的であり、限定することは意図されないことも理解されるべきである。
加えて、開示の特徴または態様が、マーカッシュグループに関して記載される場合、当業者は、開示がまた、マーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはサブグループに関してそれにより記載されることを認識する。
当業者により理解される通り、任意および全ての目的のため、特に、書かれた説明を提供する点で、本明細書において開示される全ての範囲はまた、任意および全ての可能性のある部分範囲、ならびにその部分範囲の組合せも包含する。任意の挙げられた範囲は、少なくとも等しい、半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解されている同じ範囲を十分に記載し、可能にすると容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書において考察されたそれぞれの範囲は、より下側の３分の１、中程の３分の１、および上側の３分の１などに容易に分解され得る。当業者によっても理解される通り、「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「未満」などの全ての言語は、挙げられた数を含み、上で考察された通り、部分範囲に続いて分解され得る範囲を指す。最終的に、当業者に理解される通り、範囲は、それぞれ個々のメンバーを含む。従って、例えば、１～３個の細胞を有する群は、１、２、または３個の細胞を有する群を指す。同様に、１～５個の細胞を有する群は、１、２、３、４、または５個の細胞等を有する群を指す。
全ての図および表を含む、本明細書において言及されるか、または引用される全ての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、それらが、本明細書の明確な教示と矛盾する程度まで、それらの全体が参照により取り込まれる。

Claims (18)

  1. Ｆｃドメインに融合されたインスリンポリペプチドを含むインスリンとＦｃの融合タンパク質であって、前記インスリンポリペプチドが、Ｂ鎖ペプチド、Ｃ鎖ペプチド、およびＡ鎖ペプチドを含み、
    前記インスリンとＦｃの融合タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８である、 インスリンとＦｃの融合タンパク質。
  2. 前記インスリンポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記Ｆｃフラグメントに融合される、請求項１に記載のインスリンとＦｃの融合タンパク質。
  3. 配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択されるインスリンとＦｃの融合タンパク質をコードする、組換え核酸配列。
  4. 請求項３に記載の組換え核酸配列、または配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、もしくは配列番号３４の核酸配列を含む、ベクター。
  5. 請求項４のベクターを含む、操作された真核生物の細胞。
  6. 請求項１または２に記載のインスリンとＦｃの融合タンパク質、および使用のための説明書を含む、キット。
  7. それを必要とする対象における自己免疫性糖尿病を処置または予防するための医薬を製造するための、請求項１または２に記載のインスリンとＦｃの融合タンパク質の使用。
  8. 自己免疫性糖尿病が、１型糖尿病、若年性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、または潜在性自己免疫性糖尿病を含む、請求項７に記載の使用。
  9. 前記対象が、自己免疫性糖尿病と診断されたか、またはそのリスクがある、請求項７または８に記載の使用。
  10. 前記対象が高血糖でない、請求項７～９のいずれか１項に記載の使用。
  11. 前記対象が、検出可能なレベルの、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）、抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）抗体、および抗膵島抗原２（ＩＡ－２）抗体からなる群から選択される少なくとも１つの自己免疫抗体を有する、請求項７～１０のいずれか１項に記載の使用。
  12. 前記対象が、検出可能なレベルのインスリン特異的Ｂ細胞集団を有する、請求項７～１１のいずれか１項に記載の使用。
  13. 前記対象が、（ａ）ＤＲＢ１＊０３０１－ＤＱＡ１＊０５０１－ＤＱＢ１＊０２０１；（ｂ）ＤＲＢ１＊０４０５－ＤＱＡ１＊０３０１－ＤＱＢ１＊０３０２；（ｃ）ＤＲＢ１＊０４０１－ＤＱＡ１＊０３０１－ＤＱＢ＊０３０２；（ｄ）ＤＲＢ１＊０４０２－ＤＱＡ１＊０３０１－ＤＱＢ１＊０３０２；（ｅ）ＤＲＢ１＊０４０４－ＤＱＡ１＊０３０１－ＤＱＢ１＊０３０２；および（ｆ）ＤＲＢ１＊０８０１－ＤＱＢ１＊０４０１－ＤＱＢ１＊０４０２からなる群から選択される、１種または複数のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ハプロタイプを持つ、請求項７～１２のいずれか１項に記載の使用。
  14. それを必要とする対象における自己免疫性糖尿病を処置または予防するための医薬であって、有効量の請求項１または２に記載のインスリンとＦｃの融合タンパク質を含む、医薬。
  15. 前記インスリンとＦｃの融合タンパク質が、非経口、静脈内または皮下投与される、請求項１４に記載の医薬。
  16. 前記対象が、少なくとも１回の投与に先立ち前記対象において観察されたものと比較して、前記インスリンとＦｃの融合タンパク質の少なくとも１回の投与後に抗インスリンＢ細胞数における低減を示す、請求項１４または１５に記載の医薬。
  17. 前記対象が、少なくとも１回の投与に先立ち前記対象において観察されたものと比較して、前記インスリンとＦｃの融合タンパク質の少なくとも１回の投与後に減少したレベルのインスリン自己抗体を示す、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の医薬。
  18. 前記インスリンとＦｃの融合タンパク質の少なくとも１回の投与後の前記対象の血液グルコースレベルが、少なくとも１回の投与に先立ち前記対象において観察されたものと同等である、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の医薬。
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