CN110612112B

CN110612112B - 胰岛素-fc融合物及使用方法

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Publication number: CN110612112B
Application number: CN201780085106.8A
Authority: CN
Inventors: T·M·兰卡斯特; T·C·载恩; T·萨蒂亚斯兰; S·姆里基普迪
Original assignee: Acastone Biosciences
Current assignee: Acastone Biosciences
Priority date: 2016-12-09
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2024-03-29
Anticipated expiration: 2037-12-08
Also published as: JP2023017806A; LT3551209T; EP3551209A4; CA3046337A1; AU2020227002B2; JP7170332B2; JP2020503889A; EP3551209B1; CN110612112A; AU2020227002A1; DK3551209T3; AU2017371217B2; CA3046337C; SI3551209T1; US10597435B2; US20190315828A1; WO2018107117A1; US20200131243A1; HRP20211334T1; EP3939605A1

Abstract

本公开内容一般涉及胰岛素‑Fc(例如胰岛素原‑Fc)融合蛋白的组合物及其用于治疗自身免疫疾病(例如自身免疫性糖尿病，如1型糖尿病)的用途。

Description

胰岛素-FC融合物及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年12月9日提交的美国申请No.62/432,268、2017年6月2日提交的美国申请No.62/514,427、2017年6月2日提交的美国申请No.62/514,449和2017年6月2日提交的美国申请号62/514,460的权益和优先权，其内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本技术涉及胰岛素-Fc(例如胰岛素原-Fc)融合蛋白的组合物及其用于治疗自身免疫疾病(例如自身免疫性糖尿病，如1型糖尿病)的用途。

背景技术

提供以下对本技术背景的描述仅仅是为了帮助理解本技术，并且不承认描述或构成本技术的现有技术。

自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病(T1D)，是一种糖尿病的形式，其中免疫系统攻击并破坏产生胰腺β细胞的胰岛素。由此导致的胰岛素缺乏导致患者血液和尿液中葡萄糖水平升高，这导致许多严重的长期并发症，包括心脏病、肾病、中风、神经病、皮肤溃疡和失明(Diabetes Care(2013)36,1033-1044)。在18岁以上的成年人中，糖尿病的全球患病率估计约为9％，并且到2030年，预计将增加到全球成年人口的10％(Diabetes Voice,GlobalPerspective on Diabetes,2011)。在美国，每年有超过15,000名儿童和15,000名成人被诊断患有I型糖尿病。据估计，T1D占美国诊断糖尿病经济负担的近9％，包括美国的1型和2型(Dall,T.M.et al,Popul Health Manag(2009)12,103-110)，或每年大约200亿美元的直接医疗和间接费用(Diabetes Care 36(2013),1033-1044)。

目前的治疗无法使血糖水平正常化，导致许多糖尿病并发症。因此，需要针对该疾病的更具成本效益且更少负担的治疗选择。

发明概述

在一个方面，本公开提供胰岛素-Fc融合蛋白，包含与Fc结构域融合的胰岛素多肽，其中所述胰岛素多肽包含B-链肽、C-链肽和A-链肽，并且其中C-链肽的氨基酸序列是AAK。在一些实施方案中，所述胰岛素-Fc融合蛋白在竞争性结合试验中以IC₅₀>5,000nM结合人胰岛素受体。另外或者可选择地，在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白以IC₅₀≤100nM抑制胰岛素⁺B细胞受体与胰岛素的体外结合。另外或者可选择地，在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白激活T细胞以分泌IL-2水平，与在重组人胰岛素激活的T细胞中观察到的情况相比，该IL-2水平降低。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白激活T细胞以分泌小于3,000pg/ml的IL-2水平。

在某些实施方案中，胰岛素多肽是胰岛素原多肽或前胰岛素原多肽。在胰岛素-Fc融合蛋白的一些实施方案中，所述A-链肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:19。胰岛素多肽可通过肽接头与所述Fc片段融合。肽接头的例子包括SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。可选择地，胰岛素-Fc融合蛋白的胰岛素多肽与Fc结构域之间可不存在肽接头。(例如，胰岛素多肽的C-末端区域共价连接(例如通过肽键)到Fc结构域的N-末端区域或胰岛素多肽的N-末端区域共价连接(例如通过肽键)至Fc结构域的C末端区域，例如SEQ ID NO:7)。另外或者可选择地，在胰岛素-Fc融合蛋白的一些实施方案中，Fc结构域包含人IgG₁的野生型Fc片段。在某些实施方案中，所述Fc结构域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:22。

另外或者可选择地，在任何上述胰岛素-Fc融合蛋白的实施方案中，从N-到C-末端的胰岛素多肽的取向是：(N-末端)-B-链肽-C-链肽-A-链肽-(C-末端)。胰岛素多肽可位于Fc结构域的N-末端或C-末端。

另外或者可选择地，在任何上述胰岛素-Fc融合蛋白的实施方案中，B-链肽包含氨基酸序列FVNQHLCGSHLVX₁ALX₂LVCGEX₃GFFYTPK(SEQ ID NO:28)，其中X₁是E或Q，X₂是Y或A，并且X₃是R或E。在某些实施方案中，X₂是A。

在一个方面，本公开提供胰岛素-Fc融合蛋白，包含与Fc结构域融合的胰岛素多肽，其中所述胰岛素多肽包含B-链肽、C-链肽和A-链肽，其中B-链肽包含氨基酸序列FVNQHLCGSHLVX₁ALX₂LVCGEX₃GFFYTPK(SEQ ID NO:28)，其中X₁是E或Q，X₂是Y或A，并且X₃是R或E；和其中C-链肽的氨基酸序列是AAK。在一些实施方案中，X₂是A。

在胰岛素-Fc融合蛋白的某些实施方案中，胰岛素多肽是胰岛素原多肽或前胰岛素原多肽。在胰岛素-Fc融合蛋白的一些实施方案中，所述A-链肽的氨基酸序列包含SEQ IDNO:19。胰岛素多肽可通过肽接头与所述Fc片段融合。肽接头的例子包括SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。可选择地，胰岛素-Fc融合蛋白的胰岛素多肽与Fc结构域之间可不存在肽接头。另外或者可选择地，在胰岛素-Fc融合蛋白的一些实施方案中，Fc结构域包含人IgG₁的野生型Fc片段。在某些实施方案中，所述Fc结构域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:22。

另外或者可选择地，在一些实施方案中，所述胰岛素-Fc融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQID NO:8。

在另一方面，本公开提供重组核酸序列(例如mRNA、cDNA、DNA)，编码选自由以下组成的组的胰岛素-Fc融合蛋白：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，或者SEQ ID NO:1、SEQID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35和SEQ ID NO:36的核酸序列。

在一个方面，本公开提供载体，包含本文公开的重组核酸序列、以及包含这种载体的工程化的真核细胞，例如，使用编码本文描述的胰岛素-Fc融合蛋白的重组核酸序列(例如mRNA、cDNA、DNA)转染。

在另一方面，本公开提供一种治疗或预防有需要的受试者的自身免疫性糖尿病的方法，包括给受试者施用有效量的本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白。自身免疫性糖尿病可包括1型糖尿病、青少年糖尿病、胰岛素-依赖型糖尿病或潜伏自身免疫性糖尿病。

在本文公开的方法的一些实施方案中，受试者已被诊断患有自身免疫性糖尿病或有自身免疫性糖尿病的风险。在一些实施方案中，受试者已被诊断患有自身免疫性糖尿病，持续时间少于3个月、少于6个月、少于9个月、少于1年或少于1.5年。

另外或者可选择地，在本文公开的方法的一些实施方案中，受试者具有可检测水平的至少一种自身免疫抗体但不具有高血糖症。在一些实施方案中，至少一种自身免疫抗体选自胰岛素自身抗体(IAA)、抗谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体和抗胰岛抗原-2(IA-2)抗体。在其他实施方案中，受试者缺乏可检测水平的胰岛素自身抗体(IAA)、抗谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体和抗胰岛抗原-2(IA-2)抗体。

另外或者可选择地，在本文公开的方法的一些实施方案中，受试者具有可检测水平的致病性B细胞群或致病B细胞群(例如，抗胰岛素B细胞、胰岛素特异性B细胞或胰岛素⁺B细胞)。在其他实施方案中，受试者缺乏可检测水平的致病性B细胞群或引起疾病的B细胞群(例如，抗胰岛素B细胞、胰岛素特异性B细胞或胰岛素⁺B细胞)。

另外或者可选择地，在本文公开的方法的一些实施方案中，受试者携带一种或多种选自下组的人白细胞抗原(HLA)单倍型：

(a)DRB1*0301-DQA1*0501-DQB1*0201；

(b)DRB1*0405-DQA1*0301-DQB1*0302；

(c)DRB1*0401-DQA1*0301-DQB*0302；

(d)DRB1*0402-DQA1*0301-DQB1*0302；

(e)DRB1*0404-DQA1*0301-DQB1*0302；和

(f)DRB1*0801-DQB1*0401-DQB1*0402。

另外或者可选择地，在本文公开的方法的一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白通过肠胃外、静脉内或皮下施用。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白作为可注射的贮库制剂施用。在其他实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白作为推注输注或静脉推注施用。在某些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白通过注射器注射、泵、笔、针或留置导管施用。胰岛素-Fc融合蛋白可以单剂量或多剂量施用。在某些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白每天施用、每日两次、每周两次、或至少每周一次施用受试者。

另外或者可选择地，在本文公开的方法的一些实施方案中，与施用前受试者中观察到的情况相比，胰岛素-Fc融合蛋白的施用导致受试者中(例如，血液或脾脏)抗胰岛素B细胞的数量减少，例如减少至少5％，(例如至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多)。胰岛素-Fc融合蛋白可以施用一次或多次。在某些实施方案中，施用胰岛素-Fc融合蛋白基本上不会减少抗胰岛素B细胞以外的B细胞的数量。在本文公开的方法的一些实施方案中，与施用前在受试者中观察到的情况相比，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，受试者显示抗胰岛素B细胞数量减少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周或超过3周。

另外或者可选择地，在本文公开的方法的一些实施方案中，与施用前受试者中观察到的情况相比，胰岛素-Fc融合蛋白的施用导致受试者中(例如，循环的IAA)胰岛素自身抗体的水平降低(例如，降低至少5％)。在本文公开的方法的一些实施方案中，与施用前在受试者中观察到的情况相比，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，受试者显示胰岛素自身抗体水平下降1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、3周或超过3周。胰岛素-Fc融合蛋白可以施用一次或多次。

另外或者可选择地，在本文公开的方法的一些实施方案中，与施用前在受试者中观察到的情况相比，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，所述受试者的血糖水平相当。在本文公开的方法的一些实施方案中，与施用前在受试者中观察到的情况相比，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，受试者的血糖水平相当1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、或超过3周。胰岛素-Fc融合蛋白可以施用一次或多次。

在任何上述实施方案中，受试者具有内源性C肽水平，例如，在施用胰岛素-Fc融合蛋白之前，即(i)大于或等于0.25nmol/L(例如，大于或等于0.4、0.6、1、1.5或更高)；和/或(ii)相对于参考标准大于或等于约90％、50％、25％或10％，例如，在用本文描述的胰岛素-Fc融合蛋白处理之前。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的葡萄糖降低活性低于参考标准，例如人胰岛素。

本文还公开了包含本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白以及使用说明书的试剂盒。

附图简述

图1A显示了示例性胰岛素-Fc融合蛋白的示意图。每种胰岛素-Fc融合蛋白包含胰岛素原-样胰岛素分子，其含有胰岛素B链和胰岛素A链，其任选地通过接头肽连接在B链-C-末端区域和A链-NH₂末端之间，并且通过连接子连接在A链-C-末端区域和Fc-链氨基末端之间，以及终止于Fc-CH₃-C-末端区域的胰岛素-Fc融合蛋白序列。

图1B显示了胰岛素-Fc融合蛋白的图解，所述胰岛素-Fc融合蛋白不与胰岛素-激素受体相互作用，但能够结合胰岛素-特异性B细胞受体并通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)指导它们的破坏。

图2显示了描绘在HEK细胞和CHO细胞中制备的本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白的滴度浓度的图。显示的滴度是在蛋白A纯化步骤后观察到的滴度。

图3显示了使用尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)计算的本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白的同型二聚体百分比的图。

图4A显示当示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)以2mg/kg剂量腹腔给予BALB/c小鼠时胰岛素-Fc融合蛋白浓度随时间的图。

图4B是描绘当将示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)腹腔给药到BALB/c小鼠中时血清空腹血糖水平(FBGL)随时间变化的图。

图5显示了通过RHI的放射免疫测定(IC₅₀＝3nM)和示例性胰岛素-Fc蛋白(SEQ IDNO:3)(IC₅₀＝10nM)抑制¹²⁵I-标记的重组胰岛素(RHI)与糖尿病前期IAA阳性人受试者血清中胰岛素自身抗体(IAA)结合的图。

图6A显示了来自用载体处理的125Tg脾细胞/大鼠AM共培养物的％胰岛素⁺B细胞的代表性FACS点图的图。

图6B显示了描绘来自用示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)处理的125Tg脾细胞/大鼠AM共培养物的％胰岛素⁺B细胞的代表性FACS点图。

图6C显示示例性胰岛素-Fc蛋白(SEQ ID NO：3)的剂量响应曲线及其在从125Tg脾细胞/大鼠AM共培养物中缺失胰岛素⁺B细胞中的相应活性。

图7A-7H是显示VH125 NOD小鼠中示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)的两周给药方案后的体内细胞减少数据的一系列图。图7A是显示血液中胰岛素⁺B细胞占载体处理对照的百分比的图。图7B是显示血液中胰岛素(-)B细胞占对照的百分比的图。图7C是显示脾脏(所有脾区室)中胰岛素⁺B细胞占对照的百分比的图。图7D显示边缘区脾脏群中的胰岛素⁺B细胞(CD21^HighCD23^High)；图7E显示了滤泡脾群中的胰岛素⁺B细胞(IgM^MidCD21^Mid)；图7F显示T1脾脏群体中的胰岛素⁺B细胞(CD21^LowCD23^Low)；图7G显示T2脾脏群体中的胰岛素⁺B细胞(IgM^HighCD21^Mid)；图7H显示了边缘前区脾脏群体中的胰岛素⁺B细胞(IgM^HighCD21^High)。

图8A-8B是显示体内胰岛素⁺B细胞减少数据的图。图8A显示在VH125 NOD小鼠中示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)的34周给药方案后骨髓室中的体内IgM^HI胰岛素⁺B细胞减少数据；图8B显示在VH125 NOD小鼠中示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)的34周给药方案后淋巴结区室内的体内IgM^HI胰岛素⁺B细胞减少数据。

图9是显示本发明技术的几种胰岛素-Fc融合蛋白的IL-2介导的5KC-3-4T细胞系刺激ELISA数据的图(SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9和10)和重组人胰岛素(RHI)对照。

图10是显示由T细胞刺激化合物诱导的IL-2分泌对示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)和各种对比胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：9和10)和多种浓度的控制。

图11是显示除RHI作为对照之外的几种胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9和10)的胰岛素特异性125Tg B细胞缺失有效性的定性评分的图。

图12是显示除RHI作为对照之外，对于几种胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9和10)，生物素标记的胰岛素与克隆的胰岛素特异性B细胞受体(mAb125)的抗体形式结合的抑制的图。

图13显示用示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)处理的雌性3周龄野生型NOD小鼠(每个处理组中n＝15)中T1D发展的Kaplan-Meier存活曲线。

图14显示用示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)处理的雌性3周龄野生型NOD小鼠(每个处理组中n＝20)中T1D发展的Kaplan-Meier存活曲线。

图15显示用示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：2)处理的雌性3周龄野生型NOD小鼠(每个处理组中n＝20)中T1D发展的Kaplan-Meier存活曲线。

图16显示用示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：4)处理的雌性3周龄野生型NOD小鼠(每个处理组中n＝18)中T1D发展的Kaplan-Meier存活曲线。

发明详述

应当理解，以下以各种详细程度描述本方法的某些方面、模式、实施方案、变化和特征，以便提供对本技术的实质性理解。

在实施本方法时，使用分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。参见，例如Sambrook and Russell eds.(2001)MolecularCloning:A Laboratory Manual,第三版；the series Ausubel et al.eds.(2007)CurrentProtocols in Molecular Biology；the series Methods in Enzymology(AcademicPress,Inc.,N.Y.)；MacPherson et al.(1991)PCR 1:A Practical Approach(IRL Pressat Oxford University Press)；MacPherson et al.(1995)PCR 2:A PracticalApproach；Harlow and Lane eds.(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2005)Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,第五版；Gait ed.(1984)Oligonucleotide Synthesis；U.S.Patent No.4,683,195；Hames and Higginseds.(1984)Nucleic Acid Hybridization；Anderson(1999)Nucleic AcidHybridization；Hames and Higgins eds.(1984)Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press(1986))；Perbal(1984)A Practical Guideto Molecular Cloning；Miller and Calos eds.(1987)Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides ed.(2003)GeneTransfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer and Walker eds.(1987)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press,London)和Herzenberg et al.eds(1996)Weir’s Handbook of Experimental Immunology。

本公开涉及胰岛素-Fc融合蛋白(例如胰岛素原-Fc融合蛋白)的组合物及其用于治疗或预防自身免疫疾病(例如自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的用途。如本文所述，本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白选择性结合自身抗原特异性B细胞(例如，胰岛素特异性B细胞)，从而避免与所有B细胞的非特异性全局消除相关的缺点(例如，免疫妥协)。另外，本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白避免非特异性地删除表达胰岛素激素受体的所有细胞，因为它们缺乏对胰岛素激素受体结合的胰岛素的结合亲和力。不希望受理论束缚，据信在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白结合自身抗原特异性BCR(例如，胰岛素特异性BCR)。

本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白不干扰生物素标记的胰岛素与IM-9胰岛素-激素受体的结合，因此非常弱地或根本不结合IM-9细胞上存在的胰岛素受体，这最大限度地降低了他们降低体内血糖的几率。这是治疗患有自身免疫疾病的患者的有利特性(例如，糖尿病前期患者、胰岛素自身抗体患者或近期发病的1型糖尿病患者)，这些患者可能具有正常或略微升高的血糖水平，并且易于发生由胰岛素-Fc融合蛋白治疗诱导的潜在低血糖(例如低血糖)的风险，所述胰岛素-Fc融合蛋白在本文所述的体外结合测定中能够结合IC₅₀值<3,000nM的胰岛素受体，或能够结合具有IC₅₀值<1,000nM的甚至更高结合亲和力的蛋白质。因此，本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白可用于治疗或预防受试者的自身免疫性1型糖尿病而不降低其体内血糖水平。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与该技术所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非内容另有明确说明。例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等。通常，本文使用的命名法和下文描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域公知和常用的那些。

术语“胰岛素⁺”、“Ins⁺”、“胰岛素特异性”和“抗胰岛素”在本文中可互换使用。

如本文所用，EC₅₀是指胰岛素-Fc融合蛋白的浓度，其中观察到体外胰岛素特异性B细胞缺失的半数最大响应(例如，胰岛素⁺B细胞受体减少一半的浓度)。

如本文所用，IC₅₀是指胰岛素-Fc融合蛋白的浓度，其中给定的生物学功能或生物化学过程(例如，结合)被抑制一半。在一些实施方案中，IC₅₀指胰岛素-Fc融合蛋白的浓度，其中胰岛素与人胰岛素受体的结合减少一半。在一些实施方案中，IC50指胰岛素-Fc融合蛋白的浓度，其中胰岛素与胰岛素特异性B细胞的结合减少一半。在一些实施方案中，IC50是胰岛素-Fc融合蛋白的浓度，其中由参考标准诱导的T细胞活化减少一半。

如本文使用的，除非另有说明或从上下文中显而易见，否则关于数字的术语“约”通常被认为包括在数字的任一方向(大于或小于)上落入1％，5％，10％或20％的范围内的数字(除非该数字小于0％或超过可能值的100％)。

如本文使用的，对受试者“施用”药剂或药物包括将化合物引入或递送给受试者以执行其预期功能的任何途径。给药可以通过任何合适的途径进行，包括但不限于口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、直肠、鞘内、透皮或局部给药。行政管理包括自我管理和另一个人的管理。

如本文所用，术语“类似物”是指化合物或缀合物(例如，化合物，如本文所述的缀合物，例如胰岛素)，其化学结构类似于另一种化合物或缀合物的化学结构，但至少一方面与其不同。

如本文所用，术语“自身抗体”是指靶向和/或与个体自身蛋白质、细胞、组织或器官中的一种或多种反应的抗体。如本文所用的术语“自身抗原”是指由正常组织、细胞、蛋白质、肽或DNA组成的抗原，其是免疫应答的靶标(例如，体液或细胞介导的免疫应答)。在自身免疫疾病的情况下，自身抗原可以被自身抗体靶向或与自身抗体反应。

如本文所用，“自身免疫性糖尿病”是指糖尿病，其特征在于胰腺的产生胰岛素的β细胞的破坏。

如本文所用，术语“细胞表面受体”是指通常在细胞膜的外表面上发现的分子，例如蛋白质，其与可溶性分子相互作用，例如在血液供应中循环的可溶性分子。细胞表面受体也可以以可溶形式分泌到细胞外空间中，或者可以从细胞的外表面脱落。在一些实施方案中，细胞表面受体可包括抗原或抗原受体。在其他实施方案中，B淋巴细胞，也称为B细胞，具有被称为“B细胞受体”或“BCR”的细胞表面受体，或在某些情况下称为“IgM”受体。

如本文使用的，“对照”是用于比较目的的实验中使用的替代样品。对照可以是“正”或“负”。例如，实验的目的是确定治疗剂对特定类型疾病的治疗功效的相关性，通常采用阳性对照(已知具有所需治疗效果的化合物或组合物)和阴性对照(未接受治疗或接受安慰剂的受试者或样本)。

如本文使用的，术语“有效量”是指足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如，导致预防或减少本文所述疾病或病症或与本文所述疾病或病症相关的一种或多种体征或症状的量。在治疗或预防应用的背景下，施用于受试者的组合物的量将取决于疾病的组成、程度、类型和严重程度以及个体的特征(例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。组合物还可以与一种或多种另外的治疗化合物组合施用。在本文所述的方法中，药物组合物可以施用于患有自身免疫疾病(例如自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的一种或多种体征或症状的受试者。如本文使用的，组合物的“治疗有效量”是指组合物水平，其中改善或消除了本文所述疾病或病症的生理作用。治疗有效量可以在一次或多次给药中给予。如本文使用的，组合物的“预防有效量”是指预防或延迟本文所述疾病或病症的至少一种症状发作的组合物水平。预防有效量可以在一次或多次给药中给予。

如本文所用，术语“内源性C-肽”水平是指治疗前受试者中C-肽的水平，例如本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白治疗。

如本文所用，术语“融合蛋白”，例如“胰岛素-Fc融合”蛋白质是指包含一个以上结构域的蛋白质，例如，通常来自不同来源(例如，不同的蛋白质、多肽、细胞等)，所述结构域通过肽键共价连接。在一些实施方案中，重组产生融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白的结构域通过将编码每个结构域的基因序列连接成单个核酸分子而共价连接。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白是蛋白质，例如单个多肽，其包含胰岛素多肽(例如胰岛素原多肽)和Fc片段多肽，其中胰岛素和Fc片段多肽通过肽键连接以形成单一多肽。

如本文所用，术语“胰岛素”包括成熟胰岛素、前胰岛素原和胰岛素原，以及天然存在的胰岛素或其类似物(例如胰岛素原类似物)。在一些实施方案中，胰岛素多肽(例如胰岛素原多肽)可以是全长胰岛素(例如，全长胰岛素原)多肽或其片段。在一些实施方案中，胰岛素多肽(例如，胰岛素原多肽)包含来自天然存在的胰岛素(例如胰岛素原)的一个或多个片段或结构域和/或来自非天然存在的胰岛素(例如，胰岛素原)的一个或多个片段或结构域。

如本文所用的，术语“个体”、“患者”或“受试者”可以是个体生物、脊椎动物、哺乳动物或人。在一些实施方案中，个体、患者或受试者是人。示例性人类受试者包括患有病症的人类患者，例如本文所述的病症或正常受试者。

本文所用的术语“肠胃外给药”和“肠胃外给药”是指除肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指那些在合理的医学判断范围内适合与人和动物组织接触而没有过多毒性的化合物、材料、组合物和/或适用于与人类和动物组织接触的剂型，其没有过多的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

如本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其参与携带或运输从一个器官或身体的一部分到另一个器官或身体的一部分的本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白。在与制剂的其他成分相容并且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。

如本文所用，“预防”病症是指在统计样品中相对于未处理的对照样品，减少处理样品中的病症或病症的发生的化合物，或相对于未处理的对照样品延迟病症或病症的一种或多种症状的发作。如本文所用，预防自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)包括预防或延迟自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的症状的发生。如本文所用，预防自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)还包括预防自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的一种或多种体征或症状的复发。

如本文使用的，术语“样品”是指衍生自受试者的活细胞的生物样品材料。生物样品可包括细胞的组织、细胞、蛋白质或膜提取物、和从受试者分离的生物流体(例如，腹水或脑脊液(CSF))、以及受试者体内存在的组织、细胞和流体(血液、血浆、唾液、尿液、血清等)。

如本文使用的，术语“分开的”治疗用途是指通过不同途径同时或基本上同时施用至少两种活性成分。

如本文所用，在氨基酸或核苷酸序列的上下文中，术语“序列同一性”或“相同的”是指，当查询序列的核苷酸序列或氨基酸序列的特定的、连续的区段对齐并与参考序列的核苷酸序列或氨基酸序列比较时，在特定查询序列和参考序列中发现相同的核苷酸或氨基酸残基。用于序列比对和用于确定序列之间同一性的方法是本领域已知的。参见，例如Ausubel et al.,eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 19(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York)；和ALIGN program(Dayhoff(1978)in Atlas of Polypeptide Sequence and Structure 5:Suppl.3(NationalBiomedical Research Foundation,Washington,D.C.))。关于两个核苷酸序列的最佳比对，查询核苷酸序列的连续区段相对于参考核苷酸序列可具有额外的核苷酸或缺失的核苷酸。同样，为了最佳比对两个氨基酸序列，查询氨基酸序列的连续区段可以具有相对于参考氨基酸序列的额外氨基酸残基或缺失的氨基酸残基。在一些实施方案中，用于与参考核苷酸序列或参考氨基酸序列比较的连续区段将包含至少6、10、15或20个连续核苷酸或氨基酸残基，并且可以是30、40、50、100或更多核苷酸或氨基酸残基。可以通过指定空位罚分来进行与在查询核苷酸序列或氨基酸序列中包含空位相关的增加的序列同一性的校正。序列比对的方法是本领域已知的。

在某些实施方案中，使用数学算法完成两个序列之间的同一性百分比的确定。例如，使用Smith-Waterman同源性搜索算法(其使用仿射6缺口搜索，间隙开放罚分为12，缺口延伸罚分为2，BLOSUM矩阵62)确定氨基酸序列的同一性百分比。Smith-Waterman同源搜索算法描述于Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math 2:482-489，在此引入作为参考。在一些实施方案中，使用Smith-Waterman同源性搜索算法(其使用25的空位开放罚分和5的空位延伸罚分)来确定核苷酸序列的同一性百分比。可以使用TimeLogic的DeCypher硬件加速器来执行序列标识的这种确定。

如本文使用的，术语“顺序”治疗用途是指在不同时间施用至少两种活性成分，施用途径相同或不同。更具体地，顺序使用是指在施用另一种或其他活性成分之前开始全部施用一种活性成分。因此，可以在施用其他活性成分之前数分钟，数小时或数天施用一种活性成分。在这种情况下没有同时治疗。

如本文使用的，术语“同时”治疗用途是指通过相同途径并同时或基本上同时给予至少两种活性成分。

如本文所用，“特异性结合”或“选择性结合”是指在(i)本发明技术的免疫球蛋白分子(例如，抗胰岛素免疫球蛋白)和胰岛素或胰岛素-Fc融合蛋白、(ii)B细胞受体(例如，抗胰岛素免疫球蛋白)和本发明技术的胰岛素或胰岛素-Fc融合蛋白、或(iii)表达B细胞受体(例如，抗胰岛素免疫球蛋白)和本发明技术的胰岛素或胰岛素-Fc融合蛋白的B细胞之间发生的类型的非共价相互作用。结合相互作用的强度或亲和力，例如免疫结合相互作用或特异性结合相互作用，可以用相互作用的解离常数(K_d)表示，其中较小的K_d表示较高的亲和力。可以使用本领域已知的方法定量所选多肽的免疫学或特异性结合特性。一种这样的方法需要测量配体/配体-受体复合物(例如，抗原/抗原受体复合物；胰岛素抗体/胰岛素复合物；或胰岛素抗体/胰岛素-Fc融合蛋白复合物)形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合物的浓度、相互作用的亲和力、以及同样影响两个方向速率的几何参数。因此，“开启速率常数”(k_on)和“关闭速率常数”(k_off)都可以通过计算浓度和实际结合和解离速率来确定。参见，例如，Nature361:186-87(1993)。k_off/k_on的比率使得能够消除与亲和力无关的所有参数，并且等于解离常数K_d。(参见，通常，Davies et al.(1990)Annual Rev Biochem59:439-473)。在一些实施方案中，当平衡结合常数(K_d)小于或等于1μM时(例如通过诸如放射性配体结合测定、ELISA、表面等离振子共振、平衡结合测定或本领域技术人员已知的类似测定的测定法测量)，例如，小于或等于100nM、小于或等于10nM、小于或等于100pM、或小于或等于约1pM，本文所述的融合蛋白特异性结合抗胰岛素抗体免疫球蛋白、BCR(例如，包含抗胰岛素免疫球蛋白的BCR)和/或B细胞，例如自身抗原特异性B细胞(例如胰岛素特异性B细胞)。

本文所用的术语“全身给药”、“外周给药”是指胰岛素-Fc融合蛋白直接施用于中枢神经系统，使其进入患者体系，从而进行代谢和其他类似过程，例如皮下给药。

本文所用的“治疗”包括在受试者例如人中治疗本文所述的疾病或病症，并且包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其发展；(ii)缓解疾病或病症，即引起疾病消退；(iii)减缓疾病的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种症状的进展。在一些实施方案中，治疗意指与疾病相关的症状例如缓解、减轻、治愈或处于缓解状态。

还应理解，本文所述的疾病或病症的各种治疗方式旨在表示“实质性”，其包括总治疗但也少于总治疗，并且其中实现了一些生物学或医学相关的结果。治疗可以是对慢性疾病的持续延长治疗，或者是用于治疗急性病症的单次或几次给药。

I型糖尿病的管理

减少或消除与T1D相关的困难有三种主要方法：1)更好的疾病管理，例如改进的胰岛素、智能泵和连续血糖监测仪；2)疾病逆转，例如胰腺或胰岛移植、β-细胞再生、全身或T细胞特异性免疫调节；3)疾病预防，例如避免环境诱因、抗原特异性疫苗接种、非抗原特异性免疫调节疗法)。随着T1D患者发生自身免疫，其β细胞功能下降，干预的潜在治疗益处也降低(Rewers,M and Gottlieb,P.Diabetes Care(2009),32,1769-1782)。另外，一旦自身免疫过程开始，它可能变得越来越难以改变。由于这些原因以及相对于晚期干预的估计成本效益，T1D最早可能阶段的疾病预防是长期的理想选择。

有效的疾病预防需要深入了解T1D自身免疫过程，以及能够在明显高血糖发作前准确诊断或预测T1D发生风险的工具。在胰岛自身免疫开始后，大多数T1D患者具有较长的临床前期，为治疗停止进展为临床糖尿病提供了机会。胰岛自身免疫发生的一个主要标志是胰岛自身抗原特异性的循环抗体的存在，包括胰岛素、谷氨酸脱羧酶的同种型65(抗GAD₆₅)，蛋白酪氨酸磷酸酶样蛋白(IA2)和锌转运蛋白8(ZnT8)。事实上，在诊断时，超过90％的T1D患者出现至少一种胰岛特异性抗体，并且在前瞻性糖尿病自身免疫研究(DAISY)队列中，89％进展为糖尿病的儿童表达两种或更多胰岛-特异性自身抗体。虽然CD4⁺和CD8⁺T细胞有助于最终攻击β细胞，但近年来出现了B细胞(如抗胰岛素B细胞、胰岛素特异性B细胞或胰岛素⁺B细胞)的致病作用，这能够帮助解释为什么抗体和T细胞对相同的胰岛特异性自身抗原具有特异性，以及胰岛特异性自身抗体的出现与完全T细胞介导的β细胞破坏之间的时间滞后。B细胞可以摄取胰岛抗原，将它们呈递给辅助T细胞，并分化成抗体分泌浆细胞，其增强抗原呈递细胞的抗原摄取，最终导致细胞毒性T细胞的活化以促进β细胞的破坏。

已经提出全长B细胞耗竭，例如通过B细胞抗原抗体如利妥昔单抗，作为自身免疫疾病例如T1D的治疗。参见，例如，Pescovitz et al.,N.England J.Med.361.22(2009):2143-52。然而，由于免疫系统通常需要正常功能(例如病原体清除)的健康/非自身免疫B细胞的非特异性消除，全长B细胞耗竭已显示在受试者中引起免疫妥协。

因此，需要治疗和预防自身免疫疾病如T1D，以避免由健康细胞的破坏引起的不良反应。

Fc结构域

如本文所用的术语“Fc区”、“Fc结构域”或“Fc片段”是指免疫球蛋白重链的C末端区域，其能够结合哺乳动物Fc(γ)或Fc(Rn)受体，例如，人Fc(γ)或Fc(Rn)受体。Fc受体(FcR)是指与抗体的Fc片段或Fc区结合的受体。在某些实施方案中，FcR是天然人FcR序列。在一些实施方案中，FcR结合IgG抗体(γ受体)并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有主要在其细胞质结构域中不同的相似氨基酸序列。FcR在Ravetch and Kinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9:457-92；Capel et al.,1994,Immunomethods,4:25-34；and de Haas et al.,1995,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41中有描述。“FcR”还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer et al.,1976J.Immunol.,117:587；和Kim et al.,1994,J.Immunol.,24:249)，并有助于体内延长体内消除抗体和Fc融合蛋白的半衰期。

Fc片段、区或结构域可以是天然序列Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能不同，但人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226位置的氨基酸残基或Pro230的氨基酸残基延伸至其羧基末端。Fc区中残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号。Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域，CH2和CH3。

在一些实施方案中，Fc片段包含哺乳动物IgG的Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)或由其组成，例如人IgG。在某些实施方案中，Fc片段包含人IgG₁的Fc区(例如，CH2结构域和CH3结构域)或由其组成。在一些实施方案中，Fc片段包含与人IgG₁的Fc区(例如CH2结构域和CH3结构域)具有至少80％(例如至少80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多)同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，人IgG₁的Fc区包含下列氨基酸序列：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:22)。

在某些实施方案中，人IgG₁的Fc区在一个或两个末端包含另外的氨基酸。在一些实施方案中，该另外的氨基酸包含带电侧链(例如带正电荷的氨基酸，例如赖氨酸或精氨酸)。在某些实施方案中，人IgG₁的Fc区包含以下氨基酸序列：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:23)。

胰岛素和胰岛素类似物

胰岛素是由胰腺内的朗格汉斯胰岛中的β细胞产生的肽激素。胰岛素通过调节血液中葡萄糖的吸收而起作用。当暴露于刺激物，例如增加的蛋白质和葡萄糖水平时，胰岛素从β细胞释放并与胰岛素受体结合，启动影响人体新陈代谢的许多方面的信号级联。该过程的破坏与几种疾病，自身免疫性糖尿病(例如，1型糖尿病)、胰岛素瘤、胰岛素抵抗、代谢综合征和多囊卵巢综合征直接相关。胰岛素的氨基酸序列在整个进化过程中是强烈保守的，特别是在脊椎动物中，并且由通过二硫键连接的称为A链和B链的两条多肽链组成。人胰岛素原的序列由氨基酸序列表示：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO:24)。

胰岛素最初合成为称为前列腺素的无活性前体。通过一系列高度协调的酶调节步骤，前胰岛素原转化为成熟胰岛素。在内质网中切割前胰岛素原的信号肽，然后氧化和伴侣辅助折叠产生胰岛素原，其被转运至反式-高尔基体网络。然后对胰岛素原进行进一步的蛋白水解加工步骤，导致释放称为C-肽的片段并形成成熟胰岛素，其作为无活性六聚体存储在β细胞中的锌(Zn²⁺)和钙(Ca²⁺)丰富的分泌囊泡中。在暴露于刺激物后，分泌囊泡与质膜融合，释放胰岛素并促进六聚体解离成活性胰岛素单体。在一些实施方案中，本公开的胰岛素是单体。在一些实施方案中，胰岛素是非共价多聚体(例如，二聚体、四聚体、六聚体或更高级的多聚体，例如二聚体的三聚体)。在一些实施方案中，胰岛素可以是单体或非共价多聚体(例如，二聚体、四聚体、六聚体或更高级的多聚体，例如二聚体的三聚体)。

在一些实施方案中，本文描述的胰岛素是单链胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素是前胰岛素原或胰岛素原，例如成熟胰岛素的激素原前体。所有盐形式和非盐形式的胰岛素和胰岛素类似物(例如胰岛素原和胰岛素原类似物)都包括在本公开的范围内。

在一些实施方案中，本公开的胰岛素包含胰岛素类似物(例如，胰岛素原类似物)。人胰岛素的几种类似物可商购获得用于治疗用途。在一些实施方案中，本技术的胰岛素类似物是单体。在一些实施方案中，胰岛素类似物是非共价多聚体(例如，二聚体、四聚体、六聚体或更高级的多聚体，例如二聚体的三聚体)。

胰岛素类似物可以与人胰岛素的结构密切相关，但含有修饰(例如结构修饰)以增强某些功能方面。在一些实施方案中，胰岛素类似物可以仅通过氨基酸取代而不同于人胰岛素的结构。在一些实施方案中，胰岛素类似物可仅通过氨基酸缺失而不同于人胰岛素的结构。在一些实施方案中，胰岛素类似物可以仅通过氨基酸添加而不同于人胰岛素的结构。在一些实施方案中，胰岛素类似物包含胰岛素的变体或突变体(例如，如SEQIDNO：24所述的胰岛素序列)。在一些实施方案中，胰岛素类似物包含相对于胰岛素的氨基酸取代、缺失或添加(例如，如SEQ ID NO：24所述的胰岛素序列)。在一些实施方案中，胰岛素类似物包含相对于胰岛素的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40或50个氨基酸取代、缺失或添加(例如，如SEQ ID NO：24所述的胰岛素序列)。

在一些实施方案中，胰岛素或胰岛素类似物是包含A链、B链和C链的元件的三链肽。在一些实施方案中，胰岛素或胰岛素类似物包含野生型胰岛素B、A和/或C链肽，例如来自哺乳动物(例如人或小鼠)。

人胰岛素A链和B链的序列分别由SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:25表示：人胰岛素A链：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO:19)；人胰岛素B链：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO:25)。

在一些实施方案中，对胰岛素或胰岛素类似物的序列的修饰(例如，氨基酸取代、缺失或添加或化学修饰)可以是胰岛素的A链、胰岛素的B链或其任何组合。在一些实施方案中，当胰岛素或胰岛素类似物是包含多于一个A链、B链和/或C链的非共价多聚体时，对胰岛素序列的修饰(例如，氨基酸取代、缺失或添加或化学修饰)可以是非共价多聚体中的A链、B链或两者。

本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白

在一个方面，本公开提供胰岛素-Fc融合蛋白，其包含与Fc结构域融合的胰岛素多肽，其中所述胰岛素多肽包含B-链肽、C-链肽和A-链肽，以及其中C-链肽的氨基酸序列是AAK。另外或者可选择地，在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白在竞争性结合试验中结合人胰岛素受体(在IC₅₀>5,000nM)。在一些实施方案中，本文描述的胰岛素-Fc具有低生物活性或基本上代谢失活，例如，它们在给药时基本上不降低受试者的血糖水平。

另外或可选择地，在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白抑制胰岛素⁺B细胞受体与胰岛素的体外结合，IC₅₀<300nM、<200nM、<150nM、<100nM或<75nM。另外或可选择地，在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白激活T细胞以分泌IL-2水平，与在重组人胰岛素激活的T细胞中观察到的相比，IL-2水平降低。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白激活T细胞以分泌小于3,000pg/ml、小于1,000pg/ml、小于500pg/ml、小于300pg/ml或小于100pg/ml的IL-2水平。

在某些实施方案中，胰岛素多肽是胰岛素原多肽或前胰岛素原多肽。在胰岛素-Fc融合蛋白的一些实施方案中，所述A-链肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:19。胰岛素多肽可通过肽接头与所述Fc片段融合。肽接头的示例包括SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。可选择地，胰岛素多肽和胰岛素-Fc融合蛋白的Fc结构域之间不存在肽接头(例如，胰岛素多肽的C末端区域与Fc结构域的N末端区域共价连接(例如通过肽键)，或者胰岛素多肽的N末端区域与Fc结构域的C末端区域共价连接(例如通过肽键))。另外或者可选择地，在胰岛素-Fc融合蛋白的一些实施方案中，结构域包括人IgG₁的野生型Fc片段。在某些实施方案中，所述Fc结构域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:22。

另外或者可选择地，在任何上述胰岛素-Fc融合蛋白的实施方案中，胰岛素多肽从N-末端到C-末端的取向是：(N-末端)-B-链肽-C-链肽-A-链肽-(C-末端)。胰岛素多肽可位于Fc结构域的N-末端或C-末端。

另外或者可选择地，在任何上述胰岛素-Fc融合蛋白的实施方案中，B-链肽包括氨基酸序列FVNQHLCGSHLVX₁ALX₂LVCGEX₃GFFYTPK(SEQ ID NO:28)，其中X₁是E或Q，X₂是Y或A，X₃是R或E。在某些实施方案中，X₂是A。

在一个方面，本公开提供胰岛素-Fc融合蛋白，其包含与Fc结构域融合的胰岛素多肽，其中所述胰岛素多肽包含B-链肽、C-链肽和A-链肽，其中B-链肽包含氨基酸序列FVNQHLCGSHLVX₁ALX₂LVCGEX₃GFFY TPK(SEQ ID NO:28)，其中X₁是E或Q，X₂是Y或A，X₃是R或E；并且其中C-链肽的氨基酸序列是AAK。在一些实施方案中，X₂是A。

在胰岛素-Fc融合蛋白的某些实施方案中，胰岛素多肽是胰岛素原多肽或前胰岛素原多肽。在胰岛素-Fc融合蛋白的一些实施方案中，所述A-链肽的氨基酸序列包含SEQ IDNO:19。胰岛素多肽可通过肽接头与所述Fc片段融合。肽接头的示例包括SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。可选择地，在胰岛素多肽和胰岛素-Fc融合蛋白的Fc结构域之间不存在肽接头。另外或者可选择地，在胰岛素-Fc融合蛋白的一些实施方案中，Fc结构域包含人IgG₁的野生型Fc片段。在某些实施方案中，所述Fc结构域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:22。

图1A显示了本发明技术的示例性胰岛素-Fc融合蛋白的示意图。本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白具有特异性结合以下一种或多种的优点：(i)可溶性抗胰岛素抗体(例如，未与细胞结合的抗胰岛素抗体)；(ii)与B细胞受体(BCR)结合的抗胰岛素免疫球蛋白，例如B细胞(例如抗胰岛素B细胞)；和/或(iii)抗胰岛素B细胞，但不与胰岛素-激素受体相互作用。参见图1B。

在一个方面，本公开提供胰岛素-Fc融合蛋白，其包含与Fc结构域融合的胰岛素多肽。在某些实施方案中，本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白的胰岛素多肽包含从N-末端到C-末端的以下取向的结构域:(N-末端)-B-链肽-C-链肽-A链肽-(C-末端)。另外或者可选地，在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白包含从N-末端到C-末端的以下取向的结构域:(N-末端)-胰岛素多肽-任选的接头-Fc结构域-(C-末端)(例如，(N-末端)-B链肽-C链肽-A-链肽-任选的接头-Fc结构域-(C-末端))。在某些实施方案中，接头(例如，本文所述的肽接头)位于胰岛素多肽和Fc结构域之间。在其他实施方案中，在胰岛素多肽和Fc结构域之间不存在接头(例如，肽接头)。示例性接头(例如，肽接头)在本文的接头部分中更详细地描述。

示例性胰岛素-Fc融合蛋白(例如，胰岛素原-Fc融合蛋白)及其结构域序列示于表A中。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白包括修饰的突变体，例如，导致诸如抗胰岛素B细胞去除和/或抑制胰岛素特异性T细胞活化的性质的修饰的突变体。

本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白包含长度为约3-5个氨基酸的C链肽，并包含选自丙氨酸和赖氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的C链肽不包含除丙氨酸和赖氨酸之外的氨基酸。在某些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的C链肽包含AAK的氨基酸序列或由AAK的氨基酸序列组成。见表A。

另外或可选择地，在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的A链肽包含或由下列氨基酸序列组成：野生型人胰岛素原的A链肽的氨基酸序列或与野生型人胰岛素原的A链肽的氨基酸序列具有至少80％(至少80％、85％、90％、95％、97％、99％或更高)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的A链肽包含或由下列氨基酸序列组成：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO：19)，或与SEQ ID NO：19具有至少80％(至少80％、85％、90％、95％、97％、99％或更高)同一性的氨基酸序列。

另外或可选择地，在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的B链肽包含或由下列氨基酸序列组成：野生型人胰岛素原的B链肽的氨基酸序列或与野生型人胰岛素原的B链肽的氨基酸序列具有至少80％(至少80％、85％、90％、95％、97％、99％或更高)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的B链肽包含或由下列氨基酸序列组成：表A中列出的B链肽的氨基酸序列或与表A中列出的B链肽具有至少80％(至少80％、85％、90％、95％、97％、99％或更高)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的B链肽包含或由下列氨基酸序列组成：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO:25)或与SEQ ID NO：25具有至少80％(至少80％、85％、90％、95％、97％、99％或更高)同一性的氨基酸序列。

另外或可选择地，在一些实施方案中，可以将突变引入胰岛素-Fc融合蛋白的B链肽，例如以改变序列和/或长度。胰岛素B链特定氨基酸残基的突变已被证明可以消除非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的T细胞刺激(Nakayama,M.et al.Science(2005)435:220-223；Nakayama,M.et al Ann NY Acad Sci(2006)1079:122-129)。不受理论束缚，据信某些胰岛素突变体可破坏T细胞受体对胰岛素肽表位-MHC-II复合物的识别，这反过来又阻止T细胞向胰岛细胞的活化。对胰岛素或胰岛素类似物的序列的示例性修饰可包括例如SEQ ID NO：25的残基16(例如，Y16A取代)的氨基酸取代。因此，在一些实施方案中，包含胰岛素或胰岛素类似物B链上的至少1个氨基酸取代、缺失或添加(例如，相对于SEQ ID NO.25)的胰岛素-Fc融合蛋白可导致T细胞对携带胰岛素片段或胰岛素类似物片段的MHC-II复合物的亲和力降低，和/或体内T细胞活化减少。因此，在某些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的B链肽包含在氨基酸残基16处具有突变的突变B链(例如，Y16A取代)。在某些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的B链肽具有SEQ ID NO：11-15中任一个的序列。

本文提供胰岛素-Fc融合蛋白，其包含可操作地连接至Fc结构域的胰岛素多肽。在某些实施方案中，胰岛素融合蛋白包含本文所述的Fc结构域。在胰岛素-Fc融合蛋白的一些实施方案中，Fc结构域包含或由下列氨基酸序列组成：SEQ ID NO：22或由SEQ ID NO：22的氨基酸序列组成；或与SEQ ID NO：22具有至少80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。在胰岛素-Fc融合蛋白的其他实施方案中，Fc结构域包含或由下列氨基酸序列组成：SEQ ID NO:23或与SEQ ID NO：23具有至少80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多)同一性的氨基酸序列。

以下提供本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白的全长序列：

SEQ ID NO:2

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO:3

FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTPKAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO:4

FVNQHLCGSHLVQALYLVCGERGFFYTPKAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO:5

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGEEGFFYTPKAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO:6

FVNQHLCGSHLVEALALVCGEEGFFYTPKAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO:7

FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTPKAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO:8

FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTPKAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGSGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO:9

FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTPKAAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO:10

FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTPKAAAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

/>

表A不包括前导序列。在一些实施方案中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白在N末端不包含前导序列。在其他实施方案中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白包含前导序列，例如在N末端。示例性前导序列包括氨基酸序列MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ ID NO：26)。在一些实施方案中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白由包含前导序列的核酸分子编码，例如用于在细胞(例如，真核细胞，例如哺乳动物细胞)中表达(例如，重组表达)。在某些实施方案中，在表达过程中，例如在细胞培养物中切割前导序列。编码前导序列的示例性核酸序列包括核酸序列：ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCC(SEQ ID NO:27)。在其他实施方案中，本文描述的融合蛋白由不包含前导序列的核酸分子编码。

本文还公开了编码SEQ ID NO：2-10的胰岛素-Fc融合蛋白的核酸序列(例如，mRNA、cDNA、DNA)。

在一些实施方案中，核酸序列是：在一些实施方案中，核酸序列是：

ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAAGCAGCACCTGTGCGGCCCTCACCTGGTGGAAGCTCTGTATCTCGTGTGCGGCGAGCGGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGTCTCGGAGAGAGGTGGAAGATCCCCAGGTGGAACAGCTGGAACTGGGCGGCTCTCCTGGCGATCTGCAGACACTGGCCCTGGAAGTGGCCCGGCAGAAACGGGGCATCGTGGACCAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGGTGGAGGCGGTGGAGTGCCCAGAGATTGTGGATGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTTAG(SEQ ID NO:1)。

ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGGAAGCTCTGGCTCTCGTGTGCGGCGAGCGGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGGCCGCTAAAGGCATCGTGGAACAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGGCGGAGGTGGTGCAGGAGGCGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG(SEQ ID NO:29)。

ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGCAAGCTCTGTATCTCGTGTGCGGCGAGCGGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGGCCGCTAAAGGCATCGTGGAACAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGGCGGAGGTGGTGCAGGAGGCGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG(SEQ IDNO:30)。

在一些实施方案中，核酸序列是

ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGGAAGCTCTGTATCTCGTGTGCGGCGAGGAGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGGCCGCTAAAGGCATCGTGGAACAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGGCGGAGGTGGTGCAGGAGGCGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG(SEQ ID NO:31)。

在一些实施方案中，核酸序列是：

ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGGAAGCTCTGGCTCTCGTGTGCGGCGAGGAGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGGCCGCTAAAGGCATCGTGGAACAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGGCGGAGGTGGTGCAGGAGGCGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG(SEQ ID NO:32)。

在一些实施方案中，核酸序列是：

ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGGAAGCTCTGGCTCTCGTGTGCGGCGAGCGGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGGCCGCTAAAGGCATCGTGGAACAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG(SEQ IDNO:33)。

在一些实施方案中，核酸序列是：

ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGGAAGCTCTGGCTCTCGTGTGCGGCGAGCGGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGGCCGCTAAAGGCATCGTGGAACAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGGCGGAGGTGGTTCAGGAGGCGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG(SEQ ID NO:34)。

在一些实施方案中，核酸序列是：

ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGGAAGCTCTGGCTCTCGTGTGCGGCGAGCGGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGGCCGCTGCAAAAGGCATCGTGGAACAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGGCGGAGGTGGTGCAGGAGGCGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG(SEQ ID NO:35)。

在一些实施方案中，核酸序列是：

ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGGAAGCTCTGGCTCTCGTGTGCGGCGAGCGGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGGCCGCTGCAGCTAAAGGCATCGTGGAACAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGGCGGAGGTGGTGCAGGAGGCGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG(SEQ ID NO:36)。

接头

在一些实施方案中，在一些实施方案中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白包含一个或多个接头，例如胰岛素-Fc融合蛋白的一个或多个结构域之间，或胰岛素-Fc融合蛋白和缀合的分子/部分之间。例如，胰岛素-Fc融合蛋白包含胰岛素多肽和Fc片段之间的接头。在其他实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白包含胰岛素多肽的一种或多种肽(例如，A链、B链和/或C链肽)之间的接头。

肽接头可包含天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，肽接头可以由核酸分子编码，例如，使得单个核酸分子可以编码胰岛素多肽内的各种肽以及肽接头；或者可以编码胰岛素多肽、Fc片段和肽接头。

在一些实施方案中，肽接头包含至少5个氨基酸残基，例如，至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多氨基酸残基。在一些实施方案中，肽接头包含5-9个氨基酸残基。在一些实施方案中，肽接头包含长度为四个或更少的氨基酸或六个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头包含0个氨基酸(例如，无肽接头)。在一些实施方案中，肽接头包含4个或更多个甘氨酸(例如，4、5、6、7、8或更多个甘氨酸)。在一些实施方案中，肽接头包含4个或更多个连续的甘氨酸(例如，5个或更多个连续的甘氨酸)。在一些实施方案中，肽接头包含GGGGAGGGG(SEQ ID NO：20)或GGGGSGGGG(SEQ ID NO：21)的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽接头包含依那西普融合蛋白中的接头。参见，例如，US8063182B1，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，肽接头不包含人免疫球蛋白的“铰链”区(或其片段)(例如IgG，例如IgG₁)。

人免疫球蛋白的“铰链”区域通常分为三个区域：上部、中部和下部铰链。在一些实施方案中，在免疫球蛋白中，上铰链是重链(CH1)的第一结构域的末端与形成重链间二硫键桥的第一半胱氨酸之间的氨基酸数。中间铰链富含脯氨酸并含有重链间半胱氨酸二硫键。下铰链将中间铰链连接到CH2域。参见Sandlie,I.and Michaelsen,T.,Chapter 3:Engineering the Hinge Region to Optimize Complement-induced Cytolysis,InAntibody Engineering:A Practical Guide,W.H.Freeman and Co.,New York,N.Y.；还参见Hamers-Casterman,C.,Naturally Occurring Antibodies Devoid of Light Chains,363Nature 446(1993)和Terskikh,A.V.,"Peptabody":A New Type of High AvidityBinding Protein,94Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1663(1997)。

本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白的功能特征

本文描述了用于治疗或预防自身免疫疾病(例如自身免疫性糖尿病)的方法，其包括向受试者施用本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白，其中胰岛素-Fc融合蛋白特异性结合抗胰岛素抗体、结合抗胰岛素B细胞，降低T细胞相互作用(由IL-2分泌决定)，和/或表现出与胰岛素受体的弱结合。另外或可选择地，在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白在竞争性结合测定中在IC₅₀>3,000nM(例如，4,000nM、5,000nM或更高)时结合人胰岛素受体。

另外或可选择地，在一些实施方案中，施用本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白对受试者中的葡萄糖水平(例如，血糖水平)没有实质性影响(例如，显着的降低作用)。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的葡萄糖降低活性低于(例如，低至少10％、低20％、低30％、低40％、低50％或低至少2倍、例如低至少5倍、低10倍、低15倍、低20倍、低30倍、低40倍、低50倍等)参考标准。参考标准可以是来自哺乳动物(例如人或小鼠)的天然存在的胰岛素(例如，胰岛素原或成熟胰岛素)。参考标准也可以是US2013/0028918A1或CN103509118A中描述的融合蛋白。

在一些实施方案中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白特异性靶向与特定胰岛自身抗原反应的B细胞，例如胰岛素-Fc融合蛋白不靶向不与该特定胰岛自身抗原反应的B细胞。例如，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白特异性靶向与胰岛素反应的B细胞(也称为胰岛素特异性B细胞、胰岛素⁺B细胞、胰岛素⁺B220⁺细胞或抗胰岛素B细胞)。在一些实施方案中，本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白不靶向非胰岛素特异性B细胞。因此，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白有利地对特定B细胞具有高度特异性，例如表达抗胰岛素受体的自身免疫B细胞(例如，抗胰岛素BCR、抗胰岛素B细胞或胰岛素⁺B细胞)。

在一些实施方案中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白结合特定类型的B细胞，例如，自身抗原特异性B细胞或自身免疫B细胞(例如，抗胰岛素B细胞、胰岛素特异性B细胞或胰岛素⁺B细胞)，并将它们作为消除目标，例如，通过巨噬细胞或树突细胞的吞噬作用，或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体介导的细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白不靶向非自身抗原特异性B细胞或非自身免疫B细胞(例如，抗胰岛素B细胞以外的细胞)用于消除。消除自身免疫B细胞或自身抗原特异性B细胞，例如胰岛素特异性B细胞，可降低自身免疫应答、自身抗体水平，并最终治疗或预防自身免疫疾病，例如自身免疫疾病(例如I型)糖尿病。

在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白可通过靶向特定实体(例如B细胞、自身免疫抗体、特异性免疫球蛋白B细胞受体或其他蛋白质或细胞)起作用。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白通过靶向B细胞起作用，所述B细胞例如是对胰岛自身抗原特异的B细胞，例如含有结合胰岛素的B细胞受体的B细胞。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白通过靶向抗胰岛素B细胞起作用，例如含有结合胰岛素的B细胞受体的B细胞。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白是含有两个胰岛素原或胰岛素原类似物的同源二聚体，能够同时与同一B细胞上的多个(例如一个以上)抗胰岛素B细胞受体结合，从而导致胰岛素-Fc融合蛋白被内吞。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白是含有两个胰岛素原或胰岛素原类似物的同型二聚体，并且能够同时结合同一B细胞上的多个(例如多于一个)抗胰岛素B细胞受体，这导致B细胞内的信号传导事件。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白是含有两个胰岛素原或胰岛素原类似物的同二聚体，并且能够同时结合相同B细胞上的多个(例如多于一个)抗胰岛素B细胞受体，这导致B细胞经历细胞凋亡。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白是含有两个胰岛素原或胰岛素原类似物的同二聚体，并且能够同时结合相同B细胞上的多个(例如多于一个)抗胰岛素B细胞受体，而胰岛素-Fc融合蛋白的Fc区上的表位与免疫效应细胞相互作用以引发对B细胞的作用(例如通过ADCC的细胞凋亡)。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白结合作为早期B细胞的抗胰岛素B细胞，并通过称为受体编辑的过程使早期B细胞修饰其B细胞受体。

在一个方面，本文提供了治疗自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病)的方法，其包括向受试者施用本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白，其中相对于参考标准或参照治疗，施用胰岛素-Fc融合蛋白导致受试者中自身抗原特异性B细胞水平降低。另一方面，本文提供治疗自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病)的方法，其包括向受试者施用本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白，其中胰岛素-Fc融合蛋白的给药诱导受试者中的自身抗原特异性B细胞相对于参考标准或参照治疗进行增加的受体编辑。在一些实施方案中，B细胞对自身抗原具有特异性(例如，B细胞包含BCR，其包含结合自身抗原的免疫球蛋白，例如胰岛素)。

在一些实施方案中，B细胞包含致病B细胞或致病性B细胞(例如，抗胰岛素B细胞、胰岛素特异性B细胞或胰岛素⁺B细胞)。在一些实施方案中，B细胞包含抗胰岛素B细胞。在一些实施方案中，B细胞呈现特定的细胞表面受体。在一些实施方案中，抗胰岛素B细胞表面受体包含B220、CD19、CD20、CD22和其他类似的细胞表面受体及其同种型。在一些实施方案中，抗胰岛素B细胞呈现细胞表面受体的组合，所述细胞表面受体包含B220、CD19、CD20、CD22和其他类似的细胞表面受体及其同种型。在一些实施方案中，抗胰岛素B细胞呈递对胰岛素特异的B细胞受体(BCR)，例如，BCR包含对胰岛素特异的免疫球蛋白，例如IgM受体。

在一些实施方案中，施用胰岛素-Fc融合蛋白导致在用胰岛素-Fc融合蛋白处理之前消除受试者中存在的大于10％(例如，大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的胰岛素特异性B细胞(例如，在血液或脾中)。另外或可选择地，在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的施用导致在用胰岛素-Fc融合蛋白处理之前在受试者中存在少于30％(例如，少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、2.5％、1％或更少)的非胰岛素特异性/反应性B细胞的消除。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的施用导致在用胰岛素-Fc融合蛋白处理之前在受试者中存在的B细胞总数(包括胰岛素特异性B细胞和非胰岛素特异性B细胞)的消除少于30％(例如，少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、2.5％、1％或更少)。

在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的施用导致治疗后至少1天(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23，24、25、30、35、40、45、50、55、60天或更长时间，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周或更长时间)胰岛素特异性B细胞的数量(与用胰岛素-Fc融合蛋白治疗前观察到的相比)减少(例如，至少2倍，例如，至少2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300，400、500、1000或10,000倍或更多)。

在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白，例如，当长期施用于受试者时，导致在治疗过程中(并且在一些情况下在停止治疗后一段时间内，例如，停止治疗后至少1天，(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23，24、25、30、35、40、45、50、55、60天或更长时间，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周或更长时间))胰岛素特异性B细胞的数量(与用胰岛素-Fc融合蛋白治疗前观察到的相比)减少(例如，至少2倍，例如，至少2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300，400、500、1000或10,000倍或更多)。

在实施方案部分中描述了确定通过胰岛素-Fc融合蛋白处理消除的细胞数的示例性方法。例如，可以使用含有表达抗胰岛素抗体片段(例如，来自VH-125小鼠的脾细胞)的转基因的脾细胞的巨噬细胞(例如，大鼠肺泡巨噬细胞)的体外共培养来确定消除的细胞量。参见，例如Hulbert,et al.,J.Immunol.167(2001):5535-38。在另一个实例中，可以通过测量受试者外周血中B细胞(例如，自身抗原特异性)的水平来确定消除的细胞量。例如，与用治疗前观察到的相比，用胰岛素-Fc融合蛋白处理后自身抗原特异性B细胞数量的减少表明给予胰岛素-Fc融合蛋白导致消除自身抗原特异性B细胞。总B细胞或非胰岛素特异性B细胞数量的少量(或没有)减少表明胰岛素-Fc融合蛋白不会导致B细胞的全局非特异性消除，即胰岛素-Fc融合蛋白对自身抗原特异性B细胞具有特异性。

在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白对抗胰岛素抗体具有亲和力(例如，可溶的，例如，循环的或与受体结合的)，其特征在于Kd为1μM或更低，例如1μM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM或更低)。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白对抗胰岛素免疫球蛋白或B细胞受体(BCR)(例如，胰岛素特异性B细胞)的亲和力大于(例如，至少2倍大于，例如，至少2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、400、500、1000或10,000倍或更多倍大于)胰岛素激素受体的亲和力。

在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白对胰岛素特异性B细胞具有亲和力，其特征在于1μM或更低的Kd，例如1μM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM。400nM、300nM、200nM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM或更低。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白对胰岛素特异性B细胞的亲和力低于(例如，至少2倍大于，例如，至少2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、400、500、1000或10,000倍或更多倍大于)其对非胰岛素特异性/反应性B细胞的亲和力。

另外或可选择地，在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白抑制胰岛素⁺B细胞受体与胰岛素的体外结合，IC₅₀<300nM(例如，250nM、200nM、150nM、100nM、95nM、90nM、85nM、80nM、75nM、70nM、65nM、60nM、55nM、50nM、45nM、40nM、35nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM或更低)。

另外或者可选择地，在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白在体外以约70pM的EC₅₀去除胰岛素特异性B细胞。

在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白能够结合胰岛素自身抗体(例如，体内或体外)，其结合亲和力是人胰岛素观察到的结合亲和力的至少5％。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白能够结合胰岛素自身抗体(例如，体内或体外)，其结合亲和力为人胰岛素观察到的结合亲和力的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。

在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白能够结合B细胞受体(例如，体内或体外)，其结合亲和力是人胰岛素观察到的结合亲和力的至少5％。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白能够结合B细胞受体(例如，体内或体外)，其结合亲和力为人胰岛素观察到的结合亲和力的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。

抗原呈递细胞(APC)是通过抗原呈递过程在其细胞表面上展示与主要组织相容性复合物分子(MHC)复合的抗原(例如MHCII分子)的细胞。

在一些实施方案中，本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白能够被抗原呈递细胞(APC)加工成肽。然后可以将这些APC处理的肽以肽-MHCII复合物的形式呈递到APC MHCII受体上，所述肽-MHCII复合物能够结合T细胞受体。在一些实施方案中，这些APC加工的肽-MHCII复合物能够结合T细胞受体(例如，体内或体外)，其结合亲和力比人胰岛素肽-MHC II复合物(例如，人胰岛素B9：23肽-MHC II复合物)观察到的结合亲和力高约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。

在一些实施方案中，施用胰岛素-Fc融合蛋白导致施用后受试者中胰岛素自身抗体(IAA)水平(例如，循环IAA)水平降低，例如降低至少2倍，例如至少2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、400、500、1000或10,000倍更大。在一些实施方案中，与用未与Fc片段融合的胰岛素或胰岛素类似物处理所观察到的相比，胰岛素-Fc融合蛋白的施用导致受试者中胰岛素自身抗体(IAA)(例如，流通IAA)水平降低。

在一些实施方案中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白导致体内和/或体外T细胞活化降低，例如相对于天然存在的人胰岛素，例如人胰岛素原或人成熟胰岛素。在一些实施方案中，当在体外或体内与B细胞接触时，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白由B细胞加工并在MHCII复合物中以T细胞的形式呈现抗原(例如，至少B链肽或B链肽的一部分)。

在更进一步的实施方案中，当在体外或体内与抗原呈递细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞)接触时，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白由抗原呈递细胞加工并在MHCII复合物中以T细胞的形式呈现抗原(例如，至少B链肽或B链肽的一部分)。在一些实施方案中，当胰岛素-Fc融合蛋白包含含有Y16A突变的B链肽时，相对于包含来自野生型人胰岛素的B链肽(例如，包含Y16)的胰岛素-Fc融合蛋白，T细胞识别该B链肽：MHCII复合物的程度降低，其中突变的编号是指胰岛素B链中相对于N-末端的位置。在一些实施方案中，与US2013/0028918A1或CN103509118A中描述的融合蛋白相比，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白在体内和/或体外导致更少的T细胞活化。

另外或者可选择地，在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白激活T细胞以分泌IL-2水平，与在重组人胰岛素激活的T细胞中观察到的相比，IL-2水平降低。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白激活T细胞以分泌小于3,000pg/ml的IL-2水平(例如，2750pg/mL、2500pg/mL、2250pg/mL、2000pg/mL、1750pg/mL、1500pg/mL、1250pg/mL、1000pg/mL、750pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、200pg/mL、175pg/ml、150pg/ml、125pg/ml、100pg/ml、95pg/ml、90pg/ml、85pg/ml、80pg/ml、75pg/ml、70pg/ml、65pg/ml、60pg/ml、55pg/ml、50pg/ml、45pg/ml、40pg/ml、35pg/ml或更低)。

在一些实施方案中胰岛素-Fc抑制由参考标准诱导的T细胞活化，IC₅₀为100nM或更低(例如，100nM、95nM、90nM、85nM、80nM、75nM、70nM、65nM、60nM、55nM、50nM、45nM、40nM、35nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM或更低)，其中参考标准是具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的胰岛素-Fc蛋白。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白抑制由参考标准诱导的T细胞活化，IC₅₀为5nM或更低，其中参考标准是具有SEQ IDNO：5的氨基酸序列的胰岛素-Fc蛋白。

在一些实施方案中，当给予受试者时，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白与参考标准相比降低了自身免疫疾病(例如自身免疫性糖尿病)的发生率。参考标准可以是来自哺乳动物(例如人或小鼠)的天然存在的胰岛素(例如，胰岛素原或成熟胰岛素)。

在一些实施方案中，当给予受试者时，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白具有至少2小时的血清半衰期(例如，至少2小时、5小时、10小时、15小时、20小时、24小时、36小时、1天、1.5天2天、2.2天、2.5天、3天、5天、7天或更长时间)。在一些实施方案中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白具有比参考标准更长的血清半衰期。参考标准可以是来自哺乳动物(例如人或小鼠)的天然存在的胰岛素(例如，胰岛素原或成熟胰岛素)。参考标准也可以是肽(例如胰岛素B链肽，或含有一个或多个氨基酸突变的胰岛素B链肽)。参考标准也可以是US2013/0028918A1或CN103509118A中描述的融合蛋白。

另外或者可选择地，在本文公开的方法的一些实施方案中，与施用前在受试者中观察到的相比，施用胰岛素-Fc融合蛋白导致受试者(例如，血液或脾脏)中抗胰岛素B细胞的数量减少(例如，减少至少5％，例如，至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多)。在某些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的施用基本上不会减少除抗胰岛素B细胞之外的B细胞的数量。在本文公开的方法的一些实施方案中，与施用前在受试者中观察到的相比，受试者在施用胰岛素-Fc融合蛋白后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周或超过3周显示抗胰岛素B细胞数量的减少。

另外或者可选择地，在本文公开的方法的一些实施方案中，与施用前在受试者中观察到的相比，施用胰岛素-Fc融合蛋白导致受试者中胰岛素自身抗体水平(例如，循环IAA)降低(例如，降低至少5％)。在本文公开的方法的一些实施方案中，与施用前受试者中观察到的相比，受试者在施用胰岛素-Fc融合蛋白后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周或超过3周显示降低的胰岛素自身抗体水平。

另外或者可选择地，在本文公开的方法的一些实施方案中，施用胰岛素-Fc融合蛋白后受试者的血糖水平与施用前在受试者中观察到的血糖水平相当。在本文公开的方法的一些实施方案中，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周或超过3周的受试者的血糖水平与施用前在受试者中观察到的血糖水平相当。

胰岛素-Fc融合蛋白产物

各种方法可用于产生本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白。(参见，例如，Antibodies:ALaboratory Manual,Harlow E,and Lane D,1988,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.，通过引用并入本文)。

载体。胰岛素-Fc融合蛋白可以由包含编码如本文所述的本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白的任何DNA序列的载体表达。这些可包括核酸载体、脂质体、裸DNA、佐剂辅助的DNA、基因枪、导管等。载体可包括化学缀合物，如WO93/64701中所述，其具有靶向部分(例如细胞表面受体的配体)和核酸结合部分(例如聚赖氨酸)、病毒载体(例如DNA或RNA病毒载体)、质粒、噬菌体等。载体可以是染色体的、非染色体的或合成的。

示例性载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒。在一些实施方案中，病毒载体是DNA病毒载体。示例性DNA载体包括痘病毒载体，例如orthopox或avipox载体、疱疹病毒载体，例如单纯疱疹病毒(HSV)载体(参见Geller,A.I.et al.,J.Neurochem,64:487(1995)；Lim,F.,et al.,in DNA Cloning:Mammalian Systems,D.Glover,Ed.(Oxford Univ.Press,Oxford England)(1995)；Geller,A.I.et al.,Proc Natl.Acad.Sci.:U.S.A.90:7603(1993)；Geller,A.I.,et al.,Proc Natl.Acad.Sci.USA 87:1149(1990)，腺病毒载体(参见LeGal LaSalle et al.,Science,259:988(1993)；Davidson,et al.,Nat.Genet 3:219(1993)；Yang,et al.,J.Virol.69:2004(1995)，腺相关病毒载体(参见Kaplitt,M.G.et al.,Nat.Genet.8:148(1994)。

痘病毒载体将基因导入细胞质。Avipox病毒载体仅导致核酸的短期表达。在一些实施方案中，腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体用于将核酸导入细胞。腺病毒载体导致比腺相关病毒(约4个月)更短的表达(约2个月)，其反过来短于HSV载体。选择的特定载体将取决于靶细胞和所治疗的病症。引入可以通过标准技术，例如感染、转染、转导或转化。基因转移模式的实例包括例如裸DNA、CaPO₄沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂质转染、细胞显微注射和病毒载体。这些载体可用于表达本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白可以通过实施方案部分中描述的载体表达。

细胞系、表达和纯化。本文还公开了表达本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白的宿主细胞或包含编码本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白的任何DNA序列的载体。

在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白可以重组表达，例如在真核细胞中，例如哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞。用于表达的示例性哺乳动物细胞包括HEK细胞，例如HEK293细胞，或CHO细胞，以及本领域可获得的其他细胞系，例如用于表达抗体片段或含Fc蛋白的细胞系。在一些实施方案中，非哺乳动物细胞，例如用于表达本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白的昆虫细胞，例如SF9或S2细胞，以及本领域可获得的其他细胞系，例如用于表达抗体片段或含Fc蛋白的细胞系。在一些实施方案中，用编码胰岛素-Fc融合蛋白的核酸分子(例如载体)转染细胞(例如，其中整个胰岛素-Fc融合蛋白由单个核酸分子编码)。在其他实施方案中，用一种以上核酸分子转染细胞，其中每种核酸分子编码胰岛素-Fc融合蛋白的不同结构域。例如，一种核酸分子可以编码胰岛素多肽，并且不同的核酸分子可以编码Fc片段。可以使用本领域的标准方法培养细胞。

在一些实施方案中，从细胞中纯化或分离胰岛素-Fc融合蛋白(例如，通过裂解细胞)。在其他实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白由细胞分泌，并且例如，融合蛋白从细胞培养的细胞培养基中纯化或分离。胰岛素-Fc融合蛋白的纯化可包括使用柱色谱法，例如亲和色谱法，或使用涉及某些分子的大小、电荷和/或亲和力的其他分离方法。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的纯化涉及用Fc片段选择/富集蛋白质，例如通过使用蛋白A珠或蛋白A柱。可以使用其他亲和分离方法，例如，使用抗胰岛素抗体或其片段。另外或可选择地，也可以使用其他分离方法，例如离子交换色谱和/或凝胶过滤色谱。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白的纯化还包括过滤或离心蛋白质制剂。

纯化的融合蛋白可以使用多种方法表征，例如纯度、产量、结构和/或活性，例如280nm处的吸光度(例如，确定产率)、尺寸排阻或毛细管电泳(例如，确定分子量和/或纯度)、质谱(MS)和/或液相色谱(LC)-MS(例如，以确定纯度和/或糖基化)和/或ELISA(例如，以确定抗胰岛素抗体的结合程度，例如亲和力)。示例性表征方法也在实施方案部分中描述。

在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白在细胞(例如细胞培养物)中的表达每升培养物产生至少50mg胰岛素-Fc融合蛋白(例如，纯化的融合蛋白)的产量(例如，至少50mg/L、60mg/L、70mg/L、80mg/L、90mg/L、100mg/L、110mg/L、120mg/L或更多)。在一些实施方案中，纯化的胰岛素-Fc融合蛋白具有至少80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、97％、99％重量)的纯度，例如，通过标准方法测定。

在一些实施方案中，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白在细胞中的表达产生胰岛素-Fc融合蛋白(例如，纯化的胰岛素-Fc融合蛋白)的产率，其大于(例如，至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多)US2013/0028918A1或CN103509118A中描述的融合蛋白。

治疗和预防方法

以下讨论仅以示例的方式呈现，并且不旨在限制。

本文描述了用于治疗或预防自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的方法，其中所述方法包括向受试者施用本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白。在本文公开的方法的一些实施方案中，自身免疫疾病是自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病(即1型糖尿病(T1D)、青少年糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)，或成人潜伏性自身免疫性糖尿病(LADA))。LADA，也称为缓慢发作的1型糖尿病，是1型糖尿病的一种形式，其发生在成人中并且呈现较慢的发病过程。据估计，高达约50％的被诊断患有非肥胖相关的2型糖尿病的成年人可能患有LADA。在本文公开的方法的一些实施方案中，相对于参照标准或正常对照受试者，自身免疫疾病包括受试者中胰腺产生胰岛素的β-细胞数量减少。

在本文公开的方法的一些实施方案中，受试者已被诊断患有自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)。在某些实施方案中，所述受试者已被诊断患有自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)少于3个月、少于6个月、少于9个月、少于1年或少于1.5年。

另外或者可选择地，在本文公开的方法的一些实施方案中，受试者具有可检测水平的自身免疫抗体但尚未出现自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的症状，例如高血糖症。自身免疫抗体可以对胰岛自身抗原具有特异性。例如，在一些实施方案中，胰岛自身抗原包括胰岛素、谷氨酸脱羧酶(例如，同种型65，例如抗GAD₆₅)、蛋白酪氨酸磷酸酶样蛋白(IA2)或锌转运蛋白8(ZnT8)。在其他实施方案中，自身免疫抗体是抗胰岛素抗体。

在本文公开的方法的某些实施方案中，受试者没有可检测水平的胰岛素自身抗体并且没有出现自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的症状，例如，未发生高血糖症。

在本文公开的方法的一些实施方案中，受试者没有可检测水平的致病性B细胞群或致病B细胞群(例如，抗胰岛素B细胞、胰岛素特异性B细胞或胰岛素⁺B细胞)并且未出现自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的症状，例如未发生高血糖症。

在本文公开的方法的某些实施方案中，受试者具有可检测水平的致病性B细胞群或致病B细胞群(例如，抗胰岛素B细胞、胰岛素特异性B细胞或胰岛素⁺B细胞)但未发生自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的症状，例如，未发生高血糖症。在一些实施方案中，B细胞群包含胰岛素特异性B细胞。在一些实施方案中，胰岛素特异性B细胞呈现特定细胞表面受体，例如B220、CD19、CD20、CD22或其他类似的细胞表面受体及其同种型。在某些实施方案中，胰岛素特异性B细胞表达两种或更多种细胞表面受体，例如B220、CD19、CD20、CD22和其他类似的细胞表面受体及其同种型。

另外或者可选择地，在本文公开的方法的一些实施方案中，评估受试者中内源性C肽的水平以有助于自身免疫性糖尿病(例如，1型糖尿病或潜伏性自身免疫性糖尿病)的诊断和程度。C肽经常用作残留β细胞功能的生物标志物，因为它与胰岛素的量相同，因此可代表受试者中胰岛素分泌的总量(Jones,A.G.and Hattersley,A.T.,Diabet Med(2013)30,803-817)。受试者中C-肽的测量可用于指导胰岛素水平的确定，因为在直接胰岛素测定中也将检测受试者中存在的任何外源胰岛素。健康受试者(例如，没有自身免疫性糖尿病的受试者)具有范围为约0.6nmol/L至约0.8nmol/L(例如，约0.65nmol/L)的内源性C肽水平。相反，患有自身免疫性糖尿病(例如，1型糖尿病或LADA)的受试者具有从不可检测到约0.6nmol/L(例如，约0.05nmol/L)的内源性C肽水平。在一些实施方案中，内源性C肽水平不包括衍生自本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白的C肽的任何C肽，例如，在施用本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白后。

在一些实施方案中，受试者已经被诊断患有自身免疫性糖尿病(例如，1型糖尿病)并且具有等于或小于约0.01nmol/L、约0.02nmol/L、约0.03nmol/L、约0.04nmol/L、约0.05nmol/L、约0.06nmol/L、约0.07nmol/L、约0.08nmol/L、约0.09nmol/L、约0.1nmol/L、约0.125nmol/L、约0.15nmol/L、约0.175nmol/L、约0.2nmol/L、约0.3nmol/L、约0.4nmol/L、或约0.5nmol/L、或小于0.6nmol/L的内源性C肽水平，例如，在用本文描述的胰岛素-Fc融合蛋白治疗之前。

在一些实施方案中，该受试者已被诊断患有自身免疫性糖尿病(例如，1型糖尿病)并且具有小于或等于约0.1nmol/L、约0.09nmol/L、约0.08nmol/L、约0.07nmol、约0.06nmol/L、约0.05nmol/L、约0.04nmol/L、约0.03nmol/L、约0.02nmol/L、约0.01nmol/L或更低的内源C肽水平，例如，在用本文描述的胰岛素-Fc融合蛋白处理之前。在一些实施方案中，所述受试者已经被诊断患有自身免疫性糖尿病(例如，1型糖尿病)并且具有小于或等于约0.01nmol/L、约0.009nmol/L、约0.008nmol/L、约0.007nmol、约0.006nmol/L、约0.005nmol/L、约0.004nmol/L、约0.003nmol/L、约0.002nmol/L、约0.001nmol/L或更低的内源性C肽水平，例如，在用本文描述的胰岛素-Fc融合蛋白治疗之前。在一些实施方案中，所述受试者已被诊断患有自身免疫性糖尿病(例如，1型糖尿病)并且具有小于或等于约0.001nmol/L、约0.1pmol/L、约0.01pmol/L、约0.001pmol/L或更低的内源性C肽水平，例如，在用本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白治疗之前。在某些实施方案中，所述受试者已被诊断患有自身免疫性糖尿病(例如，1型糖尿病)并且具有不可检测水平的内源性C肽，例如在用本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白治疗之前。

在一些实施方案中，该受试者已经被诊断患有自身免疫性糖尿病(例如，1型糖尿病)并且相对于参考标准具有约95％或更低的内源C肽水平，例如在用本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白治疗之前。在一些实施方案中，受试者已被诊断患有自身免疫性糖尿病(例如，1型糖尿病)并且相对于参考标准具有约95％或更低、约90％或更低、约85％或更低、约80％或更低、约75％或更低、约70％或更低、约65％或更低、约60％或更低、约55％或更低、约50％或更低、约45％或更低、约40％或更低、约35％或更低、约30％或更低、约25％或更低、约20％或更低、约15％或更低、约10％或更低、约5％或更低、或约1％或更低的内源C肽水平。

在一些实施方案中，内源性C肽水平可以在禁食(例如，缺乏葡萄糖)或进食(例如，用葡萄糖刺激)状态下在受试者中测量。举例来说，在分析内源性C肽水平之前，处于禁食状态的受试者可以禁食约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约12小时、约18小时、约20小时或约24小时。在另一个实例中，处于进食状态的受试者可在12小时内、10小时内、6小时内、4小时内、3小时内、2小时内、1.5小时内、1小时内、30分钟内、15分钟内消耗食物或与内源C肽水平的分析同时消耗食物。

在一些实施方案中，受试者处于禁食(例如，缺乏葡萄糖)状态并且具有不可检测水平的内源性C肽，例如在用本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白治疗之前。在一些实施方案中，受试者处于禁食(例如，剥夺葡萄糖)状态并且具有小于或等于约0.06nmol/L的内源C-肽水平，例如，在用本文描述的胰岛素-Fc融合蛋白治疗之前。在一些实施方案中，受试者处于禁食(例如，剥夺葡萄糖)状态并且具有小于或等于约0.06nmol/L、约0.07nmol/L、约0.08nmol/L、约0.09nmol/L、约0.1nmol/L、约0.125nmol/L、约0.15nmol/L、约0.175nmol/L、约0.2nmol/L、约0.3nmol/L、约0.4nmol/L、约0.5nmol/L、约0.6nmol/L、约0.7nmol/L、约0.8nmol/L、约0.9nmol/L、约1.0nmol/L或更高的内源C-肽水平，例如，在用本文描述的胰岛素-Fc融合蛋白治疗之前。在一些实施方案中，受试者处于禁食状态并且具有小于或等于约0.2nmol/L、或小于或等于约0.5nmol/L、或小于或等于约1.0nmol/L的内源C-肽水平，例如，在用本文描述的胰岛素-Fc融合蛋白治疗之前。

在一些实施方案中，受试者处于进食(例如，用葡萄糖刺激)状态并且具有不可检测水平的内源C肽，例如，在用本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白治疗之前。在一些实施方案中，受试者处于进食(例如，用葡萄糖刺激)状态并且具有小于或等于约0.2nmol/L的内源C-肽水平，例如，在用本文描述的胰岛素-Fc融合蛋白治疗之前。在其他实施方案中，受试者处于进食状态(例如，用葡萄糖刺激)状态并且具有小于或等于约0.2nmol/L、约0.25nmol/L、约0.3nmol/L、约0.4nmol/L、约0.5nmol/L、约0.6nmol/L、约0.7nmol/L、约0.8nmol/L、约0.9nmol/L、约1.0nmol/L或更高的内源C-肽水平，例如，在用胰岛素-Fc融合蛋白治疗之前。在某些实施方案中，受试者处于进食状态并且具有小于或等于约0.6nmol/L、或小于或等于约0.75nmol/L、或小于或等于约1.0nmol/L的内源C-肽水平，例如，在用本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白治疗之前。

在一些实施方案中，预防性地给予胰岛素-Fc融合蛋白。在一些实施方案中，受试者没有可检测水平的自身免疫抗体(例如，胰岛素自身抗体)，并且预防性施用胰岛素-Fc融合蛋白。在一些实施方案中，受试者没有可检测水平的致病性B细胞群或致病B细胞群(例如，抗胰岛素B细胞、胰岛素特异性B细胞或胰岛素⁺B细胞)并且胰岛素-Fc融合蛋白预防性施用。在一些实施方案中，受试者没有可检测水平的自身免疫抗体(例如，胰岛素自身抗体)，并且没有可检测水平的致病性B细胞群或致病B细胞群(例如，抗胰岛素B细胞、胰岛素特异性B细胞或胰岛素⁺B细胞)，并且预防性施用胰岛素-Fc融合蛋白。在一些实施方案中，受试者未被诊断患有自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)。在一些实施方案中，受试者未被诊断患有自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)，并且预防性地施用胰岛素-Fc融合蛋白。在一些实施方案中，受试者有发展T1D的风险，例如，受试者具有已被诊断患有T1D的一级亲属。受试者可以是成人或儿童。

在一些实施方案中，受试者有发展T1D的风险，例如，受试者在DRB1、DQA1和/或DQB1基因座上具有一个或多个等位基因(例如，DR-DQ单倍型)，其与发生T1D的较高风险相关，例如，在Erlich等人，Diabetes.2008April；57(4):1084–1092中描述，在此引入作为参考。在一些实施方案中，受试者具有以下一种或多种人白细胞抗原(HLA)单倍型：

(a)DRB1*0301-DQA1*0501-DQB1*0201

(b)DRB1*0405-DQA1*0301-DQB1*0302

(c)DRB1*0401-DQA1*0301-DQB*0302

(d)DRB1*0402-DQA1*0301-DQB1*0302

(e)DRB1*0404-DQA1*0301-DQB1*0302；或

(f)DRB1*0801-DQB1*0401-DQB1*0402。

在一些实施方案中，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，受试者不会出现自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的症状。在一些实施方案中，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，受试者不会出现自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的症状至少约3个月、至少约6个月、至少约9个月、至少约1年、至少约1.5年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约10年、至少约15年、至少约20年、至少约25年、至少约30年、至少约40年、至少约50年或更长。

在一些实施方案中，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，受试者不会发生自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)。在一些实施方案中，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，受试者不会发展自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如，1型糖尿病)至少约3个月、至少约6个月、至少约9个月、至少约1年、至少约1.5年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约10年、至少约15年、至少约20年、至少约25年、至少约30年、至少约40年、至少约50年或更长。

在一些实施方案中，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，与参考标准或参照治疗相比，受试者具有自身免疫疾病症状(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的延迟发作率。在一些实施方案中，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，与参考标准或参考治疗相比较，自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的发病率延迟至少约3个月、至少约6个月、至少约9个月、至少约1年、至少约1.5年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约10年、至少约15年、至少约20年、至少约25年、至少约30年、至少约40年、至少约50年或更长。在一些实施方案中，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，与参考标准或参考治疗相比较，自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的症状的发作速率延迟约2％、约3％、约4％、约5％、约7％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或更多。

在一些实施方案中，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，与参考标准或参照治疗相比，受试者具有延迟的自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的发病率。在一些实施方案中，在施用胰岛素-Fc融合蛋白时，与参考标准或参考治疗相比较，自身免疫性疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的发病率延迟至少约3个月、至少约6个月、至少约9个月、至少约1年、至少约1.5年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约10年、至少约15年、至少约20年、至少约25年、至少约30年、至少约40年、至少约50年或更长。在一些实施方案中，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，与参考标准或参考治疗相比较，自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的发病率被延迟约2％、约3％、约4％、约5％、约7％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或更多。

在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白在治疗上给药。在一些实施方案中，受试者具有可检测水平的自身免疫抗体(例如，胰岛素自身抗体)，并且胰岛素-Fc融合蛋白在治疗上施用。在一些实施方案中，受试者具有可检测水平的致病性B细胞群或致病B细胞群(例如，抗胰岛素B细胞、胰岛素特异性B细胞或胰岛素⁺B细胞)并且胰岛素-Fc融合蛋白在治疗上施用。在一些实施方案中，受试者具有可检测水平的自身免疫抗体(例如，胰岛素自身抗体)和可检测水平的致病性B细胞群或致病B细胞群(例如，抗胰岛素B细胞、胰岛素特异性B细胞或胰岛素⁺B细胞)并且胰岛素-Fc融合蛋白在治疗上施用。在一些实施方案中，受试者已被诊断患有自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)。在一些实施方案中，受试者已被诊断患有自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)，并且治疗性地施用胰岛素-Fc融合蛋白。

在一些实施方案中，与施用前在受试者中观察到的相比，施用胰岛素-Fc融合蛋白治疗、逆转或改善受试者中自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的症状。在一些实施方案中，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，与给药前在受试者中观察到的相比较，受试者中的自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的症状被治疗、逆转或改善至少约3个月、至少约6个月、至少约9个月、至少约1年、至少约1.5年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年、至少约10年、至少约15年、至少约20年、至少约25年、至少约30年、至少约40年、至少约50年或更长。在某些实施方案中，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，与给药前在受试者中观察到的相比较，受试者中的自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的症状被治疗、逆转或改善约2％、约3％、约4％、约5％、约7％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或更多。

在一些实施方案中，与施用前在受试者中观察到的相比，施用胰岛素-Fc融合蛋白治疗、逆转或改善受试者中的自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)。在一些实施方案中，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，与给药前在受试者中观察到的相比较，受试者中的自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)被治疗、逆转或改善至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少1年、至少1.5年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少10年、至少15年、至少20年、至少25年、至少30年、至少40年、至少50年或更长。在某些实施方案中，在施用胰岛素-Fc融合蛋白后，与给药前在受试者中观察到的相比较，受试者中的自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如，1型糖尿病)被治疗、逆转或改善约2％、约3％、约4％、约5％、约7％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或更多。

在一些实施方案中，受试者接受本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白的一个疗程。如本文所用的治疗过程是指由提供给受试者的合适的从业者确定的特定剂量或方案，直到自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如，1型糖尿病)被治疗、治愈、缓解或症状减轻。在其他实施方案中，受试者接受融合蛋白的一个以上疗程。在其他实施方案中，受试者接受融合蛋白的多个疗程。在其他实施方案中，受试者接受融合蛋白的多个疗程，并且每个疗程分开特定的时间长度(例如，约1天、约1周、约2周、约1个月、约2个月、约3个月、约6个月、约1年、约1.5年、约2年、约3年、约4年、约5年、约7.5年、约10年、约12.5年、约15年、大约20年或更长时间)。

在一些实施方案中，受试者是成年人(例如，至少18岁，例如，至少19、20、21、22、23、24、25、25-30、30-35、35-40、40-50、50-60、60-70、70-80或80-90岁)。在一些实施方案中，受试者是儿童(例如，小于18岁，例如，小于17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3岁、2岁、1岁或以下)。在一些实施方案中，受试者是男性或女性。

在一些实施方案中，本文描述的任何方法中使用的参考治疗包括但不限于胰岛素或胰岛素类似物，例如本文所述的胰岛素或胰岛素类似物；胰岛细胞移植；胰腺移植；抗pan-B细胞抗原(例如抗CD20抗体、抗CD22抗体或抗CD19抗体)或抗体(例如，细胞毒性抗体)。在一些实施方案中，参照治疗可包括来自哺乳动物(例如人或小鼠)的天然存在的胰岛素(例如胰岛素原或成熟胰岛素)或US2013/0028918A1或CN103509118A中描述的组合物。

在一些实施方案中，本文描述的任何方法中使用的参考标准包括自身免疫疾病治疗(例如，1型糖尿病治疗)的结果，例如本文所述的结果。在一些实施方案中，参考标准是在开始治疗之前受试者中的标志物水平(例如，血糖或C肽水平)，例如，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白疗法，例如，受试者有发展T1D的风险(例如，受试者是T1D患者的一级亲属)；受试者是糖尿病前期(例如，受试者是自身抗体阳性)；受试者最近出现T1D(例如，发病时间少于12个月)；受试者长期存在T1D(例如，发病时间大于或等于12个月)；或者受试者是健康受试者(例如，健康年龄和/或性别匹配的受试者)。在一些实施方案中，参考标准是在开始治疗(例如，本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白疗法)之前测量疾病的/疾病进展/疾病的严重程度或疾病症状的存在/严重程度，例如，受试者有发展T1D的风险(例如，受试者是T1D患者的一级亲属)；受试者是糖尿病前期(例如，受试者是自身抗体阳性)；受试者最近出现T1D(例如，发病时间少于12个月)；受试者长期存在T1D(例如，发病时间大于或等于12个月)；或者受试者是健康受试者(例如，健康年龄和/或性别匹配的受试者)。

药物组合物

本文提供了含有本文所述融合蛋白的药物组合物，其可用于治疗或预防自身免疫疾病，例如自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病。

可以基于临床相关因素，例如受试者的医学相关特征(例如，年龄、体重、性别、其他医疗条件等)、化合物在药物组合物中的溶解度、化合物的效力和活性、以及药物组合物的给药方式，来选择药物组合物中融合蛋白的量和浓度以及施用于受试者的药物组合物的量。有关行政路线和剂量制度的更多信息，请参阅综合药物化学第5卷第25.3章(CorwinHansch；Chairman of Editorial Board),Pergamon Press 1990。

本文提供了含有本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白的药物组合物，其可用于治疗或预防自身免疫疾病，例如自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病。

尽管本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白可以单独施用，但在一些实施方案中，本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白可以作为药物制剂(组合物)施用，其中胰岛素-Fc融合蛋白与一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体组合。本文公开的具有一种或多种胰岛素-Fc融合蛋白的药物组合物可包括载体，其可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇，等等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。例如，通过使用诸如卵磷脂的涂层，通过在分散的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，可以防止微生物的作用。可以包括谷胱甘肽和其他抗氧化剂以防止氧化。在许多情况下，在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠将是有利的。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝或明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。

可以配制胰岛素-Fc融合蛋白用于以任何方便的方式施用以用于人类医学。在某些实施方案中，包含在药物制剂中的胰岛素-Fc融合蛋白本身可以是活性的，或者可以是前药，例如能够在生理环境中转化为活性化合物。无论选择何种给药途径，本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白(可以以合适的水合形式使用)和/或本技术的药物组合物被配制成本文所述的药学上可接受的剂型或通过本领域技术人员已知的其他常规方法。

在另一方面，本技术提供药学上可接受的组合物，其包含治疗有效量或预防有效量的本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白，与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制。本文所述的药物组合物可以特别配制用于以固体或液体形式给药，包括适于胃肠外给药的那些，例如通过皮下、肌内或静脉内注射，例如无菌溶液或悬浮液。在某些实施方案中，药物组合物可以简单地溶解或悬浮在无菌水中。在一些实施方案中，药物制剂是无热原的，即不会升高患者的体温。

可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)辅料，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；(21)环糊精，如(22)药物制剂中使用的其他无毒相容物质。在一些实施方案中，载体包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

润湿剂、乳化剂和润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。

如本文所述，本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白的某些实施方案可含有碱性官能团，例如胺，因此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白的相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在胰岛素-Fc融合蛋白的最终分离和纯化过程中原位制备，或者通过使本文所述的纯化的胰岛素-Fc融合蛋白以其游离碱形式与合适的有机或无机酸分别反应，并分离由此形成的盐。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等(参见，例如，Berge等人(1977)"Pharmaceutical Salts",J.Pharm.Sci.66:1-19)。

在其他情况下，本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白的某些实施方案可含有一个或多个酸性官能团，因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指胰岛素-Fc融合蛋白的相对无毒的无机和有机碱加成盐。这些盐同样可以在胰岛素-Fc融合蛋白的最终分离和纯化过程中原位制备，或者通过使纯化的游离酸形式的胰岛素-Fc融合蛋白与合适的碱(例如，药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)、氨或药学上可接受的有机伯、仲或叔胺分别反应来制备。代表性的碱金属或碱土金属盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(参见，例如，Berge等人，同上)。

药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

通常将药物组合物配制成与其预期的给药途径相容。给药途径的实例包括肠胃外(例如，静脉内、皮内、腹膜内或皮下)、口服、吸入、透皮(局部)、眼内、离子电渗和经粘膜给药。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和调节渗透压的试剂如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。为方便患者或治疗医师，可以在包含所有必需设备(例如，药物小瓶、稀释剂小瓶、注射器和针头)的试剂盒中提供给药制剂用于治疗过程(例如，7天治疗)。

本公开的制剂包括适合肠胃外给药的制剂。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和特定的给药方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的化合物的量。通常，在百分之百中，该量的范围为活性成分的约1％至约99％，约5％至约70％，或约10％至约30％。

适用于肠胃外给药的本技术的药物组合物包含本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液、或可在使用前重构成无菌注射溶液或分散液的无菌粉末的组合，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、溶质，其使制剂与预期接受者的血液或悬浮剂或增稠剂等渗。

可用于本技术的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、及其合适的混合物、植物油例如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，例如吐温样表面活性剂，可以保持适当的流动性。在一些实施方案中，药物组合物(例如，如本文所述)包含吐温样表面活性剂，例如吐温-80。在一些实施方案中，药物组合物(例如，如本文所述)包含吐温样表面活性剂，例如吐温-80，浓度为约0.001％至约2％之间，或约0.005％至约0.1％之间，或约0.01％至约0.5％之间。

在一些实施方案中，为了延长胰岛素-Fc融合蛋白的作用，可能需要减缓药物从皮下或肌内注射部位的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又取决于晶体大小和晶形。可选择地，通过将胰岛素-Fc融合蛋白溶解或悬浮在油性载体中来实现胃肠外施用形式的胰岛素-Fc融合蛋白的延迟吸收。可选择地，可以通过使用浓缩形式的胰岛素-Fc融合蛋白来延迟药物的吸收。

在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白以推注输注或静脉推注给药。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白通过注射器注射、泵、笔、针或留置导管施用。

适于注射使用的药物组合物可包括无菌水溶液(水溶性的)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、CREMOPHOR EL^TM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，用于肠胃外给药的组合物必须是无菌的并且应该是易于注射的程度的流体。它应该在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。

无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物掺入适当的溶剂中，根据需要与上面列举的成分中的一种或组合，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，典型的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，其可以从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。为了口服治疗给药的目的，可以将活性化合物与赋形剂混合并以片剂、锭剂或胶囊(例如明胶胶囊)的形式使用。口服组合物也可以使用流体载体制备，用作漱口水。可以包含药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有下列任何成分或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖、崩解剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷，水杨酸甲酯或橙子调味剂。

对于吸入给药，化合物可以以气溶胶喷雾的形式从加压容器或分配器输送，该容器或分配器含有合适的推进剂，例如气体如二氧化碳，或喷雾器。这些方法包括在美国专利号6,468,798中描述的。

如本文所述的治疗化合物的全身施用还可以通过透粘膜或透皮/局部方式。对于透粘膜或透皮/局部给药，在制剂中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域已知的，并且包括例如用于经粘膜给药、去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。透粘膜给药可以通过使用鼻喷雾剂或吸入剂来完成。对于透皮/局部给药，将活性化合物配制成本领域公知的粉末、溶液、软膏、洗剂、凝胶、贴剂、糊剂、油膏或乳膏。活性化合物可以在无菌条件下与药学上可接受的载体混合，并与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。在一个实施方案中，透皮给药可以通过离子电渗疗法进行。

引入方法也可由可再充电或可生物降解的装置提供。近年来，已经开发并测试了各种缓释聚合物装置，用于药物的受控递送，包括蛋白质生物药物。多种生物相容性聚合物(包括水凝胶)，包括可生物降解和不可降解的聚合物，可用于形成用于在特定靶位点持续释放化合物的植入物。

本技术考虑在任何上述药物组合物和制剂中配制胰岛素-Fc融合蛋白。此外，本技术考虑通过任何前述给药途径给药。本领域技术人员可基于所治疗的病症和所治疗患者的总体健康状况、年龄和大小来选择合适的制剂和给药途径。

有效剂量

任何治疗剂的剂量、毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定，例如，用于测定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的人群中具有治疗效果的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且可以表示为LD50/ED50比。表现出高治疗指数的化合物是有利的。虽然可以使用表现出毒副作用的化合物，但应当注意设计将这些化合物靶向受影响组织部位的递送系统，以便最小化对未受影响细胞的潜在损害，从而减少副作用。

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的一系列剂量。这些化合物的剂量可以在包括ED50的循环浓度范围内，毒性很小或没有毒性。剂量可以在该范围内变化，这取决于所用的剂型和所用的给药途径。对于方法中使用的任何化合物，最初可以从细胞培养测定估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以达到循环血浆浓度范围，其包括在细胞培养中测定的IC₅₀。这些信息可用于准确地确定人体中的有用剂量。例如，可以通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。

可改变本文所述药物组合物中胰岛素-Fc融合蛋白的实际剂量水平，以获得有效对特定患者、组合物和给药方式实现所需的治疗或预防反应，而对患者无毒。

选择的剂量水平取决于多种因素，包括所用特定胰岛素-Fc融合蛋白(或其酯、盐或酰胺)的活性、给药途径、给药时间、使用的特定胰岛素-Fc融合蛋白的排泄速率、治疗持续时间、与所用特定胰岛素-Fc融合蛋白组合使用的其他药物、化合物和/或材料、疾病或病症的严重程度、先前的治疗、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域中众所周知的相似因素。此外，用治疗或预防有效量的本文所述药物组合物治疗受试者可包括单次治疗或一系列治疗。

本领域普通技术人员可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医生可以以低于所需水平的水平开始药物组合物中使用的胰岛素-Fc融合蛋白的剂量，以达到所需的治疗或预防效果，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。当胰岛素-Fc融合蛋白作为药物施用于受试者时，其可以本身给药或作为含有例如0.1-99.5％(或0.5-90％)活性成分的药物组合物与药学上可接受的载体组合给药。

通常，胰岛素-Fc融合蛋白的合适日剂量是胰岛素-Fc融合蛋白的量，其是有效产生治疗效果的最低剂量。这种有效剂量通常取决于上述因素。通常，有效量的本文公开的一种或多种胰岛素-Fc融合蛋白足以实现治疗或预防效果，范围为每天每千克体重约0.000001mg至每天每千克体重约10,000mg。适当地，剂量范围为每天每千克体重约0.0001mg至每天每千克体重约100mg。例如，剂量可以是每天1mg/kg体重或10mg/kg体重，每两天或每三天或每周1-10mg/kg，每两周或每三周一次。在一个实施方案中，单剂量的治疗化合物的范围为0.001-10,000微克/kg体重。在一个实施方案中，载体中的一种或多种胰岛素-Fc融合蛋白浓度范围为每递送毫升0.2至2000微克。示例性治疗方案需要每天施用一次或每周施用一次。在治疗应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量，直到疾病进展减少或终止，或直到受试者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可以给患者施用预防方案。在一些实施方案中，治疗有效量的一种或多种胰岛素-Fc融合蛋白可定义为靶组织处胰岛素-Fc融合蛋白的浓度为10^-32至10^-6摩尔，例如约10^-7摩尔。该浓度可通过0.001至100mg/kg的全身剂量或体表面积的等效剂量递送。剂量方案将被优化以维持靶组织的治疗浓度，例如通过每日或每周一次给药，但也包括连续给药(例如，肠胃外输注或透皮应用)。

通常，患者的胰岛素-Fc融合蛋白的静脉内和皮下剂量范围为每天每千克体重约0.0001至约100mg，例如，约0.0001-约0.001mg/kg/天、约0.001-约0.01mg/kg/天、约0.01-约0.1mg/kg/天、约0.1-约1mg/kg/天、约1-约10mg/kg/天、或约10-约100mg/kg/天。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白以大于或等于60nmol/kg/天的剂量施用。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白以大于或等于75nmol/kg/天、大于或等于100nmol/kg/天、大于或等于150nmol/kg/天或大于或等于200nmol/kg/天的剂量施用。在某些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白以大于或等于1mg/kg/天的剂量施用，例如2mg/kg/天、4mg/kg/天、8mg/kg/天、16mg/kg/天、32mg/kg/天、64mg/kg/天、100mg/kg/天、200mg/kg/天或更高。

胰岛素-Fc融合蛋白可以以约100mg/mL或更低的浓度存在(例如，100mg/mL或更低、例如、90mg/mL、80mg/mL、70mg/mL、60mg/mL、50mg/mL、40mg/mL、30mg/mL、20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mLmL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.01mg/mL或更低)。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白以约0.25mg/mL至约1mg/mL的浓度存在，例如，约0.25mg/mL、约0.5mg/mL(例如，0.5mg/mL)、约0.75mg/mL、或约1mg/mL。

如果需要，胰岛素-Fc融合蛋白的有效日剂量可以作为两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量施用，在一天中以适当的间隔分开施用，任选地，以单位剂型。在一些实施方案中，每天一次施用胰岛素-Fc融合蛋白。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白每周施用至少两次。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白每周至少施用一次。在某些实施方案中，每周两次施用胰岛素-Fc融合蛋白。

胰岛素-Fc融合蛋白可以原样施用或与药学上可接受的和/或无菌载体混合施用，也可以与抗微生物剂如青霉素、头孢菌素、氨基糖苷和糖肽一起施用。因此，联合治疗包括以下述方式顺序，同时和单独施用胰岛素-Fc融合蛋白，使得在施用后续治疗时仍可检测到第一次施用的治疗的治疗或预防效果。

联合治疗

在一些实施方案中，本文公开的一种或多种胰岛素-Fc融合蛋白可以与一种或多种另外的疗法组合用于预防或治疗自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)。

在任何情况下，多种治疗剂可以以任何顺序或甚至同时施用。如果同时，多种治疗剂可以以单一、统一的形式或以多种形式提供(仅作为示例，作为单个药丸或作为两个单独的药丸)。一种治疗剂可以多剂量给药，或者两者都可以多剂量给药。如果不同时，多次剂量之间的时间可以从超过零周到不超过四周。此外，组合方法、组合物和制剂不限于仅使用两种试剂。

在一些实施方案中，所述至少一种另外的疗法以包含与本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白的组合的制剂施用，以治疗或预防自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)。在某些实施方案中，所述至少一种另外的疗法与本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白同时施用。在某些实施方案中，所述至少一种另外的疗法与本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白相继(在不同的时间)施用。在一个实例中，所述至少一种另外的疗法与本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白分开约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约1.5小时、约2小时、约4小时、约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约3周、约4周施用。所述至少一种另外的疗法可以或可以不通过与胰岛素-Fc融合蛋白相同的途径施用。在一个实例中，胰岛素-Fc融合蛋白可以以一种方式(例如，静脉内或皮下)施用，而至少一种另外的疗法可以以另一种方式(例如，口服)单独施用。

在一些实施方案中，所述至少一种另外的疗法是胰岛素敏化剂。胰岛素敏化剂(例如双胍类(例如二甲双胍)和格列酮类(例如罗格列酮和吡格列酮))通过增加受试者对给定量的胰岛素(或胰岛素类似物)的反应来起作用。因此，与未接受所述胰岛素增敏剂的患者相比，接受胰岛素增敏剂的患者可能需要较低剂量的本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白。因此，在某些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白与胰岛素敏化剂组合施用于受试者。在一些实施方案中，胰岛素-Fc融合蛋白可以在不存在胰岛素增敏剂所需的标准剂量的约95％下施用，例如，在不存在胰岛素增敏剂时所需的标准剂量的约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％或更低。

在一些实施方案中，施用至少一种另外的疗法以防止自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)或其症状的完全发作，并且并导致维持至少约90％的β细胞量(与健康受试者比较)。在一些实施方案中，施用所述至少一种另外的疗法以预防自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的完全发作，并导致维持至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约10％、或至少约5％的β细胞质量(与健康受试者比较)。在一些实施方案中，将胰岛素-Fc融合蛋白与预防自身免疫疾病症状(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的疗法组合施用于受试者，并导致维持至少约90％的β细胞量(与健康受试者比较)。在一些实施方案中，将胰岛素-Fc融合蛋白与预防自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)症状的疗法组合施用于受试者，并导致维持至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约10％、或至少约5％的β细胞量(与健康受试者比较)。

在一些实施方案中，施用至少一种另外的疗法以防止自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)或其症状的完全发作，并导致维持至少约90％的内源性C肽水平(与健康受试者比较)。在一些实施方案中，施用所述至少一种另外的疗法以预防自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)或其症状的完全发作并且导致维持至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约10％或至少约5％的内源性C肽水平(与健康受试者比较)。在一些实施方案中，将胰岛素-Fc融合蛋白与预防自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)症状的疗法组合施用于受试者并导致维持至少约90％的内源性C肽水平(与健康受试者比较)。在一些实施方案中，将胰岛素-Fc融合蛋白与预防自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的症状的疗法组合施用于受试者，并导致至少维持至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约10％或至少约5％的内源性C肽水平(与健康受试者比较)。

试剂盒

本公开还提供了用于预防和/或治疗自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的试剂盒，其包含一种或多种本文所述的胰岛素-Fc融合蛋白。任选地，本技术的试剂盒的上述组分包装在合适的容器中并标记用于预防和/或治疗自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)。

上述组分可以储存在单位或多剂量容器中，例如密封的安瓿、小瓶、瓶子、注射器和试管，作为含水的，优选无菌的溶液或作为冻干的，优选无菌的用于重构的制剂。所述试剂盒可进一步包含第二容器，其容纳适于将药物组合物稀释至更高体积的稀释剂。合适的稀释剂包括但不限于药学组合物的药学上可接受的赋形剂和盐溶液。此外，试剂盒可包含用于稀释药物组合物的说明书和/或用于施用药物组合物的说明书，无论是否稀释。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料，并且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可以由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述试剂盒可进一步包含更多容器，所述容器包含药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器、用于一种或多种合适宿主的培养基。试剂盒可任选地包括通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于例如适应症、用法、剂量、制造、施用、禁忌症和/或关于使用此类治疗剂或产品的警告的信息。

试剂盒还可包含例如缓冲剂、防腐剂或稳定剂。该试剂盒还可以含有对照样品或一系列对照样品，可以对其进行测定并与测试样品进行比较。试剂盒的每个组分可以封装在单独的容器中，并且所有各种容器可以在单个包装内，以及解释使用试剂盒进行的测定结果的说明。本技术的试剂盒可以在试剂盒容器上或容器容器中包含书面产品。书面产品描述了如何使用试剂盒中包含的试剂。在某些实施方案中，可以根据本技术的方法使用试剂。

实施方案

通过以下实施方案进一步说明本技术，这些实施方案不应被解释为以任何方式进行限制。

实施方案1：在HEK293细胞中制备胰岛素-Fc融合蛋白的合成和方法

胰岛素-Fc融合蛋白如下合成。使用专有软件(LakePharma，Belmont，CA)构建目的基因序列，并将其克隆到高表达哺乳动物载体中。在转染前24小时将HEK293细胞接种在摇瓶中，并使用无血清化学成分确定的培养基培养。使用Syd Labs(Natick，MA)标准操作程序将编码目的胰岛素-Fc融合蛋白的DNA表达构建体瞬时转染到2L HEK293细胞悬浮液中用于瞬时转染。20小时后，计数细胞以确定活力和活细胞计数，并通过 (PallFortéBio LLC,Fremont,CA)测量滴度。在整个瞬时转染生产运行中进行了额外的读数。在第5天或之后收获培养物。

如表1中所示，在HEK293细胞中合成的本发明技术的示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；和SEQ ID NO:8)显示出比不含'AAK'C链序列的其他胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：9和SEQID NO：10)显着更高的滴度。

实施方案2：在CHO细胞中制备胰岛素-Fc融合蛋白的合成和方法

CHO细胞系最初源自CHO-K1(LakePharma，Belmont，CA)，并且使用本领域已知的方法通过重组技术敲除内源谷氨酰胺合成酶(GS)基因。设计稳定表达DNA载体并针对CHO表达和GS选择进行优化，并将其整合到高表达哺乳动物载体(LakePharma，Belmont，CA)中。在开始放大实验之前确认每个完成的构建体的序列。将悬浮CHO细胞在潮湿的5％CO₂培养箱中于37℃在化学成分确定的培养基(CD OptiCHO^TM；Invitrogen,Carlsbad,CA)中培养。没有血清或其他动物来源的产物用于培养CHO细胞。

在指数生长期生长在CD OptiCHO^TM培养基中，使用具有80μgDNA的系统(MaxCyte，Inc.，Gaithersburg，MD)通过电穿孔转染大约8,000个悬浮适应的CHO细胞，以为每种胰岛素-Fc融合蛋白(DNA构建体含有胰岛素-Fc融合蛋白的全长序列)创建稳定的CHO细胞系。二十四小时后，对转染的细胞进行计数并置于选择下以稳定整合胰岛素-Fc融合基因。将转染的细胞接种到含有100μM甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)的CD OptiCHO^TM选择培养基中，在摇瓶中以0.5×10 ⁶个细胞/mL的细胞密度，并在37℃下用5％CO₂温育。在选择过程中，将细胞离心并每2-3天重悬于新鲜的选择培养基中，直至培养基恢复其生长速率和活力。监测细胞培养物的生长和滴度。

细胞生长至每毫升2.5×10⁶个细胞。在收获细胞库时，活力高于95％。然后将细胞离心，并将细胞沉淀重悬浮于含有7.5％二甲基亚砜(DMSO)的CD OptiCHO^TM培养基中至每孔每瓶15×10 ⁶个细胞的细胞计数。将小瓶冷冻保存在液氮中。

使用CHO细胞如下进行小规模生产。将细胞按比例放大，在37℃下含有100μMSMSX的CD OptiCHO^TM生长培养基中生产，并根据需要每2-4天喂养一次，CD OptiCHO^TM生长培养基补充葡萄糖和必要的其他氨基酸，大约14-21天。通过离心纺丝澄清从稳定池生产运行中收获的条件培养基上清液。将蛋白质在蛋白A(MabSelect，GE Healthcare，Little Chalfont，United Kingdom)柱上运行，并使用pH梯度洗脱。使用0.2μM膜过滤器进行过滤。

任选地将细胞系进一步亚克隆至单克隆，并任选地使用有限稀释方法进一步选择高滴度胰岛素-Fc-融合蛋白表达克隆，这是本领域技术人员已知的方法。在获得高滴度、单克隆胰岛素-Fc融合蛋白表达细胞系后，如上所述在不含MSX的生长培养基中或任选地在含有MSX的生长培养基中完成胰岛素-Fc融合蛋白的产生，以获得含有重组CHO制备的胰岛素-Fc融合蛋白的细胞培养上清液。

实施方案3：胰岛素-Fc融合蛋白的纯化

如下进行胰岛素-Fc融合蛋白的纯化。从瞬时或稳定转染的HEK或CHO生产运行中收获含有分泌的胰岛素-Fc融合蛋白的条件培养基上清液，并通过离心澄清。将含有所需胰岛素-Fc融合蛋白的上清液在蛋白A柱上运行，并使用低pH梯度洗脱。然后，合并洗脱的所需蛋白质级分并将缓冲液交换到200mM HEPES、100mM NaCl、50mM NaOAc、pH7.0缓冲液中。使用0.2μm膜滤器进行最终过滤步骤。从280nm处的溶液光密度计算最终蛋白质浓度。必要时，通过离子交换色谱、凝胶过滤色谱或其他方法进行进一步任选的纯化。蛋白A柱纯化后获得的滴度结果(mg/L)显示在图2中。

实施方案4：通过非还原和还原CE-SDS的结构确认

CE-SDS分析在GXII(Perkin Elmer，Waltham，MA)中在溶解于200mMHEPES、100mM NaCl、50mM NaOAc、pH 7.0缓冲液中的纯化胰岛素-Fc融合蛋白溶液中进行，并且绘制了电泳图。在非还原条件下，样品针对已知分子量(MW)蛋白质标准物运行，洗脱峰代表胰岛素-Fc融合蛋白同型二聚体的“表观”MW。

在还原条件下(使用β-巯基乙醇破坏胰岛素-Fc融合蛋白同源二聚体的二硫键)，将得到的胰岛素-Fc融合蛋白单体的表观MW与胰岛素-Fc融合蛋白同型二聚体的分子量的一半相比较，来作为一种确定胰岛素-Fc融合蛋白的结构纯度可能是正确的方法。

通过CE-SDS分析发现HEK293细胞中合成的胰岛素-Fc融合蛋白的非还原和还原主峰显示在表2中。通过CE-SDS分析发现在CHO细胞中合成的胰岛素-Fc融合蛋白的非还原和还原主峰显示在表3中，并且将得到的胰岛素-Fc融合蛋白单体的2×表观MW与胰岛素-Fc融合蛋白同源二聚体的分子量进行比较。表2和表3中的结果说明胰岛素-Fc融合蛋白的结构纯度可能是正确的。

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*DNS＝没合成

实施方案5：通过LC-MS除去糖链的序列同一性

为了通过质谱(MS)获得胰岛素-Fc质量的准确估计，首先处理样品以除去可能干扰MS分析的天然存在的聚糖。将溶解于200mM HEPES、100mM NaCl、50mM NaOAc、pH7.0缓冲溶液中的100μL2.5mg/mL胰岛素-Fc融合蛋白使用Zeba脱盐柱(Pierce,ThermoFisherScientific,Waltham,MA)首先缓冲交换到含有5mM EDTA的0.1M Tris、pH8.0缓冲液中。向该溶液中加入1.67μL的PNGase F酶(Prozyme N-聚糖酶)以除去融合蛋白中存在的N-连接的聚糖，并将混合物在37℃下在培养箱中温育过夜。然后通过LC-MS(NovaBioassays，Woburn，MA)分析样品，得到分子的分子量，其对应于没有聚糖的所需同型二聚体。然后进一步校正该质量，因为用于从天冬酰胺切割聚糖的酶促过程，也使天冬酰胺侧链脱氨基形成天冬氨酸，并且这样做，酶处理的同型二聚体总体上获得2Da，对应于同型二聚体中存在的每个链的质量为1Da。因此，实际分子量是测得的质量减去2Da，以校正分析样品中胰岛素-Fc融合蛋白结构的酶促修饰。表4中显示了示例性胰岛素-Fc融合蛋白的LC-MS分子量数据、校正质量数据和理论分子量(通过Expasy MW/pI工具获得)。

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实施方案6：通过尺寸排阻色谱法测定％同型二聚体(SEC-HPLC)

胰岛素-Fc融合蛋白的尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)使用Waters 2795HT HPLC(Waters Corporation，Milford，MA)进行，所述HPLC连接至Waters2998光电二极管阵列，波长为280nm。将100μL或更少的含有感兴趣的胰岛素-Fc融合蛋白的样品注射到以0.2mL/分钟流速操作的MAbPac SEC-1,5μm、4×300mm柱(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)中，流动相包含50mM磷酸钠、300mM NaCl和0.05％w/v叠氮化钠、pH6.2。MAbPac SEC-1色谱柱的工作原理是分子大小分离。因此，较大的可溶性胰岛素-Fc聚集体(例如胰岛素-Fc融合蛋白同型二聚体的多聚体)在较早的保留时间洗脱，而非聚集的同型二聚体在较晚的保留时间洗脱。在通过分析型SEC-HPLC从聚集的多聚体同源二聚体分离同源二聚体的混合物时，确定胰岛素-Fc融合蛋白溶液的纯度，以非聚集的同源二聚体的百分比表示。图3显示了在HEK293细胞和CHO细胞中制备的胰岛素-Fc融合蛋白的同二聚体百分比。图3表明，当在HEK293和CHO细胞中的一种或两种中制备时，本技术的胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；和SEQ ID NO:8)显示出相对高的同二聚体％。相反，当在HEK293细胞中制备时，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10显示相对低的同型二聚体％。

实施方案7：胰岛素-Fc融合蛋白的生物素缀合物

如下将胰岛素-Fc融合蛋白与生物素缀合：将1mL在PBS中pH7.4的0.5mg/mL的胰岛素-Fc融合蛋白加入装有磁力搅拌棒的小瓶中。另外，在二甲基亚砜(DMSO)中制备30mM生物素酶抗性生物素-BR-PEG4-NHS试剂(Quanta BioDesign，Union County，Ohio)溶液。然后在将稀释的DMSO/水生物素试剂溶液加入胰岛素-Fc蛋白溶液之前，将一部分生物素试剂储备溶液在无缓冲的pH4.0去离子水中稀释10倍。在间歇搅拌下将一定量的稀释的生物素DMSO/水溶液分批加入到胰岛素-Fc蛋白溶液中，使得生物素试剂与胰岛素-Fc蛋白的摩尔比为1-100mol/mol。典型的生物素缀合反应将生物素试剂靶向胰岛素-Fc融合蛋白的摩尔比为12：1。使合并的生物素试剂-胰岛素-Fc融合蛋白溶液在室温(RT)下反应2小时或更长时间，之后使用Zeba^TM10mL、7kDa Pierce^TM离心柱(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)通过凝胶过滤除去未结合的生物素试剂和DMSO，得到无内毒素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。通过280nm处的吸光度确定溶液的最终浓度。

如下通过ELISA测定获得生物素缀合的证据。将胰岛素-Fc融合蛋白和非生物素化的小鼠IgG₁对照抗体在0.1M碳酸钠缓冲液中稀释至10μg/mL，并将100μL/孔的各溶液分别加入到96孔测定Nunc MaxiSorp^TM微孔板的孔中(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)，并在室温下孵育1小时以涂覆板孔。然后用含有0.1％v/v Tween-20(PBST)的PBS用洗板机(Winnoski,VT)洗涤板，并在在室温下用250μL/孔的Pierce^TMSuperBlock^TM(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)封闭孔表面1小时。然后将板用PBST洗涤，并将样品与100μL/孔分别与来自原液稀释在1：8000至1：15,000之间的链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物(Abcam，Cambridge，MA)一起温育。将板在室温下孵育1小时。然后用板式洗涤器用PBST洗涤板最后一次，然后再用2×去离子水洗涤。最后，将板与100μL/孔TMB(Life Technologies(ThermoFisher Scientific)，Carlsbad，CA)一起孵育适当的时间(通常5分钟)以使板显影，然后进行100μL/孔ELISA终止溶液(Boston BioProducts，Ashland，MA)。在SpectraMax190酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，California)上通过OD 450nm定量板的吸光度。成功的生物素缀合的胰岛素-Fc融合蛋白包被的孔通常表现出A450值，其具有1.5OD或更高的小于IgG₁未缀合对照或空白孔的OD50值。

实施方案8：体内药代动力学(PK)和药代动力学(PD)参数的测量

如下评估生物素缀合的胰岛素-Fc融合蛋白和未缀合的胰岛素-Fc融合蛋白的体内药代动力学。将每组N＝4只balb/c小鼠(The Jackson Laboratory(JAX)，Bar Harbor，ME)称重，并使用血糖仪(Abbott Laboratories，Abbott Park，Illinois)进行两次基线血糖测量，并且通过下颌下静脉收集一个基线血样用于后续血清分析。然后给小鼠腹膜内(i.p.)给予2mg/kg胰岛素-Fc融合蛋白。在t＝0和t＝21天之间的间隔内进行血糖测量和用于血清分析的血液收集。使血液凝固，并在离心凝结的样品后，获得血清并立即在聚丙烯96孔板中冷冻并储存在-20℃直至进行分析。用重组人胰岛素(RHI)(Sigma-AldrichCorporation，ST.Louis，MO)进行单独的对照实验，以证明胰岛素-Fc融合蛋白与RHI对照组的葡萄糖降低活性的差异。

基于ELISA的PK测定。如下通过ELISA分析获得药代动力学数据。将96孔NuncMaxiSorp^TM平板(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)用10μg/mL的Pierce^TMNeutrAvidin^TM(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)在室温下包被1小时，然后洗涤平板并用250μL/孔的Pierce^TMSuperBlock^TM(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)在4℃下封闭过夜。接下来，在分开的孔中，将100μL稀释的体内血清样品(通常2-200×稀释因子或更多)和在PBST/SB中具有已知浓度的生物素缀合的胰岛素-Fc融合蛋白标准品加载到板上以构建标准曲线(3μl连续稀释)并在室温下孵育1小时。使用平板洗涤器(Winnoski,VT)洗涤平板，并将100μL适当的第二抗体兔抗人IgG(H+L)-HRP(Bethyl Laboratories,Montgomery,TX)从原液1：10,000稀释到PBST/SB中，加入板中并在室温下温育1小时。使用洗板机洗涤板，并将100μlTMB溶液(Life Technologies(ThermoFisher Scientific)，Carlsbad，CA)加载到板的每个孔中。一旦培养板培养适当的时间，就向每个孔中加入100μL终止溶液(Boston BioProducts，Ashland，MA)。在SpectraMax 190酶标仪(MolecularDevices，Sunnyvale，California)上在OD450nm处读取平板，通过比较稀释血清样品的OD450nm与标准品获得的OD450nm曲线，获得血清中生物素结合的胰岛素-Fc浓度。然后通过Prism(GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA)分析数据，如下面进一步描述的。

根据制造商的方案和制造商的标准曲线，使用Mercodia小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Mercodia,Uppsala,Sweden)检测胰岛素-Fc融合蛋白的胰岛素原部分，任选地获得药代动力学数据，以报告小鼠胰岛素等效单位血清样品中胰岛素-Fc蛋白浓度的变化。确定每个样品的浓度，然后乘以它们的稀释因子并通过Excel(Microsoft,Seattle,WA)和Prism(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)软件分析以计算C max、t max、AUC和末期消除速率(半衰期)。

图4A示出了在示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)腹膜内给药后，以ng/mL为单位的血清浓度与时间的关系，以天为单位。如图4A所示，测试的胰岛素-Fc融合蛋白的血清半衰期为约1天。

空腹血糖(％FBGL)测量的结果表明，没有观察到测试的生物素缀合的胰岛素-Fc融合蛋白的葡萄糖降低活性。参见图4B。

实施方案9：测定人血清样品中胰岛素自身抗体(IAAs)的结合亲和力

胰岛素-Fc融合蛋白与循环人血清胰岛素自身抗体(IAAs)的结合亲和力如下测定。该测定用作胰岛素-Fc融合蛋白与IAA起源的胰岛素⁺B细胞的亲和力的代表，因为抗体是哺乳动物中B细胞受体的分泌形式。将来自糖尿病前期IAA阳性受试者(Barbara Davis儿童糖尿病中心)的人血清样品在体外与放射性标记的胰岛素和连续稀释浓度的未标记的重组人胰岛素(RHI)或胰岛素-Fc融合蛋白(例如，SEQ ID NO：3)混合以测量¹²⁵I-放射性标记的RHI与IAA结合的抑制。在室温下孵育混合物1小时后，将混合物加入到抗人IgG珠子的悬浮液中(CaptureSelect，GE Healthcare，Little Chalfont，United Kingdom)。洗涤珠子，并使用闪烁计数器(γ辐射计数器)分析所得珠子。RHI对照或胰岛素-Fc融合蛋白与人血清IAA的强结合抑制IAA与¹²⁵I标记的胰岛素的结合，从而导致较低的γ辐射计数。RHI对照或胰岛素-Fc融合蛋白的较弱结合导致更高的γ计数。该数据用于构建结合曲线并使用Prism(GraphPad Software，La Jolla，CA)分析以确定抑制50％的放射性标记的胰岛素与IAA结合的浓度(IC ₅₀)。如图5所示，对于汇集的糖尿病前期人IAA样品，SEQ ID NO：3胰岛素-Fc融合蛋白(IC₅₀＝10nM)与RHI(IC₅₀＝3nM)具有相似的亲和力，证明SEQ ID NO：3胰岛素-Fc融合蛋白可用于靶向受试者中的抗胰岛素B细胞克隆。

这些结果表明，本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白可用于治疗或预防自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的方法中。

实施方案10：体外减少抗胰岛素B细胞--125Tg NOD小鼠

为了评估本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白特异性地删除胰岛素⁺B细胞的能力，使用来自Akston Biosciences(Beverly,MA)培育的动物的125Tg NOD小鼠脾细胞和原代大鼠肺泡巨噬细胞(AMs，肺灌洗液)或小鼠巨噬细胞(来自骨髓的MMs)开发体外试验。收获脾脏，裂解红细胞，用Ficoll prep纯化脾细胞，得到纯化的T细胞和B细胞混合物。125Tg NOD模型的优点是大约50-80％的脾细胞是胰岛素⁺B细胞，这有利于实验测试。然后将纯化的脾细胞混合物与大鼠AMs或MMs在3天的时间内(～5×10⁵个脾细胞，每个96-微量滴定孔具有5×10⁴个AMs或MMs)与不同浓度的示例性胰岛素-Fc融合蛋白和对照共培养。温育后，重复洗涤细胞并在新鲜培养基中孵育过夜，以确保完全除去示例性胰岛素-Fc融合蛋白。然后收获细胞并用1μg抗B220-PE mAb、0.7μg抗IgM-PECy7mAb和5μLRHE-μBeads的混合物标记(使用RHI(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO)和NHS活化的微珠试剂盒制备)。接着，用抗-μBead-APC mAb(Miltenyi Biotec，Cambridge，MA)另外标记珠子。洗涤后固定细胞并通过FACS分析。

使用CellQuest Pro软件(BD Biosciences，San Jose，CA)在四色双激光流式细胞仪中进行FACS分析。活体淋巴细胞在FSC对比SSC分散中进行门控，并且在FL2对FL4点图中分析门控淋巴细胞，以使用象限统计来计数B220⁺B细胞和B220⁺胰岛素⁺B细胞(胰岛素特异性B细胞)。基于B220(-)胰岛素(-)群体水平和抑制对照样品(通过在标记细胞之前添加未标记的RHI来抑制)设定胰岛素⁺和胰岛素(-)群体的象限门控。还使用FL2对FL3点图中的抗IgM-PECy7的中值荧光强度(MFI)估计B细胞上的B细胞受体密度。

FACS分析的结果显示在图6A-6B中。B220是B细胞表面标志物，其允许定量多种细胞类型的混合物中的总B细胞。B220⁺是指用抗-B220-荧光团缀合物标记的细胞部分，其在流式细胞仪中结合并发荧光为B220⁺B细胞。Ins⁺是指结合在流式细胞仪中定量的所有类型的标记胰岛素(或胰岛素缀合的珠子)的细胞部分。通过评估Ins⁺和B220⁺分数，可以确定既是B细胞又能够结合胰岛素的细胞的百分比。

用SEQ ID NO：3去除靶细胞对B220⁺胰岛素⁺B细胞高度特异性，留下B220⁺胰岛素(-)B细胞(右下象限，图6A和6B)和B220(-)胰岛素(-)细胞群(左下象限，图6A和6B)与对照无法区分。SEQ ID NO：3介导的胰岛素⁺B细胞缺失的总剂量响应曲线描绘于图6C中。这些数据表明，示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)在80nM浓度下从共培养物中引起B220⁺胰岛素⁺B细胞减少>95％，并且该效果是剂量依赖性的，EC₅₀为约70pM。

实施方案11：体内减少抗胰岛素B细胞-VH125 NOD小鼠

使用示例性胰岛素-Fc融合蛋白、SEQ ID NO：3或载体对照制剂，通过在雄性和雌性VH125 NOD小鼠(每组N＝3-6只小鼠)中以0.4mg/kg每周两次腹膜内注射两周进行实验。给药两周后，在采血期间(下颌下静脉)使用异氟烷麻醉小鼠，然后进行二氧化碳窒息，并在无菌条件下收集淋巴结、骨髓和/或脾脏。如实施方案12-13中所述处理和分析血液和脾脏样品。这些实验的结果如图7A-7H所示，显示了示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)在血液和脾脏中的VH125 NOD小鼠中去除胰岛素⁺B细胞同时保留胰岛素(-)B细胞群的能力。

实施方案12：体内减少抗胰岛素B细胞-全血分析(VH125 NOD小鼠)

开发了用于分析在用本文所述的示例性胰岛素-Fc融合蛋白处理后从VH125 NOD小鼠收集的外周血中的胰岛素特异性B细胞的程序。通过下颌下(SMD)静脉穿刺将5mL微量离心机与2mL 2mM EDTA/HBSS/庆大霉素一起从处理小鼠中收集大约200-400μL血液，立即通过倒置混合以防止凝结。然后将管以500×g离心7分钟，并用5mL HBSS/肝素缓冲液以500×g洗涤两次，持续7分钟。将血小球重新悬浮于含有肝素的完全IMDM培养基(10％FBS，5mg/mL庆大霉素和2-ME)中，并在37℃下在10孔板中孵育过夜，以允许B细胞受体(BCR)的转换，使得它们从体内实验中存在的任何内源性小鼠胰岛素或任何残留的胰岛素-Fc融合蛋白中解脱出来。然后将血细胞收集到5mL管中，以500×g离心7分钟，将细胞沉淀重悬于5mL RBC-Lysis缓冲液中并在室温下保持5分钟。在裂解RBC后，用HBSS/2％FBS以500×g洗涤白细胞两次7分钟，最后悬浮于100μL含有10μL小鼠FcR块(Miltenyi Biotech,Cambridge,MA)、1μgmAb大鼠抗小鼠B220-Alexa488(/>San Diego,CA)、0.7μg大鼠抗小鼠IgM-PE/Cy7mAb和100当量体积(12.5μL)RHI缀合的微珠(Miltenyi Biotech，Cambridge，MA)的冷FACS染色培养基中，并在4℃下保持30分钟。通过加入2mL冰冷的FACS洗涤缓冲液洗涤血细胞一次，并以500×g离心7分钟。最后，将细胞用6μL抗μBead-APC(MiltenyiBiotech，Cambridge，MA)在100μLFACS染色缓冲液中于4℃标记20分钟，用2mL FACS洗涤缓冲液洗涤一次，并重悬于150μL2％多聚甲醛缓冲液中用于FACS分析。对于VH125转基因小鼠，由于血液中胰岛素特异性B细胞的低频率，在FACS分析之前进行任选的富集程序。对于富集程序，需要约500-600μL血液，这需要汇集给定治疗组的N＝3或更多个体小鼠血液样品。将血液标记程序与实施方案12中描述的胰岛素特异性B细胞富集方案组合。固定和洗涤步骤后的标记血细胞可以在FACS分析之前使用如上所述的MS柱富集VH125 NOD脾细胞。

图7A是显示血液中胰岛素⁺B细胞占载体处理对照的百分比的图。图7B是显示血液中胰岛素(-)B细胞占对照的百分比的图。从图7A和图7B可以看出，示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)显着减少Ins⁺B细胞，而不显着减少Ins(-)B细胞(*意味着结果具有统计学意义，p值≤0.05(学生t检验)，ns表示结果无统计学意义，p值>0.05(学生t检验))。

实施方案13：体内减少抗胰岛素B细胞-脾脏分析(VH125 NOD小鼠)

从小鼠脾细胞中富集胰岛素特异性B细胞用于FACS分析。该方法可用于分析来自VH125 NOD小鼠的新鲜分离的脾细胞中的胰岛素特异性B细胞。由于VH125 NOD小鼠中胰岛素特异性B细胞的频率是所有B细胞的2-5％，因此使用磁激活细胞分选(MACS)柱富集程序用于富集总脾细胞中的胰岛素特异性B细胞，以正确定量体内胰岛素特异性B细胞减少的程度。对于每个富集程序，大约标记～10×10⁶个脾细胞。当新鲜分离的VH125 NOD脾细胞富集时，将细胞与完全培养基(含有10％FBS的IMDM或DMEM培养基，5mg/mL庆大霉素和2-巯基乙醇)在37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜，以允许B细胞受体(BCR)的更新，使得它们不含任何内源性小鼠胰岛素或体内实验中存在的任何残留的胰岛素-Fc融合蛋白。将细胞收获到15mL管中，通过用2.5ml Ficoll底层细胞纯化Ficoll，并以800×g离心15分钟。

用HBSS/2％FBS缓冲液以500×g洗涤两次10分钟后，将细胞重悬于250μLFACS染色缓冲液(HBSS/2mM EDTA/0.1％叠氮化钠加4％马血清)中并保持在4℃封锁20-30分钟。计数细胞并调节至250μL体积的10⁷个细胞。细胞用3.5μgmAb大鼠抗小鼠B220-Alexa488(BioLegend)、2.5μg大鼠抗小鼠IgM-PE/Cy7mAb、1.6μgBV510-抗小鼠CD23、0.7μgBV421-抗小鼠CD21、1.6μgPE-抗小鼠CD43和200ng当量(25μL)RHI-缀合的微珠(如上所述)标记，在4℃下保持30分钟。通过加入5mL冰冷的FACS洗涤缓冲液洗涤细胞一次，并以500×g离心7分钟。然后将细胞重悬于含有10μL抗-μBead-APC(Miltenyi Biotec，Cambridge，MA)的100μLFACS染色缓冲液中，在4℃下保持20分钟，并用2-4mL冰冷的FACS洗涤缓冲液洗涤一次，在500×g持续7分钟。然后将细胞用200mL 21％新鲜制备的超纯多聚甲醛在室温下固定5分钟。固定后，用FACS洗涤缓冲液洗涤细胞两次，最后重悬于600μLMACS缓冲液(HBSS/0.5％马血清/0.1％叠氮化物/2mM EDTA)中。将MS柱(Miltenyi Biotec，Cambridge，MA)置于磁力分离器中，用500μLMACS缓冲液洗涤一次，然后将细胞悬浮液加入柱中以通过。保留大约100μL标记的细胞悬浮液而不通过MS柱用于分析未富集的总细胞。然后用3×500μlMACS缓冲液洗涤MS柱三次。然后通过从磁体中移除柱子，加入1mL MACS缓冲液并使用提供有MS柱的柱塞将它们插入1.8mL微量离心管中来洗脱柱中保持的微珠标记的胰岛素特异性B细胞。然后将富集的细胞以500×g离心7分钟，并重悬于250μLMACS缓冲液中用于FACS分析。

图7C是描绘所有脾区室中的胰岛素⁺B细胞的图。如图7C所示，示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)显着减少所有脾区室中的胰岛素⁺B细胞(**表示p值≤0.01(统计学上显着))。

图7D显示边缘区脾区室中的胰岛素⁺B细胞(CD21^High CD23^High)。如图7D所示，示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)显着减少边缘区脾区室中的胰岛素⁺B细胞(*表示p值≤0.05(统计学上显着))。

图7E显示了滤泡脾隔室中的胰岛素⁺B细胞(IgM^Mid CD21^Mid)。根据图7E，示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)显着减少了滤泡脾区室中的胰岛素⁺B细胞(*表示p值≤0.05(统计学上显着))。

图7F显示T1脾脏区室中的胰岛素⁺B细胞(CD21^LowCD23^Low)。如图7F所示，示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)显着减少T1脾区室中的胰岛素⁺B细胞(*表示p值≤0.05(统计学上显着))。

图7G显示T2脾隔室中的胰岛素⁺B细胞(IgM ^High CD21^Mid)。根据图7G，示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)在T2脾区室中具有显着减少的胰岛素⁺B细胞(*表示p值≤0.05(统计学上显着))。

图7H显示了边缘前区脾区室中的胰岛素⁺B细胞(IgM ^High CD21^High)。如图7G所示，示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)显着减少了边缘区脾区室中的胰岛素⁺B细胞(*表示p值≤0.05(统计学上显着))。

这些结果表明，本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白可用于治疗或预防自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的方法中。实施方案14：体内减少抗胰岛素B细胞-骨髓分析(VH125 NOD小鼠)

样品处理和富集(骨髓)。进行类似于实施方案11中所述的体内实验，除了在这种情况下，测试制品每周两次从6周龄到34周龄给药。在进行实施方案11中描述的体内实验后，从周围的肌肉和肌腱切下VH125 NOD胫骨和股骨。使用无菌手术刀从骨头上刮下肌肉和组织碎片后，将骨头用70％异丙醇洗涤一次并用无菌PBS洗涤两次。用无菌剪刀切割每个骨的两端，通过插入填充在20mL注射器中的大约8-10mL无菌HBSS/2％FBS缓冲液并通过骨的一端插入25G针来冲洗骨髓。将骨髓悬浮液通过20μm细胞过滤器过滤，然后以500×g离心10分钟。吸出上清液后，使用RBC裂解缓冲液在室温下裂解红细胞5分钟，然后用HBSS/2％FBS缓冲液洗涤两次。将骨髓细胞悬浮液重悬于完全培养基中(DMEM，5％BSA，1mM丙酮酸钠，50μg/mL庆大霉素，5×10^-5Mβ巯基乙醇)并在37℃温育过夜以允许BCR转换。在孵育期结束时，使用Ficoll密度梯度分离从碎片中清除骨髓单核细胞。

然后将细胞悬浮于FACS染色缓冲液(PBS，2％BSA，0.1％叠氮化钠)和Fc Block(Mitenyi Biotech，Cambridge，MA)中。将生物素化的胰岛素和其他B细胞标记物加入到冰上的细胞中。30分钟后，洗涤细胞并重悬于含有2％PFA的HBSS缓冲液中。再次洗涤细胞，并完成在具有链霉抗生物素蛋白-647的FACS染色缓冲液中的后续染色步骤。然后使用Miltenyi抗/>647微珠(Miltenyi Biotec，Cambridge，MA)进行任选的阳性富集步骤(根据制造商的方案)。使用BD FACSCalibur^TM(BD Biosciences,San Jose,CA)通过门控高MFI胰岛素⁺B细胞获得样品。使用单一染色对照设定电压和补偿。使用FlowJo软件(FlowJo，LLC，Ashland，OR)分析数据。

来自研究第34周的骨髓分析在图8A中示出，其显示在用SEQ ID NO：3处理后雄性和雌性VH125小鼠中抗胰岛素B细胞的显着减少。

实施方案15：体内减少抗胰岛素B细胞-淋巴结分析(VH125 NOD小鼠)

进行实施方案14的体内实验，并且以与先前针对脾细胞描述的程序类似的方式处理和收集淋巴结和所得淋巴结细胞悬浮液，不同之处在于对于给定的动物，将2至4个淋巴结汇集在一起作为一个样品，并且不进行Ficoll纯化和没有裂解缓冲步骤。以与上述骨髓细胞悬浮液所述类似的方式标记所得淋巴结细胞悬浮液。来自研究第34周的淋巴结分析在图8B中描绘，其显示在用SEQ ID NO：3处理后雄性和雌性VH125小鼠中抗胰岛素B细胞的显着减少。

实施方案16：T细胞活化测定-单一浓度

通过测量5KC-3-4小鼠IAg7T细胞杂交瘤与胰岛素B链表位(胰岛素B链上的9至23位)的反应性T细胞受体(TCR)的IL-2分泌来评估胰岛素-Fc融合蛋白激活T细胞的能力。从125Tg NOD脾中分离胰岛素特异性B细胞用作抗原呈递细胞。无菌分离脾脏，并在含有2％FBS的无菌缓冲液中分离细胞，通过40μm无菌细胞过滤器过滤。使用ACK裂解缓冲液(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)裂解红细胞，然后用无菌缓冲液中的2％FBS洗涤两次。根据制造商的说明，使用无接触B细胞分离试剂盒从脾细胞混合物中分离B细胞(Mouse Pan B Cell Isolation Kit II,Miltenyi Biotec,Cambridge,MA)。然后将细胞用作抗原呈递细胞而不激活或固定。将5KC-3-4细胞和B细胞混合并分别以6.67×10⁶/mL和1.33×10⁷/mL重悬浮于FBS中。使用7kDa MWCO Zeba旋转柱将测试化合物缓冲液交换到含有0.002％Tween-80 1mM丙酮酸55μMβ-巯基乙醇和庆大霉素的IMDM中，然后稀释至0.2mg/mL。作为阳性对照，在相同培养基中制备0.018mg/mL的重组人胰岛素(RHI)，使得RHI(MW～5.8kDa)在等摩尔浓度下与胰岛素-Fc融合蛋白进行比较(MW～63.5kDa)。将15μL细胞悬浮液(含有1×10⁵ 5KC-3-4和2×10⁵B细胞)和150μL测试化合物在96孔组织培养板中合并。在37℃下孵育过夜后，收集培养基并在4℃下以3500rpm离心5分钟。然后根据制造商的方案，通过小鼠IL-2Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)测定上清液的IL-2。

图9显示了以pg/mL表示的T细胞刺激实验(如IL-2分泌所示)ELISA的结果。图9证明一些胰岛素-Fc融合蛋白相对于5KC-3-4细胞表现出非常低或非刺激的行为(SEQ ID NO：3-T细胞刺激＝32pg/mL IL-2)，而一些胰岛素-Fc融合蛋白是T细胞刺激的(SEQ ID NO：5-T细胞刺激＝21,635pg/mL IL-2)。RHI对照也有些刺激(RHI-T细胞刺激＝5,503pg/mL IL-2)。

实施方案17：T细胞活化测定的抑制-多种浓度

将胰岛素B9-23反应性5KC-3-4T细胞与125Tg B细胞混合，其在测定中充当抗原呈递细胞。向该细胞悬浮液中加入固定浓度(10ng/mL)的胰岛素-Fc融合蛋白SEQ ID NO：5作为刺激对照，其与130至10,000ng/mL之间的各种连续稀释浓度的测试化合物预混合，并且将测定板在37℃温育过夜。测量IL-2分泌，并从数据确定IC ₅₀浓度。

该测定的更详细描述如下。从125Tg NOD脾中分离胰岛素特异性B细胞用作抗原呈递细胞。无菌分离脾脏，并在含有2％FBS的无菌缓冲液中分离细胞，通过40μm无菌细胞过滤器过滤。使用ACK裂解缓冲液(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)裂解红细胞，然后用无菌缓冲液中的2％FBS洗涤两次。根据制造商说明书(Mouse Pan B Cell Isolation KitII，Miltenyi Biotec，Cambridge，MA)，使用无接触B细胞分离试剂盒从脾细胞混合物中分离B细胞。然后将细胞用作抗原呈递细胞而不激活或固定。将5KC-3-4和125Tg B细胞分别以2.67×10⁶和3.6×10⁶细胞/mL重悬于40％FBS(无血清培养基)中。将测试化合物在含有1mM丙酮酸、125μMβ-巯基乙醇和0.002％吐温-80的IMDM中稀释至2×(20,000ng/mL)，并在相同的培养基中制备另外1:5连续稀释液。除了测试的胰岛素-Fc融合蛋白外，纯化的人IgG也用作非抑制性对照。将胰岛素-Fc融合蛋白SEQ ID NO：5在相同培养基中稀释至4×(10ng/mL)。将37.5μL细胞悬浮液(含有1×10⁵ 5KC-3-4和1.4×10⁵ 125Tg B细胞)、37.5μLSEQIDNO：5(或培养基)和75μL测试化合物(或培养基)在96孔组织培养板中混合。在37℃下孵育过夜后，收集培养基并在4℃下以3500rpm离心5分钟。然后根据制造商的方案，通过小鼠IL-2Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)测定上清液的IL-2水平。

图10显示在固定量的胰岛素特异性T细胞刺激化合物(SEQ ID NO：5)存在下竞争性抑制IL-2分泌的结果。表5显示了T细胞刺激化合物对IC₅₀的示例性胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3)和各种对比胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)和hIgG阴性对照(hIgG)诱导的IL-2分泌的竞争性抑制。较低的IC₅₀值表明更有效的IL-2分泌抑制剂。

表5显示，与SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10相比，SEQ ID NO：3显示出显着更大的T细胞活化抑制。不希望受理论束缚，认为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的C链(i)在体外降低它们与胰岛素⁺B细胞受体(mAb125)结合的能力(参见实施方案18)，和(ii)由于它们与B细胞受体的相对弱的相互作用，可能不能被125Tg B细胞有效地加工和呈递，因此与用SEQ IDNO：3观察到的相比，与SEQ ID NO：5共温育的胰岛素肽特异性T细胞的抑制作用减少。

实施方案18：体外胰岛素⁺B细胞缺失测定(125Tg NOD细胞)

为了评估本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白特异性地删除胰岛素⁺B细胞的能力，使用来自Akston Biosciences(Beverly,MA)培育的动物的125Tg NOD小鼠脾细胞和原代大鼠肺泡巨噬细胞(AMs，肺灌洗液)或小鼠巨噬细胞(来自骨髓的MM)开发体外试验。收获脾脏，裂解红细胞，用Ficoll prep纯化脾细胞，得到纯化的T细胞和B细胞混合物。125Tg NOD模型的优点是大约30-80％的脾细胞是胰岛素⁺B细胞，这有利于实验测试。然后将纯化的脾细胞混合物与大鼠AM或MM在3天的时间内(～5×10⁵个脾细胞，每个96-微量滴定孔具有5×10⁴个AMs或MMs)与不同浓度的示例性胰岛素-Fc融合蛋白和对照共培养。温育后，重复洗涤细胞并在新鲜培养基中孵育过夜，以确保完全除去示例性胰岛素-Fc融合蛋白。然后收获细胞并用1μg抗B220-PE mAb、0.7μg抗IgM-PECy7mAb和5μLRHE-μBeads(使用RHI(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis，MO)和使用标准试剂盒(Miltenyi Biotec，Cambridge，MA)的NHS活化微珠制备)混合物标记，然后用抗μBead-APC mAb(Miltenyi Biotec,Cambridge,MA)标记。洗涤后固定细胞并通过FACS分析。

使用CellQuest Pro软件(BD Biosciences，San Jose，CA)在四色双激光流式细胞仪中进行FACS分析。活体淋巴细胞在FSC对比SSC分散中进行门控，并且在FL2对FL4点图中分析门控淋巴细胞，以使用象限统计来计数B220⁺B细胞和B220⁺/胰岛素⁺B细胞(胰岛素特异性B细胞)。基于B220(-)胰岛素(-)群体水平和抑制对照样品(通过在标记细胞之前添加未标记的RHI来抑制)设定胰岛素⁺和胰岛素(-)群体的象限门控。还使用FL2对FL3点图中的抗IgM-PECy7的中值荧光强度(MFI)估计B细胞上的B细胞受体密度。

表6描述了所使用的定性评分方案。RHI用作阴性对照。

/>

图11显示了各种胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：2-10)在缺失胰岛素特异性125Tg B细胞中的有效性。如图11中所示，本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：2-8)在删除胰岛素特异性B细胞方面明显比SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10更有效(其含有较长的C肽链，即“AAAK”和“AAAAK”与“AAK”)。

实施方案19：胰岛素特异性B细胞受体结合ELISA

单克隆抗体mAb125(克隆AE9D6ATCC#HB-125)是125Tg转基因小鼠的表面IgM(B细胞受体)的可溶形式，因此可用于结合胰岛素或胰岛素-Fc融合蛋白以测量它们与胰岛素特异性B细胞受体的结合特性。使用裸鼠中的腹水产生体内制备mAb125，并使用本领域已知的方法通过蛋白G亲和层析纯化。将包被在ELISA板上的mAb125用于以竞争性抑制ELISA形式结合胰岛素-Fc融合蛋白的系列稀释液与固定量的生物素标记的重组人胰岛素(RHI)，以确定结合mAb125(替代B细胞受体(BCR))的相对效率，其通过其IC₅₀值量化(通过使用GraphPadPrism(GraphPad Software，La Jolla，CA)绘制数据并拟合得到的曲线计算)。96孔MaxiSorp板在室温(RT)下用10μg/mL mAb125包被超过1小时，然后用250μL/孔的SuperBlock封闭溶液(ThermoFisher，Waltham，MA)在4℃下洗涤并封闭过夜。制备8个连续稀释的胰岛素-Fc融合蛋白，范围为75μg/mL至34ng/mL，用于在含有0.1％Tween-80和10％v/v SuperBlock(PBST/SB10)的PBS缓冲液中测试。将120μL每种化合物的系列稀释液与6μL的1.5ng/mL生物素-RHI(20×)在1.2mL管中混合，并使用多通道移液器将100μL这些混合溶液快速加入到mAb125包被的板中。将板在室温下孵育1小时，然后使用洗板机(Biotek，Winooski，VT)洗涤以除去未结合的试剂。将100μL/孔1：20,000稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)加入孔中并孵育1小时。使用洗板器再次洗涤板，并将100μL/孔TMB溶液(Life Technologies，Carlsbad，CA)加入板中。5-15分钟后，通过向所有孔中加入100μLELISA终止溶液(Boston Bioproducts，Ashland，MA)终止显色。在酶标仪(SpectraMax190，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上在OD450nm处读板。OD值用于计算生物素-RHI结合的％抑制，并使用GraphPad Prism计算IC ₅₀值。

图12是显示对于几种胰岛素-Fc融合蛋白，生物素标记的胰岛素与克隆的胰岛素⁺B细胞受体(mAb125)的抗体形式结合的抑制的图(SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9和10，除了RHI作为对照之外)。如图12所示，本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：2-8)显着抑制生物素标记的胰岛素与胰岛素特异性B细胞受体的结合，并且在某些情况下显示出与用RHI观察到的抑制活性相当的抑制活性(阳性对照)。相反，SEQ ID NO：9和10在抑制生物素标记的胰岛素与胰岛素特异性B细胞受体的结合方面不太有效。

实施方案20：胰岛素受体结合测定

胰岛素受体结合测定是竞争性结合测定，其设计用于评估本文公开的胰岛素-Fc融合蛋白结合存在于人IM-9细胞(ATCC#CCL-159)表面上的胰岛素受体的能力。将在FACS染色缓冲液中稀释的七种系列稀释的胰岛素-Fc融合蛋白和对照重组人胰岛素(RHI)与固定浓度的生物素化的RHI预混合，然后加入到IM-9细胞中并在冰上孵育以允许与细胞上存在的胰岛素受体发生竞争性结合。然后通过链霉抗生物素蛋白-PE试剂标记所得的结合的生物素化的RHI，并在FACSCalibur流式细胞仪中分析标记的受体的荧光强度。IM-9细胞在T75培养瓶中在对数生长期在完全RPMI-10培养基(含有10％胎牛血清，25mM HEPES和50μg/mL庆大霉素的RPMI)中生长，在50mL管中培养当天收获，以250×g离心10分钟，并重悬于冷FACS染色培养基(HBSS/2mMEDTA/叠氮化钠/4％马血清)中至浓度为2×10⁶细胞/mL并保持在冰上。

在冷FACS染色培养基中以10μg/mL制备生物素化的RHI，并将每孔加入5μL该溶液置于置于冰上的V-底96孔板中。将测试化合物在冷FACS染色培养基中连续稀释(1：3)至管中的7摩尔浓度(784nM、261nM、87nM、29nM、9.7nM、3.2nM和1.1nM)。将RHI从192nM连续稀释至0.26nM。将50μL每种测试化合物的系列稀释液加入到含有生物素化的RHI的孔中，并将内容物在板振荡器中混合，然后置于冰上。然后使用多通道移液器将50μL2106细胞/mL的IM-9细胞悬浮液加入到所有孔中，并将内容物再次在平板振荡器上混合并在冰上孵育30分钟。然后用冷MACS缓冲液(HBSS/2mM EDTA/叠氮化钠/0.5％马血清)洗涤细胞两次，通过在4℃下以3000rpm离心3分钟并吸出上清液。将细胞再次悬浮于含有1：100稀释的链霉抗生物素蛋白-PE的50μL/孔冷FACS培养基中，并在冰上孵育20分钟。最后用冷MACS缓冲液洗涤细胞一次，然后用3％多聚甲醛固定。在FACSCalibur流式细胞仪中分析细胞，并分析每个样品管的FL-2MFI。将生物素化的RHI与IM-9细胞上的胰岛素受体结合的测试化合物的抑制百分比(％)对每种测试化合物的对数浓度作图，并在GraphPad Prism(GraphPad Software，LaJolla，CA)中计算IC ₅₀值。测试化合物的较低IC ₅₀值反映了与胰岛素受体的更强结合。

表7显示了几种胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9、和10)和RHI(对照)对生物素标记的胰岛素与IM-9胰岛素受体结合的抑制(IC₅₀；nM)。如表7所示，胰岛素-Fc融合蛋白SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7和SEQ ID NO：8不会干扰生物素标记的胰岛素与IM-9胰岛素激素受体的结合，因此非常弱地结合IM-9细胞上存在的胰岛素受体，或者根本不结合它们，这最大限度地降低了它们降低的机会。这是治疗患有自身免疫疾病的患者(例如，糖尿病前期患者、患有胰岛素自身抗体的患者或最近发病的1型糖尿病患者)的有利特性，其可能具有正常或略微升高的血糖水平，并且易受胰岛素-Fc融合蛋白治疗引起的潜在低血糖(如低血糖)风险的影响，该融合蛋白能够结合胰岛素受体，在该测定中IC₅₀值<3,000nM(例如，SEQ ID NO：9，SEQ IDNO：10，或具有甚至更高结合亲和力的蛋白质，在该测定中IC ₅₀值<1,000nM)。

DNM＝没有测量

实施方案21：SEQ ID NO：2-4预防野生型NOD小鼠中的糖尿病

该实施方案证明本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白可用于预防自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的方法中。

如下所述，用3周龄野生型NOD雌性小鼠(每组n＝15)开始该研究。NOD雌性小鼠每周两次(2mg/kg，腹膜内注射(ip))用胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：3-处理组)或载体对照(盐水加0.02％吐温-80)处理，并且在某些情况下，小鼠IgG₁同位素对照(从细胞系#CC9C10分泌和纯化)。在测试研究结果中记录了治疗持续时间。使用手持式AlphaTRAK血糖仪(Abbott，Abbott Park，IL)每周至少测量一次血糖水平。在连续两周每周血糖读数>240mg/dL后诊断出T1D。

将糖尿病发病率数据转换为Kaplan-Meier生存曲线格式，对治疗组和对照组(载体和IgG₁同种型对照)之间的糖尿病发病率进行统计学比较，使用对数秩检验，p<0.05表示统计学显着性。

图13显示，与对照组相比(转化率为55％)，接受SEQ ID NO：3(转化率为22％)的治疗组49周龄T1D发展的统计学显着性降低(p≤0.05对IgG₁同种型对照；p≤0.001对比载体对照)。在34周龄时停止给药。这些结果在随后的盲法研究中得到证实。参见图14(显示在26周龄时接受SEQ ID NO：3(56％转化)的治疗组与对照组(94％转化)之间的糖尿病预防中的统计学显着性差异(p≤0.0001)。

图15显示在26周龄时接受SEQ ID NO：2(40％转化)的治疗组与对照组(94％转化)之间的糖尿病预防的统计学显着性差异(p≤0.0001)。图16显示在接受SEQ ID NO：4(22％转化率)的治疗组中，相对于对照组(85％转化率)，68周龄时T1D发展的统计学显着性(p≤0.0001)降低。在该研究中，在18周龄时停止给药。

这些结果表明，本发明技术的胰岛素-Fc融合蛋白可用于预防自身免疫疾病(例如，自身免疫性糖尿病，例如1型糖尿病)的方法中。

实施方案22：SEQ ID NO：5-8预防野生型NOD小鼠的糖尿病

将对3周龄野生型NOD雌性小鼠(每组n＝15)进行进一步研究以评估其他示例性序列。用胰岛素-Fc融合蛋白(SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：10之一)或用盐水或载体对照每周两次(2mg/kg，腹膜内注射(i.p.))处理NOD雌性小鼠。治疗持续时间在26至60周龄之间。使用手持式AlphaTRAK血糖仪(Abbott，Abbott Park，IL)每周至少测量一次血糖水平。在连续两周每周血糖读数>240mg/dL后诊断出T1D。将糖尿病发病率数据转换为Kaplan-Meier生存曲线格式，对治疗组和对照组(载体或生理盐水对照)的糖尿病发病率进行统计学比较，使用对数秩检验，p<0.05表示统计学显着性。

预测SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8将预防类似于用SEQID NO：2(图15)、SEQ ID NO：3(图13和图14)和SEQ ID NO：4(图16)观察到的T1D表型。还预测SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10在预防T1D方面效果较差。

等同

本技术不限于本申请中描述的特定实施方案，其旨在作为本技术的各个方面的单个说明。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本技术进行许多修改和变化，这对本领域技术人员来说是显而易见的。除了本文列举的那些之外，本技术范围内的功能等同的方法和装置对于本领域技术人员而言从前面的描述中是显而易见的。这些修改和变化旨在落入本技术的范围内。应理解，本技术不限于特定的方法、试剂、化合物组合物或生物系统，它们当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是限制性的。

另外，在根据马库什群组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也因此以马库什群组的任何单个成员或成员子群的形式描述。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地被识别为充分描述并使相同的范围被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一，等等。作为非限制性示例，本文所讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解所有语言，例如“至多”、“至少、“大于”、“小于”等包括所述的数字，并且指的是可以随后分解成如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，等等。

本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物均以引用的方式整体并入本文，包括所有附图和表格，只要它们与本说明书的明确教导不矛盾。

序列表

<110> 阿卡斯通生物科学公司

<120> 胰岛素-FC融合物及使用方法

<130> 116603-0130

<140> PCT/US2017/065456

<141> 2017-12-08

<150> 62/514,460

<151> 2017-06-02

<150> 62/514,449

<151> 2017-06-02

<150> 62/514,427

<151> 2017-06-02

<150> 62/432,268

<151> 2016-12-09

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 1

atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60

gtgaagcagc acctgtgcgg ccctcacctg gtggaagctc tgtatctcgt gtgcggcgag 120

cggggcttct tctacacccc caagtctcgg agagaggtgg aagatcccca ggtggaacag 180

ctggaactgg gcggctctcc tggcgatctg cagacactgg ccctggaagt ggcccggcag 240

aaacggggca tcgtggacca gtgctgcacc tccatctgct ccctgtacca gctggaaaac 300

tactgcaatg gtggaggcgg tggagtgccc agagattgtg gatgtaagcc ttgcatatgt 360

acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc 420

attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag 480

gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg 540

gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac 600

tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc 660

gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca 720

cctcccaagg agcagatggc caaggataaa gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc 780

ttccctgaag acattactgt ggagtggcag tggaatgggc agccagcgga gaactacaag 840

aacactcagc ccatcatgga cacagatggc tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg 900

cagaagagca actgggaggc aggaaatact ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg 960

cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc cactctcctg gttag 1005

<210> 2

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 2

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys

20 25 30

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

35 40 45

Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Asp Lys

50 55 60

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

65 70 75 80

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

85 90 95

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

100 105 110

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

115 120 125

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

130 135 140

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

145 150 155 160

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

165 170 175

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

180 185 190

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

195 200 205

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

210 215 220

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

225 230 235 240

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

245 250 255

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

260 265 270

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

275 280 285

<210> 3

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 3

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys

20 25 30

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

35 40 45

Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Asp Lys

50 55 60

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

65 70 75 80

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

85 90 95

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

100 105 110

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

115 120 125

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

130 135 140

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

145 150 155 160

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

165 170 175

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

180 185 190

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

195 200 205

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

210 215 220

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

225 230 235 240

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

245 250 255

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

260 265 270

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

275 280 285

<210> 4

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 4

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys

20 25 30

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

35 40 45

Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Asp Lys

50 55 60

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

65 70 75 80

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

85 90 95

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

100 105 110

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

115 120 125

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

130 135 140

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

145 150 155 160

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

165 170 175

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

180 185 190

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

195 200 205

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

210 215 220

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

225 230 235 240

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

245 250 255

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

260 265 270

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

275 280 285

<210> 5

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 5

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Glu Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys

20 25 30

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

35 40 45

Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Asp Lys

50 55 60

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

65 70 75 80

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

85 90 95

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

100 105 110

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

115 120 125

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

130 135 140

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

145 150 155 160

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

165 170 175

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

180 185 190

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

195 200 205

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

210 215 220

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

225 230 235 240

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

245 250 255

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

260 265 270

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

275 280 285

<210> 6

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 6

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Glu Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys

20 25 30

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

35 40 45

Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Asp Lys

50 55 60

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

65 70 75 80

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

85 90 95

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

100 105 110

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

115 120 125

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

130 135 140

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

145 150 155 160

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

165 170 175

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

180 185 190

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

195 200 205

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

210 215 220

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

225 230 235 240

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

245 250 255

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

260 265 270

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

275 280 285

<210> 7

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 7

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys

20 25 30

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

35 40 45

Glu Asn Tyr Cys Asn Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

50 55 60

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

65 70 75 80

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

85 90 95

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

100 105 110

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

115 120 125

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

130 135 140

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

145 150 155 160

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

165 170 175

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

180 185 190

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

195 200 205

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

210 215 220

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

225 230 235 240

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

245 250 255

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

260 265 270

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

275

<210> 8

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 8

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Lys

20 25 30

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

35 40 45

Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Lys

50 55 60

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

65 70 75 80

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

85 90 95

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

100 105 110

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

115 120 125

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

130 135 140

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

145 150 155 160

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

165 170 175

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

180 185 190

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

195 200 205

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

210 215 220

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

225 230 235 240

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

245 250 255

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

260 265 270

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

275 280 285

<210> 9

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 9

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Ala

20 25 30

Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln

35 40 45

Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Asp

50 55 60

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

65 70 75 80

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

85 90 95

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

100 105 110

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

115 120 125

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

130 135 140

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

145 150 155 160

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

165 170 175

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

180 185 190

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

195 200 205

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

210 215 220

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

225 230 235 240

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

245 250 255

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

260 265 270

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

275 280 285

Gly

<210> 10

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 10

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Ala Ala

20 25 30

Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr

35 40 45

Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly

50 55 60

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

65 70 75 80

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

85 90 95

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

100 105 110

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

115 120 125

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

130 135 140

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

145 150 155 160

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

165 170 175

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

180 185 190

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

195 200 205

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

210 215 220

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

225 230 235 240

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

245 250 255

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

260 265 270

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

275 280 285

Pro Gly

290

<210> 11

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 11

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys

20 25

<210> 12

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 12

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys

20 25

<210> 13

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 13

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys

20 25

<210> 14

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 14

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Glu Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys

20 25

<210> 15

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 15

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Glu Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys

20 25

<210> 16

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 16

Ala Ala Lys

1

<210> 17

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 17

Ala Ala Ala Lys

1

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 18

Ala Ala Ala Ala Lys

1 5

<210> 19

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 19

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn

20

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 20

Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 21

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 22

<211> 226

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 22

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225

<210> 23

<211> 227

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 23

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 24

<211> 86

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 24

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg

20 25 30

Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro

35 40 45

Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys

50 55 60

Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln

65 70 75 80

Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

85

<210> 25

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 25

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

20 25 30

<210> 26

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 26

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 27

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 27

atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactcc 57

<210> 28

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> Glu或Gln

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)..(16)

<223> Tyr或Ala

<220>

<221> MOD_RES

<222> (22)..(22)

<223> Arg或Glu

<220>

<221>

<222>

<223> 有关详细说明，请参阅提交的说明书取代和优选的实施方案

<400> 28

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Xaa Ala Leu Xaa

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Xaa Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys

20 25

<210> 29

<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 29

atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60

gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggctctcgt gtgcggcgag 120

cggggcttct tctacacccc caaggccgct aaaggcatcg tggaacagtg ctgcacctcc 180

atctgctccc tgtaccagct ggaaaactac tgcaatggcg gaggtggtgc aggaggcggt 240

ggagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 300

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 360

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 420

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 480

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 540

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 600

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 660

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 720

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 780

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 840

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 900

agcctctccc tgtctccggg ttag 924

<210> 30

<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 30

atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60

gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtgcaagctc tgtatctcgt gtgcggcgag 120

cggggcttct tctacacccc caaggccgct aaaggcatcg tggaacagtg ctgcacctcc 180

atctgctccc tgtaccagct ggaaaactac tgcaatggcg gaggtggtgc aggaggcggt 240

ggagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 300

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 360

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taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 540

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gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 900

agcctctccc tgtctccggg ttag 924

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<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 31

atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60

gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tgtatctcgt gtgcggcgag 120

gagggcttct tctacacccc caaggccgct aaaggcatcg tggaacagtg ctgcacctcc 180

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agcctctccc tgtctccggg ttag 924

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<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

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<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 32

atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60

gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggctctcgt gtgcggcgag 120

gagggcttct tctacacccc caaggccgct aaaggcatcg tggaacagtg ctgcacctcc 180

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

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<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 33

atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60

gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggctctcgt gtgcggcgag 120

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aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 840

catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggttag 897

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<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 34

atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60

gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggctctcgt gtgcggcgag 120

cggggcttct tctacacccc caaggccgct aaaggcatcg tggaacagtg ctgcacctcc 180

atctgctccc tgtaccagct ggaaaactac tgcaatggcg gaggtggttc aggaggcggt 240

ggagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 300

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 360

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 420

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aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 600

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 660

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 720

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 780

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 840

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 900

agcctctccc tgtctccggg ttag 924

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<211> 927

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

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<222>

<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 35

atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60

gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggctctcgt gtgcggcgag 120

cggggcttct tctacacccc caaggccgct gcaaaaggca tcgtggaaca gtgctgcacc 180

tccatctgct ccctgtacca gctggaaaac tactgcaatg gcggaggtgg tgcaggaggc 240

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

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<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸

<400> 36

atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactccttc 60

gtgaaccagc acctgtgcgg ctcccacctg gtggaagctc tggctctcgt gtgcggcgag 120

cggggcttct tctacacccc caaggccgct gcagctaaag gcatcgtgga acagtgctgc 180

acctccatct gctccctgta ccagctggaa aactactgca atggcggagg tggtgcagga 240

ggcggtggag acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 300

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ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 720

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cagaagagcc tctccctgtc tccgggttag 930

Claims

1.胰岛素-Fc融合蛋白，由与Fc结构域融合的胰岛素多肽组成，其中所述胰岛素多肽由B-链肽、C-链肽和A-链肽组成，其中所述C-链肽的氨基酸序列是AAK(SEQ ID NO:16)，并且可任选地其中所述胰岛素-Fc融合蛋白在竞争性结合试验中以IC₅₀>5,000nM结合人胰岛素受体；其中B-链肽为氨基酸序列FVNQHLCGSULVX₁ALX₂LVCGEX₃GFFYTPK(SEQ ID NO:28),其中X₁是E，X₂是A，并且X₃是R；

其中所述A-链肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:19；

所述胰岛素多肽通过任选的肽接头与Fc片段融合，并且其中存在的肽接头是SEQ IDNO:20或SEQ ID NO:21，

所述胰岛素-Fc融合蛋白结构域为：(N-末端)-B-链肽-C-链肽-A-链肽-任选的接头-人IgG₁的野生型Fc片段-(C-末端)。

2.根据权利要求1所述的胰岛素-Fc融合蛋白，其中所述胰岛素-Fc融合蛋白以IC₅₀≤100nM抑制胰岛素⁺B细胞受体与胰岛素的体外结合。

3.根据权利要求1或2所述的胰岛素-Fc融合蛋白，其中所述胰岛素-Fc融合蛋白激活T细胞以分泌IL-2水平，与在重组人胰岛素激活的T细胞中观察到的情况相比，该IL-2水平降低。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的胰岛素-Fc融合蛋白，其中所述Fc结构域是人IgG₁的野生型Fc片段，并且所述Fc结构域的氨基酸序列为SEQ ID NO:22。

5.根据权利要求4所述的胰岛素-Fc融合蛋白，其中所述胰岛素-Fc融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8。

6.重组核酸序列，编码选自由以下组成的组的胰岛素-Fc融合蛋白：SEQ ID NO:3、SEQID NO:7或SEQ ID NO:8。

7.载体，包含权利要求6所述的重组核酸序列。

8.一种工程化的真核细胞，包含权利要求7所述的载体。

9.一种试剂盒，包含权利要求1-5中任一项所述的胰岛素-Fc融合蛋白和使用说明书。

10.权利要求1-5中任一项所述的胰岛素-Fc融合蛋白在用于制造用于治疗或预防有需要的受试者的自身免疫性糖尿病的药物中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述自身免疫性糖尿病包括1型糖尿病、青少年糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病或潜伏自身免疫性糖尿病。

12.根据权利要求10或11所述的用途，其中所述受试者已被诊断患有自身免疫性糖尿病或有自身免疫性糖尿病的风险。

13.根据权利要求10-12中任一项所述的用途，其中所述受试者不是高血糖。

14.根据权利要求10-12中任一项所述的用途，其中所述受试者具有可检测水平的至少一种选自胰岛素自身抗体(IAA)、抗谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体和抗胰岛抗原-2(IA-2)抗体的自身免疫抗体。

15.根据权利要求10-12中任一项所述的用途，其中所述受试者具有可检测水平的胰岛素特异性B细胞群。

16.根据权利要求10-12中任一项所述的用途，其中所述受试者携带一种或多种选自下组的人白细胞抗原(HLA)单倍型：(a)DRB 1*0301-DQA1*0501-DQB1*0201；(b)DRB1*0405-DQA1*0301-DQB1*0302；(c)DRB 1*0401-DQA1*0301-DQB*0302；(d)DRB1*0402-DQA1*0301-DQB1*0302；(e)DRB 1*0404-DQA1*0301-DQB1*0302和(f)DRB1*0801-DQB 1*0401-DQB 1*0402。

17.根据权利要求16所述的用途，其中所述胰岛素-Fc融合蛋白通过肠胃外、静脉内或皮下施用。

18.根据权利要求17所述的用途，其中与至少一次施用前在受试者中观察到的情况相比，在至少一次施用胰岛素-Fc融合蛋白后，所述受试者显示抗胰岛素B细胞的数量减少。

19.根据权利要求18所述的用途，其中与至少一次施用前在受试者中观察到的情况相比，在至少一次施用胰岛素-Fc融合蛋白后，所述受试者显示胰岛素自身抗体的水平降低。

20.根据权利要求19所述的用途，其中与至少一次施用前在受试者中观察到的情况相比，在至少一次施用胰岛素-Fc融合蛋白后，所述受试者的血糖水平相当。