JP2020503889A - インスリンとfcの融合物および使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年12月9日に出願した米国出願第62/432,268号、2017年6月2日に出願した米国出願第62/514,427号、2017年6月2日に出願した米国出願第62/514,449号、および2017年6月2日に出願した米国出願第62/514,460号の恩恵ならびに優先権を主張し、それらの内容は、全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本テクノロジーは、インスリンとFc(例えば、プロインスリンとFc)の融合タンパク質の組成物および自己免疫疾患、例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、1型糖尿病を処置するためのそれらの使用に関する。
別段定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、一般に、本テクノロジーが属する当該技術分野における当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書および添付の請求の範囲において使用される通り、単数形「a」、「an」および「the」は、内容が別段明確に示さない限り、複数の参照物を含む。例えば、「1個の細胞」への言及は、2個以上の細胞の組合せなどを含む。一般に、本明細書において使用される命名法、ならびに以下に記載される細胞培養における実験室の手法、分子遺伝学、有機化学、分析化学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションは、当該技術分野において周知であり、一般的に利用されるものである。
T1Dに付随する辛苦を低減するか、または排除するための3つの主なアプローチ、1)より良好な疾患管理、例えば、改良されたインスリン、スマートポンプ、および継続的グルコースモニター;2)疾患の逆転、例えば、膵臓または膵島移植、β細胞の再生、全身またはT細胞特異的免疫調節;ならびに3)疾患の予防、例えば、環境上のトリガーの回避、抗原特異的ワクチン接種、抗原非特異的免疫療法が存在する。T1D患者は自己免疫を発症するので、彼らのβ細胞機能は衰退し、故に、介入の可能性のある治療恩恵を衰退させる(Rewers, M and Gottlieb, P. Diabetes Care (2009), 32, 1769-1782)。加えて、自己免疫プロセスが始まると、それは、変更するのがより漸進的に困難になり得る。これらの理由から、および遅い段階での介入と比べて推定されるコスト上の利点のため、長期間の、T1Dの最も早も早い可能性のある段階での疾患の予防が理想である。
本明細書において使用される、用語「Fc領域」、「Fcドメイン」または「Fcフラグメント」は、哺乳類のFc(ガンマ)またはFc(Rn)受容体、例えば、ヒトFc(ガンマ)もしくはFc(Rn)受容体に結合する能力がある、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を指す。Fc受容体(FcR)は、抗体のFcフラグメントまたはFc領域に結合する受容体を指す。ある特定の実施形態において、FcRは、天然のヒトFcR配列である。ある実施形態において、FcRは、IgG抗体(ガンマ受容体)に結合し、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的スプライシングフォームを含む、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラスの受容体を含む。FcγRII受容体は、それらの細胞質ドメインにおいて主に異なる同様のアミノ酸配列を有するFcγRIIA(「受容体を活性化する」)およびFcγRIIB(「受容体を阻害する」)を含む。FcRは、Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92;Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34;およびde Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41において記載されている。「FcR」はまた、新生児の受容体FcRnを含み、これは、移行IgGの胎児への移動に関与し(Guyer et al., 1976 J. Immunol., 117:587;およびKim et al., 1994, J. Immunol., 24:249)、インビボでの抗体およびFc融合タンパク質の長期インビボ排除の半減期に寄与する。
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(配列番号22)を含む。
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号23)を含む。
インスリンは、膵臓内のランゲルハンス膵島中のβ細胞により産生されるペプチドホルモンである。インスリンは、血液からのグルコースの吸収を制御することにより機能する。増大したタンパク質およびグルコースレベルのような、刺激に曝露されたとき、インスリンは、β細胞から放出され、インスリン受容体に結合し、ヒトの代謝の多くの態様に影響するシグナル伝達カスケードを開始する。このプロセスの破壊は、いくつかの疾患、自己免疫性糖尿病(例えば、1型糖尿病)、インスリノーマ、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、および多嚢胞性卵巣症候群と直接関連する。インスリンのアミノ酸配列は、進化を通じて、特に、脊椎動物において強固に保存され、ジスルフィド結合を通じて結合されている、AおよびB鎖と呼ばれる、2つのポリペプチド鎖からなる。ヒトプロインスリンの配列は、アミノ酸配列:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(配列番号24)により表される。
1つの態様において、本開示は、Fcドメインに融合したインスリンポリペプチドを含むインスリンとFcの融合タンパク質であって、インスリンポリペプチドが、B鎖ペプチド、C鎖ペプチド、およびA鎖ペプチドを含み、C鎖ペプチドのアミノ酸配列がAAKである、インスリンとFcの融合タンパク質を提供する。加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとFcの融合タンパク質は、競合的結合アッセイにおいてIC50>5,000nMでヒトインスリン受容体に結合する。ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとFcの融合タンパク質は、低い生物活性を有するか、または実質的に代謝上不活性であり、例えば、それらは、投与の際に対象において血液グルコースレベルを実質的に下げない。
配列番号2
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号3
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTPKAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号4
FVNQHLCGSHLVQALYLVCGERGFFYTPKAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号5
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGEEGFFYTPKAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号6
FVNQHLCGSHLVEALALVCGEEGFFYTPKAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号7
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTPKAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号8
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTPKAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGSGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号9
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTPKAAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
配列番号10
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFFYTPKAAAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGAGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAAGCAGCACCTGTGCGGCCCTCACCTGGTGGAAGCTCTGTATCTCGTGTGCGGCGAGCGGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGTCTCGGAGAGAGGTGGAAGATCCCCAGGTGGAACAGCTGGAACTGGGCGGCTCTCCTGGCGATCTGCAGACACTGGCCCTGGAAGTGGCCCGGCAGAAACGGGGCATCGTGGACCAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGGTGGAGGCGGTGGAGTGCCCAGAGATTGTGGATGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTTAG(配列番号1)である。
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGGAAGCTCTGGCTCTCGTGTGCGGCGAGCGGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGGCCGCTAAAGGCATCGTGGAACAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGGCGGAGGTGGTGCAGGAGGCGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG(配列番号29)である。
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGCAAGCTCTGTATCTCGTGTGCGGCGAGCGGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGGCCGCTAAAGGCATCGTGGAACAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGGCGGAGGTGGTGCAGGAGGCGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG(配列番号30)である。
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGGAAGCTCTGTATCTCGTGTGCGGCGAGGAGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGGCCGCTAAAGGCATCGTGGAACAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGGCGGAGGTGGTGCAGGAGGCGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG(配列番号31)である。
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGGAAGCTCTGGCTCTCGTGTGCGGCGAGGAGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGGCCGCTAAAGGCATCGTGGAACAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGGCGGAGGTGGTGCAGGAGGCGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG(配列番号32)である。
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGGAAGCTCTGGCTCTCGTGTGCGGCGAGCGGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGGCCGCTAAAGGCATCGTGGAACAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG(配列番号33)である。
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGGAAGCTCTGGCTCTCGTGTGCGGCGAGCGGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGGCCGCTAAAGGCATCGTGGAACAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGGCGGAGGTGGTTCAGGAGGCGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG(配列番号34)である。
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGGAAGCTCTGGCTCTCGTGTGCGGCGAGCGGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGGCCGCTGCAAAAGGCATCGTGGAACAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGGCGGAGGTGGTGCAGGAGGCGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG(配列番号35)である。
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACGACTGGTGTCCACTCCTTCGTGAACCAGCACCTGTGCGGCTCCCACCTGGTGGAAGCTCTGGCTCTCGTGTGCGGCGAGCGGGGCTTCTTCTACACCCCCAAGGCCGCTGCAGCTAAAGGCATCGTGGAACAGTGCTGCACCTCCATCTGCTCCCTGTACCAGCTGGAAAACTACTGCAATGGCGGAGGTGGTGCAGGAGGCGGTGGAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG(配列番号36)である。
ある実施形態において、本明細書に記載されるインスリンとFcの融合タンパク質は、例えば、インスリンとFcの融合タンパク質の1つもしくは複数のドメインの間、またはインスリンとFcの融合タンパク質と結合した分子/部分の間に1つあるいは複数のリンカーを含む。例えば、インスリンとFcの融合タンパク質は、インスリンポリペプチドとFcフラグメントの間にリンカーを含む。他の実施形態において、インスリンとFcの融合タンパク質は、インスリンポリペプチドの1つまたは複数のペプチド(例えば、A鎖、B鎖、および/もしくはC鎖ペプチド)の間にリンカーを含む。
本明細書に記載されるインスリンとFcの融合タンパク質の対象への投与を含む、自己免疫疾患、例えば、自己免疫性糖尿病の処置または予防方法であって、インスリンとFcの融合タンパク質が、抗インスリン抗体に特異的に結合し、抗インスリンB細胞に結合し、T細胞相互作用(IL−2分泌により決定される)を減少し、および/またはインスリン受容体への弱い結合を示す、方法が、本明細書に記載される。加えてまたは代わりに、ある実施形態において、インスリンとFcの融合タンパク質は、競合的結合アッセイにおいて、ヒトインスリン受容体にIC50>3,000nM(例えば、4,000nM、5,000nM以上)で結合する。
(例えば、1μΜ、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM以下)のKdにより特徴付けられる、インスリン特異的B細胞に対する親和性を有する。ある実施形態において、インスリンとFcの融合タンパク質は、非インスリン特異的/反応性B細胞に対するその親和性より低い(例えば、少なくとも2倍より大きい、例えば、少なくとも2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、400、500、1000、または10,000倍以上低い)インスリン特異的B細胞に対する親和性を有する。
様々な手法が、本明細書に記載されるインスリンとFcの融合タンパク質の産生のため使用され得る。(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照し、これは、参照により本明細書に組込まれる)。
以下の考察は、説明の目的のみで提示され、制限することを意図しない。
(a)DRB1*0301−DQA1*0501−DQB1*0201
(b)DRB1*0405−DQA1*0301−DQB1*0302
(c)DRB1*401−DQA1*0301−DQB*0302
(d)DRB1*0402−DQA1*0301−DQB1*0302
(e)DRB1*0404−DQA1*0301−DQB1*0302;または
(f)DRB1*0801−DQB1*0401−DQB1*0402
の1つまたは複数を有する。
自己免疫疾患、例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、1型糖尿病を処置または予防するために使用することができる本明細書に記載される融合タンパク質を含有する医薬組成物が、本明細書において提供される。
任意の治療剤の投薬量、毒性および治療効果は、例えば、LD50(集団の50%に致死的な用量)およびED50(集団の50%において治療上有効な用量)を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な医薬手法により決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比は、治療指数であり、それは、比LD50/ED50として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が有利である。毒性の副作用を示す化合物が使用され得る一方、影響されない細胞への可能性のある損傷を最小にするために影響された組織の部位にかかる化合物を標的化し、それにより、副作用を低減するデリバリーシステムを設計するケアが取られるべきである。
ある実施形態において、本明細書において開示される1種または複数のインスリンとFcの融合タンパク質は、自己免疫疾患(例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、1型糖尿病)の予防もしくは処置のための1種または複数のさらなる治療と組合せてもよい。
本開示はまた、本明細書に記載されるインスリンとFcの融合タンパク質の1種または複数を含む、自己免疫疾患(例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、1型糖尿病)の予防および/または処置のためのキットを提供する。場合により、本テクノロジーのキットの上記成分は、適当な容器に入れられ、自己免疫疾患(例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、1型糖尿病)の予防および/または処置についてラベルされる。
インスリンとFcの融合タンパク質を、以下の通り合成した。プロプライエタリ・ソフトウェア(LakePharma、ベルモント、カリフォルニア州)を使用して、目的の遺伝子配列を構築し、高発現哺乳類ベクターにクローニングした。HEK293細胞を、トランスフェクションの24時間前に、振とうフラスコ内に播種し、血清を含まない化学的に規定した培地を使用して成長させた。一過性トランスフェクションのためのSyd Labs(ナティック、マサチューセッツ州)の標準的な操作手法を使用して、HEK293細胞の懸濁液2Lに、目的のインスリンとFcの融合タンパク質をコードするDNA発現コンストラクトを一過性にトランスフェクトした。20時間後、細胞をカウントして、生存能および生細胞カウントを決定し、ForteBio(登録商標)Octet(Pall ForteBio LLC、フレモント、カリフォルニア州)により、タイターを測定した。さらなる読み取りを、一過性のトランスフェクション作製実行を通じて取得した。5日目またはその後に、培養液を回収した。
CHO細胞株は、元々、CHO−K1(LakePharma、ベルモント、カリフォルニア州)に由来し、当該技術分野において公知の方法を使用する組換えテクノロジーにより、内在性グルタミンシンテターゼ(GS)遺伝子をノックアウトした。安定な発現DNAベクターを設計し、CHO発現およびGSセレクションに最適化し、高発現哺乳類ベクター(LakePharma、ベルモット、カリフォルニア州)に組込んだ。それぞれの完成したコンストラクトの配列を、スケールアップ実験の開始に先立ち確かめた。加湿5%CO2インキュベーターにおいて、37℃で、化学的に規定した培地(CD OptiCHO(商標);インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州)においてCHO細胞を培養した。CHO細胞の培養において、血清または他の動物由来の製品を使用しなかった。
以下の通り、インスリンとFcの融合タンパク質の精製を行った。一過性もしくは安定的にトランスフェクトしたHEKまたはCHO産生実行から、分泌されたインスリンとFcの融合タンパク質を含有する条件培地上清を回収し、遠心分離により清澄化した。所望のインスリンとFcの融合タンパク質を含有する上清を、タンパク質Aカラムに通し、低pH勾配を使用して溶出した。その後、溶出した所望のタンパク質分画をプールし、200mM HEPES、100mM NaCl、50mM NaOAc、pH7.0緩衝液に緩衝液交換した。0.2μmのメンブレンフィルターを使用して、最終的な濾過工程を行った。280nmでの溶液の光学密度から、最終タンパク質濃度を計算した。さらに場合により、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、または他の方法による精製を、必要に応じて行った。タンパク質Aカラム精製後に得たタイター結果(mg/L)を、図2に示す。
LabChip(登録商標)GXII(パーキンエルマー、ウォルサム、マサチューセッツ州)において、200mM HEPES、100mM NaCl、50mM NaOAc、pH7.0緩衝液に溶解した精製したインスリンとFcの融合タンパク質の溶液について、CE−SDS解析を行い、電気泳動図をプロットした。非還元条件下で、試料を公知の分子量(MW)タンパク質標準に対して走らせ、溶出ピークは、インスリンとFcの融合タンパク質ホモダイマーの「見かけ」MWを表していた。
質量分析(MS)を介してインスリン−Fc質量の正確な推定値を得るために、試料をまず処理して、MS解析と干渉し得る天然に生じ得るグリカンを除去した。200mM HEPES、100mM NaCl、50mM NaOAc、pH7.0緩衝液溶液に溶解した2.5mg/mLインスリンとFcの融合タンパク質100μLを、Zeba脱塩カラム(Pierce、サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州)を使用して、5mM EDTAを含有する0.1M Tris、pH8.0緩衝液にまず交換した。融合タンパク質に存在するN結合グリカンを除去するために、PNGaseF酵素(プロザイムN−グリカナーゼ)1.67μLをこの溶液に加え、混合物を、37℃で一晩、インキュベーターにおいてインキュベーションした。次に、試料をLC−MS(NovaBioassays、ワーバン、マサチューセッツ州)を介して解析し、グリカンを含まない所望のホモダイマーに対応する分子の分子質量を得た。次に、アスパラギンからグリカンを切断するために使用される酵素プロセスはまた、アスパラギン側鎖を脱アミノして、アスパラギン酸を形成し、その際に、酵素的に処理したホモダイマーは、ホモダイマーに存在するそれぞれの鎖についての1Daの質量に対応する、2Da全体を得るので、この質量をさらに補正した。それ故、実際の分子量は、解析試料中のインスリンとFcの融合タンパク質構造の酵素修飾について補正するために測定した質量マイナス2Daである。典型的なインスリンとFcの融合タンパク質についてのLC−MS分子量データ、補正質量データ、および理論分子量(Expasy MW/pIツールを介して得た)を、表4に示す。
280nmの波長でのWaters2998フォトダイオードアレイを取り付けたWaters2795HT HPLC(ウォーターズコーポレーション、ミルフォード、マサチューセッツ州)を使用して、インスリンとFcの融合タンパク質の分子ふるいクロマトグラフィー(SEC−HPLC)を行った。目的のインスリンとFcの融合タンパク質を含有する試料100μL以下を、0.2mL/分の流速で作動する、50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、および0.05%w/v窒化ナトリウム、pH6.2を含む移動相を有する、MAbPac SEC−1、5μm、4×300mmカラム(サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州)に注入した。MAbPac SEC−1カラムは、分子サイズ分離の原理に基づき作動する。それ故、可溶性のインスリンとFcの凝集物(例えば、インスリンとFcの融合タンパク質ホモダイマーの多量体)が大きいほど、短い保持時間で溶出し、凝集していないホモダイマーは、より長い保持時間で溶出した。解析的SEC−HPLCを介して凝集した多量体ホモダイマーからホモダイマーの混合物を分離する際に、凝集していないホモダイマーのパーセンテージに関してインスリンとFcの融合タンパク質溶液の純度を確認した。図3は、HEK293細胞においておよびCHO細胞において作られたインスリンとFcの融合タンパク質のホモダイマーのパーセンテージを示す。図3は、本テクノロジーのインスリンとFcの融合タンパク質(配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;および配列番号8)が、HEK293とCHO細胞の一方または両方において作られたとき、比較的高いホモダイマーの%を示したことを示す。対照的に、配列番号9および配列番号10は、HEK293細胞で作られたとき、比較的低いホモダイマーの%を示した。
以下の通り、インスリンとFcの融合タンパク質をビオチンに結合させた。PBS、pH7.4中0.5mg/mLのインスリンとFcの融合タンパク質1mL、を、磁気撹拌棒を備えた小さいバイアルに加えた。別に、ジメチルスルホキシド(DMSO)中で30mMビオチニダーゼ抵抗性ビオチン−BR−PEG4−NHS試薬(Quanta BioDesign、ユニオン郡、オハイオ州)を作製した。次に、ビオチン試薬ストック溶液の一部を、緩衝していないpH4.0の脱イオン水中で10倍希釈し、直後に、希釈したDMSO/水ビオチン試薬溶液をインスリン−Fcタンパク質溶液に加えた。インスリンとFcタンパク質に対するビオチン試薬のモル比が、1〜100mol/molであるように、断続的に撹拌しながら、希釈したビオチンDMSO/水溶液の量を、インスリンとFcのタンパク質溶液に少しずつ加えた。典型的なビオチン結合反応は、12:1のインスリンとFcの融合タンパク質に対するビオチン試薬のモル比を標的にする。合わせたビオチン試薬とインスリンとFcの融合タンパク質の溶液を、2時間以上、室温(RT)で反応させ、その後、結合していないビオチン試薬およびDMSOを、Zeba(商標)10mL、7kDaのPierce(商標)スピンカラム(サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州)を使用したゲル濾過を介して除去し、エンドトキシンフリーのリン酸緩衝食塩水(PBS)に入れた。280nmでの吸光度により、溶液の終濃度を決定した。
以下の通り、ビオチン結合インスリンとFcの融合タンパク質および非結合インスリンとFcの融合タンパク質を、それらのインビボでの薬物動態について評価した。1群当たりN=4匹のbalb/cマウス(ジャクソン研究所(JAX)、バー・ハーバー、メイン州)を体重測定し、2つのベースラインの血液グルコース測定値を、血糖値測定器(アボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州)を使用して取得し、1つのベースライン血液試料を、顎下静脈を介して後の血清解析のため収集した。次に、マウスに、2mg/kgインスリンとFcの融合タンパク質を腹腔内(i.p.)投与した。血清解析用血液グルコース測定および血液回収を、t=0〜t=21日の間隔で取得した。血液を凝血させ、凝血した試料の遠心分離後、血清を得て、ポリプロピレン96ウェルプレートにおいて直ちに凍結し、解析を行うまで、−20℃で保存した。別の対照実験を、組換えヒトインスリン(RHI)(シグマアルドリッチコーポレーション、セントルイス、ミズーリ州)で行い、インスリンとFcの融合タンパク質対RHI対照群のグルコース低下活性における差を示す。
以下の通り、循環ヒト血清インスリン自己抗体(IAA)へのインスリンとFcの融合タンパク質の結合親和性を決定した。抗体は、哺乳類におけるB細胞受容体の分泌形態であるので、IAAの起源であるインスリン+B細胞に対するインスリンとFcの融合タンパク質の親和性の代理として、決定値を使用した。前糖尿病のIAA陽性対象(Barbara Davis Center for Childhood Diabetes)からのヒト血清試料を、放射標識したインスリン、および連続希釈濃度の非標識組換えヒトインスリン(RHI)またはインスリンとFcの融合タンパク質(例えば、配列番号3)のいずれかとインビトロで混合して、IAAへの125I放射標識RHI結合の阻害を測定した。混合物を1時間、RTでインキュベーションした後、混合物を、抗ヒトIgGビーズ(CaptureSelect、GEヘルスケア、リトル・チャルフォント、英国)の懸濁液に加えた。ビーズを洗浄し、得られたビーズを、シンチレーションカウンター(ガンマ放射線カウンター)を使用して解析した。ヒト血清IAAへのRHI対照またはインスリンとFcの融合タンパク質の強力な結合は、125I標識インスリンへのIAA結合を阻害し、これにより、より少ないガンマ放射線カウントをもたらした。RHI対照またはインスリンとFcの融合タンパク質の結合が弱いほど、多いガンマカウントをもたらした。データを使用して、結合曲線を構築し、Prism(GraphPad Software、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州)を使用して解析して、IAAへの放射標識インスリン結合の50%を阻害する濃度(IC50)を決定した。図5に示す通り、配列番号3のインスリンとFcの融合タンパク質(IC50=10nM)は、プールした前糖尿病ヒトIAA試料についてRHI(IC50=3nM)と比較して同様の親和性を有し、これは、配列番号3のインスリンとFcの融合タンパク質が、対象において抗インスリンB細胞クローンを標的にするのに有用であることを示している。
本テクノロジーのインスリンとFcの融合タンパク質のインスリン+B細胞を特異的に除去する能力を評価するために、125Tg NODマウス脾細胞および初代ラット肺胞マクロファージ(AM、肺洗浄液)またはAkston Biosciences(ビビバリー、マサチューセッツ州)で繁殖した動物由来のマウスマクロファージ(骨髄由来のMM)を使用するインビトロアッセイを開発した。脾臓を回収し、赤血球を溶解し、脾細胞をフィコールプレップにより精製して、T細胞とB細胞の精製混合物を得た。125Tg NODモデルの利点は、脾細胞のおよそ50〜80%が、実験的な試験を促進するインスリン+B細胞であることである。次に、変動する濃度の典型的なインスリンとFcの融合タンパク質および対照に沿って、精製した脾細胞混合物を、ラットAMまたはMMと共に、3日間に渡り共培養した(1つの96マイクロタイターウェル当たり5×104個のAMまたはMMと共に約5×105個の脾細胞)。インキュベーション後、細胞を繰り返し洗浄し、一晩、新鮮培地中でインキュベーションし、典型的なインスリンとFcの融合タンパク質の完全な除去を確認した。次に、細胞を回収し、抗B220−PEmAb1μg、抗IgM−PECy7mAb0.7μg、およびRHI−マイクロビーズ(RHIを使用して作成した(シグマアルドリッチコーポレーション、セントルイス、ミズーリ州))5μL、およびNHS活性化マイクロビーズキット(Miltenyi Biotec、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)のカクテルで標識した。次に、ビーズを、抗マイクロビーズAPCmAb(Miltenyi Biotec、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)でさらに標識する。洗浄後、細胞を固定し、FACSにより解析した。
オスおよびメスVH125 NODマウス(1群当たりN=3〜6匹のマウス)における2週間の0.4mg/kgでの1週間に2回の腹腔内注射を介して、典型的なインスリンとFcの融合タンパク質、配列番号3、またはビークル対照製剤を使用した実験を行った。投与の2週間後、血液採取中(顎下静脈)イソフルランを使用してマウスを麻酔し、続いて、二酸化炭素窒息し、リンパ節、骨髄、および/または脾臓の回収を無菌条件下で行った。実施例12〜13に記載する通り、血液および脾臓試料を処理し、解析した。これらの実験の結果を図7A〜7Hに示し、これは、典型的なインスリンとFcの融合タンパク質(配列番号3)の、インスリン(−)B細胞集団を保存しながら、VH125 NODマウスにおいて血液および脾臓中のインスリン+B細胞を除去する能力を示している。
本明細書に記載される典型的なインスリンとFcの融合タンパク質での処置後のVH125 NODマウスから収集した末梢血中のインスリン特異的B細胞を解析する手法を開発した。顎下(SMD)静脈穿刺により処置したマウスからの血液およそ200〜400μlを、2mM EDTA/HBSS/ゲンタマイシン2mLを含む5mLの微量遠心管に採取し、反転させることにより直ちに混合して、凝血を防いだ。次に、試験管を500×gで7分間遠心分離し、HBSS/ヘパリン緩衝液5mLで、500×gで7分間、2回洗浄した。血液ペレットを、ヘパリンを含む完全IMDM培地(10%FBS、5mg/mLゲンタマイシンおよび2−ME)に再懸濁し、10ウェルプレートにおいて一晩、37℃でインキュベーションし、それらに、内在性マウスインスリンまたはインビボでの実験から存在する残りのインスリンとFcの融合タンパク質がないように、B細胞受容体(BCR)のターンオーバーをさせた。次に、血液細胞を、5mLの試験管に回収し、500×gで7分間、遠心分離し、細胞ペレットを、RBC−溶解バッファー5mLに再懸濁し、5分間、室温で維持した。RBCの溶解後、白血球を、HBSS/2%FBSで、500×gにて7分間、2回洗浄し、最後に、マウスFcRブロック(Miltenyi Biotech、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)10μL、mAbラット抗マウスB220−Alexa Fluor(登録商標)488(BioLegend(登録商標)、サンディエゴ、カリフォルニア州)1μg、ラット抗マウスIgM−PE/Cy7mAb0.7μgおよびRHI結合マイクロビーズ(Miltenyi Biotech、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)100当量(12.5μL)を含有する冷FACS染色培地100μLに懸濁し、30分間、4℃で維持した。氷冷FACS洗浄バッファー2mLを加える、500×gで7分間遠心分離することにより、血液細胞を洗浄した。最後に、細胞を、FACS染色バッファー100μl中の抗マイクロビーズ−APC(Miltenyi Biotech、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)6μLで、20分間、4℃で標識し、FACS洗浄バッファー2mLで1回洗浄し、FACS解析のため、2%パラホルムアルデヒドバッファー150μlに再懸濁した。VH125遺伝子導入マウスについては、血中のインスリン特異的B細胞の低い頻度のため、FACS解析前に濃縮手法を行った。濃縮手法のため、血液およそ500〜600μLを必要とし、これは、所定の処置群についてN=3以上の個々のマウス血液試料のプールを必要であった。血液標識手法を、実施例12に記載したインスリン特異的B細胞濃縮プロトコールと組合せた。FACS解析前に、VH125 NOD脾臓細胞について上で記載した通り、固定および洗浄工程後の標識血液細胞を、MSカラムを使用して濃縮することができる。
FACS解析のための、マウス脾細胞由来のインスリン特異的B細胞の濃縮。この手法を、VHI125 NODマウスから新たに単離した脾細胞中のインスリン特異的B細胞を解析するのに適用することができる。VH125 NODマウスにおけるインスリン特異的B細胞の頻度は、全てのB細胞の2〜5%であるので、磁性活性化セルソーティング(MACS)カラム濃縮手法を使用して、トータルの脾細胞からインスリン特異的B細胞を濃縮し、インビボでのインスリン特異的B細胞の低減の程度を正しく定量した。それぞれの濃縮手法のため、およそ10×106個の脾臓細胞を標識した。新たに単離したVHI125 NOD脾臓細胞を濃縮したとき、細胞を、完全培養培地(10%FBS、5mg/mLゲンタマイシンおよび2−メルカプトエタノールを含むIMDMまたはDMEM培地)と共に、37℃で、5%CO2インキュベーターにおいて、一晩インキュベーターし、それらが、内在性マウスインスリンまたはインビボでの実験から存在した残りのインスリンとFcの融合タンパク質を含まないように、B細胞受容体(BCR)のターンオーバーをさせた。細胞を、15mLの試験管に回収し、細胞をフィコール2.5mlと共に下に敷き、800×gで15分間遠心分離することにより、フィコール精製した。
試料処理および濃縮(骨髄)。この場合では、試験物を、6週齢から34週齢で週に2回投与することを除き、実施例11に記載のものと同様のインビボ実験を行った。実施例11に記載に記載したインビボ実験を行った後、VHI125 NODの脛骨および大腿骨を、周辺筋肉および腱から切断した。無菌のスクレーパーを使用して骨から、筋肉および組織デブリを掻把し、骨を、70%イソプロパノールで1回、無菌PBSで2回洗浄した。それぞれの骨の両末端を、無菌のはさみで切断し、20mLの注射器に充填した無菌のHBSS/2%FBSバッファーおよそ8〜10mLおよび骨の一方の端を通して挿入した25G針を挿入することにより、髄を流した。20μmの細胞濾過器を通して、骨髄懸濁液を濾過し、次に、500×gで10分間遠心分離した。上清を吸引後、RBC溶解バッファーを使用して、5分間、室温で、赤血球細胞を溶解し、次に、HBSS/2%FBSバッファーで2回洗浄した。骨髄細胞懸濁液を、完全培地(DMEM、5%BSA、1mMピルビン酸ナトリウム、50μg/mLゲンタマイシン、5×10−5Mベータメルカプトエタノール)に再懸濁し、一晩、37℃でインキュベーションして、BCRのターンオーバーをさせた。インキュベーション期間の終わりに、フィコール密度勾配分離を使用して、デブリから骨髄単核細胞を明らかにした。
実施例14のインビボ実験を行い、所定の動物について、2〜4つのリンパ節を1つの試料として一緒にプールし、フィコール精製および溶解バッファー工程を行わなかったことを除き、脾細胞について既に記載した手法と同様の方法で、リンパ節および得られたリンパ節懸濁液を処理し、回収した。得られたリンパ節細胞懸濁液を、上記の骨髄細胞懸濁液について記載したものと同様の方法で標識した。研究34週目のリンパ節解析を、図8Bに説明し、これは、配列番号3での処置後のオスとメスのVHI125マウスの両方における抗インスリンB細胞の有意な低減を示す。
インスリンB鎖エピトープ(インスリンB鎖上の位置9〜23)について、反応性T細胞受容体(TCR)を有する5KC−3−4マウスIAg7T細胞ハイブリドーマによるIL−2分泌を測定することにより、インスリンとFcの融合タンパク質のT細胞を活性化する能力を評価した。抗原提示細胞として使用するため、125Tg NOD脾臓からインスリン特異的B細胞を単離した。脾臓を無菌的に単離し、細胞を、40μmの無菌の細胞分離機を通してろ過した2%FBSを含有する無菌バッファーに単離した。ACK溶解バッファー(サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州)を使用して、赤血球細胞を溶解し、続いて、無菌バッファー中の2%FBSで2回洗浄した。製造元の指示(マウス膵B細胞単離キットII、Miltenyi Biotec、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)に従い、非接触B細胞単離キットを使用して、脾臓細胞混合物からB細胞を単離した。次に、活性化または固定を行うことなく、細胞を抗原提示細胞として使用した。5KC−3−4細胞とB細胞を混合し、FBS中それぞれ6.67×106/mLおよび1.33×107/mLで再懸濁した。7kDaのMWCO Zebaスピンカラムを使用して、試験化合物を、0.002%Tween−80、1mMピルビン酸塩、55μΜベータ−メルカプトエタノール、およびゲンタマイシンを含有するIMDMにバッファー交換し、次に、0.2mg/mLに希釈した。RHI(MW約5.8kDa)を、インスリンとFcの融合タンパク質(MW約63.5kDa)のものと等モル濃度で比較するように、陽性対照として、0.018mg/mLの組換えヒトインスリン(RHI)を同じ培地中で調製した。細胞懸濁液(1×105個の5KC−3−4および2×105個のB細胞)15μLならびに試験化合物150μLを、96ウェルの組織培養プレートにおいて合わせた。37℃で一晩のインキュベーション後、培養培地を回収し、3500rpmで5分間、4℃で遠心分離した。次に、製造元のプロトコールに従い、マウスIL−2Quantikine ELISAキット(R&D Systems、ミネアポリス、ミネソタ州)を介して、IL−2について上清をアッセイした。
インスリンB9−23反応性5KC−3−4T細胞を125TgB細胞と混合し、これが、アッセイにおいて抗原提示細胞として振る舞った。この細胞懸濁液に、固定濃度(10ng/mL)のインスリンとFcの融合タンパク質、配列番号5を、130〜10,000ng/mLの様々な連続希釈濃度の試験化合物と予め混合した刺激性対照として加え、アッセイプレートを、一晩37℃でインキュベーションした。IL−2分泌を測定し、データから、IC50濃度を決定した。
本テクノロジーのインスリンとFcの融合タンパク質のインスリン+B細胞を特異的に除去する能力を評価するために、125Tg NODマウス脾細胞および初代ラット肺胞マクロファージ(AM、肺洗浄液)またはAkston Biosciences(ビビバリー、マサチューセッツ州)で繁殖した動物由来のマウスマクロファージ(骨髄由来のMM)を使用する、インビトロアッセイを開発した。脾臓を回収し、赤血球を溶解し、脾細胞をフィコールプレップにより精製して、T細胞とB細胞の精製混合物を得た。125Tg NODモデルの利点は、脾細胞のおよそ30〜80%がインスリン+B細胞であり、これが、実験的な試験を促進することである。次に、変動する濃度の典型的なインスリンとFcの融合タンパク質および対照に沿って、精製した脾細胞混合物を、ラットAMまたはMMと共に、3日間に渡り共培養し(96マイクロタイターウェル当たり5×104個のAMまたはMMと共に、約5×105個の脾細胞)。インキュベーション後、細胞を繰り返し洗浄し、一晩、新鮮培地においてインキュベーションし、典型的なインスリンとFcの融合タンパク質の完全な除去を確認した。次に、細胞を回収し、抗B220−PEmAb1μg、抗IgM−PECy7mAb0.7μg、およびRHI−マイクロビーズ(標準的なキット(Miltenyi Biotec、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)を使用してRHI(シグマアルドリッチコーポレーション、セントルイス、ミズーリ州)およびNHS活性化マイクロビーズで(Miltenyi Biotec、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)で作製した)のカクテルで標識し、続いて、抗マイクロビーズ−APCmAb(Miltenyi Biotec、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)で標識した。洗浄後、細胞を固定し、FACSにより解析した。
モノクローナル抗体mAb125(クローンAE9D6 ATCC番号HB−125)は、125Tg遺伝子導入マウスの表面IgM(B細胞受容体)の可溶性バージョンであり、それ故、それを、インスリンまたはインスリンとFcの融合タンパク質への結合のため使用して、インスリン特異的B細胞受容体へのそれらの結合特性を測定することができる。ヌードマウスにおける腹水生成を使用して、mAb125をインビボで作製し、当該技術分野において公知の方法を使用して、タンパク質G親和性クロマトグラフィーを介して精製した。ELISAプレート上にコーティングしたmAb125を使用して、それらのIC50値(データをプロットし、GraphPad Prism(GraphPad Software、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州)を使用して得られた曲線をフィッティングすることにより計算した)により定量した、mAb125(代替B細胞受容体(BCR))に結合する相対的効率を決定するための競合的阻害ELISAフォーマットにおいて、固定量のビオチン標識組換えヒトインスリン(RHI)に対して連続希釈のインスリンとFcの融合タンパク質を結合させた。96ウェルMaxiSorpプレートを、10μg/mLのmAb125で、1時間以上、室温(RT)でコーティングし、次に、洗浄し、SuperBlockブロッキング溶液(サーモフィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州)250μL/ウェルで、一晩、4℃でブロッキングした。0.1%Tween−80および10%v/vSuperBlock(PBST/SB10)を含有するPBSバッファーにおける試験のため、75μg/mL〜34ng/mLの範囲にある、インスリンとFcの融合タンパク質の8つの連続希釈液を調製した。それぞれの化合物の連続希釈液120μLを、1.2mLのチューブにおいて1.5ng/mLビオチン−RHI(20×)6μLと混合し、これらの混合溶液100μLを、複数チャンネルのピペッターを使用して、mAb125コートプレートに直ちに加えた。プレートを、1時間、RTでインキュベーションし、次に、プレートウォッシャー(バイオテック、ウィヌースキ、バーモンド州)を使用して洗浄して、未結合の試薬を取り除いた。100μl/ウェルの1:20,000希釈したストレプトアビジン−HRP(サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州)をウェルに加え、1時間インキュベーションした。プレートを、プレートウォッシャーを使用して再度洗浄し、100μL/ウェルTMB溶液(ライフテクノロジーズ、カールスバド、カリフォルニア州)をプレートに加えた。5〜15分後に、ELISA停止溶液(Boston Bioproducts、アシュランド、マサチューセッツ州)100μLを全てのウェルに加えることにより、色の発生を停止させた。マイクロプレートリーダー(SpectraMaxl90、モレキュラーデバイス、サニーベール、CA)上、OD450nmで、プレートを読み取った。OD値を使用して、ビオチン−RHIの%阻害を計算し、GraphPad Prismを使用して、IC50値を計算した。
インスリン受容体結合アッセイは、ヒトIM−9細胞(ATCC番号CCL−159)の表面に存在するインスリン受容体に結合する、本明細書において開示されるインスリンとFcの融合タンパク質の能力を評価するよう設計した競合的結合アッセイである。FACS染色バッファー中で希釈した7つの連続希釈のインスリンとFcの融合タンパク質および対照組換えヒトインスリン(RHI)を、固定濃度のビオチン化RHIと予め混合し、次に、IM−9細胞に加え、氷上でインキュベーションして、細胞上に存在するインスリン受容体で生じる競合的結合を可能にした。次に、得られた結合したビオチン化RHIを、ストレプトアビジン−PE試薬により標識し、標識した受容体の蛍光強度を、FACSCaliburフローサイトメトリーにおいて解析した。IM−9細胞を、完全RPMI−10培地(10%ウシ胎児血清、25mM HEPES、および50μg/mLゲンタマイシンを含むRPMI)において、T75培養フラスコにおいて対数成長期で成長させ、50mLの試験管での培養の日に回収し、250×gで10分間遠心分離し、冷FACS染色培地(HBSS/2mMEDTA/Na−アジド/4%ウマ血清)において濃度2×106個の細胞/mLまで再懸濁し、氷上で維持した。
この結果は、本テクノロジーのインスリンとFcの融合タンパク質が、自己免疫疾患(例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、1型糖尿病)を予防する方法において有用であることを示す。
この結果は、本テクノロジーのインスリンとFcの融合タンパク質が、自己免疫疾患(例えば、自己免疫性糖尿病、例えば、1型糖尿病)を予防する方法において有用であることを示す。
本テクノロジーは、本出願に記載される特定の実施形態に関して制限されるべきではなく、それは、本テクノロジーの個々の態様の1つの説明と意図される。本テクノロジーの多くの修飾およびバリエーションは、当業者に明らかである、その精神および範囲から逸脱することなく、なされ得る。本明細書において挙げられたものに加えて、本テクノロジーの範囲内の機能的に均等な方法および装置は、前述の記載から当業者に明らかである。かかる修飾およびバリエーションは、本テクノロジーの範囲内にあることが意図される。本テクノロジーは、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物学的システムに限定されないこと、そしてそれらは、もちろん変動し得ることは理解されるべきである。明細書において使用される専門用語は、ただ、特定の実施形態の記載の目的であり、限定することは意図されないことも理解されるべきである。
Claims (32)
- Fcドメインに融合されたインスリンポリペプチドを含むインスリンとFcの融合タンパク質であって、前記インスリンポリペプチドが、B鎖ペプチド、C鎖ペプチド、およびA鎖ペプチドを含み、前記C鎖ペプチドのアミノ酸配列がAAKであり、場合により、競合的結合アッセイにおいてヒトインスリン受容体にIC50>5,000nMで結合する、インスリンとFcの融合タンパク質。
- インビトロで、インスリン+B細胞受容体のインスリンへの結合をIC50≦100nMで阻害する、請求項1に記載のインスリンとFcの融合タンパク質。
- T細胞を活性化して、組換えヒトインスリンにより活性化されたT細胞において観察されたものと比較して、低減されているIL−2レベルを分泌する、請求項1または2に記載のインスリンとFcの融合タンパク質。
- 前記A鎖ペプチドのアミノ酸配列が配列番号19を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のインスリンとFcの融合タンパク質。
- 前記FcドメインがヒトIgG1の野生型Fcフラグメントを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のインスリンとFcの融合タンパク質。
- 前記Fcドメインのアミノ酸配列が配列番号22を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のインスリンとFcの融合タンパク質。
- 前記B鎖ペプチドが、アミノ酸配列FVNQHLCGSHLVX1ALX2LVCGEX3GFFYTPK(配列番号28)(式中、X1は、EまたはQであり、X2は、YまたはAであり、X3は、RまたはEである)を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のインスリンとFcの融合タンパク質。
- 前記インスリンポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記Fcフラグメントに融合される、請求項1〜7のいずれか1項に記載のインスリンとFcの融合タンパク質。
- 前記ペプチドリンカーが、配列番号20または配列番号21である、請求項8に記載のインスリンとFcの融合タンパク質。
- Fcドメインに融合されたインスリンポリペプチドを含むインスリンとFcの融合タンパク質であって、前記インスリンポリペプチドが、B鎖ペプチド、C鎖ペプチド、およびA鎖ペプチドを含み、
前記B鎖ペプチドが、アミノ酸配列FVNQHLCGSHLVX1ALX2LVCGEX3GFFYTPK(配列番号28)(式中、X1は、EまたはQであり、X2は、YまたはAであり、X3は、RまたはEである)を含み、
前記C鎖ペプチドのアミノ酸配列がAAKである、
インスリンとFcの融合タンパク質。 - X2がAである、請求項10に記載のインスリンとFcの融合タンパク質。
- 前記A鎖ペプチドのアミノ酸配列が配列番号19を含む、請求項10または11に記載のインスリンとFcの融合タンパク質。
- 前記Fcドメインが、ヒトIgG1の野生型Fcフラグメントを含む、請求項10〜12のいずれか1項に記載のインスリンとFcの融合タンパク質。
- 前記Fcドメインのアミノ酸配列が配列番号22を含む、請求項10〜13のいずれか1項に記載のインスリンとFcの融合タンパク質。
- 前記インスリンポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記Fcフラグメントに融合される、請求項10〜14のいずれか1項に記載のインスリンとFcの融合タンパク質。
- 前記ペプチドリンカーが、配列番号20または配列番号21である、請求項15に記載のインスリンとFcの融合タンパク質。
- 前記インスリンとFcの融合タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、または配列番号8である、請求項10〜16のいずれか1項に記載のインスリンとFcの融合タンパク質。
- 配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、および配列番号10からなる群から選択されるインスリンとFcの融合タンパク質をコードする、組換え核酸配列。
- 請求項18に記載の組換え核酸配列、または配列番号1、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、もしくは配列番号36の核酸配列を含む、ベクター。
- 請求項19のベクターを含む、操作された真核生物の細胞。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載のインスリンとFcの融合タンパク質、および使用のための説明書を含む、キット。
- それを必要とする対象において自己免疫性糖尿病を処置または予防する方法であって、前記対象に有効量の請求項1〜17のいずれかに記載のインスリンとFcの融合タンパク質を投与することを含む、方法。
- 自己免疫性糖尿病が、1型糖尿病、若年性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、または潜在性自己免疫性糖尿病を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記対象が、自己免疫性糖尿病と診断されたか、またはそのリスクがある、請求項22または23に記載の方法。
- 前記対象が高血糖でない、請求項22〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、検出可能なレベルの、インスリン自己抗体(IAA)、抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)抗体、および抗膵島抗原2(IA−2)抗体からなる群から選択される少なくとも1つの自己免疫抗体を有する、請求項22〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、検出可能なレベルのインスリン特異的B細胞集団を有する、請求項22〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、(a)DRB1*0301−DQA1*0501−DQB1*0201;(b)DRB1*0405−DQA1*0301−DQB1*0302;(c)DRB1*0401−DQA1*0301−DQB*0302;(d)DRB1*0402−DQA1*0301−DQB1*0302;(e)DRB1*0404−DQA1*0301−DQB1*0302;および(f)DRB1*0801−DQB1*0401−DQB1*0402からなる群から選択される、1種または複数のヒト白血球抗原(HLA)ハプロタイプを持つ、請求項22〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インスリンとFcの融合タンパク質が、非経口、静脈内または皮下投与される、請求項22〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、少なくとも1回の投与に先立ち前記対象において観察されたものと比較して、前記インスリンとFcの融合タンパク質の少なくとも1回の投与後に抗インスリンB細胞数における低減を示す、請求項22〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、少なくとも1回の投与に先立ち前記対象において観察されたものと比較して、前記インスリンとFcの融合タンパク質の少なくとも1回の投与後に減少したレベルのインスリン自己抗体を示す、請求項22〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インスリンとFcの融合タンパク質の少なくとも1回の投与後の前記対象の血液グルコースレベルが、少なくとも1回の投与に先立ち前記対象において観察されたものと同等である、請求項22〜31のいずれか1項に記載の方法。
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