CN112789289A - 包含胰岛素肽和egf(a)肽的双功能化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含胰岛素和EGF(A)类似物或其衍生物的新型共价连接的双功能融合蛋白，及其药学用途。此外，本发明涉及包含这类双功能化合物的药物组合物，并且涉及这类化合物在治疗或预防与糖尿病有关的医学状况和与糖尿病相关的血脂异常中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及包含胰岛素类似物或其衍生物和EGF(A)类似物的新型双功能融合肽，及其药学用途。此外，本发明涉及包含这类双功能融合肽的药物组合物，并且涉及这类融合肽在治疗或预防与糖尿病有关的医学状况和与糖尿病相关的血脂异常中的用途。
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糖尿病是一种代谢失调，其中利用葡萄糖的能力部分或完全丧失。全球超过5％的人口患有糖尿病，还有数以百万计的人处于患该病的危险中。用于治疗糖尿病的胰岛素疗法已经使用了数十年，并且涉及每天施用数次胰岛素注射。这种疗法通常涉及每天一次或两次施用长效基础注射，以及在进餐时注射速效胰岛素(即餐时胰岛素)。2型糖尿病患者除了高血糖症外，还常常患有各种代谢功能障碍，例如血脂异常、肥胖症和心血管并发症，目前的胰岛素疗法对其仅具有有限的有益效果。以LDL-c(低密度脂蛋白胆固醇)升高、HDL降低和甘油三酯升高为特征的糖尿病性血脂异常是公认的心血管疾病(CVD)的驱动因素。
他汀类药物已用于血脂异常的治疗数十年，其给药显示出心血管事件的明显且持续的降低，具有可接受的安全性谱。尽管他汀类药物和其他降脂药物可以获得并广泛应用，但许多患者并未达到他们的目标LDL-C水平，并且仍处于患CVD的高风险中。
PCSK9(9型前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin)促进肝LDL-R(LDL受体)降解，由此降低肝LDL-R表面表达，并因此降低LDL颗粒的清除率。相反，阻断PCSK9增加了LDL-C以及其他致动脉粥样化脂蛋白如中密度脂蛋白和残留颗粒的清除。这种额外的清除可具有超出单独减少LDL所提供的效果的治疗益处。
LDL-R(LDL-R-(293-332))的EGF(A)(表皮生长因子样结构域A)序列(40个氨基酸)被公认为PCSK9结合的位点。已经显示分离的野生型EGF(A)肽以低μM范围内的IC50抑制PCSK9与LDL-R的结合(Biochemical and Biophysical Research Communications 375(2008)69–73)。这种较差的结合亲和力阻碍了EGF(A)肽的实际药学用途。
据称WO2012177741和J.Mol.Biol.(2012)422,685-696公开了EGF(A)的类似物及其Fc融合体。据称WO 2015/127273公开了抗PCSK9和GLP-1的融合。
据称WO2017121850公开了具有脂肪酸取代基的EGF(A)类似物。
两种抗PCSK9抗体——阿利库单抗(alirocumab)(
Sanofi-Aventis)和依伏库单抗(evolocumab)(
Amgen Europe BV)，最近已被批准用于治疗高LDL-C水平，每两周通过皮下注射给药。
众所周知，胰岛素疗法用于调节糖尿病患者的血糖水平。同样众所周知，患者有CVD的高风险并且处于发生微血管并发症(如肾病、视网膜病和神经病变)的风险下。通过目前的疗法，仍然约有50％的糖尿病患者死于心血管疾病。因此，当前强烈需要提供可以将降低血糖的效果与降低LDL胆固醇的效果结合在一起的治疗。
发明内容
在最宽泛的方面，本发明涉及将胰岛素与EGF(A)组合。
在另一方面，本发明的化合物包含胰岛素肽或其类似物、EGF(A)肽或其类似物、间隔体和取代基。
在另一方面，本发明的化合物是包含胰岛素肽或其类似物、EGF(A)肽或其类似物、间隔体和取代基的融合蛋白。
在另一方面，本发明的融合蛋白包含胰岛素肽、EGF(A)肽、间隔体和取代基，其中，
i.所述胰岛素肽是人胰岛素(SEQ ID NO:2和3)或人胰岛素的类似物
ii.所述EGF(A)肽是LDL-R(293-332)(SEQ ID NO:1)的EGF(A)结构域的类似物
iii.所述间隔体是肽连接体，其包含(GAQP)n或(GQAP)n的区段，其中n＝1-20，并且将胰岛素类似物B链的N末端与EGF(A)类似物的C末端连接
iv.所述取代基具有式(I)：Acy-AA2m-AA3p-，其中
Acy是包含约16个至约20个碳原子的脂肪二酸，
AA2是酸性氨基酸残基，并且其中m为1至10范围内的整数，并且
AA3是中性的含亚烷基二醇的氨基酸残基，且p为1至10范围内的整数，并且
其中AA2和AA3残基的最大数目为10，且
其中AA2和AA3残基可以以任何顺序出现，
或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
由于需要胰岛素给药的糖尿病患者属于CVD高危人群，因此在胰岛素化合物中包括降低LDLc的性质为糖尿病患者提供了改善的疗法，尤其是提供了胆固醇降低、治疗血脂异常和降低CVD的风险。
在一方面，本发明的双功能融合蛋白降低血糖水平并结合PCSK9，从而增强肝脏中功能性LDL-R的表达。
在一方面，本发明提供了新颖的双功能融合蛋白，其既能够激活胰岛素受体又能够结合PCSK9，即，将降低血糖的效果与降低LDL胆固醇的效果结合在一起。
在另一方面，本发明的双功能融合肽降低血糖水平并结合PCSK9，从而增强肝脏中功能性LDL-R的表达。
在另一方面，本发明的融合肽降低血糖水平。
在另一方面，本发明的融合肽降低LDL胆固醇。
在另一方面，本发明涉及包含根据本发明的融合肽的药物组合物。
在另一方面，本发明涉及用作药物的根据本发明的融合肽。
在另一方面，本发明涉及用于治疗糖尿病和与糖尿病相关的血脂异常的根据本发明的融合肽。
在另一方面，本发明涉及根据本发明的融合肽的医学用途。
本发明也可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。
附图简述
图1显示了本发明的实施例4、9和14化合物的降血糖效果，它们都具有十八烷二酰基-gGlu-2xOEG侧链并且具有不同长度的GQAP/GAQP间隔体。
图2显示了本发明的实施例2、12、17、18和19化合物的降血糖效果，它们都具有十八烷二酰基-gGlu-2xOEG侧链并且具有不同长度的GQAP/GAQP间隔体。
图3显示了相对于具有GQEP间隔体的比较化合物1和2的降血糖效果，具有不同长度的GQAP/GAQP间隔体的本发明的实施例4和17化合物的降血糖效果，所有这些都具有十八烷二酰基-gGlu-2xOEG侧链和媒介物。
图4显示了相对于具有GQEP间隔体的比较化合物1和2的降血糖效果，具有不同长度的GQAP/GAQP间隔体的本发明的实施例3、11和13化合物的降血糖效果，所有这些都具有十八烷二酰基-gGlu-2xOEG侧链和媒介物。
图5显示了相对于具有2xGQEP间隔体的比较化合物1的降血糖效果，具有2xGQAP/GAQP间隔体的本发明的实施例4和8化合物的降血糖效果，所有这些都具有十八烷二酰基-gGlu-2xOEG侧链。
图6显示了相对于具有4xGQEP间隔体的比较化合物4的降血糖效果，具有4xGAQP间隔体的本发明的实施例11和12化合物的降血糖效果，所有这些都具有十八烷二酰基-gGlu-2xOEG侧链。
图7显示了相对于具有2xGQEP间隔体的比较化合物1的降血糖效果，具有2xGAQP间隔体的本发明的实施例3、4和5化合物的降血糖效果，所有这些化合物都具有十八烷二酰基-gGlu-2xOEG侧链。
图8显示了相对于具有6xGQEP间隔体的比较化合物6的降血糖效果，具有6xGAQP间隔体的本发明的实施例13、14和15化合物的降血糖效果，所有这些都具有C18侧链。
图9显示了相对于具有2x或8x GQEP间隔体的比较化合物5和7的降血糖效果，具有2xGAQP间隔体的本发明的实施例1化合物的降血糖效果，所有这些都具有十六烷二酰基-gGlu-2xOEG侧链。
图10显示了相对于具有6xGQEP间隔体的比较化合物3的降血糖效果，具有6xGAQP间隔体的本发明的实施例16化合物的降血糖效果，这两者都具有二十烷二酰基-gGlu-2xOEG侧链。
图11显示了相对于“仅胰岛素”比较化合物8的降血糖效果，具有2xGAQP的本发明的实施例4化合物的降血糖效果，这两者都具有十八烷二酰基-gGlu-2xOEG侧链。
图12显示了在t＝0min时静脉内给予实施例3化合物(0、3、10、30和100nmol/kg)，随后在t＝15min时静脉内给予媒介物或hPCSK9的剂量响应。在向糖尿病小鼠给予媒介物或实施例3化合物，随后给予媒介物或hPCSK9后的肝LDL-r蛋白表达。
图13显示了在t＝0min时静脉内给予实施例3化合物(0、3、10、30和100nmol/kg)，随后在t＝15min时静脉内给予媒介物或hPCSK9的剂量响应。在向糖尿病小鼠给予媒介物或实施例3化合物后的血糖谱。
图14显示了向糖尿病小鼠的给药，在t＝0min时静脉内给予实施例3和13化合物(0和10nmol/kg)，随后在t＝15min时静脉内给予媒介物或hPCSK9。在向糖尿病小鼠给予媒介物、实施例3和13化合物或EGF(A)衍生物(比较化合物10)，随后给予hPCSK9后的肝LDL-r蛋白表达。
描述
本发明涉及激活胰岛素受体并与PCSK9结合的双功能化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及包含胰岛素肽和EGF(A)肽的融合蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及包含胰岛素类似物和EGF(A)类似物的融合蛋白，其中所述胰岛素类似物是人胰岛素(SEQ ID NO:2和3)的类似物，并且所述EGF(A)类似物是LDL-R(293-332)(SEQ ID NO:1)的EGF(A)结构域的类似物。
在另一个实施方案中，所述EGF(A)肽是SEQ ID NO:1的肽的类似物。
在一个实施方案中，所述胰岛素类似物经由胰岛素类似物B链的N末端氨基酸残基与EGF(A)肽类似物的C末端氨基酸融合。
在一个实施方案中，本发明涉及包含胰岛素肽、EGF(A)肽、间隔体和取代基的融合蛋白，其中，
i.所述胰岛素肽是人胰岛素(SEQ ID NO:2和3)或人胰岛素的类似物
ii.所述EGF(A)肽是LDL-R(293-332)(SEQ ID NO:1)的EGF(A)结构域的类似物
iii.所述间隔体是肽连接体，其包含(GAQP)n或(GQAP)n的区段，其中n＝1-20，并且将胰岛素类似物B链的N末端与EGF(A)类似物的C末端连接
iv.所述取代基具有式(I)：Acy-AA2m-AA3p-，其中
Acy是包含约16个至约20个碳原子的脂肪二酸，
AA2是酸性氨基酸残基，并且其中m为1至10范围内的整数，并且
AA3是中性的含亚烷基二醇的氨基酸残基，且p为1至10范围内的整数，并且
其中AA2和AA3残基的最大数目为10，且
其中AA2和AA3残基可以以任何顺序出现，
或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
在一个实施方案中，所述胰岛素类似物经由胰岛素类似物N末端B链的B1氨基酸残基与EGF(A)肽类似物的C末端氨基酸融合。
在一个实施方案中，所述胰岛素类似物经由胰岛素类似物B链的N末端氨基酸残基，经由间隔体，与EGF(A)肽类似物的C末端氨基酸融合。
在一个实施方案中，所述胰岛素类似物经由胰岛素类似物B链的N末端氨基酸残基，经由包含(GAQP)n或(GQAP)n(其中n＝2-19)的区段的间隔体，与EGF(A)肽类似物的C末端氨基酸融合。
由于需要胰岛素给药的糖尿病患者属于CVD高危人群，因此在胰岛素融合肽中包括降低LDLc的性质将为糖尿病患者提供改善的疗法，并降低其CVD风险。
在一个实施方案中，本发明的融合肽降低血糖水平。
在另一个实施方案中，本发明的融合肽相对于包含(GQEP)n的比较融合肽显示出优异的血糖降低。
在一个实施方案中，本发明的融合肽将降低血糖的效果与降低LDL胆固醇的效果结合在一起。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含根据本发明的融合肽的药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的融合肽和药学上可接受的辅料的药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及用作药物的根据本发明的融合肽。
在另一实施方案中，本发明涉及用于治疗糖尿病和与糖尿病相关的血脂异常的根据本发明的融合肽。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的融合肽的医学用途。
一般定义
本文使用术语“化合物”表示分子实体，因此，“化合物”除了针对每种化合物或化合物组定义的最小元件外，还可具有不同的结构元件。因此，化合物可以是融合化合物/肽或其衍生物，只要该化合物包含所定义的结构和/或功能元件即可。术语“化合物”还旨在涵盖其药学上相关的形式，即，本发明涉及本文所定义的化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
例如在本发明的上下文中使用的术语“肽”或“多肽”是指包含一系列通过酰胺(或肽)键互相连接的氨基酸的化合物。在特定实施方案中，肽由通过肽键相互连接的氨基酸组成。
术语“类似物”通常是指与参考氨基酸序列相比，其序列具有一个或多个氨基酸改变的肽。与其参考序列相比，“包含”某些指定改变的类似物可包含进一步的改变。在特定实施方案中，类似物“具有”或“包含”指定的改变。在其他特定实施方案中，类似物“由改变组成”。当对于类似物使用术语“组成”或“由……组成”时，例如类似物由一组指定的氨基酸突变组成时，应该理解，指定的氨基酸突变是类似物中仅有的氨基酸突变。相反，“包含”一组指定的氨基酸突变的类似物可以具有另外的突变。在本申请的上下文中，术语“类似物”还表示EGF(A)人胰岛素融合蛋白的类似物。
术语“衍生物”通常是指可以通过化学修饰，特别是通过一个或多个取代基的共价连接，由天然肽或其类似物制备的化合物。衍生物还可以被称为酰化类似物。
术语“氨基酸”包括蛋白型(proteinogenic)(或天然)氨基酸(其中有20种标准氨基酸)以及非蛋白型(或非天然)氨基酸。蛋白型氨基酸是天然地并入蛋白质中的氨基酸。标准氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。非蛋白型氨基酸或者不存在于蛋白质中，或者不通过标准细胞机制产生(例如，它们可能已经经历翻译后修饰)。
通常，如本文所用的氨基酸残基(肽/蛋白质序列)可用其全名、其单字母代码和/或其三字母代码来表示。这三种方式完全等效并且可互换使用。在下文中，未说明其光学异构体的本发明肽的各个氨基酸都应被理解为意指L-异构体(除非另有说明)。氨基酸是含有氨基和羧酸基团以及可选的一个或多个通常被称为侧链的额外基团的分子。本文中，术语“氨基酸残基”是在形式上已从羧基中去除羟基的氨基酸，和/或在形式上已从氨基中去除氢原子的氨基酸。
术语“融合”和“融合的”用于包含两个单独定义的肽/蛋白质序列的化合物，这两个序列通过肽键或通过肽间隔体连接(也通过肽键连接)。
胰岛素
如本文所用的术语“人胰岛素”意指人胰岛素激素，其结构和性质是众所周知的。人胰岛素具有两条多肽链，被命名为A链和B链。A链为21个氨基酸的肽，而B链为30个氨基酸的肽，这两条链通过以下的二硫桥连接：在A链位置7上的半胱氨酸与B链位置7上的半胱氨酸之间的第一桥，以及在A链位置20上的半胱氨酸与B链位置19上的半胱氨酸之间的第二桥。第三桥存在于A链的位置6和11上的半胱氨酸之间。
人胰岛素A链具有以下序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO:2)，而B链具有以下序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO:3)。
在人体内，该激素被合成为单链前体胰岛素原(前胰岛素原)，其由24个氨基酸的前肽以及随后的含有86个氨基酸的胰岛素原组成，其构型为：前肽-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A，其中C为31个氨基酸的连接肽。Arg-Arg和Lys-Arg是该连接肽从A和B链上切割的切割位点。
根据本发明的“胰岛素”在此应被理解为人胰岛素或来自另一物种的胰岛素，如猪或牛胰岛素。
如本文所用的术语“胰岛素肽”、“胰岛素化合物”或“胰岛素”意指作为人胰岛素或其具有胰岛素活性(即，激活胰岛素受体)的类似物或衍生物的肽。
胰岛素类似物
如本文所用的术语“胰岛素类似物”意指经修饰的人胰岛素，其中该胰岛素的一个或多个氨基酸残基已经被其他氨基酸残基置换，并且/或者其中一个或多个氨基酸残基已从该胰岛素中删除，并且/或者其中一个或多个氨基酸残基已被添加和/或插入到该胰岛素中。
如本文所用的术语“突变”意指人胰岛素序列内的氨基酸的置换或缺失。术语突变不包括向人胰岛素序列的添加、延长或延伸。胰岛素分子中的突变通过说明置换天然氨基酸残基的氨基酸残基所在的链(A或B)、其位置以及单字母或三字母代码来表示。
如本文所用的胰岛素类似物的任何突变是指单独的胰岛素肽的突变，而不包括与胰岛素肽/类似物连接的任何间隔体肽。
所谓“连接肽”或“C-肽”意指单链胰岛素原-分子的B-C-A多肽序列的连接部分“C”。在人胰岛素链中，C-肽连接B链的位置30和A链的位置1，且其长度为35个氨基酸残基。在人胰岛素中，该连接肽包括两个末端二碱性氨基酸序列，例如Arg-Arg和Lys-Arg，它们用作该连接肽从A和B链上切割以形成双链胰岛素分子的切割位点。
“desB30”或“B(1-29)”意指缺乏B30氨基酸的天然胰岛素B链或其类似物，而“A(1-21)”意指天然胰岛素A链。因此，例如，desB30人胰岛素是人胰岛素的一种类似物，其中B链中位置30处的氨基酸缺失。
本文中，如“A1”、“A2”和“A3”等术语分别表示在胰岛素A链中的位置1、2和3等位置上的氨基酸(从N末端开始计数)。类似地，如“B1”、“B2”和“B3”等术语分别表示在胰岛素B链中的位置1、2和3等位置上的氨基酸(从N末端开始计数)。使用氨基酸的单字母代码，诸如A21A、A21G和A21Q等术语表示A21位置的氨基酸分别为A、G和Q。使用氨基酸的三字母代码，相应的表示分别为A21Ala、A21Gly和A21Gln。
在一个实施方案中，本发明的人胰岛素的类似物或衍生物具有降低血糖水平的能力。
在一个实施方案中，本发明的人胰岛素的类似物或衍生物激活胰岛素受体。
在一个实施方案中，本发明的人胰岛素的类似物或衍生物降低血糖。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含人胰岛素的类似物或其衍生物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有最多12个突变的人胰岛素的类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有最多10个突变的人胰岛素的类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有1-6个突变的人胰岛素的类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有1-3个突变的人胰岛素的类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有一个突变的人胰岛素的类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有两个突变的人胰岛素的类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有三个突变的人胰岛素的类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有四个突变的人胰岛素的类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有五个突变的人胰岛素的类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有六个突变的人胰岛素的类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有七个突变的人胰岛素的类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有八个突变的人胰岛素的类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有九个突变的人胰岛素的类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有10个突变的人胰岛素的类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含人胰岛素。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有desB30的胰岛素类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有A14E的胰岛素类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有B3E的胰岛素类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有A14E、desB30的胰岛素类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有B3E、desB30的胰岛素类似物。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有desB30的胰岛素类似物，并且在所述胰岛素类似物中包含另外9个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有desB30的胰岛素类似物，并且在所述胰岛素类似物中包含另外8个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有desB30的胰岛素类似物，并且在所述胰岛素类似物中包含另外7个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有desB30的胰岛素类似物，并且在所述胰岛素类似物中包含另外6个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有desB30的胰岛素类似物，并且在所述胰岛素类似物中包含另外5个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有desB30的胰岛素类似物，并且在所述胰岛素类似物中包含另外4个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有desB30的胰岛素类似物，并且在所述胰岛素类似物中包含另外3个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有desB30的胰岛素类似物，并且在所述胰岛素类似物中包含另外2个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含含有desB30的胰岛素类似物，并且在所述胰岛素类似物中包含另外一个突变。
EGF(A)
本文使用术语“EGF(A)化合物”或“EGF(A)肽”来泛指包含EGF(A)肽的融合蛋白，其涵盖如SEQ ID NO:1所定义的wt-LDL-R(293-332)及其类似物。术语EGF(A)化合物包括EGF-(A)肽及其类似物的衍生物，即，如本文所述的具有酰基部分的EGF(A)肽类似物是EGF(A)化合物的典型实例。本文中的术语“EGF(A)类似物”是指LDL-R(293-332)(SEQ ID NO:1)的修饰的EGF(A)结构域。
如本文所用的术语“LDL-R的EGF(A)结构域”、“LDL-R(293-332)”、“天然LDL-R(293-332)、“EGF(A)(293-332)”、“野生型EGF(A)”、“wt-EGF(A)”或“天然EGF(A)”是指由序列SEQ ID NO:1组成的肽，其为：
Gly-Thr-Asn-Glu-Cys-Leu-Asp-Asn-Asn-Gly-Gly-Cys-Ser-His-Val-Cys-Asn-Asp-Leu-Lys-Ile-Gly-Tyr-Glu-Cys-Leu-Cys-Pro-Asp-Gly-Phe-Gln-Leu-Val-Ala-Gln-Arg-Arg-Cys-Glu。
在该式中，氨基酸残基的编号遵循LDL-R的EGF(A)结构域(LDL-R-(293-332))的编号，其中第一个(N末端)氨基酸残基被编号为第293号或被给予第293号的位置，并且后续的朝向C末端的氨基酸残基被编号为294、295、296等，直到最后一个(C末端)氨基酸残基，其在LDL-R的EGF(A)结构域中是编号为332的Glu。
在序列表中进行不同的编号，其中SEQ ID NO:1的第一个氨基酸残基(Gly)被指定为第1号，并且最后一个(Glu)被指定为第40号。这同样适用于序列表中的其他序列，即所指定的N末端氨基酸为第1号，而无论其相对于293Gly或参照LDL-R(293-332)的293置换氨基酸残基如何定位。然而，如上所说明的，本文中氨基酸位置的编号是参照LDL-R(293-332)的。
EGF(A)类似物
术语“EGF(A)类似物”通常是指与参考氨基酸序列相比，其序列具有一个或多个氨基酸改变的肽。
如本文所用的术语“LDL-R(293-332)的EGF(A)结构域”、“SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域”、“LDL-R(293-332)类似物”、“EGF(A)类似物”或“SEQ IDNO:1的类似物”可被称为肽，其序列包含突变，即相对于序列SEQ ID NO:1的氨基酸置换或缺失。
如本文所用的EGF(A)类似物的任何突变是指单独的EGF(A)肽的突变，而不包括与EGF(A)肽/类似物连接的任何间隔体肽。
在一个实施方案中，根据SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)的EGF(A)结构域或其类似物能够抑制PCSK9与人低密度脂蛋白受体(LDL-R)的结合。
在一个实施方案中，根据SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)的EGF(A)结构域或其类似物具有抑制PCSK9与LDL-R结合的能力。
在一个实施方案中，根据SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)的EGF(A)结构域或其类似物具有抑制PCSK9与LDL-R结合并降低血液中的LDL水平的能力。
在一个实施方案中，根据SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)的EGF(A)结构域或其类似物降低LDL血液水平。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域，其中与SEQ ID NO.:1相比，所述EGF(A)类似物包含1-15个氨基酸突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域，其中与SEQ ID NO.:1相比，所述EGF(A)类似物包含1-10个氨基酸突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域，其中与SEQ ID NO.:1相比，所述EGF(A)类似物包含1-8个氨基酸突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域，其中与SEQ ID NO.:1相比，所述EGF(A)类似物包含1-6个氨基酸突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域，其中所述EGF(A)类似物包含1-5个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域，其中所述EGF(A)类似物包含一个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域，其中所述EGF(A)类似物包含两个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域，其中所述EGF(A)类似物包含三个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域，其中所述EGF(A)类似物包含四个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域，其中所述EGF(A)类似物包含五个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域，其中所述EGF(A)类似物包含六个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域，其中所述EGF(A)类似物包含七个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域，其中所述EGF(A)类似物包含八个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域，其中所述EGF(A)类似物包含九个突变。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)类似物的EGF(A)结构域，其中所述EGF(A)类似物包含10个突变。
换言之，肽类似物可以参照天然LDL-R(293-332)EGF(A)肽来描述，即描述为与天然LDL-R(293-332)EGF(A)(SEQ ID NO:1)相比其中许多氨基酸残基已经改变的其类似物。这些变化可独立地代表一个或多个氨基酸突变。
并入本发明融合肽中的EGF(A)类似物可被称为以下LDL-R(293-332)EGF(A)类似物：(301Leu,309Arg,312Glu,321Glu)LDL-R(293-332)EGF(A)或(Leu301,Arg309,Glu312,Glu321)-LDL-R(293-332)EGF(A)或(301L,309R,312E,321E)LDL-R(293-332)或(L301,R309,E312,E321)LDL-R(293-332)。这意味着当这种类似物与天然LDL-R(293-332)比对时，其i)在该类似物中根据该比对与天然LDL-R(293-332)EGF(A)的位置301相对应的位置处具有Leu，ii)在该类似物中与天然LDL-R(293-332)EGF(A)的位置309相对应的位置处具有Arg，iii)在该类似物中与天然LDL-R(293-332)EGF(A)的位置312相对应的位置处具有Glu，iv)在该类似物中与天然LDL-R(293-332)EGF(A)的位置321相对应的位置处具有Glu。
与SEQ ID NO:1相比，“包含”某些指定改变的类似物可包含进一步的改变。
本发明的融合肽内的EGF(A)肽类似物包含氨基酸残基301从Asn至Leu的氨基酸置换，还被描述为Asn301Leu、301Leu，或简单地描述为301L。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的EGF(A)类似物，其中所述EGF(A)类似物包含301Leu。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的EGF(A)类似物，其中所述EGF(A)类似物包含309R。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的EGF(A)类似物，其中所述EGF(A)类似物包含312E。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的EGF(A)类似物，其中所述EGF(A)类似物包含321E。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的EGF(A)类似物，其中所述EGF(A)类似物包含301L和309R。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的EGF(A)类似物，其中所述EGF(A)类似物包含301L、309R和312E。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的EGF(A)类似物，其中所述EGF(A)类似物包含301L、309R、312E和321E。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含SEQ ID NO:1的EGF(A)类似物，其中该EGF(A)肽类似物包含由如下所列的第i-vii组中的任一组表示的氨基酸突变：
i.301Leu
ii.301Leu和309Arg
iii.301Leu和312Glu
iv.301Leu和321Glu
v.301Leu、309Arg、312Glu
vi.301Leu、309Arg和321Glu
vii.301Leu、309Arg、312Glu和321Glu。
EGF(A)胰岛素融合蛋白
本发明的化合物或融合肽包含胰岛素肽、EGF(A)肽和间隔体，其中，
i.所述胰岛素肽是人胰岛素(SEQ ID NO:2和3)或人胰岛素的类似物，
ii.所述EGF(A)肽是LDL-R(293-332)(SEQ ID NO:1)的EGF(A)结构域的类似物，并且
iii.所述间隔体是肽连接体，其将胰岛素类似物B链的N末端与EGF(A)类似物的C末端连接。
本发明的化合物或融合肽进一步包含与所述融合蛋白的氨基酸残基连接的取代基。
EGF(A)胰岛素融合蛋白的名称是作为相对于如上详述的EGF(A)和人胰岛素蛋白的类似物和衍生物而给出的。连接两个蛋白质和与融合蛋白连接的取代基的间隔体的命名在下文详述。
本发明的化合物可以互换地称为“本发明的化合物”、“本发明化合物”、“双功能化合物”、“本发明的融合蛋白”、“本发明融合蛋白”。
间隔体
通常，融合肽/蛋白包含间隔体，以确保两个肽/蛋白质末端存在的任何功能性都不会被其他肽/蛋白质的邻近性所干扰。
在一个实施方案中，该间隔体是肽，其在本文中被称为间隔肽或肽间隔体或肽连接体。各种间隔肽是本领域已知的，并且可以放置在胰岛素类似物与EGF(A)类似物之间以获得融合化合物。
当欲融合两个肽区段时，顺序可能会影响所得融合化合物以及包含它的衍生物的功能性。
在本发明的一个实施方案中，从N末端开始的EGF(A)类似物和胰岛素类似物的顺序是EGF(A)类似物，随后是胰岛素类似物，任选地由间隔肽隔开。在一个实施方案中，EGF(A)类似物的C末端与胰岛素类似物B链的N末端融合。
在一个实施方案中，所述间隔体是由经由肽键连接的4-80个氨基酸组成的肽区段。
在一个实施方案中，所述间隔体包含以下氨基酸残基中的一个或多个：Ala(A)，Gly(G)，Pro(P)，Gln(Q)。
出人意料的是，本发明人发现间隔体的氨基酸组成影响化合物降低血糖水平的能力。相对于包含带电荷的间隔体如(GQEP)n的比较化合物，包含不带电荷的间隔体(GQAP)n或(GAQP)n的本发明化合物显示出优异的血糖降低。此外，还发现间隔体的长度影响化合物降低血糖水平的能力。
表1.本发明化合物/融合肽中包含的间隔体和比较化合物中包含的间隔体的实例
实施例4的EGF(A)-胰岛素融合蛋白衍生物内的间隔体被命名为[GAQP]2，这意味着将EGF(A)肽的C末端残基与胰岛素B链的N末端残基连接的间隔体具有序列(GAQP)2，其还可以被表示为GAQPGAQP或2xGAQP或[GAQP]2或2x(GAQP)。氨基酸残基可用其全名、其单字母代码和/或其三字母代码来表示。这三种方式完全等效并且可互换使用。
类似地，实施例2的EGF(A)-胰岛素融合蛋白衍生物内的间隔体被命名为[GAQP]10，这意味着将EGF(A)肽的C末端残基与胰岛素B链的N末端残基连接的间隔体具有序列(GAQP)10，其还可以被表示为10xGAQP、[GAQP]10、10x(GAQP)或GAQPGAQPGAQPGAQPGAQPGAQPGAQPGAQPGAQPGAQP。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白相对于包含(GQEP)n的比较化合物显示出优异的血糖降低。
在一个实施方案中，其中间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n的本发明的融合蛋白相对于包含(GQEP)n的比较化合物显示出优异的血糖降低。
在另一方面，其中间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n(其中n＝1-20)的本发明的融合蛋白相对于包含(GQEP)n的比较化合物显示出优异的血糖降低。
在另一方面，其中间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n(其中n＝2-19)的本发明的融合蛋白相对于包含(GQEP)n的比较化合物显示出优异的血糖降低。
在另一个实施方案中，其中间隔体包含(GAQP)n(其中n＝2-10)的本发明的融合蛋白相对于包含(GQEP)n的比较化合物显示出优异的血糖降低。
在另一个实施方案中，其中间隔体包含(GAQP)n(其中n＝2-10)的本发明的融合蛋白相对于包含(GQEP)n的比较化合物和包含(GAQP)n(n＝12-19)的化合物均显示出优异的血糖降低。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝1-20。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝2-19。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝2-12。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝2-10。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝2-8。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝2-6。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝2-4。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝4-6。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝2。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝3。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝4。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝5。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝6。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝7。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝8。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝9。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝10。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝11。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝12。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝13。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝14。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝15。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝16。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝17。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝18。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝19。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝20。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体由(GAQP)n或(GQAP)n组成，其中n＝2-19，或者由[(GAQP)n或(GQAP)n]组成，其中n＝2-10。
在一个实施方案中，本发明的融合肽包含间隔体，该间隔体由(GAQP)n或(GQAP)n组成，其中n＝2-19，或者由[(GAQP)n或(GQAP)n]组成，其中n＝2-6。
取代基
在一个实施方案中，取代基/酰基部分连接至本发明的融合蛋白(即，双功能胰岛素EGF(A)融合化合物或双功能化合物)。
理想的是，取代基对EGF(A)肽的功能性没有影响或具有最小的影响，并且对胰岛素的功能性具有预期影响，即胰岛素受体亲和力的降低，类似于将酰基部分连接至不带有EGF(A)肽的胰岛素的影响。
在一个实施方案中，酰基部分经由胰岛素类似物序列内的Lys/K氨基酸残基连接。
在一个实施方案中，与本发明化合物连接的取代基具有通式(I)：Acy-AA2m-AA3p-，其中
Acy是包含约16个至约20个碳原子的脂肪二酸，
AA2是酸性氨基酸残基，并且其中m为1至10范围内的整数，并且
AA3是中性的含亚烷基二醇的氨基酸残基，且p为1至10范围内的整数，并且
其中AA2和AA3残基的最大数目为10，且
其中AA2和AA3残基可以以任何顺序出现，
或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
在一个实施方案中，取代基具有式(I)Acy-AA2m-AA3p-，其中所述Acy包含选自1,16-十六烷二酸、1,18-十八烷二酸和1,20-二十烷二酸的脂肪二酸基团。
在一个实施方案中，取代基具有式(I)Acy-AA2m-AA3p-，其中所述Acy包含脂肪二酸基团1,16-十六烷二酸。
在一个实施方案中，取代基具有式(I)Acy-AA2m-AA3p-，其中所述Acy包含脂肪二酸基团1,18-十八烷二酸。
在一个实施方案中，取代基具有式(I)Acy-AA2m-AA3p-，其中所述Acy包含脂肪二酸基团1,20-二十烷二酸。
在一个实施方案中，取代基具有式(I)Acy-AA2m-AA3p-，其中所述AA2m包含gGlu，gGlu代表由以下结构表示的γ谷氨酸残基：
在一个实施方案中，取代基具有式(I)Acy-AA2m-AA3p-，其中所述AA3p包含[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基或氨基酸残基8-氨基-3,6-二氧杂辛酸-NH(CH2)2O(CH2)2OCH2CO-，并且由以下结构表示：
在一个实施方案中，取代基具有式(I)Acy-AA2m-AA3p-，并且其中AA2m-AA3p-独立地由gGlu-OEG或gGlu-OEG-OEG表示。
在一个实施方案中，取代基具有式(I)Acy-AA2m-AA3p-，并且其中AA2m-AA3p-由gGlu-OEG表示。
在一个实施方案中，取代基具有式(I)Acy-AA2m-AA3p-，并且其中AA2m-AA3p-由gGlu-OEG-OEG表示。
在一个实施方案中，取代基具有式(I)Acy-AA2m-AA3p-，独立地由以下表示：
i.C16二酸-gGlu，
ii.C18二酸-gGlu-OEG，
iii.C18二酸-gGlu-2xOEG或
iv.C20二酸-gGlu-2xOEG。
在一个实施方案中，取代基具有式(I)Acy-AA2m-AA3p-，由C16二酸-gGlu表示。
在一个实施方案中，取代基具有式(I)Acy-AA2m-AA3p-，由C18二酸-gGlu-OEG表示。
在一个实施方案中，取代基具有式(I)Acy-AA2m-AA3p-，由C18二酸-gGlu-2xOEG表示。
在一个实施方案中，取代基具有式(I)Acy-AA2m-AA3p-，由C20二酸-gGlu-2xOEG表示。
在另一个实施方案中，与本发明的融合肽连接的酰基部分具有通式Acy-AA2m-AA3p-(I)，其中AA2选自L-或D-gGlu、L-或D-Glu、L-或D-Asp、L-或D-homoGlu。
被命名为AA2的酸性氨基酸残基是分子量最高为约200Da的氨基酸，其包含两个羧酸基团和一个伯氨基或仲氨基。
被命名为AA3的中性含亚烷基二醇的氨基酸残基是亚烷基二醇部分，任选地是在一个末端包含羧酸官能团且在另一末端包含氨基官能团的寡聚或多聚亚烷基二醇部分。
在本文中，术语亚烷基二醇部分涵盖单亚烷基二醇部分以及寡聚亚烷基二醇部分。单和寡聚亚烷基二醇包含基于单和寡聚乙二醇的、基于单和寡聚丙二醇的以及基于单和寡聚丁二醇的链，即基于重复单元-CH2CH2O-、-CH2CH2CH2O-或-CH2CH2CH2CH2O-的链。亚烷基二醇部分是单分散的(具有明确限定的长度/分子量)。单亚烷基二醇部分在每个末端包含含有-OCH2CH2O-、-OCH2CH2CH2O-或-OCH2CH2CH2CH2O-的不同基团。
如本文所提及的，AA2和AA3在具有式(I)(Acy-AA2m-AA3p-)的酰基部分中出现的顺序可以独立地互换。因此，式Acy-AA2m-AA3p-还涵盖诸如以下的部分，例如式Acy-AA2m-AA3p-、式Acy-AA2-AA3n-AA2-和式Acy-AA3p-AA2m-，其中AcyAA2、AA3、n、m和p如本文所定义。
如本文所提及的，Acy、AA2和/或AA3部分之间的连接通过从在形式上构成其的母体化合物中除去水以形成酰胺键(肽键)(-CONH-)而获得。这意味着为了获得具有式(I)(Acy-AA2m-AA3p-，其中Acy、AA2、AA3、m和p如本文所定义)的酰基部分的完整通式，必须在形式上采用术语Acy、AA2和AA3给出的化合物，并从其中除去氢和/或羟基，并在形式上在游离端连接如此获得的结构单元。
对于取代基的命名，在一些情况下，命名是根据IUPAC命名法进行的，而在其他情况下，命名是按照肽命名法进行的。
作为示例，具有以下结构的实施例2化合物的酰基部分：
例如，可以被命名为“十八烷二酰基-gGlu-2xOEG”、“十八烷二酰基-gGlu-(OEG)2”、“十八烷二酰基-γGlu-2xOEG”、“十八烷二酰基-γGlu-(OEG)2”、“1,18-十八烷二酰基-gGlu-2xOEG”、“(C18二酸)-gGlu-2xOEG”、“C18d-gGlu-2xOEG”等，其中γGlu(和gGlu)是L-构型的氨基酸γ-谷氨酸的简写形式，而“2x”是指随后的残基重复2次。
Gamma Glu、γGlu和gGlu是L-构型的氨基酸γ-谷氨酸H2N-CH(CO2H)-CH2CH2-CO2H(经由α氨基和经由gamma(侧链)羧基连接)的简写形式。
OEG是氨基酸残基8-氨基-3,6-二氧杂-辛酸NH2(CH2)2O(CH2)2OCH2CO2H的简写形式。
在一个实施方案中，式Acy-AA2m-AA3p-的取代基由以下表示：
在一个实施方案中，式Acy-AA2m-AA3p-的取代基由以下表示：
在一个实施方案中，式Acy-AA2m-AA3p-的取代基由以下表示：
在一个实施方案中，式Acy-AA2m-AA3p-的取代基由以下表示：
式Acy-AA2m-AA3p-的取代基的上述非限制性实例中的任何一个可以连接至存在于任何本发明化合物中的赖氨酸残基的ε氨基上，从而给出本发明的酰化化合物的其他具体实例。可以通过任何方便的方法引入所需的式Acy-AA2m-AA3p-的基团，并且在现有技术中公开了许多用于这类反应的方法。
结合以上详述的命名法，将实施例1的EGF(A)-胰岛素融合化合物衍生物命名为“EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B3E,B29K(十六烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)”，来表示EGF(A)肽含有相对于天然EGF(A)的置换301L、309R、312E、321E，胰岛素肽含有置换B3E和desB30，并且胰岛素B29位置的赖氨酸已用十六烷二酰基-gGlu-2xOEG部分衍生化(酰化)。将EGF(A)肽的C末端残基与胰岛素B链的N末端残基连接的间隔体具有序列(GAQP)2，其还可以被表示为GAQPGAQP或2xGAQP或[GAQP]2。
类似地，将实施例2的EGF(A)-胰岛素融合蛋白衍生物命名为“EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]10-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)”，来表示EGF(A)肽含有相对于天然EGF(A)的置换301L、309R、312E、321E，胰岛素肽含有置换desB30，并且胰岛素B29位置的赖氨酸已用十八烷二酰基-gGlu-2xOEG部分衍生化(酰化)。将EGF(A)肽的C末端残基与胰岛素B链的N末端残基连接的间隔体具有序列(GAQP)10，其还可以被表示为10xGAQP、[GAQP]10或GAQPGAQPGAQPGAQPGAQPGAQPGAQPGAQPGAQPGAQP。
在整个申请中，给出了本发明的优选化合物的通式和名称。
表2.本发明化合物的实例
在一个实施方案中，本发明涉及选自实施例1至24的融合蛋白的化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及选自实施例1的融合蛋白的化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及独立地选自实施例2-5、8-15和17-21的实施例的融合蛋白的化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及独立地选自实施例6、7、16、22、23和24的实施例的融合蛋白的化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及独立地选自实施例1-4、5-14和16-24的实施例的融合蛋白的化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及独立地选自实施例1-18的实施例的融合蛋白的化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及独立地选自实施例1和3-17的实施例的融合蛋白的化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及独立地选自实施例1和3-16的实施例的融合蛋白的化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及独立地选自实施例1和3-12的实施例的融合蛋白的化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及独立地选自实施例1和3-8的实施例的融合蛋白的化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例1的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B3E,B29K(十六烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式1表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例3的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B3E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式3表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例4的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式4表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例5的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B3E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-OEG),desB30)，并且由化学式5表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例6的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B3E,B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式6表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例7的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式7表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例8的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GQAP]2-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式8表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例9的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]3-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式9表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例10的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]3-胰岛素(A14E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式10表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例11的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]4-胰岛素(A14E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式11表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例12的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]4-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式12表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例13的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]6-胰岛素(A14E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式13表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例14的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]6-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式14表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例15的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]6-胰岛素(A14E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-OEG),desB30)，并且由化学式15表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例16的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]6-胰岛素(A14E,B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式16表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例17的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]8-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式17表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例18的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]12-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式18表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例19的融合肽：
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式19表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例20的融合肽：
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(A14E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式20表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例21的融合肽：
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(B3E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式21表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例22的融合肽：
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式22表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例23的融合肽：
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(A14E,B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式23表示。
在一个实施方案中，本发明涉及实施例24的融合肽：EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(B3E,B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)，并且由化学式24表示。
中间产物
本发明进一步涉及新型骨架形式的中间产物，本发明的取代基与之连接，从而产生本发明的融合肽。
本发明还涉及本发明融合肽的新型骨架形式的中间产物，其选自：
i.实施例1、3、5和6的骨架(SEQ ID NO:17和2)
ii.实施例2的骨架(SEQ ID NO:18和2)
iii.实施例4和7的骨架(SEQ ID NO:19和2)
iv.实施例8的骨架(SEQ ID NO:30和2)
v.实施例9的骨架(SEQ ID NO:20和2)
vi.实施例10的骨架(SEQ ID NO:20和29)
vii.实施例11的骨架(SEQ ID NO:21和29)
viii.实施例12的骨架(SEQ ID NO:21和2)
ix.实施例13、15和16的骨架(SEQ ID NO:22和29)
x.实施例14的骨架(SEQ ID NO:22和2)
xi.实施例17的骨架(SEQ ID NO:23和2)
xii.实施例18的骨架(SEQ ID NO:24和2)
xiii.实施例19和22的骨架(SEQ ID NO:27和2)
xiv.实施例20和23的骨架(SEQ ID NO:27和29)
xv.实施例21的骨架(SEQ ID NO:28和2)
xvi.实施例24的骨架(SEQ ID NO:28和29)。
双功能性
不同的功能性与胰岛素类似物和EGF(A)类似物这两种类似物相关。当将两种类似物组合在本发明的融合化合物衍生物中时，优选所述类似物保持功能，即，胰岛素类似物具有激活胰岛素受体的能力，并且EGF(A)类似物与PCSK9结合。可以如下所述测试这类化合物的功能性。
胰岛素功能
胰岛素类似物对人胰岛素受体(IR)的相对结合亲和力可以通过如实施例25所述的闪烁迫近测定(SPA)中的竞争结合来确定。
在一个实施方案中，本发明的融合肽具有与胰岛素受体结合的能力。
实施例26中描述的脂肪生成试验可以用作胰岛素类似物的功能(激动性)活性的量度。
在一个实施方案中，包含胰岛素类似物的本发明的融合肽具有结合并激活胰岛素受体的能力。
在一个实施方案中，本发明的融合肽具有降低血糖水平的能力。
可以如实施例29和30中所述，测试本发明的融合肽的药代动力学参数和/或胰岛素相关的药效学性质。
本发明的融合肽可以通过皮下施用至大鼠来测试，例如按照该方案与比较融合化合物和/或类似的B29K酰化胰岛素类似物进行比较。
在一个实施方案中，本发明的融合肽降低血糖水平。
在另一个实施方案中，本发明的融合肽相对于类似的B29K酰化胰岛素类似物显示出相当的血糖降低。
本发明的融合肽包含具有不带电荷的间隔体(GQAP)n或(GAQP)n的间隔体，所述间隔体相对于包含带电荷的间隔体(GQEP)n的比较化合物具有出人意料的优异血糖降低。
发现包含间隔体(GQAP)n或(GAQP)n(其中n＝2-10)的本发明的融合肽在降血糖效果方面是等效的，而对于其中n高于10的间隔体，其效果不那么明显(图1-2)。
发现包含间隔体(GQAP)n或(GAQP)n(其中n＝2-8)的本发明的融合肽显示出比所有测试的包含(GQEP)n(其中n＝2-8)的比较化合物更优异的降血糖效果(图3-11)。
发现包含间隔体(GQAP)n或(GAQP)n(其中n＝2)的本发明的融合肽显示出剂量依赖性的血糖降低(图13)。
EGF(A)功能
EGF(A)肽类似物具有与PCSK9结合的能力。可以使用本文实施例27中描述的测定来评估这种结合。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白是PCSK9抑制剂。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白抑制PCSK9与人低密度脂蛋白受体(LDL-R)的结合。
在一个实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO:1的EGF(A)肽类似物的融合蛋白，其中该融合蛋白能够抑制PCSK9与人低密度脂蛋白受体(LDL-R)的结合。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白具有抑制PCSK9与LDL-R结合的能力。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白具有抑制PCSK9与LDL-R结合并降低血液中的LDL水平的能力。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白降低LDL血液水平。
在一个实施方案中，与天然LDL-R(293-332)(SEQ ID NO:1，天然EGF-(A))相比，本发明的融合蛋白具有改善的与PCSK9结合的能力。在一个实施方案中，相对于LDL-R(293-332)EGF(A)类似物：(301Leu,309Arg,312Glu,321Glu)(比较融合蛋白9)，本发明的融合蛋白具有相当的与PCSK9结合的能力。
在一个实施方案中，如在PCSK9-LDL-R结合竞争性ELISA测定中所测量的，本文所述的本发明融合蛋白的Ki低于20nM，如低于15nM，或如低于10nM，或如低于5nM。
在另一个实施方案中，如在PCSK9-LDL-R结合竞争性ELISA测定中所测量的，本文所述的本发明融合蛋白的Ki低于5nM。
如本文实施例28中所述，本发明的融合蛋白及其衍生物内的EGF(A)类似物的功能性可进一步通过它们改善LDL摄取的能力来表征。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白在PCSK9的存在下增加LDL摄取。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白能够逆转或减低PCSK9介导的LDL摄取减少。
在一个实施方案中，如在LDL摄取试验中所测量的，本发明的融合蛋白的EC50低于1500nM，如低于1000nM，如低于500nM，或如低于200nM。
在一个实施方案中，如在LDL摄取试验中所测量的，本发明的融合蛋白的EC50低于1500nM。
在一个实施方案中，如在LDL摄取试验中所测量的，本发明的融合蛋白的EC50低于500nM。
在一个实施方案中，如在LDL摄取试验中所测量的，本发明的融合蛋白的EC50低于200nM。
发现向小鼠施用hPCSK9导致肝LDL受体蛋白几乎完全下调(图12)。胰岛素-EGF(A)融合蛋白以剂量依赖性方式有效地阻止了PCSK9介导的LDLr蛋白的下调。此外，已显示两种胰岛素-EGF(A)融合蛋白能够阻止hPCSK9介导的LDLr蛋白下调，这类似于单独使用EGF(A)衍生物所见(图14)。
双功能性
为了证明双功能性或双重活性，在实施例31中描述的体内模型中测试了本发明的所选化合物。双重活性意味着通过用基于胰岛素-EGF(A)的抗PCSK9肽抑制静脉内注射的hPCSK9的作用来增加小鼠肝脏中的LDL受体表达水平，以及该分子的胰岛素部分的降血糖效果。
发现所选化合物降低血糖并阻止hPCSK9介导的LDLr蛋白下调，这类似于单独使用EGF(A)衍生物所见。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白激活胰岛素受体。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白降低血糖。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白与比较融合蛋白相比显示出优异的血糖降低。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白与比较融合蛋白相比显示出改善的血糖降低。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白与PCSK9结合。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白抑制PCSK9与LDL-R的结合。
在一个实施方案中，与野生型EGF(A)相比，本发明的融合蛋白显示出改善的结合PCSK9的能力。
在一个实施方案中，当在PCSK9-LDL-R结合竞争性ELISA测定中测量时，本发明的融合蛋白的Ki低于20nM。
在一个实施方案中，当在PCSK9-LDL-R结合竞争性ELISA测定中测量时，本发明的融合蛋白的Ki低于5nM。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白增加LDL摄取。
在一个实施方案中，当在LDL摄取试验中测量时，本发明的融合蛋白的EC50低于1000nM。
在一个实施方案中，当在LDL摄取试验中测量时，本发明的融合蛋白的EC50低于500nM。
在一个实施方案中，当在LDL摄取试验中测量时，本发明的融合蛋白的EC50低于200nM。
如上所述，在体外测定中已经发现，本发明的双功能融合蛋白与胰岛素受体和PCSK9都结合，从而导致胰岛素反应的激活并阻止PCSK9结合，从而阻止LDLR降解。此外，发明人惊奇地发现了在体内对降低葡萄糖(胰岛素作用)和增强肝LDLR表达(PCSK9i作用)的综合效果。
此外，出人意料地发现，相对于包含带电荷的间隔体(GQEP)n的比较融合蛋白，包含不带电荷的间隔体的本发明融合蛋白显示出优异的血糖降低，并且进一步降低的水平取决于所述不带电荷的间隔体的长度。
药物组合物
本发明还涉及药物组合物，其包含本发明的融合蛋白，包括例如本发明的类似物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，以及一种或多种药学上可接受的辅料。这类组合物可如本领域所知的那样制备。
术语“辅料”宽泛地指除活性治疗成分以外的任何组分。辅料可以是惰性物质、无活性物质和/或非药学活性物质。辅料可用于各种目的，例如作为载体、媒介物、稀释剂、片剂助剂和/或用来改善活性物质的给药和/或吸收。辅料的非限制性实例是：溶剂、稀释剂、缓冲液、防腐剂、张度调节剂、螯合剂和稳定剂。药学活性成分与各种辅料的配制是本领域已知的，参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(例如第21版(2005)和任何后续版本)。
本发明的组合物可以是液体制剂的形式，即，包含水的水性制剂。液体制剂可以是溶液或悬浮液。或者，其可以是固体制剂，例如冷冻干燥或喷雾干燥的组合物。
本发明的药物组合物可以进一步包含第二活性成分，如治疗剂，这可以在联合治疗的情况下简化给药。
本发明的组合物可以用于肠胃外给药，例如通过皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射进行。
药物适应症
糖尿病
术语“糖尿病”包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病(妊娠期间)和引起高血糖症的其他状态。该术语用于其中胰腺产生的胰岛素量不足，或者其中身体细胞对胰岛素没有适当反应从而阻止细胞吸收葡萄糖的代谢紊乱。结果，葡萄糖在血液中积聚。
1型糖尿病，也称为胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和幼年型糖尿病，是由B细胞破坏引起的，通常导致绝对胰岛素缺乏。
2型糖尿病，也称为非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)和成年型糖尿病，与主要的胰岛素抵抗相关，因此与相对胰岛素缺乏相关，和/或与主要的胰岛素分泌缺陷伴胰岛素抵抗相关。
其他适应症
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白用于制备用于治疗或预防包括应激诱发的高血糖症在内的高血糖症、2型糖尿病、糖耐量减低、1型糖尿病的药物。
在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白用作延迟或预防2型糖尿病的疾病进展的药物。
在本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白用作治疗或预防包括应激诱发的高血糖症在内的高血糖症、2型糖尿病、糖耐量减低、1型糖尿病的药物。
在进一步的实施方案中，本发明涉及治疗或预防包括应激诱发的高血糖症在内的高血糖症、2型糖尿病、糖耐量减低、1型糖尿病的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者施用有效量的采用本发明融合蛋白的这类治疗。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白或其组合物可以在糖尿病患者中用于：
(i)改善脂质参数，如预防和/或治疗血脂异常，降低总血清脂质；降低LDL-C，增加HDL；降低小而密的LDL；降低VLDL；降低甘油三酯；降低胆固醇；降低脂蛋白a(Lp(a))的血浆水平；在另一个实施方案中，本发明涉及糖尿病患者的治疗方法，其用于：
i.改善脂质参数，如预防和/或治疗血脂异常，降低总血清脂质；增加HDL-C；降低LDL-C，降低小而密的LDL；降低VLDL-C；降低甘油三酯；降低胆固醇；降低脂蛋白a(Lp(a))的血浆水平；其中将药学活性量的根据本发明的融合蛋白，例如根据本发明的肽类似物或衍生物，施用于糖尿病患者。
在一个实施方案中，本发明涉及如本文所述的融合蛋白在制备药物中的用途。
本发明还涉及用作药物或用于制备药物的本发明融合蛋白或其药物组合物。
给药方式
术语“治疗”旨在包括预防和最小化所提及的疾病、病症或病况(即，“治疗”是指预防性和治疗性施用本发明的融合蛋白或包含本发明融合蛋白的组合物，除非另有说明或与上下文明显矛盾)。
给药途径可以是有效地将本发明融合蛋白输送至身体中的所需或适当位置的任何途径，诸如肠胃外，例如皮下、肌肉内或静脉内途径。或者，可以口服、经肺、经直肠、经皮、经颊、舌下或经鼻施用本发明的融合蛋白。
虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附实施方案涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和变化。
实施方案
1.融合蛋白，其包含胰岛素肽、EGF(A)肽、间隔体和取代基，其中，i.所述胰岛素肽是人胰岛素(SEQ ID NO 2-3)或人胰岛素的类似物
ii.所述EGF(A)肽是LDL-R(293-332)(SEQ ID NO:1)的EGF(A)结构域的类似物
iii.所述间隔体是肽连接体，其包含(GAQP)n或(GQAP)n的区段，n＝2-19，并且将胰岛素类似物B链的N末端与EGF(A)类似物的C末端连接
iv.所述取代基具有式(I)：Acy-AA2m-AA3p-，其中
Acy是包含约16个至约20个碳原子的脂肪二酸，
AA2是酸性氨基酸残基，并且其中m为1至10范围内的整数，并且
AA3是中性的含亚烷基二醇的氨基酸残基，且p为1至10范围内的整数，并且
其中AA2和AA3残基的最大数目为10，且
其中AA2和AA3残基可以以任何顺序出现，
或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
2.根据实施方案1的融合蛋白，其中所述EGF(A)肽类似物经由所述EGF(A)类似物的C末端氨基酸残基与所述胰岛素类似物B链的N末端融合。
3.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物与SEQ IDNO.:1相比包含1-15个氨基酸突变。
4.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物与SEQ IDNO.:1相比包含1-13个氨基酸突变。
5.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物与SEQ IDNO.:1相比包含1-11个氨基酸突变。
6.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物与SEQ IDNO.:1相比包含1-9个氨基酸突变。
7.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物与SEQ IDNO.:1相比包含1-7个氨基酸突变。
8.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物与SEQ IDNO.:1相比包含1-5个氨基酸突变。
9.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物与SEQ IDNO.:1相比包含1-3个氨基酸突变。
10.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物与SEQ IDNO.:1相比包含一个或两个氨基酸突变。
11.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物与SEQ IDNO.:1相比包含八个氨基酸突变。
12.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物与SEQ IDNO.:1相比包含七个氨基酸突变。
13.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物与SEQ IDNO.:1相比包含六个氨基酸突变。
14.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物与SEQ IDNO.:1相比包含五个氨基酸突变。
15.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物与SEQ IDNO.:1相比包含四个氨基酸突变。
16.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物与SEQ IDNO.:1相比包含三个氨基酸突变。
17.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物与SEQ IDNO.:1相比包含两个氨基酸突变。
18.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物包含301L。
19.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物包含309R。
20.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物包含312E。
21.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物包含321E。
22.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物包含以下组合之一：
a.301Leu和309Arg
b.301Leu、309Arg和312Glu
c.301Leu、309Arg、312Glu和321Glu
23.根据实施方案22的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物包含301L和309R。
24.根据实施方案22的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物包含301L、309R和312E。
25.根据实施方案22的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物包含301L、309R、312E和321E。
26.根据实施方案22的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物是301L，309R，312E，321E。
27.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述胰岛素类似物/衍生物是包含0-10个突变的人胰岛素的类似物/衍生物。
28.根据实施方案27的融合蛋白，其中所述胰岛素包含1-10个突变。
29.根据实施方案28的融合蛋白，其中所述胰岛素包含1-8个突变。
30.根据实施方案28的融合蛋白，其中所述胰岛素包含1-6个突变。
31.根据实施方案28的融合蛋白，其中所述胰岛素包含五个突变。
32.根据实施方案28的融合蛋白，其中所述胰岛素包含1-4个突变。
33.根据实施方案28的融合蛋白，其中所述胰岛素包含四个突变。
34.根据实施方案28的融合蛋白，其中所述胰岛素包含1-3个突变。
35.根据实施方案28的融合蛋白，其中所述胰岛素包含一个或两个突变。
36.根据实施方案28的融合蛋白，其中所述胰岛素包含一个突变。
37.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述胰岛素类似物包含以下组合之一：
a.A14E
b.B3E
c.desB30
d.A14E、desB30
e.B3E、desB30
38.根据实施方案37的融合蛋白，其中所述胰岛素类似物包含desB30。
39.根据实施方案37的融合蛋白，其中所述胰岛素类似物包含B3E。
40.根据实施方案37的融合蛋白，其中所述胰岛素类似物包含A14E、desB30。
41.根据实施方案37的融合蛋白，其中所述胰岛素类似物包含B3E、desB30。
42.根据实施方案37的融合蛋白，其中所述胰岛素类似物是A14E，desB30。
43.根据实施方案37的融合蛋白，其中所述胰岛素类似物是B3E，desB30。
44.根据实施方案37的融合蛋白，其中所述胰岛素类似物是胰岛素desB30人胰岛素。
45.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白激活胰岛素受体并与PCSK9结合。
46.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含连接所述EGF(A)类似物和所述胰岛素类似物/衍生物的间隔体。
47.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述间隔体包含酰胺键。
48.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述间隔体包含4-80个氨基酸残基。
49.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述间隔体包含一个或多个以下氨基酸残基：Ala(A)、Gly(G)、Pro(P)和/或Gln(Q)。
50.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝1-20。
51.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝2-19。
52.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝2-12。
53.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝2-10。
54.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝2-8。
55.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝2-6。
56.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝2-4。
57.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝2。
58.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝3。
59.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝4。
60.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝5。
61.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝6。
62.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝7。
63.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝8。
64.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝10。
65.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝12。
66.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝14。
67.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝16。
68.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝18。
69.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝19。
70.根据实施方案50的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n或(GQAP)n，其中n＝20。
71.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含一个取代基。
72.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述取代基经由Lys/K氨基酸残基连接。
73.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述取代基与所述融合蛋白的胰岛素序列内的Lys/K氨基酸残基B29K连接。
74.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中AA2和AA3在式中出现的顺序可以独立地互换。
75.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中式(I)Acy-AA2m-AA3p-的Acy包含选自1,16-十六烷二酸、1,18-十八烷二酸和1,20-二十烷二酸的脂肪二酸基团。
76.根据实施方案75的融合蛋白，其中所述Acy包含脂肪二酸基团1,16-十六烷二酸。
77.根据实施方案75的融合蛋白，其中所述Acy包含脂肪二酸基团1,18-十八烷二酸。
78.根据实施方案75的融合蛋白，其中所述Acy包含脂肪二酸基团1,20-二十烷二酸。
79.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中式(I)Acy-AA2m-AA3p-的所述AA2m包含gGlu，gGlu代表由以下结构表示的γ谷氨酸残基：
80.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中式(I)Acy-AA2m-AA3p-的所述AA3p包含1xOEG或[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰基或氨基酸残基8-氨基-3,6-二氧杂辛酸-NH(CH2)2O(CH2)2OCH2CO-，并且由以下结构表示：
81.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中式(I)Acy-AA2m-AA3p-的所述AA3p包含2xOEG。
82.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中式(I)Acy-AA2m-AA3p-的AA2m-AA3p-独立地由gGlu-OEG或gGlu-OEG-OEG表示。
83.根据实施方案82的融合蛋白，其中式(I)Acy-AA2m-AA3p-的AA2m-AA3p-由gGlu-OEG表示。
84.根据实施方案82的融合蛋白，其中式(I)Acy-AA2m-AA3p-的AA2m-AA3p-由gGlu-OEG-OEG表示。
85.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述取代基Acy-AA2m-AA3p-由以下表示：
86.根据实施方案85的融合蛋白，其中所述取代基Acy-AA2m-AA3p-选自以下：
87.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述取代基Acy-AA2m-AA3p-独立地由以下表示：
i.C16二酸-gGlu-2xOEG
ii.C18二酸-gGlu-OEG
iii.C18二酸-gGlu-2xOEG
iv.C20二酸-gGlu-2xOEG
88.根据实施方案87的融合蛋白，其中所述取代基Acy-AA2m-AA3p-独立地由C16二酸-gGlu-2xOEG表示。
89.根据实施方案87的融合蛋白，其中所述取代基Acy-AA2m-AA3p-独立地由C18二酸-gGlu-OEG表示。
90.根据实施方案87的融合蛋白，其中所述取代基Acy-AA2m-AA3p-独立地由C18二酸-gGlu-2xOEG表示。
91.根据实施方案87的融合蛋白，其中所述取代基Acy-AA2m-AA3p-独立地由C20二酸-gGlu-2xOEG表示。
92.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白激活胰岛素受体。
93.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有降低血糖的能力。
94.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白与比较融合蛋白相比显示出优异的血糖降低。
95.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白与比较融合蛋白相比显示出改善的血糖降低。
96.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白与PCSK9结合。
97.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白抑制PCKS9与LDL-R的结合。
98.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中与野生型EGF(A)相比，所述融合蛋白具有改善的结合PCSK9的能力。
99.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中当在PCSK9-LDL-R结合竞争性ELISA测定中测量时，所述融合蛋白的Ki低于20nM。
100.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中当在PCSK9-LDL-R结合竞争性ELISA测定中测量时，所述融合蛋白的Ki低于5nM。
101.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白增加LDL摄取。
102.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中当在LDL摄取试验中测量时，所述融合蛋白的EC50低于1000nM。
103.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中当在LDL摄取试验中测量时，所述融合蛋白的EC50低于500nM。
104.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中当在LDL摄取试验中测量时，所述融合蛋白的EC50低于200nM。
105.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白由实施例1-24的融合蛋白代表。
106.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白由实施例1的融合蛋白代表。
107.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白由实施例1-24的融合蛋白代表。
108.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白由实施例2-5、8-15和17-21的融合蛋白代表。
109.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白由实施例6、7、16、22、23和24的融合蛋白代表。
110.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白由实施例1-4、5-14和16-24的融合蛋白代表。
111.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白由实施例1-18的融合蛋白代表。
112.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白由实施例1和3-17的融合蛋白代表。
113.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白由实施例1和3-16的融合蛋白代表。
114.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白由实施例1和3-12的融合蛋白代表。
115.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白由实施例1和3-8的融合蛋白代表。
116.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其用作药物。
117.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其用于预防或治疗糖尿病患者的心血管疾病。
118.根据前述实施方案中任一项的融合蛋白，其用于改善糖尿病患者的脂质参数的方法中。
119.本发明融合蛋白的新型骨架形式的中间产物，其选自：
i.实施例1、3、5和6的骨架(SEQ ID NO:17和2)
ii.实施例2的骨架(SEQ ID NO:18和2)
iii.实施例4和7的骨架(SEQ ID NO:19和2)
iv.实施例8的骨架(SEQ ID NO:30和2)
v.实施例9的骨架(SEQ ID NO:20和2)
vi.实施例10的骨架(SEQ ID NO:20和29)
vii.实施例11的骨架(SEQ ID NO:21和29)
viii.实施例12的骨架(SEQ ID NO:21和2)
ix.实施例13、15和16的骨架(SEQ ID NO:22和29)
x.实施例14的骨架(SEQ ID NO:22和2)
xi.实施例17的骨架(SEQ ID NO:23和2)
xii.实施例18的骨架(SEQ ID NO:24和2)
xiii.实施例19和22的骨架(SEQ ID NO:27和2)
xiv.实施例20和23的骨架(SEQ ID NO:27和29)
xv.实施例21的骨架(SEQ ID NO:28和2)
xvi.实施例24的骨架(SEQ ID NO:28和29)。
120.根据实施方案1-115中任一项的融合蛋白，其用于治疗或预防糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、糖耐量减低、高血糖症和/或血脂异常。
121.根据实施方案1-115中任一项的融合蛋白，其在糖尿病患者的治疗方法中用于改善脂质参数，如预防和/或治疗血脂异常，降低总血清脂质，增加HDL-C，降低LDL-C，降低小而密的LDL-C，降低VLDL-C，降低甘油三酯，降低胆固醇，降低脂蛋白a(Lp(a))的血浆水平或抑制载脂蛋白A(apo(A))的产生。
122.药物组合物，其包含根据前述实施方案1-118中任一项的融合蛋白和药学上可接受的辅料。
123.根据实施方案122的药物组合物，其用于皮下给药。
124.用于在需要治疗的患者中治疗糖尿病的药物组合物，其包含治疗有效量的根据实施方案1-118中任一项的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。
125.实施方案122的药物组合物，其用作药物。
126.实施方案122的药物组合物，其用于治疗患有糖尿病和具有心血管疾病高风险的患者。
127.根据实施方案1-118中任一项的融合蛋白在制备用于治疗或预防糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、糖耐量减低、高血糖症、血脂异常的药物中的用途。
128.改善脂质参数的方法，其包括在糖尿病患者中施用药学活性量的根据前述实施方案1-115中任一项的融合蛋白的步骤。
129.改善糖尿病患者的脂质参数的方法，其包括施用药学活性量的根据前述实施方案1-118中任一项的融合蛋白的步骤，如预防和/或治疗血脂异常，降低总血清脂质；增加HDL；降低LDL-C；降低小而密的LDL-C；降低VLDL-C；非-HDL-C；降低甘油三酯；降低胆固醇；降低脂蛋白a(Lp(a))的血浆水平。
130.根据前述实施方案1-118中任一项的胰岛素类似物，其在糖尿病患者的治疗方法中用于：改善脂质参数，如预防和/或治疗血脂异常，降低总血清脂质，增加HDL-C，降低LDL-C，降低小而密的LDL-C，降低VLDL-C，降低甘油三酯，降低胆固醇，降低脂蛋白a(Lp(a))的血浆水平或抑制载脂蛋白A(apo(A))的产生；以及预防和/或治疗心血管疾病。
131.预防和/或治疗糖尿病患者的心血管疾病的方法，其包括施用药学活性量的根据前述实施方案1-118中任一项的融合蛋白的步骤。
132.治疗或预防糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、糖耐量减低、高血糖症、血脂异常的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据实施方案1-118中任一项的融合蛋白。
实施例
缩写列表
AcOH： 乙酸
ADO： 8-氨基-3,6-二氧杂辛酸
ALP 水解无色杆菌(Achromobactor lyticus)蛋白酶
API： 活性药物成分
AUC 曲线下面积；
AUC/D 剂量归一化的曲线下面积；
BG： 血糖
BHK： 幼仓鼠肾
Boc： 叔丁氧羰基
Cmax 最大血浆浓度；
Cmax/D 剂量归一化的最大血浆浓度；
C-肽 连接肽
Clt： 2-氯三苯甲基
可力丁(collidine)： 2,4,6-三甲基吡啶
D 剂量；
DCM： 二氯甲烷
DIC： 二异丙基碳二亚胺
DIPEA＝DIEA N,N-二异丙基乙胺
DMAP： 4-二甲基氨基吡啶
DMF： N,N-二甲基甲酰胺
DMSO： 二甲基亚砜
DTT： DL-二硫苏糖醇
EC50： 半数最大有效浓度
EDC： N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺
EDTA： 乙二胺四乙酸
EGF： 表皮生长因子样
EGF(A)： 表皮生长因子样结构域A
eps： epsilon
F 生物利用度(吸收的分数)；
Fmoc： 9-芴基甲氧羰基
γGlu(gGlu) γL-谷氨酰基；
HCl 盐酸
HDL： 高密度脂蛋白
HEPES： 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸
HFIP 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇或六氟异丙醇
HI： 人胰岛素
hLDL-R： 人LDL受体
hPCSK9： 人PCSK9
HPLC： 高效液相色谱法
HSA： 人血清白蛋白
IC50： 半数最大抑制浓度
IGF-1R 胰岛素样生长因子1受体
IP： 腹膜内
IR： 胰岛素受体
i.v. 静脉内
LC 液相色谱法
LCMS或LC-MS： 液相色谱质谱法
LDL-R或LDLr： LDL受体
LDL： 低密度脂蛋白
LDL-C： LDL胆固醇
MALDI-TOF 基质辅助激光解吸电离飞行时间
MeCN： 乙腈
MeOH： 甲醇
MRT 平均停留时间；
MS 质谱法
Mtt： 4-甲基三苯甲基
NMP： N-甲基吡咯烷酮
OEG [2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基羰基；
OSu： O-琥珀酰亚胺酯(羟基琥珀酰亚胺酯)
OtBu： 叔丁酯
Oxyma
氰基-羟基亚氨基-乙酸乙酯
％extrap 外推曲线的百分比
Pbf： 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
PBS： 磷酸盐缓冲盐水
PD 药效学(例如降低血液/血浆葡萄糖的效果)
PK 药代动力学(血液/血浆胰岛素浓度相对于时间的曲线)
Pra： L-炔丙基甘氨酸
rhLDL-R： 重组人LDL受体
RP： 反相
RP-HPLC： 反相高效液相色谱法
RT： 室温
s.c.： 皮下
SD： 标准偏差
SEM： 平均值的标准误差
SPA： 闪烁迫近测定
SPPS： 固相肽合成
T1/2 终末半衰期；
tBu： 叔丁基
Tmax 到最大血浆暴露的时间；
TCTU： O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓四氟硼酸盐
TFA： 三氟乙酸
THPTA： 三羟丙基三唑基甲胺
TIS或TIPS： 三异丙基硅烷
TRIS： 三(羟甲基)氨基甲烷或2-氨基-2-羟甲基-丙-1,3-二醇
TBS-T： Tris缓冲盐水
Trt： 三苯基甲基(三苯甲基)
TSTU O-(N-琥珀酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐
UPLC： 超高效液相色谱法
wt. 野生型
参照以下实施例进一步说明本发明，这些实施例并非意在以任何方式限制所请求保护的本发明的范围。
类似物，即双链非酰化胰岛素EGF(A)融合蛋白，可以如以下进一步描述的那样在大肠杆菌或酵母中表达。
EGF(A)胰岛素融合化合物类似物在大肠杆菌中的重组表达和纯化
EGF(A)胰岛素融合蛋白类似物可以在大肠杆菌中很好地表达为包涵体(IB)。
将胰岛素-EGF(A)融合蛋白类似物的cDNA亚克隆到pET11b衍生的载体中，然后将质粒转化到BL21(DE3)衍生的宿主菌株中。在化学成分确知培养基中经补料分批工艺进行发酵。
进一步如下纯化胰岛素-EGF(A)融合蛋白类似物：
收获细胞，并使用细胞破碎仪在含有150mM NaCl的20mM pH8.0Tris缓冲液中裂解。收集含有融合蛋白的IB的不溶级分，并依次用含有500mM NaCl的20mM pH 8.0Tris缓冲液和H2O洗涤。然后，在室温(20-25℃)下，使用20mM Tris，6M尿素，10mM DTT(pH 9.0)，将IB溶解至10mg/mL的浓度。溶解后，将溶液用20mM甘氨酸，1mM半胱氨酸，10mM CaCl2(pH 10.5)稀释10倍以供重折叠，这将在室温下在6-10小时内完成。澄清(离心或深层过滤)后，使用QSepharose大珠(20mM Tris，10mM CaCl2，10％EtOH，pH 8.0)捕获蛋白质。之后，在室温下，用ALP以1:1000的比例处理洗脱合并物3-4小时。然后将切割的蛋白质加至Source 30RPC上进行分离。作为最后的精制步骤，采用了使用浅NaCl梯度的Source 30Q(20mM Tris，10mMCaCl2，10％EtOH，pH 8.0)。对于具有较长间隔体(即重复数>＝6)的类似物，应在两个阴离子交换步骤中使用pH 8.5促进结合。
EGF(A)胰岛素融合化合物在酵母中的重组表达和纯化
通过公知的技术，例如，如WO2017/032798所公开的，表达并培养EGF(A)胰岛素融合类似物。更具体而言，如下制备并纯化胰岛素-EGF(A)融合蛋白：
在SP Sepharose BB上捕获前体：
将酵母上清液以10-20cv/h的流速上样到用SP Sepharose BB填充的柱上。用0.1M柠檬酸pH 3.5洗涤，并用40％EtOH进行洗涤。用0.2M乙酸钠pH 5.5/35％EtOH洗脱该类似物。
二硫键的改组：
将SP合并物调节至pH 9。添加改组试剂至终浓度；半胱氨酸2.5mM，胱氨酸0.25mM，CaCl2 25mM，然后进行UPLC。
ALP消化：
将改组合并物调节至pH 9，并以1:100(w/w)添加ALP酶。随后将反应进行UPLC。将ALP裂解合并物调节至pH 2.5，并稀释2倍，以为RPHPLC纯化作准备。
RPHPLC纯化：
如下所示通过RPHPLC C18进行纯化：
柱：15um C18 50x250mm
缓冲液：
A：25mM CaCl2，0.2％甲酸，5％EtOH，
B：0.2％甲酸，50％EtOH
梯度：20-55％B-缓冲液。
梯度：20CV
流速20CV/h
上样g～5g/l树脂
通过UPLC分析级分，合并，并冷冻干燥。
一般说明
以下实施例和一般程序涉及在本说明书和合成方案中鉴定的终产物。使用以下实施例对本发明化合物的制备进行详细描述，但所描述的化学反应是就其对制备本发明化合物的一般适用性而公开的。
偶尔，所述反应可能并不像所描述的那样适用于包含在本发明公开范围内的每种化合物。本领域技术人员将容易认识到发生这种情况的化合物。在这些情况下，所述反应可以通过本领域技术人员已知的常规改动，即通过干扰基团的适当保护、通过更换成其他常规试剂或通过反应条件的常规修改而成功进行。
或者，本文公开的或常规的其他反应将可适用于本发明相应化合物的制备。在所有制备方法中，所有起始材料都是已知的，或者可以从已知的起始材料容易地制备。所有温度均以摄氏度表示，并且除非另有说明，当提及产量时，所有份数和百分比都以重量计，而当提及溶剂和洗脱液时，所有份数都以体积计。
分析方法：
LC-MS方法1(电喷雾)：
系统：Waters Acquity UPLC SQD 2000
柱：Acquity UPLC BEH 1.7μC18
2.1x50mm
检测器：UV：PDA，SQD 2000
电离方法：ES+
扫描范围：500-2000
锥形电压：60V
扫描时间0.5
线性梯度：10％至90％B
梯度运行时间：3min
总运行时间：4min
流速：0.3ml/min
柱温：40℃
PDA：210-400nm
溶剂A：99.90％H2O，0.1％TFA
溶剂B：99.90％CH3CN，0.1％TFA
溶剂C：NA
LC-MS方法2(电喷雾)：
系统：Waters Acquity UPLC H-Class SQD2 2000
柱：Acquity UPLC BEH 1,7C18 100 2,1x50mm。部件编号：186002350
检测器：UV：PDA，SQD 2000
电离方法：ES+
扫描范围：500-2000
锥形电压：60V
扫描时间0.5
线性梯度：10％至80％B
梯度运行时间：2.50min
总运行时间：4min
流速：0.3ml/min(0-2.51min)和0.8ml/min(2.51-4.00min)
柱温：40℃
PDA：210-400nm
溶剂A：99.90％H2O，0.1％TFA
溶剂B：99.90％CH3CN，0.1％TFA
溶剂C：NA
LC-MS方法3(TOF)：
系统：Agilent 1290infinity系列UPLC
柱：Eclipse C18+2.1x50 mm 1.8u
检测器：Agilent Technologies LC/MSD TOF 6230(G6230A)
电离方法：Agilent Jet Stream源
扫描范围：m/z最小100，m/z最大3200
线性反射器模式
正模式
线性梯度：5％至95％B
梯度运行时间：6分钟0-4.5min 5-95％B，4.5-5 95％B，5-5.595-5％B 5.5-6 5％B
流速：0.40ml/min固定
柱温：40℃
溶剂A：99.90％H2O，0.02％TFA
溶剂B：99.90％CH3CN，0.02％TFA
溶剂C：NA
所计算的质量是所需化合物的平均分子量。
对于m 3000的化合物，实测质量(平均值)是使用Masshunter WorkstationSoftware Version B.05.00Build 5.0.519.13SP1(Agilent)解卷积的结果。
LC-MS方法4(TOF)：
系统：Agilent 1290infinity系列UPLC
柱：Phenomenex Aeris widepore 3.6μC4 50x2.1mm
检测器：Agilent Technologies LC/MSD TOF 6230(G6230A)
电离方法：Agilent Jet Stream源
扫描范围：m/z最小100，m/z最大3200
线性反射器模式
正模式
阶梯梯度：5％至90％B
梯度运行时间：10分钟：0-1min 5-20％B，1-7min 20-90％B，7-8min 90％B 8-8.5min 90-5％B 8.5-10min 5％B
流速：0.40ml/min固定
柱温：40℃
溶剂A：99.90％H2O，0.02％TFA
溶剂B：99.90％CH3CN，0.02％TFA
溶剂C：NA
所计算的质量是所需化合物的平均分子量。
对于m 3000的化合物，实测质量(平均值)是使用Masshunter WorkstationSoftware Version B.05.00Build 5.0.519.13SP1(Agilent)解卷积的结果。
取代基的合成：
例如，如WO 2009/115469所述，在溶液中或固相上合成取代基。
本发明的胰岛素-EGRA)融合蛋白的酰化的一般程序：
将胰岛素-EGF(A)融合蛋白溶解在水性缓冲液中，其中任选地加入有机共溶剂(例如EtOH、乙腈、DMSO或NMP)，并将pH调整至11.2。在通过添加1M NaOH使pH保持在约11.2的同时，逐滴添加活化的侧链在NMP中的溶液(100mg/mL)，并通过LC-MS监测反应进程。反应完成后，向混合物中加入TFA、乙酸或1M HCl。用水稀释后，将混合物通过制备型HPLC纯化。合并纯级分并冻干，得到本发明的化合物。
以下实施例1中进一步说明了该一般程序。类似地制备本发明的所有其他化合物。
实施例1
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B3E,B29K(十六烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式1：
将EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B3E,desB30)的溶液(48mL，2.44mg/mL，117mg)溶解于由20mM Tris，pH 8.0，10mM CaCl2，10％EtOH，50mM NaCl组成的缓冲液中。用1M NaOH使pH升高至11.1。在使用1M NaOH将pH保持恒定在11.1的同时，逐滴加入十六烷二酰基-Glu-2xOEG-OSu的溶液(24mg在0.5mL NMP中)。结束反应后，向混合物中加入TFA至pH 1.6。向混合物中加入乙腈(14mL)，之后加水至100mL。通过RP-HPLC纯化混合物。
柱：Phenomenex Gemini，5μM 5u C18
30x250mm
流速：20mL/min
缓冲液A：在milliQ水中的0.1％TFA
缓冲液B：在乙腈中的0.1％TFA
梯度：20％B至50％B，线性
梯度时间：40min
级分大小：6mL
合并纯级分并冻干，得到56mg标题化合物。
LC-MS 38(电喷雾)：m/z＝1873.28(M+6)/6。计算值：1873.27。
Rt＝1.67min
实施例2
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]10-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式2：
LC-MS 38(电喷雾)：m/z＝1597.35(M+9)/9。计算值：1597.00
Rt＝1.75min
实施例3
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B3E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式3：
LC-MS 27(TOF)：m/z＝11552.89。计算值：11552.00
实施例4
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式4：
LC-MS方法1(电喷雾)：m/z＝1924.39(M+6)/6。计算值：1923.83
Rt＝2.13min
实施例5
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B3E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-OEG),desB30)
化学式5：
LC-MS方法2(电喷雾)：m/z＝1902.01(M+6)/6。计算值：1902.1
Rt＝1.8min
实施例6
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B3E,B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式6：
LC-MS方法2(电喷雾)：m/z＝1930.74(M+6)/6。计算值：1931.02
Rt＝1.89min
实施例7
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式7：
LC-MS方法1(电喷雾)：m/z＝1928.67(M+6)/6。计算值：1928.51
Rt＝2.27min
实施例8
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GQAP]2-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式8：
LC-MS方法1(电喷雾)：m/z＝1924.33(M+6)/6。计算值：1923.83
Rt＝1.87min
实施例9
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]3-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式9：
LC-MS方法1(电喷雾)：m/z＝1983.44(M+6)/6。计算值：1982.72
Rt＝2.00min
实施例10
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]3-胰岛素(A14E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式10：
LC-MS方法2(电喷雾)：m/z＝1977.18(M+6)/6。计算值：1977.05
Rt＝1.8min
实施例11
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]4-胰岛素(A14E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式11：
LC-MS方法2(电喷雾)：m/z＝1527.13(M+8)/8。计算值：1527-2
Rt＝1.78min
实施例12
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]4-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式12：
LC-MS方法2(电喷雾)：m/z＝1749.96(M+7)/7。计算值：1750.10
Rt＝1.71min
实施例13
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]6-胰岛素(A14E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式13：
LC-MS方法2(电喷雾)：m/z＝1845.9(M+7)/7。计算值：1846.2
Rt＝1.74min
实施例14
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]6-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式14：
LC-MS方法1(电喷雾)：m/z＝1851.01(M+7)/7。计算值：1851.07
Rt＝2.07min
实施例15
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]6-胰岛素(A14E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-OEG),desB30)
化学式15：
LC-MS方法4(TOF)：m/z＝12771.82；计算值：12771.26
实施例16
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]6-胰岛素(A14E,B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式16：
LC-MS方法2(电喷雾)：m/z＝1850.16(M+7)/7。计算值：1850.21
Rt＝1.98min
实施例17
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]8-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式17：
LC-MS方法2(电喷雾)：m/z＝1708.15(M+8)/8。计算值：1708.15
Rt＝1.74min
实施例18
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]12-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式18：
LC-MS方法1(电喷雾)：m/z＝1884.76(M+8)/8。计算值：1884.84
Rt＝2.04min
实施例19
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式19：
LC-MS方法3(TOF)：m/z＝17545.17；计算值：17544.34
实施例20
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(A14E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式20：
LC-MS方法1(电喷雾)：m/z＝1947.0(M+9)/9。计算值：1946.6
Rt＝1.73min
实施例21
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(B3E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式21：
LC-MS方法3(TOF)：m/z＝17559.93；计算值：17559.35
实施例22
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式22：
LC-MS方法3(TOF)：m/z＝17573.37；计算值：17572.39
实施例23
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(A14E,B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式23：
LC-MS方法1(电喷雾)：m/z＝1462.45(M+12)/12。计算值：1462.53
Rt＝1.84min
实施例24
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(B3E,B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
化学式24：
LC-MS方法3(TOF)：m/z＝17587.97；计算值：17587.40
比较化合物1
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GQEP]2-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
LC-MS方法1(电喷雾)：m/z＝1943.59(M+6)/6。计算值：1943.18
Rt＝2.09min
比较化合物2
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GQEP]8-胰岛素(A14E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
LC-MS方法1(电喷雾)：m/z＝1566.29(M+9)/9。计算值：1566.27
Rt＝1.79min
比较化合物3
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GQEP]4-胰岛素(B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
LC-MS方法1(电喷雾)：m/z＝1787.19(M+7)/7。计算值：1787.28
Rt＝2.16min
比较化合物4
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GQEP]4-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
LC-MS方法3(TOF)：m/z＝12473；计算值：12475
比较化合物5
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GQEP]2-胰岛素(B29K(十六烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
LC-MS方法3(TOF)：m/z＝11625.00；计算值：11625.00
比较化合物6
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GQEP]6-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
LC-MS方法3(TOF)：m/z＝13296；计算值：13298
比较化合物7
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GQEP]8-胰岛素(A14E,B29K(十六烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)
LC-MS方法1(电喷雾)：m/z＝1758.57(M+8)/8。计算值：1758.43
Rt＝1.67min
比较化合物8
B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30人胰岛素
这是在WO 2009/022006的实施例1中公开的现有技术的分子。
比较化合物9
EGF(A)(301L,309R,312E,321E)
该化合物如WO2017121850所述制备。
比较化合物10
EGF(A)(301L,309R,312E,321E,328K(十六烷二酰基-gGlu-2xOEG),330K(十六烷二酰基-gGlu-2xOEG))
这是在WO 2017/121850的实施例151中公开的分子。
实施例25
在增溶的受体上测定的，本发明的选定胰岛素衍生物的胰岛素受体亲和力
本发明的胰岛素类似物对人胰岛素受体(IR)的相对结合亲和力通过在闪烁迫近测定(SPA)(根据Glendorf T等人(2008)Biochemistry 474743-4751)中的竞争结合来确定。
简言之，在96孔Optiplates(Perkin-Elmer Life Sciences)中进行人胰岛素标准品和待测胰岛素类似物的稀释系列，随后添加在由100mM HEPES(pH 7.8)、100mM NaCl、10mM MgSO4和0.025％(v/v)吐温20组成的结合缓冲液中的[125I-A14Y]-人胰岛素、抗IR小鼠抗体83-7、增溶的人IR-A(通过麦胚凝集素色谱法从过表达IR-A全受体(holoreceptor)的幼仓鼠肾(BHK)细胞中半纯化的)和SPA珠(抗小鼠聚乙烯基甲苯SPA珠，GE Healthcare)。将板在22℃下轻轻摇动孵育22-24小时，以2000rpm离心2分钟，并在TopCount NXT(Perkin-Elmer Life Sciences)上进行计数。
根据四参数逻辑模型(
A(1978)Biometrics 34 357-365)分析SPA的数据，并且相对于在同一板内测量的人胰岛素标准品的结合亲和力计算所述类似物的结合亲和力。
还使用相关的测定，其中结合缓冲液含有1.5％HSA(w/v)(Sigma A1887)，以模拟更多的生理条件。
以下表3中列出了本发明的选定胰岛素类似物的胰岛素受体亲和力和其他体外数据，以下表4中列出了比较化合物的数据。
实施例26
在大鼠脂肪细胞中的脂肪生成
作为本发明胰岛素的体外效力的量度，可以使用脂肪生成。从附睾脂肪垫中分离出原代大鼠脂肪细胞，并与3H-葡萄糖在含有例如1％无脂肪HSA和本发明的标准品(人胰岛素，HI)或胰岛素的缓冲液中孵育。标记的葡萄糖以浓度依赖性方式转化为可提取的脂质，从而产生完整的浓度响应曲线。结果表示为本发明胰岛素与标准品(HI)相比的带有95％置信限的相对效力(％)。
数据在以下表3和表4中给出。
表3.本发明的选定类似物在不存在和存在HSA(0或1.5％)时的胰岛素受体结合数据，以及来自大鼠脂肪细胞的功能性脂肪生成数据
表4.比较化合物在不存在和存在HSA(0和/或1.5％)时的IR(A同种型)受体结合数据，以及来自大鼠脂肪细胞的功能性脂肪生成数据
可以看出，本发明化合物和比较化合物的胰岛素受体结合(和脂肪生成效力)没有不同，因此与连接体的组成(电荷)无关。这与观察到的体内效力差异(实施例30)形成鲜明对比，其中包含带电荷的GQEP连接体的比较化合物比本发明化合物的效力显著更低。
还可以看出，经由肽连接体将EGF(A)肽附加至胰岛素的N末端，在不存在和存在1.5％HSA的情况下，胰岛素受体亲和力大致减半。
实施例27
PCSK9-LDL-R结合竞争性(ELISA)
该测定的目的是测量EGF(A)化合物对PCSK9的表观结合亲和力。
由于它们抑制PCSK9与LDL-R相互作用的能力，本发明化合物也可以被称为PCSK9抑制剂。
实验前一天，将重组人低密度脂蛋白受体(rhLDL-R；NSO-衍生的；R&Dsystems#2148-LD或内部制备)以1μg/mL溶解于50mM碳酸钠(pH 9.6)中，然后向测定板(Maxisorp96，NUNC#439454)的每个孔中添加100μL的该溶液，并在4℃下包被过夜。在实验当天，一式两份制作含生物素化PCSK9(0.5ug/mL，BioSite/BPSBioscience目录号71304或内部制备)的EGF(A)化合物的八点浓度曲线。制备EGF(A)化合物和生物素化PCSK9的混合物，并于室温下在含有25mM Hepes，pH7.2(15630-056，100ml，1M)、150mM NaCl(Emsure 1.06404.1000)、1％HSA(Sigma A1887-25G)、0.05％吐温20(Calbiochem 655205)、2mM CaCl2(Sigma223506-500G)的测定缓冲液中孵育1小时。然后将包被的测定板用200μl测定缓冲液洗涤4次，然后将100μL的EGF(A)化合物和生物素化PCSK9的混合物添加至该板并在室温下孵育2小时。将板用200μL的测定缓冲液洗涤4次，然后在室温下与链霉亲和素-HRP(25ng/ml；VWR#14-30-00)孵育1小时。通过添加50μL的TMB-on(KEM-EN-TEC)来检测该反应并在黑暗中孵育10分钟。然后通过向混合物中添加50μL 4M H3PO4终止反应，其通过电子多重移液添加。然后在1小时内用Spectramax在450和620nm处读板。620nm读数用于背景减除。使用GraphpadPrism，通过非线性回归log(抑制剂)与响应变量斜率(四个参数)计算IC50值，并使用以下公式将其转换为Ki值：Ki＝IC50/(1+(生物素-PCSK9)/(kd(生物素-PCSK9)))，其中生物素-PCSK9的Kd为1.096727714μg/mL，[Biotin-PCSK9]＝0.5(μg/mL)。
本发明化合物的结果在以下表5中示出，比较化合物的数据在以下表5中示出。较高的Ki值反映较低的对PCSK9的表观结合亲和力，反之亦然。通常，大量所测试的EGF(A)化合物在低nM范围内表现出抑制PCSK9与hLDL-R结合的能力。
表5：本发明化合物的表观PCSK9结合亲和力(Ki，单位为nM)和在HepG2细胞中的LDL摄取(EC50，单位为nM)
表6.比较化合物的表观PCSK9结合亲和力(Ki，单位为nM)和在HepG2细胞中的LDL摄取(EC50，单位为nM)
可以看出，本发明化合物和比较化合物的PCSK9结合没有不同，因此与连接体的组成(电荷)无关。
还可以观察到，向EGF(A)肽的C末端附加连接体和胰岛素不会改变与PCSK9的结合。
实施例28
在HepG2细胞中的LDL摄取试验
下文描述了用来确定PCSK9肽及其衍生物的抑制效力的替代试验，用于测量HepG2细胞中的LDL摄取。
试验原理：LDL摄取主要由内源表达的hLDL-R介导，因此LDL摄取能力是LDL-R表达的间接量度。与外源性PCSK9一起孵育可以以剂量依赖性方式下调hLDL-R。因此，PCSK9孵育会降低细胞摄取LDL分子的能力。然后可以通过添加能中和或抑制PCSK9/LDL-R结合的化合物来拮抗LDL摄取的下调。因此，可以基于PCSK9抑制剂在PCSK9的存在下增加LDL摄取以及例如抵消PCSK9介导的hLDL-R下调的能力来表征PCSK9抑制剂。
使用在10％脂蛋白缺乏的胎牛血清(Sigma Aldrich#S5394)中生长的HepG2细胞(Sigma Aldrich ECACC：保藏号85011430)进行试验，并且测量细胞摄取BODIPY荧光标记的LDL颗粒(Life technologies Europe BV#L3483)的能力。
试验方案：将96孔板(Perkin Elmer，ViewPlate-96 Black#60005182)在培养箱中用聚-D-赖氨酸(10mg/L，Sigma Aldrich#P6407，溶解于PBSGibco#14190-094)于37℃包被1小时。然后用100μl的PBS(Gibco#14190-094)洗板2次。为获得EGF(A)化合物的8点浓度曲线制备测试组合物，它们全部含有在测定培养基(DMEM(Gibco#31966-021)、10％脂蛋白缺乏的胎牛血清(Sigma Aldrich#S5394)和1％的Pen Strep(Cambrex#DE17-602E))中稀释的PCSK9(10ug/mL；内部制备)，并且以50uL/孔的体积添加至板上。
30-60分钟后，以50μL/孔的体积添加在测定培养基中稀释的50,000个HepG2细胞(Sigma-Aldrich：ECACC：保藏号85011430，批号：13B023)，并将板在CO2可透性塑料袋(Antalis Team，LDPE袋120/35x300x0.025mm#281604)中孵育20小时(在37℃、5％CO2下)。此后将板清空，之后立即向每个孔中添加50μL在测定培养基中浓度为10μg/mL的FL-LDL(Life technologies Europe BV#L3483)，并将板在CO2可透性塑料袋中孵育2小时(在37℃、5％CO2下)，其用黑色盖子盖上以避光。将板清空，并用100μL的PBS(Gibco#14190-094)洗涤2次。然后添加100μL的PBS(Gibco#14190-094)，并在此后的15分钟内在SpecktraMaxM4(Molecular Probes,Invitrogen Detection Technologies)上使用以下滤波器Ex(515nm)/Em(520nm)读板(底部读取)。
最后，使用GraphPad Prism、非线性回归曲线拟合、S形剂量-响应(可变斜率)计算EC50值。
结果在上表中示出。较低的EC50值反映了较高的逆转PCSK9介导的LDL摄取下调的能力，而相反，高EC50值表明化合物具有低的抑制PCSK9介导的LDL摄取下调的能力。
可以看出，所测试的化合物在LDL摄取试验中表现出100-200nM的EC50，这表明化合物具有高的逆转PCSK9介导的LDL摄取下调的能力。
实施例29
大鼠药代动力学，静脉内大鼠PK：
向300克的有意识、非禁食的约雄性Sprague-Dawley大鼠静脉内(i.v.)给予不同剂量的胰岛素类似物，并在给药后至多48小时以指定的时间间隔使用免疫测定或质谱法测定所用化合物的血浆浓度。随后使用WinNonLin Professional(Pharsight Inc.，MountainView,CA,USA))计算药代动力学参数。
表7.静脉内施用本发明化合物后的大鼠PK数据(平均停留时间)
表8.静脉内施用比较化合物后的大鼠PK数据(平均停留时间)
结论是，本发明的化合物具有与相似的比较化合物类似的PK谱。因此，PK数据不能解释观察到的出人意料的体内效力差异(实施例30)，其中包含带电荷的GQEP连接体的比较化合物比本发明化合物的效力显著更低。
实施例30
本发明和现有技术的胰岛素类似物在Sprague Dawley大鼠中的皮下PK/PD谱
本发明的融合肽衍生物可以通过皮下施用至大鼠来测试，例如按照该方案与现有技术的类似的B29K酰化胰岛素类似物进行比较。可以测试所述衍生物的药代动力学和/或药效学参数。
体内方案
这些实验使用约350克的有意识的、非禁食的雄性Sprague-Dawley大鼠。在研究期间(给药后长达30小时)，大鼠可以自由饮水和进食。使用NovoPen
向大鼠的颈部皮下给药(90nmol/kg；600μM胰岛素衍生物制剂)。在时间点0(给药前)和胰岛素衍生物给药后15分钟、1、2、4、5.5、7、24、29/30小时和最后每天直到30小时抽取血液样品(舌下静脉；将200μl加入
200EDTA管中)，并采集血浆。分别使用BIOSEN分析仪和免疫测定/LCMS分析对葡萄糖以及最终胰岛素衍生物的血浆浓度进行定量。
由图1和图2得出以下结论：间隔体2xGAQP、3xGAQP、4xGAQP、6xGAQP、8xGAQP和10xGAQP赋予相等的胰岛素效力，而较长的间隔体12xGAQP和19xGAQP则削弱胰岛素效力。
观察图3得出以下结论：间隔体2xGAQP和8xGAQP赋予相等的胰岛素效力，而间隔体2xGQEP和8xGQEP出人意料且显著地削弱胰岛素效力。
观察图4得出以下结论：含有连接体2xGAQP、4xGAQP和6xGQAP以及胰岛素置换A14E或B3E的化合物的降血糖效果是等效的，并且优于分别含有连接体2xGQEP和8xGQEP的比较化合物1和2以及媒介物的降血糖效果。
观察图5得出以下结论：间隔体2xGAQP和2xGQAP赋予相等的胰岛素效力，而间隔体2xGQEP出人意料地削弱胰岛素效力。
观察图6得出以下结论：对于间隔体4xGAQP，胰岛素置换desB30和A14E、desB30赋予相等的胰岛素效力，而间隔体4xGQEP出人意料地削弱胰岛素效力。
观察图7得出以下结论：胰岛素置换desB30和B3E，desB30赋予相等的胰岛素效力，并且含有一个和两个OEG部分的侧链赋予相等的胰岛素效力，而与具有2xGAQP间隔体的类似化合物相比，间隔体2xGQEP出人意料地削弱胰岛素效力。
观察图8得出以下结论：胰岛素置换desB30和A14E，desB30赋予相等的胰岛素效力，并且含有一个和两个OEG部分的侧链赋予相等的胰岛素效力，而与具有6xGAQP间隔体的类似化合物相比，间隔体6xGQEP出人意料地削弱胰岛素效力。
观察图9得出以下结论：实施例1的具有侧链十六烷二酰基-gGlu-2xOEG、间隔体2xGAQP的胰岛素出人意料地赋予远高于间隔体2xGQEP和8xGQEP的胰岛素效力。
观察图10得出以下结论：具有侧链二十烷二酰基-gGlu-2xOEG、间隔体6xGAQP的胰岛素出人意料地赋予远高于间隔体4xGQEP的胰岛素效力。
观察图11得出以下结论：经由不带电荷的连接体将本发明的EGF(A)部分附加到胰岛素上，产生与单独胰岛素的效力相比具有类似葡萄糖动力学(glucodynamic)效力的化合物。本发明的融合蛋白起效较慢，这对于基础胰岛素是有利的。
实施例31
急性体内概念验证模型：链脲佐菌素诱发的糖尿病小鼠中的人PCSK9(hPCSK9)攻击模型
该模型的目的是证明胰岛素-EGF(A)融合蛋白的双重活性。双重活性意味着通过用基于胰岛素-EGF(A)的抗PCSK9肽抑制静脉内注射的hPCSK9的作用来增加小鼠肝脏中的LDL受体表达水平，以及该分子的胰岛素部分的降血糖效果。
方法：通过单次高剂量皮下(s.c.)注射链脲佐菌素(230-250mg/kg)使健康的雄性BalBC小鼠(Charles River，德国)成为糖尿病小鼠。5-7天后，将糖尿病动物随机分入指定的治疗组。在实验当天，在t＝0min(图上的第一次给药)向动物静脉内(i.v.)注射媒介物、EGF(A)衍生物或胰岛素-EGF(A)融合蛋白。在t＝15min，以0.4mg/kg的剂量静脉内注射hPCSK9或媒介物(图上的第2次给药)。在时间＝0、15、45和75min时测量血糖水平。注射hPCSK9后60分钟(t＝75min)，将动物用异氟烷麻醉并通过颈脱位法施以安乐死。迅速切下肝脏并在液氮中冷冻。将肝脏样品保持于-80摄氏度下直至分析。通过ELISA对肝脏样品中的LDL-r蛋白进行定量。
小鼠LDL-R ELISA：使用钢珠将一块肝脏(10mg)在TissueLyser上在500uL PBS中以30Hz均质化2.5min。然后，通过添加500uL 2X Lysis Buffer 2(R&D systems目录号895347)裂解组织，并在振荡器(500rpm)上孵育1h。将肝脏裂解物在4℃下以20000g离心10分钟。将澄清的上清液在校准稀释液中稀释50倍，并将50uL用于在mLDL-R ELISA(RDSystems MLDLR0)上分析。用相同样品中的蛋白质浓度对肝脏裂解物中的LDL-R浓度值进行归一化。将裂解物在PBS中稀释20倍，并根据Pierce BCA Protein Assay Kit(目录号23225)，用25uL进行蛋白质测定，重复2次。
通过研究向链脲佐菌素-糖尿病小鼠施用化合物后的血糖变化和肝LDL-r蛋白表达，证明了胰岛素-EGF(A)融合蛋白的体内双重活性。实施例3的胰岛素-EGF(A)融合蛋白以0、3、10、30和100nmol/kg给药，每组n＝5-6只动物。图12显示，向小鼠施用hPCSK9导致肝LDL受体蛋白几乎完全下调。胰岛素-EGF(A)融合蛋白以剂量依赖性方式有效地阻止了PCSK9介导的LDLr蛋白的下调。另外，胰岛素-EGF(A)融合蛋白剂量依赖性地降低血糖(图13)。此外，已显示两种胰岛素-EGF(A)融合蛋白能够阻止hPCSK9介导的LDLr蛋白下调，这类似于单独使用EGF(A)衍生物所见(图14)。
Claims (15)
1.融合蛋白，其包含胰岛素肽、EGF(A)肽、间隔体和取代基，其中：
i.所述胰岛素肽是人胰岛素(SEQ ID NO 2和3)或人胰岛素的类似物，
ii.所述EGF(A)肽是根据SEQ ID NO:1的LDL-R(293-332)的EGF(A)结构域的类似物，
iii.所述间隔体是肽连接体，其包含(GAQP)n或(GQAP)n的区段，其中n＝1-20，并且将胰岛素类似物B链的N末端与EGF(A)类似物的C末端连接，并且
iv.所述取代基具有式(I)：Acy-AA2m-AA3p-，其中
Acy是包含约16个至约20个碳原子的脂肪二酸，
AA2是酸性氨基酸残基，并且其中m为1至10范围内的整数，并且
AA3是中性的含亚烷基二醇的氨基酸残基，且p为1至10范围内的整数，并且
其中AA2和AA3残基的最大数目为10，且
其中AA2和AA3残基可以以任何顺序出现，
或其药学上可接受的盐、酰胺或酯。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物包含301L。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物进一步包含309R；[309R，312E]或[309R，312E，321E]。
4.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述EGF(A)类似物序列是301L，309R，312E和321E。
5.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述胰岛素肽是人胰岛素或包含最多12个突变的人胰岛素的类似物/衍生物。
6.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述胰岛素类似物包含desB30。
7.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述间隔体包含(GAQP)n，其中n为2-10。
8.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述取代基经由所述化合物内胰岛素序列中的Lys/K氨基酸残基连接。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述取代基经由所述化合物的胰岛素序列中的Lys/K氨基酸残基B29K连接。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中所述至少一个酰基部分包含选自1,16-十六烷二酸、1,18-十八烷二酸和1,20-二十烷二酸的脂肪二酸基团。
11.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白选自实施例1-24的化合物(SEQ ID No 17-40)：
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B3E,B29K(十六烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式1)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]10-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式2)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B3E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式3)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式4)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B3E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-OEG),desB30)(化学式5)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B3E,B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式6)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]2-胰岛素(B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式7)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GQAP]2-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式8)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]3-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式9)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]3-胰岛素(A14E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式10)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]4-胰岛素(A14E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式11)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]4-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式12)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]6-胰岛素(A14E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式13)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]6-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式14)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]6-胰岛素(A14E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-OEG),desB30)(化学式15)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]6-胰岛素(A14E,B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式16)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]8-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式17)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]12-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式18)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式19)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(A14E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式20)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(B3E,B29K(十八烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式21)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式22)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(A14E,B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式23)
·EGF(A)(301L,309R,312E,321E)-[GAQP]19-胰岛素(B3E,B29K(二十烷二酰基-gGlu-2xOEG),desB30)(化学式24)。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的融合蛋白，其用作药物。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的融合蛋白，其用于治疗糖尿病和与糖尿病相关的血脂异常。
14.用于在需要治疗的患者中治疗糖尿病的药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1-11中任一项的融合蛋白，以及药学上可接受的辅料。
15.根据权利要求1-11中任一项的融合蛋白在制备用于治疗或预防糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、糖耐量减低、高血糖症和糖尿病性血脂异常的药物中的用途。
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