CN106232627A - 抗pcsk9～glp‑1融合体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供抗PCSK9～GLP‑1融合体及其使用方法。

Description

抗PCSK9～GLP-1融合体及其使用方法

领域

抗PCSK9～GLP-1融合体及其使用方法

背景

糖尿病与较高的心血管疾病发病率和死亡率相关联。高血压、高血脂症以及糖尿病独立地与增加的心血管疾病风险相关联。患有2型糖尿病的受试者与没有糖尿病的受试者相比，具有两倍至四倍增加的心血管疾病风险。

胰高血糖素样肽1(GLP-1)以具有代谢和心血管益处的多效肽著称。其衍生自前胰高血糖素原，前胰高血糖素原为具有158个氨基酸的前体多肽，其在不同的组织中被加工形成许多种不同的胰高血糖素原衍生肽，包括胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)和胃泌酸调节素(OXM)，它们涉及许多种生理功能，包括葡萄糖稳态、胰岛素分泌、胃排空、和肠道生长，以及进食调节。GLP-1被产生为对应于胰高血糖素原的氨基酸72至108(前胰高血糖素原的92至128)的37氨基酸肽。主要的生物活性形式是30氨基酸肽激素(GLP-1(7-37)酸)，其在餐后产生于肠中并且被丰富的内源蛋白酶DPP4快速降解。巴治奥·L(Baggio，L.)和德鲁克·D(Drucker，D.)，肠胃病学(Gasteroenterology)，132：2131-2157(2007)。

GLP-1和GLP-1类似物，充当GLP-1受体的激动剂，已显示出可有效地控制低血糖症，例如2型糖尿病。在销售或开发中的用于治疗2型糖尿病的某些GLP-1类似物包括，例如，利拉鲁肽(liraglutide)(来自诺和诺德公司(Nordisk)的)、度拉糖肽(dulaglutide)(礼来公司(Eli Lilly))、Bydureon(阿斯利康公司/百时美施贵宝公司(AZ/BMS))、阿必鲁泰(Aliblutide)(葛兰素史克公司(GSK))、和艾塞那肽(Exenatide)(来自礼来公司/艾米林生物制药公司(Eli Lilly/Amylin)的)。

起始GLP-1疗法后的主要副作用之一是胃肠道副作用，特别是恶心。这种副作用是暂时的，随时间消退并且能够通过剂量递增而缓解。然而，疗法仅限于能够忍受胃肠道副作用的患者。

PCSK9是LDL胆固醇减少的非酶靶标并且PCSK9突变与LDL胆固醇减少和冠心病相关联。科恩·JC(Cohen JC)，《新英格兰医学杂志》(N Engl J Med)，354：1264(2006)。已显示PCSK9抗体降低由他汀治疗的患者中的LDL胆固醇并且多种选择物正经历临床审评。

虽然存在用于糖尿病和心血管疾病的多种单独治疗，但对解决两种疾病状态(和糖尿病与心血管疾病之间的关系)的单一药用组合物存在需要。提供具有双重活性的单一药用化合物将减少副作用、患者顺应性困难，将增加对个体患者的有益结果，并且将减少卫生保健系统所承担的开支。

概述

根据本描述，披露一种用于治疗糖尿病的双重活性融合分子，该双重活性融合分子包含稳定地融合至一种GLP-1肽的一种抗PCSK9抗体，其中该抗PCSK9抗体结合一种PCSK9多肽并且该GLP-1肽结合一种GLP-1受体。

在一个方面中，其中GLP-1肽通过一种连接肽融合至PCSK9抗体。

在另一种方式中，该连接肽融合至GLP-1肽的C端。

在一个实施例中，GLP-1肽包括SEQ ID NO：36的氨基酸序列。

在一个实施例中，GLP-1肽包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

在一种方式中，其中GLP-1分子的Cys18与连接肽或与GLP-1肽自身形成一个二硫桥键。

在一个方面中，融合分子在动物中控制葡萄糖和/或降低LDL。该动物可以是人。

还披露一种用于治疗糖尿病的双重活性融合分子，该双重活性融合分子包含稳定地融合至包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列的一种GLP-1肽的一种抗PCSK9抗体；其中该GLP-1肽的C端通过一个肽接头融合至该抗PCSK9抗体的轻链，并且其中该抗PCSK9抗体结合一种PCSK9多肽而该GLP-1肽结合一种GLP-1受体。

另一个实施例披露一种治疗2型糖尿病的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予在此所述的一种融合分子。

另一个方面包括向对其有需要的受试者给予在此所述的一种融合分子。

在一种方式中，一种降低受试者的低密度脂蛋白(LDL)的方法包括向对其有需要的受试者给予在此所述的一种融合分子。

另一个方面包括一种在受试者中控制葡萄糖和降低LDL的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予在此所述的一种融合分子。

另一个方面包括一种在受试者中促进体重减轻和降低LDL的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予在此所述的一种融合分子。

在一个实施例中，该受试者具有2型糖尿病。

在另一个实施例中，该受试者具有代谢性综合征。

再一个方面是一种双重活性融合分子，该双重活性融合分子包含稳定地融合至包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列的一种GLP-1肽的一种抗体，其中该GLP-1肽的C端通过一个肽接头融合至该抗体的轻链，并且其中该抗体结合一种靶标多肽而该GLP-1肽结合一种GLP-1受体。

再一个方面是一种双重活性融合分子，该双重活性融合分子包含稳定地融合至包括SEQ ID NO：36的氨基酸序列的一种GLP-1肽的一种抗体，其中该GLP-1肽的C端通过一个肽接头融合至该抗体的轻链，并且其中该抗体结合一种靶标多肽而该GLP-1肽结合一种GLP-1受体。

在一些方面中，GLP-1分子包括SEQ ID NO：36的氨基酸序列。在一些方面中，抗体是一种抗PCSK9抗体。

在某些方式中，该抗PCSK9抗体的轻链与SEQ ID NO：2的氨基酸序列为至少90％一致的。在其他方式中，该抗PCSK9抗体的轻链包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在又一些方式中，该抗PCSK9抗体的重链与SEQ ID NO：1的氨基酸序列为至少90％一致的。在一些方面中，该抗PCSK9抗体的重链包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在一些实施例中，肽接头包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在该双重活性融合分子的一些实施例中，GLP-1分子的Cys18与GLP-1肽的C端形成一个二硫桥键。

在一些实施例中，双重活性融合分子是用于治疗糖尿病。在一些实施例中，双重活性融合分子在动物中控制葡萄糖和/或降低LDL。

在一些方式中，受试者是人。

一些实施例包括一种用于治疗糖尿病的双重活性融合分子，该双重活性融合分子包含稳定地融合至一种GLP-1肽的一种抗PCSK9抗体，该GLP-1肽与包括SEQ ID NO：29的氨基酸序列的一种GLP-1肽相比对人GLP-1受体具有降低的效力；其中该GLP-1肽的C端通过一个肽接头融合至该抗PCSK9抗体，并且其中该抗PCSK9抗体结合一种PCSK9多肽而该GLP-1肽结合一种GLP-1受体。在一些实施例中，包括SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29的氨基酸序列的GLP-1肽使用包括SEQ ID NO：4的一个接头融合至包括SEQ ID NO：416的氨基酸序列。在另外的实施例中，根据权利要求25或26所述的双重活性融合分子，其中与包括SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29的氨基酸序列的GLP-1肽相比，对人GLP-1受体的效力降低30至60倍。

一些实施例包括一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码在此所述的融合分子。

在某些方式中，包括一种载体，该载体包含在此所述的多核苷酸。在其他方式中，一种宿主细胞包含在此所述的多核苷酸或载体。

在一些实施例中，一种制备融合分子的方法包括在允许融合分子表达的条件下培养宿主细胞，以及回收融合分子。

在一些方式中，一种药用组合物包含在此所述的融合分子和一种载体。在一些方式中，一种试剂盒包含在此所述的组合物。

另外的目的和优点将在随后的描述中部分阐述，并且部分目的和优点在描述中将是显而易见的，或可通过实践来领会。这些目的和优点将通过附加权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。

应了解，上文的一般描述与下文的详细描述均只是例示性和解释性的，而并非为权利要求的限制。

附图被结合在本说明书中并构成本说明书的一部分，其说明一个(若干)实施例并且与描述一起，用于解释在此所述的原则。

附图简要说明

图1A是如在此所述的双重作用融合分子的示意图。图1B-D示出抗体-肽融合分子的某些实施例的不同示意图。

图1E示出使用PC9#2可变重链与种系序列1-46(DP-7)的数值编号的比对。不符值以黑色背景下的白色显示。

图1F示出使用PC9#2可变轻链与种系序列VK1 O18 O8(DPK1)的数值编号的比对。不符值以黑色背景下的白色显示。

图2A-G示出在重链N端处的抗PCSK9抗体/GLP-1肽融合体对人PCSK9结合抗PCSK9mAb的抑制作用。

图3A-G示出在轻链N端处的抗PCSK9抗体/GLP-1肽融合体对人PCSK9结合抗PCSK9mAb的抑制作用。

图4A-B示出在抗体重链(A)和轻链(B)处的抗PCSK9抗体/GLP-1肽N端融合体对人GLP1-受体的活化作用。

图5A展示GLP-1类似物与对照抗体NIP228重链融合时，在大鼠中的稳定性。

图5B证实Exendin-4 GLP-1类似物与抗PCSK9抗体PC9#2轻链融合时，在大鼠中的稳定性。

图5C证实GLP-1类似物与人IgG4 Fc片段融合时，在小鼠中的稳定性。

图5D证实GLP-1类似物与抗PCSK9抗体PC9#2轻链融合时，在小鼠中的稳定性。

图6证实指导PCSK9亲和力和GLP-1效力的潜在靶标分布图。

图7A提供用于具有所结合的N-糖基化共有基序的八种化合物的肽和接头氨基酸序列。

图7B提供用于结合有二硫桥键的三种化合物的肽氨基酸序列。

图8示出PC9#2_GLP1分子和用作基准对照的抗PC9#2抗体和GLP-1Fc(G4)的视觉表示。

图9示出NIP228_GLP1_VH(与对照抗体NIP228重链融合的GLP-1类似物)在大鼠中的稳定性。

图10示出PC9#2_GLP-1_VL(与抗PCSK9抗体PC9#2轻链融合的GLP-1类似物)在小鼠中的稳定性。

图11示出PC9#2_DSB#3(与抗PCSK9抗体PC9#2轻链融合的Exendin-4类似物DSB#3)在小鼠中的稳定性。

图12示出PC9#2_NGS#7(与抗PCSK9抗体PC9#2轻链融合的GLP-1类似物NGS#7)在小鼠中的稳定性。

图13A示出GLP-1类似物NGS#7在与抗PCSK9抗体PC9#2轻链融合时，在小鼠中的稳定性。

图13B示出Exendin-4类似物DSB#1在与抗PCSK9抗体PC9#2轻链融合时，在小鼠中的稳定性。

图13C展示Exendin-4类似物DSB#3在与抗PCSK9抗体PC9#2轻链融合时，在小鼠中的稳定性。

图14A示出基准化合物GLP-1-Fc融合体在小鼠中的稳定性。空心正方形：血清中待测分子随时间推移的浓度；空心菱形：对于同样的样品，“活性”待测分子(如通过GLP-1活性所测量)随时间推移的浓度。

图14B示出Exendin-4类似物DSB#1在与抗PCSK9抗体PC9#2轻链融合时，在小鼠中的稳定性。空心正方形：血清中待测分子随时间推移的浓度；空心菱形：对于同样的样品，“活性”待测分子(如通过GLP-1活性所测量)随时间推移的浓度。

图15A提供Exendin-4类似物DSB#1在与抗PCSK9抗体PC9#2轻链融合时，在初始蛋白A纯化之后的制备性SEC色谱图。

图15B提供Exendin-4类似物DSB#3在与抗PCSK9抗体PC9#2轻链融合时，在初始蛋白A纯化之后的制备性SEC色谱图。

图16示出Exendin-4类似物DSB#1在与抗PCSK9抗体PC9#2轻链融合时，在初始蛋白A纯化之后的分析性SEC-HPLC分布图。

图17示出结合有半胱氨酸桥的另外的Exendin-4变体肽的氨基酸序列。半胱氨酸残基以黑色显示，其他突变残基显示为加下划线，并且位于C端帽处的另外的甘氨酸残基以灰色显示。

图18提供Exendin-4类似物DSB#7在与抗PCSK9抗体PC9#2轻链融合时，在初始蛋白A纯化之后的制备性SEC色谱图。

图19提供Exendin-4类似物DSB#9在与抗PCSK9抗体PC9#2轻链融合时，在初始蛋白A纯化之后的制备性SEC色谱图。

图20示出Exendin-4类似物DSB#7在与抗PCSK9抗体PC9#2轻链融合时，在大鼠中的稳定性。

图21展示Exendin-4类似物DSB#9在与抗PCSK9抗体PC9#2轻链融合时，在大鼠中的稳定性。

图22A示出PCSK9/GLP-1融合体对PCSK9的抑制作用在人类中的模拟。

图22B展示与度拉糖肽相比，PCSK9/GLP-1融合分子对GLP-1的激动活性在人类中的模拟。

图23示出PC9_2_DSB#7的改善单体分布图。

图24展示在单次静脉内注射后，肽/抗体分子在大鼠中的药代动力学分布图。

图25使用竞争ELISA证实人PCSK9结合LDL受体的抑制。

图26示出HepG2细胞中人PCSK9依赖性的LDL摄取损失的抑制。

图27示出经工程化的对人GLP-1受体的效力降低。

图28A示出Exendin-4GLP-1类似物DSB7_V19A在与抗PCSK9抗体HS9轻链融合时的人GLP1r cAMP测定。

图28B展示Exendin-4GLP-1类似物DSB7_V19A在与抗PCSK9抗体HS9轻链融合时，在大鼠中的稳定性。

图29A-D示出通过cAMP测定而确定的融合分子HS9_DSB7_V19对GLP-1受体的特异性。

图30A-B示出随时间推移，包括给药后第7天的优越葡萄糖控制(A)和体重减轻(B)。

图31示出抗PCSK9抗体HS9使用不同接头与GLP-1类似物肽DSB7_V19A融合时，结合人PCSK9。

图32示出GLP-1类似物肽DSB7_V19A使用不同接头与抗PCSK9抗体HS9融合时的人GLP-1受体活化。

图33展示抗PCSK9抗体与GLP-1类似物肽DSB7_V19A融合时，结合人PCSK9

图34展示GLP-1类似物肽DSB7_V19A与抗PCSK9抗体融合时的人GLP-1受体活化

图35证实抗B7-H1抗体2.7A4与GLP-1类似物肽DSB7_V19A融合时，结合人B7-H1

图36示出GLP-1类似物肽DSB7_V19A与抗B7-H1抗体2.7A4融合时的人GLP-1受体活化。

图37描述在以60、30或10mg/kg进行单次静脉内注射后，融合分子HS9_DSB7_V19A在大鼠中的稳定性。

图38示出在以60、30或10mg/kg的HS9_DSB7_V19A进行单次静脉内注射后，大鼠中的游离PCSK9浓度。

图39示出在以60mg/kg的HS9_DSB7_V19A进行单次皮下注射后，大鼠中的总化合物、对GLP-1受体的活性化合物以及游离PCSK9浓度。

图40A-C提供口服葡萄糖耐量试验(第0天(A)、第2天(B)、第7天(C))的结果，确认了HS9_DSB7_V19A的单次皮下给药的能力。

图41示出图40A-C的口服葡萄糖耐量试验中随时间推移的体重变化。

图42A-C展示口服葡萄糖耐量试验(第0天(A)、第2天(B)、第7天(C))的结果。

图43提供图42A-C的口服葡萄糖耐量试验中随时间推移的体重变化。

图44示出腹膜内葡萄糖耐量试验中的体重变化。

图45证实在腹膜内葡萄糖耐量试验中，与媒介物对照相比，每周一次的HS9_DSB7_V19A表现出4小时空腹血糖的剂量依赖性降低。

图46显示如通过IPGTT在研究第22天所评估，每周给药一次的HS9_DSB7_V19A表现出葡萄糖耐量的剂量依赖性改善。

图47A-B示出在饮食诱导的肥胖小鼠模型中的血糖水平。

图48A-B示出在饮食诱导的肥胖小鼠模型中的体重(克)(A)和％体重变化(B)。

图49示出在使用HS9_DSB7_V19A的多剂量研究中，随时间推移的体重变化。

图50A-B示出在每周一次的给药设置中，HS9_DSB7_V19A的GLP-1组分对血糖控制的效应，测量了进食血糖(fed glucose)(A)和末期空腹血糖(terminal fasting glucose)(B)。

实施方式说明

I.抗PCSK9～GLP-1融合分子

本披露涉及抗体(例如，抗PCSK9抗体或其抗原结合片段)与GLP-1部分的融合体。

在一个实施例中，该融合体被构建为：

GLP-1部分-接头-抗体轻链

或

GLP-1部分-接头-抗体重链。

该融合蛋白可以被构建为基因融合体。可替代地，该融合蛋白可以被构建为化学偶联物，诸如通过半胱氨酸：半胱氨酸二硫键。

GLP-1部分和抗体部分的其他安排也在本文的范围之内。

A.抗体和其抗原结合片段

1.抗PCSK9部分

该抗体部分可以是抗PCSK9抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，抗PCSK9部分提供降低LDLc(坏胆固醇)的效应。

在一个实施例中，抗PCSK9VL部分可以是SEQ ID NO：2(PC9_2_HS9)。在另一个实施例中，抗PCSK9 VL部分可以是SEQ ID NO：2的抗原结合部分。在一个实施例中，抗PCSK9 VL部分可以包括SEQ ID NO：2的全部六个CDR。在一个实施例中，抗PCSK9 VH部分可以是如SEQID NO：5所示的抗体的pH依赖性型式。

在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段可以是pH依赖性的，这样使得与抗原的抗体结合是pH依赖性的。这可以用于改变抗体和/或抗原的半衰期。在一个实施例中，改变抗体半衰期的意思是延长半衰期。在一个实施例中，改变抗体半衰期的意思是缩短半衰期。在一个实施例中，抗体半衰期可以被改变(延长或缩短)以便最大化其融合配偶体(即GLP-1)的稳定性。修改抗原半衰期还可以意指抗原-抗体复合物能够改变抗原的半衰期，诸如通过抗体介导的降解(缩短半衰期)或通过保护抗原以免典型的降解过程(延长半衰期)。在一个实例中，抗体可以在pH 7.4下与在内体pH(即，pH 5.5-6.0)下相比，对抗原具有一个更高的亲和力，这样使得pH 5/5/pH 7.4或pH 6.0/pH 7.2下的K_D比率为2或更大。工程化pH依赖性抗体的方法描述于US2011/0229489和2014/0044730，两者通过引用结合在此。

在一个实施例中，抗PCSK9部分提供游离PCSK9的持续抑制。在一个实施例中，提供至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的抑制。

在一个实施例中，能够特异性结合PCSK9的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包括：

a.一个重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO：1、5、8或10至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列；以及

b.一个轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO：2、6、9或11至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。

在一个实施例中，能够特异性结合PCSK9的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包括：

a.一个重链可变区CDR1序列，该重链可变区CDR1序列包括与SEQ ID NO：14相比具有一个突变的序列；

b.一个重链可变区CDR2序列，该重链可变区CDR2序列包括与SEQ IDNO：15、16、17或18相比具有一个或两个突变的序列；

c.一个重链可变区CDR3序列，该重链可变区CDR3序列包括与SEQ IDNO：19相比具有一个突变的序列；

d.一个轻链可变区CDR1序列，该轻链可变区CDR1序列包括与SEQ ID NO：20、21、22或23相比具有一个或两个突变的序列；

e.一个轻链可变区CDR2序列，该轻链可变区CDR2序列包括与SEQ ID NO：24或25相比具有一个突变的序列；以及

f.一个轻链可变区CDR3序列，该轻链可变区CDR3序列包括与SEQ ID NO：26相比具有一个突变的序列。

在一个实施例中，能够特异性结合PCSK9的抗PCSK9抗体或其抗原结合片段包括：

a.一个重链可变区CDR1序列，该重链可变区CDR1序列包括SEQ ID NO：14；

b.一个重链可变区CDR2序列，该重链可变区CDR2序列包括SEQ ID NO：15、16、17或18；

c.一个重链可变区CDR3序列，该重链可变区CDR3序列包括SEQ ID NO：19；

d.一个轻链可变区CDR1序列，该轻链可变区CDR1序列包括SEQ ID NO：20、21、22或23；

e.一个轻链可变区CDR2序列，该轻链可变区CDR2序列包括SEQ ID NO：24或25；以及

f.一个轻链可变区CDR3序列，该轻链可变区CDR3序列包括SEQ ID NO：26。

在另一个实施例中，抗PCSK9部分可以包括如US 8,030,457、US 8,062,640、US 8,357,371、US 8,168,762、US 8,563,698、US 8,829,165、US 8,859,741、US 8,188,233、WO2012/088313、US 2012/0195910、US 8,530,414、US 2013/0189278、US 8,344,144、US2011/0033465、US 8,188,234、US 8,080,243、US 2011/0229489、US 2010/0233177、US2013/315927以及US 2013/0071405中的任一个中所述的抗PCSK9抗体或抗原结合片段。这些参考案中的每一个针对抗PCSK9抗体和其抗原结合片段的序列和说明而通过引用结合。

在一个实施例中，抗PCSK9部分可以包括选自以上表1的B组中序列的重链可变区和轻链可变区。可替代地，抗PCSK9部分可以包括与以上表1的B组中的重链可变区和轻链可变区一致的具有CDR的重链可变区和轻链可变区。另外地，抗PCSK9部分可以包括选自SEQID NOS：53、55、57、59、61或63的一个重链可变区和选自SEQ ID NOS：54、56、58、60、62或64的一个轻链可变区。可替代地，抗PCSK9部分可以包括选自SEQ ID NOS：53、55、57、59、61或63中的任一个的重链CDR1、CDR2以及CDR3和选自SEQ ID NOS：54、56、58、60、62或64中的任一个的轻链CDR1、CDR2以及CDR3。

在一个实施例中，抗PCSK9部分可以包括选自以上表1的C组中序列的重链可变区和轻链可变区。可替代地，抗PCSK9部分可以包括与以上表1的C组中的重链可变区和轻链可变区一致的具有CDR的重链可变区和轻链可变区。另外地，抗PCSK9部分可以包括选自SEQID NOS：65-95的一个重链可变区和选自SEQ ID NOS：96-126的一个轻链可变区。可替代地，抗PCSK9部分可以包括选自SEQ ID NOS：65-95中的任一个的重链CDR1、CDR2以及CDR3和选自SEQ ID NOS：96-126中的任一个的轻链CDR1、CDR2以及CDR3。

在一个实施例中，抗PCSK9部分可以包括选自以上表1的D组中序列的重链可变区和轻链可变区。可替代地，抗PCSK9部分可以包括与以上表1的D组中的重链可变区和轻链可变区一致的具有CDR的重链可变区和轻链可变区。另外地，抗PCSK9部分可以包括选自SEQID NOS：127-218的一个重链可变区和选自SEQ ID NOS：219-311的一个轻链可变区。可替代地，抗PCSK9部分可以包括选自SEQ ID NOS：127-218中的任一个的重链CDR1、CDR2以及CDR3和选自SEQ ID NOS：219-311中的任一个的轻链CDR1、CDR2以及CDR3。

在一个实施例中，抗PCSK9部分可以包括选自以上表1的E组中序列的重链可变区和轻链可变区。可替代地，抗PCSK9部分可以包括与以上表1的E组中的重链可变区和轻链可变区一致的具有CDR的重链可变区和轻链可变区。另外地，抗PCSK9部分可以包括选自SEQID NOS：312-317的一个重链可变区和选自SEQ ID NOS：318-323的一个轻链可变区。可替代地，抗PCSK9部分可以包括选自SEQ ID NOS：312-317中的任一个的重链CDR1、CDR2以及CDR3和选自SEQ ID NOS：318-323中的任一个的轻链CDR1、CDR2以及CDR3。

在一个实施例中，抗PCSK9部分可以包括选自以上表1的F组中序列的重链可变区和轻链可变区。可替代地，抗PCSK9部分可以包括与以上表1的F组中的重链可变区和轻链可变区一致的具有CDR的重链可变区和轻链可变区。另外地，抗PCSK9部分可以包括选自SEQID NO：324的一个重链可变区和选自SEQ ID NO：325的一个轻链可变区。可替代地，抗PCSK9部分可以包括选自SEQ ID NOS：324中的任一个的重链CDR1、CDR2以及CDR3和选自SEQ IDNOS：325中的任一个的轻链CDR1、CDR2以及CDR3。

在一个实施例中，抗PCSK9部分可以包括选自以上表1的G组中序列的重链可变区和轻链可变区。可替代地，抗PCSK9部分可以包括与以上表1的G组中的重链可变区和轻链可变区一致的具有CDR的重链可变区和轻链可变区。另外地，抗PCSK9部分可以包括选自SEQID NOS：326、339、340或343-400的一个重链可变区和选自SEQ ID NOS：327、341或342的一个轻链可变区。可替代地，抗PCSK9部分可以包括选自SEQ ID NOS：326、339、340或343-400中的任一个的重链CDR1、CDR2以及CDR3和选自SEQ ID NOS：327、341或342中的任一个的轻链CDR1、CDR2以及CDR3。此外，抗PCSK9部分可以包括选自SEQ ID NOS：328(HC CDR1)、329(HC CDR2)、331(HC CDR2)、330(HC CDR3)、332(HC CDR3)的重链CDR1、CDR2以及CDR3和选自SEQ ID NOS：333(LC CDR1)、334(LC CDR2)、335(LC CDR3)、336(LC CDR1)、337(LC CDR2)和338(LC CDR3)的轻链CDR1、CDR2以及CDR3。在一个实施例中，抗PCSK9部分可以包括重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包括SEQ ID NO：491的氨基酸序列，该轻链可变区包括SEQ ID NO：492的氨基酸序列。可替代地，抗PCSK9部分可以包括选自SEQ ID NOS：493-495中的重链CDR1、CDR2以及CDR3和选自SEQ ID NOS：496-498的轻链CDR1、CDR2以及CDR3。

在其他实施例中，抗体部分可以包括不同于抗PCSK9抗体的抗体(例如，抗B7-H1抗体)。在一个实施例中，抗B7-H1抗体可以包括重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包括SEQ ID NO：422的氨基酸序列，该轻链可变区包括SEQ ID NO：423的氨基酸序列。

2.抗体或抗原结合片段

在此使用的术语抗体或其抗原结合片段在其最广泛的意义上使用。它可以是人造的，诸如通过常规杂交瘤技术、重组技术产生的单克隆抗体(mAb)和/或其功能片段。它可以包括完整的免疫球蛋白分子，例如多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、单特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体、动物抗体(例如，骆驼科动物抗体)、嵌合抗体，以及其部分、片段、区、肽和衍生物(通过任何已知的技术诸如但不限于酶促裂解、肽合成或重组技术所提供的)，例如诸如缺乏轻链的免疫球蛋白、Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fv、scFv、抗体片段、双抗体、Fd、CDR区、或抗体的能够结合抗原或表位的任何部分或肽序列。在一个实施例中，功能部分是单链抗体、单链可变区片段(scFv)、Fab片段、或F(ab′)₂片段。

如果一种抗体或功能部分能够特异性与一种分子反应从而使该分子结合至该抗体，则称该抗体或功能部分“能够结合”该分子。抗体片段或部分可以缺乏完整抗体的Fc片段，从循环中更快速清除，并且可以具有比完整抗体更少的非特异性组织结合。抗体的实例可以使用本领域中熟知的方法由完整抗体产生，例如通过用酶诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab′)₂片段)进行蛋白水解裂解。抗体的部分可以通过上述方法中的任一种而产生，或者可以通过表达重组分子的一部分而产生。例如，重组抗体的一个或多个CDR可以被分离并且亚克隆到适当的表达载体中。

在一个实施例中，抗体或功能部分是一种人类抗体。人类抗体用于人类疗法可以减小由于人类个体中针对非人序列的免疫反应而引起的副反应的可能性。在另一个实施例中，抗体或功能部分是人源化的。在另一个实施例中，抗体或功能部分是一种嵌合抗体。这样，所感兴趣的序列，诸如例如所感兴趣的结合位点能够被包括进抗体或功能部分中。

在一个实施例中，抗体可以具有一种IgG、IgA、IgM或IgE同种型。在一个实施例中，抗体是一种IgG。在一个方面中，抗PCSK9抗体或其抗原结合片段可以是一种IgG1。

3.对恒定结构域的修饰

在一个实施例中，抗PCSK9抗体或抗原结合片段包括一个Fc区。应理解，如在此使用的Fc区包括含有抗体的除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的恒定区的多肽。因此，Fc是指IgA、IgD、以及IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域、以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域、以及在这些结构域的N端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cgamma2和Cgamma3(Cγ2和Cγ3)以及Cgammal(Cγ1)与Cgamma2(Cγ2)之间的铰链。尽管Fc区的界限可以改变，人IgG重链Fc区通常被定义为在其羧基端包括残基C226或P230，其中编号是根据如卡巴特(Kabat)(1991，NIHPublication 91-3242，国家技术信息服务(National Technical Information Service)，斯普林菲尔德(Springfield)，弗吉尼亚州(VA))中列出的EU索引进行的。“如卡巴特中列出的EU索引”是指如卡巴特等人(同上)中所述的人IgG1 EU抗体的残基编号。Fc可以是指孤立地这个区，或在抗体、抗体片段或Fc融合蛋白的环境中的这个区。

在一个实施例中，抗PCSK9抗体或其抗原结合部分具有效应子功能降低(例如，降低的ADCC和/或CDC)的一个变体Fc区。在一个实施例中，该Fc区没有可检测的效应子功能。在一个实施例中，该Fc区包含在选自以下的一个或多个位置处的至少一个非天然氨基酸：如通过如在Kabat中列出的EU索引来编号的234、235以及331。在一个具体实施例中，本发明提供一种Fc变体，其中Fc区包含选自以下的至少一个非天然氨基酸：如通过如在Kabat中列出的EU索引来编号的234F、235F、235Y以及331S。在又一个具体实施例中，本发明的Fc变体包含如通过如在Kabat中列出的EU索引来编号的234F、235F以及331S氨基酸残基。在另一个具体实施例中，本发明的Fc变体包含如通过如在Kabat中列出的EU索引来编号的234F、235Y以及331S氨基酸残基。在一个特定实施例中，抗PCSK9抗体或其抗原结合部分具有一个变体Fc区，其中该变体包含位置234处的苯丙氨酸(F)残基、位置235处的苯丙氨酸(F)残基或谷氨酸(E)残基、以及位置331处的丝氨酸(S)残基，如通过如在Kabat中列出的EU索引来编号的。此类突变组合在下文中称为三突变体(TM)。

如通过如在Kabat中列出的EU索引来编号的丝氨酸228脯氨酸突变(S228P)在下文中称为P突变，已经被报道增加了特定IgG4分子的稳定性(Lu等人，《药学杂志》(JPharmaceutical Sciences)97(2)：960-969，2008)。注意：在Lu等人中，将其称为位置241，因为其中他们使用了Kabat编号体系，而非如Kabat中列出的“EU索引”。

这个P突变可以与L235E结合以便进一步敲出ADCC。这种突变组合在下文中称为双突变(DM)。

B.GLP-1部分

该融合分子含有GLP-1部分。GLP-1也可以利用同义词胰高血糖素样肽-1来提及。通过GLP-1我们还提及了Exendin-4，这是一种GLP-1类似物。在一个实施例中，GLP-1部分提供葡萄糖控制和/或体重减轻的益处。

在一个实施例中，全长GLP-1分子可以用在融合蛋白中。在另一个实施例中，GLP-1的片段可以用作融合蛋白中的GLP-1部分。

在一个实施例中，GLP-1部分具有允许形成二硫桥键的一对半胱氨酸残基。在一个实施例中，半胱氨酸是与亲本序列相比而言的一种工程化的半胱氨酸。在一个实施例中，半胱氨酸是一种E18C突变。

在一个实施例中，相比于野生型GLP-1(例如SEQ ID NO：29)或GLP-1类似物(例如SEQ ID NO：12)，对人GLP-1受体的GLP-1效力有所降低。在另一个实施例中，对人GLP-1受体的GLP-1效力低于野生型GLP-1或GLP-1类似物至少约10X、20X、30X、40X、50X、60X、100X、125X、150X、175X、200X或225X。在另一个实施例中，与度拉糖肽相比，效力降低相似的量。GLP-1效力可以降低以便允许PCSK9饱和并且同时减少副作用。在一个实施例中，GLP-1部分可以具有降低GLP-1部分的效力的至少一个突变。在一个实施例中，这提供了减少副作用(包括但不限于恶心)的益处。在一个实施例中，该突变是一种点突变。在一个实施例中，该点突变选自关于Exendin-4而言的V19A、G2V、E15A或L26I。

在一个实施例中，GLP-1部分包括SEQ ID NOS：3、7、12、13或28-42中的任一个。在另一个实施例中，GLP-1部分是SEQ ID NOS：3、7、12、13或28-42中的任一个的包含至少10、15、20或25个氨基酸的片段。在又一个实施例中，GLP-1部分包括与SEQ ID NOS：3、7、12、13或28-42中的任一个至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在又一个实施例中，GLP-1部分包括与SEQ ID NOS：3、7、12、13或28-42中的任一个相比具有1、2、3、4、5或6个突变的序列。

C.融合和接头

在一个实施例中，GLP-1部分直接或间接融合至抗PCSK9抗体或抗原结合片段的轻链。在另一个实施例中，GLP-1部分直接或间接融合至抗PCSK9抗体或抗原结合片段的重链。

在一个实施例中，一种接头可以用于构建抗PCSK9抗体或抗原结合片段与GLP-1部分之间的融合体。在另一个实施例中，抗PCSK9抗体或抗原结合片段可以直接偶联至GLP-1部分。

如果使用一种接头，该接头可以选自用于融合蛋白的任何适合的接头。在一个实施例中，该接头可以包括单独的或与其他氨基酸组合的GGGGS(SEQ ID NO：27)重复，即一组、二组、三组或四组重复。在一个实施例中，该接头可以包括单独的或与其他氨基酸组合的G和S的其他组合。在一些实施例中，该接头具有C端丙氨酸(A)。

在一个实施例中，一种特异性接头可以选自GGGGSGGGGSGGGGSA(SEQ ID NO：4)。在一个实施例中，该接头允许在GLP-1部分的C端与GLP-1分子的另一部分、但不与抗体部分之间形成二硫桥键。在这种实例中，具有有限柔性的接头可以防止与抗体部分的所不需要的二硫桥键连接。

在一个实施例中，接头与SEQ ID NO：4至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。

在一个实施例中，通过在GLP-1部分中产生半胱氨酸置换突变来形成半胱氨酸：半胱氨酸二硫桥键。在一个实施例中，该突变是E18C。

II.编码融合分子的核酸

当前实施例进一步提供一种分离的、合成的或重组的核酸序列，该核酸序列编码以上节段错误！未找到引用源。中所述的任何融合分子。此类核酸编码在此列出的重链和轻链序列。可替代地，此类核酸包括融合至GLP-1部分的抗PCSK9抗体或抗原结合部分。由于核酸编码的简并性，多种核酸将编码同一氨基酸并且全部包括在此。

III.制备融合分子、配制品和药用组合物的方法

一个实施例包括一种产生融合分子的方法，该方法包括在表达一种核酸以产生核酸分子的条件下培养宿主细胞，接着回收该融合分子。多种细胞系可以用于表达融合分子，包括但不限于哺乳动物细胞系。在一个实施例中，细胞系可以是人类的。在另一个实施例中，可以使用细菌或昆虫细胞系。在一个实施例中，细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO细胞变体(例如DG44)、293细胞、以及NS0细胞。在另一个实施例中，细胞系包括VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293F、293T、3T3、W138、BT483、Hs578T、Sp2/0、HTB2、BT2O、T47D、CRL7O3O以及HsS78Bst细胞。

重组表述利用表达载体的构建，该表达载体包含编码融合分子的多核苷酸。一旦获得多核苷酸，就通过本领域中熟知的重组DNA技术来产生用于产生融合分子的载体。表达载体可以包括适当的转录和翻译控制信号。这可以使用体外重组DNA技术、合成技术、以及体内基因重组来完成。在一个实施例中，一种复制载体包含可操作地连接至异源性启动子的核酸序列，该核酸序列编码一种抗体或功能部分。

多种宿主表达载体系统可以用以表达在美国专利号5,807,715中所述的融合分子。例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，与载体如来自人巨细胞病毒的主要立即早期基因启动子元件相结合是抗体的有效表达系统(福金(Foecking)等人，《基因》(Gene)45：101(1986)；以及科克特(Cockett)等人，《生物技术》(Bio/Technology)，8：2(1990))。另外，可以选择调节所插入序列的表达、或以所希望的特定方式来修饰并且加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)对于蛋白质的功能来说可能是重要的。不同的宿主细胞具有针对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征性和特异性机制。可以选择适当细胞系或宿主系统以确保本发明蛋白质的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于初级转录物的适当加工、基因产物的糖基化、以及磷酸化的细胞机器(cellular machinery)的真核宿主细胞。

在细菌系统中，取决于所表达的融合分子的预定用途，可以选择许多表达载体。例如，在有待产生大量的这种融合分子以便产生包含该融合分子的药用组合物时，引导容易纯化的较高水平的融合蛋白产物的表达的载体可以是令人希望的。这类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，EMBO，12：1791(1983))，其中编码序列可以单独地连接入载体中、与lac Z编码区同框，这样使得一个融合蛋白被产生；pIN载体(Inouye&Inouye，1985，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)13：3101-3109(1985)；Van Heeke&Schuster，1989，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，24：5503-5509(1989))；等等。pGEX载体也可以用于表达作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。总体来说，这类融合蛋白是可溶的并且可以通过吸附并且结合至谷胱甘肽-琼脂糖亲和基质，随后在存在游离谷胱甘肽下洗脱来容易地从溶解的细胞中纯化。pGEX载体被设计成将凝血酶和/或因子Xa蛋白酶裂解位点引入所表达的多肽中以使得克隆的靶标基因产物可以从GST部分上释放。

在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus；AcNPV)被用作表达外源基因的载体。病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。蛋白质编码序列可以单独地克隆至病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)中并且置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。

在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，所感兴趣的编码序列可以连接至腺病毒转录/翻译控制复合物，例如，晚期启动子和三联体前导序列。然后可以通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组。插入病毒基因组的一个非必要区(例如，E1或E3区)中可能产生活的并能够在感染的宿主中表达抗体或功能部分的重组病毒(例如，参见Logan&Shenk，《美国国家科学院院刊》，81：355-359(1984))。特定的起始信号也可能被要求用于插入的抗体或功能部分编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。另外，起始密码子应当与所希望的编码序列的阅读框同框以便确保整个插入物的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以具有多种来源，天然的和合成的。表达效率可以通过包括适当的转录增强子元件、转录终止子等来提高(参见例如，Bittner等人，《酶学方法》(Methods in Enzymol.)，153：51-544(1987))。

稳定表达可以用于重组蛋白的长期、高产量生产。例如，可以产生稳定表达融合分子的细胞系。可以用包含表达控制元件(例如，启动子、增强子、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标志基因的适当工程化的载体转化宿主细胞。在引入外源DNA后，可以允许细胞在富集培养基中生长1-2天，并且然后转换至选择性培养基。在重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性，并且允许将质粒稳定整合进其染色体中的细胞生长并且形成病灶，进而可以将其克隆并且扩充成细胞系。编码融合分子的质粒可以用于将基因/cDNA引入适用于培养产生的任何细胞系中。

可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒的胸苷激酶(威格勒(Wigler)等人，《细胞》(Cell)，11：223(1977))、次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(Szybalska&Szybalski，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，48：202(1992))、以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(洛伊(Lowy)等人，《细胞》，22：8-17(1980))基因，可以分别用在tk-、hgprt-或aprT-细胞中。另外，抗代谢物抗性可以用作选择以下基因的基础：dhfr，其赋予甲氨蝶呤抗性(威格勒(Wigler)等人，《美国国家科学院院刊》(Natl.Acad.Sci.USA)，77：357(1980)；奥黑尔(O′Hare)等人，《美国国家科学院院刊》，78：1527(1981))；gpt，其赋予麦考酚酸抗性(马利根(Mulligan)&贝格(Berg)，《美国国家科学院院刊》，78：2072(1981))；neo，其赋予氨基糖甙G-418抗性(Wu和Wu，《生物疗法》(Biotherapy)3：87-95(1991)；Tolstoshev，《药理学和毒理学年鉴》(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.)32：573-596(1993)；马利根(Mulligan)，《科学》(Science)260：926-932(1993)；以及摩根(Morgan)和安德森(Anderson)，《生物化学年鉴》(Ann.Rev.Biochem.)62：191-217(1993)；梅(May)，TIB TECH11(5)：155-2 15(1993))；以及hygro，其赋予潮霉素抗性(桑泰尔(Santerre)等人，《基因》，30：147(1984))。关于重组DNA技术的本领域中普遍已知的方法可以按常规应用以便选择所希望的重组克隆，并且此类方法例如描述于：奥苏伯尔(Ausubel)等人(编)，《分子生物学实验室指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，约翰·威利父子出版公司(JohnWiley&Sons)，纽约(NY)(1993)；Kriegler，《基因转移和表达》(Gene Transfer andExpression)，实验室手册(A Laboratory Manual)，斯托克顿出版社(Stockton Press)，纽约(NY)(1990)；以及第12和13章，德拉科波利(Dracopoli)等人(编)，《人类遗传学实验室指南》(Current Protocols in Human Genetics)，约翰·威利父子出版公司，纽约(1994)；Colberre-Garapin等人，1981，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，150∶1。

一旦融合分子已经通过重组来产生，就可以通过本领域中已知的用于纯化的任何方法将其纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和力(特别是通过对于特定抗原蛋白A或蛋白G的亲和力)，以及尺寸分级柱色谱)、离心、差别溶解度，或者通过用于蛋白质的纯化的任何其他标准技术。

进一步提供了组合物，例如，含有有效量的如在此提供的双重活性融合分子的药用组合物，其被配制为用于治疗代谢性疾病，例如，2型糖尿病。

可以根据已知的方法配制本披露的组合物。适合的制备方法描述于，例如，雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第19版，A.R.真纳罗(Gennaro)编著，马克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿(Easton)，PA(1995)，将其通过引用以其全文结合在此。组合物可以处于多种形式，包括但不限于，水溶液、乳剂、凝胶剂、混悬剂、冻干形式、或本领域已知的任何其他形式。另外，该组合物可含有药学上可接受的添加剂，包括例如，稀释剂、粘合剂、稳定剂、和防腐剂。一旦配制，本披露的组合物即可以直接给予受试者。

可以与本披露的组合物一起使用的载体是本领域熟知的，并且包括但不限于，例如甲状腺球蛋白、白蛋白(如人血清白蛋白)、破伤风类毒素、和聚氨基酸(如聚L-赖氨酸、聚L-谷氨酸)、流感病毒和乙肝病毒核心蛋白，等等。可以使用许多种水性载体，例如，水、缓冲水、0.8％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等等。可以通过常规的、熟知的灭菌技术将组合物灭菌，或者可以将其过滤灭菌。可将得到的组合物包装为原样使用、或冻干，该冻干制剂在给药之前与无菌溶液组合。根据需要，组合物可以含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如PH调节和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。

IV.抗PCSK9～GLP-1融合分子的使用方法和试剂盒

抗PCSK9～GLP-1融合体可以用于治疗糖尿病或2型糖尿病。在一个实施例中，患者具有2型糖尿病。在一个实施例中，患者具有高心血管疾病风险分布图。在另一个实施例中，患者具有2型糖尿病和高心血管疾病风险分布图二者。高心血管疾病风险分布图意指患者由于一种或多种因素而处于心血管事件的较高风险之下：高胆固醇、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高血压、动脉粥样硬化、肥胖症、过去的心血管事件(包括心绞痛、心脏病发作、暂时性缺血、中风等)、心血管事件家族史、抽烟、高三酸甘油酯、缺乏身体活动、血糖不良控制等等。

在其他实施例中，抗PCSK9～GLP-1融合体可以用于治疗其他疾病，包括但不限于NASH、肥胖症、高胆固醇血症，以及主要心血管不良事件(MACE)，包括但不限于急性冠脉综合征(ACS)、中风、心力衰竭、以及恶性节律异常。

在一个实施例中，融合分子在给药时具有增加的稳定性。在一个实施例中，该增加的稳定性是通过在体内给予大鼠时将其与一种基准对照化合物度拉糖肽(与Fc片段融合的一种GLP-1类似物)相比较而证实的。

在一个实施例中，融合分子对GLP-1受体具有增加的效力。在一个实施例中，该增加的效力是针对人GLP-1受体超过基准对照化合物度拉糖肽和/或野生型GLP-1而证实的。

在一些实施例中，融合分子促进受试者的体重减轻。

在一个实施例中，融合分子通过注射来给药。

在其他实施例中，本披露提供了包含双重活性融合分子的试剂盒，这些试剂盒可用于进行在此所述的方法。在某些方面中，试剂盒包含处于一个或多个容器中的在此披露的双重活性融合分子。如在此提供的试剂盒可以包含用于联合治疗的另外组合物。本领域的技术人员将易于认识到，这些披露的双重活性融合分子可以易于与本领域中熟知的已建立的试剂盒形式之一相结合。

现在将详细参考当前的示例性实施例，其实例在附图中展示。在一切可能之处，将贯穿整个附图使用相同的参考数字来指代相同或类似部件。在考虑了在此披露的说明书和实践之后，本领域技术人员将了解其他实施例。这些实施例在以下实例中进行进一步阐述。这些实例不限制权利要求书的范围，而是仅用于阐明某些实施例。说明书和实例旨在被视为仅是示例性的，真实范围和精神由以下权利要求书指出。

实例

实例1.抗体优化

对抗PCSK9抗体PC9#2(分别用于可变重链和轻链的SEQ ID NO.8和9)进行了优化，以便：

1_通过将氨基酸复原成对应于最接近的人种系序列的氨基酸来降低免疫原性风险，而不显著影响与PCSK9抗原的结合。

2_通过使组氨酸残基VH_52、VL_30和VL_50(Kabat编码)突变来去除与PCSK9的pH依赖性结合。

3_改善生理pH下对人PCSK9的亲和力，以便在给予PCSK9/GLP-1肽抗体融合分子之后，有效地与靶标接合并且实现足够的游离PCSK9抑制作用。

A)种系化

将抗PCSK9抗体PC9#2的VH和VL结构域的氨基酸序列与VBASE数据库(Tomlinson，1997；http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)中的已知人种系序列进行比对，并且通过序列相似性将最接近的人种系鉴定为分别用于可变重链和轻链的1-46(DP-7)(SEQ ID 417)和VK1 O18 O8(DPK1)(SEQ ID 418)。图1E和1F示出了PC9#2可变结构域与那些种系序列的比对。

产生了抗PCSK9PC9#2抗体与人PCSK9抗原复合的一种结构模型，其中使用PC9#2可变结构域的初级氨基酸序列，以及先前描述的人PCSK9与另一种抗PCSK9抗体复合的晶体结构，以PBD ID code 3SQO寄存在蛋白质数据厍中(Liang等人，2012，《药理学与实验治疗学杂志》(J.Pharm.Exp.Ther.)，第340卷，第228-236页)。

使用该结构模型，将以下残基鉴定为与PCSK9抗原非接触的，但是为暴露于溶剂的：可变重链中的Arg56、Asn58、Glu61、Lys64和Ser65以及可变轻链中的Arg24(Kabat编号)。因为那些残基不同于最接近的种系序列并且可能是暴露于溶剂的，它们可能呈现一些免疫原性风险。不受理论约束，使那些残基突变应当不会显著影响抗体强烈结合PCSK9的能力，因为它们应当不会对抗体与其抗原之间的相互作用网络有贡献。

然后使用标准分子生物学技术将突变R56S、N58S、E61Q、K64Q和S65G引入PC9#2重链序列中以及将K24Q引入轻链中，以便产生分别用于可变重链和轻链的SEQ ID 5和6的抗体PC9#2_FG。

如实例2中所述产生抗PCSK9 PC9#2和PC9#2_FG作为人IgG1-TM抗体并且使用实例17中所述的Biacore针对与人PCSK9的结合对这些抗体进行表征。那些化合物在pH 7.4下的动力学参数汇总于表2中。两种抗体表现出相似的缔合速率(on-rate)、解离速率(off-rate)和对人PCSK9的亲和力，证实了种系诱变不影响抗原结合。

表2：PC9#2抗体的种系化和非种系化型式在生理pH下对人PCSK9的动力学参数

化合物	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				PC9#2	2.70E+05	5.10E-04	1.89E-09
PC9#2_FG	3.03E+05	5.40E-04	1.78E-09

B)去除pH依赖性结合并且改善对人PCSK9的亲和力

抗PCSK9抗体PC9#2和PC9#2_FG表现出pH依赖性结合特性，因为它们在生理pH下强烈结合至人PCSK9抗原，但在酸性pH下快速与其靶标解离。该特征应当使抗体能够在内含体的酸性隔区中与PCSK9解离以便在细胞表面再循环，而非被送往溶酶体进行降解。这应当最终转化成更长的抗体体内半衰期。

表3比较了通过如实例17中所述并进行以下修改的Biacore所确定的这两种化合物与人PCSK9在pH7.4(生理)下的解离速率(kd)。在抗体捕获到CM5芯片上后，注射在pH7.4运行缓冲液(10mM磷酸钠pH 7.4，150mM氯化钠，1mg/mL BSA，0.05％Tween20)中稀释至处于从1nM至200nM范围内的浓度的人PCSK9抗原10分钟。在缔合期后，注射pH7.4或pH6.0的运行缓冲液进行10分钟的解离期。使用1∶1结合动力学模型计算总体解离速率。

表3：PC9#2抗体的种系化和非种系化型式在生理和酸性pH下的解离常数(kd)。

长的抗体体内半衰期不是PCSK9/GLP-1融合分子所希望的，因为可能导致药物代谢物的积累，这些药物代谢物能够结合PCSK9，但在GLP-1类似物肽中降解，并因此不能够活化GLP-1受体。

此外，如实例5表11中所示，与PC9#2抗体(7nM)相比，GLP-1类似物肽在抗PCSK9PC9#2的轻链前面的基因融合稍微地影响化合物对人PCSK9的亲和力(19nM)。然后为了平衡GLP-1类似物轻链对于对人PCSK9抗原的亲和力的负面影响，要求PC9#2_FG的亲和力成熟。

为了去除pH依赖性结合，重链的位置52中的以及轻链的位置30和50中的组氨酸残基需要进行突变。基于上述结构模型和PC9#2与人PCSK9复合的随后分析，以下突变被鉴定为对与PCSK9的抗体结合是潜在有益的，并且可能导致亲和力改善：重链H52K或H52S，轻链H30Y、H30K或H30S、以及轻链H50Y或H50S。

使用标准分子生物学技术产生PC9#2_FG的序列中所有那些突变的组合，以便产生优化抗体。表4汇总了由组合实验得到的不同化合物。

表4.用于产生优化抗体的PC9#2_FG突变

PC9#2_FG轻链中H30S和H50Y突变的组合未能递送并且化合物#5和#11随后未被产生。

如实例2中所述产生抗体作为人IgG1-TM并且使用如实例3中所述的表位竞争测定来测试其阻断PC9#2结合至人PCSK9的能力。数据汇总于表5中并且显示与亲本抗体PC9#2_FG相比，HS7、HS9和HS10具有至少10倍减少的IC50，表明了那些抗体可能具有比PC9#2_FG显著更好的对PCSK9的亲和力。

表5.使用抗PCSK9抗体作为竞争试剂对PC9#2结合人PCSK9的抑制。

抗体HS9被进一步表征并且通过如实例17中所述的Biacore，与亲本抗体PC9#2_FG比较其在生理pH下与人PCSK9的结合参数。如表6中所示，工程化的抗PCSK9抗体HS9与PC9#2_FG相比，在生理pH下显示出对人PCSK9的亲和力的3倍改善，这主要是由于解离速率(kd)降低。

表6.工程化抗体HS9与PC9#2_FG相比在生理pH下对人PCSK9的动力学参数

在一个单独的实验中，使用如上所述的Biacore将HS9抗PCSK9抗体的pH依赖性结合与PC9#2_FG的pH依赖性结合进行比较。表7示出这两种化合物在生理和酸性pH下的解离常数(kd)。与在pH6.0下比在pH7.4下更快速解离的PC9#2_FG相反，HS9显示出在酸性pH下比在生理pH下更低的kd，证实了它在pH6.0下比在pH7.4下更缓慢地与PCSK9解离。

表7.工程化抗体HS9与PC9#2_FG相比在生理和酸性pH下的解离常数(kd)。

实例2.双重作用融合分子的制备

根据图1A中所示的大比例尺结构制备双重作用融合分子：GLP-1部分-接头-抗体轻链。SEQ ID NO：3用作GLP-1部分，SEQ ID NO：4用作接头，并且SEQ ID NO：1和2分别用作重链和轻链。

在此实施例中，GLP-1类似物肽的N端末端是游离的，以便最有效地接合和活化GLP-1受体；将肽融合至抗体可变结构域的N端。在许多构建体中将接头序列用在肽的末端与可变结构域的起点之间，以便最小化该融合对肽和/或抗体活性的影响。将肽融合在抗体的重链或轻链处，以便获得每个融合分子的两种肽部分。此类融合体的大比例尺结构在图1B(重链融合)和图1C(轻链融合)中示出。在一些实施例中，可以将肽融合在重链和轻链二者处以便显示每个融合分子的四种肽部分(图ID中预言性地示出)。

通过使用标准方法的重叠PCR来构建编码与抗体可变结构域融合的GLP-1类似物肽的基因。将独特的限制位点结合在DNA片段的5’末端和3’末端处，以便能够在表达载体中进行克隆。

将有或没有肽/接头融合的VH结构域克隆进含有人重链恒定结构域和调控元件的载体中，以便在哺乳动物细胞中表达完整的IgG1三突变(IgG1-TM)重链。IgG1-TM形式类似于人IgG1，但Fc序列结合有突变L234F、L235E和P331S以便降低其触发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性的能力(Oganesyan V.等人，2008，《晶体学报》(ActaCryst.)，D64：700-704)。将有或没有肽/接头融合的VL结构域克隆进用于表达人轻链恒定结构域和调控元件的载体中，以便在哺乳动物细胞中表达完整的IgG轻链。在重链和轻链表达载体中包括了OriP片段，以便促进在CHO细胞中使用并且允许游离型复制。

为了获得IgG和肽抗体融合体，将表达重链和轻链的载体瞬时转染到30mL(小规模)或400mL(中等规模)的CHO哺乳动物细胞中。表8汇总了可以在有或没有肽/接头融合的情况下通过表达重链和轻链的载体的共转染获得的不同产物。

化合物被表达并分泌到培养基中。使用蛋白A色谱法进行化合物纯化之前，将收获物汇集并过滤。将培养物上清液加载到适当尺寸的MabSelectSure(通用医疗集团(GEHealthcare Life Sciences))的柱上并且用1×DPBS(Gibco)洗涤。将结合化合物使用0.1M柠檬酸钠pH 3.0从柱上洗脱并且通过添加Tris-HC1 pH 9.0进行中和。对于小规模转染，使用PD10柱(通用医疗集团)将洗脱的材料缓冲液交换到1×DPBS中。对于中度规模转染，通过尺寸排阻色谱法(SEC)进一步纯化洗脱的材料，其中对于多达5ml的样品体积使用HiLoad16/600Superdex 200制备级柱(通用医疗集团)，而对于多达12ml的样品体积使用HiLoad26/600 Superdex 200柱(通用医疗集团)。使用1xDPBS作为运行缓冲液进行等度洗脱。

根据Mach，H.等人，天然蛋白中色氨酸和酪氨酸的消光系数平均值的统计学测定(Statistical determination of the average values of the extinctioncoefficients of tryptophan and tyrosine in native proteins)，《分析生物化学》(Anal Biochem)，200(1)：74-80(1992)中的方案，基于氨基酸序列，使用消光系数用光谱学方法测定化合物浓度。使用SEC-HPLC和SDS-PAGE对纯化的化合物进行聚集和降解的分析。通过使用1mL/min的流速和0.1M无水磷酸氢二钠加上0.1M硫酸钠(pH 6.8)作为运行缓冲液，将70μL的样品加载到TSKgel G3000SWXL 7.8mm x 300mm柱(日本东曹株式会社生命科学事业部(Tosoh Bioscience))上来进行SEC-HPLC。通过使用1x NuMES SDS运行缓冲液(英杰公司(Invitrogen))，将2μg蛋白质加载到Nu4％-12％Bis-Tris(英杰公司)上来运行SDS-PAGE。来自中度规模转染的化合物进一步通过电喷射离子化质谱法(ESI-MS)对完整性进行表征，并且使用鲎变形细胞裂解物(Limulus Amebocyte Lysate)(LAL)Kinetic-QCL(Lonza)测试内毒素水平。对于ESI-MS分析，在10mM Tris-HCl pH8.0中制备1mg/mL的样品。分析之前，使用10mM DTT在37℃下进行30分钟还原。使用采用MassLynx软件操作的与Waters SYNAPT G1 QTOF质谱仪结合的Waters ACQUITYI-Class系统获取数据。所使用的流动相是高纯水加上0.01％三氟乙酸(TFA)、0.1％甲酸(A)和乙腈+0.01％TFA、0.1％FA(B)。重链与轻链之间的分离使用在60℃下加热的 WatersBEH300 C4柱实现。流速设定为总运行时间为22分钟。将样品(10pmol)注入到柱上，并且使用以下电喷射源参数在正离子模式下获取MS数据：毛细管电压：3.4kV，81℃源温度81℃，去溶剂化温度：24℃。在500与4500Da之间获取数据。

实例3.与抗PCSK9抗体基因融合的GLP-1类似物的体外表征

为了评价通过GLP-1受体激动剂肽与抗PCSK9抗体之间的基因融合来产生双重活性分子的可行性，使用SEQ ID NO：4的接头将SEQ ID NO：28的GLP-1类似物肽融合至先前鉴定的七种不同抗PCSK9抗体的重链或轻链可变结构域。

1_PC9#1与SEQ ID NO：10的抗体可变重链和SEQ ID NO：11的抗体可变轻链。

2_PC9#2与SEQ ID NO：8的抗体可变重链和SEQ ID NO：9的抗体可变轻链。

3_PC9#3与SEQ ID NO：404的抗体可变重链和SEQ ID NO：405的抗体可变轻链。

4_PC9#4与SEQ ID NO：406的抗体可变重链和SEQ ID NO：407的抗体可变轻链。

5_PC9#5与SEQ ID NO：408的抗体可变重链和SEQ ID NO：409的抗体可变轻链。

6_PC9#6与SEQ ID NO：410的抗体可变重链和SEQ ID NO：411的抗体可变轻链。

7_PC9#7与SEQ ID NO：412的抗体可变重链和SEQ ID NO：413的抗体可变轻链。

使用均相时间分辨荧光(HTRF)表位竞争测定评估每个肽-抗体融合体的PCSK9活性。在这些测定中，在链霉亲和素穴状化合物、生物素酰化的PCSK9与荧光(DyLight 650)标记的抗PCSK9抗体之间形成荧光共振能量转移(FRET)复合物。与荧光标记抗体结合相同或重叠的PCSK9表位的未标记肽-抗体融合体将竞争，从而导致FRET信号降低。

根据厂商说明书使用DyLight-650(Thermo Scientific 84536)来对抗PCSK9抗体进行加标记。对于该测定，在含有1X磷酸盐缓冲生理盐水、0.1％BSA(Sigma A9576)以及0.4M氟化钾的测定缓冲液中制备所有样品和试剂。在384孔的聚丙烯板中通过3倍连续稀释制备肽-抗体融合体或对照抗体的待测样品。将样品(5μl)或测定缓冲液(总结合对照孔)转移到384孔的测定板(Costar 3676)并且在室温下以20μl总测定体积用1nM链霉亲和素穴状化合物(Cisbio 61SAXLB)、0.05-0.5nM生物素酰化的PCSK9以及0.1-2nM Dy650标记的抗PCSK9抗体孵育4小时。设置非特异性结合(NSB)对照孔，其中省去生物素酰化的PCSK9。使用Perkin Elmer Envision在320nm处的激发之后测量665nm和620nm处的时间分辨荧光发射。计算665nm计数/620nm计数的比率并且乘以10000以得到HTRF计数。然后使用以下方程计算ΔF％。

根据以下方程将结果表示为％特异性结合：

图2A-G和图3A-G示出分别使用未标记的重链或轻链肽抗体融合体的滴定对人PCSK9结合至抗PCSK9抗体的抑制。单独的同种型匹配的不相关抗体NIP228IgG1-TM(对照#1)或使用SEQ ID NO：4的接头将SEQ ID NO：28的GLP-1类似物肽与重链(对照#2)或轻链(对照#3)的融合体用作阴性对照。

使用cAMP产生测定评估每个肽抗体融合体对人GLP-1受体的效力。通过标准方法在CHO细胞中产生表达人GLP-1受体的稳定细胞系。所测试化合物对GLP-1受体的活化将导致下游的cAMP第二信使的产生，其可以在功能活性测定中测得。使用低蛋白质结合384孔板(格瑞纳公司(Greiner))进行待测化合物的十一次1/4连续稀释，这些连续稀释是在测定培养基(处于含有0.5mM IBMX(西格玛公司(Sigma))的Hanks平衡盐溶液(GIBCO或西格玛公司)中的0.1％牛血清白蛋白)中进行的。所有样品稀释度均制作一式两份。将表达人GLP-1受体的细胞的冻结的冷冻小瓶在水浴中迅速解冻，转移到预加温的测定培养基中并且在240xg旋转离心5分钟。然后将细胞以1x10⁵个细胞/mL的优化浓度重悬在测定缓冲液中并且以每孔5uL分配至黑色浅孔u形底的384孔板(康宁公司(Corning))。将5μL待测化合物从稀释板转移至细胞板并且在室温下孵育30分钟。根据厂商推荐按照两步式方案使用cAMP动态2HTRF试剂盒(Cisbio)测量cAMP水平。简要地说，通过将抗cAMP穴状化合物(供体荧光团)和cAMP-d2(受体荧光团)各1/20稀释于提供在该试剂盒中的偶联与裂解缓冲液中而单独地将它们制成。将5uL抗cAMP穴状化合物添加到测定板的所有孔中，并且将5uLcAMP-d2添加到除了非特异性结合孔之外的所有孔中，非特异性结合孔中仅添加偶联与裂解缓冲液。将这些板在室温下孵育一个小时，然后在Envision读取器(珀金埃尔默(Perkin Elmer))上使用320nm的激发波长和620nm和665nm的发射波长进行读数。如厂商指南中所述将数据转化成％ΔF，并且通过对数据、曲线中点的无约束的4-参数逻辑拟合进行分析以确定EC₅₀值。

重链(A)或轻链(B)肽抗体融合体对人GLP-1受体的活化分别在图4A-B中示出。游离人GLP-1肽(Bachem)和没有肽的同种型匹配的不相关NIP228人IgG1-TM分别用作阳性对照和阴性对照。

总的说来，所有测试的融合体都能够与抗PCSK9抗体竞争结合至人PCSK9并且活化人GLP-1受体。GLP-1类似物肽与不同抗PCSK9抗体之间的那些融合分子显示出双重活性并且能够用于提供组合的药理学特性。

实例4.现有GLP-1类似物在抗体融合时的体内稳定性

在没有靶标介导的清除时，人IgG在男性中具有大约21天的长循环半衰期。这特别地归因于FcRn受体对内化抗体的挽救。在被细胞非特异性摄取之后，抗体能够在内含体的酸性环境中结合至FcRn并且被引导至细胞表面且返回到循环中，而非去往溶酶体进行降解。

为了实现最大功效，与抗PCSK9抗体分子融合的GLP-1类似物肽对于分别由肽和抗体部分介导的GLP-1受体活化和PCSK9抑制，应当显示出足够的体内活性半衰期。例如，如果在注射后肽快速失活，则大部分产物仅将对PCSK9抑制起作用，并且随时间推移将不会适当地与GLP-1受体接合以便在给药周期内提供有效的葡萄糖控制。

为了评估现有GLP-1类似物肽在与抗体融合时的体内稳定性，产生以下融合体：

1：使用SEQ ID NO：4的接头将SEQ ID NO：28的GLP-1类似物肽融合至SEQ ID NO：414和415的不相关NIP228人IgG1-TM抗体的重链(化合物NIP228_GLP-1_VH)。

2：使用SEQ ID NO：4的接头将SEQ ID NO：12的Exendin-4肽(来源于毒蜥唾液的一种GLP-1类似物)融合至SEQ ID NO 9的抗PCSK9抗体PC9#2的轻链(化合物PC9#2_Exe4_VL)。

3：使用SEQ ID NO：4的接头将SEQ ID NO：28的GLP-1类似物肽融合至SEQ ID NO：416的人IgG4Fc片段(化合物GLP-1-Fc)。

4：使用SEQ ID NO：4的接头将SEQ ID NO：28的GLP-1类似物肽融合至SEＱ ID NO9的抗PCSK9抗体PC9#2的轻链(化合物PC9#2_GLP-1_VL)。

所有化合物在体外对人GLP-1受体是活性的并且在实例3所述的cAMP测定中显示出NIP228_GLP-1_VH、PC9#2_Exe4_VL、GLP-1-Fc和PC9#2_GLP-1_VL分别为2.08E-10M、1.12E-10M、1.12E-10M和1.03E-10M的EC₅₀。

将化合物NIP228_GLP-1_VH和PC9#2_Exe4_VL静脉注射到大鼠中并且在注射后的若干时间点收集血清或血浆样品。对于每个样品，测定血清或血浆中的化合物浓度(暴露)以及对于GLP-1活性的活性化合物的浓度。总化合物(暴露)和对GLP-1受体的活性化合物随时间推移的衰退之间的比较提供了对与抗体融合的GLP-1类似物肽的体内稳定性的评估。

使用Gyrolab平台(Gyros AB)，通过一般的夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)方法定量大鼠血浆或血清中总的人IgG1抗体的水平。通过100ug/mL的一种生物素酰化的单克隆抗人IgG1抗体(对于血浆样品为来自Southern Biotech的克隆JDC-10，或对于血清样品为内部的克隆TM446)捕获人IgG1，并且在Gyrolab Bioaffy 200 CD上，通过25nM(对于血浆样品为BD Pharmingen的克隆G18-145)或10nM(对于血清样品为Binding Site的AU003CUS01)的Alexa标记的单克隆抗人IgG1抗体进行检测。根据Gyrolab方法将标准物、对照物、血浆或血清样品、洗涤液、捕获和检测抗体添加到0.2mL 96孔PCR板(Thermo Scientific)并且加载到带有CD200板的机器上。所有样品均按一式两份进行分析。将每个人IgG标准物的平均应答对浓度绘图并且采用Gyrolab Evaluator软件，使用5参数权重逻辑斯谛模型对这些点进行弥合。

使用离体cAMP细胞基测定评估大鼠样品中对人GLP-1受体的活性肽-抗体融合体的浓度。将参考化合物以一种已知的浓度掺入初试大鼠血清或血浆中以便用作标准物。所有样品在测定培养基中连续稀释，并且对于血清样品如实例3所述使用cAMP动态2HTRF试剂盒(Cisbio)或者对血浆样品使用Ultra cAMP检测试剂盒(珀金埃尔默)进行检测。

待测样品使用相同的最高浓度绘图以作为相当的参考物。然后可以将所获得的EC₅₀值用于计算样品比率(样品EC₅₀/EC₅₀参考化合物)，接着计算估计的活性GLP-1化合物的浓度(已知的掺入大鼠血浆或血清中的参考化合物的最高浓度/样品比率)。单独的大鼠血清或血浆对穴状化合物供体信号具有猝灭效应并且得出可以被稀释的对cAMP的浓度依赖性活化。因此任何的测试化合物都必须具有高于大鼠血清或血浆基线(被称为检测极限)的cAMP活性，以便在活性测定中具有可观察的效应。

在三只威斯达(Wistar)大鼠(查尔斯河实验室(Charles River))中注射2mg/kg的化合物NIP228_GLP-1_VH，并且在注射后2分钟、1h、24h、48h、120h、168h和216h，在含有dPP4抑制剂的EDTA管中收集每只动物的血液样品。大鼠血浆中总化合物和活性GLP-1化合物随时间推移的浓度在图5A和图9中示出。在48h后收集的样品中的活性化合物的浓度未能进行测定，因为它们低于测定的定量下限。

在三只CD大鼠(查尔斯河实验室)中注射1mg/kg的化合物PC9#2_Exe4_VL，并且在注射后30分钟、6h、24h、48h、96h、240h和336h，在含有dPP4抑制剂的普通的管中收集血液样品。通过使管子留在工作台上30分钟并接着在13000rpm离心2分钟来制备血清样品。大鼠血清中暴露和活性GLP-1化合物随时间推移的浓度在图5B中示出。在48h后收集的样品中的活性化合物的浓度未能准确地测定，因为它们低于测定的定量下限。

对于暴露和对GLP-1受体的活性化合物，NIP228_GLP-1_VH和PC9#2_Exe4_VL在大鼠中的体内半衰期在表9中呈现。

对于NIP228_GLP-1_VH和PC9#2_Exe4_VL化合物二者，对GLP-1受体的活性比化合物本身损失得快得多，证实了体内肽不稳定性。

将化合物GLP-1-Fc和PC9#2_GLP-1_VL静脉注射到健康的C57/B6小鼠(7-8周龄，雌性，查尔斯河实验室)中并且在若干时间点收集血浆样品。如上文所述针对每个样品测定血浆中的化合物浓度(暴露)和对GLP-1活性的活性化合物的浓度。

注射1mg/kg的GLP-1-Fc。在以下时间点中的每个时间点处死成组的三只小鼠：注射前、注射后2分钟、1h、6h、24h、48h、72h和96h。在含有dPP4抑制剂的EDTA管中收集每只动物的血液。然后在4℃下以14000rpm离心血浆样品5min并且储存于-80℃等待分析。

注射5mg/kg的PC9#2_GLP-1_VL，并且在以下时间点中的每个时间点处死小鼠：注射前、注射后5分钟、6.5h、24h、72h和168h。如上所述处理样品。

对于GLP-1-Fc而言在小鼠血浆中的暴露和活性GLP-1化合物随时间推移的浓度在图5C和图14A中示出，并且PC9#2_GLP-1_VL分别在图5D和图10中示出。

对于暴露和活性GLP-1，GLP-1-Fc和PC9#2_GLP-1_VL在小鼠中的体内半衰期在表10中呈现。

如大鼠中对于NIP228_GLP-1_VH和PC9#2_Exe4_VL所观察到的，小鼠中GLP-1-Fc和PC9#2_GLP-1_VL注射后对GLP-1受体的活性比化合物本身损失得要快，证实了体内肽不稳定性。

关于SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：12的两种GLP-1类似物的快速失活将影响PCSK9/GLP-1融合分子的有效葡萄糖控制，并且需要工程化具有更佳体内稳定性的GLP-1类似物肽。

实例5.对huPCSK9的亲和力

将PCSK9抗体用作基准对照。数据呈现于表11中，并且用作基准对照的PC9#2_GLP1分子和抗PC9#2抗体的视觉表示在图8中示出。图6提供指导PCSK9亲和力和GLP-1效力的潜在靶标分布图的可视化。

在25℃下，使用Biacore 2000生物传感器(通用医疗集团)，通过表面等离子体共振(SPR)来测定关于PCSK9结合的缔合(ka或kon)、解离(kd或koff)和平衡解离常数(KD)。

首先在CM5传感器芯片(通用医疗集团)上建立蛋白G表面。然后在注射不同浓度的人、食蟹猴或大鼠PCSK9之前，将人类抗体捕获在芯片表面上。使用1∶1结合动力学模型，首先计算总体解离速率，接着计算总体缔合速率。

这证实了该融合体仅稍微地影响PCSK9结合。

另外，如实例17中所述在Biacore测定中测试双重作用融合分子HS9_DSB7，以便测定其对于人PCSK9的亲和力。将单独的PCSK9抗体(重链和轻链分别为SEQ ID 1和2的PC9_2_FG_HS#9)用作基准对照。表12提供数据。该数据证实了在不同物种(人(Hu)、食蟹猴(Cy)和大鼠)中，该融合体仅稍微地影响PCSK9结合。

实例6.在cAMP细胞基测定中的GLP-1效力

如实例3中所述在cAMP细胞基测定中测试PC9#2_GLP-1，以便测定其效力。将单独的GLP1肽用作对照物，并且将GLP-IFc用作基准。数据呈现于表13中，并且用作基准对照的PC9#2_GLP1分子和GLP-1 Fc的视觉表示在图8中示出。

该数据证实了与基准分子GLP-1-Fc相比，在GLP-1类似物肽融合至抗PCSK9抗体PC9#2的轻链后，GLP-1效力没有显著损失。

实例7.度拉糖肽：一种基准分子

图14A提供了GLP-1-Fc基准在大鼠中的稳定性。基准分子是GLP-1部分与抗体Fc部分的融合体，如图14A所示。

将化合物GLP-1-Fc静脉注射到健康的C57/B6小鼠(7-8周龄，雌性，查尔斯河实验室)中并且在若干时间点收集血浆样品。如实例4所述针对每个样品测定血浆中的化合物浓度(暴露)和对GLP-1活性的活性化合物的浓度。

注射1mg/kg的GLP-1-Fc。在以下时间点中的每个时间点处死成组的三只小鼠：注射前、注射后2分钟、1h、6h、24h、48h、72h和96h。在含有dPP4抑制剂的EDTA管中收集每只动物的血液。然后在4℃下以14000rpm离心血浆样品5min并且储存于-80℃等待分析。

GLP-1活性比化合物损失的速率更快，证实了肽不稳定性。带有正方形的线对应于GLP-1-Fc的血清浓度而带有圆圈的线对应于针对相同样品的GLP-1-Fc的活性。参见图14A。

实例8.具有增强的体内稳定性分布图的融合分子

A)评价具有增强的体内稳定性分布图的与抗体融合的GLP-1类似物肽

为了改善抗体融合分子的体内肽稳定性，在肽周围工程化位阻以使其免于降解。这通过引入大体积的糖基序或者通过工程化分子间二硫桥键来完成。

已证实，添加N-糖基化共有基序能够增加体内稳定性和蛋白质的作用持续时间(艾略特·S(Elliott S)等人，《自然-生物技术》(Nat.Biotech.)，2003，21，414-421)。已经工程化与抗PCSK9抗体PC9#2的轻链(抗体轻链SEQ ID NO：9)融合的GLP-1类似物肽，这些GLP-1类似物肽在肽的C端或者在肽与抗体的接头中结合有一个额外的N-糖基化基序NxS或NxT，其中x可以是脯氨酸以外的任何氨基酸。那些化合物中的八种化合物的肽和接头氨基酸序列(N-糖基化位点称为NGS)在图7A中示出。用于产生糖基化基序的氨基酸变化以带下划线的粗体示出。

在那些八种化合物当中，仅PC9_2_GLP-1_NGS#7通过SDS-PAGE显示出高的糖基化产率。这通过与没有糖基化共有序列的对照化合物相比轻链分子量的增加，并且没有可见的对应于非糖基化轻链产物的较低分子量带来检测。通过ESI质谱法进一步确认PC9_2_GLP-1_NGS#7的糖基化。

还已经显示，引入二硫化物间键(inter-disulphide bond)可能是一种改善作为游离肽的GLP-1类似物的体内稳定性的成功的方法(Li Y.等人，《肽》(Peptides)，2011，21，1303-1312)。

将结合有两个半胱氨酸残基以形成二硫桥键以及(若适当时)甘氨酸C端帽以促进键合的Exendin-4肽变体融合至抗PCSK9抗体PC9#2的轻链(SEQ ID NO：9)。起初产生的三种化合物的肽氨基酸序列(二硫桥键称为DSB)在图7B中示出(作为SEQ ID NO：30-32)。半胱氨酸残基以黑色显示，其他突变残基显示为加下划线，并且位于C端帽处的另外的甘氨酸残基以灰色显示。

对于DSB#1变体，在9位工程化第一半胱氨酸代替天冬氨酸并且使用C端帽，结合第二半胱氨酸，具有序列GGGGGGGGGGGCGG(SEQ ID NO：401)。

对于DSB#2变体，在4位工程化第一半胱氨酸代替甘氨酸并且使用C端帽，结合第二半胱氨酸，具有序列GGGGGGGGGGGGCG(SEQ ID NO：402)。

对于DSB#3变体，在18位工程化第一半胱氨酸代替丙氨酸，但不使用C端帽。在Exendin-4序列的39位引入第二半胱氨酸代替丝氨酸。还将脯氨酸38改变成甘氨酸以在Exendin-4的色氨酸笼中产生更多柔性，以便促进二硫桥键的形成。

轻链融合的PC9_2_Exe4_DSB#2在哺乳动物细胞中未显著表达并且未进一步表征，但是获得了足量的PC9_2_Exe4_DSB#1和PC9_2_Exe4_DSB#3。融合体的完整性和身份在体内实验之前通过ESI质谱法确认。

在小鼠中，通过按照如实例4中所述的化合物暴露和活性GLP-1随时间推移的浓度，评估PC9_2_GLP-1_NGS#7、PC9_2_Exe4_DSB#1和PC9_2_Exe4_DSB#3的体内稳定性。

健康的C57/B6小鼠(7-8周龄，雌性，查尔斯河实验室)接受一个单次静脉内(IV)剂量的40mg/kg的PC9_2_GLP-1_NGS#7、10.8mg/kg的PC9_2_Exe4_DSB#1、或5mg/kg的PC9_2_Exe4_DSB#3。在以下时间点中的每个时间点处死成组的三只小鼠：注射前、注射后5分钟、6h、24h、72h和168h，并且在含有dPP4抑制剂的EDTA管中收集每只动物的血液。然后在4℃下以14000rpm离心血浆样品5min并且储存于-80℃等待分析。

所有三种化合物在体外对人GLP-1受体是活性的，但是在cAMP测定中显示了不同的EC₅₀：PC9_2_GLP-1_NGS#7、PC9_2_Exe4_DSB#1和PC9_2_Exe4_DSB#3分别为1.94^-8M、5.25^{- 9}M和3.25^-10M。尽可能多地基于效力调整剂量以在cAMP离体测定中产生高于定量下限的信号，以便计算活性GLP-1化合物经过相当一段时间的浓度。

对于PC9_2_GLP-1_NGS#7而言在小鼠血浆中的暴露和活性GLP-1化合物随时间推移的浓度在图12和图13A中示出，PC9_2_Exe4_DSB#1在图13B和图14B中示出，并且PC9_2_Exe4_DSB#3融合分子分别在图11和图13C中示出。

对于暴露和活性GLP-1，PC9_2_GLP-1_NGS#7、PC9_2_Exe4_DSB#1和PC9_2_Exe4_DSB#3的体内半衰期在表14中呈现。

与母体分子NIP228_GLP-1_VH和PC9#2_Exe4_VL(表9)相比，所有三种化合物都具有对GLP-1活性的改善的体内半衰期，PC9_2_GLP-1_NGS#7、PC9_2_Exe4_DSB#1和PC9_2_Exe4_DSB#3的半衰期分别为76h、约100h和36h。

十分有趣的是，PC9_2_Exe4_DSB#1看似在小鼠中长达7天是完全稳定的，与化合物暴露相比时未观察到GLP-1活性的损失(图13B)。

这些数据表明，在GLP-1类似物周围产生位阻能够增加与抗体融合的肽的体内活性半衰期。

B)评价具有增强的体内稳定性分布图的融合分子

按照实例4和8A中讨论的方案来向小鼠给予不同化合物并且绘制随时间推移的血浆中化合物的浓度。使用如实例3中所述的cAMP测定来确定对人GLP-1受体的化合物效力(EC50)。

通过体内PK/稳定性评估指导融合分子的优化。如图14A、图11和图12中所示，肽工程化产生了具有增强的体内稳定性分布图的融合分子。利用二硫桥键稳定化发现了益处，其中具有更长的活性保留和对GLP-1受体效力的最小影响。NGS#7也具有改善的稳定性分布图，但是与DSB#3(340pM)相比具有低的效力(19nM)。

图14A示出具有100pm的EC₅₀的一种GLP-1-Fc基准分子。

图11示出具有340pM的EC₅₀的一种二硫键桥接变体(PC9_2_DSB#3)(SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：8)。

图12示出具有19nM的EC₅₀的一种n-糖基化变体(PC9_2_NGS#7)(SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：8)。

那些化合物的体内半衰期呈现于表15中。

实例9.PCSK9/GLP-1融合体证实了理想的稳定性/活性分布图

在小鼠模型中评价双重作用融合分子的Fc-暴露和GLP-1活性。给药剂量为静脉内10.8mg/kg并且体内效力为5200pM。方案如实例8中所述。将数据与GLP-1 Fc基准分子比较，给药剂量为静脉内1mg/kg并且体内效力为100pM。此处使用如实例4中所述的相似方案。结果在图14A(度拉糖肽)和图14B(PCSK9/GLP-1融合体PC9_2_DSB#1)(SEQ ID NO：48和SEQ IDNO：8)中示出。在小鼠中长达7天没有GLP-1活性的丧失。

实例10.具有分子内二硫桥键的早期GLP-1类似物肽抗体融合体的产生和纯化

对于PC9_2_Exe4_DSB#1和PC9_2_Exe4_DSB#3而言来自中度规模批次的蛋白A纯化后的材料的质量是较差的，因为通过SEC-HPLC检测到许多聚集体。然后如实例2中所述，使用采用Superdex 200制备级柱的制备型尺寸排阻色谱法来进一步纯化这些化合物。

PC9_2_Exe4_DSB#1和PC9_2_Exe4_DSB#3的制备型SEC色谱图分别在图15A和图15B中示出。如早期保留时间处的另外的峰所示，一个显著比例(25％-40％)的材料发生聚集。收集含有单体化合物的级分，以便获得用于体内测试的材料。参见实例8和9。

通过在wave袋中的瞬时转染的48.2L CHO哺乳动物细胞(通用医疗集团)进一步评估PC9_2_Exe4_DSB#1产生的可扩缩性。通过使用蛋白A柱、接着进行使用混合模式树脂的两个另外的纯化步骤来纯化化合物。

在收获物中检测到高水平的聚集(＞25％)并且单体产物的有效纯化是特别有挑战性的。通过SEC-HPLC，需要三个色谱法步骤来产生95.9％纯度的产物。这对于纯化产率是非常不利的，总回收率为约3.4％。此外，收获物中的效价为104mg/L，这与使用相似表达系统的单克隆抗体相比而言是低的。与抗PCSK9抗体HS9的轻链(SEQ ID NO：2)融合的DSB#1二硫桥键GLP-1类似物的产生得出非常相似的结果。

实例11.聚集

双重作用融合分子(PCSK9/GLP-1融合体PC9_2_DSB#1)(SEQ ID NO：48)具有聚集的可能性并且在一些实施例中希望选择出单体。如实例2中所述的蛋白A纯化之后在分析性SEC-HPLC过程中检测到的聚集体在图16中示出。因此，在一些实施例中，可能希望进行另外的工程化以便改善单体分布图。

实例12.具有增强的单体分布图的与抗体融合的GLP-1类似物肽

产生与PC9#2的轻链(SEQ ID NO：9)融合的另外的Exendin-4二硫桥键肽(DSB)，以便改善肽抗体分子的产生过程中的单体分布图。工程化了半胱氨酸桥的不同位置，以及富甘氨酸C端帽的长度和Exendin-4肽的C端中的不同甘氨酸点突变，以便促进二硫键的形成并且最终降低产生过程中可能由于二硫键混杂而造成的聚集。肽工程化工作使用Exendin-4的3-D NMR结构进行指导(Neidigh，JW等人，《生物化学》(Biochemistry)，2001，40，13188-200)。

总共以小规模产生了十个DSB肽抗PCSK9融合体并且通过SEC-HPLC就改善的单体分布图进行了筛选。肽序列描述于图17中。PC9_2_Exe4_DSB#4未显著表达并且未进一步表征。

蛋白A纯化后通过分析性SEC-HPLC测定的九种融合体与PC9_2_Exe4_VL和PC9_2_Exe4_DSB#1相比的聚集体百分比描述于表16中。

在所测试的九种化合物当中有四种达到了低于10％的聚集体百分比：PC9_2_Exe4_DSB#7、PC9_2_Exe4_DSB#9、PC9_2_Exe4_DSB#10、和PC9_2_Exe4_DSB#11。PC9_2_Exe4_DSB#7具有5.1％的最低聚集体百分比，相比之下早期融合体PC9_2_Exe4_DSB#1为26.5％。没有二硫桥键的Exendin-4抗体融合体PC9_2_Exe4_VL显示出2.9％聚集体。

对PC9_2_Exe4_DSB#7和PC9_2_Exe4_DSB#9的产生扩大规模，以便供应足量的材料来执行体内稳定性实验。图18和图19示出分别在如实例2中所述的初始蛋白A纯化之后的PC9_2_Exe4_DSB#7和PC9_2_Exe4_DSB#9的制备型SEC色谱图。与PC9_2_Exe4_DSB#1和PC9_2_Exe4_DSB#3(图15A和图15B)不同，在纯化步骤过程中未检测到显著比例的聚集体。

为了验证具有改善的单体分布图的优化DSB肽抗体融合体确实与Exendin-4抗体融合体相比表现出优越的体内稳定性，将PC9_2_Exe4_DSB#7和PC9_2_Exe4_DSB#9静脉注射到三只CD大鼠中，每种化合物分别为10mg/kg和1mg/kg。在注射后30分钟、6h、24h、48h、96h、240h和336h收集每只动物的血清样品。如实例4所述随时间的推移测量化合物暴露和活性GLP-1的浓度。

在cAMP测定中两种化合物对人GLP-1受体都是活性的，PC9_2_Exe4_DSB#7的EC₅₀为9.45E-10M并且PC9_2_Exe4_DSB#9为1.24E-10M。PC9_2_Exe4_DSB#7的效力比PC9_2_Exe4_DSB#9低约八倍，因此注射十倍高的剂量以便在cAMP离体测定中经过相当一段时间产生高于定量下限的信号。

对于PC9_2_Exe4_DSB#7和PC9_2_Exe4_DSB#9融合分子而言在大鼠血清中的暴露和活性GLP-1化合物随时间推移的浓度分别在图20和图21中示出。将活性GLP-1的浓度根据第一时间点(30min)处的暴露归一化以便简化分析。

PC9_2_Exe4_DSB#7和PC9_2_Exe4_DSB#9对GLP-1活性分别具有44.2h和12.5h的半衰期，相比之下母体Exendin-4融合分子PC9_2_Exe4_VL的半衰期为5.7h(参见表9)。在96h后收集的PC9_2_Exe4_DSB#9样品中的活性化合物的浓度未能进行测定，因为它们低于测定的定量下限。

那些数据证实，PC9_2_Exe4_DSB#7和PC9_2_Exe4_DSB#9与母体融合分子相比，在与抗体融合时都具有GLP-1类似物肽的改善的体内活性半衰期。

如上所述，肽工程化能够控制聚集分布图。在肽中半胱氨酸桥的位置以及肽的组成和长度/GLP-1部分的C端中产生突变。

方案如上所述。

PCSK9/GLP-1融合体(PC9_2_DSB#7)(SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：8)在小规模批次中通过SEC-HLPC测定达到了＞90％的单体。在中度规模批次中仍检测到聚集，但是比PCSK9/GLP-1融合体PC9_2_DSB#1(SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：8)低得多。

结果呈现于图15A、18、23和表16中。

实例13.与抗PCSK9抗体融合的GLP-1类似物肽的药代动力学和药效动力学建模

为了指导PCSK9/GLP-1融合分子的设计，已经使用先前的关于在临床上测试的抗PCSK9抗体的PCSK9抑制与亲和力之间的关系的数据以及关于被批注的GLP-1受体激动剂分子利拉鲁肽和度拉糖肽的数据，开发了一种药代动力学(PK)-药效动力学(PD)模型。

对与抗PCSK9抗体融合的GLP-1类似物肽的效力进行扫描，以便鉴定将使用能够产生足够PCSK9抑制的剂量导致与市售药物相当的GLP-1活性的最佳范围。使用度拉糖肽的药代动力学、血浆蛋白结合以及受体亲和力特性进行模拟，以便获得该化合物随时间推移的效力归一化的GLP-1活性。对于PCSK9/GLP-1融合分子，假设PK特性为针对PCSK9的一种典型人类抗体的PK特性，并且从临床中的化合物推导出该信息。这些模拟指示，60mg皮下每周剂量的对人PCSK9具有3.9nM亲和力的PCSK9/GLP-1融合体应当在稳态时在给药周期内导致大于90％的PCSK9抑制(图22A)。

使用该给药方案，模拟指示，对人GLP-1受体的PCSK9/GLP-1融合分子的效力应当在3-5nM之内，以便实现与现有分子相比相似的GLP-1活性(图22B)。在那些模拟中度拉糖肽的效力被设定为80pM，表明PCSK9/GLP1融合分子的效力需要低于度拉糖肽约30至60倍，以便在有效地抑制PCSK9所需要的剂量下控制与GLP-1受体激动剂分子相关的恶心副作用。

实例14.对人GLP-1受体具有降低的效力的GLP-1类似物肽

用于降低GLP-1肽或GLP-1类似物的效力的方法在本领域是众所周知的，例如使肽中的关键残基发生突变或引入非天然氨基酸。用于GLP-1肽结合至受体的关键残基和活性特别地通过丙氨酸扫描来鉴定(Adelhorst，K.等人，《生物化学杂志》(J.Bio.Chem.)，1994，269，6276-6278)。

为了进一步证实降低对GLP-1受体的效力的可行性，合成了使用7-36GLP-1序列的在2或3位具有突变或非天然氨基酸的一组GLP-1类似物以作为游离肽，并且如实例3中所述在cAMP体内测定中测试对人GLP-1受体的活性。数据汇总于以下表17中。Aib表示2-氨基异丁酸，而Orn表示鸟氨酸。

那些数据证实，能够调节GLP-1类似物肽的EC₅₀来实现限定的效力降低。

实例15.对人GLP-1受体具有降低的效力的与抗体融合的GLP-1类似物肽为了降低与抗PCSK9抗体HS9的轻链(SEQ ID NO：2)融合的DSB#7GLP-1类似物肽(SEQ ID NO：13)的效力，使用标准分子生物学技术在肽中的G2、E15、V19、123或L26位引入点突变。总共产生了28个肽抗体融合分子的突变体，并且使用如实例3中所述的cAMP测定测试对人GLP-1受体的活性。化合物和活性数据的列表呈现于表18中。

二十八个构建体中的五个是无活性的。其他化合物显示出对人GLP1受体的非常多样的效力，其范围从HS9_DSB7_V19T的400pM至HS9_DSB7_L26Q的将近6uM。此外，一些化合物，如HS9_DSB7_G2Y或HS9_DSB7_L26Q为部分激动剂：它们与GLP-1肽相比在饱和剂量下未提供相同的活化水平。

基于实例13中的PKPD建模，双重活性抗PCSK9抗体GLP-1受体激动剂分子需要与GLP-1-Fc基准相比对人GLP-1受体具有约30至60倍的效力降低，以便在有效地抑制PCSK9抗原所需要的剂量下控制恶心。

四个肽抗体融合体(HS9_DSB7_G2V、HS9_DSB7_E15A、HS9_DSB7_V19A和HS9_DSB7_L26I)显示出在700pM与1.4nM之间的效力，其对应于与基准GLP1-Fc相比的25至50倍的损失。所有那些四种化合物都是对人GLP-1受体的完全激动剂，具有与GLP-1肽相比大于90％的最大活化百分比。

实例16.与抗PCSK9抗体融合的GLP-1类似物肽的表征

A)与抗PCSK9抗体融合的GLP-1类似物肽的可开发性评估

以大规模产生具有所希望的人GLP-1R效力的四种选择的肽抗体融合体(HS9_DSB7_G2V、HS9_DSB7_E15A、HS9_DSB7_V19A和HS9_DSB7_L26I)，以便支持进一步的表征。为了评估产生过程中化合物聚集的倾向性，通过分析性SEC-HPLC对蛋白A纯化后的样品进行测试。数据汇总于表19中。

四个融合体中仅有两个(HS9_DSB7_V19A和HS9_DSB7_L26I)在蛋白A纯化后达到了大于90％的单体百分比。HS9_DSB7_V19A呈现出具有超过95％单体的最佳分布图。HS9_DSB7_G2V和HS9_DSB7_E15A显著倾向于在产生过程中发生聚集，具有大于20％的聚集体百分比，相比之下HS9_DSB7_V19A为小于5％。

以30kDa的分子量截断值使用离心旋转浓缩器对纯化的化合物进行浓缩，以便达到在默认配制缓冲液中的50mg/mL的目标浓度。HS9_DSB7_G2V和HS9_DSB7_E15A的浓缩分别停止于38.7和33.7mg/mL，因为注意到进一步的体积缩小导致蛋白质浓度的下降。在HS9_DSB7_V19A和HS9_DSB7_L26I的浓缩步骤过程中未观察到这种问题。

然后将样品在5℃或40℃下孵育4周，接着进行分析性SEC-HPLC以便评估储存稳定性。结果汇总于表20中。

HS9_DSB7_V19A和HS9_DSB7_L26I都显示出比HS9_DSB7_G2V和HS9_DSB7_E15A更好的稳定性参数。例如，前两者具有约0.3％的5℃下每月的聚集率，相比之下HS9_DSB7_E15A和HS9_DSB7_G2V分别为0.8％和1.4％。

B)与抗PCSK9抗体融合的GLP-1类似物肽在大鼠中的单次静脉内剂量药代动力学

在三只CD大鼠中HS9_DSB7_G2V、HS9_DSB7_E15A、HS9_DSB7_V19A和HS9_DSB7_L26I分别为60、53、58.5和60mg/kg的单次静脉内团注之后，如实例4所述评估具有所希望的人GLP-1R效力的四种选择的肽抗体融合体的药代动力学分布图。使用高剂量的化合物(高于50mg/kg)使PCSK9陷阱饱和持续相当一段时间，以便确定线性阶段期间的PK参数，但没有任何靶标介导的药物处置分量。

在注射后30分钟、6h、24h、48h、96h、168h、240h和336h收集血液样品。四种化合物随时间推移的浓度在图24中示出并且半衰期数据汇总于表21中。

四种融合分子尽管在序列上非常接近并且分享相同的抗体主链，但具有显著不同的分布图。HS9_DSB7_V19A具有四个融合体的最长的体内半衰期128h，相比之下例如HS9_DSB7_L26I的仅为39h。

实例17.与抗PCSK9抗体融合的GLP-1类似物肽在不同物种之中对PCSK9的亲和力和动力学参数确定

基本上如Karlsson等人(《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)(1991)，第145卷，第Dear229-40页)所述，在25℃下，使用Biacore 2000生物传感器(通用医疗集团)，通过表面等离子体共振(SPR)测定GLP-1类似物抗PCSK9融合体HS9_DSB7_V19A人IgG1-TM对于人、食蟹猴和大鼠PCSK9结合的缔合(ka)、解离(kd)和平衡解离常数(KD)。抗PCSK9抗体PC9#3人IgG1-TM用作基准(SEQ ID NO：404的可变重链和SEQ ID NO：405的可变轻链)。

首先使用人抗体捕获试剂盒(Human Antibody Capture Kit)和CM5传感器芯片(通用医疗集团)建立小鼠抗人IgG单克隆抗体表面。在10μL/分钟的流速下捕获人类抗体化合物持续3分钟。将重组人Avi_PCSK9_Flag_His(内部的)、食蟹猴Avi_PCSK9_Flag_His(内部的)、和带His标签的大鼠PCSK9(SinoBiological)在运行缓冲液(10mM磷酸钠pH 7.4、150mM氯化钠、1mg/mL BSA、0.05％Tween20)中稀释至范围从1nM至200nM的浓度，并且注射到芯片表面上10分钟，接着注射运行缓冲液仅持续10分钟的解离期。在每次抗体施加之间使用3M氯化镁来再生芯片的表面。使用1∶1结合动力学模型，首先计算总体解离速率，接着计算总体缔合速率。

结果在表22中示出。

融合分子HS9_DSB7_V19A在pH7.4下对人PCSK9具有600pM的亲和力，非常类似于基准抗PCSK9抗体PC9#3。有趣的是，具有四倍更低解离常数的HS9_DSB7_V19A与PC9#3相比更少倾向于与人PCSK9解离。

此外，HS9_DSB7_V19A在生理pH下强烈地结合至食蟹猴和大鼠PCSK9，平衡解离常数接近于人PCSK9值(分别为1.7nM和570pM)。

实例18.与抗PCSK9抗体融合的GLP-1类似物肽与密切相关的人蛋白质相比对PCSK9的特异性

GLP-1类似物抗PCSK9融合体HS9_DSB7_V19A人IgG1-TM与相关人蛋白质相比对PCSK9的特异性通过解离增强镧系荧光免疫测定时间分辨荧光(DELFIA TRF测定，珀金埃尔默)进行测定。将重组人Avi_PCSK9_Flag_His(内部的)、带GST标签的人PCSK7(亚诺法(Abnova))、带GST标签的人MBTPS1(亚诺法)、和带Flag/His标签的人CD86(内部的)在PBS中以10μg/mL涂布至96孔免疫测定板中。洗涤后，将HS9_DSB7_V19A以25μg/mL的浓度添加至涂布抗原的孔中。深入洗涤之前，在室温下将板孵育2小时。使用二次的铕标记的抗人IgG抗体(珀金埃尔默)检测结合的HS9_DSB7_V19A人IgG1-TM。对于人PCSK7和人MBTPS1，使用小鼠抗GST IgG(Abcam)作为一次抗体和铕标记的抗小鼠IgG(珀金埃尔默)作为检测抗体，评估对板的抗原涂布。人PCSK9和人CD86涂布直接使用铕标记的anti-His IgG(珀金埃尔默)进行评估。

结果显示，HS9_DSB7_V19A人IgG1-TM强烈结合至人PCSK9，而不强烈结合至人PCSK7、人MBTPS1(PCSK8)、或人CD86(数据未示出)。

实例19.利用与抗PCSK9抗体融合的GLP-1类似物肽阻断人PCSK9与LDL受体的结合

使用ELISA竞争测定评估GLP-1类似物抗PCSK9融合体HS9_DSB7_V19A阻断人PCSK9结合至人LDL受体的能力。抗PCSK9抗体HS9和同种型匹配的不相关NIP228人IgG1-TM分别用作阳性和阴性对照。

使用以100ng/mL稀释于Delfia缓冲液(珀金埃尔默)中的穴状化合物标记的链霉抗生物素蛋白(珀金埃尔默)，通过ELISA来检测5ug/mL的生物素酰化的人PCSK9(内部的)在1X磷酸盐缓冲生理盐水、3％脱脂乳中与10ug/mL过夜涂布于96孔MaxiSorb板(NUNC)上的人LDL-R(安迪生物科技公司(R&D Systems))的结合。使用在室温下与涂布LDL受体的孔中的生物素酰化的PCSK9试剂共同孵育2h的化合物以100ug/mL开始的3倍连续稀释来激发该相互作用。使用340nm激发波长和620nm发射波长在Perkin Elmer Envision机器上读取荧光信号。如下计算特异性结合百分比：扣除没有LDL受体涂布于板上时所获得的背景信号，利用没有竞争化合物存在时所获得的最大特异性结合信号减去背景水平归一化。

对PCSK9结合至LDL受体的生化抑制呈现于图25中。

融合分子HS9_DSB7_V19A能够阻断生物素酰化的人PCSK9结合至重组LDL受体，与阳性对照抗PCSK9抗体HS9相比具有相似的IC₅₀(分别为4.3E-8和3.5E-8M)。

实例20.经与抗PCSK9抗体融合的GLP-1类似物肽处理的HEPG2细胞的LDL摄取

GLP-1类似物抗PCSK9融合体HS9_DSB7_V19A阻断PCSK9活性并且恢复LDL摄取的能力如下在HepG2肝细胞中测试。抗PCSK9抗体PC9#2和同种型匹配的不相关NIP228人IgG1-TM分别用作阳性和阴性对照。

将人HepG2细胞以每孔2x10⁴个细胞的浓度在补充有10％脂蛋白缺乏的血清(西格玛)的DMEM培养基(Gibco)中接种到黑色、透明底部的96孔Greiner板中，并且在37℃(5％CO₂)下孵育过夜。为了使PCSK9与测试化合物复合，将45nM的人Avi_PCSK9_FLAG_His(内部的)在DMEM+10％LPDS中在存在或不存在不同浓度的测试化合物情况下室温孵育1小时。将全部培养基从细胞板移除并且将PCSK9/化合物混合物转移到板上并孵育1小时。接着将在DMEM+10％LPDS中稀释至50nM最终浓度的Bodipy-LDL(分子探针公司(Molecular Probes)转移至细胞并且将板在37℃(5％CO₂)下孵育5小时。细胞用PBS彻底地洗涤，用核染料Hoescht染色并且使用甲醛以3.7％(v/v)的最终浓度固定。使用Cellomics ArrayScan VTi高内涵成像系统读取测定板的细胞相关荧光。在通道1中使用BGRFR_386_23过滤器和Bodipy-LDL以及在通道2中使用BGRFR_485_20过滤器测量Hoescht染色。使用房室分析v4算法分析图像。

对HepG2细胞的LDL摄取的PCSK9依赖性损失的抑制呈现于图26中。

融合分子HS9_DSB7_V19A能够恢复经人PCSK9处理的HepG2细胞的LDL摄取，与阳性对照抗PCSK9抗体PC9#2相比具有相似的IC₅₀(分别为2.5E-8和3.1E-8M)。

实例21.与抗PCSK9抗体融合的GLP-1类似物肽在不同物种之中对GLP-1受体的效力

通过使用过表达所感兴趣的受体的稳定细胞系，在如前所述的cAMP产生测定中测试GLP-1类似物抗PCSK9融合体HS9_DSB7_V19A对人、食蟹猴、小鼠、和大鼠GLP-1受体的交叉反应性。GLP1-Fc融合体(内部的)和GLP-1肽用作阳性对照。

对不同GLP-1受体的效力汇总于表23中。

融合分子HS9_DSB7_V19A能够活化所有四种测试物种之中的GLP-1受体。

实例22.通过降低对人GLP-1受体的效力鉴定若干化合物

为了降低DSB7效力，使肽中的某些残基发生突变。在所希望效力下利用接头SEQID NO：4与SEQ ID NO：2的肽抗体融合体在此以绿色三角形示出，被进一步分析对人GLP1-R的特异性以及物种交叉反应性。参见图27。

这些变体被示出为HS9_DSB7_G2V(Gly₂-＞Val)(SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：1)；HS9_DSB7_E15A(Glu₁₅-＞Ala)(SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：1)；HS9_DSB7_V19A(Val19-＞Ala)(SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：1)；HS9_DSB7_L26I(Leu₂₆-＞Ile)(SEQ ID NO：46和SEQID NO：1)(与Val₁₉-＞Ala(SEQ ID NO：3)相比)。选择这四种变体进行最后的表征。结果示于图27中。

实例23.具有降低的效力的融合分子

PCSK9/GLP-1融合分子表现出所希望的对GLP-1受体的效力，如图28A中所示。该化合物的效力已经被降低来最小化恶心。表24显示，HS9_DSB7_V19A相对于度拉糖肽具有57.7倍降低的效力。这种工程化的效力降低提供了减少恶心和其他不利作用的所希望的效应。

实例1的PCSK9/GLP-1融合体显示出足以能够每周给药的抗体暴露/GLP-1活性分布图，例如，如图28B中所示。在大鼠中的pK稳定性研究向大鼠中注射58.5mg/kg的HS9_DSB7_V19A。随时间推移在血清中测量融合化合物的浓度。分析从大鼠取得的样品中的待测化合物的活性和血清中待测化合物的浓度。将来自GLP-1活性部分的数据用于反向计算“活性”化合物的浓度。带有封闭圆圈的线是HS9_DSB7_V19A的浓度，并且带有封闭正方形的线是针对相同样品的活性HS9_DSB7_V19A(即，具有GLP-1活性)的浓度。

实例24.与抗PCSK9抗体融合的GLP-1类似物肽与密切相关的人受体相比对GLP-1受体的特异性

通过使用过表达所感兴趣的受体胰高血糖素、GIP、GLP-2和促胰液素受体的稳定细胞系，在如前所述的cAMP产生测定中测试GLP-1类似物抗PCSK9融合体HS9_DSB7_V19A与相关人受体相比对GLP-1受体的特异性。四种受体中的每一个的特异性激动剂肽用作阳性对照。

数据示于图29A-D中(A：胰高血糖素受体，B：GIP受体，C：GLP-2受体，D：促胰液素受体)。

融合分子HS9_DSB7_V19A特异于GLP-1受体并且不活化四种测试的密切相关受体中的任一种。

实例25.融合分子的进一步表征证实了有利的体内分布图。

实例2的PCSK9/GLP-1融合分子(HS9_DSB7_V19A(SEQ ID NO：1的重链和SEQ IDNO：47的轻链融合)显示了随时间推移的优越的葡萄糖控制和体重减轻，包括给药后第7天。示出了度拉糖肽以及PC9_2_VH和VL(SEQ ID NOS：8和9)的数据。在第0天向动物给予化合物，然后随时间推移测量它们的体重以便确定体重的变化。

融合分子已显示它以高亲和力结合纯化的PCSK9，恢复HEPG2细胞中的LDLc摄取，以所希望的效力刺激GLP-1R，促进体重减轻，并且证实了大鼠PK中的有利的暴露/活性分布图，以便支持每周给药和体内持久的GLP-1活性。

结果提供于图30A-B中。

实例26.接头对与抗PCSK9抗体融合的GLP-1类似物肽的活性的影响

化合物HS9_DSB7_V19A在肽部分与抗体轻链之间具有SEQ ID NO：4的接头，该接头对应于重复三次的Gly₄Ser基序。为了研究当融合至抗PCSK9抗体HS9的轻链(轻链：SEQ IDNO：2和重链：SEQ ID NO：1)时在GLP-1类似物肽DSB7_V19A(SEQ ID NO：3)之间的接头长度的影响，产生具有减小的接头长度的三种融合体：HS9_DSB7_V19A_L2(SEQ ID NO：419)，具有对应于重复两次的Gly₄Ser基序的接头(接头：SEQ ID NO：403)；HS9_DSB7_V19A_L1(SEQID NO：420)，具有对应于重复一次的Gly₄Ser基序的接头(SEQ ID NO.27)；以及在肽与抗体轻链之间没有接头的HS9_DSB7_V19A_L0(SEQ ID NO：421)。

通过ELISA来测试化合物与重组人PCSK9的结合并且使用如实例4中所述的cAMP测定细胞基测定来测试化合物对人GLP-1受体的活性。

通过在1X磷酸盐缓冲生理盐水中以10ug/mL涂布人PCSK9(内部的)执行结合ELISA。将板用1X磷酸盐缓冲生理盐水、3％脱脂乳阻断后，添加在PBS中100ug/mL的化合物并且在洗涤前室温孵育2h。使用在Delfia缓冲液(珀金埃尔默)中稀释为100ng/mL的穴状化合物标记的Fc特异性抗人IgG(珀金埃尔默)检测结合的化合物。使用340nm激发波长和620nm发射波长在Perkin Elmer Envision机器上读取荧光信号。HS9_DSB7_V19A用作阳性对照并且使用同种型匹配的不相关NIP228确定背景水平。

PCSK9结合和GLP-1受体活化数据分别示于图31和图32中。

所有另外的融合分子都能够与HS9_DSB7_V19A相比以类似的水平结合人PCSK9。所测试的融合分子还能够在cAMP细胞基测定中活化人GLP-1受体，但是减小接头长度对化合物效力具有负面影响。在该测定中，HS9_DSB7_V19A、HS9_DSB7_V19A_L2、HS9_DSB7_V19A_L1、和HS9_DSB7_V19A_L0的EC₅₀分别为5.0nM、15.6nM、68.7nM、和537nM。

实例27.与抗PCSK9抗体融合的稳定GLP-1类似物肽的体外表征

使用SEQ ID NO：4的接头将SEQ ID NO：3的GLP-1类似物肽DSB7_V19A融合至HS9以外的其他抗PCSK9抗体的轻链：

1_PC9#1，具有SEQ ID NO：10的抗体可变重链和SEQ ID NO：11的抗体可变轻链

2_PC9#3，具有SEQ ID NO：404的抗体可变重链和SEQ ID NO：405的抗体可变轻链。

3_PC9#4，具有SEQ ID NO：406的抗体可变重链和SEQ ID NO：407的抗体可变轻链。

4_PC9#5，具有SEQ ID NO：408的抗体可变重链和SEQ ID NO：409的抗体可变轻链。

5_PC9#6，具有SEQ ID NO：410的抗体可变重链和SEQ ID NO：411的抗体可变轻链。

6_PC9#7，具有SEQ ID NO：412的抗体可变重链和SEQ ID NO：413的抗体可变轻链。

通过如实例26中所述的ELISA来测试融合体与重组人PCSK9的结合并且使用如实例4中所述的cAMP细胞基测定来测试融合体对人GLP-1受体的活性。HS9_DSB7_V19A和NIP228同种型匹配分别用作阳性和阴性对照。

PCSK9结合和GLP-1受体活化数据分别示于图33和图34中。

在人GLP-1受体cAMP测定中测试的所有七种化合物都能够活化该受体。该组当中的效力对于PC9#6_DSB7_V19A和PC9#5_DSB7_V19A分别介于从1至350nM的范围内。HS9_DSB7_V19A在该测定中具有5nM的效力。

此外，通过ELISA确定，除了结合不佳的PC9#7_DSB7_V19A和不结合的PC9#6_DSB7_V19A，所有测试的融合体都还能够强烈地结合至人PCSK9。

实例28.与抗B7-H1抗体融合的稳定GLP-1类似物肽的体外表征

使用SEQ ID NO：4的接头将SEQ ID NO：3的GLP-1类似物肽DSB7_V19A融合至专利WO2011066389中描述的抗B7-H1抗体2.7A4的轻链。抗B7-H1抗体2.7A4具有SEQ ID NO：422的可变重链和SEQ ID NO：423的可变轻链。

通过ELISA来测试融合体与重组人B7-H1的结合并且使用如实例4中所述的cAMP测定细胞基测定来测试融合体对人GLP-1受体的活性。

通过在1X磷酸盐缓冲生理盐水中以5ug/mL涂布人B7-H1(内部的)执行结合ELISA。将板用1X磷酸盐缓冲生理盐水、3％脱脂乳阻断后，添加在PBS中10ug/mL的化合物并且在洗涤前室温孵育2h。使用如在实例25中所述的穴状化合物标记的Fc特异性抗人IgG(珀金埃尔默)检测结合的化合物。抗B7-H1抗体2.7A4和同种型匹配的不相关NIP228分别用作阳性和阴性对照。

B7-H1结合和GLP-1受体活化数据分别示于图35和图36中。

融合体2.7A4_DSB7_V19A能够以与阳性对照2.7A4抗体类似的水平结合人B7-H1。该融合体还能够在cAMP细胞基测定中活化人GLP-1受体，具有100nM的效力，相比之下HS9_DSB7_V19A为5nM。

实例29.在单次静脉内剂量后与抗PCSK9抗体融合的GLP-1类似物肽在大鼠中的药代动力学和药效动力学

进行了在CD大鼠中单次静脉内团注后肽抗体融合体HS9_DSB7_V19A的PKPD研究，以便评估其体内稳定性：通过测量化合物暴露和活性GLP-1的浓度，以及通过测量游离大鼠PCSK9的浓度来评估靶标接合。

注射10、30和60mg/kg的融合分子。没有连接肽的抗PCSK9单克隆抗体HS9用作对照物并且以60mg/kg注射。血液样品收集时间：

1：对于10mg/kg治疗组，给药前-0.5h-6h-24h-48h-96h和168h；

2：对于30mg/kg治疗组，给药前-0.5h-24h-48h-96h-168h和240h；以及

3：对于60mg/kg治疗组，给药前-0.5h-24h-72h-168h一336h和504h。

如实例4中所述定量大鼠血清样品中总的人IgG1抗体(暴露)和活性GLP-1化合物的浓度。

对于三种测试剂量(10、30和60mg/kg)，在大鼠血清中总的和活性GLP-1化合物随时间推移的HS9_DSB7_V19A浓度示于图37中。

总化合物和活性GLP-1的曲线下面积(AUC)汇总于表25中。计算活性GLP-1与总化合物AUC之间的比是评价体内稳定性的一种方式。其比率对应于在测试条件中的完全稳定的化合物。

包含与抗PCSK9单克隆抗体PC9#2(参见实例4)轻链融合的Exendin-4的母体融合分子PC9#2_Exe4的数据也包括在内以供比较。

HS9_DSB7_V19A显示出与母体分子PC9#2_Exe4相比更高的活性/总AUC比，证实了在大鼠中对GLP-1受体的活性的改善的体内稳定性分布图。

血清样品中游离大鼠PCSK9浓度的测定是基于使用平台的夹心配体结合测定方法。使用首先非特异性地吸附于标准结合板的碳表面上的抗PCSK9mAb HS9来捕获游离大鼠PCSK9。来自Abcam的抗PCSK9抗体(产品编号ab125251)在内部用SULFO-TAG^TM标记并且用作检测试剂。然后使用分区成像仪6000(S16000)仪器对板进行读取。

通过测量大鼠血清样品中游离抗原的浓度来评价随时间推移HS9_DSB7_V19A与大鼠PCSK9的接合。三个给药组(10、30和60mg/kg)的数据示于表26和图38中。

HS9_DSB7_V19A能够在所有测试剂量下将大鼠PCSK9抑制到低于90％，但是抑制的持续时间是剂量依赖性的。当HS9_DSB7_V19A分别以10、30和60mg/kg给药时，游离大鼠PCSK9在注射后的6h、168h和336h再次是可检测的。

实例30.在单次皮下剂量后与抗PCSK9抗体融合的GLP-1类似物肽在大鼠中的药代动力学和药效动力学

进行了在CD大鼠中单次皮下团注60mg/kg后GLP-1类似物肽抗体融合体HS9_DSB7_V19A的药代动力学研究，以便比较给药途径和它们对化合物暴露和体内稳定性的潜在影响。

使用1.5mL/kg方案注射40mg/mL的融合分子。在给药前-6h-24h-48h-96h-168h、和240h收集血液样品。

如实例4和实例29中所述测定血清样品中总的人IgG1抗体和活性GLP-1化合物的浓度以及游离大鼠PCSK9抗原的浓度。

HS9_DSB7_V19A的总化合物和活性化合物以及游离大鼠PCSK9浓度示于图39中。在注射后48h与96h之间观察到约1000nM的最大化合物浓度。在化合物注射后游离大鼠PCSK9的浓度急剧下降到测定的定量下限以下并且在168h能够再次检测到。

计算总化合物和活性化合物的曲线下面积(AUC)并且进行比较(表27)，以便使用来自实例29中所述的单次静脉内剂量注射的数据对预测进行建模。吸收比率和吸收速率分别设定为75％和0.3d^-1。

单次皮下注射60mg/kg后HS9_DSB7_V19A的暴露和活性GLP-1AUC类似于使用单次静脉内注射数据预测的那些值。这证实了皮下的注射途径与静脉内的给药途径相比对体内化合物稳定性没有显著影响。

实例31.与抗PCSK9抗体融合的GLP-1类似物肽的啮齿动物药理学-抗糖尿病效应

为了确认HS9_DSB7_V19A融合分子的GLP-1类似物肽部分的工程化性质保留体内的抗糖尿病活性，进行了在正常、肥胖、和糖尿病小鼠模型中的若干啮齿动物药理学研究。

A)HS9_DSB7_V19A对C57Bl6小鼠中的葡萄糖耐量的急性和半急性效应

在正常C57Bl6小鼠中皮下给予1或50mg/kg的单次剂量的HS9_DSB7_V19A。在HS9_DSB7_V19A给药后4、48和168小时通过多种葡萄糖激发(口服葡萄糖耐量试验)评价融合分子的GLP-1类似物组分的功效。没有所融合的GLP-1类似物肽的抗PCSK9单克隆抗体HS9以50mg/kg给药以作为葡萄糖耐量的阴性对照，而利拉鲁肽(Victoza)和一种GLP-1类似物-Fcγ4片段(类似于度拉糖肽)分别以0.2和1mg/kg给药。由于利拉鲁肽的短半衰期，这种化合物在每次葡萄糖激发之前2小时给药，而GLP-1类似物-Fcγ4融合分子与HS9_DSB7_V19A待测化合物同时进行一次给药。

使来自Taconic Denmark的30只雄性C57Bl6小鼠在实验过程之前适应五天。在研究的第-1天，基于体重将动物随机化成5组。

实验组如下：

组1：没有GLP-1类似物肽组分的抗PCSK9单克隆抗体HS9(阴性对照)-50mg/kg皮下剂量

组2：利拉鲁肽(阳性对照)-0.2mg/kg皮下剂量

组3：HS9_DSB7_V19A-1mg/kg皮下剂量

组4：HS9_DSB7_V19A-50mg/kg皮下剂量

组5：GLP-1类似物-Fcγ4融合体-1mg/kg皮下剂量

为了评估融合分子的GLP-1类似物组分在给药后的延长时间段内的功效，在第0、2和7天进行3个口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。在口服葡萄糖激发之前使动物禁食4小时。在第0天OGTT之前4小时将两个剂量的HS9_DSB7_V19A、无活性对照和GLP-1类似物-Fcγ4融合体给药一次。在第0天、第2天和第7天每次葡萄糖激发之前2小时给予利拉鲁肽(阳性对照)。在t＝0大鼠时，所有小鼠用2g/kg葡萄糖的口服葡萄糖负荷激发。在t＝-240、-120和0分钟时测量血糖以建立基线并且在t＝15、30、60和120分钟时测量血糖以监控对葡萄糖偏移的效应。第0、2和7天OGTT的结果呈现于图40A-C(第0天(A)、第2天(B)、第7天(C))中。

该研究确认了50mg/kg的HS9_DSB7_V19A的单次皮下给药改善正常C57B16小鼠中葡萄糖耐量至少7天的能力。

作为HS9_DSB7_V19A融合分子的GLP-1类似物组分的功效的另外一个量度，从第-3天至研究结束每天一次记录所有动物的体重。50mg/kg的HS9_DSB7_V19A的单次皮下给药诱导了第1天和第2天体重的瞬时减轻。随时间推移的体重变化百分比示于图41中。

B)HS9_DSB7_V19A对C57B16小鼠中的葡萄糖耐量的急性和半急性效应-剂量反应

为了检测剂量反应效应以及确定HS9_DSB7_V19A对正常C57B16小鼠中葡萄糖耐量和体重减轻的最大功效剂量，进行了与上述设计类似的研究，实验组和剂量如下：

组1：没有GLP-1类似物肽组分的抗PCSK9单克隆抗体HS9(阴性对照)-50mg/kg皮下剂量

组2：利拉鲁肽(阳性对照)-0.2mg/kg皮下剂量

组3：HS9_DSB7_V19A-10mg/kg皮下剂量

组4：HS9_DSB7_V19A-30mg/kg皮下剂量

组5：HS9_DSB7_V19A-60mg/kg皮下剂量

组6：GLP-1类似物-Fcγ4融合体-1mg/kg皮下剂量

在第-1天，基于体重将动物随机化成这6组(每组n＝6只动物)。如先前所述，在第0、2和7天进行OGTT并且在t＝-240、-120、0、15、30、60和120分钟时测量血糖。

所有三种剂量的HS9_DSB7_V19A都在进行OGTT的所有三个时间点导致了相似的改善葡萄糖耐量水平。图42A-C展示了来自这些口服葡萄糖耐量试验的结果(第0天(A)、第2天(B)、第7天(C))。

与缺少关于葡萄糖稳态改善所观察到的剂量反应相对比，在此研究中观察到了清楚的对体重减轻的剂量依赖性效应。图43。

在此实验模型中，单次10mg/kg剂量的HS9_DSB7_V19A在给药后7天进行的OGTT中产生了葡萄糖稳态改善的最大功效水平，而相同剂量在研究期间的任何时间点都未对体重减轻具有统计学显著的效应。

C)HS9_DSB7_V19A在糖尿病db/db小鼠模型中的慢性代谢效应

为了确认HS9_DSB7_V19A对糖尿病模型中若干代谢参数的慢性体内功效，利用db/db(瘦素受体缺陷)小鼠检测HS9_DSB7_V19A的每周给药对空腹血糖、葡萄糖耐量、体重减轻、和体重组成的效应。

在此研究中，检测了通过皮下途径每周给药时HS9_DSB7_V19A的慢性代谢效应。媒介物对照组和阳性对照GLP-1类似物-Fcγ4融合分子每周两次皮下给药。为了使研究中所有动物的给药操作的次数相匹配，接受每周剂量HS9_DSB7_V19A的组在其他动物接受它们的第二次每周剂量的媒介物(阴性对照)或阳性对照GLP-1类似物-Fcγ4融合分子当天用媒介物给药。

来自Italy查尔斯河实验室的60只雄性db/db小鼠主要根据体重和糖基化血红蛋白(HbAlc)且其次根据4小时空腹血糖进行随机化。这些动物如下随机化成5组(n＝12)：

组1：媒介物对照组(磷酸盐缓冲生理盐水)-每周两次(BIW)皮下给药

组2：GLP-1类似物-Fcγ4融合体(阳性对照)-1mg/kg皮下剂量-每周两次皮下给药

组3：HS9_DSB7_V19A-30mg/kg皮下剂量-每周一次(QW)

组4：HS9_DSB7_V19A-10mg/kg皮下剂量-每周一次(QW)

组5：HS9_DSB7_V19A-3mg/kg皮下剂量-每周一次(QW)

该慢性研究在初始剂量后进行28天。BIW组的最后剂量在研究的第24天，而QW组的最后剂量在研究的第21天。该研究的主要功效端点是体重、空腹血糖和葡萄糖耐量。

在治疗期期间每周三次测量体重。

在给药后大约24小时每周一次测量4小时空腹血糖。

在研究第22天，给药后大约24小时通过腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)测量葡萄糖耐量。在给予1g/kg葡萄糖团注之前使动物禁食4小时。在t＝0、15、30、60、120和180分钟测量血糖。

在此研究中的体重减轻不是显著的，除了阳性对照GLP-1类似物-Fcγ4融合分子组中的一个时间点之外。所有三个剂量的HS9_DSB7_V19A在28天研究的过程中的任何时间点都未导致显著的体重减轻。图44。

每周的HS9_DSB7_V19A与媒介物对照相比表现出4小时空腹血糖的剂量依赖性降低。图45。

每周给药的HS9_DSB7_V19A通过在研究第22天的IPGTT评估而表现出葡萄糖耐量的剂量依赖性改善。图46。

D)单次剂量的HS9_DSB7_V19A对饮食诱导性肥胖(DIO)小鼠模型中的葡萄糖耐量的急性效应

在饮食诱导性肥胖(DIO)小鼠中皮下给予0.1、1或10mg/kg的单次剂量的HS9_DSB7_V19A。在HS9_DSB7_V19A给药后4和168小时通过单独的葡萄糖激发(腹膜内葡萄糖耐量试验)评价融合分子的GLP-1类似物组分的功效。没有所融合的GLP-1类似物肽的抗PCSK9单克隆抗体HS9以10mg/kg给药以作为对于葡萄糖耐量的效应的阴性对照。作为阳性对照，先前实验中所用的GLP-1类似物-Fcγ4融合体(类似于度拉糖肽)每周两次(BIW)以1mg/kg给药。为了模拟阳性对照GLP-1类似物-Fcγ4融合体的给药方案，对阴性对照组中和HS9_DSB7_V19A实验组中的所有动物用媒介物BIW给药。研究持续时间是在第一剂量后21天。主要端点是第0天(给药后4小时)和第7天时对IPGTT中的葡萄糖耐量的效应。次要端点是体重减轻。

从杰克逊实验室(Jackson labs)(JAX：380050)获得研究开始之前15周使用60％高脂肪饮食的50只雄性的21周龄DIO小鼠。即将在研究开始之前，基于体重将动物随机化成5组。

实验组(每组n＝10)如下：

组1：没有GLP-1类似物肽组分的抗PCSK9单克隆抗体HS9(阴性对照)-10mg/kg皮下剂量-单次剂量

组2：HS9_DSB7_V19A-0.1mg/kg皮下剂量-单次剂量

组3：HS9_DSB7_V19A-1mg/kg皮下剂量-单次剂量

组4：HS9_DSB7_V19A-10mg/kg皮下剂量-单次剂量

组5：GLP-1类似物-Fcγ4融合体-1mg/kg皮下剂量-每周两次给药(BIW)

为了评估融合分子的GLP-1类似物组分在给药后的延长时间段内的功效，在第0和7天进行两个腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)。在腹膜内(IP)葡萄糖激发之前使动物禁食6小时。在第0天OGTT之前4小时将所有三个剂量的HS9_DSB7_V19A、无活性对照和GLP-1类似物-Fcγ4融合体给药一次。在第0、3、7、10、14、17和21天给予GLP-1类似物-Fcγ4融合体。在第0天，所有组在IP葡萄糖激发之前4小时用待测化合物给药，在第7天，在IP葡萄糖激发之前4小时给予GLP-1类似物-Fcγ4融合体，而所有其他组仅用媒介物给药。对于进行IPGTT的每天，在t＝0大鼠时，所有大鼠用1.5g/kg葡萄糖的IP葡萄糖负荷激发。在t＝-240和0分钟时测量血糖以建立基线并且在t＝15、30、45、60、90和120分钟时测量血糖以监控对葡萄糖偏移的效应。

第0天和第7天IPGTT的结果呈现于图47A-B中。

为了评估HS9_DSB7_V19A的GLP-1组分对体重的效应，所有动物在整个研究过程中每天称重。对体重的效应呈现于48A-B中。

E)多次剂量的HS9_DSB7_V19A对DIO小鼠体重的效应。

为了建立体重减轻的剂量反应，对饮食诱导性肥胖小鼠每周一次(QW)皮下给予3、10和30mg/kg的HS9_DSB7_V19A。研究的持续时间是28天并且主要端点是体重减轻。分析包括的次要的血糖参数评价包括整个研究过程中的进食血糖和末期空腹血糖的测量值。如同我们在DIO和db/db两种小鼠中的先前研究，每周两次(BIW)皮下给予1mg/kg的GLP-1类似物-Fcγ4融合体，以作为关于血糖控制和体重减轻的阳性对照。

从杰克逊实验室(JAX：380050)获得研究开始之前15周使用60％高脂肪饮食的雄性的21周龄DIO小鼠。即将在研究开始之前，基于体重将动物随机化成5组(每组n＝8只动物)。

实验组(每组n＝8)如下：

组1：媒介物对照

组2：HS9_DSB7_V19A-3mg/kg皮下剂量-每周一次(QW)

组3：HS9_DSB7_V19A-10mg/kg皮下剂量-每周一次(QW)

组4：HS9_DSB7_V19A-30mg/kg皮下剂量-每周一次(QW)

组5：GLP-1类似物-Fcγ4融合体-1mg/kg皮下剂量-每周两次给药(BIW)

为了评估HS9_DSB7_V19A的GLP-1组分对体重(该研究的主要端点)的效应，所有动物在整个研究过程中每天称重。对体重的效应呈现于图49中。

作为次要端点并且为了评估在每周剂量设置中HS9_DSB7_V19A的GLP-1组分对血糖控制的效应，在第0、7、11、14、21和26天测量进食血糖并且在研究即将结束之前(第28天)测量空腹血糖。结果呈现于图50A-B中。

等效物

前述书面说明书被认为足以使本领域的技术人员能够实践这些实施例。前述描述和实例详述了某些实施例，并且描述了诸位发明人所期望的最佳模式。然而，将了解到，无论前述内容以文本形式表现的如何详细，这些实施例仍可以以多种方式实践，并且权利要求书包括其任何等效物。

Claims (40)

1.一种用于治疗糖尿病的双重活性融合分子，该双重活性融合分子包含稳定地融合至一种GLP-1肽的一种抗PCSK9抗体，其中该抗PCSK9抗体结合一种PCSK9多肽并且该GLP-1肽结合一种GLP-1受体。

2.如权利要求1所述的融合分子，其中该GLP-1肽是通过一种连接肽融合至该PCSK9抗体。

3.如权利要求2所述的融合分子，其中该连接肽被融合至该GLP-1肽的C端。

4.如权利要求1-3中任一项所述的融合分子，其中该GLP-1肽包括SEQ ID NO：36的氨基酸序列。

5.如权利要求1-3中任一项所述的融合分子，其中该GLP-1肽包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

6.如权利要求5所述的融合分子，其中该GLP-1肽的Cys18与该GLP-1肽的C端形成一个二硫桥键。

7.如权利要求1-6中任一项所述的融合分子，其中所述融合分子在动物中控制葡萄糖和/或降低LDL。

8.如权利要求7所述的融合分子，其中该动物是人类。

9.一种用于治疗糖尿病的双重活性融合分子，该双重活性融合分子包含稳定地融合至包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列的一种GLP-1肽的一种抗PCSK9抗体，其中该GLP-1肽的C端通过一个肽接头融合至该抗PCSK9抗体，并且其中该抗PCSK9抗体结合一种PCSK9多肽而该GLP-1肽结合一种GLP-1受体。

10.如权利要求9所述的双重活性融合分子，其中该GLP-1肽是通过一个肽接头融合至该抗PCSK9抗体的轻链。

11.如权利要求9所述的双重活性融合分子，其中该GLP-1肽是通过一个肽接头融合至该抗PCSK9抗体的重链。

12.一种双重活性融合分子，包含稳定地融合至包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列的一种GLP-1肽的一种抗体，其中该GLP-1肽的C端通过一个肽接头融合至该抗体，并且其中该抗体结合一种靶标多肽而该GLP-1肽结合一种GLP-1受体。

13.如权利要求12所述的双重活性融合分子，其中该抗体是一种抗PCSK9抗体。

14.如权利要求13所述的双重活性融合分子，其中该GLP-1肽是通过一个肽接头融合至该抗PCSK9抗体的轻链。

15.如权利要求13所述的双重活性融合分子，其中该GLP-1肽是通过一个肽接头融合至该抗PCSK9抗体的重链。

16.如权利要求10或14所述的双重活性融合分子，其中该抗PCSK9抗体的轻链与SEQ IDNO：2的氨基酸序列是至少90％一致的。

17.如权利要求16所述的双重活性融合分子，其中该抗PCSK9抗体的轻链包括SEQ IDNO：2的氨基酸序列。

18.如权利要求11或15所述的双重活性融合分子，其中该抗PCSK9抗体的重链与SEQ IDNO：1的氨基酸序列是至少90％一致的。

19.如权利要求18所述的双重活性融合分子，其中该抗PCSK9抗体的重链包括SEQ IDNO：1的氨基酸序列。

20.如权利要求12-19中任一项所述的双重活性融合分子，其中该肽接头包括SEQ IDNO：4的氨基酸序列。

21.如权利要求12-20中任一项所述的双重活性融合分子，其中该双重活性融合分子是用于治疗糖尿病。

22.如权利要求12-21中任一项所述的双重活性融合分子，其中该GLP-1肽的Cys18与该GLP-1肽的C端形成一个二硫桥键。

23.如权利要求12-22中任一项所述的双重活性融合分子，其中该双重活性融合分子在动物中控制葡萄糖和/或降低LDL。

24.如权利要求23所述的双重活性融合分子，其中该动物是人类。

25.一种用于治疗糖尿病的双重活性融合分子，该双重活性融合分子包含稳定地融合至一种GLP-1肽的一种抗PCSK9抗体，该GLP-1肽与包括SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29的氨基酸序列的一种GLP-1肽相比对人GLP-1受体具有降低的效力，其中该GLP-1肽的C端是通过一个肽接头融合至该抗PCSK9抗体，并且其中该抗PCSK9抗体结合一种PCSK9多肽而该GLP-1肽结合一种GLP-1受体。

26.如权利要求25所述的双重活性融合分子，其中包括SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29的氨基酸序列的该GLP-1肽是使用包括SEQ ID NO：4的一个接头融合至包括SEQ ID NO：416的氨基酸序列。

27.如权利要求25或26所述的双重活性融合分子，其中与包括SEQ ID NO：28或SEQ IDNO：29的氨基酸序列的一种GLP-1肽相比，对人GLP-1受体的效力降低30至60倍。

28.一种治疗2型糖尿病的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予如权利要求1-27中任一项所述的融合分子。

29.一种控制受试者的葡萄糖的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予如权利要求1-27中任一项所述的融合分子。

30.一种降低受试者的低密度脂蛋白(LDL)的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予如权利要求1-27中任一项所述的融合分子。

31.一种在受试者中控制葡萄糖和降低LDL的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予如权利要求1-27中任一项所述的融合分子。

32.一种在受试者中促进体重减轻、控制葡萄糖和降低LDL的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予如权利要求1-27中任一项所述的融合分子。

33.如权利要求28-32中任一项所述的方法，其中该受试者具有2型糖尿病。

34.如权利要求28-32中任一项所述的方法，其中该受试者具有代谢性综合征。

35.一种分离的多核苷酸，编码如权利要求至27中任一项所述的融合分子。

36.一种载体，包括如权利要求35所述的多核苷酸。

37.一种宿主细胞，包括如权利要求35所述的多核苷酸或如权利要求36所述的载体。

38.一种制备如权利要求至27中任一项所述的融合分子的方法，该方法包括在允许表达该融合分子的条件下培养如权利要求35所述的宿主细胞，并且回收该融合分子。

39.一种药用组合物，包含如权利要求1至27中任一项所述的融合分子和载体。

40.一种试剂盒，包含如权利要求39所述的组合物。