CN110036022A - 作为神经肽y受体的调节剂的抗体-偶联的环状肽酪氨酸酪氨酸化合物 - Google Patents

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R.J.帕奇
张瑞
M.A.凯斯
S.M.朗瓦拉
J.N.里奥纳德
R.C.卡马乔
M.J.亨特
K.E.达奎诺
W.爱德华兹
R.V.斯万森
W.简
章越梅
M.沃尔
E.齐
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Abstract

本发明包括缀合物，所述缀合物包含缀合到环状PYY肽上的单克隆抗体。本发明还涉及药物组合物及其使用方法。新型缀合物可用于预防、治疗或改善本文所公开的疾病和障碍。

Description

作为神经肽Y受体的调节剂的抗体-偶联的环状肽酪氨酸酪氨 酸化合物
技术领域
本发明整体涉及新型抗体偶联的环状肽酪氨酸酪氨酸(PYY)缀合物，其为神经肽Y2受体的调节剂。本发明还涉及药物组合物及其使用方法。新型抗体偶联化合物可用于预防、治疗或改善疾病或障碍，诸如肥胖症、2型糖尿病、代谢综合征、胰岛素抵抗和血脂异常等等。
相关申请的交叉引用
本专利申请要求提交于2016年10月27日的美国临时专利申请号62/413,613和提交于2016年10月27日的美国临时专利申请号62/413,586的优先权。每份公开全文以引用方式并入本文。
以电子方式提交的参考序列表
该申请包含序列表，该序列表以电子方式经由EFS-Web作为ASCII格式化序列表提交，其文件名称为“PRD3436序列表”并且创建日期为2017年10月23日，并且大小为135kb。通过EFS-Web提交的该序列表是本说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。在本文所述信息和经由EFS-Web以文件名“PRD3436序列表”以电子方式提交的序列表之间的SEQ IDNO:1-156的结构存在任何不一致的情况下，将以本文的信息为准。
背景技术
神经肽Y(NPY)受体由一组紧密相关的被称为“NPY家族”的肽激动剂活化，其对每个受体亚型具有不同的亲和性。NPY，肽酪氨酸-酪氨酸(PYY)和胰多肽(PP)，所有36个氨基酸的长度，为NPY受体家族的激动剂。NPY是神经递质，与去甲肾上腺素和肾上腺素合成、共储存和释放。NPY是人类和啮齿动物的中枢神经系统(CNS)中最丰富和广泛分布的肽之一，并且在与摄进食和应激相关的大脑区域中表达。在外周神经系统中，含NPY的神经元主要是感神经。PYY主要通过肠内分泌细胞合成和释放。通过内皮丝氨酸蛋白酶、二肽基肽酶IV(DPP-IV)裂解NPY和PYY产生NPY3-36和PYY3-36，其为NPY受体家族的Y2和Y5亚型的选择性配体。PP主要存在于胰岛细胞中，该细胞不同于储存胰岛素、胰高血糖素或生长激素抑素的那些。
迄今已发现五种不同的NPY受体，其中四种被理解为与人类生理机能相关。受体Y1、Y2和Y5优先地结合NPY和PYY，而Y4受体优先地结合PP。Y2和Y5受体也通过NPY3-36和PYY3-36有效地活化。一般来讲，NPY家族的配体对NPY受体亚型中的每一种具有可变选择性，以前据报道PYY3-36对Y2亚型具有适度至稳健的选择性。这些受体中的每一个通过百日咳毒素敏感的Gαi偶联以抑制腺苷酸环化酶。
PYY从内分泌L-细胞分泌以响应食物，并且尤其是在摄取脂肪之后。PYY1-36在空腹状态下占主导，其中PYY3-36是在人类膳食后存在的主要形式，具有血浆浓度与消耗的卡路里数负相关。已证实PYY3-36降低了人类、猴子、大鼠、兔和小鼠的食物摄取(Batterham RL等人的《自然》，2002年，8月8日；第418(6898)卷：第650-4页(Nature 2002 Aug 8；418(6898):650-4)；Batterham RL等人的《新英格兰医学期刊》，2003年9月4日，第349(10)卷：第941-8页(N Engl J Med 2003 Sep 4；349(10):941-8)；Challis BG等人的《生物化学与生物物理研究通讯》，2003年，11月28日；第311(4)卷：第915-9页(Biochem Biophys Res Commun2003 Nov 28；311(4):915-9))。PYY3-36的厌食效应被认为是Y2-介导的，基于在该受体中的优先结合以及在Y2-缺乏的小鼠中丧失摄食功能(Batterham RL等人的《自然》，2002年，8月8日；第418(6898)卷：第650-4页(Nature 2002 Aug 8；418(6898):650-4))。PYY3-36的弓形内注射减少了大鼠和小鼠的食物摄取(Batterham等人的《自然》，2002年，8月8日；第418(6898)卷：第650-4页(Nature 2002 Aug 8；418(6898)：650-4))，暗示下丘脑Y2受体的参与可能介导这些效应。对摄食的急性影响也已显示为转化成在ob/ob小鼠、DIO小鼠和Zuckerfa/fa小鼠中对体重的剂量依赖性效应(Pittner RA等人的《国际肥胖和相关代谢紊乱杂志》，2004年8月；第28(8)卷：第963-71页(Int J Obes relat Metab Disord 2004 Aug；28(8):963-71))。此外，PYY3–36也已显示改善了在DIO啮齿动物中胰岛素介导的葡萄糖处置和胰岛素敏感性(Vrang N等人的《美国生理调节综合与比较生理学杂志》，8月；第291(2)卷：第R367-75页(Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol Aug；291(2):R367-75)。减肥外科手术导致循环PYY-免疫性反应增加(le Roux Cw等人的《外科学年鉴》，2006年1月；第243(1)卷；第108-14页，(Ann Surg2006Jan；243(1)；108-14))，其似乎在手术后体重减轻中发挥作用。
鉴于其在哺乳动物胃肠道中控制食欲和食物摄取以及其抗分泌和促吸收效应的作用，PYY3-36可有效地治疗肥胖症和相关病症以及许多胃肠疾病。然而，PYY3-36自身作为处理剂的治疗效用受到其快速代谢和所得的短循环半衰期的限制(Torang等人的《美国生理学杂志·调节、综合和比较生理学》，第310卷：R866-R874(2016年)(Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.310:R866-R874(2016))。
因此，期望获得相对于PYY3-36具有改善的代谢稳定性和药代动力学类型的PYY类似物或其衍生物。具有在体内持久的半衰期的此类衍生物，将提供具有更大的作用持续时间的Y2受体调节，使得它们适用作需要此类调节的受试者的治疗剂。
提出上述讨论仅仅是为了提供更好地理解本领域所面对的问题的性质，并且不应以任何方式理解为对现有技术的认可，并且本文的任何参考文献的引用均不应理解为承认此类参考构成本专利申请的“现有技术”。
发明内容
在一个整体方面，本发明涉及新型抗体偶联的环状肽酪氨酸酪氨酸(PYY)化合物，其为神经肽Y2受体的调节剂。
本文提供了包含偶联到环状PYY肽的单克隆抗体或抗原结合片段的缀合物，其中该环状PYY肽由式I或其衍生物或药学上可接受的盐表示：
其中
p为0或1；
m为0、1、2、3、4或5；
n为1、2、3或4；
q为0或1；前提条件是仅当Z30不存在时，q为1；
桥为-Ph-CH2-S-、-三唑基-、-NHC(O)CH2S-、-SCH2C(O)NH-、
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S、-NHC(O)-或-CH2S-；
Z4为K、A、E、S或R；
Z7为A或K；
Z9为G或K；
Z11为D或K；
Z22为A或K；
Z23为S或K；
Z26为A或H；
Z30为L、W、不存在或K；
前提条件是仅当q为1时，Z30不存在；
Z34为
Z35为
其中所述衍生物为通过一种或多种方法修饰的式I的化合物，所述方法选自：酰胺化、糖基化、氨甲酰化、硫酸化、磷酸化、环化、脂化和聚乙二醇化。在某些实施方案中，环状PYY肽为式I的化合物或通过一种或多种方法修饰的式I的环状PYY肽的衍生物，或其药学上可接受的盐，所述方法选自：酰胺化、脂化和聚乙二醇化。
在某些实施方案中，环状PYY肽由式I或其衍生物或药学上可接受的盐表示，其中：
p为0或1；
m为0、1、2、3、4或5；
n为1、2、3或4；
q为0或1；前提条件是仅当Z30不存在时，q为1；
桥为-Ph-CH2-S-、-三唑基、-NHC(O)CH2S-、-SCH2C(O)NH2-、
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S、-NHC(O)-或-CH2S-；
Z4为K、A、E、S或R；
Z7为A或K，其中所述K的氨基侧链任选地被以下取代：
其中i为0至24的整数，并且X＝Br、I或Cl，
-C(O)CH2Br、-C(O)CH2I或-C(O)CH2Cl；
Z9为G或K，其中所述K的氨基侧链任选地被以下取代：
其中i为0至24的整数，并且X＝Br、I或Cl，
-C(O)CH2Br、-C(O)CH2I或-C(O)CH2Cl；
Z11为D或K，其中所述K的氨基侧链任选地被以下取代：
其中i为0至24的整数，并且X＝Br、I或Cl，
-C(O)CH2Br、-C(O)CH2I或-C(O)CH2Cl；
Z22为A或K，其中所述K的氨基侧链任选地被以下取代：
其中i为0至24的整数，并且X＝Br、I或Cl，
-C(O)CH2Br、-C(O)CH2I或-C(O)CH2Cl；
Z23为S或K，其中所述K的氨基侧链任选地被以下取代：
其中i为0至24的整数，并且X＝Br、I或Cl，
-C(O)CH2Br、-C(O)CH2I或-C(O)CH2Cl；
Z26为A或H；
Z30为L或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
Z34为以及
Z35为
在某些实施方案中，环状PYY肽由式I或其衍生物或药学上可接受的盐表示，其中：
p为0或1；
m为0、1、2、3或5；
N为1、2或4；
q为0或1；前提条件是仅当Z30不存在时，q可为1；
桥为-Ph-CH2-S-、-三唑基-、-NHC(O)CH2S-、-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S、-NHC(O)-或-CH2S-；
Z4为K、A、E、S或R；
Z7为A或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
Z9为G或K，
Z11为D或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
-C(O)CH2Br，
Z22为A或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
Z23为S或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
Z26为A或H，
Z30为L或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
Z34为
Z35为
在某些实施方案中，环状PYY肽选自SEQ ID NO:1、73-100和147-156，或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段经由连接基在所述环状PYY肽的赖氨酸残基处与所述环状PYY肽共价连接。例如，连接基可包括选自以下的连接基：聚乙二醇(PEG)8-三唑基-CH2CH2CO-PEG4、2-24个PEG单元的PEG链、含有2-10个碳原子的烷基链；(Gly4Ser)j，其中j＝1-4；(AlaPro)u，其中u＝1-10；以及键。
在某些实施方案中，式I中Z7、Z9、Z11、Z22和Z23中的仅一个为赖氨酸，并且所述赖氨酸经由连接基与所述单克隆抗体或其抗原结合片段的工程化半胱氨酸残基共价连接。
本发明还提供了缀合物，该缀合物包含偶联到环状PYY肽的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该缀合物包含选自SEQ ID NO:102-127的序列或其药学上可接受的盐，其中mAb表示单克隆抗体或其抗原结合片段，并且]2表示环状PYY肽中的1种或2种共价缀合到mAb。
在某些实施方案中，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3，和轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其分别具有以下的多肽序列：SEQ ID NO:141、142、143、144、145和146。在某些实施方案中，分离的单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:137的多肽序列的重链可变结构域(VH)和具有SEQ ID NO:139的多肽序列的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，分离的单克隆抗体还包含Fc部分。在某些实施方案中，分离的单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:138的多肽序列的重链(HC)和具有SEQID NO:140的多肽序列的轻链(LC)。
本发明还提供了缀合物，该缀合物包含偶联到环状PYY肽的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3，和轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO:141、142、143、144、145和146的多肽序列，优选地该单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:137的多肽序列的重链可变结构域(VH)，和具有SEQ ID NO:139的多肽序列的轻链可变结构域(VL)，并且更优选地，该单克隆抗体，具有SEQ ID NO:138的多肽序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:140的多肽序列的轻链(LC)；该环状PYY多肽包含选自以下的多肽序列：SEQ IDNO:1、73-100和147-156，或其药学上可接受的盐；以及该单克隆抗体或其抗原结合片段在所述环状PYY肽的残基7、9、11、22或23处，优选地在所述环状PYY肽的赖氨酸残基11处，直接或经由连接基缀合至所述环状PYY肽。
本发明还提供了制备本发明的缀合物的方法。该方法包括使引入该环状PYY肽的侧链，优选地该环状PYY肽的赖氨酸残基的侧链上的亲电体，优选地溴乙酰胺或马来酰亚胺，与该单克隆抗体或其抗原结合片段的SEQ ID NO:143的半胱氨酸残基的巯基基团反应，从而在该环状PYY肽和所述单克隆抗体或其抗原结合片段之间形成共价键。
本发明还提供了包含本发明的缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明提供了用于治疗或预防对其有需要的受试者的疾病或障碍的方法，其中所述疾病或障碍选自：肥胖症、I型或II型糖尿病、代谢综合征、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常、高血糖、高胰岛素血症、高甘油三酯血症、由于先天性高胰岛素血症(CHI)引起的低血糖、血脂异常、动脉粥样硬化、糖尿病肾病、以及其他心血管危险因素诸如高血压和与未管理胆固醇和/或血脂水平相关的心血管危险因素、骨质疏松症、炎症、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肾脏疾病和湿疹。该方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本发明的药物组合物。
本发明还提供了减少对其需要的受试者食物摄取的方法。该方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本发明的药物组合物。
本发明还提供了调节对其需要的受试者的Y2受体活性方法。该方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本发明的药物组合物。
在某些实施方案中，该药物组合物经由注射施用。在某些实施方案中，该药物组合物与至少一种抗糖尿病剂组合施用。该抗糖尿病剂可例如为胰高血糖素样肽-1受体调节剂。在某些实施方案中，该药物组合物与利拉鲁肽组合施用。
本发明还提供了包含本发明的缀合物，优选地还包含利拉鲁肽和用于注射的装置。
本发明还提供了制备本发明的药物组合物的方法。本发明包括将缀合物与药学上可接受的载体组合以获得药物组合物。
根据阅读以下对本发明和权利要求的详细描述，将更好地理解本发明的其他方面、特征和优点。
附图说明
结合附图进行阅读时，能够更好地理解前述发明内容和以下对本专利申请的优选实施方案的详细说明。但是，应当理解，本专利申请不限于附图中示出的精确实施方案。
图1：示出了根据本发明的实施方案的通用肽-mAb缀合策略。X表示引入到治疗肽的侧链上的亲电子试剂，诸如溴乙酰胺或马来酰亚胺，其与具有工程化到半衰期延长mAb的CDR中的Cys残基的巯基基团进行位点特异性反应，从而在肽和mAb之间形成共价键。
图2：被选择用于PH9H5_VH(SEQ ID NO:129)和PH9L3_VL(SEQ ID NO:128)中的置换的CDR残基的概述。用Cys取代的残基是加粗和带下划线的。
图3：化合物1在饮食诱导肥胖小鼠(DIO)中的药代动力学。
图4：化合物1在食蟹猴中的药代动力学。
图5：用化合物1治疗的DIO小鼠的食物摄取量：急性给药。
图6：用化合物1治疗的DIO小鼠的体重减轻：急性给药
图7：用化合物1处理的DIO小鼠的食物摄取量：慢性给药。
图8：用化合物1处理的DIO小鼠的体重减轻：慢性给药
图9：用化合物1与利拉鲁肽联合治疗的DIO小鼠的体重减轻：慢性给药
图10：展示出在利拉鲁肽开始之前3周、用利拉鲁肽治疗1周，并且在利拉鲁肽给药2周之后，每周平均食物摄取量的图。指示治疗的每周平均食物摄取量相对于3周基线平均值的百分比降低。
图11A-11D：示出了展示出化合物1与利拉鲁肽添加对肥胖恒河猴中的葡萄糖、胰岛素和甘油三酯的影响的图。图11A示出了化合物1单一疗法(PYY)和利拉鲁肽组合疗法(PYY+Lira)对葡萄糖水平的影响的图。图11B示出了化合物1单一疗法(PYY)和利拉鲁肽组合疗法(PYY+Lira)对胰岛素水平的影响的图。图11C示出了化合物1单一疗法(PYY)和利拉鲁肽组合疗法(PYY+Lira)对HOMA-IR影响的图。图11D示出了化合物1单一疗法(PYY)和利拉鲁肽组合疗法(PYY+Lira)对甘油三酯水平的影响的图。
图12A-12D：示出化合物1与利拉鲁肽添加对肥胖恒河猴中的胆固醇和肝酶的影响的图。图12A示出了化合物1单一疗法(PYY)和利拉鲁肽组合疗法(PYY+Lira)对胆固醇水平的影响的图。图12B示出了化合物1单一疗法(PYY)和利拉鲁肽组合疗法(PYY+Lira)对HDL水平的影响的图。图12C示出了化合物1单一疗法(PYY)和利拉鲁肽组合疗法(PYY+Lira)对ALT水平的影响的图。图12D示出了化合物1单一疗法(PYY)和利拉鲁肽组合疗法(PYY+Lira)对AST水平的影响的图。
具体实施方式
背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、物质、设备、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。
应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。
除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确表示，如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围内的所有单个数值，包括此类范围内的整数和该范围内的分数。
除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为指代系列中的每个元素。本领域的技术人员将会认识到、或仅使用常规实验就能够确定本文所述发明的具体实施方案的多种等同物。此类等同物旨在由本发明所涵盖。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其他变型应被理解为是指包括指定的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且是非排他性的或开放式的。例如，包含元素列表的组合物、混合物、过程、方法、制品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括这些组合物、混合物、过程、方法、制品或设备未明确列出或固有的其他元素。此外，除非明确地指明相反，否则“或”是指包括性的“或”而不是排他性的“或”。例如，条件A或B由以下任一项满足：A为真(或存在)而B为假(或不存在)，A为假(或不存在)而B为真(或存在)，以及A和B均为真(或存在)。
还应当理解，当提及优选发明的部件的尺寸或特性时，本文使用的“约”、“大约”、“大致”、“基本上”和类似的术语表示所描述的尺寸/特性不是严格的边界或参数，并且不排除在功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员所理解的。至少，包括数值参数的这种参考将包括使用本领域已接受的数学和工业原理(例如，舍入、测量或其他系统误差、制造公差等)的变化，不会改变最低有效数字。
在两个或更多个核酸或多肽序列(例如，环状PYY3-36多肽序列、抗体轻链或重链序列)的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”是指根据本公开，当使用以下序列比较算法之一或通过使用本领域已知的方法的视觉检查时，当比较和对齐以获得最大对应性时，相同的或者具有相同的氨基酸残基或核苷的特定百分比的两种或更多种序列或亚序列。
对于序列比对，通常将一个序列作为参考序列，将测试序列与其进行对比。当使用序列比对算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果必要的话)，并指定序列算法的程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数来计算对于测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比较的序列的最佳比对可例如通过Smith&Waterman的局部同源性算法进行，《高等应用数学》第2卷：第482页(1981年)(Adv.Appl.Math.2:482(1981))，通过使用Needleman&Wunsch的同源比对算法进行，《分子生物学杂志》，第48卷：第443页(1970年)(JMol.Biol.48：443(1970))，通过搜索Pearson&Lipman的相似性方法进行，《美国国家科学院院刊》，第85卷：第2444页(1988年)(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988))，通过这些算法(GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，在威斯康星州遗传学软件包，遗传学计算小组，威斯康辛州，麦迪逊，科学街区575号(575Science Dr.,Madison,WI)计算机化实施，或通过目测(大体参见，《分子生物学实验室指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等人编辑，《实验室指南》，格林尼出版协会和约翰威利父子公司的合资企业(1995年增补版)(Ausubel))。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的示例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人的(1990年)《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页(J.Mol.Biol.215:403-410)和Altschul等人的(1997年)核酸研究第25卷：第3389-3402页(Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。
两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是通过第一核酸编码的多肽与通过第二核酸编码的多肽免疫地交叉反应，如下所述。因此，多肽通常与第二多肽基本上相同，例如在两个肽的区别仅在于保守取代时。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是，两个分子在严格条件下彼此杂交，如下所述。
如本文所用，“受试者”是指任何动物，优选哺乳动物，最优选人。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于奶牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴子、人等，更优选地包括人。
就本发明方法而言，术语“施用”意指通过使用本发明的缀合物或其形式、组合物或药物来治疗性地或预防性地预防、治疗或改善本文所述的综合症、障碍或疾病的方法。此类方法包括在治疗过程中的不同时间施用有效量的所述缀合物、其形式、组合物或药物，或者以组合形式同时施用。本发明的方法应理解为涵盖所有已知的治疗性处理方案。
术语“有效量”意指在组织系统、动物或人中引起生物学反应或药物反应的活性缀合物的量，而所述生物学反应或药物反应正是研究人员、兽医、医生或其它临床医师所寻求的，包括预防、治疗或改善所治疗的综合征、障碍或疾病，或预防、治疗或改善所治疗的综合征、障碍或疾病的症状。
如本文所用，术语“组合物”旨在涵盖包含指定量的指定成分的产品，以及通过组合指定量的指定成分而直接或间接得到的任何产品。
如本文所用的，术语“偶联”是指将两个或更多个物体接合或连接在一起。当涉及化学或生物化合物时，偶联可指两种或更多种化学或生物化合物之间的共价连接。借助于非限制性示例，本发明的抗体可与目的肽偶联以形成抗体偶联肽。抗体偶联的肽可通过被涉及用于使抗体与肽缀合的特定化学反应形成。在某些实施方案中，本发明的抗体可通过连接基与本发明的肽共价连接。例如，连接基可首先与抗体或肽共价连接，然后与肽或抗体共价连接。
如本文所用，术语“连接基”是指化学模块，其包含将抗体共价附接到肽的共价链或原子链。连接基可例如，包括但不限于肽连接基、烃连接基、聚乙二醇(PEG)连接基、聚丙二醇(PPG)连接基，多糖连接基、聚酯连接基、由PEG和嵌入的杂环组成的混合连接基以及烃链。
如本文所用，术语“缀合物”是指共价偶联至药物活性部分的抗体或其片段。术语“缀合至”是指本发明的抗体或其片段经由连接基直接或间接地共价连接或共价连接至药学活性部分，优选地治疗肽。借助于非限制性示例，抗体可以为本发明的单克隆抗体，并且药物活性部分可以为治疗肽，诸如感兴趣的环状PYY肽。
本文所述的肽序列根据常用惯例书写，从而肽的N末端区域在左边，并且C末端区域在右边。虽然氨基酸的同分异构形式是已知的，但除非另外明确指明，它是所表示的氨基酸的L形式。
抗体
在一个总体方面，本发明涉及一种新型抗体，其已被工程化为非靶向的并包含半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基能够用于以位点特异性方式化学缀合(即，偶联)药物活性部分，诸如治疗肽(例如，环状PYY肽)，使得与单独的肽相比，抗体偶联的肽具有延长的/增加的半衰期。如本文所用，在抗体的上下文中，术语“非靶向”是指在体内不特异性结合到任何靶的抗体。如本文所用，“特异性地结合到靶”的抗体是指以1×10-8M或更小、优选地5×10-9M或更小、1×10-9M或更小、5×10-10M或更小、或者1×10-10M或更小的KD结合到靶抗原的抗体。术语“Kd”是指由Kd与Ka(即，Kd/Ka)的比率获得的解离常数，并且表示为摩尔浓度(M)。根据本公开，抗体的KD值可使用本领域的方法来测定。例如，抗体的KD可通过使用表面等离子体共振，诸如使用生物传感器系统(例如系统)，或通过使用生物层干涉测量技术(例如Octet RED96系统)进行测定。抗体的KD值越小，抗体与靶抗原结合的亲和力就越高。
完整的单克隆抗体或其片段可用作半衰期延长部分。单克隆抗体是已经充分研究的蛋白质，其已被利用并表征用于体内用途，因此，很好地理解能够在体内获得其延长的半衰期的机制和其在内体消除的机制。另外，单克隆抗体的两个“臂”的空间分离和展示对于治疗部分(即治疗肽)的有效二价展示可能是有利的。已经开发了毒素或其他小分子药物与单克隆抗体化学连接的治疗剂，但通常使用结合至特异性抗原并将抗体-药物缀合物靶向到感兴趣的组织/细胞的单克隆抗体，其优先表达抗原，并且通常药物/小分子以不影响抗体抗原结合的方式附接到抗体。
对于治疗性肽-mAb缀合物，不期望抗原被半衰期延长的单克隆抗体特异性结合。因此，不预期特定性结合任何靶的重链(HC)和轻链(LC)可变(V)结构域用于制备本发明的能够偶联的非靶向单克隆抗体。为了获得能够偶联的非靶向单克隆抗体，将半胱氨酸残基工程化到所选非靶向抗体的互补决定区(CDR)之一中。药物活性部分(例如治疗肽/化合物)可包含适当的化学部分，以允许药物活性部分与非靶向单克隆抗体的工程化半胱氨酸残基缀合。根据本发明的一个实施方案，肽-单克隆抗体通用缀合策略示于图1中。
如本文所用，术语“抗体”是指广义的含义，并且包括非人(例如，鼠、大鼠)、人、人适应性、人源化和嵌合单克隆抗体，抗体片段，双特异性或多特异性抗体，二聚体、四聚体或多聚体抗体，以及单链抗体。
基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。因此，本发明的抗体可包含κ或λ轻链恒定结构域。根据具体实施方案，本发明的抗体包括来自小鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除了重恒定结构域和轻恒定结构域之外，抗体还包含由轻链可变区和重链可变区组成的抗原结合区，其各自包含三个结构域(即，互补决定区1-3；(CDR1、CDR2和CDR3))。轻链可变区结构域另选地被称为LCDR1、LCDR2和LCRD3，并且重链可变区结构域另选地被称为HCDR1、HCRD2和HCDR3。
根据重链恒定结构域氨基酸序列，可将免疫球蛋白指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG是五种类型的免疫球蛋白中最稳定的，在人类中具有约23天的血清半衰期。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。四个IgG亚型中的每一个均具有不同的生物功能，被称为效应子功能。这些效应子功能一般通过与Fc受体(FcγR)相互作用或通过结合C1q并固定互补序列来介导。结合到FcγR可导致抗体依赖性细胞介导的细胞溶解，然而结合到互补因子可导致互补序列介导的细胞裂解。用于治疗性肽的延长半衰期的能力的本发明抗体不具有或具有最小的效应子功能，但保留其结合FcRn的能力，对其的结合可以是抗体具有延长的体内半衰期的主要方式。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的抗体或其抗原结合片段，其包含具有完全人Ig种系V基因序列的轻链可变区，和具有完全人Ig种系V基因序列的重链可变区，除了HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:143之外，其中该抗体或其抗原结合片段在体内不特异性地结合至任何人抗原。在一个实施方案中，本发明涉及包含分离的抗体或其抗原结合片段的缀合物，其包含具有完全人Ig种系V基因序列的轻链可变区，和具有完全人Ig种系V基因序列的重链可变区，除了HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:143和缀合于其上的药物活性部分(例如吧，本发明的环状PYY肽)之外，其中该抗体或其抗原结合片段在体内不特异性地结合至任何人抗原。在本公开中，相关于根据本发明的实施方案的抗体或其抗原结合片段，短语“包含抗体或其抗原结合片段的缀合物和缀合与其上的药物活性部分的缀合物”与短语“与药物活性部分缀合的抗体或其抗原结合片段”互换使用。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，诸如，双抗体，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定化Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定化双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单结构域抗体(sdab)和scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体、或结合至抗原但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够结合至亲本抗体或亲本抗体片段结合与之结合的相同抗原。根据具体实施方案，抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区和Fd片段(即，包括在Fab片段中的重链的部分)。根据其他具体实施方案，抗原结合片段包含Fab和F(ab')。
如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域中的常规单链抗体，其包含由约15至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单结构域抗体”是指本领域中的常规单结构域抗体，其包含重链可变区和重链恒定区或者仅包含重链可变区。
短语“分离的抗体或抗体片段”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体或抗体片段(例如，特异性地结合靶抗原的分离的抗体基本上不含不特异性结合靶抗原的抗体)。此外，分离的抗体或抗体片段可基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
抗体可变区由被三个“抗原结合位点”中断的“框架”区组成。使用不同术语来定义抗原结合位点：(i)三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)且三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)的互补决定区(CDR)是基于序列变异性(Wu和Kabat，J Exp Med 132:211-50,1970；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。(ii)“高可变区”、“HVR”或“HV”，三个在VH中(H1、H2、H3)并且三个在VL中(L1、L2、L3)是指在结构上高可变的抗体可变结构域的区域，如由Chothia和Lesk所定义的(Chothia和Lesk Mol Biol 196:901-17，1987)。其他术语包括“IMGT-CDR”(Lefranc等人，Dev Comparat Immunol 27:55-77，2003)和“特异性决定残基使用”(SDRU)(Almagro Mol Recognit 17:132-43,2004)。国际免疫遗传学(IMGT)数据库(http://www_mgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。CDR、HV和IMGT描述之间的对应关系在Lefranc等人，Dev Comparat Immunol27:55-77,2003中有所描述。
“框架”或“框架序列”是可变区的除了被定义为抗原结合位点的那些序列之外的其余序列。因为抗原结合位点可以由如上所述的各种术语定义，所以框架的精确氨基酸序列取决于如何定义抗原结合位点。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含分别具有SEQ IDNO:144、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变区和分别具有SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:143的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区。
在另一个实施方案中，分离的抗体还包含来源于人IgG4 Fc区的Fc区。与其他IgG亚型相比，人IgG4 Fc区具有降低的结合FcγR和互补因子的能力。优选地，Fc区包含具有消除效应子功能的置换的人IgG4 Fc区。因此，分离的抗体还包含Fc区，该Fc区具有包含以下置换中的一者或多者的修饰的人IgG4 Fc区：残基233处脯氨酸置换谷氨酸，残基234处丙氨酸或缬氨酸置换苯丙氨酸，残基235处丙氨酸或谷氨酸置换亮氨酸(EU编号，Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版。U.S.Dept.ofHealth and Human Services，Bethesda,Md.，NIH出版物编号91-3242)。通过在残基297处(EU编号)用Ala置换Asn来移除IgG4 Fc区中的N连接的糖基化位点是确保消除残余的效应子活性的另一种方式。
优选地，本发明的抗体作为由二硫键和各种非共价相互作用接合在一起的二聚体存在。因此，可用于本发明抗体的Fc部分可以为包含置换的人IgG4 Fc区，诸如在位置228(EU编号)处丝氨酸对脯氨酸的置换，其稳定重链二聚体形成并防止形成半-IgG4 Fc链。
在另一个实施方案中，移除重链中的C末端Lys残基，如在重组产生的单克隆抗体中所常见的。
“人抗体”是指具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中框架和抗原结合位点均来源于人起源的序列。如果所述抗体包含恒定区，则该恒定区也来源于人起源的序列。
如果人抗体的可变区来源于使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系统，则人抗体包含“来源于”人起源序列的重链可变区或轻链可变区。此类系统包括在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带如本文所述的人免疫球蛋白基因座的小鼠。在与人种系免疫球蛋白序列或重排免疫球蛋白序列进行比较时，“人抗体”可包含由于例如天然存在的体细胞突变或者在框架或抗原结合位点中特意引入置换所引起的氨基酸差异。通常，“人抗体”的氨基酸序列与由人种系或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些情况下，人抗体可包含由人框架序列分析得到的共有框架序列(例如Knappik等人，J Mol Biol296:57-86,2000中所述)；或结合到展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3(例如Shi等人，J Mol Biol 397:385-96,2010和国际专利公布WO2009/085462中所述。“人抗体”的定义中不包括抗原结合位点来源于非人物种的抗体。
分离的人源化抗体可以是合成的。虽然人抗体来源于人免疫球蛋白序列，但可使用诸如噬菌体展示的系统结合合成的CDR和/或合成的框架来生成该人抗体，或者可对其进行体外诱变以改善抗体特性，从而得到并非天然存在于体内整套人抗体种系内的抗体。
如本文所用，术语“重组抗体”包括通过重组方法制备、表达、创建或分离的所有抗体，诸如：从动物(例如，小鼠)分离的抗体，即人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体，或从其制备的杂交瘤分离的抗体；从经转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体；从重组的、组合的抗体文库分离的抗体；以及通过涉及将人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接在一起的任何其他方法制备、表达、创建或分离的抗体，或使用Fab臂交换体外生成的抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指单分子组合物的抗体分子的制剂。本发明的单克隆抗体可通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术、或通过重组DNA方法制备。例如，可通过杂交瘤制备单克隆抗体，该杂交瘤包括由转基因非人动物，诸如转基因小鼠或大鼠获得的B细胞，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
在某些实施方案中，术语“mAb”是指具有包含SEQ ID NO:137的可变重链(VH)序列和包含SEQ ID NO:139的可变轻链(VL)序列的单克隆抗体。在某些实施方案中，mAb是全人单克隆抗体，其具有包含SEQ ID NO:138的重链(HC)序列和包含SEQ ID NO:140的轻链(LC)序列。在某些实施方案中，SEQ ID NO:138的在位置446处的赖氨酸残基任选地缺失。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。轻链和重链的可变区通常对应于来源于一个物种的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)的抗体的可变区，其具有期望的特异性、亲和力和能力，然而恒定区对应于来源于另一物种的哺乳动物(例如人)的抗体序列，以避免在该物种中引起免疫应答。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指包含多个免疫球蛋白可变结构域序列的抗体，其中所述多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列具有对第一表位的结合特异性，或包含缺乏任何已知结合特异性的种系序列，并且所述多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列具有对第二表位的结合特异性或者包含缺乏任何已知结合特异性的种系序列，并且其中该第一和/或第二免疫球蛋白可变结构域任选地包含缀合的药物活性部分(例如治疗肽)。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在相同的抗原，例如相同的蛋白质(或多聚蛋白质的亚基)上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位不重叠或基本上不重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同的抗原，例如不同的蛋白质(或多聚蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，第一免疫球蛋白可变结构域和第二免疫球蛋白可变结构域包含相同的缀合的药物活性部分。在一个实施方案中，第一免疫球蛋白可变结构域和第二免疫球蛋白可变结构域包含不同的药物活性部分。在一个实施方案中，仅第一免疫球蛋白可变结构域包含缀合的药物活性部分。在一个实施方案中，仅第二免疫球蛋白可变结构域包含缀合的药物活性部分。在一个实施方案中，多特异性抗体包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体分子、三特异性抗体或四特异性抗体分子。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合不超过两个表位或两个抗原和/或包括两个缀合的药物活性部分(例如，相同或不同的药物活性部分)的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于第一免疫球蛋白可变结构域序列，其对第一表位具有结合特异性或包含缺乏任何已知结合特异性的种系序列，和第二免疫球蛋白可变结构域序列，其对第二表位具有结合特异性或包含缺乏任何已知结合特异性的种系序列，并且其中第一和/或第二免疫球蛋白可变结构域任选地包含缀合的药物活性部分。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在相同的抗原，例如相同的蛋白质(或多聚蛋白质的亚基)上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同的抗原，例如不同的蛋白质(或多聚蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，第一免疫球蛋白可变结构域和第二免疫球蛋白可变结构域包含相同的缀合的药物活性部分。在一个实施方案中，第一免疫球蛋白可变结构域和第二免疫球蛋白可变结构域包含不同的药物活性部分。在一个实施方案中，仅第一免疫球蛋白可变结构域包含缀合的药物活性部分。在一个实施方案中，仅第二免疫球蛋白可变结构域包含缀合的药物活性部分。在一个实施方案中，双特异性抗体包括第一重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，其具有对第一表位的结合特异性或包含缺乏任何已知结合特异性的种系序列，以及第二重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，其具有对第二表位的结合特异性或包含缺乏任何已知结合特异性的种系序列，并且其中该第一和/或第二重链可变结构域任选地包含缀合的药物活性部分。在一个实施方案中，第一重链可变结构域和第二重链可变结构域包含相同的缀合的药物活性部分。在一个实施方案中，第一重链可变结构域和第二重链可变结构域包含不同的缀合的药物活性部分。在一个实施方案中，仅第一重链可变结构域包含缀合的药物活性部分。在一个实施方案中，仅第二重链可变结构域包含缀合的药物活性部分。
如本文所用，“全长抗体”是指具有两条全长抗体重链和两条全长抗体轻链的抗体。全长抗体重链(HC)由众所周知的重链可变区和恒定区VH、CH1、CH2和CH3组成。全长抗体轻链(LC)由众所周知的轻链可变区和恒定区VL和CL组成。全长抗体可在一条或两条重链中缺少C-端赖氨酸(K)。
术语“Fab臂”或“半分子”是指特异性地结合抗原的一个重链-轻链对。
全长双特异性抗体可以例如使用两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(或半分子交换)通过下列方式产生：在每个半分子中的重链CH3交界处引入置换以促成两个在体外无细胞环境中或使用共表达而具有不同特异性的抗体半分子的异源二聚体形成。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3域解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键被还原。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的CH3结构域通过解离-缔合而释放和重新形成。可将Fab臂的CH3域改造成促成异源二聚化而非同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，这两个Fab臂或半分子各自可结合不同的表位。
如本文所用，关于抗体的“同源二聚化”是指具有相同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，关于抗体的“同源二聚体”是指具有含有相同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。
如本文所用，关于抗体的“异源二聚化”是指具有不同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，关于抗体的“异源二聚体”是指具有不同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。
“钮扣”策略(参见，例如PCT国际公布WO 2006/028936)可用于产生全长双特异性抗体。简而言之，在人IgG中形成CH3域的交界的选定氨基酸可在影响CH3域相互作用的位置处突变，从而促进异源二聚体形成。将具有小侧链(扣)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(钮)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“扣”的重链与具有“钮”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成钮和扣的示例性CH3置换对表示为第一重链的第一CH3域中的修饰位置/第二重链的第二CH3域中的修饰位置：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。
还可使用其它技术，诸如通过在一个CH3表面置换带正电荷的残基并在另一CH3表面置换带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化，如美国专利公布US2010/0015133；美国专利公布US2009/0182127；美国专利公布US2010/028637或美国专利公布US2011/0123532中所述。在其他策略中，可通过下面的置换(表示为第一重链的第一CH3域中的修饰位置/第二重链的第二CH3域中的修饰位置)促进异源二聚化：L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如美国专利公布US2012/0149876或美国专利公布US2013/0195849中所述。
除了上述方法之外，双特异性抗体可在无细胞环境中，通过在两个单特异性同源二聚抗体的CH3区域中导入非对称突变并由两个亲本单特异性同源二聚抗体在还原条件下形成双特异性异源二聚抗体而体外生成，该还原条件允许二硫键异构化，其根据国立专利公布WO2011/131746中所述的方法。在所述方法中，将第一单特异性二价抗体和第二单特异性二价抗体工程化为在CH3结构域处具有促进异源二聚体稳定性的某些置换；将这些抗体在足以使铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下一起温育；从而通过Fab臂交换产生双特异性抗体。温育条件最理想地可恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选为选自2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦的还原剂。例如，可使用如下条件：在至少25mM 2-MEA的存在下或至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下，在5-8的pH例如pH 7.0或pH 7.4，至少20℃的温度下，温育至少90分钟。
除非另有明确说明，否则在整个说明书中，抗体恒定区中的氨基酸残基根据EU索引进行编号，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中有所描述。
缀合物
在另一个总体方面，本发明涉及一种缀合物，其包含以位点特异性方式共价缀合到药物活性部分，诸如合成治疗肽(例如，环状PYY肽)的本发明抗体，使得与单独的肽相比，抗体偶联的肽具有延长的/增加的半衰期。本发明还涉及药物组合物及其使用方法。该缀合物可用于预防、治疗或改善疾病或障碍，例如肥胖症，2型糖尿病、代谢综合征(即综合征X)、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常葡(例如葡萄糖耐受不良)、高血糖、高胰岛素血症、高甘油三酯血症、由于先天性高胰岛素血症(CHI)引起的低血糖、血脂异常、动脉粥样硬化、糖尿病性肾脏疾病、以及其他心血管危险因素诸如高血压和与未管理胆固醇和/或血脂水平相关的心血管危险因素、骨质疏松症、炎症、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肾脏疾病和湿疹等等。
在某些实施方案中，将本发明的抗体修饰以包含至少一种半胱氨酸残基置换，其能够缀合至药物活性部分以延长/增加药物活性部分的半衰期。在某些实施方案中，所述至少一种半胱氨酸残基置换包含在抗体的互补决定区中。在某些实施方案中，所述至少一种半胱氨酸残基置换处于重链互补决定区(HCDR)中。在某些实施方案中，所述至少一种半胱氨酸残基置换处于HCDR3中，其中HCDR3包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列。在某些实施方案中，包含具有SEQ ID NO:143的氨基酸序列的HCDR3的抗体具有至少一个能够缀合到药物活性部分的附加半胱氨酸置换。
在某些实施方案中，药物活性部分可包含连接基。连接基可化学修饰以允许抗体缀合到药物活性部分。连接基可例如，包括但不限于，肽连接基、烃连接基、聚乙二醇(PEG)连接基、聚丙二醇(PPG)连接基、多糖连接基、聚酯连接基、由PEG和嵌入的杂环或烃链P组成的杂合连接基。PEG连接基可例如包含2-24个PEG单元。
在某些实施方案中，本发明的单克隆抗体缀合至感兴趣的一个、两个、三个、四个、五个或六个药物活性部分(例如一个或多个治疗肽)。在优选的实施方案中，非靶向单克隆抗体缀合至感兴趣的两个药物活性部分。在其中单克隆抗体缀合至感兴趣的至少两个药物活性部分的某些实施方案中，感兴趣的药物活性部分可以是相同的药物活性部分或可以是不同的药物活性部分。
将本发明的抗体与本发明的药物活性部分缀合的方法是本领域已知的。简而言之，本发明的抗体可用还原剂(例如TCEP(三(2-羧乙基)膦))还原、纯化(例如通过蛋白质A吸附或凝胶过滤)，并且与药物活性部分缀合(例如，通过在允许缀合的条件下向还原的抗体提供冻干肽)。在缀合反应之后，可通过离子交换色谱或疏水相互作用色谱法(HIC)，利用蛋白质A吸附的最终纯化步骤纯化缀合物。在某些实施方案中，本发明的抗体可在利用HIC方法还原之前纯化。关于缀合方法的更详细描述，参见例如实施例103和Dennler等人，Antibodies 4:197-224(2015)。
本文提供了包含偶联到环状PYY肽的单克隆抗体或抗原结合片段的缀合物，其中该环状PYY肽由式I或其衍生物或药学上可接受的盐表示：
其中
p为0或1；
m为0、1、2、3、4或5；
n为1、2、3或4；
q为0或1；前提条件是仅当Z30不存在时，q为1；
桥为-Ph-CH2-S-、-三唑基-、-NHC(O)CH2S-、-SCH2C(O)NH-、
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S、-NHC(O)-或-CH2S-；
Z4为K、A、E、S或R；
Z7为A或K；
Z9为G或K；
Z11为D或K；
Z22为A或K；
Z23为S或K；
Z26为A或H；
Z30为L、W、不存在或K；
前提条件是仅当q为1时，Z30不存在；
Z34为
Z35为
其中所述衍生物为通过一种或多种方法修饰的式I的化合物，所述方法选自：酰胺化、糖基化、氨甲酰化、硫酸化、磷酸化、环化、脂化和聚乙二醇化。
在某些实施方案中，环状PYY肽为通过一种或多种方法修饰的式I的环状PYY肽的衍生物，或其药学上可接受的盐，所述方法选自：酰胺化、脂化和聚乙二醇化。
在某些实施方案中，环状PYY肽由式I或其衍生物或药学上可接受的盐表示，其中：
p为0或1；
m为0、1、2、3、4或5；
n为1、2、3或4；
q为0或1；前提条件是仅当Z30不存在时，q为1；
桥为-Ph-CH2-S-、-三唑基-、-NHC(O)CH2S-、-SCH2C(O)NH-、
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S、-NHC(O)-或-CH2S-；
Z4为K、A、E、S或R；
Z7为A或K，其中所述K的氨基侧链任选地被以下取代：
的晶体形式，
其中i为0至24的整数，并且X＝Br、I或Cl，-C(O)CH2Br、-C(O)CH2I或-C(O)CH2Cl；Z9为G或K，其中所述K的氨基侧链任选地被以下取代：
的晶体形式，
其中t为0、1或2；
u为0或1；并且
v为14、16或18；
其中i为0至24的整数，并且X＝Br、I或Cl、-C(O)CH2Br、-C(O)CH2I或-C(O)CH2Cl；
Z11为D或K，其中所述K的氨基侧链任选地被以下取代：
其中w为0、1、2或4；
x为0或1；并且
y为14、16或18；
其中i为0至24的整数，并且X＝Br、I或Cl，
-C(O)CH2I、
-C(O)CH2Cl或-C(O)CH2Br；
Z22为A或K，其中所述K的氨基侧链任选地被以下取代：
其中i为0至24的整数，并且X＝Br、I或Cl、-C(O)CH2Br、-C(O)CH2I或-C(O)CH2Cl；
Z23为S或K；其中所述K的氨基侧链任选地被以下取代：
其中i为0至24的整数，并且X＝Br、I或Cl、-C(O)CH2Br、-C(O)CH2I或-C(O)CH2Cl；
Z26为A或H；
Z30为L、W、不存在或K，前提条件是仅当q为1时，Z30不存在，其中所述K的氨基酸链任选地被以下取代：
其中r为0、1或2；
s为0或1；并且
q为14、16或18；或
Z34为
Z35为
在某些实施方案中，环状PYY肽由式I或其衍生物或药学上可接受的盐表示，其中：
p为0或1；
m为0、1、2、3或5；
N为1、2或4；
q为0或1；前提条件是仅当Z30不存在时，q为1；
桥为-Ph-CH2-S-、-三唑基-、-NHC(O)CH2S-、-SCH2C(O)NH-、
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S、-NHC(O)-或-CH2S-；
Z4为K、A、E、S或R；
Z7为A或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
的晶体形式，
Z9为G或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
其中t为0；
u为1；并且
v为14；
Z11为D或K，其中所述K的氨基侧链任选地被以下取代：
其中w为0或4；
x为1；并且
y为14；
-C(O)CH2Br、
或Z22为A或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
Z23为S或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
Z26为A或H；
Z30为L或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
其中r为0或2；
s为1；并且
q为14、16或18；或
Z34为
Z35为
在某些实施方案中，缀合物包含缀合到环状PYY肽的单克隆抗体或其片段，其中环状PYY肽选自SEQ ID NO:1-100和SEQ ID NO:147-156。在一个优选的实施方案中，缀合物包含缀合到环状PYY肽的单克隆抗体或其片段，其中环状PYY肽选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:73-100和SEQ ID NO:147-156。
在某些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段经由连接基在所述环状PYY肽的赖氨酸残基处与所述环状PYY肽共价连接。例如，连接基可包括选自以下的连接基：聚乙二醇(PEG)8-三唑基-CH2CH2CO-PEG4、2-24个PEG单元的PEG链、含有2-10个碳原子的烷基链；(Gly4Ser)j，其中j＝1-4；(AlaPro)u，其中u＝1-10；以及键。
可使用本领域已知的方法，将根据本发明的一个实施方案的单克隆抗体或其抗原结合片段可在环状PYY的一个或多个氨基酸位置处，诸如在PYY的氨基酸残基的4、7、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、30或31处，缀合至环状PYY肽。氨基酸残基编号遵循hPYY3-36的编号。在某些实施方案中，式I中Z7、Z9、Z11、Z22和Z23中的仅一个为赖氨酸，并且所述赖氨酸经由连接基与所述单克隆抗体或其抗原结合片段的工程化半胱氨酸残基共价连接。在一个优选的实施方案中，根据本发明实施方案的单克隆抗体或其抗原结合片段与环状PYY肽在该环状PYY的残基11处缀合。在另一个优选的实施方案中，将亲电体，诸如溴乙酰胺或马来酰亚胺在环状PYY的残基11处引入环状PYY的侧链中，诸如赖氨酸的氨基侧链中，并且亲电体与工程化到单克隆抗体或其片段的CDR(优选地HCDR3)中的Cys残基的巯基基团位点特异性反应，从而在环状PYY肽和单克隆抗体或其片段之间形成共价键。更优选地，环状PYY肽选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:73-100和SEQ ID NO:147-156。在一个实施方案中，将亲电体直接引入环状PYY的侧链上。在另一个实施方案中，经由连接基将亲电体间接引入环状PYY的侧链上。
本发明还提供了包含本发明的缀合物并且还包含药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明还提供了包含偶联到环状PYY肽的单克隆抗体或其抗原结合片段的缀合物，其中该缀合物分别由式IIIa-b、IVa-b、Va-b和/或VIa-b表示。
在式IIIa-b、IVa-b、Va-b和VIa-b中，
x可例如为1、2、3、4、5或6，优选地为2。
连接1可例如为G、βA、-COCH2OCH2CH2OCH2CH2NH-、γ-氨基丁酰基、GG、-CO(CH2)mSCH2-(前提条件是当连接2＝-NH-，m＝1，2时)或键；
连接2可例如为–CH2-、苄基、乙基三唑基、-NH-或键；
n可例如为1、2或3；
X可例如为–S-或–CH2-；
Z3可例如为I或键；
Z4可例如为K、S或R；
Z30可例如为L、W、K(mPEG16)、或K(mPEG12)；
Z34可例如为Q，其中所述Q在α-酰胺氮上任选地N-甲基化，
Z35可例如为R，其中所述R在α-酰胺氮上任选地N-甲基化，或者将R脱羰基，从而产生psi-(Z35Z36)酰胺键，或者R在α-酰胺氮上N-甲基化和脱羰基，从而产生psi-(Z35Z36)酰胺键；
Z36可例如为Y(Tyr)、Cha(β-环己基丙氨酸)、Aic(2-氨基茚满-2-羧酸)或F(Phe)，其中所述F任选地被氟(4-F-Phe)、氯(4-Cl-Phe)、溴(4-Br-Phe)、碘(4-I-Phe)、氨基(4-NH2-Phe)对位取代；并且
连接3可例如包含对赖氨酸侧链的以下酰胺化中的任一种：(PEG)8-三唑基-CH2CH2CO-PEG4(包括)、2-24个PEG单元的PEG链(包括)、含有2-10个碳原子的烷基链(包括)、其中j＝1-4的(Gly4Ser)j、其中u＝1-10的(AlaPro)u，或者–NH-连接3-可被键取代。
本发明还提供了一种缀合物，该缀合物包含经由连接基(L)偶联到环状PYY肽(cPYY)的单克隆抗体或其抗原结合片段(mAb)：cPYY-L]2-mAb，其中该缀合物包含选自SEQID NO:102-127的环状PYY序列或其药学上可接受的盐，其中mAb表示根据本发明的实施方案的单克隆抗体或其抗原结合片段，并且]2表示环状PYY肽中的1种或2种共价缀合到mAb。
本文还提供了PYY的N末端至侧链环状类似物，其表现出与人PYY3-36(hPYY3-36)的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。作为测定两种类似物之间的序列同一性的方法的示例，将两种肽
(SEQ ID 1)和hPYY3-36
(SEQ ID NO:101)
进行比对。类似物相对于hPYY(3-36)的序列同一性通过比对残基的总数减去不同残基的数目(即，比对的相同残基的数目)除以hPYY3-36中的残基总数来给出。在该示例中，不同的残基为D11，其已经被交换为取代的K11，然后进行V31，其已经被交换为hC31，并且最后R35已被脱羰基。因此，在所述示例中，序列同一性为(34-3)/34×100。
环状PYY肽
PYY3-36是由肠末端的L细胞分泌的内源激素，其充当Y2受体的激动剂以抑制食物摄取。鉴于其在哺乳动物胃肠道中控制食欲和食物摄取以及其抗分泌和促吸收效应的作用，PYY3-36可有效地治疗肥胖症和相关病症以及许多胃肠疾病。然而，PYY3–36自身作为处理剂的治疗效用受到其快速代谢和短循环半衰期的限制。因此，本发明一般涉及修饰的PYY3–36缀合物，其延长了PYY3–36肽的半衰期并降低了肽在体内的代谢。
在本发明的某些实施方案中，修饰的PYY3–36肽为环状PYY肽。术语“环状PYY肽”，“环状PYY3–36类似物”和“环状PYY3–36肽类似物”可互换使用。可用于缀合物中的环状PYY肽的示例描述于2016年10月27日提交的美国专利申请62/413,613和与该申请同一天提交的名称为“Cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulators of neuropeptidereceptors”的美国专利申请______(代理人案卷号PRD3411)中，两个专利申请全文以引用方式并入本文中。
如本文所用，术语“NTSC-PYY”旨在描述PYY的N-末端至侧链环状类似物。
本文所述的肽序列根据通常的惯例书写，其中肽的N-末端区域在左侧，并且C-末端区域在右侧。虽然氨基酸的同分异构形式是已知的，但除非另外明确指明，它是所表示的氨基酸的L形式。为了方便描述本发明的分子，使用了对于各种氨基酸(单个和三个字母代码两者)和功能部分的常规和非常规缩写。这些缩写为本领域技术人员所熟悉，但为清楚起见，如下列出：A＝Ala＝丙氨酸；R＝Arg＝精氨酸；N＝Asn＝天冬酰胺；D＝Asp＝天冬氨酸；βA＝βAla＝β-丙氨酸；C＝Cys＝半胱氨酸；hC＝hCys＝同型半胱氨酸；E＝Glu＝谷氨酸；Q＝Gln＝谷氨酸；G＝Gly＝甘氨酸；H＝His＝组氨酸；I＝Ile＝异亮氨酸；L＝Leu＝亮氨酸；K＝Lys＝赖氨酸；Nle＝正亮氨酸；F＝Phe＝苯丙氨酸；P＝Pro＝脯氨酸；S＝Ser＝丝氨酸；T＝Thr＝苏氨酸；W＝Trp＝色氨酸；Y＝Tyr＝酪氨酸和V＝Val＝缬氨酸。
为方便起见，用于命名本发明的NTSC-PYY肽的氨基酸残基编号惯例遵循hPYY3-36的。已引入NTSC-PYY肽中的特定氨基酸置换相对于hPYY3-36中相应位置处的天然残基，由适当的氨基酸代码指示，之后是置换的位置。因此，NTSC-PYY肽中的“S4”是指其中丝氨酸已置换了hPYY3-36的相应的天然lys4残基的肽。相似地，NTSC-PYY肽中的“hC31”是指其中同型半胱氨酸已置换了hPYY3-36的相应的天然val31残基的肽。根据该惯例，描述了发生在NTSC-PYY肽内的另外的氨基酸置换，并且将同样地被本领域的技术人员认识到。
为方便起见，用于本发明的NTSC-PYY肽的命名惯例将循环中所涉及的氨基酸残基连同介于它们之间的连接基团，从循环中所涉及的N-末端残基开始，以左到右的方向结合。在所有情况下，循环的N-末端氨基酸残基以其α-氨基官能团连接至连接基团，所述连接基团继而连接至NTSC-PYY肽的位置31处的氨基酸侧链残基。因此，“环-(I3-m-COPhCH2-hC31)”用于描述NTSC-PYY肽的循环，其中Ile3的α-氨基官能团用间甲基苯甲酸残基酰化，其甲基基团通过硫醚键进一步连接至hCys31残基的侧链。类似地，“环-(K4-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31)”用来描述NTSC-PYY肽的循环，其中天然Ile3残基已被删除，并且其(现在的N-末端)lys4的α-氨基官能团通过3-乙酰胺基丙酰基酰化，其乙酰氨基亚甲基碳经由硫醚键连接至hCys31残基的侧链。
赖氨酸残基可结合在hPYY3-36序列的各种位置以提供方便的功能性柄部用于进一步衍生。赖氨酸残基可被修饰成直接或间接地偶联至单克隆抗体。在与单克隆抗体的间接偶联中，可修饰赖氨酸残基以包含连接基，该连接基将允许环状PYY肽偶联到单克隆抗体。本领域的技术人员将认识到，相关的直系同源物也可如此有效地使用，并且在本文中是预期的。
出现在肽序列中的术语“K(γ-Glu)”表示其侧链ε-氨基已被谷氨酸的γ-羧基酰化的赖氨酰残基。
术语“K(γ-Glu-Pal(棕榈酰))”表示其侧链ε-氨基已被N-十六烷-1-酰基谷氨酸的γ-羧基酰化的赖氨酰残基。
术语“K(γ-Glu-Stear(硬脂酰))”表示其侧链ε-氨基已被N-十八烷-1-酰基谷氨酸的γ-羧基酰化的赖氨酰残基。
术语“K(γ-Glu-Arach(花生酰)”表示其侧链ε-氨基已被N-十二烷-1-酰基谷氨酸的γ-羧基酰化的赖氨酰残基。
术语“K(OEG)(8-氨基-3,6-二氧杂辛酰基)”表示其侧链ε-氨基已被8-氨基-3,6-二氧杂辛酸酰化的赖氨酰残基。
术语“(OEG)2”表示通过酰胺键(即，17-氨基-10-氧代-3,6,12,15-四氧杂-9-氮杂十七烷酸)连续连接在一起的两个OEG单元。
术语“K(OEG)2”表示其侧链ε-氨基已被17-氨基-10-氧代-3,6,12,15-四氧杂-9-氮杂十七烷酸酰化的赖氨酰残基。
术语“K((OEG)2-γ-Glu”表示其侧链ε-氨基已通过(22S)-22-氨基-10,19-二氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18-二氮杂二十三碳二酸，经由其1-羧酸官能团酰化的赖氨酰残基。
术语“K((OEG)2-γ-Glu-Stear”表示其侧链ε-氨基已通过(22S)-10,19-二氧代-22-硬脂酰胺-3,6,12,15-四氧杂-9,18-二氮杂二十三碳二酸，经由其1-羧酸官能团酰化的赖氨酰残基。
术语“K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)”表示其侧链ε-氨基基团已经通过(21S)-9,18,23-三氧代-2,5,11,14-四氧杂-8,17,22-三氮杂三十九烷-1,21,39-三羧酸，经由其1-羧酸官能团酰化的赖氨酰残基。
相似地，术语“K((OEG)2-γ-Glu-COC18CO2H)”表示其侧链ε-氨基已通过(21S)-9,18,23-三氧代-2,5,11,14-四氧杂-8,17,22-三氮杂四十一烷-1,21,41-三羧酸，经由其1-羧酸官能团酰化的赖氨酰残基。
术语“K((OEG)2-COC16CO2H)”表示其侧链ε-氨基已通过10,19-二氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18-二氮杂三十六烷二酸，经由其1-羧酸官能团酰化的赖氨酰残基。
术语“K(PEG24-AcBr)”表示其侧链ε-氨基已通过N-溴乙酰-75-氨基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73-二十四氧杂七十五烷酸，经由其1-羧酸官能团酰化的赖氨酰残基。
术语“K(PEG12-AcBr)”表示其侧链ε-氨基已通过N-溴乙酰-39-氨基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂三十九烷酸，经由其1-羧酸官能团酰化的赖氨酰残基。
术语“K(PEG6-AcBr)”表示其侧链ε-氨基已通过N-溴乙酰-3-[(17-氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1-基)氧]丙酸，经由其1-羧酸官能团酰化的赖氨酰残基。
术语“K(PEG8-三唑基-CH2CH2CO-PEG4-AcBr)”表示其侧链ε-氨基已通过27-[4-[2-[3-[2-[2-[3-(N-溴乙酰氨基)丙氧基]乙氧基]乙氧基]丙基氨基羰基]乙基]四唑-1-基]-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂二十七烷酸，经由其1-羧酸官能团酰化的赖氨酰残基。
术语“K(mPEG16)”表示其侧链ε-氨基已通过4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49-十六氧杂五十烷酸，经由其1-羧酸官能团酰化的赖氨酰残基。
术语“K(mPEG12)”表示其侧链ε-氨基已通过4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-十二氧杂三十八烷酸，经由其1-羧酸官能团酰化的赖氨酰残基。
术语“VitE”代表分子中的α-生育酚基单元。
术语“AcVitE”表示其酚基带有醚连接的甲烯基羧基官能团的α-生育酚基单元。
术语“K-γ-Glu-AcVitE”表示其侧链ε-氨基基团已经通过(2-(((2R)-2,5,7,8-四甲基-2-((4R,8R)-4,8,12-三甲基十三烷基)苯并二氢吡喃-6-基)氧基)乙酰基)-L-谷氨酸，经由其γ-羧酸官能团酰化的赖氨酰残基。
本发明的许多化合物/缀合物在序列的C末端残基Y36与其相邻残基R35之间掺入还原的酰胺键。该减少的酰胺键由术语“psi-(R35,Y36)”表示。
包含本发明某些序列的各种氨基酸残基包含已甲基化的α-氨基。因此，术语“N-Me-Q34”或“N-Me-R35”分别表示在序列的位置34处的α-N-甲基化谷氨酰胺和在序列的位置35处的α-N-甲基化精氨酸。
序列描述中的术语“N-Me-Q34,psi-(R35,Y36)”是指包含在位置34处的α-甲基谷氨酰胺残基以及介于残基R35和Y36之间的减少的酰胺键两者的序列。
相似地，序列描述中的术语“N-Me-R35,psi-(R35,Y36)”是指包含在位置35处的α-甲基精氨酸残基以及介于该残基和Y36之间的减少的酰胺键两者的序列。
半衰期延长部分
除了本发明的抗体或其抗原结合片段之外，本发明的缀合物可结合一个或多个其他部分，用于例如经由共价相互作用延长药物活性部分(例如，环状PYY肽)的半衰期。示例性的其他半衰期延长部分包括但不限于白蛋白、白蛋白变体、白蛋白-结合蛋白和/或结构域、转铁蛋白及其片段和类似物。可结合到本发明的缀合物中的附加半衰期延长部分包括例如，聚乙二醇(PEG)分子，诸如PEG5000或PEG20,000；不同链长的脂肪酸和脂肪酸酯，例如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯、花生酸酯、二十二烷酸酯、油酸酯、花生四烯酸、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等、聚赖氨酸、辛烷、碳水化合物(右旋糖酐、纤维素、寡糖或多糖)，以便获得期望的特性。这些部分可与蛋白质支架编码序列直接融合并且可通过标准的克隆和表达技术产生。另选地，熟知的化学偶联方法可用于将这些部分连接到本发明的重组制备和化学制备的缀合物。
可通过使用熟知的方法将半胱氨酸残基结合到分子的C-末端并将pegyl基团附接到半胱氨酸来将pegyl部分例如添加到本发明的肽分子。
可通过多种熟知的测定法来比较结合附加部分的本发明的肽分子的功能性。例如，单独或在根据本发明的缀合物中的感兴趣的治疗肽的生物或药代动力学活性可使用已知的体外或体内测定法测定并比较。
药物组合物
在另一个总的方面，本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含本发明的缀合物和化合物以及药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药物组合物”意指包含本发明的缀合物和药学上可接受的载体的产品。本发明的缀合物和化合物以及包含它们的组合物还可用于制造用于本文所述的治疗应用的药物。
如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知的用于药物制剂的其他材料。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。根据本公开，根据具体实施方案，适用于抗体药物组合物的任何药学上可接受的载体均可用于本发明。
在本发明中使用的药学上可接受的酸式盐/阴离子盐包括且不限于乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、对羟乙酰氨基苯胂酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘液酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐和三乙碘化物。有机酸或无机酸还包括且不限于氢碘酸、过氯酸、硫酸、磷酸、丙酸、乙醇酸、甲磺酸、羟基乙磺酸、草酸、2-萘磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、糖精酸或三氟乙酸。
药学上可接受的碱盐/阳离子盐包括不限于铝、2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇(也已知为三(羟甲基)氨基甲烷、氨基丁三醇或“TRIS”)、氨、苄星青霉素、叔丁胺、氯普鲁卡因、胆碱、环己胺、二乙醇胺、乙二胺、锂、L-赖氨酸、镁、葡甲胺、N-甲基-D-葡糖胺、哌啶、钾、普鲁卡因、奎宁、钠、三乙醇胺或锌。
在本发明的一些实施方案中，本发明提供了药物制剂，该药物制剂包含量为约0.001mg/ml至约100mg/ml、约0.01mg/ml至约50mg/ml、或约0.1mg/ml至约25mg/ml的本发明缀合物。该药物制剂具有约3.0至约10，例如约3至约7、或约5至约9的pH。所述制剂还可包含至少一种选自以下的成分：缓冲体系、一种或多种防腐剂、一种或多种张度剂、一种或多种螯合剂、一种或多种稳定剂和一种或多种表面活性剂。
用药学上可接受的载体配制药物活性成分是本领域已知的，例如Remington：《药学的科学和实践》(The Science and Practice of Pharmacy)(例如第21版(2005年)，以及任何以后的版本)。附加成分的非限制性示例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张度调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种药学上可接受的载体可用于配制本发明的药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物为液体制剂。液体制剂的一个优选示例为水性制剂，即包含水的制剂。液体制剂可包含溶液、悬浮液、乳液、微乳液、凝胶等等。水性制剂通常包含至少50％w/w的水，或至少60％w/w、70％w/w、75％w/w、80％w/w、85％w/w、90％w/w或至少95％w/w的水。
在一个实施方案中，可将药物组合物配制为可注射的，其可例如经由注射装置(例如，注射器或输液泵)注射。注射可例如皮下、肌内、腹膜内或静脉内递送。
在另一个实施方案中，药物组合物为固体制剂，例如冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，其可按原样使用，或在使用前由医师或患者添加溶剂和/或稀释剂。固体剂型可包括片剂，诸如压片和/或包衣片，以及胶囊剂(例如硬明胶胶囊或软明胶胶囊)。药物组合物也可为例如用于重构的小药囊、糖衣丸、粉末、颗粒剂、锭剂或粉末的形式。
剂型可为速释型，在这种情况下它们可包含水可溶或水可分散的载体，或者它们可被延迟释放、缓释或改变释放，在这种情况下它们可包含在胃肠道中调节剂型的溶解速率的水不溶的聚合物。
在其他实施方案中，药物组合物可在鼻内、颊内或舌下递送。
水性制剂中的pH可介于pH 3和pH 10之间。在本发明的一个实施方案中，制剂的pH为约7.0至约9.5。在本发明的另一个实施方案中，制剂的pH为约3.0至约7.0。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含缓冲剂。缓冲剂的非限制性示例包括：精氨酸、天冬氨酸、二羟乙基甘氨酸、柠檬酸盐、磷酸氢二钠、富马酸、甘氨酸、双甘氨肽、组氨酸、赖氨酸、马来酸、苹果酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、琥珀酸盐、酒石酸、三嗪和三(羟甲基)氨基甲烷、以及它们的混合物。缓冲剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定缓冲剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含防腐剂。缓冲剂的非限制性示例包括：苄索氯铵、苯甲酸、苄醇、溴代硝基丙二醇、4-羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、氯甲酚、氯己啶、氯苯甘油醚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、4-羟基苯甲酸乙酯、咪脲、4-羟基苯甲酸甲酯、苯酚、2-苯氧基乙醇、2-苯基乙醇、4-羟基苯甲酸丙酯、脱氢乙酸钠、硫柳汞以及它们的混合物。防腐剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定防腐剂中的每一种的药物组合物构成本发明可供选择的实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含等渗剂。该实施方案的非限制性示例包括盐(诸如氯化钠)、氨基酸(诸如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸)、糖醇(诸如甘油、1,2-丙二醇、丙二醇)、1,3-丙二醇和1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如，PEG400)以及它们的混合物。等渗剂的另一个示例包括糖。糖的非限制性示例可以是单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、α和β-HPCD、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。等渗剂的另一个示例是糖醇，其中术语“糖醇”被定义为具有至少一个—OH基团的C(4-8)烃。糖醇的非限制性示例包括甘露糖醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、己六醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。包含本段中列出的每种等渗剂的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。等渗剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定等渗剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含螯合剂。螯合剂的非限制性示例包括柠檬酸、天冬氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)的盐、以及它们的混合物。螯合剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定螯合剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含稳定剂。稳定剂的非限制性示例包括一种或多种聚集抑制剂、一种或多种氧化抑制剂、一种或多种表面活性剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。
在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含稳定剂，其中所述稳定剂为羧基-/羟基纤维素及其衍生物(诸如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、2-甲基硫基乙醇、聚乙二醇(诸如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮、盐(诸如氯化钠)、含硫的物质，诸如硫代甘油或巯基乙酸。稳定剂可单独存在或在聚集体中以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定稳定剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种表面活性剂，优选一种表面活性剂、至少一种表面活性剂或两种不同的表面活性剂。术语“表面活性剂”是指任何由水溶性部分(亲水性)和脂溶性和部分(亲脂性)组成的分子或离子。表面活性剂可例如选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。表面活性剂可单独存在或在聚集体中以约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定表面活性剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种蛋白酶抑制剂，诸如例如EDTA和/或苯甲脒盐酸盐(HCl)。蛋白酶抑制剂可单独存在或在聚集体中以约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定蛋白酶抑制剂中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
本发明的药物组合物可包含一定量的，足以在组合物储存期间减少多肽的聚集形成的氨基酸碱基。术语“氨基酸碱基”是指一种或多种氨基酸(诸如甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)或它们的类似物。任何氨基酸可以其游离碱形式或其盐形式存在。可以存在氨基酸碱基的任何立体异构体(即L、D或它们的混合物)。氨基酸碱基可单独存在或与其他氨基酸碱基组合，以约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml的浓度存在。包含这些特定氨基酸碱基中的每一种的药物组合物构成本发明的可供选择的实施方案。
对于本领域的技术人员还将显而易见的是，本发明的缀合物或其药物组合物的治疗有效剂量将根据期望的效果而变化。因此，本领域技术人员可容易地确定待施用的最佳剂量，并且最佳剂量将随所使用的具体缀合物、给药方式、制剂强度和疾病状况的进展而变化。另外，与接受治疗的具体受治疗者相关的因素，包括受治疗者年龄、体重、饮食和给药时间，将导致需要将剂量调整至适当的治疗水平。
适应症，本发明的缀合物优选以单一剂量或分开剂量(例如，单一剂量可分成2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚剂量)，以每天约1μg至约5mg的剂量，或以每剂量约0.01μg/kg至约500μg/kg，更优选地约0.05μg/kg至约250μg/kg，最优选地低于约50μg/kg外周施用。当然，这些范围内的剂量将随每种激动剂的效能而变化，并且易于由本领域的技术人员确定。因此，上述剂量为一般情况的示例。当然，可能会存在其中应使用较高或较低剂量范围的个别情况，并且这类情况也在本发明的范围内。
在某些实施方案中，本发明的缀合物以约1μg至约5mg的剂量，或以约0.01μg/kg至约500μg/kg的剂量，更优选地以约0.05μg/kg至约250μg/kg的剂量，最优选地以低于约50μg/kg的剂量，与以约1μg至约5mg的剂量，或以约0.01μg/kg至约500μg/kg的剂量，更优选地以约0.05μg/kg至约250μg/kg的剂量，最优选地以低于约50μg/kg的剂量的第二治疗剂(例如，利拉鲁肽)一起施用。
本发明的缀合物的药学上可接受的盐包括由无机或有机的酸或碱形成的常规无毒盐或季铵盐。此类酸加成盐的示例包括乙酸盐、己二酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、十二烷基硫酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、草酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐和酒石酸盐。碱盐包括铵盐、碱金属盐诸如钠盐和钾盐、碱土金属盐诸如钙盐和镁盐、有机碱盐诸如二环己胺盐以及氨基酸诸如精氨酸的盐。另外，可以将碱性含氮基团用例如烷基卤进行季铵化。
本发明的药物组合物可以通过能实现其预期目的的任何方式施用。示例包括通过肠胃外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、透皮、口腔或眼等途径给药。可通过口服途径给药。适用于肠胃外给药的制剂包括水溶性形式的活性缀合物(例如，水溶性盐)的水溶液、酸性溶液、碱性溶液、右旋糖水溶液、等渗碳水化合物溶液以及环糊精包合配合物。
本发明还涵盖一种制备药物组合物的方法，该方法包括将药学上可接受的载体与本发明缀合物中的任一种混合。另外，本发明包括通过将一种或多种药学上可接受的载体与本发明缀合物中的任一种混合而制备的药物组合物。
此外，本发明的缀合物可具有一种或多种多晶型物或无定形结晶形式，并因此旨在被包括在本发明的范围内。此外，该缀合物可以与例如水形成溶剂化物(即水合物)或与常用有机溶剂形成溶剂化物。本文所用的术语“溶剂化物”意指本发明的缀合物与一个或多个溶剂分子的物理缔合。该物理缔合涉及不同程度的离子键合和共价键合，包括氢键合。在某些情况下，溶剂化物将能够在例如一个或多个溶剂分子掺入在结晶固体的晶格中时分离出来。术语“溶剂化物”旨在既涵盖溶液相溶剂化物又涵盖可分离的溶剂化物。合适的溶剂化物的非限制性示例包括乙醇化物、甲醇化物等。
本发明旨在将本发明缀合物的多晶型物和溶剂化物包括在其范围内。因此，在本发明的治疗方法中，术语“施用”应涵盖用于利用本发明的缀合物或者其多晶型物或溶剂化物治疗、改善或预防本文所述的综合征、障碍或疾病的方法，其虽然没有被具体公开，但将明显包括在本发明的范围之内。
在另一个实施方案中，本发明涉及用作药物的本发明的缀合物。
本发明在其范围内包括本发明缀合物的前药。一般来讲，此类前药将是该缀合物的功能衍生物，其可容易地在体内转化成所需的缀合物。因此，在本发明的治疗的方法中，术语“施用”应涵盖使用具体公开的缀合物或未具体公开的缀合物来治疗所述的多种障碍，而该未具体公开的缀合物可在向患者施用后，在体内转化为指定缀合物。选择和制备适宜前药衍生物的常规方法描述于例如“Design of Prodrugs”H.Bundgaard编辑，Elsevier,1985中。
此外，在本发明的范围内，任何元素(尤其是当针对本发明的缀合物而提及时)意在应当以其天然丰度或以其同位素富集形式而包含所述元素的全部同位素或同位素混合物(天然存在的或合成制备的)。例如，对氢的标引在其范围内包括1H、2H(D)和3H(T)。相似地，对碳和氧的标引在其范围内分别包括12C、13C和14C以及16O和18O。所述同位素可为放射性的或非放射性的。本发明的放射性标记缀合物可包含选自3H、11C、18F、122I、123I、125I、131I、75Br、76Br、77Br和82Br的放射性同位素。优选地，放射性同位素选自3H、11C和18F。
本发明的一些缀合物可以阻转异构体的形式存在。阻转异构体为由围绕单键受阻旋转而获得的立体异构体，其中旋转的空间应变阻隔足够高，以使得构象异构体分离。应当理解，所有此类构象异构体以及它们的混合物涵盖于本发明的范围内。
当根据本发明的缀合物具有至少一个立体中心时，它们可作为对映异构体或非对映异构体相应地存在。应当理解，所有的此类异构体及其混合物涵盖在本发明的范围内。
如果用于制备根据本发明的缀合物的方法产生立体异构体的混合物，则这些异构体可通过常规技术如制备色谱来分离。所述缀合物可以外消旋形式制备，或者可通过对映体特异性合成或通过拆分来制备单独的对映体。例如，可通过标准技术，如通过与光学活性酸(诸如(-)-二对甲苯酰-D-酒石酸和/或(+)-二对甲苯酰-L-酒石酸)形成盐来形成非对映体对，然后分级结晶并再生游离碱，来将缀合物拆分成它们的组分对映体。所述缀合物也可通过形成非对映体酯或酰胺，然后进行色谱分离并除去手性助剂来拆分。另选地，所述缀合物可使用手性柱经由高效液相色谱法(HPLC)或SFC来拆分。在一些情况下，可存在缀合物的旋转异构体，其可通过1H NMR观察，从而导致在1HNMR光谱中复杂的多重峰和峰一体化。
在用于制备本发明的缀合物的任何方法中，可能必需和/或期望保护任何有关分子中的敏感基团或反应性基团。这可通过常规保护基团来实现，诸如《有机合成中的保护性基团》，J.F.W.McOmie编辑，普莱纽姆出版社，1973年；(Protective Groups in OrganicChemistry,ed.J.F.W.McOmie,Plenum Press,1973；和T.W.Greene&P.G.M.Wuts的，《有机合成中的保护性基团》，约翰威利父子公司，1991年(Protective Groups in OrganicSynthesis,John Wiley&Sons,1991)，这些文献各自以引用方式全文并入本文以用于所有目的。可使用本领域已知的方法在方便的后续阶段除去保护基团。
使用方法
本发明涉及用于预防、治疗或改善对其有需要的受试者中的Y2受体介导的综合症、障碍或疾病的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本发明的缀合物、化合物或药物组合物。
本发明涉及用于预防、治疗或改善对其有需要的受试者中的障碍、疾病或病症的开始或改善所述障碍、疾病或病症的任一种或多种症状的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本发明的缀合物、化合物或药物组合物。
根据具体实施方案，该障碍或病症选自：肥胖症、I型或II型糖尿病、代谢综合征(即综合征X)、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常葡(例如葡萄糖耐受不良)、高血糖、高胰岛素血症、高甘油三酯血症、由于先天性高胰岛素血症(CHI)引起的低血糖、血脂异常、动脉粥样硬化、糖尿病性肾脏疾病、以及其他心血管危险因素诸如高血压和与未管理胆固醇和/或血脂水平相关的心血管危险因素、骨质疏松症、炎症、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肾脏疾病和/或湿疹。
根据具体实施方案，治疗有效量是指足以实现以下效应中的一者、两者、三者、四者、或更多者的治疗量：(i)减少或改善所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的严重性；(ii)减少所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的持续时间；(iii)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状发展；(iv)引起所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状消退；(v)防止所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状发展或发作；(vi)防止所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状复发；(vii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的住院治疗；(viii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的住院时间；(ix)提高患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的存活；(xi)抑制或减少受试者中所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。
治疗有效量或剂量可根据各种因素而变化，诸如所治疗的疾病、障碍或病症、给药方式、靶位点、受试者的生理状态(包括例如年龄、体重、健康)，无论受试者是人还是动物，施用的其他药物，并且无论治疗是预防性还是治疗性的。最佳地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
如本文所用，术语“治疗”和“处理”均旨在意指与疾病、障碍或病症有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，其不一定是受试者中可识别的，但能够在受试者中识别。术语“处理”和“治疗”也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、障碍或病症发展。在一个具体实施方案中，“治疗”、“处理”和“疗法”是指减轻、预防发展或发作，或缩短与疾病、障碍或病症相关的一种或多种症状的持续时间。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指防止疾病、障碍或病症的复发。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指患有疾病、障碍或病症的受试者的存活提高。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指受试者中疾病、障碍或病症的消除。
在一个实施方案中，本发明涉及用于预防、治疗或延迟对其有需要的受试者中的肥胖症的开始，或改善肥胖症，或肥胖症的任一种或多种症状，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本发明的缀合物、化合物或药物组合物。在一些实施方案中，在施用任何本文所述的本发明的缀合物、化合物、药物组合物、形式或药物之前，相对于受试者的体重，或相比于没有接受任何本文所述的本发明的缀合物、组合物、形式、药物或组合的对照受试者，受试者的体重降低，例如介于约0.01％至约0.1％之间，介于约0.1％至约0.5％之间，介于约0.5％至约1％之间，介于约1％至约5％之间，介于约2％至约3％之间，介于约5％至约10％之间，介于约10％至约15％之间，介于约15％至约20％之间，介于约20％至约25％之间，介于约25％至约30％之间，介于约30％至约35％之间，介于约35％至约40％之间，介于约40％至约45％之间或介于约45％至约50％之间。
在一些实施方案中，在体重上的降低持续例如约1周、约2周、约3周、约1月、约2月、约3月、约4月、约5月、约6月、约7月、约8月、约9月、约10月、约11月、约1年、约1.5年、约2年、约2.5年、约3年、约3.5年、约4年、约4.5年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约15年或约20年。
本发明提供方一种用于预防、治疗、延迟对其有需要的受试者的综合征、障碍或疾病的开始，或改善该综合征、障碍或疾病，或所述综合征、障碍或疾病的任一种或多种症状的方法，其中所述综合征、障碍或疾病选自：肥胖症、I型或II型糖尿病、代谢综合征(即，综合征X)、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常(例如，葡萄糖不耐受)、高血糖、高胰岛素血症、高甘油三酯血症、由于先天性高胰岛素血症(CHI)引起的低血糖、血脂异常、动脉粥样硬化、糖尿病肾病、以及其他心血管危险因素诸如高血压和与未管理胆固醇和/或血脂水平相关的心血管危险因素、骨质疏松症、炎症、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肾脏疾病和湿疹，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本发明的缀合物、化合物或药物组合物。
如本文所用，代谢综合征是指具有下列中任一种或多种的受试者：高血糖(例如，高空腹血糖)、高血压、胆固醇水平异常(例如，低HDL水平)、甘油三酯水平异常(例如，高甘油三酯)、大腰围(即腰围)、腹部脂肪增加、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、C-反应性蛋白水平升高(即促炎症状态)、以及血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1和纤维蛋白原水平(即，促血栓形成状态)增加。
本发明涉及一种减少对其有需要的受试者的食物摄取的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本发明的缀合物、化合物或药物组合物。在一些实施方案中，在施用任何本文所述的本发明的缀合物、化合物、组合物、形式、药物或组合之前，相对于受试者的食物摄取，或相比于没有接受任何本文所述的本发明的缀合物、化合物、组合物、形式、药物或组合的对照受试者，受试者的食物摄取降低，例如介于约0.01％至约0.1％之间，介于约0.1％至约0.5％之间，介于约0.5％至约1％之间，介于约1％至约5％之间，介于约2％至约3％之间，介于约5％至约10％之间，介于约10％至约15％之间，介于约15％至约20％之间，介于约20％至约25％之间，介于约25％至约30％之间，介于约30％至约35％之间，介于约35％至约40％之间，介于约40％至约45％之间或介于约45％至约50％之间。
在一些实施方案中，在食物摄取上的降低持续例如约1周、约2周、约3周、约1月、约2月、约3月、约4月、约5月、约6月、约7月、约8月、约9月、约10月、约11月、约1年、约1.5年、约2年、约2.5年、约3年、约3.5年、约4年、约4.5年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约15年或约20年。
本发明提供了一种减少对其有需要的受试者的糖化血红蛋白(AIC)的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本发明的缀合物、化合物或药物组合物。在一些实施方案中，在施用任何本文所述的本发明的缀合物、化合物、组合物、形式、药物或组合之前，相对于受试者的A1C，或相比于没有接受任何本文所述的本发明的缀合物、化合物、组合物、形式、药物或组合的对照受试者，受试者的A1C降低，例如约介于约0.001％和约0.01％之间、介于约0.01％和约0.1％之间、介于约0.1％和约0.2％之间、介于约0.2％和约0.3％之间、介于约0.3％和约0.4％之间、介于约0.4％和约0.5％之间、介于约0.5％和约1％之间、介于约1％和约1.5％之间、介于约1.5％和约2％之间、介于约2％和约2.5％之间、介于约2.5％和约3％之间、介于约3％和约4％之间、介于约4％和约5％之间、介于约5％和约6％之间、介于约6％和约7％之间、介于约7％和约8％之间、介于约8％和约9％之间或介于约9％和约10％之间。
在其他实施方案中，提供用于降低对其有需要的受试者的空腹血糖水平的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本发明的缀合物、化合物、或药物组合物。在施用任何本文所述的本发明的缀合物、化合物、组合物、形式、药物或组合之前，相对于受试者的空腹血糖水平，或相比于没有接受任何本文所述的本发明的缀合物、化合物、组合物、形式、药物或组合的对照受试者，空腹血糖水平可被降低至小于约140至约150mg/dL、小于约140至约130mg/dL、小于约130至约120mg/dL、小于约120至约110mg/dL、小于约110至约100mg/dL、小于约100至约90mg/dL或小于约90至约80mg/dL。
本发明涉及一种调节对其有需要的受试者的Y2受体活性的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的本发明的缀合物、化合物或药物组合物。如本文所用，“调节”是指增加或降低受体活性。
在一些实施方案中，将有效量的本发明的缀合物或化合物或其形式、组合物或药物每日一次、每天两次、每日三次、每日四次、每日五次、每日六次、每日七次或每日八次施用于对其有需要的受试者。在其他实施方案中，将有效量的本发明的缀合物或化合物或其形式、组合物或药物每隔一天一次、每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、每月两次、每月三次、或每月四次施用于对其有需要的受试者。
本发明的另一个实施方案包括预防、治疗、延迟对其有需要的受试者的疾病、障碍或综合征的开始，或改善疾病、障碍或综合征、或所述疾病、障碍或综合征中一种或多种症状的方法，所述方法包括以联合疗法向对其有需要的受试者施用本发明的缀合物、化合物或药物组合物。在某些实施方案中，联合疗法为第二治疗剂。在某些实施方案中，联合疗法为外科疗法。
如本文所用，在将两种或更多种疗法施用于受试者的情形中，术语“联合”是指使用多于一种疗法。
如本文所用，联合疗法涉及与有效量的本发明的缀合物或化合物或其形式、组合物或药物同时向对其有需要的受试者施用一种或多种附加治疗剂、或一种或多种外科疗法。在一些实施方案中，一种或多种附加治疗剂或外科疗法可与有效量的本发明缀合物在同一天施用，并且在其他实施方案中，一种或多种附加治疗剂或外科疗法可与有效量的本发明的缀合物或化合物在同一周或同一个月一起施用。
在某些实施方案中，其中该疾病或障碍选自肥胖症、II型糖尿病、代谢综合征、胰岛素抵抗和血脂异常，该第二治疗剂可为抗糖尿病剂。在某些实施方案中，抗糖尿病剂可为胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体调节剂。
本发明还设想利用联合疗法预防、治疗、延缓对其有需要的受试者中的本文所述的疾病、障碍、综合征或症状中任一种的开始，或改善该疾病、障碍、综合征或症状中的任一种，所述联合疗法包括与以下治疗剂中的任一种或多种联合向对其有需要的受试者施用有效量的本发明的缀合物、化合物或药物组合物：二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂(例如西他列汀、沙格列汀、利格列汀、阿格列汀等)；GLP-1受体激动剂(例如，短效GLP-1受体激动剂，诸如艾塞那肽和利西拉肽；中效GLP-1受体激动剂，诸如利拉鲁肽；长效GLP-1受体激动剂，诸如缓释艾塞那肽、阿必鲁泰、度拉糖肽)；钠-葡萄糖协同转运蛋白-2(SGLT-2)抑制剂(例如，坎格列净(canaglifozin)、达格列净(dapaglifozin)、恩格列净(empaglifozin))；胆汁酸多价螯合剂(例如，考来维仑等)；多巴胺受体激动剂(例如，速释的溴麦角环肽)；双胍(例如，二甲双胍等)；胰岛素；胃泌酸调节素；磺酰脲类(例如，氯环丙脲、格列美脲、格列吡嗪、优降糖、格列本脲、格列波脲、格列派特、格列吡脲、甲磺吖庚脲、甲苯磺丁脲、乙酰苯磺酰环己脲、氨磺丁脲等)；和噻唑烷二酮类(例如；吡格列酮、罗格列酮、洛贝格列酮、环格列酮、达格列酮、恩格列酮、奈格列酮、利格列酮、曲格列酮等)。在一些实施方案中，当与本发明的缀合物或化合物组合提供时，一种或多种附加治疗剂的剂量减少。在一些实施方案中，当与本发明的缀合物或化合物组合使用时，所述另外的治疗剂可以比当每个单独使用时更低的剂量使用。
在某些实施方案，该疾病或障碍选自：肥胖症、I型或II型糖尿病、代谢综合征(即综合征X)、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常葡(例如葡萄糖耐受不良)、高血糖、高胰岛素血症、高甘油三酯血症、由于先天性高胰岛素血症(CHI)引起的低血糖、血脂异常、动脉粥样硬化、糖尿病性肾脏疾病、以及其他心血管危险因素诸如高血压和与未管理胆固醇和/或血脂水平相关的心血管危险因素、骨质疏松症、炎症、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肾脏疾病和湿疹，所述第二治疗剂可以为利拉鲁肽。
本发明设想利用联合疗法预防、治疗、延缓对其有需要的受试者中的本文所述的疾病、障碍、综合征或症状中任一种的开始，或改善该疾病、障碍、综合征或症状中的任一种，所述联合疗法包括与外科疗法联合向对其有需要的受试者施用有效量的本发明的缀合物、化合物或药物组合物。在某些实施方案中，外科疗法可为肥胖症外科手术(例如，胃旁路手术，诸如胆管空肠胃旁路术外科手术；袖状胃减容术；可调式胃束带手术；胆胰分流十二指肠转位术；内置胃气球；胃折叠术；以及它们的组)合。
在其中一种或多种另外的治疗剂或外科疗法与有效量的本发明的缀合物或化合物在同一天施用的实施方案中，可在附加治疗剂或外科疗法之前、之后或同时施用本发明的缀合物或化合物。使用的术语“联合”并不限制疗法施用于受试者的次序。例如，第一疗法(例如，本文所述的组合物)可在第二疗法施用于受试者之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)，同时，或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以后)施用。
实施方案
本发明还提供一些非限制性实施方案。
实施方案1为一种缀合物，包含偶联到环状PYY肽的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述环状PYY肽由式I或其衍生物或药学上可接受的盐表示：
其中
p为0或1；
m为0、1、2、3、4或5；
n为1、2、3或4；
q为0或1；前提条件是仅当Z30不存在时，q为1；
桥为-Ph-CH2-S-、-三唑基-、-NHC(O)CH2S-、-SCH2C(O)NH-、
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S、-NHC(O)-或-CH2S-；
Z4为K、A、E、S或R；
Z7为A或K；
Z9为G或K；
Z11为D或K；
Z22为A或K；
Z23为S或K；
Z26为A或H；
Z30为L、W、不存在或K；
前提条件是仅当q为1时，Z30不存在；
Z34为
Z35为
其中所述衍生物为通过一种或多种方法修饰的式I的化合物，所述方法选自：酰胺化、糖基化、氨甲酰化、硫酸化、磷酸化、环化、脂化和聚乙二醇化。
实施方案2为根据实施方案1所述的缀合物，其中所述环状PYY肽为通过一种或多种方法修饰的式I的环状PYY肽的衍生物，或其药学上可接受的盐，所述方法选自：酰胺化、脂化和聚乙二醇化。
实施方案3为根据实施方案1所述的缀合物，其中所述环状PYY肽由式I或其衍生物或药学上可接受的盐表示，其中：
p为0或1；
m为0、1、2、3、4或5；
n为1、2、3或4；
q为0或1；前提条件是仅当Z30不存在时，q为1；
桥为-Ph-CH2-S-、-三唑基、-NHC(O)CH2S-、-SCH2C(O)NH2-、
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S、-NHC(O)-或-CH2S-；
Z4为K、A、E、S或R；
Z7为A或K，
Z9为G或K，
Z11为D或K，
Z22为A或K，
Z23为S或K，
Z26为A或H；
Z30为L或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
Z34为并且
Z35为
实施方案4为根据实施方案1所述的缀合物，其中所述环状PYY肽由式I或其衍生物或药学上可接受的盐表示，其中：
p为0或1；
m为0、1、2、3或5；
N为1、2或4；
q为0或1；前提条件是仅当Z30不存在时，q可为1；
桥为-Ph-CH2-S-、-三唑基、-NHC(O)CH2S-、-SCH2C(O)NH2-、
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S、-NHC(O)-或-CH2S-；
Z4为K、A、E、S或R；
Z7为A或K，
Z9为G或K，
Z11为D或K，
Z22为A或K，
Z23为S或K，
Z26为A或H；
Z30为L或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
Z34为并且
Z35为
实施方案5为一种缀合物，包含偶联到环状PYY肽的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该缀合物分别由式IIIa-b、IVa-b、Va-b和/或VIa-b表示，其中在式IIIa-b、IVa-b、Va-b和/或VIa-b中，x可例如为1、2、3、4、5或6，优选地为2。
连接1可例如为G、βA、-COCH2OCH2CH2OCH2CH2NH-、γ-氨基丁酰基、GG、-CO(CH2)mSCH2-(前提条件是当连接2＝-NH-，m＝1，2时)或键；
连接2可例如为–CH2-、苄基、乙基三唑基、-NH-或键；
n可例如为1、2或3；
X可例如为–S-或–CH2-；
Z3可例如为I或键；
Z4可例如为K、S或R；
Z30可例如为L、W、K(mPEG16)、或K(mPEG12)；
Z34可例如为Q，其中所述Q在α-酰胺氮上任选地N-甲基化，
Z35可例如为R，其中所述R在α-酰胺氮上任选地N-甲基化，或者将R脱羰基，从而产生psi-(Z35Z36)酰胺键，或者R在α-酰胺氮上N-甲基化和脱羰基，从而产生psi-(Z35Z36)酰胺键；
Z36可例如为Y(Tyr)、Cha(β-环己基丙氨酸)、Aic(2-氨基茚满-2-羧酸)或F(Phe)，其中所述F任选地被氟(4-F-Phe)、氯(4-Cl-Phe)、溴(4-Br-Phe)、碘(4-I-Phe)、氨基(4-NH2-Phe)对位取代；并且
连接3可例如包含对赖氨酸侧链的以下酰胺化中的任一种：(PEG)8-三唑基-CH2CH2CO-PEG4(包括)、2-24个PEG单元的PEG链(包括)、含有2-10个碳原子的烷基链(包括)；(Gly4Ser)j，其中j＝1-4；(AlaPro)u，其中u＝1-10；或者–NH-连接3-可被键取代。
实施方案6为根据实施方案1是所述的缀合物，其中所述环状PYY肽选自SEQ IDNO:1-100。
实施方案7为根据实施方案1-6中任一项所述的缀合物，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段经由连接基在所述环状PYY肽的赖氨酸残基处与所述环状PYY肽共价连接。
实施方案8为根据实施方案7所述的缀合物，其中所述连接基包括选自以下的一种：聚乙二醇(PEG)8-三唑基-CH2CH2CO-PEG4、2-24个PEG单元的PEG链、含有2-10个碳原子的烷基链；(Gly4Ser)j，其中j＝1-4；(AlaPro)u，其中u＝1-10；以及键。
实施方案9为根据实施方案8所述的缀合物，其中式I中Z7、Z9、Z11、Z22和Z23中的仅一个为赖氨酸，并且所述赖氨酸经由连接基与所述单克隆抗体或其抗原结合片段的工程化半胱氨酸残基共价连接。
实施方案10为一种缀合物，包含偶联到环状PYY肽的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述缀合物包含选自以下的结构：SEQ ID NO:102-127或其药学上可接受的盐，
其中mAb表示单克隆抗体或其抗原结合片段，并且]2表示环状PYY肽中的1个或2个共价缀合到mAb。
实施方案11为根据实施方案1-10中任一项所述的缀合物，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3，和轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其分别具有以下的多肽序列：SEQ ID NO:141、142、143、144、145和146。
实施方案12为根据实施方案11所述的缀合物，其中所述分离的单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:137的多肽序列的重链可变结构域(VH)和具有SEQ ID NO:139的多肽序列的轻链可变结构域(VL)。
实施方案13为根据实施方案12所述的缀合物，还包含Fc部分。
实施方案14为根据实施方案13所述的缀合物，包含具有SEQ ID NO:138的多肽序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:140的多肽序列的轻链(LC)。
实施方案15为一种制备根据实施方案1-14中任一项所述的缀合物的方法，包括使引入所述环状PYY肽的侧链，或优选地环状PYY肽的赖氨酸残基的氨基侧链上的亲电体，优选地溴乙酰胺或马来酰亚胺，与所述单克隆抗体或其抗原结合片段的SEQ ID NO:143的半胱氨酸残基的巯基基团反应，从而在所述环状PYY肽和所述单克隆抗体或其抗原结合片段之间形成共价键。
实施方案16为一种药物组合物，其包含根据实施方案1-14中任一项所述的缀合物，和药学上可接受的载体。
实施方案17为一种治疗或预防对其有需要的受试者的肥胖症的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的根据实施方案16所述的药物组合物。
实施方案18为根据实施方案17所述的方法，其中向对其有需要的受试者施用有效量的药物组合物导致与施用药物组合物之前的受试者体重相比，体重减少约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、或约20％至约25％。
实施方案19为一种用于治疗或预防对其有需要的受试者的疾病或障碍的方法，其中所述疾病或障碍选自：肥胖症、I型或II型糖尿病、代谢综合征、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常、高血糖、高胰岛素血症、高甘油三酯血症、由于先天性高胰岛素血症(CHI)引起的低血糖、血脂异常、动脉粥样硬化、糖尿病肾病、以及其他心血管危险因素诸如高血压和与未管理胆固醇和/或血脂水平相关的心血管危险因素、骨质疏松症、炎症、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肾脏疾病和湿疹，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的根据实施方案16所述的药物组合物。
实施方案20为根据实施方案19所述的方法，其中所述疾病或障碍为肥胖症。
实施方案21为根据实施方案19所述的方法，其中所述疾病或障碍为I型糖尿病。
实施方案22为根据实施方案19所述的方法，其中所述疾病或障碍为II型糖尿病。
实施方案23为根据实施方案19所述的方法，其中所述疾病或障碍为代谢综合征。
实施方案24为根据实施方案19所述的方法，其中所述疾病或障碍为肾脏疾病。
实施方案25为根据实施方案19所述的方法，其中所述疾病或障碍为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
实施方案26为根据实施方案19所述的方法，其中所述疾病或障碍为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。
实施方案27为一种减少对其有需要的受试者的食物摄取的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的根据实施方案16所述的药物组合物。
实施方案28为根据实施方案27所述的方法，其中向对其有需要的受试者施用有效量的药物组合物导致与施用药物组合物之前的受试者的食物摄取相比，食物摄取减少约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约25％、约25％至约30％、约30％至约35％、约35％至约40％、约40％至约45％、约45％至约50％。
实施方案29一种调节对其有需要的受试者的Y2受体活性的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的根据实施方案16所述的药物组合物。
实施方案30为根据实施方案17-29中任一项所述的方法，其中所述药物组合物经由注射施用。
实施方案31为根据实施方案30所述的方法，其中所述注射皮下、肌内、腹膜内、或静脉内递送。
实施方案32为根据实施方案17-31中任一项所述的方法，其中所述药物组合物与第二治疗剂联合施用。
实施方案33为根据实施方案32所述的方法，其中所述疾病或障碍选自肥胖症、2型糖尿病、代谢综合征、胰岛素抵抗和血脂异常，并且该第二治疗剂为至少一种抗糖尿病剂。
实施方案34为根据实施方案33所述的方法，其中所述抗糖尿病剂为胰高血糖素样-肽-1受体调节剂。
实施方案35为根据实施方案32所述的方法，其中第二治疗剂是利拉鲁肽。
实施方案36为根据实施方案17-35中任一项所述的方法，其中将该药物组合物每天、每周或每月施用于对其有需要的受试者。
实施方案37为根据实施方案36所述的方法，其中所述药物组合物每天一次、两次、三次、四次、五次或六次施用。
实施方案38为根据实施方案36所述的方法，其中所述药物组合物每周一次、两次、三次、四次、五次或六次施用。
实施方案39为根据实施方案36所述的方法，其中所述药物组合物每月一次、两次、三次或四次施用。
实施方案40为一种试剂盒，包含根据实施方案1-14中任一项所述的缀合物或根据实施方案16的药物组合物，优选地该试剂盒还包含有效量的第二治疗剂，更优选地，该试剂盒还包含有效量的利拉鲁肽。
实施方案41为根据实施方案40所述的试剂盒，其中该试剂盒还包括注射装置。
实施方案42为一种制备包含根据实施方案1-14中任一项所述的缀合物的药物组合物的方法，包括将所述缀合物与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
实施例
合成
本发明的化合物或缀合物可根据本领域技术人员已知的一般合成方法合成。以下对合成的描述用于示例性目的，绝不意在成为本发明的限制。
本发明的NTSC环状PYY(NTSC-PYY)类似物或衍生物可通过用于在介于氨基酸之间形成连续肽键的多种已知的常规方法合成，并且优先地通过固相肽合成(SPPS)进行，如普遍地描述于Merrifield的《美国化学学会期刊》，1963年，第85卷，第2149-2154页(J.Am.Chem.1963，85，2149-2154)，使用自动肽合成器，传统的小试合成，或这两种方法的组合。对于肽合成的常规方法涉及介于其他活性官能团已被适当保护的一个氨基酸残基的游离氨基与其活性官能团也已被适当保护的其他氨基酸的游离羰基之间的缩合。通常用于肽键形成的缩合剂的示例包括二异丙基碳二亚胺(DIC)，其具有或不具有1-羟基苯并三唑(HOBT)或氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma Pure)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵(HBTU)、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵(HATU)、2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵(HCTU)、1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基-三-吡咯烷基-鏻六氟磷酸盐(PyOxim)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基四氟硼酸铵(TBTU)、溴-三-吡咯烷基-鏻六氟磷酸盐(PyBroP)等。
自动肽合成方法可在室温(rt)或升高的温度下，优选地通过应用微波加热来进行，如由下列所述的：Yu(J.Org.Chem.,1992,57,4781-4784))以及如由Palasek新进改善的(《肽科学杂志》，2007年，第13卷，第143-148页)(J.Pept.Sci.,2007,13,143-148))。
本发明的化合物(C-末端酰胺)可使用N-α-FMOC(9-芴基甲氧基羰基)保护的氨基酸方法便利地制备，从而适当保护的N-α-FMOC保护的氨基酸使用适宜的偶联剂偶联到常规固相树脂上。合适的常规可商购获得的固相树脂包括：Rink酰胺MBHA树脂、Rink酰胺AM树脂、Tentagel S RAM树脂、FMOC-PAL-PEG PS树脂、SpheriTide Rink酰胺树脂、ChemMatrixRink树脂、Sieber酰胺树脂、TG Sieber树脂等。然后可通过暴露于20％哌啶的N,N二甲基甲酰胺(DMF)溶液或1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)溶液使树脂结合的FMOC氨基酸脱保护，其处理用于选择性地移除FMOC保护基团。然后将附加的FMOC保护的氨基酸依次偶联并脱保护，从而产生所需的树脂结合的保护肽。在某些情况下，可能有必要将正交反应性保护基团用于肽序列中的另一种胺，其将耐受FMOC脱保护条件。保护基团，诸如4-甲基三苯甲基(Mtt)或4-甲氧基三苯甲基(Mmt)，两者均可通过1％三氟乙酸(TFA/二氯甲烷(DCM)处理来移除，或者优选地烯丙氧羰基(alloc；用过Pd(PPh3)4(四(三苯基膦)钯(0))/PhSiH3(苯基硅烷)处理移除)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde；可通过用2-3％肼/DMF处理移除)和1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基(ivDde；可通过用2-3％肼/DMF处理移除)，可有效地用在此情况下。
在常规的肽合成方法中，α氨基酸的反应性侧链通常在整个合成期间用适宜的保护基团保护，以使它们对偶合和脱保护方案惰性。虽然本领域已知用于氨基酸侧链的多个保护基团，但本文中下列保护基团是最优选的：用于丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和酪氨酸的叔丁基(t-Bu)；用于天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、同型半胱氨酸和组氨酸的三苯甲基(Trt)；用于色氨酸和赖氨酸的ε-氨基的叔丁氧羰基(Boc)；和用于精氨酸的2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)。在强酸处理时，诸如高浓度的三氟乙酸(TFA)，移除这些保护基团。
在该SPPS完成时，使用裂解混合物将树脂结合的，侧链受保护的肽脱保护并伴随地从树脂上裂解，所述裂解混合物主要由(TFA)连同碳正离子清除剂，诸如三异丙基硅烷(TIPS)、水、苯酚和苯甲醚的各种组合组成。然后将该粗固体肽通过用冷的醚沉淀肽/混合物滤液分离。在受Sieber树脂结合的受保护的肽的特殊情况下，受保护的肽从树脂的裂解可有利地在用DCM中的1-2％TFA重复处理而不引起侧链去保护的情况下实现。一旦分离，可在溶液相反应中进行受保护的肽的进一步操作。最后，使用具有裂解混合物的单独处理将受保护的肽全局去保护，并如上所述沉淀。然后将如此获得的粗肽以低浓度(约<4mg/mL)溶于包含有机共溶剂，诸如乙腈或乙醇的大部分含水(aq)溶剂体系中。在将溶液的pH提高至>5时，然后所述肽经历分子内环化反应以形成本发明的对应粗NTSC PYY类似物。如此形成的NTSC PYY类似物可使用本领域通常已知的纯化技术纯化。本文所用的优选的肽纯化方法是反相高效液相色谱法(HPLC)。然后通过液相色谱/质谱(LC/MS)表征经纯化的肽。
应当理解，本文所述的下列实施例和实施方案仅仅是为了进行示意性的说明，并且根据其的各种变型或改变对于本领域技术人员将是提示性的，并且将包括在本专利申请的实质和范围内以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均据此全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
常规方案
用于合成C-末端酰胺NTSC-PYY肽的常规合成程序描述于2016年10月27日提交的美国临时专利申请62/413,613和与该专利申请同一天提交的，代理人案卷号为PRD3411的名称为“Cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulators ofneuropeptide receptors”的美国专利申请_____中。两个专利申请的内容全文以引用方式并入本文中。
实施例1：环状PYY类似物SEQ ID NO:1的合成
方案14.Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-(N-Boc)Tyr(tBu)]-OH的合成
1.Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-(N-Boc)Tyr(tBu)]-OH的合成
A.H2N-Tyr(tBu)-OAll的合成
向冰冷却的Fmoc-Tyr(tBu)-O(69g，150.15mmol)和K2CO3(62g，445.36mmol)的DMF(500mL)溶液中添加烯丙基溴(72g，595.16mmol)，并且将所得混合物搅拌3小时。然后添加冰/水(1L)并用EtOAc萃取该混合物。将合并的有机萃取物干燥(Na2SO4)并减压浓缩，以得到黄色油状Fmoc-Tyr(tBu)-OAll。向冰冷却的Fmoc-Tyr(tBu)-OAll(70g，140.1mmol)的DMF(600mL)溶液中在20分钟的时间内以逐滴方式添加哌啶(150mL)。在3小时后，将反应溶液倾注到水/冰(1L)中，并且用EtOAc(2×2L)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有机萃取物，并在减压下浓缩。将如此获得的残余物通过硅胶色谱纯化，用EtOAc/石油醚(10:1)洗脱以获得34g黄色油状H2N-Tyr(tBu)-OAll。
B.Fmoc-Arg(Pbf)-N(Me)OMe(2)的F合成的合成
在10分钟的时间内，向Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1)(64.8g，99.88mmol)、N,O-二乙基羟基胺盐酸盐(20g，206.2mmol)和HATU(57g，149.91mmol)的DCM(500mL)的冰冷却混合物中以逐滴方式添加DIEA(52g，402.2mmol)，并且使所得的混合物在室温下搅拌过夜。然后将反应倾注到水/冰(1L)中，并用DCM(1L)萃取。将有机萃取物干燥(Na2SO4)并减压浓缩，以得到70g黄色固体状粗Fmoc-Arg(Pbf)-N(Me)OMe(2)，其无需进一步纯化即可使用。
C.Fmoc-Arg(Pbf)-CHO(3)的合成
在惰性氮气氛下，在1小时的时间段内，以逐滴的方式，通过套管向LAH的THF的冷却(-78℃)溶液(1M，107mL，0.107mmol)中添加Fmoc-Arg(Pbf)-N(Me)OMe(2)(50g，72.3mmol)的THF(100mL)的冷却(-50℃)溶液。在-78℃下搅拌5小时后，将混合物倾注到1NHCl溶液(300mL)中，根据需要添加附加的1N HCl以将pH调节至4，并且然后用EtOAc(2×2L)萃取。将合并的有机萃取物干燥(Na2SO4)并减压浓缩，以获得45g黄色固体状粗Fmoc-Arg(Pbf)-CHO(3)，无需进一步纯化即可使用。
D.Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-Tyr(tBu)]-OAll(4)的合成
在30分钟的时间段内，将来自步骤C的Fmoc-Arg(Pbf)-CHO(3)(45g，71.12mmol)、和来自步骤A的H2N-Tyr(tBu)-OAll(32g，115.37mmol)的THF(200mL)、MeOH(200mL)和HOAc(15mL)的冰冷却溶液中分批添加氰基硼氢化钠(18.0g，286.4mmol)，并且在室温下将所得的溶液搅拌过夜。通过添加NaHCO3(500mL)饱和水溶液淬灭该反应，并且该混合物用EtOAc(2×2L)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有机萃取物，并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶色谱纯化，用EtOAc/石油醚(10:1)洗脱以获得40g黄色固体状Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-Tyr(tBu)]-OAll(4)。
E.Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OAll(5)的合成
向Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-OAll](4)(53g，59.28mmol)的MeCN(240mL)溶液中添加二碳酸二叔丁酯(20g，91.3mmol)，并将所得溶液在50℃下搅拌过夜。然后将该混合物减压浓缩，并且通过硅胶色谱纯化残余物，用EtOAc/石油醚(1:1)洗脱，以获得32g黄色固体状Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OAll(5)。
F.Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OH(6)的合成
在氮气惰性起风下，向Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OAll(5)(32g，32mmol)的DCM(600mL)冷却(-30℃)溶液中添加Pd(PPh3)4(3.0g，4.33mmol)，之后在30分钟的时间段内逐滴添加N-甲基苯胺(10g，93mmol)。所得的混合物在室温下搅拌2小时，并且然后减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱纯化，用EtOAc/石油醚(1:1)洗脱以获得26.8g淡黄色固体状Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OH(6)1H NMR(300MHz,CD3OD)δ7.75-7.77(2H,m),7.59-7.60(2H,m),7.32-7.33(4H,m),7.09-7.11(2H,m),6.87-7.00(2H,m),4.27-4.50(3H,m),3.30-3.50(4H,m),3.02-3.23(3H,m),2.75-2.98(3H,m),2.57(3H,s),2.48(3H,s),2.00(3H,s),1.31-1.41(28H,m)。LC/MS(ES,m/z)：对于C52H67N5O10S质量计算值：953.46，实测值：954.55[M+H]+。
2.将二肽加载到Fmoc-psi-(R35-N(Boc)-Y36)Sieber树脂上
在一个烧结的微波反应容器中(由CEM Corporation供应)，用DMF(10mL)中的20％哌啶处理NovaSyn TG Sieber树脂(由Novabiochem供应)(0.2mmol)，并在50℃下，在CEM微波反应器中加热2.5分钟。排出反应，并且用DMF洗涤树脂，并在50℃下，在CEM微波反应器中，用DMF中的20％哌啶再次处理5分钟。在排出并用DMF洗涤该树脂后，再一次重复去保护处理。然后用得自上文的Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-(N-Boc)Tyr(tBu)]-OH(3-5当量)、HATU(2.75–4.8当量)和DIEA(6–10当量)于DMF(4mL)中的溶液处理树脂，并在室温下混合6至24小时。排出该混合物，并且用DMF充分地洗涤该树脂，然后在微波条件下，在50℃，通过用DMF(5mL)中的20％Ac2O处理5分钟来封端。排出反应，并且用DMF和DCM充分洗涤该树脂。
3.Fmoc-βA-IKPEAPGEK(Alloc)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQ(psi-R35Y36)- Sieber树脂的合成
在CEM Liberty Blue Microwave肽合成器上，执行氨基酸延长至预加载的(psi-R35,Y36)-Sieber树脂(0.2mmol)。使用HBTU/DIEA作为偶联剂，在50℃下，标准α-Fmoc-保护的氨基酸以相对于初始树脂负载3.8倍过量的量被双重偶联并持续15分钟。使用两阶段方案双偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH：在室温下25分钟，之后在50℃下15分钟，并且使用两阶段方案双偶联Fmoc-His(Trt)-OH：在室温下4分钟，之后在50℃下8分钟。
4.Fmoc-βA-IKPEAPGEK(NH2)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQ(psi-R35Y36)-Sieber 树脂的合成：Alloc去保护
用脱氧的DCM(10mL)中的苯基硅烷(25当量)的溶液处理由上文所得的树脂。在持续搅拌约2分钟后，添加Pd(PPh3)4(0.5当量)于DCM(10mL)中的溶液，并且在氩中，持续搅拌树脂混合物30分钟。排出反应，然后用脱氧的DCM洗涤树脂。用新鲜的试剂重复去保护，这之后，排出反应，并且用DCM和DMF充分洗涤该树脂。
5.Fmoc-βA-IKPEAPGEK(NH-dPEG12-NHFmoc)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQ(psi- R35Y36)-Sieber树脂的合成：将N-FmocdPEG12羧酸偶联到11K上
在CEM微波反应器中，在50℃下，用N-Fmoc-dPEG12-羧酸(5eq)、HBTU(4.8当量)和DIEA(10当量)于DMF(7mL)中的溶液处理得自上文的Alloc-去保护的肽-Sieber树脂15分钟，到那时，该反应Kaiser测试显阴性。排出反应，并且用DMF和DCM充分洗涤该树脂。
6.BrCH2COHN-βA-IKPEAPGEK(NH-dPEG12-NHCOCH2Br)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQ(psi-R35Y36)-Sieber树脂的合成：在βA和dPEG12处双-溴乙酰化
在CEM微波反应器中，在50℃下，使用新鲜的20％哌啶的DMF溶液使上述树脂经受Fmoc-脱保护并持续5分钟。重复该去保护两次。在CEM微波反应器中，在50℃下，用溴乙酸酐(20当量)于DMF(5mL)中的溶液处理如此获得的Fmoc-去保护的肽树脂10分钟，到那时该反应Kaiser测试显阴性。排出反应，并且用DMF和DCM充分洗涤该树脂，然后干燥。
7.BrCH2COHN-βA-IKPEAPGEK(NH-dPEG12-NHCOCH2Br)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQ(psi-R35Y36)-CONH2的合成：从树脂上裂解并全局去保护
用1.5％TFA于DCM(10mL)中的溶液处理干燥的树脂，并混合5至10分钟，然后过滤。对于每次处理使用新鲜的混合物重复该处理另外的9次。然后合并所合并的滤液并浓缩以获得黄色泡沫状粗制受保护的肽。在室温下，用20mL裂解混合物(TFA/苯酚/H2O/TIPS＝88/5/5/2)处理该泡沫并持续2.5小时，然后在氮气流下浓缩至约2.5mL的体积，然后添加冷却的乙醚(40mL)以沉淀该肽。离心混合物(5分钟；5000rpm)并滗出。将该方法再重复2次，以获得灰白色粉末状粗肽。
另选地，没有之前用DCM中的1-2％TFA处理，用裂解混合物处理的树脂以提供完全去保护的肽。
8.环状PYY类似物SEQ ID NO:1：环化步骤A和纯化
将得自上文的粗肽溶解于任选地添加EDTA(1mm)的脱氧的50％MeCN/水(5-10mg/mL)中。然后过添加7.5w/v％NaHCO3溶液将反应溶液的pH升高至约8。在室温下持续搅拌所得的溶液0.5至2.5小时，然后通过添加TFA酸化至pH<1。然后在室温下，在减压下浓缩该溶液至约初始体积的一半(约24mL)。通过反相制备型HPLC纯化所得的溶液。在使用VarianPursuit XRs C18柱(30×250mm，5μm)的Gilson HPLC2020个人纯化系统上执行纯化。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围在20％B的初始浓度至50％B的最终浓度，经过36分钟。在220nm和254nm处监测UV检测。包含产品的级分使用与上文相同类型的柱(4.6×250mm，5μm)，通过分析的HPLC，在Agilent1100 HPLC系统上分析。将纯级分合并，并且然后冻干以获得为棉化状固体的产物。LCMS：在12.27min下，对于产品峰而言，1225.5(M+4H)/4，1633.4(M+3H)/3和2450.0(M+2H)/2(LC：Atlantis T3C18柱，5um，4.6×250mm，1.0mL/min，15-60％梯度)
实施例2：环状PYY类似物SEQ ID No:2的合成
1.H2N-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQRY-PAL-PEG树脂的合成
如在方案1中所述，以0.1mmol的规模，使用低载量Rink酰胺树脂，优选地Fmoc-PAL-PEG PS树脂(约0.16-0.2meq/g，由应用生物系统提供)，使用如上文所述的Fmoc策略在CEM Liberty Blue Microwave肽合成器上合成受保护的肽基树脂。使用DIC/Oxyma作为偶联剂，将标准物Fmoc保护的氨基酸以相对于树脂负载5倍过量偶联，反应温度为约90℃并持续4分钟。将Fmoc-Arg(Pbf)-OH在90℃下各自双重偶联4分钟，并使用两阶段方案将Fmoc-His(Trt)-OH偶联：在室温下4分钟，然后在50℃下8分钟。单Fmoc去保护在DMF中的20％哌啶(脱保护溶液)中，在90℃下进行1.5分钟。
2.m-BrCH2PhCOHN-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQRY-PAL-PEG树脂的合 成
在微波反应器中，在75℃下，用间溴甲基苯甲酸(20当量)和DIC(10当量)于DMF(4mL)中的溶液处理得自上文的Fmoc-去保护的肽-树脂(0.1mmol)15分钟，到那时，根据Kaiser茚三酮测试通常确定该反应完成(Kaiser等人的《分析生物化学》，1970年，第34卷，第595-598页(Anal.Biochem.,1970,34,595-598))。在确定偶联不完全的情况下，使用新鲜试剂重复该偶联。排出反应，并且用DMF和DCM充分洗涤该树脂。
3.m-BrCH2PhCOHN-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQRY-CONH2的合成：去保 护并从树脂上裂解
然后用由TFA/水/苯酚/TIPS(88:5:5:2)组成的裂解混合物(10mL/0.1mmol规模)处理得自上文的树脂，并在微波反应器中在38℃下加热40分钟，然后过滤。用TFA洗涤树脂，并且将合并的滤液在氮气流下浓缩至约2.5mL的体积，并且通过添加冷二乙醚(40mL)沉淀所述肽。离心肽/醚悬浮液，并滗出醚层。将肽小球再悬浮于醚中，离心并滗出，并且重复该方法三次。在温和的氮气流下干燥如此获得的粗肽。
4.环状PYY类似物SEQ ID NO:2：环化程序A和纯化
将得自上文的粗肽以≤4mg/mL的浓度溶解于脱氧的MeCN/水(60％MeCN)中。然后可通过添加NH4OAc(200mm，pH 8.4)的水溶液将肽溶液的pH升高至约7–9，并且根据LCMS，在室温下搅拌所得的溶液直至环化完成(通常3-4小时)。通过加入TFA将环化反应混合物酸化至pH1.5–3，并且浓缩溶液以移除大部分有机共溶剂至出现轻微浑浊的点。必要时，将最小量的MeCN添加回去以致使混合物均匀，然后以多次注射，使用C18Varian Pursuit XRs C18(21×250mm，5μm)柱通过制备型HPLC直接纯化所得的溶液。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围在20％B的初始浓度至40％B的最终浓度，经过45分钟。在220nm和254nm处监测UV检测。在Agilent 1100HPLC系统上使用合适的柱通过分析型HPLC分析含有产物的级分。合并纯级分、浓缩以移除大部分有机相，然后冻干。
实施例3：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:3
1.(H2N)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL-(叠氮基-norLeu)-TRQRYPAL-PEG树脂 的合成
根据描述于实施例2，步骤1中的方法，以0.1mmol规模，制备树脂结合的肽，在位置31处，以Fmoc-azidonorLeu-OH代替Fmoc-hCys(trt)-OH。
2.(HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL-(叠氮基-norLeu)- TRQRYPAL-PEG树脂的合成
在微波条件下，使用DIC/HOBT方案(75℃，10分钟)将4-戊炔酸偶联到上文树脂上。排出反应，并且用DMF和DCM充分洗涤该树脂。
3.(HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL-(叠氮基-norLeu)- TRQRYPAL-CONH2的合成
在微波条件下(38℃，40分钟)，用由TFA/DODT/H2O/TIS(92.5:2.5:2.5:2.5)组成的10mL裂解混合物处理上述树脂。排出反应，然后用TFA(10mL)洗涤树脂。然后在氮气流下浓缩合并的滤液至约2.5mL的体积。然后添加冷醚(40mL)以沉淀肽，并且将混合物离心(5分钟；5000rpm)并滗出。将该方法再重复2次，以获得灰白色粉末状粗肽。
4.环状PYY类似物SEQ ID NO:3
在2mL脱氧的H2O中制备7mg的CuSO4。制备5.4mL的EtOH和0.6mL的MeCN中的30mg的TBTA。预混0.94mLCuSO4溶液和4.8mL TBTA溶液。制备3mL的脱氧的H2O中的30mg抗坏血酸Na。
向步骤3的粗叠氮基肽(100mg)的20mL脱氧水溶液中加入预混的CuSO4/TBTA溶液，然后加入2.4mL抗坏血酸钠溶液(溶液立即变为乳状)。将混合物温热至40℃，并持续搅拌1.5小时，在那时LCMS分析指示彻底反应。用水(0.1％TFA)将混合物稀释至约40mL；离心该混合物，并且通过反相制备型HPLC纯化上清液。在35℃，使用Varian Pursuit XRs C18柱(21×250mm，5μm)执行纯化。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围在10％B初始浓度至18％B(21mpm)中间浓度，然后至33％B(10.5mpm)最终浓度，经过35分钟。在220nm和254nm处监测UV检测。包含产品的级分使用与上文相同类型的柱(4.6×250mm，5μm)，通过分析的HPLC，在Agilent 1100HPLC系统上分析。将纯级分合并，并且然后冻干以获得为棉化状固体的产物。
实施例4：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:4
1.(Dde)K(NH2)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQRY-PAL-PEG树脂的合成
使用描述于实施例2，步骤1中的方法制备树脂结合的肽。
2.(Dde)K(NH-Glu-(OtBu)NH2)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQRY-PAL-PEG树脂的 合成
在微波条件下，使用DIC/Oxyma偶联方法(90℃，6分钟；dc)将Fmoc-Glu-OtBU(5当量)偶联到上文的树脂上。排出该树脂，并用DMF洗涤。然后使用3-阶段方案(75℃持续0.5分钟；75℃持续3分钟；75℃持续3分钟)，使用20％哌啶的DMF溶液进行Fmoc脱保护，其中每个阶段均进行DMF洗涤。
3.(Dde)K(NH-Glu-(OtBu)NH-PaL)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQRY-PAL-PEG树脂 的合成
在微波条件下，使用DIC/Oxyma偶联方法(90℃，5分钟)将棕榈酸(5当量)偶联到上述树脂上。排出该树脂，并且用DMF和DCM充分洗涤。
4.(H2N)K(NH-Glu-(OtBu)NH-PaL)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQRY-PAL-PEG树脂 的合成
在用DMF洗涤上文的树脂后，在室温下将其用DMF中的2％肼溶液(6mL/0.1mmol树脂)处理5分钟，然后排出并用DMF洗涤。重复该处理另外的5次。
5.(H2N)IKPEAPGEK(NH-Glu-(OtBu)NH-PaL)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQRY- PAL-PEG树脂的合成
剩余的氨基酸偶联使用实施例2，步骤1中所述的方法实施。
6.环状PYY类似物SEQ ID NO:4
使用实施例2，步骤2-4中所述的方法实施合成的剩余部分。在室温下，使用VarianPursuit XRS C18柱(21×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围从23％B至33％B(21mpm)中间浓度，经过5分钟，然后至48％B(10.5mpm)最终浓度，经过55分钟。
实施例5：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:5
根据如实施例4中所述的程序，用α-生育酚羟基乙酸(AcVitE)(8)替代步骤3中的棕榈酸来制备该标题化合物。在室温下，使用Agilent 300SB C8柱(21×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围从35％B初始浓度至45％B(21mpm)中间浓度，经过5分钟，然后至60％B(10.5mpm)最终浓度，经过60分钟。
实施例6：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:6
1.(HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(Dde)-(叠氮基-norLeu)- TRQRY-PAL-PEG树脂的合成
如实施例3，步骤1中所述制备树脂键合的肽，其用Fmoc-Lys(Dde)-OH代替位置30处的Fmoc-Leu-OH，并且在该步骤中将4-戊炔酸结合到位置2处(双偶联)，之后将Fmoc-Ile-OH结合到位置3处。
2.(HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH2)-(叠氮基-norLeu)- TRQRY-PAL-PEG树脂的合成
在室温下，用DMF中的3％肼(8mL/0.1mmol规模)处理上文的树脂5分钟，然后排出混合物，并用DMF洗涤。重复该步骤约5x，在这之后用DCM，然后用DMF充分洗涤树脂。
3.(HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH-γ-Glu-AcVitE)-(叠 氮基-norLeu)-TRQRY-PAL-PEG树脂的合成
使用实施例2，步骤1中所述的偶联方案将Fmoc-Glu-OtBu偶联到上文的树脂上，具有5分钟的偶联时间。使用3-阶段微波方案，通过用DMF中的20％哌啶处理来去保护树脂(75℃，0.5分钟；75℃，3分钟；75℃，3分钟)，这之后，用DMF和DCM充分洗涤该树脂。然后使用用于偶联Fmoc-Glu-OtBu的相同方法，将α-生育酚氧基乙酸(AcVitE)(8)偶联到树脂上。
4.(HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH-γ-Glu-AcVitE)-(叠 氮基-norLeu)-TRQRY-CONH2的合成
使用实施例3，步骤3中所述的方法实施得自上文的树脂的肽的裂解和沉淀。
5.环状PYY类似物SEQ ID NO:6
使用实施例3，步骤4中所述的程序制备标题化合物。在35℃，在Varian PursuitXRs C8柱上(21×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围从35％B初始浓度至48％B(21mpm)中间浓度，经过5分钟，然后至63％B(10.5mpm)最终浓度，经过40分钟。
实施例7：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:7
根据如实施例4中所述的程序制备标题化合物，其中在位置9而不是位置11处安装K(NH-γ-Glu-Pal)残基。在室温下，使用Agilent 300SB C8柱(21×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围在23％B初始浓度至43％B(21mpm)中间浓度，然后至43％B(10.5mpm)最终浓度，经过40分钟。在室温下，使用从25％B初始浓度至35％B(21mpm)中间浓度，然后至45％B(10.5mpm)最终浓度梯度，经过80分钟，在Waters T3C18柱(250×19mm，5μm)上再纯化包含不纯产物的级分。
实施例8：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:8
使用根据如实施例4中所述的程序制备标题化合物，其中在位置30而不是位置11处安装K(NH-γ-Glu-Pal)残基。在35℃，使用Agilent 300SB C8柱(21×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围在21％B初始浓度至31％B(21mpm)中间浓度，然后至41％B(10.5mpm)最终浓度，经过40分钟。在室温下，使用从21％B初始浓度至31％B(21mpm)中间浓度，然后至40％B(10.5mpm)最终浓度，经过80分钟的梯度，在Waters T3C18柱(250×19mm，5μm)上再纯化包含不纯产物的级分。
实施例9：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:9
1.H2N-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQ(psi-R35Y36)-Sieber树脂的合 成
如实施例1，步骤3所述，利用5倍过量的经保护氨基酸的修改，进行氨基酸到来自实施例1，步骤2的预加载(psi-R35,Y36)-Sieber树脂(0.1mmol)上的延长。
2.m-BrCH2PhCOHN-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQ(psi-R35Y36)- Sieber树脂的合成
根据实施例1，步骤中所述的方法将间溴甲基苯甲酸偶联到上文的树脂上，具有在50℃而不是75℃实施偶联的修改。
3.环状PYY类似物SEQ ID NO:9
遵循实施例1，步骤7和8所述的方法，制备得自上文的树脂的标题化合物。在35℃，使用Varian Pursuit XRs C18柱(21×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围从10％B初始浓度至18％B(21mpm)中间浓度，经过10分钟，然后至33％B(10.5mpm)最终浓度，经过35分钟。
实施例10：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:10
根据如实施例4中所述的程序来制备该标题化合物，在位置30处，用Dde-Lys(Fmoc)-OH替代Fmoc-Leu-OH，并且在步骤3中用α-生育酚羟基乙酸(AcVitE)(8)替代棕榈酸。在室温下，使用Agilent 300SB C8柱(21×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围在30％B初始浓度至40％B(21mpm)中间浓度，经过10分钟，然后至55％B(21mpm)最终浓度，经过35分钟。使用从35％B初始浓度至43％B(21mpm)中间浓度，经过5分钟，然后至58％B(10.5mpm)最终浓度，经过40分钟的修改的梯度，再纯化包含不纯产物的级分。
实施例11：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:11
1.(Alloc)K(NH2)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-Sieber树脂的合成
遵循实施例9，步骤1中所述的方法制备上文的树脂，在位置30处，使用Alloc-Lys(Fmoc)-OH代替Fmoc-Leu-OH。
2.(Alloc)K(NH-γ-Glu-AcVitE)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-Sieber树脂的合成
在微波条件下，在50℃，使用HBTU/DIEA-介导的偶联将Fmoc-Glu-OtBu和α-生育酚氧基乙酸(AcVitE)(8)(每个5当量)顺序地偶联到上文的树脂上15-20分钟。
3.H2N-K(NH-γ-Glu-AcVitE)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-Sieber树脂的合成
遵循实施例1，步骤4中所述的方法移除alloc保护基团。
4.环状PYY类似物SEQ ID NO:11
遵循实施例9，步骤1-3中所述的方法，制备得自上文的树脂的标题化合物，具有使用1M TRIS/HCl缓冲液，pH 7.5代替NH4OAc缓冲液的修改以实现环化。在35℃，使用VarianPursuit XRs C18柱(21×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围从10％B初始浓度至18％B(21mpm)中间浓度，经过10分钟，然后至33％B(10.5mpm)最终浓度，经过35分钟。
实施例12：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:12
根据如实施例2中所述的程序，在步骤1中用Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH置换位置35处的Fmoc-Arg(pbf)-OH，并且具有用1M NaHCO3缓冲液代替NH4OAc缓冲液的修改以实现环化。在室温下，使用Varian Pursuit XRs C18柱(30×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(0.1％TFA的水溶液)和缓冲液B(0.1％TFA的MeCN缓冲液)的梯度洗脱组成，其在10-60％B(30mpm)的范围内，经过36分钟。
实施例13：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:13
标题化合物根据与实施例11中所述的程序，在步骤2中使用棕榈酸代替α生育酚氧基乙酸(AcVitE)(8)，并且具有将60％EtOH/H2O用作溶剂代替MeCN/H2O并且饱和含水NaHCO3代替NH4OAc缓冲液的修改以实现环化。在室温下，使用Waters XBridge C18 OBD柱(50×250mm,5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的10mM NH4OH，pH约9)和缓冲液B(MeCN)的梯度洗脱组成，范围从15％B初始浓度至20％B(100mpm)中间浓度，经过5分钟，然后至35％B(100mpm)最终浓度，经过40分钟。
实施例14：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:14
根据如实施例4中所述的程序，在位置30处而不是位置11处安装s(NH-γ-Glu-Pal)残基，并且在步骤1中在位置35处用Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH代替Fmoc-Arg(pbf)-OH，并且具有在步骤6中用1M NaHCO3缓冲液代替NH4OAc缓冲液的修改，以实现环化。在室温下，使用Varian Pursuit XRs C18柱(30×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(0.1％TFA的水溶液)和缓冲液B(0.1％TFA的MeCN缓冲液)的梯度洗脱组成，其在20-70％B(30mpm)的范围内，经过36分钟。将不纯的级分在Varian Pursuit XRs二苯基柱(30×100mm，5μm)上在室温下使用30-50％B(30mpm)的梯度在25分钟内再纯化。
实施例15：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:15
根据实施例4中所述的程序制备标题化合物，在位置30处而不是位置11处安装Lys(NH-γ-Glu-Pal)残基，在位置3处用Fmoc-βAla-OH取代Fmoc-Ile-OH偶联，并且具有用1MNaHCO3缓冲液代替NH4OAc缓冲液的修改以实现环化，并且使用以下程序，在步骤6中(实施例2的步骤2)使用与溴乙酸酐的偶联代替与间溴甲基溴苯甲酸的偶联：在50℃下在微波反应器中，利用溴乙酸酐(10当量)的DMF(5mL)溶液处理Fmoc-脱保护的肽-树脂(0.1mmol)并持续5-10分钟，此时一般根据茚三酮测试确定反应完成。在确定偶联不完全的情况下，使用新鲜试剂重复该偶联。在室温下，使用Varian Pursuit XRs C18柱(30×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(0.1％TFA的水溶液)和缓冲液B(0.1％TFA的MeCN缓冲液)的梯度洗脱组成，其在20-60％B(30mpm)的范围内，经过36分钟。将不纯的级分在VarianPursuit XRs二苯基柱(30×100mm，5μm)上在室温下使用30-50％B(30mpm)的梯度在25分钟内再纯化。
实施例16：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:16
根据如实施例4所述的程序来制备该标题化合物，在位置30而不是位置11处安装Lys(NH-γ-Glu-Pal)残基，在位置3处省略Fmoc-Ile-OH偶联，并且在步骤6(实施例2的步骤2)使用对溴甲基苯甲酸代替间溴甲基苯甲酸。另选地，使用1M NaHCO3缓冲液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Varian Pursuit XRs C18柱(30×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(0.1％TFA的水溶液)和缓冲液B(0.1％TFA的MeCN缓冲液)的梯度洗脱组成，其在20-70％B(30mpm)的范围内，经过36分钟。将不纯的级分在VarianPursuit XRs二苯基柱(30×100mm，5μm)上在室温下使用30-50％B(30mpm)的梯度在25分钟内再纯化。
实施例17：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:17
根据如实施例4中所述的程序制备标题化合物，其中在位置30而不是位置11处安装Lys(NH-γ-Glu-Pal)残基，并且在步骤1中在位置4处使用Fmoc-Ala-OH代替Fmoc-Lys(Boc)-OH。在步骤6中，使用TRIS/HCl缓冲液(1M，pH 7.5)代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Agilent Polaris C18-A柱(30×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围从20％B初始浓度至35％B(40mpm)中间浓度，经过5分钟，然后至45％B(40mpm)最终浓度，经过40分钟。
实施例18：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:18
根据如实施例4中所述的程序制备标题化合物，其中在位置30而不是位置11处安装Lys(NH-γ-Glu-Pal)残基，并且在步骤1中在位置4处使用Fmoc-Glu(OtBu)-OH代替Fmoc-Lys(Boc)-OH。在步骤6中，使用TRIS/HCl缓冲液(1M，pH 7.5)代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Agilent Polaris C18-A柱(30×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围从20％B初始浓度至35％B(40mpm)中间浓度，经过5分钟，然后至45％B(40mpm)最终浓度，经过40分钟。
实施例19：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:19
根据如实施例4所述的程序制备该标题化合物，在位置30处而不是位置11处安装Lys(NH-γ-Glu-Pal)残基，在步骤1位置35处用Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH代替Fmoc-Arg(pbf)-OH，用Fmoc-Cys(trt)-OH代替Fmoc-hCys(trt)-OH，并且在步骤6(实施例2的步骤2)中使用对溴甲基苯甲酸代替间溴甲基苯甲酸。
对步骤6进行下列修改(得自实施例2的步骤3和4)：在室温下，使用VarianPursuit XRs C18柱(30×250mm，5μm)纯化环化之前获得的粗肽。流动相由缓冲液A(0.1％TFA的水溶液)和缓冲液B(0.1％TFA的MeCN缓冲液)的梯度洗脱组成，其在20-70％B(30mpm)的范围内，经过36分钟。将含产物的级分组合并用固体NaHCO3处理以使pH升至约7-8；在室温下持续搅拌所得的溶液4小时，然后用TFA酸化至pH4。浓缩溶液至5-10mL的体积并且添加MeCN以溶解任何沉淀。如上文执行产品纯化，具有20-60％B(30mpm)梯度，经过36分钟。
实施例20：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:20
根据如实施例4中所述的程序制备该标题化合物，在位30处而不是位置11处安装Lys(NH-γ-Glu-Pal)残基，在步骤1中在位置35处，Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH代替Fmoc-Arg(pbf)-OH，并且Fmoc-Cys(trt)-OH代替Fmoc-hCys(trt)-OH。根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。执行最终产品纯化，使用20-60％B(30mpm)梯度，经过36分钟。
实施例21：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:21
根据如实施例4中所述的程序制备标题化合物，其中在位置30处而不是位置11处安装Lys(NH-γ-Glu-Pal)残基，并且在步骤1中在位置26处使用Fmoc-Ala-OH代替Fmoc-His(trt)-OH，并且在位置4处使用Fmoc-Ala-OH代替Fmoc-Lys(Boc)-OH。在步骤6中，使用TRIS/HCl缓冲液(1M，pH 7.5)代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Agilent PolarisC18-A柱(30×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围从20％B初始浓度至35％B(40mpm)中间浓度，经过5分钟，然后至45％B(40mpm)最终浓度，经过40分钟。
实施例22：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:22
根据如实施例4中所述的程序制备标题化合物，在位置30处而不是位置11处安装Lys(NH-γ-Glu-Pal)残基，在步骤1中在位置26处使用Fmoc-Ala-OH代替Fmoc-His(trt)-OH，并且在位置4处使用Fmoc-Glu(OtBu)-OH代替Fmoc-Lys(Boc)-OH。在步骤6中，使用TRIS/HCl缓冲液(1M，pH7.5)代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Agilent PolarisC18-A柱(30×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围从20％B初始浓度至33％B(40mpm)中间浓度，经过5分钟，然后至43％B(40mpm)最终浓度，经过40分钟。
实施例23：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:23
根据实施例11中所述的程序制备标题化合物，使十八烷二酸、单叔丁基酯(购自AstaTech,Inc.)代替α-生育酚氧基乙酸(AcVitE)(8)，偶联方案在50℃下采用HATU/DIEA并持续30分钟，并且在步骤2中NMP作为溶剂代替DMF，并且在步骤2中，在偶联Fmoc-Glu-OtBu之前，将Fmoc-OEG-OH的两个单元串联偶联。根据实施例19中所述的修改将粗线性肽纯化和环化，其使用20-60％B的梯度。使用20-70％B(30mpm)的梯度在36分钟内进行最终产物纯化。
实施例24：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:24
根据实施例23中所述的程序制备该标题化合物，使用20-(叔丁氧基)-20-氧代二十烷酸(购自Key Organics,Inc.)代替十八烷二酸，单叔丁基酯。使用20–60％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-60％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例25：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:25
根据实施例11中所述的程序制备标题化合物，其使用硬脂酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，偶联方案在50℃下采用HATU/DIEA并持续30分钟，并且在步骤2中NMP作为溶剂代替DMF。使用20–80％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-80％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例26：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:26
根据实施例11中所述的程序制备标题化合物，使用花生酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，偶联方案在50℃下采用HATU/DIEA并持续30分钟，并且在步骤2中NMP作为溶剂代替DMF。使用20–90％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-90％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例27：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:27
根据实施例23所述的程序制备标题化合物，但在串联Fmoc-OEG-OH偶联后省略Fmoc-Glu-OtBu的偶联。使用20–60％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-60％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例28：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:28
根据实施例11中所述的程序制备该标题化合物，使用棕榈酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，在步骤4(实施例9，步骤2)中，在位置3处省略Fmoc-Ile-OH的偶联，并且使用对溴甲基苯甲酸代替间溴甲基苯甲酸。使用20–60％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-60％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例29：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:29
根据实施例11中所述的程序制备该标题化合物，使用棕榈酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，在位置3处用Fmoc-βAla-OH代替Fmoc-Ile-OH，并且使用实施例15所述的修改，在步骤4(实施例9，步骤2)中溴乙酸酐代替间溴甲基苯甲酸进行偶联。使用20–60％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-60％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例30：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:30
根据实施例11中所述的程序制备该标题化合物，使用棕榈酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，在位置3处用Fmoc-β-OH代替Fmoc-Ile-OH，并且在步骤4(实施例9，步骤2)中，使用实施例15中所述的修改，用溴乙酸酐代替间溴甲基苯甲酸进行偶联。使用20–60％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-60％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例31：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:31
根据实施例23中所述的程序制备该标题化合物，使用十八烷二酸，单叔丁酯。使用20–60％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-60％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例32：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:32
根据实施例11中所述的程序制备标题化合物，在步骤2中使用棕榈酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，在步骤4(实施例9，步骤1)中，在位置26处使用Fmoc-Ala-OH代替Fmoc-His(trt)-OH，并且在位置4处使用Fmoc-Ala-OH代替Fmoc-Lys(Boc)。在步骤6中，使用TRIS/HCl缓冲液(1M，pH 7.5)代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用AgilentPolaris C18-A柱(30×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围从20％B初始浓度至35％B(40mpm)中间浓度，经过5分钟，然后至45％B(40mpm)最终浓度，经过40分钟。
实施例33：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:33
根据实施例11中所述的程序制备该标题化合物，在步骤2中使用棕榈酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，并且在步骤4(实施例9，步骤1)中，在位置34处使用Fmoc-N(Me)-Gln(trt)-OH代替Fmoc-Gln(trt)-OH。在这种情况下，在室温下使用NMP作为溶剂和HATU/DIEA方案(1小时，单偶联)实施偶联；Fmoc-N(Me)-Gln(trt)-OH和Fmoc-Arg(pbf)-OH被双偶联。全部使用两阶段Fmoc去保护方案(DMF中的20％哌啶；室温；10分钟，15分钟)。使用20–70％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-70％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例34：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:34
根据实施例11中所述的程序制备该标题化合物，使用棕榈酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，在位置31处用Fmoc-Cys(trt)-OH代替Fmoc-hCys(trt)-OH，在位置3处用6-Fmoc-氨基己酸代替Fmoc-Ile-OH，并且使用实施例15所述的修改，在步骤4(实施例9，步骤2)中用溴乙酸酐代替间溴甲基苯甲酸进行偶联。水性使用NaHCO3(2N)代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Varian Pursuit XRs C18柱(30×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(0.1％TFA的水溶液)和缓冲液B(0.1％TFA的MeCN缓冲液)的梯度洗脱组成，其在20-70％B(30mpm)的范围内，经过36分钟。
实施例35：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:35
根据实施例9中所述的程序制备标题化合物，其具有以下修改：将根据实施例1，步骤1中的程序，由Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH代替Fmoc-Arg(Pbf)-OH制得的Fmoc-psi-[N-Me-Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OH，用于代替Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OH(6)来制备本文所用的负载的Sieber树脂。在位置30处，Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH(得自Active Peptide)被用于代替Leu；在步骤2中，间氯甲基苯甲酸被用来代替间溴甲基苯甲酸；在室温下使用NMP作为溶剂和HATU/DIEA方案(1小时，单偶联)实施偶联；Fmoc-Arg(pbf)-OH被双偶联。全部使用两阶段Fmoc去保护方案(DMF中的20％哌啶；室温；10分钟，15分钟)。使用20–70％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-70％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例36：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:36
根据实施例35中所述的程序制备标题化合物，在位置3处用Fmoc-βAla-OH代替Fmoc-Ile-OH，并且使用实施例15所述的修改，在步骤4(实施例9，步骤2)中，用溴乙酸酐代替间溴苯甲酸进行偶联。实施例19的修改工作被删除了。在微波条件下，在50℃偶联Fmoc-βAla-OH 20分钟。使用饱和NaHCO3水溶液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Varian Pursuit XRs C18柱(30×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(0.1％TFA的水溶液)和缓冲液B(0.1％TFA的MeCN缓冲液)的梯度洗脱组成，其在20-70％B(30mpm)的范围内，经过36分钟。
实施例37：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:37
根据实施例9中所述的程序制备标题化合物，在位置31处用Fmoc-Cys(trt)-OH代替Fmoc-hCys(trt)-OH，并且在位置30处，用Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH(得自ActivePeptide)代替Fmoc-Leu-OH。此外，在步骤1中，在位置2处，Fmoc-Abu-OH被附加到序列上，并且在步骤2中用溴乙酸酐的偶联被用于代替间溴甲基苯甲酸，使用实施例15中所述的修改。在步骤3中，使用饱和NaHCO3水溶液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用VarianPursuit XRs C18柱(30×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(0.1％TFA的水溶液)和缓冲液B(0.1％TFA的MeCN缓冲液)的梯度洗脱组成，其在20-70％B(30mpm)的范围内，经过36分钟。
实施例38：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:38
根据实施例35所述的程序制备该标题化合物，其具有以下修改：在步骤1之后，在50℃下使用微波条件并持续20分钟，在位置2处，将Fmoc-βAla-OH附加到序列上，并且使用实施例15中所述的修改，在步骤2中，使用溴乙酸酐的偶联代替间溴甲基苯甲酸。使用饱和NaHCO3水溶液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Varian Pursuit XRs C18柱(30×250mm，5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(0.1％TFA的水溶液)和缓冲液B(0.1％TFA的MeCN缓冲液)的梯度洗脱组成，其在20-80％B(30mpm)的范围内，经过36分钟。
实施例39：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:39
根据实施例11中所述的程序制备该标题化合物，在步骤2中，使用花生酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)。在步骤4中，在位置4处，使用Fmoc-Ser(tBu)-OH代替Fmoc-Lys(Boc)-OH(实施例9，步骤1)，并且在步骤4中，使用间氯甲基苯甲酸代替间溴甲基苯甲酸(实施例9，步骤2)。在步骤4中，使用60％EtOH/H2O作为溶剂代替MeCN/H2O，并使用饱和NaHCO3水溶液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Waters XBridge C18 OBD柱(50×250mm,5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的10mM NH4OH，pH约9)和缓冲液B(MeCN)的梯度洗脱组成，范围从20％B初始浓度至25％B(100mpm)中间浓度，经过5分钟，然后至40％B(100mpm)最终浓度，经过40分钟。
实施例40：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:40
1.(HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(Dde)-(叠氮基-norLeu)- TRQ(psi-R35Y36)-Sieber树脂的合成
在室温下使用作为溶剂的NMP、5倍过量的经保护氨基酸和HATU/DIEA方案(1小时，单偶联)；进行氨基酸到来自实施例1，步骤2的预加载(psi-R35,Y36)-Sieber树脂(0.1mmol)上的延长；Fmoc-Arg(pbf)-OH和Fmoc-His(trt)-OH被双偶联。全部使用两阶段Fmoc去保护方案(DMF中的20％哌啶；室温；10分钟，15分钟)。
2.(HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH2)-(叠氮基-norLeu)- TRQ(psi-R35Y36)-Sieber树脂的合成
在室温下，用DMF中的2％肼(12mL/0.2mmol规模)处理上文的树脂2分钟，然后排出混合物。重复该步骤约4x，在这之后用DCM，然后用DMF充分洗涤树脂。
3.(HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK((OEG)2-γ-Glu-PaL)-(叠 氮基-norLeu)-TRQ(psi-R35Y36)-Sieber树脂的合成
在室温下，上文的树脂用(S)-10,19-二氧代-22-棕榈酰胺基-3,6,12,15-四氧杂-9,18-二氮杂二十三烷二酸(5当量)[根据对于中间体3的合成所述的方法制备，在步骤G中，以棕榈酸代替18-叔丁氧基-18-氧代十八酸]，使用HBTU/DIEA方案偶联1.5小时。排出树脂并用DMF和DCM充分洗涤。
4.(HCCH(CH2)2CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK((OEG)2-γ-Glu-PaL)-(叠 氮基-norLeu)-TRQ(psi-R35Y36)-CONH2的合成
用2％TFA于DCM(20mL)中的溶液处理干燥的树脂，并混合20分钟，然后过滤。对于每次处理使用新鲜的混合物重复该处理另外的2次。然后将合并的滤液合并浓缩以得到粗的经保护肽，其为黄色泡沫。在室温下用20mL的裂解混合物(TFA/H2O/TIPS＝95/2.5/2.5)处理该泡沫2.5小时。然后在氮气流下浓缩至约2.5mL的体积。然后添加冷醚(40mL)以沉淀肽，并且将混合物离心(5分钟；5000rpm)并滗出。将该方法再重复2次，以获得灰白色粉末状粗肽。
另选地，没有之前用DCM中的1-2％TFA处理，用裂解混合物处理的树脂以直接提供完全去保护的肽。使用Varian Pursuit XRs C18柱(30×250mm，5μm)通过反相制备型HPLC纯化该粗肽。流动相由缓冲液A(0.1％TFA的水溶液)和缓冲液B(0.1％TFA的MeCN缓冲液)的梯度洗脱组成，其在20-70％B的范围内，经过36分钟。紫外检测在220nm和254nm下进行监测。包含产品的级分使用与上文相同类型的柱(4.6×250mm，5μm)，通过分析的HPLC，在Agilent 1100HPLC系统上分析。将纯级分合并，并且然后冻干以获得为棉化状固体的产物。LCMS:1211.8(M+4H)/4,1615.4(M+3H)/3和2422.9(M+2H)/2对于产品峰在16.87分钟(LC:Atlantis T3C18柱，5μm,4.6×250mm，1.0mL/min，30-60％梯度)。
5.环状PYY类似物SEQ ID NO:40
制备1mL H2O中的5.1mg的CuSO4。制备3mL的EtOH中的10.4mg的TBTA。预混合400μL的CuSO4溶液和3mL TBTA溶液。制备2mL的H2O中的13mg的抗坏血酸Na。
向得自步骤4(37mg)，在4mL的HEPES(0.1M,pH 7.4)中的纯化的含叠氮基的肽溶液添加1.7mL的预混合的CuSO4/TBTA溶液，之后添加1mL的抗坏血酸Na溶液。调节EtOH/H2O比率直至反应溶液变成澄清。在室温下搅拌该混合物并通过HPLC监控。30分钟后，反应完成。将混合物调节至pH 4，并通过反相制备型HPLC纯化。使用Varian Pursuit XRs C18柱(30×250mm，5μm)执行纯化。流动相由缓冲液A(0.1％TFA的水溶液)和缓冲液B(0.1％TFA的MeCN缓冲液)的梯度洗脱组成，其在20-60％B的范围内，经过36分钟。紫外检测在220nm和254nm下进行监测。包含产品的级分使用与上文相同类型的柱(4.6×250mm，5μm)，通过分析的HPLC，在Agilent 1100HPLC系统上分析。将纯级分合并，并且然后冻干以获得为棉化状固体的产物。
实施例41：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:41
根据实施例40中所述的程序制备标题化合物，其在步骤3中用L-谷氨酸、N-(1-氧代十六烷基)-,1-(1,1-二甲基乙基)酯代替(S)-10,19-二氧代-22-棕榈酰胺基-3,6,12,15-四氧杂-9,18-二氮杂二十三碳二酸。
实施例42：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:42
根据实施例40中所述的程序制备标题化合物，在步骤3中用(S)-22-(叔丁氧基羰基)-43,43-二甲基-10,19,24,41-四氧代-3,6,12,15,42-五氧待-9,18,23-三氮杂四十四烷-1-酸(16)(中间体2)代替(S)-10,19-二氧杂-22-棕榈酰胺-3,6,12,15-四氧杂-9,18-二氮杂二十三碳二酸。
实施例43：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:43
1.(Alloc)Lys((OEG)2-γ-Glu-NH2)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-Sieber树脂的合成
在室温下使用作为溶剂的NMP、5倍过量的经保护氨基酸和HATU/DIEA方案(1小时，单偶联)；进行氨基酸到来自实施例1，步骤2的预加载(psi-R35,Y36)-Sieber树脂(0.1mmol)上的延长；Fmoc-Arg(pbf)-OH被双偶联。全部使用两阶段Fmoc去保护方案(DMF中的20％哌啶；室温；10分钟，15分钟)。
2.(Alloc)Lys((OEG)2-γ-Glu-PaL)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-Sieber树脂的合成
在50℃，使用微波条件，使用HATU/DIEA，20–30分钟，并且NMP作为溶剂，将棕榈酸偶联到得自步骤1的树脂上。
3.(H2N)Lys((OEG)2--γ-Glu-PaL)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-Sieber树脂的合成
遵循实施例1，步骤4中所述的方法移除上文的树脂上的alloc保护基团。
4.环状PYY类似物SEQ ID NO:43
遵循实施例9，步骤1-3中所述的方法，在步骤2中，使用间氯甲基苯甲酸代替间溴甲基苯甲酸制备得自上文的树脂的标题化合物。使用20–60％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-60％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例44：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:44
根据实施例43所述的程序制备标题化合物，对其修饰使得串联Fmoc-OEG-OH单元和Fmoc-Glu-OtBu单元掺入步骤2而不是步骤1中。在步骤2中使用十八烷二酸，单叔丁酯(AstaTech，Inc.)代替棕榈酸，并且在位置11而不是位置30处安装连接基-脂质序列。使用20–70％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-70％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例45：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:45
根据实施例43所述的程序制备该标题化合物，对其修饰使得使用Fmoc-dPEG24-羧酸代替串联Fmoc-OEG-OH单元，并且连同棕榈酸一起掺入步骤2中。在位置11而不是位置30处安装连接基-脂质序列。使用20–90％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-90％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例46：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:46
根据实施例9中所述的程序制备标题化合物，在位置30处，使用Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH(得自Active Peptide)代替Leu。此外，遵循步骤1，在50℃，使用微波条件，在位置2处，Fmoc-βAla-OH被附加到序列20分钟，并且在步骤2中，用溴乙酸酐的偶联被用于代替间溴甲基苯甲酸，使用实施例15中所述的修改。使用20–70％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化固体粗制线性的肽。使用20-70％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例47：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:47
根据实施例44所述的程序制备标题化合物，将连接基-脂质序列安装在位置7处而不是位置11处。在室温下，使用Varian Pursuit XRs C18柱(30×250mm，5μm)执行产品纯化。使用20–60％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-60％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例48：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:48
根据实施例43所述的程序制备标题化合物，在步骤2中使用十八烷二酸，单叔丁基酯(AstaTech,Inc.)代替棕榈酸，其中偶联时间为30分钟，并且将连接基-脂质序列安装在位置22处而不是位置30处。使用20–70％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-70％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例49：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:49
按照实施例11中所述的程序制备该标题化合物，在步骤2中，使用16-四氢吡喃-2-基氧基棕榈酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，并且在步骤4(实施例9，步骤2)中，使用间氯甲基苯甲酸代替间溴甲基苯甲酸。在步骤4中，使用60％EtOH/H2O作为溶剂代替MeCN/H2O，并使用饱和NaHCO3水溶液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Waters XBridgeC18 OBD柱(50×250mm,5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的10mM NH4OH，pH约9)和缓冲液B(MeCN)的梯度洗脱组成，范围从20％B初始浓度至10％B(100mpm)中间浓度，经过5分钟，然后至30％B(100mpm)最终浓度，经过40分钟。
实施例50：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:50
根据实施例48中所述的程序制备该标题化合物，并将连接基-脂质序列安装在位置23处而不是位置30处。
实施例51：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:51
根据实施例9中所述的程序制备标题化合物，在步骤1中，在位置30处用Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH(得自Active Peptide)代替Fmoc-Leu-OH，并且在位置4处，用Fmoc-Ser(tBu)-OH代替Fmoc-Lys(Boc)-OH。在步骤4中，使用60％EtOH/H2O作为溶剂代替MeCN/H2O，并使用饱和NaHCO3水溶液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Waters XBridge C18OBD柱(50×250mm,5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的10mM NH4OH，pH约9)和缓冲液B(MeCN)的梯度洗脱组成，范围在10％B初始浓度至20％B(100mpm)中间浓度，经过5分钟，然后至30％B(100mpm)最终浓度，经过40分钟。使用包含10％B初始浓度至20％B(100mpm)中间浓度，经过5分钟，然后至30％B(100mpm)最终浓度，经过60分钟的梯度，再用色谱法分析不纯的级分。
实施例52：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:52
根据实施例43所述的程序制备该标题化合物，使用Fmoc-dPEG12-羧酸代替串联Fmoc-OEG-OH单元，并且将其连同Fmoc-Glu-OtBu和棕榈酸一起掺入步骤2中。在位置11而不是位置30处安装连接基-脂质序列。使用20–70％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-70％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例53：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:53
根据实施例52所述的程序制备标题化合物，其使用串联的Fmoc-OEG-OH的四个单元代替Fmoc-dPEG12-羧酸。
实施例54：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:54
根据实施例53中所述的方法制备标题化合物，其串联安装Fmoc-OEG-OH的两个单元而不是两个。
实施例55：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:55
根据实施例43所述的程序制备标题化合物，将连接基-脂质序列安装在位置23处而不是位置30处。使用20–70％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-70％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化
实施例56：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:56
根据实施例11中所述的方法制备标题化合物，在步骤2中(4’-氯联苯-4-基)-乙酸代替α--生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，并且在步骤4(实施例9，步骤2)中，使用间氯甲基苯甲酸代替间溴甲基苯甲酸。在步骤4中，使用60％EtOH/H2O作为溶剂代替MeCN/H2O，并使用饱和NaHCO3水溶液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Waters XBridge C18 OBD柱(50×250mm,5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A缓冲液A(水中的10mm NH4OH，pH约9)和缓冲液B(MeCN)的梯度洗脱组成，范围在10-28％B(100mpm)，经过40分钟。
实施例57：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:57
按照实施例11中所述的程序制备该标题化合物，在步骤2中，使用3-[(2,4-二氯苯氧基)苯-4-基]丙酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，并且在步骤4(实施例9，步骤2)中，使用间氯甲基苯甲酸代替间溴甲基苯甲酸。在步骤4中，使用60％EtOH/H2O作为溶剂代替MeCN/H2O，并使用饱和NaHCO3水溶液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用WatersXBridge C18 OBD柱(50×250mm,5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的10mmNH4OH，pH约9)和缓冲液B(MeCN)的梯度洗脱组成，范围在10-30％B(80mpm)，经过40分钟。合并含产品的级分，在室温下，用TFA酸化、浓缩并在Agilent Polaris C18-A柱(30×250mm，5μm)上再用色谱法分析。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围从20％B初始浓度至15％B(40mpm)中间浓度，至45％B(40mpm)最终浓度，经过45分钟。
实施例58：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:58
按照实施例11中所述的程序制备该标题化合物，在步骤2中，使用11-(4-四氟苯基}十一烷酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，并且在步骤4(实施例9，步骤2)中，使用间氯甲基苯甲酸代替间溴甲基苯甲酸。在步骤4中，使用60％EtOH/H2O作为溶剂代替MeCN/H2O，并使用饱和NaHCO3水溶液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Waters XBridgeC18 OBD柱(50×250mm,5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(10mM NH4OH的水溶液，pH约9)和缓冲液B(MeCN)的梯度洗脱组成，其在15-35％B(100mpm)的范围内，经过40分钟。
实施例59：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:59
根据实施例43中所述的程序制备该标题化合物，省略步骤2，并且将棕榈酸联接掺入步骤1中。连接基-脂质序列被安装在位置22处而不是位置11处。使用20–70％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-70％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化
实施例60：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:60
根据实施例53中所述的程序制备该标题化合物，掺入串联的FMOC-OEG-OH单元而不是四个，并将连接基-脂质序列安装在位置7处而不是位置11处。使用20–80％B的梯度，根据实施例19中所述的修改纯化并环化粗制线性的肽。使用20-80％B(30mpm)梯度，经过36分钟执行最终产品纯化。
实施例61：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:61
按照实施例11中所述的程序制备该标题化合物，在步骤2中，使用11-(4-三氟甲基)苯基]十一烷酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，并且在步骤4(实施例9，步骤2)中，使用间氯甲基苯甲酸代替间溴甲基苯甲酸。在步骤4中，使用60％EtOH/H2O作为溶剂代替MeCN/H2O，并使用饱和NaHCO3水溶液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用WatersXBridge C18 OBD柱(50×250mm,5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(10mM NH4OH的水溶液，pH约9)和缓冲液B(MeCN)的梯度洗脱组成，其在15-35％B(100mpm)的范围内，经过40分钟。
实施例62：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:62
按照实施例11中所述的程序制备该标题化合物，在步骤2中，使用11,11,11-三氟十一烷酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，并且在步骤4(实施例9，步骤2)中，使用间氯甲基苯甲酸代替间溴甲基苯甲酸。在步骤4中，使用60％EtOH/H2O作为溶剂代替MeCN/H2O，并使用饱和NaHCO3水溶液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Waters XBridge C18OBD柱(50×250mm,5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(10mM NH4OH的水溶液，pH约9)和缓冲液B(MeCN)的梯度洗脱组成，其在10-28％B(100mpm)的范围内，经过40分钟。
实施例63：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:63
按照实施例11中所述的程序制备该标题化合物，在步骤2中，使用15,15,15-三氟十五烷酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，并且在步骤4(实施例9，步骤2)中，使用间氯甲基苯甲酸代替间溴甲基苯甲酸。在步骤4中，使用60％EtOH/H2O作为溶剂代替MeCN/H2O，并使用饱和NaHCO3水溶液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Waters XBridge C18OBD柱(50×250mm,5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(10mM NH4OH的水溶液，pH约9)和缓冲液B(MeCN)的梯度洗脱组成，其在15-30％B(100mpm)的范围内，经过40分钟。
实施例64：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:64
按照实施例11中所述的程序制备该标题化合物，在步骤2中，使用16-乙氧基棕榈酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，并且在步骤4(实施例9，步骤2)中，使用间氯甲基苯甲酸代替间溴甲基苯甲酸。在步骤4中，使用60％EtOH/H2O作为溶剂代替MeCN/H2O，并使用饱和NaHCO3水溶液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Waters XBridge C18 OBD柱(50×250mm,5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(10mM NH4OH的水溶液，pH约9)和缓冲液B(MeCN)的梯度洗脱组成，其在15-30％B(100mpm)的范围内，经过40分钟。
实施例65：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:65
按照实施例11中所述的程序制备该标题化合物，在步骤2中，使用13,13,14,14,15,15,16,16,16-D9-棕榈酸(Cambridge Isotopes)代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，并且在步骤4(实施例9，步骤2)中，使用间氯甲基苯甲酸代替间溴甲基苯甲酸。在步骤4中，使用60％EtOH/H2O作为溶剂代替MeCN/H2O，并使用饱和NaHCO3水溶液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Waters XBridge C18 OBD柱(50×250mm,5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(水中的10mM NH4OH，pH约9)和缓冲液B(MeCN)的梯度洗脱组成，范围从15％-20％B(100mpm)，经过5分钟，然后至35％B(100mpm)，经过40分钟。
实施例66：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:66
按照实施例11中所述的程序制备该标题化合物，在步骤2中，使用11-[(2,4-双(三氟甲基)苯基]十一烷酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，并且在步骤4(实施例9，步骤2)中，使用间氯甲基苯甲酸代替间溴甲基苯甲酸。在步骤4中，使用60％EtOH/H2O作为溶剂代替MeCN/H2O，并使用饱和NaHCO3水溶液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Waters XBridge C18 OBD柱(50×250mm,5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(10mMNH4OH的水溶液，pH约9)和缓冲液B(MeCN)的梯度洗脱组成，其在15-35％B(100mpm)的范围内，经过40分钟。
实施例67：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:67
按照实施例11中所述的程序制备该标题化合物，在步骤2中，使用11-[(3,5-双(三氟甲基)苯基]十一烷酸代替α-生育酚氧乙酸(AcVitE)(8)，并且在步骤4(实施例9，步骤2)中，使用间氯甲基苯甲酸代替间溴甲基苯甲酸。在步骤4中，使用60％EtOH/H2O作为溶剂代替MeCN/H2O，并使用饱和NaHCO3水溶液代替NH4OAc缓冲液以实现环化。在室温下，使用Waters XBridge C18 OBD柱(50×250mm,5μm)执行产品纯化。流动相由缓冲液A(10mMNH4OH的水溶液，pH约9)和缓冲液B(MeCN)的梯度洗脱组成，其在15-35％B(100mpm)的范围内，经过40分钟。
实施例68：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:68
1.(Fmoc)-βA-IKPEAPGEK(Alloc)ASPEELNRYYASLRHYLNCVTRQ(psi-R35Y36)- Sieber树脂的合成
在室温下使用DMF作为溶剂，6倍过量的保护的氨基酸和HATU/DIEA方案，实施氨基酸延长至得自实施例1，步骤2的预加载的(psi-R35,Y36)-Sieber树脂上(0.1mmol)(10分钟，双偶联)。全部使用两阶段Fmoc去保护方案(DMF中的20％哌啶；室温；10分钟，15分钟)。
2.(Fmoc)-βA-IKPEAPGEK((OEG)2-γ-Glu-NHCO(CH2)16CO2tBu)- ASPEELNRYYASLRHYLNCVTRQ(psi-R35Y36)-Sieber树脂的合成
遵循实施例1，步骤4所述的方法实施上文的树脂的去保护，对于每个处理，使用修改的10分钟反应时间。然后用中间体2(15)(5当量)，使用HATU/DIEA方案于DMF中(1小时，室温)偶联树脂。
3.(BrAc)-βA-IKPEAPGEK((OEG)2-γ-Glu-NHCO(CH2)16CO2tBu)-ASPEELNRYYASLRHYLNCVTRQ(psi-R35Y36)-Sieber树脂的合成
遵循Fmoc去保护(20％哌啶/DMF)，用溴乙酸酐(10当量；室温，30分钟)处理上文的树脂以提供溴乙酰化的树脂。
4.(BrAc)-βA-IKPEAPGEK((OEG)2-γ-Glu-NHCO(CH2)16CO2tBu)- ASPEELNRYYASLRHYLNCVTRQ(psi-R35Y36)-CONH2的合成
在室温下，用由TFA/H2O/TIPS(95:2.5:2.5)组成的裂解混合物处理上文的树脂1.5小时。按照实施例1，步骤7中所述的程序用醚沉淀粗肽。
5.环状PYY类似物SEQ ID NO:68
将上文获得的粗肽以10mg/mL的浓度溶解于10％MeCN/H2O中，并且添加TEA以升高溶液pH至8-9。在室温下持续搅拌约20分钟后，添加TFA以降低pH至2，并且在KineticsC18Evo柱(30×100mm，5μm)上通过制备型HPLC直接纯化该溶液。流动相由缓冲液A(0.1％TFA的水溶液)和缓冲液B(0.1％TFA的MeCN缓冲液)的梯度洗脱组成，其在20-60％B的范围内，经过22分钟。紫外检测在220nm和254nm下进行监测。将纯级分合并，并且然后冻干以获得棉化状固体的产物。
实施例69：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:69
1.(Boc)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNLE(OAllyL)TRQ(psi-R35Y36)- Sieber树脂的合成
在室温下使用作为溶剂的DMF、6倍过量的经保护氨基酸和HATU/DIEA方案(10分钟，双偶联)；进行氨基酸到来自实施例1，步骤2的预加载(psi-R35,Y36)-Sieber树脂(0.1mmol)上的延长；全部使用两阶段Fmoc去保护方案(DMF中的20％哌啶；室温；10分钟，15分钟)。
2.(Boc)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNLE(NHS)TRQ(psi-R35Y36)- Sieber树脂的合成
遵循实施例1，步骤4中所述的方法实施上文树脂的Alloc-去保护，对于每个处理，使用修改的10分钟反应时间。然后用NHS(10当量)，使用HATU/DIEA方案于DMF中(1小时，室温，双偶联)偶联树脂。
3.(NH2)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNLE(NHS)TRQ(psi-R35Y36)的合 成
在室温下，用由TFA/H2O/TIPS(95:2.5:2.5)组成的裂解混合物处理上文的树脂1.5小时。按照实施例1，步骤7中所述的程序用醚沉淀粗肽。
4.环状PYY类似物SEQ ID NO:69
将上文获得的粗肽以80mg/mL的浓度溶解于DMSO中，并且添加TEA(25当量)以实现内酰胺化作用。在室温下搅拌约30分钟之后，反应用10％MeCN/水稀释10倍，将pH调节至2，并且通过在Kinetics C18Evo柱(30×100mm，5μm)上由制备型HPLC直接纯化粗肽。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度组成，范围为10％-60％B，经过22分钟。在220nm和254nm处监测UV检测。将纯级分合并，并且然后冻干以获得K(Dde)-保护的肽在室温下，使用2％肼/DMF(10mg肽/ml)30分钟移除该Dde保护基团。反应用10％MeCN/水稀释10倍，并且利用TFA将pH调节至2，并且如上纯化粗肽溶液以产生棉样固体状产物。
实施例70：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:70
根据实施例69中的程序制备标题化合物，在位置30处以Fmoc-E(OAlL)-OH代替Fmoc-Leu-OH，并在位置31处以Fmoc-Val-OH代替Fmoc-E(OAlL)-OH。
实施例71：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:71
1.(Boc)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNE(OAllyL)VTRQ(N-Me-R)Y- NovaSynTGR树脂的合成
使用实施例69，步骤1中所述的程序实施氨基酸延长至NovaSyn TGR树脂(0.1mmol)。
2.环状PYY类似物SEQ ID NO:71
使用实施例69，步骤2-4中所述的程序由上述树脂制备标题化合物。
实施例72：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:72
1.(S)-22-(叔丁氧羰基)-43,43-二甲基-10,19,24,41-四氧代-3,6,12,15,42-五 氧杂-9,18,23-三氮杂四十四烷-1-酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的合成
向(S)-22-(叔丁氧羰基)-43,43-二甲基-10,19,24,41-四氧代-3,6,12,15,42-五氧杂-9,18,23-三氮杂四十四烷-1-酸(中间体2(16))(54.0mg，0.063mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(14.6mg，0.127mmol)和HATU(24.1mg，0.063mmol)于1.0ml的DMF中的溶液中添加DIEA(0.022mL，0.127mmol)，并且在室温下持续搅拌混合物30分钟，并且直接用于下一步而无需进一步纯化。
2.合成环状PYY类似物SEQ ID NO:72
向[环-(G2-E30),S4,K11,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36(在实施例70中制备的)(4mg，0.96μmoL)于DMF(0.2mL)中的溶液中添加24μL的N-羟基酯溶液(在步骤1中制备的)和TEA(0.66μL；5当量)，并且在室温下搅拌混合物过夜。反应用10％MeCN/水稀释10倍，利用TFA将pH调节至2，并且通过在Kinetics C18Evo柱(30×100mm，5μm)上由制备型HPLC直接纯化粗肽。流动相由缓冲液A(水中的0.1％TFA)和缓冲液B(MeCN中的0.1％TFA)的梯度洗脱组成，范围为10％-60％B，经过22分钟。在220nm和254nm处监测UV检测。将纯级分合并，并且然后冻干以获得叔丁基酯-保护的肽。在室温下，使用混合物TFA/H2O/TIPS(95:2.5:2.5)1.5小时移除叔丁酯保护基团。浓缩该混合物并且如上所述纯化肽，以得到棉样固体状产物。
实施例73：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:73
根据如实施例1中所述的程序来制备该标题化合物，在步骤5中用N-Fmoc-dPEG6-羧酸代替N-Fmoc-dPEG12-羧酸。
实施例74：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:74
根据实施例1中所述的程序制备标题化合物，但跳过PEG连接基偶联步骤5。
实施例75：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:75
根据如实施例1中所述的程序制备标题化合物，在步骤3中在位置31处，用Fmoc-C(trt)-OH代替Fmoc-hC(trt)-OH，并跳过Fmoc-βA-OH偶联步骤。
实施例76：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:76
根据如实施例1中所述的程序制备标题化合物，其具有修改的步骤3和步骤4。在步骤A中，Fmoc-K(Alloc)-OH和Fmoc-K(dde)-OH分别用于位置30和位置11。在用Pd(PPh3)4-苯基硅烷在位置30处将Alloc去保护后，用HATU-DIPEA偶联mPEG16-羧酸。在步骤4中，用DMF中的2％肼移除在位置11处的dde。
实施例77：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:77
根据如实施例76中所述的程序制备该标题化合物，在步骤A中用mPEG12-羧酸代替mPEG16-羧酸，并且跳过步骤5中的Fmoc-dPEG12-羧酸偶联步骤。
实施例78：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:78
根据如实施例1中所述的程序制备标题化合物，在步骤3中用Fmoc-N-Me-Q(trt)-OH代替Fmoc-Q(trt)-OH。
实施例79：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:79
根据如实施例1中所述的程序来制备标题化合物，在步骤1B中用Fmoc-N-Me-R(pbf)-OH代替Fmoc-R(pbf)-OH。
实施例80：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:80
根据如实施例79中所述的程序制备标题化合物，在步骤3中在位置4处，用Fmoc-R(pbf)-OH代替Fmoc-K(Boc)-OH，并在位置30处，用Fmoc-W(Boc)-OH代替Fmoc-L-OH。
实施例81：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:81
根据如实施例80中所述的程序制备标题化合物，在步骤3中在位置31处，用Fmoc-C(trt)-OH代替Fmoc-hC(trt)-OH，并用Fmoc-γ-氨基丁酸代替Fmoc-βA-OH。
实施例82：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:82
根据如实施例1中所述的程序制备标题化合物，在位置31处，用Fmoc-PEG2-羧酸代替Fmoc-βA-OH，并用Fmoc-C(trt)-OH代替Fmoc-hC(trt)-OH，以及跳过步骤3中的Fmoc-Ile-OH偶联。
实施例83：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:83
根据如实施例1中所述的程序制备标题化合物，在步骤3中在位置31处，用Fmoc-K(N3)-OH代替Fmoc-hC(trt)-OH，并用戊-4-炔酸代替Fmoc-βA-OH，并且之后如下进行环化程序B。
环化方法B：向具有PEG12-AcBr安装在位置11处的完全去保护的肽(38mg，0.0067mmol)于2mL的HEPES(pH 7.4)中的溶液添加1.7mL的预混合的CuSO4/TBTA溶液(该溶液通过混合2.2mg的CuSO4于水(0.4mL)中的溶液和11mg的TBTA于EtOH中的溶液制备)，之后添加7mg的抗坏血酸钠于水(1mL)中的溶液。将澄清的反应溶液在室温下搅拌并通过HPLC监测。30分钟后，反应完成，并且使用TFA将反应混合物调节至pH 4并进行HPLC纯化(PursuitXRS 5 250x30mm C18柱，以30mpm流量运行，在214nM波长下检测，其中梯度范围为20-60％ACN-水/水，两者均具有0.1％TFA，经过36分钟)。收集期望的级分并冻干。
实施例84：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:84
根据如实施例1中所述的程序制备该标题化合物，跳过Fmoc-βA-OH偶联步骤，在步骤5中用N3-PEG8-羧酸代替Fmoc-dPEG12-羧酸，并且在步骤3中用于DIC偶联的3-(溴甲基)苯甲酸代替溴乙酸酐酰化，并且之后如下进行环化程序C。
环化方法C：向完全去保护的肽(20mg，0.0035mmol)于5mL的脱气的水中的溶液添加NaHCO3水溶液以调节反应混合物至pH 6.4或更高。20分钟后，LCMS指示反应完成，并且使用TFA将反应混合物调节至pH 4并进行HPLC纯化(Pursuit XRS 5250×30mm C18柱，以30mpm流量运行，在214nM波长下检测，其中梯度范围为10-60％ACN-水/水，两者均具有0.1％TFA，经过36分钟)。收集期望的级分并冻干。
环化后，通过点击化学，遵循环化方法B使环化的中间体经受与N-(1-溴-2-氧代-7,10,13-三氧杂-3-单子十六烷-16-yL)戊-4-炔酰胺的连接基延长，其通过使用HATU-DIPEA，通过N-Boc-PEG4-NH2与戊-4-炔酸的偶联之后用TFA去Boc保护，并且用溴乙酸酐在TEA的存在下酰化制备。
实施例85：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:85
使用根据如实施例1中所述的程序制备标题化合物，其中在位置23而不是位置11处安装PEG12-AcBr连接基。
实施例86：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:86
使用根据如实施例1中所述的程序制备标题化合物，其中在位置22而不是位置11处安装PEG12-AcBr连接基。
实施例87：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:87
使用根据如实施例1中所述的程序制备标题化合物，其中在位置7而不是位置11处安装PEG12-AcBr连接基。
实施例88：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:88
根据如实施例1中所述的程序制备标题化合物，在步骤3中，在位置31处，用Fmoc-V-OH代替Fmoc-hC(trt)-OH，在位置30处，用Fmoc-C(trt)-OH代替Fmoc-L-OH，并用Fmoc-G-OH代替Fmoc-βA-OH。
实施例89：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:89
根据如实施例88中所述的程序制备标题化合物，跳过步骤1以制备还原肽，并且在步骤2中用Fmoc-Y(tBu)-OH加载和之后与Fmoc-(N-Me)R-OH偶联来代替Fmoc-psi-(R35-N(Boc)-Y36)-OH加载。
实施例90：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:90
根据如实施例89中所述的程序制备该标题化合物，在步骤3中用Fmoc-βA-OH代替Fmoc-G-OH。
实施例91：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:91
根据如实施例89中所述的程序制备该标题化合物，在步骤3中，在位置30处，用Fmoc-hC(trt)-OH代替Fmoc-C(trt)-OH。
实施例92：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:92
根据如实施例90中所述的程序制备该标题化合物，在步骤3中，在位置31处，用Fmoc-hC(trt)-OH代替Fmoc-V-OH，并且在位置30处，用Fmoc-L-OH代替Fmoc-C(trt)-OH。
实施例93：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:93
根据如实施例1中所述的程序制备标题化合物，在步骤3中，在位置31处，用Fmoc-V-OH代替Fmoc-hC(trt)-OH，在位置30处，用Fmoc-C(trt)-OH代替Fmoc-L-OH，并在N-末端处，用Fmoc-G-OH代替Fmoc-βA-OH。
实施例94：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:94
根据如实施例1中所述的程序制备标题化合物，在步骤3中，在位置31处，用Fmoc-V-OH代替Fmoc-hC(trt)-OH，并且在位置30处，用Fmoc-C(trt)-OH代替Fmoc-L-OH。
实施例95：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:95
根据如实施例1中所述的程序制备标题化合物(0.05mmol规格)，在步骤3中，在位置31处，用Fmoc-V-OH代替Fmoc-hC(trt)-OH，并且在位置30处，用Fmoc-Glu(OAlloc)-OH代替Fmoc-L-OH，在位置11处用Fmoc-Lys(dde)-OH代替Fmoc-Lys(Alloc)-OH，在位置4处用Fmoc-Ser(tBu)-OH代替Fmoc-K(Boc)-OH，并且在N-末端处用Boc-G-OH代替Fmoc-βA-OH。
向得自上文的所得的树脂添加脱氧的DCM(10mL)、苯基硅烷(10当量)和Pd(PPh3)4(0.2当量)于DCM(1mL)中的溶液，并且持续搅拌混合物10分钟。排出反应，并用脱氧的DCM洗涤树脂，并重复去保护一次。
向得自上文的树脂中添加DMF(10ml)、HATU(5当量)和DIEA(10当量)，搅拌混合物5分钟，然后添加N-羟基琥珀酰亚胺(10当量)的DMF溶液并搅拌另外的20分钟。将树脂过滤，并且重复该程序一次。
将得自上文的树脂在室温下在TFA/TIPS/水(95/2.5/2.5)(10ml)中去保护并持续2小时。将裂解混合物浓缩至大约1ml，然后添加40ml的醚。通过离心收集所得的沉淀，并在N2下干燥。
将得自上文的所得材料溶于9mL的DMSO中，向其中添加10当量TEA，并且使反应在室温下持续进行3小时。将所得溶液用水稀释至30ml，将pH调节至2并在30mm×250mm C18柱上由RP-HPLC纯化，该柱在30分钟内以20-40％ACN的水溶液(0.1％TFA)的线性梯度洗脱。冻干包含产品的级分。
然后用1-2％肼/DMF(1mL)处理得自上文的所得的材料以从赖氨酸上移除Dde。将所得的混合物用水稀释至10ml，将pH调节至2并且然后如上所述通过RP-HPLC纯化。
然后将所得产物溶于10％ACN/水中，将pH调节至10，并且添加溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液(3当量的0.1M/DMF溶液)，并且使反应在室温下持续进行10分钟。用水将所得的混合物稀释至10ml，将pH调节至2，然后如上通过RP-HPLC纯化以得到标题产品。
实施例96：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:96
根据如实施例1中所述的程序制备该标题化合物，在步骤5中用N-Fmoc-dPEG24-羧酸代替N-Fmoc-dPEG12-羧酸。
实施例97：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:97
根据如实施例1中所述的程序制备该标题化合物，在步骤3中用Fmoc-G-OH代替Fmoc-βA-OH。
实施例98：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:98
根据如实施例89中所述的程序制备该标题化合物，但跳过步骤5中的Fmoc-dPEG12-羧酸偶联步骤。
实施例99：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:99
根据如实施例90中所述的程序制备该标题化合物，但跳过步骤5中的Fmoc-dPEG12-羧酸偶联步骤。
实施例100：合成环状PYY类似物SEQ ID NO:100
根据如实施例94中所述的程序制备该标题化合物，但跳过步骤5中的Fmoc-dPEG12-羧酸偶联步骤。
实施例101：mAb MSCB97的鉴定和制备
选择PH9L3 VL和PH9H5 VH作为用于工程化的起始V区
将命名为PH9L3(SEQ ID NO:128)的抗体轻链可可变区(VL)(Teplyakov等人，“Structural diversity in a human antibody germline library,”mAbs Aug-Sep 8(6):1045-63(2016))，和命名为H9H5(SEQ ID NO:129)的抗体重链可变区(VH)(Teplyakov等人，“Structural diversity in a human antibody germline library,”mAbs Aug-Sep8(6):1045-63(2016))选择为起始可变区，由此将能够用于肽缀合的mAb工程化。PH9L3完全由人Ig种系V基因序列构成，并且因此不含任何来自体内亲和力成熟过程的序列突变，该过程将导致高亲和力、抗原特异性结合。PH9H5的CDR3是该VH中唯一不包含人种系V基因序列的区段。PH9H5的CDR3来自抗人CCL2抗体，CNTO 888，并由SEQ ID NO:130提供。产生含有PH9H5/PH9L3 VH/VL对的Fab。
将这些最相似的PH9L3、PH9H5和人Ig种系V区和J区序列进行比对以确定与种系序列的序列同一性或相似性。将PH9H5与人Ig种系基因IGHV3-23*01(PubMed ID：M99660)(SEQID NO:132)和人GHJ1*01(PubMed ID:J00256)(SEQ ID NO:133)的连结(SEQ ID NO:131)进行比对，PH9H5氨基酸序列和连结的人IGHV3-23*01-IGHJ1*01序列之间的区别仅在于VHCDR3，其为PH9H5的SEQ ID NO:130。
将PH9L3与人Ig种系基因IGKV3-11*01(PubMed ID:X01668)(EQ ID NO:135)和IGKJ1*01(PubMed ID:J00242)(SEQ ID NO:136)的连结(SEQ ID NO:134)进行比对，区别仅在于V基因/J基因连接基的一个偏差。
设计并生成PH9H5和PH9L3的Cys的取代的变体
在V区的所有三个CDR中，在所选CDR残基处包含单一Cys取代的PH9H5 VH的变体作为具有人IgG1恒定区的完成重链设计、生成并克隆到哺乳动物宿主表达载体中。PH9H5/PH9L3 Fab结构用于帮助选择用于取代的CDR残基，其看起来更可用于缀合，并且在一些变体中，将附加的甘氨酸(Gly)残基插入引入的Cys残基的任一侧以潜在地增加Cys用于缀合的容易性。设计并生成PH9L3 VL的类似变体，不同的是将这些变体作为具有人κ恒定区的完整轻链克隆到表达载体中。生成总共PH9H5单一Cys变体的24种表达构建体和PH9L3单一Cys变体的22种表达构建体。被选择用于PH9H5_VH(SEQID NO:129)和PH9L3_VL(SEQ ID NO:128)内的取代的残基总结于图2中。
产生的表达构建体用于通过用野生型PH9L3 LC构建体瞬时共转染每种基于PH9H5的HC Cys变体构建体或用野生型PH9H5 HC构建体共转染每种基于PH9L3的LC Cys变体构建体来表达Cys变体。初始测试转染使用HEK衍生的Expi293作为表达宿主并且处于20ml规模。基于来自培养上清液的变体蛋白质定量，HC和LC Cys变体的大部分均表达良好。
五种初始HC Cys变体，MSCB33-MSCB37，在Expi293中以750ml规模表达并纯化变体蛋白。经纯化变体的纯化收率和质量特性非常相似并且足以将经纯化蛋白质用于初始肽缀合反应中。
评价肽与基于PH9H5的HCCys变体的缀合
MSCB33蛋白质和其他变体蛋白的分析质量测定指示在被工程化用于缀合的Cys处存在半胱氨酸加合物，每个mAb有两个，以及HC C-末端Lys残基的移除，这通常见于重组产生的mAb中。为了制备用于缀合的变体mAb，通过开发的还原过程除去加合物以维持mAb内的天然二硫键(参见实施例103)。使用马来酰亚胺化学对所有五种HC Cys变体mAb进行与人胃泌酸调节素(OXM)肽类似物(GCG Aib2、Glu16,24、Arg20、Leu27、Lys30-ε-(PEG12)-NH2)的初始测试缀合。mAb变体之间的缀合效率不同，其通过缀合反应产物和各自的相对百分比来定性评估。与含有侧翼Gly残基的其他I102C变体相比，在MSCB33的情况下，观察到最大效率，如由同源二聚体产物的最大百分比所测量，并且在Y103C变体MSCB35或MSCB37的情况下观察到很少缀合或没有观察到缀合。
几种其他HC和LC Cys变体，在各种CDR中具有工程化的半胱氨酸取代(PH9H5_VH(SEQID NO:129)中的T28C、S30C和S54C取代，以及PHpL3_VL(SEQ ID NO:128)中的S30C和S92C取代)在Expi293中以大规模表达。通过还原从这些纯化的蛋白质中除去Cys加合物具有挑战性，并且不进一步追求这些变体。由于在大多数Cys变体的情况下观察到的挑战和在I102C PH9H5变体mAb，MSCB33的情况下观察到的初始良好缀合效率，方法开发和进一步工程化尝试集中于该具体的变体。
MSCB33的Fc工程化
将MSCB33重新工程化以含有沉默的人IgG4_PAA Fc从而降低体内Fc功能。人IgG4_PAA在人IgG4同种型nG4m(a)上具有突变S228P/F234A/L235A(基于如IMGT中所定义的IGHG4*01等位基因)。产生具有与IgG4_PAA Fc融合的MSCB33的VH的表达构建体，并与用于MSCB33表达的相同LC表达构建体一起使用以产生MSCB33的IgG4_PAA变体，其被命名为MSCB97。MSCB97VH、HC、VL和LC的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:137、138、139和140提供。
在Expi293细胞中以20ml规模瞬时进行MSCB97的测试表达，并且该mAb变体表达良好。MSCB97从大规模的Expi293表达运行中纯化。MSCB97的纯化收率为264.53mg/L，并且重量测定为85％单体物质。后续大规模表达运行和纯化在收率和质量方面相似或更好，并且指示可产生该mAb的一致性。
肽与MSCB97缀合以及缀合反应可扩展性的评估
LC HC二硫连接在IgG1和IgG4同种型之间不同，因此使用上述OXM-马来酰亚胺测试肽的TCEP还原和缀合，来测试还原和马来酰亚胺缀合，并证实可从IgG1mAb MSCB33转化成IgG4_PAA mAb MSCB97。已知由马来酰亚胺缀合产生的连接是潜在可逆的，因此采用产生更稳定的键的溴乙酰胺缀合化学，并基于起始MSCB97以10mg规模成功地实施。
测定通过溴乙酰胺化学产生的OXM类似物GCG Aib2、Glu16,24、Arg20、Leu27、Lys30-ε-(PEG12)-NH2的MSCB97缀合物(MSCB97-OXM1)来测定体外GLP-1R和GCGR效力。相对于参照肽和参照非结构化多肽缀合物的效力是合理的并且与由相同肽产生的对MSCB33(IgG1)的缀合物的效力相似。这展示出MSCB97(IgG4_PAA)与作为同种型的MSCB33(IgG1)之间的单一差异对包含相同肽的缀合物的效力不具有影响。另外，这些数据示出可在用溴乙酰胺化学产生的肽-mAb缀合物中保留期望的体外效力，所述溴乙酰胺化学产生在体内稳定的键。其他OXM类似物也可缀合到MSCB97，并测定这些缀合物的体外效力。这些缀合物具有与MSCB97-OXM1相似的GLP-1R和GCGR效力，从而突出了将多种肽缀合至MSCB97，同时保持肽效力的能力。
肽-MSCB97缀合物与人CCL2结合的评价
虽然MSCB97被选择和工程化以缺失特异性抗原结合，但该mAb可能结合的最可能的抗原(如果有的话)是基于VH CDR3的源的人CCL2。使用两种肽-MSCB97缀合物，OXM肽类似物或PYY肽类似物来评价MSCB97是否确实展示出了任何特异性CCL2结合。
通过表面等离子共振(SPR)直接测量潜在的CCL2结合，其中使用抗-Fc捕获方法将缀合物表面固定。将可商购获得的抗-CCL2小鼠mAb用作阳性对照，并且将两种非特异性人抗体CNTO 9412和HH3B33用作阴性对照。将所有对照类似地表面固定，并且将重组体人CCL2以高达400nM的浓度流经固定的缀合物和对照。基于预先确定的测定标准，在阳性对照的情况下，而不是在阴性对照的情况下，也不是在肽-MSCB97缀合物的情况下，观察到指示特异性抗原结合的CCL2积聚这证实，在肽-mAb缀合物的相关治疗形式中，MSCB97缺乏人CCL2结合。
实施例102：mAb的表达和纯化
全人单克隆抗体(mAb)可以在哺乳动物表达宿主中重组表达，并使用本领域已知的标准方法从细胞培养上清液中纯化。例如，各自包括能够分泌的适当信号肽的编码mAb的轻链(LC)和重链(HC)的cDNA序列，可以使用标准分子生物学方法克隆到单独的哺乳动物表达载体或单个表达载体中。使用的表达载体可以是可商购获得的那些中的任一种，诸如pEE12.4、pcDNATM3.1(+)或pIRESpuro3，或具有相似功能的任何定制表达载体。在此类载体中，mAb的重链和轻链的转录各自由任何已知的有效启动子诸如hCMV-MIE启动子来驱动。使用标准方法如QIAGEN质粒抽提试剂盒，针对单独的LC和HC表达构建体或表达LC和HC两者的单一构建体制备转染级质粒DNA。
按照制造商的说明，用基于脂质的转染试剂诸如FreestyleTMMax转染试剂制备纯化的质粒DNA，并且然后转染到标准哺乳动物表达宿主细胞系，诸如CHO-S或HEK 293-F中。如果mAb LC和HC由单独的表达构建体编码，则两个构建体同时被转染。在转染之前和之后，按照标准细胞培养方法培养哺乳动物细胞以用于维持或用于mAb表达，由此维持细胞密度范围，使用的培养基以及随后的其他细胞培养条件由所使用的特定哺乳动物宿主细胞系来确定。这些参数通常由从其获得细胞系的供应商或在科学文献中记录。例如，将CHO-S细胞在CHO FreestyleTM培养基中保持悬浮，在设定为37℃和8％CO2的增湿培养箱中以125 RPM振荡，并且当细胞浓度介于1.5×106个细胞/mL和2.0×106个细胞/ml之间时分裂。
在转染后几天收获来自表达mAb的瞬时转染的哺乳动物细胞的细胞培养物上清液，通过离心澄清并过滤。CHO-S细胞的表达持续时间通常为四天，但可调节，并且对于不同哺乳动物宿主细胞系可以不同。使用浓缩器诸如Centramate将大规模转染(>10升)浓缩10倍。使用蛋白A亲和柱(诸如HiTrap MabSelect Sure)从澄清的上清液中纯化mAb，利用标准方法将mAb与蛋白质A树脂结合，使用低pH缓冲液洗涤树脂并洗脱蛋白。通过洗脱到包含pH7缓冲液的管中立即中和蛋白级份，并且合并峰级分，过滤并在4℃下用pH 7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析过夜。透析后，再次过滤mAb(0.2μ过滤器)，并且通过280nm处的吸光度测定蛋白质浓度。经纯化的mAb蛋白的质量通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行和分析型尺寸排阻HPLC进行评估，并且内毒素含量使用鲎变形细胞溶解物(LAL)测定法进行测量。纯化的mAb在4℃下储存。
来自瞬时转染的CHO细胞的MSCB97的表达和纯化
按照制造商的推荐，MSCB97通过用MSCB97表达构建体的纯化质粒DNA瞬时转染细胞，在ExpiCHO-STM细胞(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA；目录号A29127)中进行表达。简而言之，将ExpiCHO-STM细胞以悬浮液形式保持在设定为37℃，8％CO2和125RPM的振荡培养箱中的ExpiCHOTM表达培养基(ThermoFisher Scientific，目录号A29100)中。将细胞传代，使得在转染当天，可实现稀释至6.0×106个细胞/ml，从而将细胞活力保持在98％或更高。使用ExpiFectamineTMCHO转染试剂盒(ThermoFisher Scientific，目录号A29131)进行瞬时转染。对于每ml待转染的经稀释细胞，使用1微克质粒DNA并稀释到OptiPROTMSFM复合培养基中。ExpiFectamineTMCHO试剂以1:3的比率(体积/体积，DNA：试剂)使用，并且也稀释到OptiPROTM中。将稀释的DNA和转染试剂混合一分钟，从而允许DNA/脂质复合物形成，然后将其添加到细胞中。过夜温育后，将ExpiCHOTM饲料和ExpiFectamineTMCHO增强剂添加到细胞中。在收获培养上清液之前，将细胞在32℃下振荡培养五天。
通过离心(30分钟，6000rpm)进行澄清，之后进行过滤(0.2μPES膜，Corning)收获来自瞬时转染的ExpiCHO-STM细胞的培养物上清液。首先使用Pall Centramate切向流过滤系统将大规模转染(5升至20升)浓缩10倍。将pH7.2的10x DPBS(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水)加入上清液中至1x最终浓度，然后以每毫升树脂约20mg蛋白质的浓度，使用AKTA FPLC色谱系统，加载到平衡的(DPBS，pH 7.2)HiTrap MabSelect Sure蛋白质A柱(GE Healthcare；Little Chalfont，United Kingdom)上。加载后，用10倍柱体积的DPBS(pH7.2)洗涤该柱。用10倍柱体积，pH 3.5的0.1M乙酸钠洗脱蛋白质。通过以20％洗脱级分体积洗脱到含有2.0MTris，pH 7的管中立即中和蛋白质级分。合并峰值级分，并且如果需要，用附加的Tris将pH调节至约5.5。将纯化的蛋白质过滤(0.2μ)，并通过在BioTek SynergyHTTM分光光度计上在280nm处的吸光度来测定浓度。通过SDS-PAGE和分析型尺寸排阻HPLC(Dionex HPLC系统)来评估纯化的蛋白质的质量。使用浊度LAL测定法(-T，Associates of Cape Cod)测量内毒素含量。
实施例103：mAb和环状PYY类似物的缀合
方法A：用TCEP部分还原mAb
用3当量的TCEP处理mAb的tris-乙酸盐缓冲液(20mL，在EDTA中1mM)的10mg/mL溶液。将溶液调节至pH 6，并在室温下1小时后，质谱联用高压液相色谱(LCMS)示出在位置C102处的二硫化物加合物已完全还原。通过蛋白A吸附和洗脱(4CV 100mM乙酸)纯化还原的mAb以提供180mg的还原mAb。
还原mAb和环状PYY类似物的缀合
将冻干肽(5当量，相对于mAb)加入上述还原mAb中。添加EDTA，至最终浓度为1mM，并且将pH调节至7。将浓度调节至8mg/mL，并且使反应在室温下在温和搅拌下进行16小时。加入TCEP(0.5当量，相对于mAb)并使反应在室温下在温和搅拌下进一步进行4小时，此后高分子量(MW)物质减少至小于3％。
将反应混合物调节至pH 5.5，并且通过CaptoSP树脂上的离子交换色谱法纯化，其使用梯度100％A(100mM TRIS-乙酸酯，pH 5.5)至100％B(100mM TRIS-乙酸盐，pH 5.5；0.5M NaCl)，超过20CV。汇集包含期望的缀合物的级分，并且回收140mg缀合物，与少量未反应的肽共洗脱。最终纯化通过蛋白A吸附和洗脱(4CV 100mM乙酸)来进行。将产物的pH调节至6，以提供120mg缀合物(60％收率)，纯度>90％，具有<3％的高MW物质。
方法B
mAb的疏水相互作用色谱(HIC)纯化
将mAb在tris-乙酸盐缓冲液中的20mg/mL溶液加载在疏水相互作用柱(TOSOH TSK凝胶苯基7.5x21cm)上并用线性梯度(0-70％B/A，溶剂A：5％iPrOH，1M(NH4)2SO4，100mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0；溶剂B：20％iPrOH，100mM磷酸盐缓冲液)洗脱。合并mAb单体峰，浓缩(5mg/mL-10mg/mL)并针对3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液(100mM，pH 5.5)进行透析。
利用TCEP的部分还原以及还原mAb与环状PYY类似物的缀合
向纯化的mAb(27mL，9.28mg/mL)中添加4当量TCEP，之后添加EDTA(1mM)。在室温下2小时后，LCMS示出在位置C102处的二硫化物加合物已完全还原。用Zebra脱盐旋转柱(7x10mL，7K MWCO，用MOPS 100mM pH 5.5预平衡)处理还原mAb，以除去释放的半胱氨酸/GSH。向还原mAb(28mL)的合并级分中添加PYY肽的Milli Q级水溶液(6.5当量，相对于mAb，15mg/mL-20mg/mL)，之后添加EDTA(1mM)。通过滴加1N NaOH，将反应的pH调节至7.2至7.4。使反应在室温下在温和搅拌下进行18小时。在添加另外0.5当量TCEP后，使反应继续进行另外的12小时，以还原在反应过程中形成的mAb-mAb二聚体，并允许转化成期望的mAb同源二聚体。通过添加2M乙酸将反应的pH降低至pH 5.5，并且通过疏水相互作用色谱法纯化粗缀合物，并且用线性梯度(0-100％B/A，溶剂A：5％iPrOH，1M(NH4)2SO4，100mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0；溶剂B：20％iPrOH，100mM磷酸盐缓冲液)洗脱。最终纯化通过蛋白质A吸附(PBS)和洗脱(NaOAc，pH 3.5)进行。将产物的pH调节至6并针对PBS透析以得到最终样品(56％)。
另选地，用GSH和/或Cys还原mAb。在通过切向流过滤(TFF)除去还原剂后，任选地在0.2-0.5当量TCEP的存在下，将过量的肽加入还原的mAb中。
实施例104：mAb缀合物表征
PYY-mAb缀合物的分析表征使用(i)疏水性相互作用色谱法(HIC)，(iii)通过LC-ESIMS的完整质量测量，(iii)尺寸排阻色谱法(SEC)进行。PYY-mAb缀合物的分析表征的结果和缀合方法示于表1中。
表1：PYY-mAb缀合物的分析数据。
实施例105：体外测定
评估化合物1在体外在表达人、大鼠、小鼠和恒河猴Y2受体以及人Y1、Y4和Y5受体的克隆细胞(HEK或CHO)中激活NPY受体的能力。PYY3-36、NPY和PP作为研究对照包括在这些测定中。
细胞系
表达NPY受体的稳定转染的克隆细胞系被开发用于cAMP测定。简而言之，根据其方案使用Lipofectamine 2000试剂盒(Invitrogen)，利用携带人Y2受体(登录号：NM_000910.2)、人Y5受体(登录号：NM_000910.2)、小鼠Y2受体(登录号：NM_008731)和恒河猴Y2受体(登录号：NM_001032832)的编码序列的表达质粒转染HEK293细胞系。在转染后四十八小时，用选择培养基(DMEM高葡萄糖与10％胎牛血清(FBS)、50I.U.青霉素、50μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和600μg/ml G418)重新接种细胞。将细胞保存在选择培养基中2周，然后使用有限稀释方法挑选单克隆体。随后通过在补充有10％胎牛血清、1％L-谷氨酰胺、1％丙酮酸钠、1％青霉素/链霉素和600μg/ml G418的DMEM-高葡萄糖培养基(Cellgro)中培养来维持转染的细胞。
此外，CHO-K1细胞系得自DiscoverX Corporation，其表达人Y1受体(目录号：93-0397C2)和人Y4受体(目录号：95-0087C2)。DiscoverX细胞在补充有10％FBS的F12培养基(Gibco)中并且在G418选择下(800μg/mL)培养。大鼠Y2受体在得自Promega Corporation的Glo-Sensor CHO-K1细胞系中表达。用pGloSensorTM-23F cAMP质粒转染这些细胞用于基于发光的cAMP测定，但已经过c以用于Perkin-Elmer LANCE cAMP测定。大鼠Y2细胞在补充有10％FBS和800μg/ml G418的F12培养基(Gibco)中生长。
将所有细胞系存放在小瓶(4×106个细胞/小瓶)中并储存在液氮中直至使用。在测定前一天，解冻小瓶并添加到15ml适当培养基中。将细胞以450×g离心5分钟，吸出上清液，将细胞以0.2×106个细胞/ml的密度重新悬浮于不具有G418的培养基中。将细胞(25μl/孔)分配到Biocoat胶原涂覆的白色384孔板中至最终密度为5000个细胞/孔。将细胞板在37℃加湿的组织培养箱中在5％CO2/90％O2气氛下温育过夜。
实验方案
对于各种受体测定，cAMP测定是相同的。在所有实验中均使用LANCE cAMP试剂盒(Perkin Elmer Corporation；Waltham，MA)以定量细胞内cAMP含量。在测定当天，将细胞培养基从细胞中滗出，并将6μl肽(2倍浓度)添加到孔中。在刺激缓冲液中，将肽以11点剂量反应(从100μnM或10M开始，连续1:3稀释)形式组成。刺激缓冲液由5mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、500μM IBMX和0.1％牛血清白蛋白(BSA)的HBSS溶液(Hank平衡盐溶液)组成。接着，将6μl包含毛喉素(2倍，5μM终浓度)和LANCE cAMP抗体(1:100)的刺激缓冲液加入细胞中。在室温下温育25分钟后，将12μl的测定检测混合物加入每个孔中。通过在由LANCEcAMP试剂盒提供的检测缓冲液中稀释生物素-cAMP(1:750)和铕-W8044(1:2250)来制备检测混合物。将板在室温下温育2小时，然后在Envision平板读数器上按照TR-FRET测定读数(激发320nm，发射615nm和665nm)。将通道1荧光(615nm处的相对荧光单位)和通道2荧光(665nm处的相对荧光单位)连同其比率一起输出到Excel文件中。
数据分析
来自Envision平板读出器的数据以相对荧光单位(RFU)表示，其计算为(615nm/665nm)×10,000。对所有样品均进行三次重复测量。使用由Eudean Shaw设计的Crucible内部数据分析软件来分析数据。从每个板中包括的已知cAMP浓度的参考标准内推每个孔内的未知cAMP浓度。参数，诸如EC50、Log(EC50)、HillSlope(nH)、上限和下限通过在R环境中使用非线性加权最小二乘法应将cAMP浓度值相对于用4-P模型拟合的对数化合物浓度进行作图导出(开放资源http://cran.us.r-project.org/)，其由Janssen R&D的非临床统计和计算部门进行实施。
表2：体外数据
表3：体外人同种型和杂交种EC50
实施例106：体内小鼠稳定性测定
雄性C57BL/6N小鼠(9-12周龄)得自Taconic Laboratory。在一个具有12小时的亮/暗循环的温度受控室内，小鼠被安置，一个带有AlphaDri被褥的笼子一只小鼠。允许小鼠随意获取水并维持咀嚼进食(5001，实验室饮食)。
用1mg/kg化合物皮下给药小鼠。经由尾部采血在t＝4小时、24小时和48小时时收集来自3只动物的大约100μL血液。还在t＝4小时、24小时和48小时时，经由心脏穿刺收集每个时间点的2-3只动物的血液(约600μL)。将血液样本收集到含有4％比率的完全蛋白酶抑制剂溶液和1％比例的DPPIV抑制剂的K3E(EDTA)试管中。将血液样本置于湿冰上，然后在冷藏条件(约5℃)下以10,000rpm离心10分钟，以在每个时间点收集之后30分钟内移除细胞，并将所有可用的血浆转移至96孔板中。将孔板储存在-80℃冰箱中。使用下文所述的LCMS方法测量化合物的含量。数据示于表4中。
用于测定完整缀合物的剩余％的质谱分析
通过使用抗人Fc抗体进行免疫亲和捕获来处理血浆样品，之后在三重TOF(飞行时间)质谱仪上进行反相LC-高分辨率全扫描MS分析。对原始MS光谱进行解卷积以阐明注入样品中各组分的分子量。完整缀合物的分子离子的峰用于定量未改变的完整缀合物。在单独的测定法中，通过使用抗人Fc抗体进行免疫亲和捕获来处理血浆样品，之后在三重四极杆质谱仪上进行胰蛋白酶消化和反相LC-MSMS分析。监测位于mAb的Fc上的肽用于对总mAb进行定量。对于两种测定而言，通过在血浆中加标参比标准品来制备标准曲线和质量对照样品，并同时使用与所产生的样品相同的程序进行处理。将完整缀合物的浓度与总mAb的浓度的比率计算为剩余％。
表4：体内小鼠稳定性数据
化合物编号 小鼠中的％Rem@48小时
1 90.8
2 65.6
3 51.8
4 NA
5 80.4
6 49.7
7 75.4
8 51.6
9 51.5
10 42.4
11 60
12 63.5
13 74.4
14 102
15 NA
16 96
17
18 77
19 87.4
20 74.4
21 85.8
22
23
24
25 81.5
26 71.9
实施例107：药代动力学(PK)
DIO小鼠PK
雄性DIO C57BL/6N小鼠(20周龄，高脂肪饮食14周)得自Taconic Laboratory。在一个具有12小时的亮/暗循环的温度受控室内，小鼠被安置，一个带有AlphaDri被褥的笼子一只小鼠。使小鼠随意触及水，并保持它们的高脂饮食(D12492，研究饮食)。
对小鼠皮下(s.c.)给药1mg/kg化合物1，在t＝4小时、8小时、24小时、48小时、72小时、120小时和168小时时，在每个时间点处死3只动物，并收集血液。还收集来自3只幼稚动物的血液。在用70％CO2和30％O2混合物诱导的气体麻醉下，在断头后经由颈静脉收集来自每只动物的大约300μL血液。将血液样本(约300μl)收集到含有12μl(4％比率)完全蛋白酶抑制剂溶液和3μL(1％比率)DPP-IV抑制剂的K3E(EDTA)涂覆的Sarstedt管中。将血液样本置于湿冰上，然后在冷藏条件(约5℃)下以10,000rpm离心约4分钟，以在每个时间点收集之后30分钟内移除细胞，并将所有可用的血浆转移至96孔板中。将孔板储存在干冰上直至将其置于-80℃冰箱中。数据示于表5和图3中。
大鼠PK
以PBS(pH 7.0-7.6)中1.0mg/kg的剂量水平，将化合物1皮下给药和静脉内给药于雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)。经由隐静脉，在每个时间点从三只动物收集约500μL血液(t＝给药后1小时、4小时、24小时、48小时、72小时、96小时、168小时和240小时)。在用70％CO2和30％O2混合物诱导的气体麻醉下，在断头后经由颈静脉收集来自给药后336小时的血液样本。将血液样本收集到含有20μl(4％比率)完全蛋白酶抑制剂溶液和5μL(1％比率)DPPIV抑制剂的K3E(EDTA)涂覆的Sarstedt试管中。将血液样本置于湿冰上，然后在冷藏条件(约5℃)下以10,000rpm离心约4分钟，以在每个时间点收集之后60分钟内移除细胞，并将所有可用的血浆转移至96孔板中。使用下文所述的LCMS方法测量化合物1的含量。数据示于表6中。
食蟹猴(Cyno)PK
所有动物在给药前禁食至少8小时，并且血液样本采集的整个前四个小时禁食。三只动物接受单次IV剂量的1mg/kg化合物1，并且三只动物接受单次SC剂量的1mg/kg化合物1。在给药前并且在给药后1小时、6小时、10小时、24小时、36小时、48小时、72小时、120小时、168小时、240小时、336小时、432小时和504小时收集血液。对于IV组，在给药后0.5小时收集附加的样品。来自每只动物的大约1ml血液收集到含有4％比率的完全蛋白酶抑制剂溶液和1％比率的DPPIV抑制剂的K3E(EDTA)涂覆的试管中。将血液样本置于湿冰上，然后在每个时间点收集之后在30分钟内离心，并将所得血浆分成三份并转移到一式三份的96孔板中。将孔板储存在干冰上直至将其置于-80℃冰箱中。数据示于表7和图4中。
用于测定血浆水平的完整质谱分析
通过使用抗人Fc抗体进行免疫亲和捕获来处理血浆样品，之后在三重TOF(飞行时间)质谱仪上进行反相LC-高分辨率全扫描MS分析。对原始MS光谱进行解卷积以阐明注入样品中各组分的分子量。完整缀合物的分子离子的峰用于定量。通过在血浆中加标参比标准品来制备标准曲线和质量对照样品，并同时使用与所产生的样品相同的程序进行处理。在DIO小鼠、大鼠和恒河猴的PK数据分别示于表5、表6和表7中。DIO小鼠和恒河猴的PK数据也分别示于图3和图4中。
表5：DIO小鼠中的PK
表6：大鼠PK
表7：Cyno中的PK
实施例108：体内功效研究
饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠的体重减轻：急性给药
在单剂量之后，评价化合物1减少雄性DIO C57B1/6小鼠的食物摄取量和体重的能力。雄性DIO C57BL/6N小鼠(20周龄，高脂肪饮食14周)得自Taconic Laboratory。在一个具有12小时的亮/暗循环的温度受控室内，小鼠被安置，一个带有AlphaDri被褥的笼子一只小鼠。使小鼠随意触及水，并保持它们的高脂饮食(D12492，研究饮食)。在实验开始之前，使动物适应该设施至少一周。
在给药前的一天，基于个体体重，将小鼠分成八种动物的组群。在第二天的下午3:00-4:00，将动物称重并经由皮下(s.c.)施用溶媒(dPBS，pH7.2)，0.1nmol/kg、0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、3.0nmol/kg或7.5nmol/kg的剂量的化合物1或0.3nmol/kg的度拉糖肽处理。在给药后24小时、48小时和72小时测量体重和食物摄取量，并计算体重减轻和食物摄取减少的百分比。使用双向重复测量ANOVA与Prism中的Tukey的事后检验进行统计分析。所有数据均以平均值±SEM表示(图5和图6)。
饮食诱导的肥胖小鼠的体重减轻：慢性给药
评估化合物1在8天的时间内在雄性DIO C57B1/6小鼠中重复给药时减少食物摄取量和体重并改善葡萄糖稳态的能力。雄性DIO C57BL/6N小鼠(20周龄，高脂肪饮食14周)得自Taconic Laboratory。在一个具有12小时的亮/暗循环的温度受控室内，小鼠被安置，一个带有AlphaDri被褥的笼子一只小鼠。使小鼠随意触及水，并保持它们的高脂饮食(D12492，研究饮食)。在实验开始之前，将动物驯化至该设施至少一周。
在给药前的一天，基于个体体重，将小鼠分组。在接下来8天中每一天的下午3:00-4:00，称重动物和食物摄取量。每天经由皮下给药用0.3nmol/kg的载体(dPBS，pH7.2)或度拉糖肽处理动物，或者每三天经由皮下给药，用0.1nmol/kg、0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、3.0nmol/kg的剂量的化合物1处理动物。8天后，将小鼠禁食5小时，然后在t＝0时口服推注2g/kg的葡萄糖。在t＝葡萄糖负荷后的0分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟时，测量血糖，并在t＝分钟、30分钟和90分钟时，抽血以测量血浆胰岛素。使用单向ANOVA或者双向重复测量ANOVA与Prism中的Tukey的事后检验进行统计分析。所有数据均以平均值±SEM表示(图7、图8和表8-11)。
表8：化合物1对8天治疗后体重(g)的影响
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM
*p<0.05，相对于溶媒；双相ANOVARM，Tukey的多重比较检验；
表9：化合物1在治疗8天后OGTT期间对血糖(mg/dL)水平的影响
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM
*p<0.05，相对于溶媒；对葡萄糖值应用双向ANOVA RM、Tukey的多重比较检验；
对AUC应用单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
表10：化合物1在治疗8天后在OGTT期间对胰岛素(ng/mL)水平的影响
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM
*p<0.05，相对于溶媒；对葡萄糖值应用双向ANOVA RM、Tukey的多重比较检验；
对AUC应用单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
表11：化合物1在治疗8天后对饲喂的血糖(mg/dL)水平的影响
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM
*p<0.05，相对于溶媒；单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
与利拉鲁肽联合治疗的饮食诱导肥胖小鼠的体重减轻：慢性给药
评估化合物1在9天的时间内与长效GLP-1激动剂，利拉鲁肽组合对雄性DIOC57B1/6小鼠重复给药时减少食物摄取量和体重并改善葡萄糖稳态的能力。
雄性DIO C57BL/6N小鼠(20周龄，高脂肪饮食14周)得自Taconic Laboratory。在一个具有12小时的亮/暗循环的温度受控室内，小鼠被安置，一个带有AlphaDri被褥的笼子一只小鼠。使小鼠随意触及水，并保持它们的高脂饮食(D12492，研究饮食)。在实验开始之前，使动物适应该设施至少一周。
在给药前一天，通过MRI测量身体组成，并基于个体体重对小鼠进行分组。在第0天的下午3:00-4:00，称重动物和食物摄取量。单一疗法组中的动物每天经由皮下给药以10nomol/kg剂量用溶媒(dPBS，pH7.2)或度拉糖肽处理，或者每三天经由皮下给药，以0.1nmol/kg或1.0nmol/kg的剂量用化合物1处理。联合疗法组中的动物每天接受利拉鲁肽(10nmol/kg)和剂量为0.1nmol/kg或1.0nmol/kg的化合物1。在第8天，通过MRI测量身体组成。在第9天，使小鼠禁食5小时，并测量空腹血糖和胰岛素。使用单向ANOVA或者双向重复测量ANOVA与Prism中的Tukey的事后检验进行统计分析。所有数据均以平均值±SEM表示(图9和图12-17)。
表12：化合物1、利拉鲁肽以及化合物1和利拉鲁肽的组合对治疗9天后每日食物摄 取量(g)的影响
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM，除了用^表示时＝n＝7
*p<0.05，相对于溶媒；双相ANOVARM，Tukey的多重比较检验；
表13：化合物1、利拉鲁肽以及化合物1和利拉鲁肽的组合在治疗9天后对体重(g) 的影响
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM
*p<0.05，相对于溶媒；双相ANOVARM，Tukey的多重比较检验；
表14：相对于在第9天单独给药化合物1或利拉鲁肽的体重变化百分比之和，联合 给药的化合物1和利拉鲁肽的体重变化百分比的比较结果
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM
*p<0.05，相对于联合给药，化合物1和利拉鲁肽的总和，单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
表15：化合物1、利拉鲁肽以及化合物1和利拉鲁肽的组合对治疗9天后的血糖(mg/ dL)、胰岛素和HOMA-IR的影响。
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM
*p<0.05，相对于载体；单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
表16：治疗8天后通过MRI测量的化合物1、利拉鲁肽以及化合物1和利拉鲁肽的组 合对身体组成(g)的影响
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM
*p<0.05，相对于溶媒；单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
表17：在治疗8天后通过MRI测量的化合物1、利拉鲁肽以及化合物1和利拉鲁肽的 组合对身体组成(％)的影响
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM
*p<0.05，相对于载体；单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
实施例109：单一剂量的化合物1对Sprague-Dawley大鼠的食物摄取和体重的影响
在单剂量后评估化合物1减少Sprague-Dawley的食物摄取量和体重的能力。动物获自Charles River Labs(Wilmington,MA)，体重200-225g，并在分娩后一周内使用。将它们每个笼一只圈养在α-干燥的床上用品和塑料管上，用于在具有12小时光照/黑暗周期的温度受控的室内进行富集。它们被允许随意获得水并用实验室啮齿动物饮食喂养；经辐照的认证啮齿动物饮食20,5K75*(由Purina Mills,St.Louis,MO.经由ASAPQuakertown,PA提供)。在给药之前，对每只大鼠采集动物重量并记录。
给药前一天，将大鼠基于个体体重分成八个动物的组群。第二天，将动物称重并经由皮下给药用溶媒(dPBS，pH7.2)、剂量为0.1nmol/kg、0.3nmol/kg、1.0nmol/kg或3.0nmol/kg的化合物1，或者剂量为0.3nmol/kg的度拉糖肽进行处理。在给药后1天、2天和3天测量体重和食物摄取量，并计算体重减轻和食物摄取减少的百分比。使用双向重复测量ANOVA与Prism中的Tukey的事后检验进行统计分析。所有数据均以平均值±SEM表示(表18-20)。
表18：单一剂量的化合物1在三天内对Sprague-Dawley大鼠的每日食物摄取量和 总食物消耗的影响
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM
*p<0.05，相对于溶媒；对总食物消耗应用单向ANOVA、Dunnett的多重比较检验；
对每天食品消耗应用双向ANOVA、Tukey的多重比较检验
表19：单一剂量的化合物1对Sprague-Dawley大鼠三天内绝对体重的影响。
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM
*p<0.05，相对于溶媒；双相ANOVA、Tukey的多重比较检验
表20：单一剂量的化合物1对Sprague-Dawley大鼠三天内体重变化的影响。
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM
*p<0.05，相对于溶媒；对于第3天的体重净变化应用单向ANOVA、Dunnett的多重比较检测；对每天体重变化应用双向ANOVA、Tukey的多重比较检验
实施例110：化合物1单独的或与利拉鲁肽组合在肥胖食蟹猴中的效果
评估化合物1的减少肥胖食蟹猴的食物摄取量的能力。还评估了当利拉鲁肽与有效剂量的化合物1共同给药时观察到的附加功效。首先，进行缩短的剂量范围研究以确定在共同给药期间使用的利拉鲁肽的剂量六只动物每天接受一次盐水的皮下给药，持续三周。每天测量食物摄取量，并将基线食物摄取量设定为溶媒治疗三周内的平均每日摄取量。然后将六只动物分成两组；0.01mg/kg(n＝3)且0.02mg/kg(n＝3)。每只接受利拉鲁肽的日皮下剂量并持续一周以确定相对于基线对食物摄取量的影响，并确定最大耐受剂量。在停止利拉鲁肽治疗后两周也测量食物摄取量。所有数据均表示为平均每周食物摄取量±SEM(图10)。
使用十(10)只肥胖恒河猴来评估化合物1的功效。在2周的基线期后，将化合物1每天皮下给药并持续4周。将动物以0.01mg/kg给药7天，然后以0.03mg/kg给药7天，然后以0.015mg/kg给药9天，并且最后以0.015mg/kg的化合物1与和0.01mg/kg的利拉鲁肽联合给药5天。检测每天食物摄取量，并且每周测量体重。在化合物1治疗之后和联合治疗之后，评估在基线处的葡萄糖、胰岛素、总胆固醇、HDL、LDL、ALT和AST含量。所有数据均以平均值±SEM表示(表21-22和图11和12)。
表21：化合物1和利拉鲁肽添加对肥胖恒河猴食物摄取的影响
表22：化合物1和利拉鲁肽添加对肥胖恒河猴的体重的影响
数值代表每组8只动物的数据的平均值±SEM
*p<0.05，相对于溶媒；
单向ANOVA RM、Dunnett多重比较检验
本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的广义的发明构思的情况下，可对上述实施方案作出修改。因此，应当理解，本发明不局限于所公开的特定实施方案，但本发明旨在涵盖在本发明实质和范围内的修改，如本说明书所定义。
本文引用的所有文献均以引用方式并入本文。
本发明的示例性环状PYY序列或它们的缀合物包括：
SEQ ID NO:1
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31),K(PEG12-AcBr)11,psi-(35R,36Y)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:2
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结构：
SEQ ID NO:3
名称：[环-(I3-CO(CH2)2三唑基-Nle31)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:4
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31),K(γ-Glu-Pal)11]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:5
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31),K(γ-Glu-AcVitE)11]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:6
名称：[环-(I3-CO(CH2)2三唑基-Nle31)，K(γ-Glu-AcVitE)11]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:7
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-Pal)9]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:8
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-Pal)30]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:9
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，psi-(R35Y36)]-PYY3-36结构：
SEQ ID NO:10
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-AcVitE)30]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:11
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31),K(γ-Glu-AcVitE)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:12
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，(N-Me-R35)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:13
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结构：
SEQ ID NO:14
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结构：
SEQ ID NO:15
名称：[环-(K4-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31)，K(γ-Glu-Pal)30]-PYY4-36
结构：
SEQ ID NO:16
名称：[环-(K4-p-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-Pal)30]-PYY4-36
结构：
SEQ ID NO:17
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，A4，K(γ-Glu-Pal)30]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:18
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，E4，K(γ-Glu-Pal)30]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:19
名称：[环-(I3-p-COPhCH2-C31)，K(γ-Glu-Pal)30，(N-Me-R35)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:20
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-C31),K(γ-Glu-Pal)30，(N-Me-R35)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:21
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，A4，A26，K(γ-Glu-Pal)30]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:22
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，E4，A26，K(γ-Glu-Pal)30]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:23
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:24
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结构：
SEQ ID NO:25
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-Stear)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:26
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-Arach)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:27
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K((OEG)2-COC16CO2H)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:28
名称：[环-(K4-p-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-Pal)30，psi-(R35,Y36)]-PYY4-36
结构：
SEQ ID NO:29
名称：[环-(K4-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31)，K(γ-Glu-Pal)30，psi-(R35,Y36)]-PYY4-36
结构：
SEQ ID NO:30
名称：[环-(K4-CO(CH2)3NHCOCH2-C31)，K(γ-Glu-Pal)30，psi-(R35,Y36)]-PYY4-36
结构：
SEQ ID NO:31
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K((OEG)2-γ-Glu-Stear)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:32
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，A4，A26，K(γ-Glu-Pal)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:33
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31),K(γ-Glu-Pal)30,(N-Me-Q34),psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:34
名称：[环-(K4-CO(CH2)5NHCOCH2-C31)，K(γ-Glu-Pal)30，psi-(R35,Y36)]-PYY4-36
结构：
SEQ ID NO:35
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-Pal)30，(N-Me-R35)，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:36
名称：[环-(K4-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31)，K(γ-Glu-Pal)30，(N-Me-R35)，psi-(R35,Y36)]-PYY4-36
结构：
SEQ ID NO:37
名称：[环-(I3-CO(CH2)3NHCOCH2-C31)，K(γ-Glu-Pal)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:38
名称：[环-(I3-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31)，K(γ-Glu-Pal)30，(N-Me-R35)，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:39
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，S4，K(γ-Glu-Arach)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:40
名称：[环-(I3-CO(CH2)2三唑基-Nle31)，K((OEG)2-γ-Glu-Pal)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:41
名称：[环-(I3-CO(CH2)2三唑基-Nle31)，K(γ-Glu-Pal)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:42
名称：[环-(I3-CO(CH2)2三唑基-Nle31)，K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:43
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K((OEG)2-γ-Glu-Pal)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:44
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)11，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:45
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(COCH2CH2(OCH2CH2)24NH-γ-Glu-Pal)11，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:46
名称：[环-(I3-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31)，K(γ-Glu-Pal)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:47
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)7，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:48
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)22，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:49
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-(Pal-16-OH))30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:50
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)23，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:51
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，S4，K(γ-Glu-Pal)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:52
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(COCH2CH2(OCH2CH2)12NH-γ-Glu-Pal)11，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:53
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K((OEG)4-γ-Glu-Pal)11，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:54
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K((OEG)2-γ-Glu-Pal)11，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:55
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K((OEG)2-γ-Glu-Pal)23，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:56
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31),K(γ-Glu-COCH2Ph-(4-ClPh)30,psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:57
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31),K(γ-Glu-CO(CH2)2PhO-(2,4-Cl2Ph)30,psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:58
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-CO(CH2)10-(4-F-Ph))30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:59
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K((OEG)2-γ-Glu-Pal)22，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:60
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K((OEG)2-γ-Glu-Pal)7，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:61
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-CO(CH2)10-(4-F3C-Ph))30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:62
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-CO(CH2)10-CF3)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:63
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-CO(CH2)13-CF3)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:64
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-(Pal-16-OEt))30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:65
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-CO(CH2)11(CD2)3CD3)30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:66
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-CO(CH2)10-(2,4-(CF3)2-Ph))30,，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:67
名称：[环-(I3-m-COPhCH2-hC31)，K(γ-Glu-CO(CH2)10-(3,5-(CF3)2-Ph))30,，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:68
名称：[环-(I3-CO(CH2)2NHCOCH2-C30)，K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)11，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:69
名称：[环-(G2-E31),S4,K11,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:70
名称：[环-(G2-E30),S4,K11,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:71
名称：[环-(G2-E30),S4,K11,(N-Me-R35)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:72
名称：[环-(G2-E30)，S4，K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)11，psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:73
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31),K(PEG6-AcBr)11,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:74
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31),K(AcBr)11,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:75
名称：[环-(I3-COCH2-C31),K(PEG12-AcBr)11,psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:76
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31),K(PEG12-AcBr)11,K(mPEG16)30,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:77
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31),K(AcBr)11,K(mPEG12)20,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:78
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31),K(PEG12-AcBr)11,(N-Me)Q34,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:79
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31),K(PEG12-AcBr)11,N-Me-R35,psi-(R35,36Y)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:80
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31),R4,K(PEG12-AcBr)11,W30,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:81
名称：[环-(3I-COCH2CH2CH2NHCOCH2-C31),R4,K(PEG12-AcBr)11,W30,psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:82
名称：[环-(K4-OEG-COCH2-C31),K(PEG12-AcBr)11,psi-(R35,Y36)]-PYY4-36
结构：
SEQ ID NO:83
名称：[环-(I3-COCH2CH2三唑基Nle31),K(PEG12-AcBr)11,psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构
SEQ ID NO:84
名称：[环-(I3-m-CO-苄基-hC31),K(PEG8-三唑基-CH2CH2CO-PEG4-AcBr)11，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
结构：
SEQ ID NO:85
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31)，K(PEG12-AcBr)23，psi-(R35,Y36)]-PYY2-36，结构：
SEQ ID NO:86
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31),K(PEG12-AcBr)22,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:87
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31),K(PEG12-AcBr)7,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:88
名称：[环-(G2-COCH2-C30),K(PEG12-AcBr)11,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:89
名称：[环-(G2-COCH2-C30),K(PEG12-AcBr)11,N-Me-R35]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:90
名称：[环-(βA2-COCH2-C30),K(PEG12-AcBr)11,N-Me-R35]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:91
名称：[环-(G2-COCH2-hC30),K(PEG12-AcBr)11,N-Me-R35]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:92
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31),K(PEG12-AcBr)11,N-Me-R35]PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:93
名称：[环-(G2-COCH2-hC30),K(PEG12-AcBr)11,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:94
名称：[环-(βA2-COCH2-C30),K(PEG12-AcBr)11,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:95
名称：[环-(G2-E30),S4,K(AcBr)11,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:96
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31),K(PEG24-AcBr)11,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:97
名称：[环-(G2-Ac-hC31),K(PEG12-AcBr)11,psi-(R35-Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:98
名称：[环-(G2-COCH2-C30),K(AcBr)11,N-Me-R35]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:99
名称：[环-(βA2-COCH2-C30),K(AcBr)11,N-Me-R35]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:100
名称：[环-(βA2-COCH2-C30),K(AcBr)11,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:101
hPYY3-36
结构：
SEQ ID NO:102
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31)，K(PEG12)11，psi-(35R,36Y)]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物1)
结构：
SEQ ID NO:103
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31)，K(PEG6)11，psi-(R35,Y36)]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物2)
结构：
SEQ ID NO:104
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31)，K11，psi-(R35,Y36)]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物3)
结构：
SEQ ID NO:105
名称：[环-(I3-COCH2-C31)，K(PEG12)11，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36mAb同源二聚体缀合物(化合物4)
结构：
SEQ ID NO:106
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31)，K(PEG12)11，K(mPEG16)30，psi-(R35,Y36)]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物5)
结构：
SEQ ID NO:107
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31)，K11，K(mPEG12)20，psi-(R35,Y36)]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物6)
结构：
SEQ ID NO:108
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31)，K(PEG12)11，(N-Me)Q34，psi-(R35,Y36)]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物7)
结构：
SEQ ID NO:109
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31)，K(PEG12)11，N-Me-R35，psi-(R35,36Y)]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物8)
结构：
SEQ ID NO:110
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31)，R4，K(PEG12)11，W30，psi-(R35,Y36)]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物9)
结构：
SEQ ID NO:111
名称：[环-(3I-COCH2CH2CH2NHCOCH2-C31)，R4，(PEG12)11，W30，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36mAb同源二聚体缀合物(化合物10)
结构：
SEQ ID NO:112
名称：[环-(K4-OEG-COCH2-C31)，K(PEG12)11，psi-(R35,Y36)]-PYY4-36mAb同源二聚体缀合物(化合物11)
结构：
SEQ ID NO:113
名称：[环-(I3-COCH2CH2三唑基Nle31)，K(PEG12)11，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36mAb同源二聚体缀合物(化合物12)
结构
SEQ ID NO:114
名称：[环-(I3-m-CO-苄基-hC31),K(PEG8-三唑基-CH2CH2CO-PEG4)11，psi-(R35,Y36)]-PYY3-36mAb同源二聚体缀合物(化合物13)
结构：
SEQ ID NO:115
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31)，K(PEG12)23，psi-(R35,Y36)]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物14)
结构：
SEQ ID NO:116
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31)，K(PEG12)22，psi-(R35,Y36)]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物15)
结构：
SEQ ID NO:117
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31)，K(PEG12)7，psi-(R35,Y36)]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物16)
结构：
SEQ ID NO:118
名称：[环-(G2-COCH2-C30)，K(PEG12)11，psi-(R35,Y36)]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物17)
结构：
SEQ ID NO:119
名称：[环-(G2-COCH2-C30)，K(PEG12)11，N-Me-R35]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物18)
结构：
SEQ ID NO:120
名称：[环-(βA2-COCH2-C30)，K(PEG12)11，N-Me-R35]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物19)
结构：
SEQ ID NO:121
名称：[环-(G2-COCH2-hC30)，K(PEG12)11，N-Me-R35]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物20)
结构：
SEQ ID NO:122
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31)，K(PEG12)11，N-Me-R35]PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物21)
结构：
SEQ ID NO:123
名称：[环-(G2-COCH2-hC30)，K(PEG12)11，psi-(R35,Y36)]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物22)
结构：
SEQ ID NO:124
名称：[环-(βA2-COCH2-C30)，K(PEG12)11，psi-(R35,Y36)]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物23)
结构：
SEQ ID NO:125
名称：[环-(G2-E30)，S4，K11，psi-(R35,Y36)]-PYY2-36同源二聚体缀合物(化合物24)
结构：
SEQ ID NO:126
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31)，K(PEG24)11，psi-(R35,Y36)]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物25)
SEQ ID NO:127
名称：[环-(G2-Ac-hC31)，K(PEG12)11，psi-(R35-Y36)]-PYY2-36mAb同源二聚体缀合物(化合物26)
结构：
SEQ ID NO:147
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31),psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:148
名称：[环-(βA2-COCH2-hC31),K11,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:149
名称：[环-(G2-E30),S4,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:150
名称：[环-(G2-E30),S4,K11,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:151
名称：[环-(G2-COCH2-C30),N-Me-R35]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:152
名称：[环-(G2-COCH2-C30),K11,N-Me-R35]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:153
名称：[环-(βA2-COCH2-C30),N-Me-R35]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:154
名称：[环-(βA2-COCH2-C30),K11,N-Me-R35]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:155
名称：[环-(βA2-COCH2-C30),psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：
SEQ ID NO:156
名称：[环-(βA2-COCH2-C30),K11,psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
结构：

Claims (25)

1.一种缀合物，包含偶联到环状PYY肽的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述环状PYY肽由式I或其衍生物或药学上可接受的盐表示：
其中
p为0或1；
m为0、1、2、3、4或5；
n为1、2、3或4；
q为0或1；前提条件是仅当Z30不存在时，q为1；
桥为-Ph-CH2-S-、-三唑基-、-NHC(O)CH2S-、-SCH2C(O)NH-、-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S、-NHC(O)-或-CH2S-；
Z4为K、A、E、S或R；
Z7为A或K；
Z9为G或K；
Z11为D或K；
Z22为A或K；
Z23为S或K；
Z26为A或H；
Z30为L、W、不存在或K；
前提条件是仅当q为1时，Z30不存在；
Z34为
Z35为
其中所述衍生物为通过一种或多种方法修饰的式I的化合物，所述方法选自：酰胺化、糖基化、氨甲酰化、硫酸化、磷酸化、环化、脂化和聚乙二醇化。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述环状PYY肽为式I的化合物或通过一种或多种方法修饰的式I的环状PYY肽的衍生物，或其药学上可接受的盐，所述方法选自：酰胺化、脂化和聚乙二醇化。
3.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述环状PYY肽由式I或其衍生物或药学上可接受的盐表示，其中：
p为0或1；
m为0、1、2、3、4或5；
n为1、2、3或4；
q为0或1；前提条件是仅当Z30不存在时，q为1；
桥为-Ph-CH2-S-、-三唑基、-NHC(O)CH2S-、-SCH2C(O)NH2-、-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S、-NHC(O)-或-CH2S-；
Z4为K、A、E、S或R；
Z7为A或K，其中所述K的氨基侧链任选地被以下取代：
其中i为0至24的整数，并且X＝Br、I或Cl，
-C(O)CH2Br、-C(O)CH2I或-C(O)CH2Cl；
Z9为G或K，其中所述K的氨基侧链任选地被以下取代：
其中i为0至24的整数，并且X＝Br、I或Cl，
-C(O)CH2Br、-C(O)CH2I或-C(O)CH2Cl；
Z11为D或K，其中所述K的氨基侧链任选地被以下取代：
其中i为0至24的整数，并且X＝Br、I或Cl，
-C(O)CH2Br、-C(O)CH2I或-C(O)CH2Cl；
Z22为A或K，其中所述K的氨基侧链任选地被以下取代：
其中i为0至24的整数，并且X＝Br、I或Cl，
-C(O)CH2Br、-C(O)CH2I或-C(O)CH2Cl；
Z23为S或K，其中所述K的氨基侧链任选地被以下取代：
其中i为0至24的整数，并且X＝Br、I或Cl，
-C(O)CH2Br、-C(O)CH2I或-C(O)CH2Cl；
Z26为A或H；
Z30为L或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
Z34为并且
Z35为
4.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述环状PYY肽由式I或其衍生物或药学上可接受的盐表示，其中：
p为0或1；
m为0、1、2、3或5；
n为1、2或4；
q为0或1；前提条件是仅当Z30不存在时，q可为1；
桥为-Ph-CH2-S-、-三唑基-、-NHC(O)CH2S-、-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S、-NHC(O)-或-CH2S-；
Z4为K、A、E、S或R；
Z7为A或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
Z9为G或K，
Z11为D或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
-C(O)CH2Br，
Z22为A或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
Z23为S或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
Z26为A或H，
Z30为L或K，其中所述K的氨基侧链被以下取代：
Z34为
Z35为
5.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述环状PYY肽选自SEQ ID NO:1、73-100和147-156，或其药学上可接受的盐。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的缀合物，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段经由连接基在所述环状PYY肽的赖氨酸残基处与所述环状PYY肽共价连接。
7.根据权利要求6所述的缀合物，其中所述连接基包括选自以下的一种：聚乙二醇(PEG)8-三唑基-CH2CH2CO-PEG4、2-24个PEG单元的PEG链、含有2-10个碳原子的烷基链；(Gly4Ser)j，其中j＝1-4；(AlaPro)u，其中u＝1-10；以及键。
8.根据权利要求7所述的缀合物，其中式I中Z7、Z9、Z11、Z22和Z23中的仅一个为赖氨酸，并且所述赖氨酸经由连接基与所述单克隆抗体或其抗原结合片段的工程化半胱氨酸残基共价连接。
9.一种缀合物，包含偶联到环状PYY肽的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述缀合物包含选自SEQ ID NO:102-127的序列或其药学上可接受的盐，
其中mAb表示单克隆抗体或其抗原结合片段，并且]2表示所述环状PYY肽中的1个或2个共价缀合到所述mAb。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的缀合物，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3，和轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其分别具有以下的多肽序列：SEQ ID NO:141、142、143、144、145和146。
11.根据权利要求10所述的缀合物，其中分离的单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:137的多肽序列的重链可变结构域(VH)和具有SEQ ID NO:139的多肽序列的轻链可变结构域(VL)。
12.根据权利要求11所述的缀合物，还包含Fc部分。
13.根据权利要求12所述的缀合物，包含具有SEQ ID NO:138的多肽序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:140的多肽序列的轻链(LC)。
14.一种缀合物，包含偶联到环状PYY肽的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3，和轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其分别具有SEQ ID NO:141、142、143、144、145和146的多肽序列，优选地所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:137的多肽序列的重链可变结构域(VH)，和具有SEQ ID NO:139的多肽序列的轻链可变结构域(VL)，并且更优选地，所述单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:138的多肽序列的重链(HC)和具有SEQID NO:140的多肽序列的轻链(LC)；
所述环状PYY多肽包含选自以下的多肽序列：SEQ ID NO:1、73-100和147-156，或其药学上可接受的盐；并且
所述单克隆抗体或其抗原结合片段在所述环状PYY肽的残基7、9、11、22或23处，优选地在所述环状PYY肽的赖氨酸残基11处，直接或经由连接基缀合至所述环状PYY肽。
15.一种制备根据权利要求1-14中任一项所述的缀合物的方法，包括使引入所述环状PYY肽的侧链，优选地所述环状PYY肽的赖氨酸残基的侧链上的亲电体，优选地溴乙酰胺或马来酰亚胺，与所述单克隆抗体或其抗原结合片段的SEQ ID NO:143的半胱氨酸残基的巯基基团反应，从而在所述环状PYY肽和所述单克隆抗体或其抗原结合片段之间形成共价键。
16.一种药物组合物，包含根据权利要求1-14中任一项所述的缀合物，和药学上可接受的载体。
17.一种用于治疗或预防对其有需要的受试者的疾病或障碍的方法，其中所述疾病或障碍选自：肥胖症、I型或II型糖尿病、代谢综合征、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常、高血糖、高胰岛素血症、高甘油三酯血症、由于先天性高胰岛素血症(CHI)引起的低血糖、血脂异常、动脉粥样硬化、糖尿病肾病、以及其他心血管危险因素诸如高血压和与未管理胆固醇和/或血脂水平相关的心血管危险因素、骨质疏松症、炎症、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肾脏疾病和湿疹，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的根据权利要求16所述的药物组合物。
18.一种减少对其有需要的受试者的食物摄取量的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的根据权利要求16所述的药物组合物。
19.一种调节对其有需要的受试者的Y2受体活性的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的根据权利要求16所述的药物组合物。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述药物组合物经由注射施用。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法，其中所述药物组合物与至少一种抗糖尿病剂组合施用。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述抗糖尿病剂为胰高血糖素样-肽-1受体调节剂。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述药物组合物与利拉鲁肽组合施用。
24.一种试剂盒，包含根据权利要求1-14中任一项所述的缀合物，优选地其还包含利拉鲁肽和用于注射的装置。
25.一种制备包含根据权利要求1-15中任一项所述的缀合物的药物组合物的方法，包括将所述缀合物与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
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