TW202304972A - 免疫球蛋白及其用途 - Google Patents

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TW202304972A
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seq
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馬克 馬希雷格
雷蒙德 派契
張瑞
馬丁 凱斯
馬克 沃
越梅 章
舍米娜 蘭華拉
詹姆斯 雷納德
羅 卡馬喬
麥克 航特
凱瑟琳 迪阿基諾
威爾遜 愛德華茲
羅納德 斯旺森
蹇文嬰
友善 戚
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比利時商健生藥品公司
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Abstract

本發明關於一種經設計以被偶合至治療肽的單株抗體平台，以增加治療肽於個體中之半衰期。本發明亦關於醫藥組成物及使用該醫藥組成物之方法。

Description

免疫球蛋白及其用途
本發明大致上關於一種新穎的抗體及其片段、及其作為載劑以被偶合至治療肽以增加治療肽於體內之半衰期的用途。本發明亦關於醫藥組成物及使用該醫藥組成物之方法。
相關申請案之交互參照
本申請案主張美國臨時專利申請案62/413,613（申請日2016年10月27日）及美國臨時專利申請案62/413,586（申請日2016年10月27日）之優先權。各揭示內容全文以引用方式併入本文中。
電子提交序列表之參照
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式序列表經由EFS-Web電子提交，檔案名稱為「PRD3459 Sequence Listing」，創建日期2017年10月23日，檔案大小20kb。經EFS-Web提交之序列表係本說明書之一部分，其全文以引用方式併入本文中。若在本文中描述之關於SEQ ID NOs: 1至27結構之資訊與經由EFS-Web以檔案名稱「PRD3459 Sequence Listing」電子提交之序列表之間有任何不一致，以本文中之資訊為主。
基於肽之治療劑因為其可提供特異性及選擇性而常被探討及發展，如由許多經核准基於肽之治療所證實，但可使用其的方式係受限於其於體內相對短的半衰期。有許多半衰期延長策略被評估並用在基於肽之治療劑。已將抗體或抗體片段用作為藥理活性部份之半衰期延長部份，以預防或減輕藥理活性部份之快速體內排除。
需要改良的免疫球蛋白，其可用作為藥理活性部份之藥理非活性半衰期延長部份，藥理活性部份較佳係基於肽之治療劑。
前述討論僅針對所屬技術領域所面臨之問題本質提供較佳理解，且不應以任何方式被視為對先前技術之承認，且本文中所引用之任一參考文獻亦不應被視為承認該等參考文獻構成本申請案之「先前技術」。
在一大致態樣中，本發明關於一種單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別具有SEQ ID NO: 16、17、18、19、20、及21之多肽序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、HCDR3、及輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2、及LCDR3。
在較佳實施例中，本發明之單離單株抗體其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO:12之多肽序列的重鏈可變域(VH)、及具有SEQ ID NO:14之多肽序列的輕鏈可變域(VL)。更佳的是，本發明之單離單株抗體包含具有SEQ ID NO:13之多肽序列的重鏈(HC)、及具有SEQ ID NO:15之多肽序列的輕鏈(LC)。
本發明亦關於一種編碼本發明之單株抗體或其抗原結合片段的核酸；一種包含該核酸之載體，較佳的是表現載體；及一種包含該載體之宿主細胞。亦提供一種產生單離單株抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含：在多個條件下培養本發明之宿主細胞，以產生該單株抗體或其抗原結合片段；及自該細胞或培養物回收該抗體或其抗原結合片段。
本發明之實施例包括本發明之單株抗體或其抗原結合片段，其直接或經由連接子接合至至少一個藥理活性部份，較佳的是治療肽。可將本發明之單株抗體或其抗原結合片段接合至任何治療肽。治療肽之實例包括但不限於調酸素(oxyntomodulin)、類升糖素肽1 (GLP1)、酪酪肽(peptide tyrosine tyrosine, PYY)、毒蜥外泌肽(exendin)（艾塞那肽(exenatide)）、澱粉素（普蘭林肽(pramlintide)）、α-黑色素細胞刺激素(MSH)、古柯鹼及安非他命調控之轉錄物(CART)、神經肽Y受體Y1 (NPY1)拮抗劑、神經肽Y受體Y5 (NPY5)拮抗劑、神經調壓素(neurotensin) S、神經肽B、神經肽W、飢餓肽、鈴蟾肽樣受體3 (bombesin-like receptor 3, BRS3)、甘丙胺素、膽囊收縮素(CCK)、食慾素、黑色素濃縮激素(MCH)、催產素、及壓克肽(stresscopin)。
亦提供一種製造接合至治療肽的本發明之單株抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含使引入該治療肽之側鏈上的親電子劑與該單株抗體或其抗原結合片段之巰基反應，藉以在該治療肽與該單株抗體或其抗原結合片段之間建立共價鍵結，該親電子劑較佳係溴乙醯胺或順丁烯二醯亞胺，該巰基較佳係SEQ ID NO:18的半胱胺酸殘基之巰基。
本發明亦關於一種醫藥組成物，其包含：本發明之單株抗體或其抗原結合片段，其直接或經由連接子接合至至少一個藥理活性部份，較佳的是治療肽；及醫藥上可接受之載劑。
本發明之另一大致態樣關於一種增加治療肽於個體中之半衰期的方法，該方法包含使該治療肽與單株抗體或其抗原結合片段接合，該單株抗體或其抗原結合片段包含分別具有SEQ ID NO: 16、17、18、19、20、及21之多肽序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、HCDR3、及輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2、及LCDR3，其中該治療肽係在巰基處接合至該單株抗體或其抗原結合片段，較佳的是SEQ ID NO:18之Cys殘基的巰基。
本發明之進一步態樣、特色及優點將藉由閱讀下列本發明之實施方式及申請專利範圍更佳地理解。
各篇公開案、論文、及專利已於先前技術及整份說明書引用或描述；此等參考文獻之各者全文係以引用方式併入本文中。在本說明書中所包括之對於文件、行動、材料、裝置、物品、或其類似者的論述，目的在於提供關於本發明的脈絡。此等論述並非承認，任一或所有此等情事形成了關於任何所揭示或請求之發明的先前技術部分。
除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學用語，均與本發明有關技術領域中具有通常知識者所通常了解之意義相同。在其他方面，在本文中所使用的某些用語具有如本說明書所闡述之意義。
必須注意的是，本文及附加之申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱，除非上下文另有明確說明。
除非以其他方式說明，在本文中描述之任何數值諸如濃度或濃度範圍應理解為在所有情況下皆受到用語「約(about)」之修飾。因此，數值一般包括記載值之± 10%。例如，濃度1 mg/mL包括0.9 mg/mL至1.1 mg/mL。同樣地，濃度範圍1%至10% (w/v)包括0.9% (w/v)至11% (w/v)。如本文中所使用，明示使用之數值範圍包括所有可能的子範圍、在該範圍內之所有個別數值，包括在該等範圍內之整數及數值之分數，除非上下文以其他方式清楚指示。
除非以其他方式指示，在一系列元件之前的用語「至少(at least)」應理解為係指該序列中的每一元件。所屬技術領域中具有通常知識者將認可或僅使用例行實驗即可確定本文所述之本發明的特定實施例的許多等效物。該等等效物意欲涵蓋於本發明中。
如本文中所使用，用語「包含(comprises、comprising)」、「包括(includes、including)」、「具有(has、having)」、或「含有(contains、containing)」或彼等之任何其他變體將被理解為隱含包括所述整體或整體之群，但不排除任何其他整體或整體之群，且意欲為非排他性或開放式的。例如，包含表列元件之組成物、混合物、過程、方法、物品、或設備未必局限於僅該些元件，但可包括未明示表列或為該組成物、混合物、過程、方法、物品、或設備所固有之其他元件。再者，除非明示相反說明，「或(or)」係指包括性的「或」而非排他性的「或」。例如，下列任一者皆滿足條件A或B：A為真（或存在）且B為偽（或不存在）、A為偽（或不存在）且B為真（或存在）、及A及B兩者皆為真（或存在）。
亦應理解的是，在本文中使用之用語「約(about)」、「大約(approximately)」、「通常(generally)」、「實質上(substantially)」及類似用語當用於較佳發明之組分的尺寸或特徵時，指示所述尺寸/特徵並非嚴格邊界或參數，且不排除將為所屬技術之技術領域中具有通常知識者所理解的彼等之功能上相同或類似的微小變異。在最小限度上，包括數值參數之該等指稱將包括使用所屬技術領域中已接受之數學及工業原理（例如，四捨五入、測量或其他系統誤差、製造公差等）不會改變最低有效數位(least significant digit)之變異。
在二或更多個核酸或多肽序列（例如，環狀PYY 3-36多肽序列、調酸素(oxyntomodulin)多肽序列、抗體輕鏈或重鏈序列）上下文中之用語「同一(identical)」或「同一性(identity)」百分比，係指將二或更多個序列或子序列比較及對準以達最大對應性時，如使用序列比較演算法之一或使用本揭露所屬技術領域中已知方法目視檢查測量，二或更多個序列或子序列係相同或具有特定百分比的相同胺基酸殘基或核苷酸。
為進行序列比較，一般將一個序列當作參考序列，並使測試序列與其比較。當使用序列比較演算法時，將測試及參考序列輸入電腦中，指定子序列座標（若有需要），並指定序列演算法程式參數。序列比較演算法接著基於指定程式參數，計算（多個）測試序列相對於參考序列之序列同一性百分比。
序列比較之最佳比對可藉由例如Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)之局部同源性演算法、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)之同源性比對演算法、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)之搜尋相似性方法、這些演算法的電腦化實施（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI中之GAP、BESTFIT、FASTA、及TFASTA）、或目視檢查（通常見Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel等人，eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)）進行。
適合用於判定序列同一性及序列相似性百分比之演算法實例為BLAST及BLAST 2.0演算法，彼等分別描述於Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410及Altschul等人(1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402。執行BLAST分析之軟體由美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)供大眾使用。
二個核酸序列或多肽係實質上同一的進一步指示在於第一核酸編碼之多肽及第二核酸編碼之多肽具有如下所述之免疫交叉反應性。因此，例如當二個肽只有保守性取代之差異時，多肽一般係實質上與第二多肽同一。二個核酸序列係實質上同一的另一個指示在於二個分子在如下述之嚴謹條件下彼此雜交。
如本文中所使用之「個體(subject)」意指任何動物，較佳的是哺乳動物，最佳的是人類。如本文中所使用的用語「哺乳動物(mammal)」，其涵蓋任何哺乳動物。哺乳動物之實例包括（但不限於）牛、馬、羊、豬、貓、狗、小鼠、兔、天竺鼠、猴、人類等，更佳的是人類。
與本發明之方法有關的用語「投予(administering)」，意指一種藉由使用本發明之接合物或其形式、組成物或藥劑來治療性地或預防性地預防、治療或改善如本文中所述之症候群、病症或疾病的方法。此類方法包括在療程期間的不同時間投予有效量的該接合物、接合物形式、組成物或藥劑，或者以組合形式同時投予有效量的該接合物、接合物形式、組成物或藥劑。本發明之方法應被理解為包括所有習知的治療性治療方案。
用語「有效量(effective amount)」意指能在組織系統、動物或人類中引發生物或醫學反應之活性接合物或藥劑的量，該反應為研究者、獸醫師、醫師、或其他臨床醫師所尋求，且包括預防、治療或改善欲治療之症候群、病症、或疾病、或欲治療之症候群、病症、或疾病的症狀。
本文中所使用之用語「組成物(composition)」意欲涵蓋包含特定量之特定成分的產品，以及任何由特定成分以特定量組合所直接或間接形成之產品。
如本文中所使用，用語「偶合(coupled)」係指將二或更多個物件接合或連接在一起。當用於化學或生物化合物時，偶合可指二或更多個化學或生物化合物之間的共價連接。舉非限制性實例來說，本發明之抗體可與受到關注的肽偶合以形成抗體偶合肽。抗體偶合肽可經由經設計以將抗體接合至肽的特定化學反應形成。在某些實施例中，本發明之抗體可與本發明之肽經由連接子共價偶合。連接子可例如先共價連接至抗體或肽，接著再共價連接至肽或抗體。
如本文中所使用，用語「連接子(linker)」係指包含將肽共價附接至肽之共價或原子鏈的化學分子。連接子可例如包括但不限於肽連接子、烴連接子、聚乙二醇(PEG)連接子、聚丙二醇(PPG)連接子、多醣連接子、聚酯連接子、由PEG及埋置雜環組成之混合連接子、及烴鏈。PEG連接子可例如包含2至24個PEG單元。
本文中所使用之用語「接合物(conjugate)」係指共價偶合至醫藥活性部份之抗體或其片段。用語「接合至(conjugated to)」係指本發明之抗體或其片段直接或經由連接子間接共價連結至或共價連接至醫藥活性部份，較佳的是治療肽。舉非限制性實例來說，抗體可為本發明之單株抗體，且醫藥活性部份可為治療肽，諸如環狀PYY、調酸素肽、或任何其他受到關注之治療肽。醫藥活性部份亦可為非肽有機部份（即「小分子(small molecule)」）。在本揭露中，關於根據本發明之實施例之抗體或其抗原結合片段，詞組「包含抗體或其抗原結合片段及接合至其之醫藥活性部份（或治療肽）的接合物(a conjugate comprising an antibody or antigen binding fragment thereof and a pharmaceutically active moiety (or therapeutic peptide) conjugated thereto)」與詞組「接合至醫藥活性部份（或治療肽）之抗體或其抗原結合片段(an antibody or antigen binding fragment thereof conjugated to a pharmaceutically active moiety (or a therapeutic peptide))」可交換使用。
在本文中描述之肽序列係根據通常慣例書寫，其中肽之N端區域寫在左側，且C端區域寫在右側。雖然已知胺基酸具有異構形式，但除非以其他方式明示指示，否則以L型胺基酸表示。 抗體
在一大致態樣中，本發明關於一種新穎抗體，其經工程改造成非靶向性且含有能夠用於以位點特異性方式化學接合（即偶合）醫藥活性部份（諸如治療肽（例如環狀PYY肽、調酸素肽或變體肽等））之半胱胺酸殘基，使得抗體偶合肽相較於單獨肽具有延長/增加的半衰期。如本文中所使用，在抗體上下文中之用語「非靶向性(non-targeting)」係指不特異性結合至任何體內目標之抗體。如本文中所使用，「特異性結合至目標(specifically binds to a target)」的抗體係指以1×10 -7M或更小、較佳地1×10 -8M或更小、更加地5×10 -9M或更小、1×10 -9M或更小、5×10 -10M或更小、或1×10 -10M或更小之KD結合至目標抗原的抗體。用語「KD」係指解離常數，此常數獲自Kd對Ka之比例（即Kd/Ka），並以莫耳濃度(M)表示。抗體之KD值可使用本揭露所屬技術領域中之方法判定。例如，抗體之KD可藉由使用表面電漿共振（諸如使用生物感測器系統例如Biacore®系統）、或使用生物層干涉技術（諸如Octet RED96系統）判定。抗體之KD值越小，抗體結合至目標抗原的親和性越高。
單株抗體（完整或其片段）可用來作為半衰期延長部份。單株抗體係廣為研究的蛋白質，已被利用及表徵於體內用途，因此能使彼等具有延長體內半衰期之機制及彼等體內之排除機制係廣為理解。此外，單株抗體之二個「臂(arm)」的空間分離及呈現可有利地用於有效雙價呈現治療部份（即治療肽）。已發展其中有毒素或其他小分子藥物經化學連結至單株抗體之治療劑，但一般利用的單株抗體結合至特定抗原且使抗體-藥物接合物靶向優先表現抗原之受到關注之組織/細胞，且藥物/小分子一般以不影響抗體之抗原結合的方式附接至抗體。
就治療肽-mAb接合物而言，半衰期延長單株抗體之抗原特異性結合並非所欲。因此，使用不預期特異性結合任何目標之重鏈(HC)及輕鏈(LC)可變(V)域對，以用於製備本發明之可偶合、非靶向性單株抗體。為了獲得可偶合、非靶向性單株抗體，半胱胺酸殘基係經工程改造至選定非靶向性抗體之互補決定區(CDR)之一。醫藥活性部份（例如治療肽/化合物）可含有適當化學部份以允許醫藥活性部份接合至非靶向性單株抗體的工程改造半胱胺酸殘基。根據本發明之實施例之肽-單株抗體常規接合策略係顯示於圖1。
本文中使用之用語「抗體(antibody)」為廣義上的用意且包括非人類（例如鼠類、大鼠）、人類、人類調適(human-adapted)、人化及嵌合單株抗體、抗體片段、雙特異性或多特異性抗體、二聚體、四聚體或多聚體抗體、及單鏈抗體。
任何脊椎動物物種的抗體輕鏈可分派為兩種截然不同類型（即kappa (κ)及lambda (λ)）之一者，視其等恆定域的胺基酸序列而定。因此，本發明之抗體可含有κ或λ輕鏈恆定域。根據具體實施例，本發明之抗體包括例如來自小鼠或人類抗體之重鏈及/或輕鏈恆定區。除了重鏈及輕鏈恆定域之外，抗體含有抗原結合區，其係由輕鏈可變區及重鏈可變區構成，該輕鏈可變區及重鏈可變區各含有三個結構域（即互補決定區1至3；（CDR1、CDR2、及CDR3））。輕鏈可變區域替代地稱為LCDR1、LCDR2、及LCRD3，且重鏈可變區域替代地稱為HCDR1、HCRD2、及HCDR3。
免疫球蛋白可分為五大類，即IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，取決於重鏈恆定域(constant domain)胺基酸序列。IgG係五種免疫球蛋白中最穩定的一種，在人類的血清半衰期約為23天。IgA及IgG係進一步次分為下列同型(isotype)：IgA 1、IgA 2、IgG 1、IgG 2、IgG 3及IgG 4。四種IgG亞型各具有不同的生物功能稱為效應功能。這些效應功能通常經由與Fc受體(FcγR)交互作用或藉由結合C1q及固定補體所媒介。結合至FcγR可導致抗體依賴性細胞媒介性細胞溶解，然而結合至補體因子可導致補體媒介性細胞溶解。為了延長治療肽半衰期之能力而利用之本發明之抗體不具有或具有最少效應功能，但保留其結合FcRn之能力，與FcRn之結合可為抗體藉以具有延長體內半衰期之主要手段。
在一實施例中，本發明關於單離抗體或其抗原結合片段，該單離抗體或其抗原結合片段包含具有完整人類Ig生殖系V基因序列之輕鏈可變區、及除了具有SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HCDR3外具有完整人類Ig生殖系V基因序列之重鏈可變區，其中該抗體或其抗原結合片段不特異性結合至任何人類體內抗原。在某些實施例中，本發明關於一種單離抗體或其抗原結合片段，其包含具有完整人類Ig生殖系V基因序列之輕鏈可變區、及除了具有SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HCDR3外具有完整人類Ig生殖系V基因序列之重鏈可變區，其中該抗體或其抗原結合片段不特異性結合至任何人類體內抗原，其中該單離抗體或其抗原結合片段係偶合至醫藥活性部份（例如環狀PYY肽、調酸素肽、及/或本發明之治療肽）。
本文中所使用之用語「抗原結合片段(antigen-binding fragment)」係指抗體片段諸如例如雙體抗體(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、雙硫鍵穩定性Fv片段(dsFv)、(dsFv) 2、雙特異性dsFv (dsFv-dsFv')、雙硫鍵穩定性雙體抗體（ds雙體抗體）、單鏈抗體分子(scFv)、單結構域抗體(sdab)、scFv二聚體（雙價雙體抗體）、由包含包含一或多個CDRs之抗體的一部分形成之多特異性抗體、駱駝化單結構域抗體、奈米抗體、結構域抗體、雙價結構域抗體、或任何其他結合至抗原但不包含完整抗體結構之抗體片段。抗原結合片段能夠結合至親本抗體(parent antibody)或親本抗體片段所結合之相同抗原。根據具體實施例，抗原結合片段包含輕鏈可變區、輕鏈恆定區、及Fd區段（即包括在Fab片段中之重鏈部分）。根據其他具體實施例，抗原結合片段包含Fab及F(ab')。
本文中所使用之用語「單鏈抗體(single-chain antibody)」係指所屬技術領域中習知之單鏈抗體，其包含由約15至約20個胺基酸之短肽連接的重鏈可變區及輕鏈可變區。本文中所使用之用語「單結構域抗體(single domain antibody)」係指所屬技術領域中習知之單結構域抗體，其包含重鏈可變區及重鏈恆定區或其僅包含重鏈可變區。
詞組「經單離之抗體或抗體片段(isolated antibody or antibody fragment)」係指實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體的抗體或抗體片段（例如，特異性結合目標抗原的經單離抗體實質上不含不特異性結合目標抗原的抗體）。此外，經單離之抗體或抗體片段可實質上不含其他細胞材料和/或化學物。
抗體可變區係由被三個「抗原結合部位(antigen binding site)」中斷的「架構(framework)」區所組成。該等抗原結合部位係使用各種用語定義：(i)互補決定區(CDR)（三個在VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3)，且三個在VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3)）係基於序列變異性（Wu and Kabat J Exp Med 132:211-50, 1970；Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991)。(ii)「高度變異區(Hypervariable region)」、「HVR」、或「HV」，三個在VH（H1, H2, H3）且三個在VL（L1, L2, L3），其係指如Chothia及Lesk所定義般在結構上係高度變異之抗體可變域中的區域(Chothia and Lesk Mol Biol 196:901-17, 1987)。其他用語包括「IMGT-CDR」（Lefranc等人，Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003）及「特異性決定殘基用途(Specificity Determining Residue Usage, SDRU)」(Almagro Mol Recognit 17:132-43, 2004)。國際免疫遺傳學(International ImMunoGeneTics, IMGT)資料庫(http://www_mgt_org)提供了標準化編號及抗原結合部位的定義。CDR、HV及IMGT描繪之間的對應性係描述於Lefranc等人，Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003。
「架構(framwork)」或「架構序列(framwork sequence)」為可變區中被定義為抗原結合部位以外的其餘序列。因為抗原結合部位可用如上所述之各種用語來定義，架構之確切胺基酸序列取決於如何定義抗原結合部位。
在本發明之一實施例中，單離抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區及重鏈可變區，該輕鏈可變區具有胺基酸序列分別為SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20及SEQ ID NO: 21之LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該重鏈可變區具有胺基酸序列分別為SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17及SEQ ID NO: 18之HCDR1、HCDR2及HCDR3。
在另一實施例中，單離抗體進一步包含衍生自人類IgG4 Fc區之Fc區。人類IgG4 Fc區相較於其他IgG亞型具有減少之結合FcγR及補體因子的能力。較佳地，Fc區含有具有消除效應功能之取代的人類IgG4 Fc區。因此，單離抗體進一步包含具有經修飾的人類IgG4 Fc區的Fc區，該經修飾的人類IgG4 Fc區含有一或多個下列取代：以脯胺酸取代殘基233處之麩胺酸、以丙胺酸或纈胺酸取代殘基234處之苯丙胺酸、及以丙胺酸或麩胺酸取代殘基235處之白胺酸（EU編號，Kabat, E. A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, Md., NIH Publication no. 91-3242）。藉由以Ala取代殘基297處（EU編號）之Asn移除IgG4 Fc區中之N-連結的醣化部位係另一種確保消除殘基效應活性之方法。
較佳地，本發明之抗體以藉由雙硫鍵及各種非共價交互作用連接在一起的二聚體形式存在。因此，可用於本發明之抗體之Fc部可為含有取代諸如絲胺酸取代位置228（EU編號）之脯胺酸，以穩定重鏈二聚體形成且防止半-IgG4 Fc鏈形成的取代的人類IgG4 Fc區。
在另一實施例中，重鏈中之C端Lys殘基係經移除，如同在重組生產單株抗體中常見的情況。
「人類抗體(human antibody)」係指具有重鏈及輕鏈可變區的抗體，其中架構及抗原結合部位兩者皆衍生自人源序列。若該抗體含有恆定區，則該恆定區亦衍生自人源序列。
如果該抗體的可變區係得自使用人類生殖系免疫球蛋白或重排(rearranged)免疫球蛋白基因的系統，則人類抗體包含「衍生自(derived from)」人源序列的重或輕鏈可變區。該等系統包括經展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫(gene library)、及基因轉殖非人類動物（諸如帶有人類免疫球蛋白基因位點的小鼠），如本文中所述。「人類抗體」在與人類生殖系或重排免疫球蛋白序列比較時可能含有胺基酸差異，此係由於例如天然發生之體細胞突變或在架構或抗原結合部位中刻意引入取代所致。一般而言，「人類抗體」係在胺基酸序列上與由人類生殖系或重排免疫球蛋白基因所編碼的胺基酸序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。在一些情況下，「人類抗體」可能含有自人類架構序列分析衍生出的共有架構序列，例如Knappik等人所述(J Mol Biol 296:57-86, 2000)，或合併至經展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫的合成HCDR3，例如Shi等人(J Mol Biol 397:385-96, 2010)及國際專利公開號WO2009/085462中所述。抗原結合部位衍生自非人類物種的抗體不包括在「人類抗體」的定義中。
根據本發明實施例之單離抗體可係合成的。抗體若衍生自人類免疫球蛋白序列，則可使用諸如合併有合成CDR及/或合成架構之噬菌體展示(phage display)的系統來產生，或者可在體外經受誘變以改良抗體性質，從而得到在體內人類抗體生殖系貯庫(repertoire)內不會天然存在的抗體。
本文中所使用之用語「重組抗體(recombinant antibody)」包括所有藉由重組手段製備、表現、創建或單離之抗體，諸如自經過人類免疫球蛋白基因之基因轉殖或染色體轉殖的動物（如小鼠）或由其製備的融合瘤單離之抗體，自經轉形(transform)以表現抗體之宿主細胞單離之抗體，自重組的組合抗體庫單離之抗體，及藉由任何涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的其他手段製備、表現、創建、或單離之抗體，或在體外使用Fab臂交換所產生的抗體。
本文中使用之用語「單株抗體(monoclonal antibody)」係指由單一分子組成之抗體分子的製劑。單株抗體組成物對特定表位展示出單一結合特異性及親和力，或者在雙特異性單株抗體的情況下，對兩個不同的表位有雙結合特異性。本發明之單株抗體可藉由融合瘤方法、嗜菌體展示技術、單淋巴細胞基因選殖技術、或藉由重組DNA方法製備。例如，單株抗體可藉由融合瘤生產，該融合瘤包括獲自基因轉殖非人類動物（諸如基因轉殖小鼠或大鼠）的B細胞，該B細胞具有包含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因的基因體。
在某些實施例中，用語「mAb」係指單株抗體。在一實施例中，mAb具有包含SEQ ID NO: 12的重鏈可變區(VH)序列及包含SEQ ID NO:14的輕鏈可變區(VL)序列。在某些實施例中，mAb係具有包含SEQ ID NO: 13之重鏈(HC)序列及包含SEQ ID NO: 15之輕鏈(LC)序列的全人類單株抗體。在某些實施例中，SEQ ID NO:13的位置446之離胺酸殘基係可選地漏失。
本文中所使用之用語「嵌合抗體(chimeric antibody)」係指其中免疫球蛋白分子之胺基酸序列係衍生自二或更多個物種之抗體。輕鏈及重鏈二者之可變區通常對應具有所欲特異性、親和性及能力之衍生自一個哺乳動物物種（例如小鼠、大鼠、兔等）的抗體可變區，然而恆定區對應衍生自另一個哺乳動物物種（例如人類）的抗體序列以避免在該物種引發免疫反應。
本文中所使用之用語「多特異性抗體(multispecific antibody)」係指包含複數個免疫球蛋白可變域序列的抗體，其中複數個中的第一免疫球蛋白可變域序列具有對第一表位的結合特異性或包含缺乏任何已知結合特異性的生殖系序列，且複數個中的第二免疫球蛋白可變域序列具有對第二表位的結合特異性或包含缺乏任何已知結合特異性的生殖系序列，且其中第一及/或第二免疫球蛋白可變域可選地包括接合醫藥活性部份（例如，治療肽）。在一實施例中，第一及第二表位係在相同抗原例如相同蛋白質（或多聚體蛋白質的次單元）上。在一實施例中，第一及第二表位重疊或實質上重疊。在一實施例中，第一及第二表位不重疊或實質上不重疊。在一實施例中，第一及第二表位係在不同抗原例如不同蛋白質（或多聚體蛋白質的不同次單元）上。在一實施例中，第一及第二免疫球蛋白可變域包括相同的接合醫藥活性部份。在一實施例中，第一及第二免疫球蛋白可變域包括不同的接合醫藥活性部份。在一實施例中，只有第一免疫球蛋白可變域包括接合醫藥活性部份。在一實施例中，只有第二免疫球蛋白可變域包括接合醫藥活性部份。在一實施例中，多特異性抗體包含第三、第四、或第五免疫球蛋白可變域。在一實施例中，多特異性抗體係雙特異性抗體分子、三特異性抗體、或四特異性抗體分子。
本文中所使用之用語「雙特異性抗體(bispecifc antibody)」係指結合不多於二個表位或二個抗原且/或包含二個接合醫藥活性部份（例如，相同或不同醫藥活性部份）的多特異性抗體。雙特異性抗體之特徵在於第一免疫球蛋白可變域序列具有對第一表位的結合特異性或包含缺乏任何已知結合特異性的生殖系序列，且第二免疫球蛋白可變域序列具有對第二表位的結合特異性或包含缺乏任何已知結合特異性的生殖系序列，且其中第一及/或第二免疫球蛋白可變域可選地包括接合醫藥活性部份。在一實施例中，第一及第二表位係在相同抗原例如相同蛋白質（或多聚體蛋白質的次單元）上。在一實施例中，第一及第二表位重疊或實質上重疊。在一實施例中，第一及第二表位係在不同抗原例如不同蛋白質（或多聚體蛋白質的不同次單元）上。在一實施例中，第一及第二免疫球蛋白可變域包括相同的接合醫藥活性部份。在一實施例中，第一及第二免疫球蛋白可變域包括不同的接合醫藥活性部份。在一實施例中，只有第一免疫球蛋白可變域包括接合醫藥活性部份。在一實施例中，只有第二免疫球蛋白可變域包括接合醫藥活性部份。在一實施例中，雙特異性抗體包含第一重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列及第二重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列，該第一重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列具有對第一表位的結合特異性或包含缺乏任何已知結合特異性的生殖系序列，該第二重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列具有對第二表位的結合特異性或包含缺乏任何已知結合特異性的生殖系序列，且其中第一及/或重鏈可變域可選地包括接合醫藥活性部份。在一實施例中，第一及第二重鏈可變域包括相同的接合醫藥活性部份。在一實施例中，第一及第二重鏈可變域包括不同的接合醫藥活性部份。在一實施例中，只有第一重鏈可變域包括接合醫藥活性部份。在一實施例中，只有第二重鏈可變域包括接合醫藥活性部份。
本文中所用之「全長抗體(full length antibody)」係指具有兩個全長抗體重鏈及兩個全長抗體輕鏈之抗體。全長抗體重鏈(HC)係由重鏈可變區(VH)及恆定域（CH1、CH2、及CH3）所組成。全長抗體輕鏈(LC)係由輕鏈可變區(VL)及恆定域(CL)所組成。全長抗體可在任一或兩個重鏈中缺乏C端離胺酸(K)。
用語「Fab臂(Fab-arm)」或「半分子(half molecule)」係指一個重鏈-輕鏈對。
全長雙特異性抗體可例如使用兩個單特異性雙價抗體之間的Fab臂交換（或半分子交換）來產生，其藉由於各半分子中之重鏈CH3界面引入取代，以利於兩個具有不同特異性之抗體半分子的異二聚體在活體外無細胞環境中或者使用共表現形成。該Fab臂交換反應係雙硫鍵異構化反應及CH3域之解離-締合的結果。親本單特異性抗體的絞鏈區(hinge region)中的重鏈雙硫鍵被還原。其中一個親本單特異性抗體所生成的游離半胱胺酸與第二親本單特異性抗體分子之半胱胺酸殘基形成重鏈間雙硫鍵，同時該等親本抗體之CH3域藉由解離-締合而釋出及重新形成。該等Fab臂之CH3域可經工程改造以利於異二聚化而非同二聚化。所生成之產物係具有兩個Fab臂或半分子之雙特異性抗體，這兩個Fab臂或半分子可各自結合不同表位。
本文中關於抗體所用之「同二聚化(homodimerization)」係指具有相同CH3胺基酸序列之兩個重鏈的交互作用。本文中關於抗體所用之「同二聚體(homodimer)」係指具有兩個有相同CH3胺基酸序列之重鏈的抗體。
本文中關於抗體所用之「異二聚化(heterodimerization)」係指具有不同CH3胺基酸序列之兩個重鏈的交互作用。本文中關於抗體所用之「異二聚體(heterodimer)」係指具有兩個有不同CH3胺基酸序列之重鏈的抗體。
「鈕扣結構」策略（見例如PCT國際專利申請案公開號WO 2006/028936）可用於產生全長雙特異性抗體。簡言之，在人類IgG中形成CH3域界面之選定胺基酸可在影響CH3域交互作用的位置處突變，以促進異二聚體形成。將具有小側鏈之胺基酸（孔）引入特異性結合第一抗原之抗體的重鏈中，並將具有大側鏈之胺基酸（鈕）引入特異性結合第二抗原之抗體的重鏈中。在共表現這兩個抗體之後，具有「孔」之重鏈與具有「鈕」之重鏈優先交互作用而導致異二聚體形成。形成鈕和孔之例示性CH3取代對係（表現為第一重鏈之第一CH3域中的經修飾位置/第二重鏈之第二CH3域中的經修飾位置）：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S及T366W/T366S_L368A_Y407V。
可使用其他策略，諸如使用靜電交互作用促進重鏈異二聚化，其取代一個CH3表面之帶正電荷殘基及第二CH3表面之帶負電荷殘基，如在美國專利公開號US2010/0015133；美國專利公開號US2009/0182127；美國專利公開號US2010/028637或美國專利公開號US2011/0123532中所述。在其他策略中，異二聚化可藉由下列取代來促進（表現為第一重鏈之第一CH3域中的經修飾位置/第二重鏈之第二CH3域中的經修飾位置）：L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如在美國專利公開號US2012/0149876或美國專利公開號US2013/0195849中所述。
除了上述方法之外，雙特異性抗體可在無細胞環境中體外產生，此係藉由在兩個單特異性同二聚體抗體之CH3區中引入非對稱突變，且在還原條件中（以讓雙硫鍵異構化）自兩個親本單特異性同二聚體抗體形成雙特異性異二聚體抗體，其係根據描述於以下文獻中之方法：國際專利公開號WO2011/131746。在該等方法中，第一單特異性雙價抗體及第二單特異性雙價抗體係經工程改造以在CH3域具有某些促進異二聚體穩定性之取代；該等抗體係在足以讓絞鏈區中之半胱胺酸進行雙硫鍵異構化的還原條件下一起培養；從而藉由Fab臂交換來產生該雙特異性抗體。培養條件可最佳地被回復為非還原性(non-reducing)。可使用之例示性還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、二硫赤蘚醇(dithioerythritol, DTE)、麩胱甘肽、參(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸、及β-巰基乙醇，還原劑較佳係選自由下列所組成之群組：2-巰基乙胺、二硫蘇糖醇、及參(2-羧乙基)膦。舉例而言，可使用在至少20℃之溫度且有至少25 mM之2-MEA存在下或於至少0.5 mM之二硫蘇糖醇存在且在5至8之pH下（例如在7.0之pH下或在7.4之pH下）培養至少90 min。
整個說明書中抗體恆定區中的胺基酸殘基編號係根據如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)中所述的EU索引(EU index)實施，除非另有明確說明。 接合物
在另一大致態樣中，本發明關於一種接合物，其包含以位點特異性方式共價接合至醫藥活性部份（諸如合成的治療肽（例如，環狀PYY肽或調酸素變體肽））的本發明之抗體，使得抗體偶合肽相較於單獨肽具有延長/增加的半衰期。接合物可用於預防、治療、或改善本文中揭示之疾病或病症。本發明亦關於醫藥組成物、其製備方法及使用其之方法。
在某些實施例中，本發明之抗體經修飾以包含至少一個能夠接合至醫藥活性部份以延長/增加該醫藥活性部份之半衰期的半胱胺酸殘基取代。在某些實施例中，至少一個半胱胺酸殘基取代包含在抗體的互補決定區中。在某些實施例中，至少一個半胱胺酸殘基取代位在重鏈互補決定區(HCDR)中。在某些實施例中，至少一個半胱胺酸殘基取代位在HCDR3中，其中HCDR3包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列。在某些實施例中，包含HCDR3（包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列）之抗體具有至少一個能夠接合至醫藥活性部份之額外半胱胺酸取代。
在某些實施例中，醫藥活性部份可包含連接子。連接子可經化學修飾以允許抗體與醫藥活性部份之接合。連接子可例如包括但不限於肽連接子、烴連接子、聚乙二醇(PEG)連接子、聚丙二醇(PPG)連接子、多醣連接子、聚酯連接子、由PEG及埋置雜環組成之混合連接子、及烴鏈。PEG連接子可例如包含2至24個PEG單元。
在某些實施例中，本發明之單株抗體接合至一、二、三、四、五、或六個受到關注之醫藥活性部份（例如，（多個）治療肽）。在較佳實施例中，非靶向單株抗體接合至二個受到關注之醫藥活性部份。在其中單株抗體接合至至少二個受到關注之醫藥活性部份之某些實施例中，受到關注之醫藥活性部份可為相同醫藥活性部份或可為不同醫藥活性部份。
接合本發明之抗體與本發明之醫藥活性部份之方法係所屬技術領域中已知。簡言之，本發明之抗體可經還原劑（例如，TCEP（參(2-羧基乙基)膦）還原、經純化（例如，藉由蛋白質A吸附或凝膠過濾）、並與醫藥活性部份接合（例如，藉由在允許接合之條件下提供冷凍乾燥肽至經還原抗體）。在接合反應後，接合物可藉由離子交換層析法或疏水性交互作用層析法(HIC)與蛋白質A吸附之最終純化步驟純化。在某些實施例中，本發明之抗體可在還原之前利用HIC方法純化。有關接合方法更詳細的說明，請見例如實例3和實例7及Dennler等人，Antibodies 4:197-224 (2015)。
本文中關於接合物所用之「同二聚化(homodimerization)」係指兩個相同醫藥活性部份與抗體的交互作用。本文中關於接合物所用之「同二聚體(homodimer)」係指偶合至兩個相同醫藥活性部份的抗體。
本文中關於接合物所用之「異二聚化(heterodimerization)」係指兩個不同醫藥活性部份與抗體的交互作用。本文中關於接合物所用之「異二聚體(heterodimer)」係指偶合至兩個不同醫藥活性部份的抗體。 環狀 PYY 肽
PYY 3-36係由遠端腸道L細胞分泌之內源性激素，其係Y2受體促效劑，具有抑制攝食之作用。鑒於其在控制食慾及攝食上之作用以及其在哺乳動物胃腸道中的抗分泌及促吸收效應，PYY 3-36可能有效治療肥胖及相關病況以及一些胃腸病症。然而，PYY 3-36本身作為治療劑的治療效用受限於其快速代謝及短循環半衰期。因此，本發明之抗體可用作為PYY 3-36之載劑，較佳的是經修飾之PYY 3-36，其延長PYY 3-36肽之半衰期並減少肽於體內之代謝。
在本發明之某些實施例中，經修飾的PYY 3-36肽係環狀PYY肽。用語「環狀(cyclic) PYY肽(peptide)」、「環狀PYY 3-36類似物(analog)」及「環狀PYY 3-36肽類似物(peptide analog)」可交換使用。可用於接合物之環狀PYY肽實例係描述於美國臨時專利申請案號62/413,613（申請日2016年10月27日）及美國專利申請案號______標題「Cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulators of neuropeptide receptors」（申請日與本申請案同一天，代理人案號為PRD3411），二申請案之內容全文特此以引用方式併入本文中。
包含本發明之抗體及環狀PYY肽的接合物實例係描述於美國臨時專利申請案號62/413,586（申請日2016年10月27日）及美國專利申請案號______標題「Antibody coupled cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulators of neuropeptide Y receptors」（申請日與本申請案同一天，代理人案號為PRD3436），二申請案之內容全文特此以引用方式併入本文中。例如，在環狀PYY肽中，環之N端胺基酸殘基係藉由其α-胺基官能基連結至鍵聯基，其進而連接至NTSC-PYY肽位置31處之胺基酸的側鏈殘基。離胺酸殘基可併入hPYY 3-36序列之不同位置，以提供方便的官能性柄(functional handle)以供進一步衍生。離胺酸殘基可經修飾以供直接或間接偶合至單株抗體。在間接偶合至單株抗體時，離胺酸殘基可經修飾以包含允許環狀PYY肽偶合至單株抗體之連接子。所屬技術領域中具有通常知識者將認可相關同源物亦可如此被有效採用且經設想於本文中。 調酸素肽
調酸素(OXM)係由腸中之腸內分泌L細胞所分泌的37個胺基酸肽。透過其對GLP-1受體(GLP1R)及升糖素受體(GCGR)之促效劑活性，OXM增強β細胞功能，減少攝食並增強能量消耗。透過這些互補機制，OXM調節之重量減輕相對於目前銷售之GLP1R促效劑可為優異的。OXM亦可減少血漿膽固醇及三酸甘油酯。OXM於人類中之半衰期非常短，大約為數分鐘（Schjoldager等人，Eur. J. Clin. Invest. 18(5):499-503 (1988)）。因此，本發明之一實施例關於一種接合物，其包含共價連結至調酸素的本發明之抗體，以提供調酸素之雙重促效劑性質及足以達成每週一次劑量的延長半衰期。
藉由穩定化OXM肽對抗蛋白質水解易感性及藉由減少血漿廓清，實現延長肽半衰期。例如，由DPP4之蛋白質水解係藉由將位置2之絲胺酸用胺基異丁酸(Aib)取代而減輕。肽之螺旋形貌(topology)係藉由將分叉鹽橋引入Q20R至S16E及Q24E而穩定化，且藉由將甲硫胺酸27用白胺酸取代而減輕潛在氧化傾向。肽之循環壽命係藉由單株抗體(mAb)之共價附接而增加。此類抗體藥物接合物可顯現出延長的血漿半衰期，此係憑藉其大小（可減少腎小球濾過），及藉由經由新生兒Fc受體回收。將短的低聚乙二醇間隔物插置於mAb與肽之間，以確保肽未受阻地接近GCGR及GLP1R。
根據本發明之實施例，本發明之調酸素接合物含有四個特徵。(A)雙重促效作用：調酸素接合物具有對GLP-1受體及升糖素受體之雙重促效作用。(B)受體平衡：調酸素接合物對GLP1R或GCGR不具有過度的效力偏向，因為對GLP1R之過度偏向可能會導致其中GLP-1調節之胃腸不良事件由於升高暴露量而在GCGR標靶銜接(target engagement)前發生的接合物，且對GCGR之過度偏向可能會減輕升糖功效。(C)生物分布：調酸素接合物對於GLP-1受體效力具有中度偏向（相對於單獨調酸素），目的在於以類似暴露量達成周邊GCGR及中樞能量攝入調節之GLP1R的標靶銜接。(D)每週一次劑量：調酸素接合物係由於能夠每週一次投予至有需要之個體而具競爭力。 其他治療肽
本文亦提供一種包含其他肽之接合物，該肽能夠被接合至本文所述之單株抗體平台。肽可例如選自由下列所組成之群組：類升糖素肽1 (GLP1)、毒蜥外泌肽(exendin)（艾塞那肽(exenatide)）、澱粉素（普蘭林肽(pramlintide)）、α-黑色素細胞刺激素(MSH)、古柯鹼及安非他命調控之轉錄物(CART)、神經肽Y受體Y1 (NPY1)拮抗劑、神經肽Y受體Y5 (NPY5)拮抗劑、神經調壓素(neurotensin) S、神經肽B、神經肽W、飢餓肽、鈴蟾肽樣受體3 (bombesin-like receptor 3, BRS3)、甘丙胺素、膽囊收縮素(CCK)、食慾素、黑色素濃縮激素(MCH)、催產素、及壓克肽(stresscopin)。
類升糖素肽-1 (GLP-1)係30個胺基酸長的肽激素，其係衍生自升糖素原(proglucagon)基因之組織特異性轉譯後加工。GLP-1係在食物攝取時由腸的腸內分泌L細胞及某些神經元產生並分泌。起始產物GLP-1 (1-37)係易於醯胺化及蛋白酶切割，其產出兩種截短且等效生物活性形式GLP-1 (7-36)醯胺及GLP-1 (7-37)。內源性GLP-1係透過多種途徑快速降解，主要藉由二肽基肽酶-4（DPP-4或DPP-IV），但亦藉由中性內肽酶24.11 (NEP 24.11)及透過腎臟清除，其導致大約2分鐘的半衰期。基於GLP-1治療已與重量減輕及較低低血糖風險相關聯，其在第II型糖尿病的治療中系重要的。
毒蜥外泌肽（艾塞那肽）係屬於腸促胰島素擬似物群之GLP-1促效劑，其已被核准用於治療第II型糖尿病(T2DM)。艾塞那肽係毒蜥外泌肽-4（39個胺基酸肽激素）之合成版本，其係具有葡萄糖調控作用之胰島素促泌素。毒蜥外泌肽-4與哺乳動物GLP-1共享廣泛的同源性及功能，但因為其對由DPP-4 (DPP-IV)之降解具抗性而具有治療優勢，此允許較長的藥理半衰期。毒蜥外泌肽-4之生物特性造成考慮將其用作為T2DM之治療劑。
澱粉素（胰島類澱粉多肽(IAPP)）係37個胺基酸肽激素，其係與胰島素由胰臟β細胞共分泌。澱粉素藉由減緩胃排空及促進飽食感而在血糖調控中扮演一角色。澱粉素(IAPP)係加工自89個胺基酸肽。前胰島類澱粉多肽(proIAPP)係在胰臟β細胞中自89個胺基酸肽在將22個胺基酸信號肽切割後，產生為67個胺基酸肽。咸信，proIAPP之不良加工可能會造成導致第II型糖尿病的病況，因為缺乏澱粉素(IAPP)之產生可能會造成缺乏血糖控制。普蘭林肽係澱粉素仿劑，且係至少與人類澱粉素一樣有效。其係37個胺基酸多肽，且由於用脯胺酸在位置25（丙胺酸）、位置28（絲胺酸）、及位置29（絲胺酸）處之胺基酸置換而在胺基酸序列上與人類澱粉素不同。脯胺酸係在大鼠澱粉素中所見之天然發生的變異。由於此等取代，普蘭林肽係可溶、非黏著性、且非聚集性，因而克服一些天然人類澱粉素之物理化學不利條件（Janes等人，Diabetes 45(Suppl 2):235A (1996)；Young等人，Drug Dev. Res. 37:231-48 (1996b)）。
α-黑色素細胞刺激素(α-MSH)係內源性肽激素，且係黑皮質素(melanocortin)家族之神經肽。α-MSH在刺激黑色素生成方面係黑色素細胞刺激素(MSH)中最重要的，黑色素生成係哺乳動物中負責頭髮及皮膚之色素形成的過程。α-MSH在餵食行為、能量恆定、性活動、及對抗缺血和再灌注損傷之保護作用中亦扮演一角色。
古柯鹼及安非他命調控之轉錄物(CART)係由人類CARTPT基因所編碼之神經肽蛋白。CART肽、特別是CART (55-102)在調控能量恆定上似乎具有重要功能，因為CART肽與數個下視丘食慾回路互動。CART表現係藉由涉及食慾調控之周邊肽激素調控，其包括瘦素、膽囊收縮素、及飢餓肽。CART及膽囊收縮素在食慾調控上具有協同效應。咸信，CART在類焦慮行為中扮演一角色，由乙醇戒斷誘導；調節精神刺激劑之動作性、制約性場地偏好及古柯鹼自我施用效應；抑制攝食；且涉及恐懼及驚嚇行為。CART於下視丘中之活性減退係與嗜食症及重量增加相關聯，且CART被認為在調節天然獎勵過程(reward process)之類鴉片中腦多巴胺回路中扮演一角色。
神經肽Y (NPY)在身體內具有許多角色，包括例如控制餵食行為、皮質神經活動、心臟活動、及情緒調控。亦已將NPY牽涉到數種人類疾病，包括肥胖、酒精中毒、及憂鬱症。再者，使用抗NPY抗體、對抗NPY之反義去氧寡核苷酸、及NPY受體拮抗劑來阻斷NPY之中樞作用，導致減少能量匱乏(energy-deprived)動物的攝食。具體而言，已顯示神經肽Y受體Y5 (NPY5)及神經肽Y受體Y1 (NPY1)會刺激不同餵食階段( Br J Pharmacol. 2003 Aug; 139(8):1433-40)。因此，NPY5及NPY1拮抗劑在治療肥胖及其他相關代謝疾病上可能為有效的。
神經調壓素係13個胺基酸神經肽，其牽涉到黃體成長激素及催乳激素釋放之調控，且與多巴胺系統具有顯著交互作用。神經調壓素分布在整個中樞神經系統，其中最高水準係在下視丘、杏仁核、及伏隔核。神經調壓素可誘導各種效應，包括止痛、失溫，增加運動活性，且涉及多巴胺途徑之調控。
神經肽B (NPB)係短的生物活性肽，其前驅物係由NPB基因編碼。NPB可經由兩個G蛋白偶聯受體（稱為神經肽B/W受體1及2（NPBWR1及NPBWR2））作用。咸信，神經肽B係與調控餵食、神經內分泌系統、記憶、學習、及傳入痛覺途徑相關聯。
神經肽W (NPW)存在兩種形式，由23個(NPW23)或30個(NPW30)胺基酸所組成。此等神經肽結合至兩個G蛋白偶聯受體且經由兩個G蛋白偶聯受體作用，該兩個G蛋白偶聯受體係NPBWR1（亦稱為GPR7）及NPBWR2（亦稱為GPR8）。已顯示NPW會抑制攝食及體重，且會增加熱產生及體溫，此暗示NPW作用為內源性異化傳訊分子。
飢餓肽（亦稱為飢餓激素(ienomorelin, INN)）係一種肽激素，其由胃腸道中的飢餓肽能細胞(ghrelinergic cell)產生，其在中樞神經系統中作用為神經肽。飢餓肽在調控食慾、調控能源之分布及使用率、調控多巴胺神經元中之獎勵感受能力(reward perception)中扮演一角色。飢餓肽係由GHRL基因編碼，且被認為係自前飢餓肽原(preproghrelin)切割而產生，前飢餓肽原經切割以產生飢餓肽原(proghrelin)，飢餓肽原經切割以產生28個胺基酸的飢餓肽。不同於其他內源性肽，飢餓肽能夠跨過血腦屏障，其給予外源投予之飢餓肽獨特的臨床潛力。
鈴蟾肽樣受體3 (BRS3)係一種G蛋白偶聯受體，其僅與已知天然存在的鈴蟾肽相關肽以低親和力交互作用，且因為其不具有高親和力配體，故BRS3被分類為孤兒受體。
甘丙胺素係由GAL基因所編碼之神經肽。甘丙胺素在人類以及其他動物之腦、脊髓、及腸中大量表現。尚未完全將甘丙胺素之功能分類；然而，甘丙胺素主要涉及調節及抑制神經元中之動作電位。已將甘丙胺素牽涉到許多生物多樣功能，包括但不限於痛覺、清醒和睡眠調控、認知、餵食、情緒調控、及血壓調控。甘丙胺素常與經典的神經傳導物共定位，諸如乙醯膽鹼、血清素、及去甲腎上腺素，且亦與神經調節物質共定位，諸如神經肽Y、物質P、及血管活性腸肽。
膽囊收縮素(CCK)係胃腸道系統之肽激素，其負責刺激脂肪及蛋白質之消化。CCK係由在小腸中之腸內分泌細胞合成及分泌，且其存在造成消化酶及膽汁自胰臟及膽囊釋放。CCK在消化、飽食感、及焦慮中扮演一角色。
食慾素（亦稱為下視丘分泌素(hypocretin)）係一種神經肽，其調控醒覺、清醒、及食慾。有兩種類型的食慾素：食慾素A及食慾素B（下視丘分泌素-1及下視丘分泌素-2），其長度分別為33個及28個胺基酸。主要相信食慾素系統涉及刺激攝食，且除了上述角色之外，食慾素調控能量消耗且調節內臟功能。
黑色素濃縮激素(MCH)係環狀19個胺基酸且促進食慾的下視丘肽，咸信其涉及調控餵食行為、情緒、睡眠-清醒週期、及能量平衡。表現MCH之神經元係位於下視丘外側及未定帶(zona increta)，且儘管其受限的分布，MCH神經元廣泛投射於整個腦部。
催產素係一種肽激素及神經肽，其正常由下視丘之室旁核產生，且由腦垂體後葉釋放。咸信催產素在社會鍵、有性生殖、及分娩期間和之後中扮演一角色。催產素受體係一種需要鎂及膽固醇之G蛋白偶聯受體，且屬於G蛋白偶聯受體之視紫質類型（I類）組。
人類壓克肽(h-SCP)係40個胺基酸肽，其係促腎上腺皮質素釋放激素(CRH)肽家族之成員。CRH肽家族之生物作用係由兩個7跨膜G蛋白偶聯受體CRH受體類型1 (CRHR1)及CRH受體類型2 (CRHR2)引發。雖然這些受體含有高序列同源性，但CRH肽家族之不同成員在其相對結合親和力、受體活化程度、及對這兩種受體的選擇性上表現出顯著的差異。不像許多CRH家族成員，h-SCP對CRHR2表現出較高的選擇性，且作用為有助於衰減生理壓力之起始及維持過程的中介物。除了此於生理壓力中之顯而易見的角色之外，已報導h-SCP會引發一些其他生理作用。其對內分泌、中樞神經、心血管、肺、胃腸道、腎、骨骼肌、及發炎系統施加作用。CRHR2活性亦已被牽涉到骨骼肌萎縮疾病（諸如肌少症）、運動活性及攝食，參與心臟保護作用，並表現出支氣管鬆弛(bronchorelaxant)及抗發炎活性。再者，壓克肽模擬物已被鑑定為可用於治療由促腎上腺皮質素釋放激素受體2活性調節之醫療適應症，請見例如美國專利申請案第20100130424號。 半衰期延長部分 (half-life extending moiety)
除了本發明之抗體或其抗原結合片段之外，本發明之接合物可例如經由共價交互作用併入一或多個其他用於延長醫藥活性部份之半衰期的部份。例示性的其他半衰期延長部份包括但不限於白蛋白、白蛋白變體、白蛋白結合蛋白質及/或結構域、轉鐵蛋白及其片段及類似物。可併入本發明之接合物的額外半衰期延長部份包括例如聚乙二醇(PEG)分子（諸如PEG5000或PEG20,000）、不同鏈長之脂肪酸及脂肪酸酯（例如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸脂、花生酸酯(arachidate)、二十二酸酯、油酸酯、花生四烯酸酯(arachidonate)、辛二酸(octanedioic acid)、十四烷二酸(tetradecanedioic acid)、十八烷二酸(octadecanedioic acid)、二十二烷二酸(docosanedioic acid)及類似物）、聚離胺酸、辛烷、或具有所欲性質之碳水化合物（葡聚糖、纖維素、寡醣或多醣）。這些部份可以直接與蛋白質支架編碼序列融合，且可藉由標準選殖及表現技術產生。替代地，可使用熟知的化學偶合方法，將該等部份附接至重組及化學產生的本發明之接合物。
聚乙二醇基(pegyl)部份可例如藉由使用熟知方法，將半胱胺酸殘基併入分子C端且將聚乙二醇基附接至半胱胺酸而添加至本發明之肽分子。
併入額外部份的本發明之肽分子可藉由幾種習知的檢定法就功能性進行比較。例如，受到關注之治療肽單獨或在根據本發明之接合物中的生物或藥物動力學活性可使用已知體外或體內檢定分析及比較。 醫藥組成物
在另一大致態樣中，本發明關於一種醫藥組成物，其包含本發明之接合物及醫藥上可接受之載劑。如本文中所使用之用語「醫藥組成物(pharmaceutical composition)」意指包含本發明之接合物與醫藥上可接受之載劑之產品。本發明之接合物及包含其之組成物亦可用於製造用於在本文中提及之治療應用的藥劑。
本文中所使用之用語「載劑(carrier)」係指任何賦形劑、稀釋劑、填充料、鹽、緩衝劑、穩定劑、助溶劑、油、脂質、含脂質囊泡、微球、脂質體包封、或其他所屬技術領域中已知用於醫藥配方之材料。將理解載劑、賦形劑或稀釋劑之特徵將取決於特定應用之投予途徑而定。本文中所使用之用語「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」係指不干擾根據本發明之組成物的有效性或根據本發明之組成物的生物活性之非毒性材料。根據鑒於本揭露之具體實施例，任何適合用於抗體醫藥組成物之醫藥上可接受之載劑皆可用於本發明。
用於本發明中之醫藥上可接受之酸性/陰離子性鹽包括但不限於：乙酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、依地酸鈣(calcium edetate)、樟腦磺酸鹽(camsylate)、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、二氫氯化物、依地酸鹽(edetate)、乙二磺酸鹽(edisylate)、丙酸酯十二烷硫酸鹽(estolate)、乙磺酸鹽(esylate)、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽(glyceptate)、葡萄糖酸鹽(gluconate)、麩胺酸鹽(glutamate)、羥乙醯胺基苯砷酸鹽(glycollylarsanilate)、己基間苯二酚鹽(hexylresorcinate)、海巴明(hydrabamine)、氫溴酸鹽、氫氯酸鹽、羥基萘甲酸鹽(hydroxynaphthoate)、碘化物、2-羥乙磺酸鹽(isethionate)、乳酸鹽、乳糖酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、苯乙醇酸鹽、甲磺酸鹽、甲基溴化物、甲基硝酸鹽、甲基硫酸鹽、黏酸鹽(mucate)、萘磺酸鹽(napsylate)、硝酸鹽、巴摩酸鹽(pamoate)、泛酸鹽、磷酸鹽/二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、次乙酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、單寧酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽(teoclate)、甲苯磺酸鹽以及三碘化物。有機或無機酸亦包括但不限於：氫碘酸、過氯酸、硫酸、磷酸、丙酸、乙醇酸、甲磺酸、羥乙基磺酸、草酸、2-萘磺酸、對甲苯磺酸、環己磺醯胺酸、醣酸或三氟乙酸。
醫藥上可接受之鹼性/陽離子性鹽包括且不限於鋁、2-胺基-2-羥甲基-丙烷-1,3-二醇（亦稱為參(羥基甲基)胺基甲烷、托美滇(tromethane)或「TRIS」）、氨、苯札辛(benzathine)、三級丁胺、鈣、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、環己胺、二乙醇胺、乙二胺、鋰、L-離胺酸、鎂、美古明(meglumine)、N-甲基-D-還原葡糖胺、哌啶、鉀、普魯卡因(procaine)、奎寧、鈉、三乙醇胺、或鋅。
在本發明之一些實施例中，提供包含自約0.001 mg/ml至約100 mg/ml、自約0.01 mg/ml至約50 mg/ml、或自約0.1 mg/ml至約25 mg/ml之量的本發明之接合物的醫藥配方。醫藥配方可具有自約3.0至約10，例如自約3至約7、或自約5至約9之pH。配方可進一步包含至少一種選自由緩衝劑系統、（多種）保存劑、（多種）張力劑、（多種）螫合劑、（多種）穩定劑及（多種）界面活性劑所組成之群組之成分。
醫藥活性成分與醫藥上可接受之載劑的調製係所屬技術領域中已知，例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy（例如第21版(2005)、及任何之後的版本）。額外成分之非限制性實例包括：緩衝劑、稀釋劑、溶劑、張力調節劑、保存劑、穩定劑、及螯合劑。一或多種醫藥上可接受之載劑可用於調製本發明之醫藥組成物。
在本發明之一實施例中，醫藥組成物係液體配方。液體配方之較佳實例係水溶液配方，即包含水之配方。液體配方可包含溶液、懸浮液、乳液、微乳液、凝膠、及類似者。水溶液配方一般包含至少50% w/w水、或至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、或至少95% w/w的水。
在一實施例中，醫藥組成物可調製成可例如經由注射器或輸注泵注射之注射用劑。例如，注射可經皮下、肌內、腹膜內、或靜脈內傳遞。
在另一實施例中，醫藥組成物係固體配方，例如冷凍乾燥或噴霧乾燥組成物，其可照原樣使用，或在使用前由醫師或患者添加溶劑、及/或稀釋劑至其中。固體劑型可包括錠劑（諸如壓製錠及/或包衣錠）及膠囊（例如硬質或軟質明膠膠囊）。醫藥組成物亦可呈例如囊劑(sachet)、糖衣錠、粉劑、顆粒劑、口含錠(lozenge)、或重構用粉劑之形式。
劑型可為可包含水溶性或分散性載劑之立即釋放劑型，或者可為可包含水不溶性聚合物以調節劑型在胃腸道中之溶解速率的延緩釋放、持續釋放、或修飾釋放劑型。
在其他實施例中，醫藥組成物可經鼻內、頰內、或舌下傳遞。
水溶液配方中之pH可介於pH 3與pH 10之間。在本發明之一實施例中，配方pH係自約7.0至約9.5。在本發明之另一實施例中，配方pH係自約3.0至約7.0。
在本發明之另一實施例中，醫藥組成物包含緩衝劑。緩衝劑之非限制性實例包括：精胺酸、天冬胺酸、二羥乙基甘胺酸(bicine)、檸檬酸、磷酸氫二鈉、反丁烯二酸、甘胺酸、甘胺醯甘胺酸、組胺酸、離胺酸、順丁烯二酸、蘋果酸、乙酸鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉、琥珀酸鹽、酒石酸、三羥甲基甘胺酸(tricine)、及參(羥甲基)-胺基甲烷、及其混合物。緩衝劑可個別地或總體地以自約0.01 mg/ml至約50 mg/ml，例如自約0.1 mg/ml至約20 mg/ml之濃度存在。包含這些特定緩衝劑中之每一者的醫藥組成物構成本發明之替代實施例。
在本發明之另一實施例中，醫藥組成物包含保存劑。緩衝劑之非限制性實例包括：氯化本索寧、苯甲酸、苄醇、溴硝丙二醇(bronopol)、丁基4-羥基苯甲酸酯、氯丁醇、氯甲苯酚、氯己定、氯菲那辛、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、乙基4-羥基苯甲酸酯、咪唑啶基脲(imidurea)、甲基4-羥基苯甲酸酯、苯酚、2-苯氧乙醇、2-苯乙醇、丙基4-羥基苯甲酸酯、去氫乙酸鈉、硫柳汞(thiomerosal)、及其混合物。保存劑可個別地或總體地以自約0.01 mg/ml至約50 mg/ml，例如自約0.1 mg/ml至約20 mg/ml之濃度存在。包含這些特定保存劑中之每一者的醫藥組成物構成本發明之替代實施例。
在本發明之另一實施例中，醫藥組成物包含等張劑。實施例之非限制性實例包括鹽（諸如氯化鈉）、胺基酸（諸如甘胺酸、組胺酸、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、色胺酸、及蘇胺酸）、醛醣醇（諸如甘油、1,2-丙二醇（丙二醇(propyleneglycol)）、1,3-丙二醇、及1,3-丁二醇）、聚乙二醇（例如PEG400）、及其混合物。等張劑之另一實例包括糖。糖之非限制性實例可為單醣、雙醣、或多醣、或水溶性葡聚糖包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、普魯蘭(pullulan)、糊精、環糊精、α及β-HPCD、可溶性澱粉、羥乙基澱粉、及鈉羧甲基纖維素。等張劑的另一實例係糖醇，其中用語「糖醇(sugar alcohol)」定義為具有至少一個-OH基團之C(4-8)烴。糖醇之非限制性實例包括甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、甜醇(dulcitol)、木糖醇、及阿拉伯糖醇。包含此段列出之各種等張劑的醫藥組成物構成本發明之替代實施例。等張劑可個別地或總體地以自約0.01 mg/ml至約50 mg/ml，例如自約0.1 mg/ml至約20 mg/ml之濃度存在。包含這些特定等張劑中之每一者的醫藥組成物構成本發明之替代實施例。
在本發明之另一實施例中，醫藥組成物包含螫合劑。螯合劑之非限制性實例包括檸檬酸、天冬胺酸、伸乙二胺四乙酸(EDTA)之鹽、及其混合物。螯合劑可個別地或總體地以自約0.01 mg/ml至約50 mg/ml，例如自約0.1 mg/ml至約20 mg/ml之濃度存在。包含這些特定螯合劑中之每一者的醫藥組成物構成本發明之替代實施例。
在本發明之另一實施例中，醫藥組成物包含穩定劑。穩定劑之非限制性實例包括一或多種聚集抑制劑、一或多種氧化抑制劑、一或多種界面活性劑、及/或一或多種蛋白酶抑制劑。
在本發明之另一實施例中，醫藥組成物包含穩定劑，其中該穩定劑係羧基-/羥基纖維素及其衍生物（諸如HPC、HPC-SL、HPC-L及HPMC）、環糊精、2-甲基硫代乙醇、聚乙二醇（諸如PEG 3350）、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯啶酮、鹽（諸如氯化鈉）、含硫物質諸如單硫代甘油）、或巰乙酸。穩定劑可個別地或總體地以自約0.01 mg/ml至約50 mg/ml，例如自約0.1 mg/ml至約20 mg/ml之濃度存在。包含這些特定穩定劑中之每一者的醫藥組成物構成本發明之替代實施例。
在本發明之進一步實施例中，醫藥組成物包含一或多種界面活性劑，較佳地一種界面活性劑、至少一種介面活性劑、或二種不同界面活性劑。用語「界面活性劑(surfactant)」係指任何包含水溶性（親水性）部分及脂溶性（親脂性）部分的分子或離子。界面活性劑可例如選自由陰離子界面活性劑、陽離子界面活性劑、非離子界面活性劑、及/或兩性離子界面活性劑所組成之群組。界面活性劑可個別地或總體地以自約0.1 mg/ml至約20 mg/ml之濃度存在。包含這些特定界面活性劑中之每一者的醫藥組成物構成本發明之替代實施例。
在本發明之一進一步實施例中，醫藥組成物包含一或多種蛋白酶抑制劑，諸如例如EDTA（乙二胺四乙酸）、及/或苯甲脒鹽酸(HCl)。蛋白酶抑制劑可個別地或總體地以自約0.1 mg/ml至約20 mg/ml之濃度存在。包含這些特定蛋白酶抑制劑中之每一者的醫藥組成物構成本發明之替代實施例。
本發明之醫藥組成物可包含足以降低組成物儲存期間多肽聚集體形成之量的胺基酸鹼。用語「胺基酸鹼(amino acid base)」係指一或多種胺基酸（諸如甲硫胺酸、組胺酸、咪唑、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、色胺酸、蘇胺酸）、或其類似物。任何胺基酸可以其游離鹼形式或其鹽形式存在。胺基酸鹼之任何立體異構物（即L、D、或其混合物）皆可存在。胺基酸鹼可個別地或與其他胺基酸鹼組合以自約0.01 mg/ml至約50 mg/ml，例如自約0.1 mg/ml至約20 mg/ml之濃度存在。包含這些特定胺基酸鹼中之每一者的醫藥組成物構成本發明之替代實施例。
對於所屬領域中具有通常知識者亦為顯而易見的是，本發明之接合物或其醫藥組成物的治療有效劑量將隨所欲效果而變化。因此，所欲投予之最佳劑量可由所屬領域中具有通常知識者輕易決定，並且將隨所使用之特定接合物、投予模式、製劑強度、及病況進程而變化。此外，與接受治療之特定個體相關的因素，包括個體年齡、重量、飲食及投予時間，將導致需要將劑量調整至適當的治療水準。
對所有適應症而言，本發明之接合物較佳地以每天約1 µg至約5 mg單一或多次劑量（例如，單一劑量可分成2、3、4、5、6、7、8、9、或10個子劑量）、或以每劑量約0.01 µg/kg至約500 µg/kg、更佳的是約0.05 µg/kg至約250 µg/kg、最佳的是低於約50 µg/kg之劑量經周邊投予。這些範圍中之劑量當然將隨各促效劑之效力而異，且由所屬領域中具有通常知識者輕易判定。因此，上述劑量為平均情況的示例。當然，個別情況下需要較高或較低劑量範圍皆為可行的，該等範圍也包含於本發明之範疇中。
在某些實施例中，本發明之接合物以約1 µg至約5 mg之劑量、或以約0.01 µg/kg至約500 µg/kg之劑量、更佳的是以約0.05 µg/kg至約250 µg/kg之劑量、最佳的是以低於約50 µg/kg之劑量，加上一劑第二治療劑（例如利拉魯肽）以約1 µg至約5 mg之劑量、或以約0.01 µg/kg至約500 µg/kg之劑量、更佳的是以約0.05 µg/kg至約250 µg/kg之劑量、最佳的是以低於約50 µg/kg之劑量投予。
本發明之接合物之醫藥上可接受之鹽包括習用的無毒性鹽或四級銨鹽，其係形成自無機或有機的酸或鹼。此等酸加成鹽的例子包括乙酸鹽、己二酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、十二烷基硫酸鹽、氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、甲磺酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、三甲基乙酸鹽(pivalate)、丙酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽以及酒石酸鹽。鹼鹽包括銨鹽、鹼金屬鹽如鈉鹽和鉀鹽、鹼土金屬鹽包括鈣鹽和鎂鹽、有機鹼之鹽如二環己基胺基鹽、以及胺基酸如精胺酸之鹽。此外，鹼性含氮之基團可經例如鹵化烷基之四級化。
本發明之醫藥組成物可藉由任何可達成其預期目的之手段來投予。實例包括透過非經腸(parenteral)、皮下、靜脈、肌肉內、腹膜內、經皮、經頰(buccal)或經眼(ocular)途徑投予。投予可透過經口途徑進行。用於非經腸投予之合適配方包括水溶性形式之活性接合物的水溶液，例如水溶性鹽、酸性溶液、鹼溶液、葡萄糖水溶液、等張碳水化合物溶液以及環糊精包容錯合物。
本發明亦包含一種製造醫藥組成物之方法，其包含混合醫藥上可接受之載劑與任何本發明之接合物。此外，本發明包括藉由混合一或多種醫藥上可接受之載劑與任何本發明之接合物所製成之醫藥組成物。
再者，本發明之接合物可具有一或多種多形體或非晶形式，並且意欲將彼等包括於本發明之範疇中。此外，接合物可與例如水（即水合物）或常見的有機溶劑形成溶劑合物。本文中所使用之用語「溶劑合物(solvate)」意指本發明之接合物與一或多個溶劑分子的物理性締合。此物理性締合包含不同程度的離子性或共價性鍵結，包括氫鍵。在某些情況下可單離該溶劑合物，例如當一或多個溶劑分子係結合於結晶固體之晶格中時。用語「溶劑合物(solvate)」意欲涵括溶液相和可單離之溶劑合物兩者。非限定之合適溶劑合物的實例包括乙醇合物(ethanolate)、甲醇合物(methanolate)及類似者。
本發明意欲將本發明之接合物的多形體及溶劑合物包括在其範疇內。因此，在本發明的治療方法中，用語「投予(administering)」應包含使用本發明之接合物或其多形體或溶劑合物來治療、改善或預防本文中所述之症候群、病症或疾病的手段，該手段儘管未經具體揭露，但明顯將被包括於本發明的範疇中。
在另一實施例中，本發明係關於本發明之接合物用作為藥劑之用途。
本發明的範疇包括本發明之接合物的前藥。一般而言，此等前藥將為接合物的功能性衍生物，其可於體內輕易轉換為所需之接合物。因此，在本發明中的治療方法中，用語「投予(administering)」應包含使用具體揭露之接合物，或者使用可能未具體揭露但在投予至病患後在體內轉換為特定接合物之接合物，來治療所述之各種病症。選擇及製備合適前藥衍生物之習用程序係描述於例如「Design of Prodrugs」，Ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985。
此外，所意欲者為在本發明之範疇中，任何元素（尤其是在涉及本發明之接合物而提及時）應包含該元素的所有同位素及同位素混合物，無論是天然存在或合成產生，無論是具有天然豐度或呈同位素富集形式。例如，提及氫時，其範疇包括 1H、 2H (D)、及 3H (T)。同樣地，提及碳及氧時，其範疇分別包括12C、 13C和 14C及 16O和 18O。該等同位素可具放射性或不具放射性。本發明之放射性標示接合物可包含選自 3H、 11C、 18F、 122I、 123I、 125I、 131I、 75Br、 76Br、 77Br、及 82Br之群組的放射性同位素。較佳地，放射性同位素係選自 3H、 11C及 18F之群組。
本發明的一些接合物可能以阻轉異構物(atropisomer)存在。阻轉異構物係由於相對於單鍵之轉動受阻所產生的立體異構物，其中旋轉的立體應變障壁高到足以讓構型異構物能夠單離出來。應理解的是所有此類構型異構物及其混合物皆涵括於本發明的範疇中。
本發明之接合物具有至少一個立體中心，它們可因此存在為鏡像異構物或非鏡像異構物。應理解的是所有此類異構物以及其混合物皆涵括於本發明的範疇中。
若用於製備根據本發明之接合物的方法產生立體異構物之混合物，則這些異構物可藉由習用技術如製備型層析法來分離。接合物可經製備為外消旋形式，或是個別之鏡像異構物可藉由鏡像特定合成(enantiospecific synthesis)或離析法(resolution)來製備。接合物可藉由例如標準技術來離析為其組分鏡像異構物，諸如藉由與具光學活性酸（諸如(-)-二-對甲苯甲醯基-D-酒石酸及/或(+)-二-對甲苯甲醯基-L-酒石酸）進行鹽形成以形成非鏡像異構物對，接著進行分段結晶(fractional crystallization)與游離鹼再生。接合物亦可藉由形成非鏡像異構酯或醯胺，接著使用層析法分離並移除掌性助劑而離析。替代地，接合物可使用掌性管柱經由高效液相層析(HPLC)或SFC來離析。在一些情況中，接合物之旋轉異構體可能存在，藉由1H NMR可觀察到其導致1H NMR譜中之複雜多重峰及峰整合。
在任何製備本發明接合物的方法中，對於任何相關分子上的敏感或反應性基團加以保護可能為必要及/或所欲的。此可藉由習用保護基來達成，諸如以下文獻所述者：Protective Groups in Organic Chemistry, ed. J.F.W. McOmie, Plenum Press, 1973；及T.W. Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 1991，其各者全文以引用方式併入本文中以符合所有目的。保護基可在便利的後續階段中利用該項技術習知的方法去除。 使用方法
本發明亦提供一種用於預防、治療、延緩發生、或改善有需要之個體之病症、疾病、或病況、或該病症、疾病、或病況之任一或多個症狀的方法，該方法包含向該有需要之個體投予有效量的本發明之接合物或醫藥組成物。
根據具體實施例，該疾病、病症、或病況可係任何可用能夠偶合至本發明之單株抗體平台的肽或化合物治療之疾病、病症、或病況。在某些實施例中，該疾病、病症、或病況係選自由下列所組成之群組：肥胖、第I或II型糖尿病、代謝症候群（即X症候群）、胰島素抗性、葡萄糖耐受不良（例如，葡萄糖不耐）、高血糖症、高胰島素血症、高三酸甘油酯血症、因先天性高胰島素血症(CHI)所致之低血糖症、異常血脂症、動脈粥樣硬化、糖尿病腎病變、及其他心血管風險因子諸如高血壓及與未管理膽固醇及/或脂質水準有關之心血管風險因子、骨質疏鬆症、發炎、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、腎疾病、及/或濕疹。
根據具體實施例，治療有效量係指足以達成一、二、三、四、或更多個下列效應之療法之量：(i)減少或改善待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的嚴重性；(ii)減少待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的期間；(iii)預防待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的進展；(iv)造成待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的消退；(v)預防待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的發展或發生；(vi)預防待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的復發；(vii)減少具有待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的個體的住院期；(viii)減少具有待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的個體的住院期長度；(ix)增加具有待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀的個體的存活；(xi)抑制或減少個體的待治療之疾病、病症、或病況或與其相關之症狀；及/或(xii)增強或改善另一療法的（多種）疾病預防或治療效應。
治療有效量或劑量可根據各種因子變化，諸如待治療之疾病、病症或病況、投予手段、目標部位、個體之生理狀態（包括例如年齡、體重、健康）、個體係人類抑或動物、其他投予藥物、及治療係疾病預防性抑或治療性。治療劑量經最佳地滴定以最佳化安全性及療效。
本文中所使用之用語「治療(treat、treating及treatment)」皆意欲指稱改善或逆轉至少一個與疾病、病症、或病況有關的可測量物理參數，該物理參數未必可在個體中覺察，但可在個體中覺察。用語「治療」亦可指造成疾病、病症、或病況消退、預防疾病、病症、或病況進展、或至少延緩疾病、病症、或病況之進展。在一具體實施例中，「治療」係指減輕一或多個與疾病、病症、或病況相關之症狀、預防一或多個與疾病、病症、或病況相關之症狀的發展或開始、或減少一或多個與疾病、病症、或病況相關之症狀的期間。在一具體實施例中，「治療」係指預防疾病、病症、或病況之復發。在一具體實施例中，「治療」係指增加具有疾病、病症、或病況之個體的存活。在一具體實施例中，「治療」係指排除個體之疾病、病症、或病況。
在一實施例中，本發明提供一種用於預防、治療、延緩發生、或改善有需要之個體之肥胖、或肥胖之任一或多個症狀的方法，該方法包含向該有需要之個體投予有效量的本發明之接合物或醫藥組成物。在一些實施例中，個體之體重減少例如介於約0.01%至約0.1%、介於約0.1%至約0.5%、介於約0.5%至約1%、介於約1%至約5%、介於約2%至約3%、介於約5%至約10%、介於約10%至約15%、介於約15%至約20%、介於約20%至約25%、介於約25%至約30%、介於約30%至約35%、介於約35%至約40%、介於約40%至約45%、或介於約45%至約50%，該減少係相對於個體在投予任何本文中所述之本發明之接合物、醫藥組成物、形式、或藥劑之前的體重，或相較於未接受任何本文中所述之本發明之接合物、組成物、形式、藥劑、或組合之對照個體。
在一些實施例中，體重減少維持例如約1週、約2週、約3週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約1年、約1.5年、約2年、約2.5年、約3年、約3.5年、約4年、約4.5年、約5年、約6年、約7年、約8年、約9年、約10年、約15年、或約20年。
本發明提供一種預防、治療、延緩發生、或改善有需要之個體之症候群、病症、或疾病、或該症候群、病症、或疾病之任一或多個症狀的方法，其中該症候群、病症、或疾病係選自由下列所組成之群組：肥胖、第I型或第II型糖尿病、代謝症候群（即X症候群）、胰島素抗性、葡萄糖耐受不良（例如，葡萄糖不耐）、高血糖症、高胰島素血症、高三酸甘油酯血症、異常血脂症、動脈粥樣硬化、糖尿病腎病變、及其他心血管風險因子諸如高血壓及與未管理膽固醇及/或脂質水準有關之心血管風險因子、骨質疏鬆症、發炎、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、腎疾病、及濕疹，該方法包含向該有需要之個體投予有效量的本發明之接合物或醫藥組成物。
如本文中所使用，代謝症候群係指具有下列任一或多者之個體：高血糖（例如高空腹血糖）、高血壓、異常膽固醇水準（例如低HDL水準）、異常三酸甘油酯水準（例如高三酸甘油酯）、大腰線（即腰圍）、腹部區域脂肪增加、胰島素抗性、葡萄糖不耐、C-反應性蛋白質水準升高（即促發炎狀態）、及血漿纖維蛋白溶酶原活化物抑制劑-1及纖維蛋白原水準增加（即促血栓狀態）。
本發明提供一種減少有需要之個體的攝食之方法，該方法包含向該有需要之個體投予有效量的本發明之接合物或醫藥組成物。在一些實施例中，個體之攝食減少例如介於約0.01%至約0.1%、介於約0.1%至約0.5%、介於約0.5%至約1%、介於約1%至約5%、介於約2%至約3%、介於約5%至約10%、介於約10%至約15%、介於約15%至約20%、介於約20%至約25%、介於約25%至約30%、介於約30%至約35%、介於約35%至約40%、介於約40%至約45%、或介於約45%至約50%，該減少係相對於個體在投予任何本文中所述之本發明之接合物、組成物、形式、藥劑、或組合之前的攝食，或相較於未接受任何本文中所述之本發明之接合物、組成物、形式、藥劑、或組合之對照個體。
在一些實施例中，攝食減少維持例如約1週、約2週、約3週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約1年、約1.5年、約2年、約2.5年、約3年、約3.5年、約4年、約4.5年、約5年、約6年、約7年、約8年、約9年、約10年、約15年、或約20年。
本發明提供一種減少有需要之個體的糖化血色素(A1C)之方法，該方法包含向該有需要之個體投予有效量的本發明之接合物或醫藥組成物。在一些實施例中，個體之A1C減少例如介於約0.001%與約0.01%之間、介於約0.01%與約0.1%之間、介於約0.1%與約0.2%之間、介於約0.2%與約0.3%之間、介於約0.3%與約0.4%之間、介於約0.4%與約0.5%之間、介於約0.5%與約1%之間、介於約1%與約1.5%之間、介於約1.5%與約2%之間、介於約2%與約2.5%之間、介於約2.5%與約3%之間、介於約3%與約4%之間、介於約4%與約5%之間、介於約5%與約6%之間、介於約6%與約7%之間、介於約7%與約8%之間、介於約8%與約9%之間、或介於約9%與約10%之間，該減少係相對於個體在投予任何本文中所述之本發明之接合物、組成物、形式、藥劑、或組合之前的A1C，或相較於未接受任何本文中所述之本發明之接合物、組成物、形式、藥劑、或組合之對照個體。
在其他實施例中，提供用於減少有需要之個體的空腹血糖水準之方法，該方法包含向該有需要之個體投予有效量的本發明之接合物或醫藥組成物。空腹血糖水準可減少至小於約140至約150 mg/dL、小於約140至約130 mg/dL、小於約130至約120 mg/dL、小於約120至約110 mg/dL、小於約110至約100 mg/dL、小於約100至約90 mg/dL、或小於約90至約80 mg/dL，該減少係相對於個體在投予任何本文中所述之本發明之接合物、組成物、形式、藥劑、或組合之前的空腹血糖水準，或相較於未接受任何本文中所述之本發明之接合物、組成物、形式、藥劑、或組合之對照個體。
本發明提供一種調節有需要之個體的Y2受體活性之方法，該方法包含向該有需要之個體投予有效量的本發明之接合物或醫藥組成物。如本文中所使用，「調節(modulating)」係指增加或降低受體活性。
在一些實施例中，有效量的本發明之接合物或其形式、組成物、或藥劑係向有需要之個體一天一次、一天二次、一天三次、一天四次、一天五次、一天六次、一天七次、或一天八次投予。在其他實施例中，有效量的本發明之接合物或其形式、組成物、或藥劑係向有需要之個體每二天一次、每週一次、每週二次、每週三次、每週四次、每週五次、每週六次、每月二次、每月三次、或每月四次投予。
本發明之另一實施例包含一種預防、治療、延緩發生、或改善有需要之個體之疾病、病症、或症候群、或任何該疾病、病症、或症候群之一或多個症狀的方法，該方法包含在組合療法中向該有需要之個體投予有效量的本發明之接合物或醫藥組成物。在某些實施態樣中，組合療法係第二治療劑。在某些實施態樣中，組合療法係外科療法。
本文中所使用之在向個體投予二或更多種療法上下文中之用語「組合(in combination)」係指使用超過一種療法。
如本文中所使用，組合療法係指向有需要之個體投予有效量的本發明之接合物或其形式、組成物、或藥劑的同時，投予一或多種額外治療劑、或一或多種外科療法。在一些實施例中，一或多種額外治療劑或外科療法可與有效量的本發明之接合物在同一天投予，且在其他實施例中，一或多種額外治療劑或外科療法可與有效量的本發明之接合物在同一週或同一月投予。
在某些實施例中，其中該疾病或病症係選自由肥胖、第II型糖尿病、代謝症候群、胰島素抗性、及異常血脂症所組成之群組，該第二治療劑可為抗糖尿劑。在某些實施例中，抗糖尿劑可為類升糖素肽-1 (GLP-1)受體調節劑。
本發明亦設想以組合療法預防、治療、延緩發生、或改善有需要之個體的任何本文所述之疾病、病症、症候群、或症狀，該組合療法包含向該有需要之個體投予有效量的本發明之接合物或醫藥組成物與下列治療劑之任一或多者的組合：二肽基肽酶-4 (DPP-4)抑制劑（例如西他列汀(sitagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、利拉利汀(linagliptin)、阿格列汀(alogliptin)等）；GLP-1受體促效劑（例如，短效型GLP-1受體促效劑諸如艾塞那肽(exenatide)及利西拉來(lixisenatide)；中效型GLP-1受體促效劑諸如利拉魯肽(liraglutide)；長效型GLP-1受體促效劑諸如艾塞那肽緩釋型、阿必魯肽(albiglutide)、度拉魯肽(dulaglutide)）；鈉-葡萄糖共轉運子-2 (SGLT-2)抑制劑（例如卡格列淨(canaglifozin)、達格列淨(dapaglifozin)、安帕列淨(empaglifozin)等）；膽酸扣押劑（例如考來維崙(colesevelam)等）；多巴胺受體促效劑（例如溴麥角環肽(bromocriptine)速效型）；雙胍（例如二甲雙胍(metformin)等）；胰島素；調酸素；磺醯脲（例如氯磺丙脲(chlorpropamide)、格列美脲(glimepiride)、格列甲嗪(glipizide)、優降糖(glyburide)、優降糖(glibenclamide)、格列波脲(glibornuride)、格列派特(glisoxepide)、格列吡脲(glyclopyramide)、甲磺氮卓脲(tolazamide)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、乙醯苯磺醯環己脲(acetohexamide)、磺胺丁脲(carbutamide)等）；及四氫噻唑二酮（例如；吡格列酮(pioglitazone)、羅格列酮(rosiglitazone)、洛貝格列酮(lobeglitazone)、環格列酮(ciglitazone)、達格列酮(darglitazone)、恩格列酮(englitazone)、萘格列酮(netoglitazone)、利格列酮(rivoglitazone)、曲格列酮(troglitazone)等）。在一些實施例中，（多種）額外治療劑之劑量當與本發明之接合物組合給予時減少。在一些實施例中，當與本發明之接合物組合使用時，（多種）額外治療劑可以相較於各者單獨使用時較低之劑量使用。
在某些實施例中，其中疾病或病症係選自由下列所組成之群組：肥胖、第I型或第II型糖尿病、代謝症候群（即X症候群）、胰島素抗性、葡萄糖耐受不良（例如，葡萄糖不耐）、高血糖症、高胰島素血症、高三酸甘油酯血症、因先天性高胰島素血症(CHI)所致之低血糖症、異常血脂症、動脈粥樣硬化、糖尿病腎病變、及其他心血管風險因子諸如高血壓及與未管理膽固醇及/或脂質水準有關之心血管風險因子、骨質疏鬆症、發炎、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、腎疾病、及濕疹，第二治療劑可為利拉魯肽。
本發明設想以組合療法預防、治療、延緩發生、或改善有需要之個體的任何本文所述之疾病、病症、症候群、或症狀，該組合療法包含向該有需要之個體投予有效量的本發明之接合物或醫藥組成物與外科療法的組合。在某些實施例中，外科療法可為減重手術（例如胃繞道手術，諸如Roux-en-Y胃繞道手術；袖狀胃切除術；可調整胃束帶手術；膽胰分流與十二指腸轉位；胃內氣球；胃摺疊術；及其組合）。
在其中一或多種額外治療劑係與有效量的本發明之接合物在同一天投予的實施例中，本發明之接合物可在額外治療劑之前、之後、或同時投予。用語「組合」之使用並不限制向個體投予療法之順序。例如，第一療法（例如本文描述之組成物）可在向個體投予第二療法之前（例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週以前）、之同時或之後（例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週或12週之後）投予。 實施例
本發明亦提供以下非限制性實施例。
實施例1係一種單離抗體或其抗原結合片段，其包含具有完整人類Ig生殖系V基因序列之輕鏈可變區、及除了具有SEQ ID NO:18之胺基酸序列之HCDR3外具有完整人類Ig生殖系V基因序列之重鏈可變區，其中該抗體或其抗原結合片段不特異性結合至任何人類體內抗原。
實施例2係實施例1之單離單株抗體或其抗原結合片段，其中該單離單株抗體或其抗原結合片段包含分別具有SEQ ID NO: 16、17、18、19、20、及21之多肽序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、HCDR3、及輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2、及LCDR3。
實施例3係實施例2之單離單株抗體或其抗原結合片段，其中該單離單株抗體包含具有SEQ ID NO:12之多肽序列的重鏈可變域(VH)、及具有SEQ ID NO:14之多肽序列的輕鏈可變域(VL)。
實施例4係實施例1至3中任一者之單離單株抗體，其進一步包含Fc部分。
實施例5係實施例4之單離單株抗體，其中該Fc部分進一步包含衍生自人類IgG4 Fc區之Fc區。
實施例6係實施例5之單離單株抗體，其中該人類IgG4 Fc區具有消除效應功能之取代。
實施例7係實施例6之單離單株抗體，其中該單株抗體進一步包含經修飾的人類IgG4 Fc區，該經修飾的人類IgG4 Fc區含有至少一個選自由下列所組成之群組的取代：以脯胺酸取代殘基233處之麩胺酸、以丙胺酸或纈胺酸取代殘基234處之苯丙胺酸、以丙胺酸或麩胺酸取代殘基235處之白胺酸、以丙胺酸取代殘基297處之天冬醯胺酸。
實施例8係實施例6或7之單離單株抗體，其中該人類IgG4 Fc區包含絲胺酸取代位置228之脯胺酸。
實施例9係實施例4至8中任一者之單離單株抗體，其包含具有SEQ ID NO:13之多肽序列的重鏈(HC)、及具有SEQ ID NO:15之多肽序列的輕鏈(LC)。
實施例10係一種單離核酸，其編碼實施例1至9中任一者之單株抗體或其抗原結合片段。
實施例11係一種載體，其包含實施例10之單離核酸。
實施例12係一種宿主細胞，其包含實施例11之載體。
實施例13係一種產生單離單株抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含：在多個條件下培養實施例12之宿主細胞，以產生該單株抗體或其抗原結合片段；及自該細胞或培養物回收該抗體或其抗原結合片段。
實施例14係實施例1至9中任一者之單離單株抗體或其抗原結合片段，其進一步包含至少一個接合至其之藥理活性部份。
實施例15係實施例14之單離單株抗體或其抗原結合片段，其中該藥理活性部份係治療肽。
實施例16係實施例15之單離單株抗體或其抗原結合片段，其中該治療肽係在SEQ ID NO:18之半胱胺酸殘基處接合。
實施例17係實施例15或16之單離單株抗體或其抗原結合片段，其中該治療肽係經由連接子接合至該抗體或其抗原結合片段。
實施例18係實施例17之單離單株抗體或其抗原結合片段，其中該連接子包含肽連接子、烴連接子、聚乙二醇(PEG)連接子、聚丙二醇(PPG)連接子、多醣連接子、聚酯連接子、或由PEG及埋置雜環所組成之混合連接子。
實施例19係實施例15至18中任一者之單離單株抗體或其抗原結合片段，其中該治療肽係選自由下列所組成之群組：調酸素、類升糖素肽1 (GLP1)、酪酪肽(PYY)、毒蜥外泌肽（艾塞那肽）、澱粉素（普蘭林肽）、α-黑色素細胞刺激素(MSH)、古柯鹼及安非他命調控之轉錄物(CART)、神經肽Y受體Y1 (NPY1)拮抗劑、神經肽Y受體Y5 (NPY5)拮抗劑、神經調壓素S、神經肽B、神經肽W、飢餓肽、鈴蟾肽樣受體3 (BRS3)、甘丙胺素、膽囊收縮素(CCK)、食慾素、黑色素濃縮激素(MCH)、催產素、及壓克肽。
實施例20係實施例19之單離單株抗體或其抗原結合片段，其中該治療肽係包含SEQ ID NO:24之多肽序列的調酸素。
實施例21係一種接合物，其包含偶合至調酸素治療肽之單株抗體或其抗原結合片段，其中該接合物具有如圖11所示之SEQ ID NO:27的結構，其中mAb代表根據實施例1至9中任一者之單株抗體或其抗原結合片段，且]2代表1或2個調酸素治療肽共價接合至該mAb。
實施例22一種製造實施例15至21中任一者之單離單株抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包含使引入該治療肽之側鏈上的親電子劑與該單株抗體或其抗原結合片段之SEQ ID NO:18的半胱胺酸殘基之巰基反應，藉以在該治療肽與該單株抗體或其抗原結合片段之間建立共價鍵結，該親電子劑較佳係溴乙醯胺或順丁烯二醯亞胺。
實施例23係一種醫藥組成物，其包含實施例14至21中任一者之單離單株抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。
實施例24係一種製造包含實施例14至21中任一者之單離單株抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物之方法，該方法包含將該單株抗體或其抗原結合片段與醫藥上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組成物。
實施例25係一種套組，其包含實施例1至9及14至21中任一者之單株抗體或其抗原結合片段。
實施例26係一種增加治療肽於個體中之半衰期的方法，該方法包含使該治療肽與單株抗體或其抗原結合片段接合，該單株抗體或其抗原結合片段包含分別具有SEQ ID NO: 16、17、18、19、20、及21之多肽序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、HCDR3、及輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2、及LCDR3，其中該治療肽係在SEQ ID NO:18之Cys殘基處接合至該單株抗體或其抗原結合片段。
實施例27係實施例26之方法，其中該治療肽係選自由下列所組成之群組：調酸素、類升糖素肽1 (GLP1)、酪酪肽(PYY)、毒蜥外泌肽（艾塞那肽）、澱粉素（普蘭林肽）、α-黑色素細胞刺激素(MSH)、古柯鹼及安非他命調控之轉錄物(CART)、神經肽Y受體Y1 (NPY1)拮抗劑、神經肽Y受體Y5 (NPY5)拮抗劑、神經調壓素S、神經肽B、神經肽W、飢餓肽、鈴蟾肽樣受體3 (BRS3)、甘丙胺素、膽囊收縮素(CCK)、食慾素、黑色素濃縮激素(MCH)、催產素、及壓克肽。
實施例28係實施例27之方法，其中該治療肽係調酸素。
實施例29係實施例28之方法，其中該調酸素具有SEQ ID NO:24之多肽序列。
實施例30係實施例25至29中任一者之方法，其中該單株抗體包含具有SEQ ID NO:12之多肽序列的重鏈可變域(VH)。
實施例31係請求項25至30中任一者之方法，其中該單株抗體包含具有SEQ ID NO:13之多肽序列的重鏈(HC)。
實施例32係實施例25至31中任一者之方法，其中該單株抗體包含具有SEQ ID NO:14之多肽序列的輕鏈可變域(VL)。
實施例33係實施例25至32中任一者之方法，其中該單株抗體包含具有SEQ ID NO:15之多肽序列的輕鏈(LC)。
實施例34係一種單離單株抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO:18之重鏈互補決定區3，其中該單離單株抗體或其抗原結合片段能夠偶合至治療肽。 實例 實例 1 ：鑑定及生產 mAb MSCB97 選擇 PH9L3 VL 及 PH9H5 VH 作為起始 V 區進行工程改造
選擇指定為PH9L3之抗體輕鏈可變區(VL) (SEQ ID NO:3)（Teplyakov等人，「Structural diversity in a human antibody germline library」，mAbs Aug-Sep 8(6):1045-63 (2016)）及指定為PH9H5之抗體重鏈可變區(VH) (SEQ ID NO:4)（Teplyakov等人，「Structural diversity in a human antibody germline library」，mAbs Aug-Sep 8(6):1045-63 (2016)）作為起始可變區，自此將mAb工程改造以使其能夠用於肽接合。PH9L3完全由人類Ig生殖系V基因序列所構成，因此不含有任何來自體內親和性成熟過程且會導致高親和性、抗原特異性結合的序列突變。PH9H5之CDR3係在該VH中唯一不包含人類生殖系V基因序列的區段。PH9H5之CDR3 (SEQ ID NO:5)係與下列：抗人類CCL2抗體CNTO 888（一種中和CCL2抗體）之CDR3同一，請見例如US 20100074886 A1，CNTO 888相關揭露之全文以引用方式併入本文中。產製含有PH9H5/PH9L3 VH/VL對之Fab。
將PH9L3、PH9H5與彼等之最類似的人類Ig生殖系V區及J區序列對準，以判定與生殖系序列之序列同一性或類似性。將PH9H5與人類Ig生殖系基因IGHV3-23*01 (PubMed ID: M99660) (SEQ ID NO:7)及人類IGHJ1*01 (PubMed ID: J00256) (SEQ ID NO:8)之串連物(SEQ ID NO:6)對準，其中PH9H5胺基酸序列與串連人類IGHV3-23*01-IGHJ1*01序列之間的唯一差異在於VH CDR3，即PH9H5之SEQ ID NO:5。
將PH9L3與人類Ig生殖系基因IGKV3-11*01 (PubMed ID: X01668) (SEQ ID NO:10)及IGKJ1*01 (PubMed ID: J00242) (SEQ ID NO:11)之串連物(SEQ ID NO:9)對準，其中唯一差異於在於V基因/J基因連接處之一個偏差。 設計及產製 PH9H5 及 PH9L3 之 Cys 取代變體
設計、產製在V區之所有三個CDR中的選定CDR殘基處含有單一Cys取代之PH9H5 VH變體，並將其以具有人類IgG1恆定區之完整重鏈選殖至哺乳動物宿主表現載體中。利用PH9H5/PH9L3 Fab結構以幫助選擇在接合時看似更易於接近之CDR殘基以進行取代，且在一些變體中，將額外甘胺酸(Gly)殘基插入經引入Cys殘基的任一側，以潛在地增加Cys在接合時的可接近性。設計及產製PH9L3 VL之類似變體，惟這些變體以具有人類κ恆定區之完整輕鏈選殖至表現載體中。總共產製24個PH9H5單一Cys變體之表現建構體及22個PH9L3單一Cys變體之表現建構體。在PH9H5_VH (SEQ ID NO:4)內及在PH9L3_VL (SEQ ID NO:3)內經選定以用於取代之殘基係概括於圖2。
將產製之表現建構體用於表現Cys變體，各基於PH9H5之HC Cys變體建構體係與野生型PH9L3 LC建構體暫時共轉染，或各基於PH9L3之LC Cys變體建構體係與野生型PH9H5 HC建構體共轉染。初始測試轉染使用HEK衍生性Expi293作為表現宿主且規模為20 ml。基於培養上清液之變體蛋白質定量得知，大部分的HC及LC Cys變體皆表現良好。
五個初始HC Cys變體MSCB33至MSCB37係以750 ml之規模表現於Expi293中，並將變體蛋白質純化。純化變體之純化產率及品質特性相當類似，且足以將這些純化蛋白質用於初始肽接合反應。 評估肽接合至基於 PH9H5 之 HC Cys 變體
MSCB33蛋白質及其他變體蛋白質之分析質量判定，指示半胱胺酸加成物存在於經工程改造以供接合之Cys處（每個mAb二個），且HC C端Lys殘基係經移除（常見於重組生產之mAbs）。為了製備用於接合之變體mAbs，藉由經發展以維持mAb內之天然雙硫鍵的還原過程移除加成物（見實例3）。與人類調酸素(OXM)肽類似物(GCG Aib2, Gly16,24, Arg20, Leu27, Lys30 (PEG 12)-NH 2)之初始測試接合，係使用順丁烯二醯亞胺化學在所有五個HC Cys變體mAb上進行。在mAb變體之間有不同的接合效率，此藉由接合反應產物及各接合反應產物之相對百分比來定性評估。相較於其他含有側翼(flanking) Gly殘基之I102C變體，最高效率（以具有最高百分比的同二聚體產物測量）係在MSCB33觀察到，且在Y103C變體MSCB35或MSCB37則觀察到很少或無接合。
數個在不同CDRs具有工程改造半胱胺酸取代的其他HC及LC Cys變體（PH9H5_VH (SEQID NO:129)中之T28C、S30C、及S54C取代、及PHpL3_VL (SEQ ID NO:128)中之S30C及S92C取代）係以大規模表現於Expi293中。自這些純化蛋白質還原移除Cys加成物極具挑戰，因此未進一步研究這些變體。由於在大部分Cys變體觀察到的挑戰，以及在I102C PH9H5變體mAb（MSCB33）觀察到的初始良好接合效率，製程開發及進一步的改造工程著重於此特定變體。 MSCB33 之 Fc 工程改造
將MSCB33再工程改造為含有靜默、人類IgG4_PAA Fc以減少體內Fc功能。人類IgG4_PAA在人類IgG4異型nG4m(a)（基於如IMGT定義之IGHG4*01對偶基因）上具有突變S228P/F234A/L235A。產製具有MSCB33之VH與IgG4_PAA Fc融合之表現建構體，並與用於MSCB33表現之相同LC表現建構體一起使用，以生產MSCB33之IgG4_PAA變體，將其指定為MSCB97。MSCB97 VH、HC、VL、及LC之胺基酸序列分別提供於SEQ ID NO:12、13、14、及15。
MSCB97之測試表現係以20 ml規模在Expi293細胞中暫時進行，此mAb變體表現良好。自大規模Expi293表現運行純化MSCB97。MSCB97之純化產率係264.53 mg/L，且品質經判定為85%單體物種。後續大規模表現運行及純化具有類似或較佳的產率及品質，且指示此mAb可一致地生產。 評估肽接合至 MSCB97 及接合反應規模
IgG1與IgG4同型之間的LC-HC雙硫鍵連接性不同，因此使用TCEP還原及如上述與OXM-順丁烯二醯亞胺測試肽之接合，來測試並證實還原及順丁烯二醯亞胺接合可自IgG1 mAb MSCB33轉移至IgG4_PAA mAb MSCB97。已知順丁烯二醯亞胺接合所導致的鍵結係潛在可逆的，因此採用產生較為穩定鍵結的溴乙醯胺接合化學，並以10 mg之規模基於起始MSCB97成功實施。
OXM類似物GCG Aib2, Glu16,24, Arg20, Leu27, Lys30-ε-(PEG 12)-NH 2之MSCB97接合物（化合物2-「化合物2」與「接合物2」在本文中可交換使用）（MSCB97接合至H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRARDFVEWLLNTK-(COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) 12NHCOCH 2Br)-NH 2(SEQ ID NO: 24)以形成化合物2（圖11；SEQ ID NO:27））係透過溴乙醯胺化學產生，並經檢定以判定體外GLP-1R及GCGR效力。效力相對於參考肽及參考未結構化肽接合物為合理，且與用相同肽與MSCB33 (IgG1)所產生之接合物的效力類似。這證明MSCB97 (IgG4_PAA)與MSCB33 (IgG1)（此係同型）之間的單一差異對於含有相同肽之接合物的效力沒有影響。此外，這些資料顯示所欲的體外效力可保留於用溴乙醯胺化學（生產體內穩定鍵結）所產製的肽-mAb接合物中。亦將其他OXM類似物接合至MSCB97，並分析這些接合物的體外效力。這些接合物具有與化合物2類似的GLP-1R及GCGR效力，此強調MSCB97接合各種肽同時保留肽效力的能力。 評估肽 -MSCB97 接合物與人類 CCL2 之結合
雖然MSCB97缺乏特異性抗原結合因而被選定來進行工程改造，但此mAb最可能結合的抗原（若有的話）係基於VH CDR3來源而為人類CCL2。使用具有OXM肽類似物（化合物2）或PYY肽類似物（化合物1-「化合物1」與「接合物1」在本文中可交換使用）之兩個肽-MSCB97接合物來評估MSCB97是否展現出任何特異性CCL2結合。
潛在CCL2結合直接藉由表面電漿共振(SPR)測量，其中使用抗Fc捕捉方法將接合物固定在表面。使用市售抗CCL2小鼠mAb作為陽性對照，二個非特異性人類抗體CNTO 9412及HH3B33作為陰性對照。將所有對照物類似地固定在表面，使重組人類CCL2以至多400nM之濃度流過經固定的接合物及對照物。基於預先建立之檢定標準，指示特異性抗原結合之CCL2累積係見於陽性對照，但不見於陰性對照或任一肽-MSCB97接合物（化合物1或化合物2）。此證實MSCB97（為肽-mAb接合物之相關治療形式）缺乏人類CCL2結合。
SPR結合方法：使用ProteOn XPR36系統(BioRad)執行利用表面電漿共振(SPR)的結合測量。生物感測器表面係藉由使用胺偶合化學之製造商說明書，將抗人類IgG Fc (Jackson cat#109-005-098)及抗小鼠IgG Fc (Jackson cat#315-005-046)之混合物偶合至GLC晶片(BioRad, Cat#176-5011)之經修飾藻酸鹽聚合物層表面而製備。大約5700 RU（反應單位）的mAb經固定化。結合實驗係在25℃下於運行緩衝液（DPBS；0.01%P20；100 µg/ml BSA）中執行。為執行結合動力學實驗，捕捉樣本（化合物２、化合物１、及對照mAb-陽性和陰性），隨後以５個濃度（以4倍連續稀釋液）注射重組人類CCL2 (Thermo，目錄號為RMCP120)。以50 µL/min監測締合相3分鐘，隨後進行5分鐘的緩衝液流（解離相）。晶片表面係用兩個18秒的100 mM H 3PO 4(Sigma, Cat#7961)以100 µL/min的脈衝而再生。
將所收集之數據使用ProteOn Manager軟體處理。首先，用間點將數據針對背景校正。接著，數據之雙參考減法係藉由使用緩衝液注射用於分析物注射來執行。預先建立之用於判定化合物2、化合物1、及CCL2陽性對照之特異性可偵測結合的檢定標準需要與劑量成比例的反應，其中最高濃度為＞10 RU信號，且陰性對照反應信號＜10 RU。基於檢定標準，將各樣本之結果記述為是或否對人類CCL2呈劑量反應結合。 實例 2 ：表現與純化 mAb
全人類單株抗體(mAb)可重組表現於哺乳動物表現宿主中，且使用該領域已知之標準方法自細胞培養上清液純化。例如，可使用標準分子生物學方法，將編碼mAb之輕鏈(LC)及重鏈(HC)的cDNA序列（各包括使能夠分泌的適當信號肽）選殖至不同的哺乳動物表現載體或單一表現載體中。使用的表現載體可為任何市售表現載體（諸如pEE12.4、pcDNA™3.1(+)或pIRESpuro3）、或任何具有類似功能之客製表現載體。在該等載體中，mAb之重鏈及輕鏈的轉錄各自受到任何已知有效啟動子諸如hCMV-MIE啟動子的驅動。轉染級質體DNA係使用標準方法諸如QIAGEN質體Midi套組製備，以用於不同的LC及HC表現建構體或表現LC及HC二者之單一建構體。
純化質體DNA係經製備以與基於脂質之轉染試劑諸如Freestyle™ Max轉染試劑依照廠商說明用於轉染，接著經轉染至標準哺乳動物表現宿主細胞系諸如CHO-S或HEK 293-F。若mAb LC及HC係由不同的表現建構體編碼，則同時轉染二個建構體。在轉染之前及之後，哺乳動物細胞依照標準細胞培養方法培養以用於維持或用於mAb表現，其中應維持的細胞密度範圍、應使用的培養介質、及遵照的其他細胞培養條件係由所利用的特定哺乳動物宿主細胞系而定。這些參數一般由供應細胞系之供應商或在科學文獻中記載。例如，CHO-S細胞懸浮維持於CHO Freestyle™介質中，以125 RPM在設定37℃及8% CO 2的增濕培養箱中震盪，且當細胞濃度介於每ml 1.5與2.0 × 10 6個細胞之間時繼代。
將來自表現mAb之暫時轉染哺乳動物細胞之細胞培養上清液在轉染後數天收集、藉由離心澄清並過濾。CHO-S細胞的表現期間一般係四天但可經調整，且不同的哺乳動物宿主細胞系可不同。大規模轉染（＞10公升）係使用濃縮器諸如Centramate濃縮10倍。將mAb使用蛋白質A親和性管柱（諸如HiTrap MabSelect Sure）自澄清上清液純化，利用標準方法將mAb結合至蛋白質A樹脂、使用低pH緩衝液洗滌樹脂並洗提蛋白質。將蛋白質流份藉由洗提至含有pH 7緩衝液之試管中立即中和，並將尖峰流份彙集、過濾且用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、pH 7.2在4℃下透析整夜。在透析後將mAb再次過濾（0.2 µ過濾器），並以在280 nm之吸光度判定蛋白質濃度。藉由SDS-PAGE（聚丙醯胺凝膠電泳）及分析性尺寸篩除HPLC評估經純化之mAb蛋白質品質，且使用鱟變形細胞溶解物(LAL)檢定測量內毒素水準。將純化mAb儲存在4℃下。 自暫時轉染 CHO 細胞表現及純化 MSCB97
使MSCB97表現於ExpiCHO-S™細胞(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA; Cat # A29127)，此係遵循製造商建議，以MSCB97表現建構體之純化質體DNA進行細胞暫時轉染。簡言之，將ExpiCHO-S™細胞懸浮維持於設定37℃、8% CO 2及125 RPM之震盪培養箱中之ExpiCHO™表現介質(ThermoFisher Scientific, Cat # A29100)中。將細胞繼代以使得在轉染當天可達成稀釋至每ml 6.0 × 10 6個細胞，維持98%或更佳之細胞存活性。使用ExpiFectamine™ CHO轉染套組(ThermoFisher Scientific Cat # A29131)進行暫時轉染。每ml待轉染的稀釋細胞使用一微克的質體DNA，且質體DNA係經稀釋於OptiPRO™ SFM錯和介質中。ExpiFectamine™ CHO試劑係以1:3比例（v/v，DNA：試劑）使用，且亦稀釋於OptiPRO™中。將稀釋的DNA及轉染試劑合併一分鐘，允許DNA/脂質錯合物形成，接著添加至細胞。在整夜培養後，將ExpiCHO™ feed及ExpiFectamine™ CHO增強子添加至細胞。使細胞在32℃下震盪培養五天，之後收集培養上清液。
來自暫時轉染ExpiCHO-S™細胞之培養上清液係藉由離心澄清(30 min, 6000 rpm)隨後過濾（0.2 µ PES膜，Corning）來收集。大規模轉染（5至20公升）首先係使用Pall Centramate切向流過濾系統濃縮10倍。將pH7.2之10× Dulbecco’s磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)添加至上清液至1×最終濃度，之後裝載至平衡(DPBS, pH 7.2) HiTrap MabSelect Sure蛋白質A管柱(GE Healthcare; Little Chalfont, United Kingdom)上，相對濃度為每ml樹脂約20 mg蛋白質，使用AKTA FPLC層析系統。在裝載後，將管柱用10倍管柱體積之DPBS, pH7.2洗滌。將蛋白質用10倍管柱體積之0.1 M Na-乙酸酯pH 3.5洗提。將蛋白質流份藉由以20%洗提流份體積洗提至含有pH 7之2.0 M參(羥甲基)胺基甲烷(Tris)的試管中立即中和。將尖峰流份彙集，並將pH用額外的Tris調整至約5.5（若有需要）。將純化蛋白質過濾(0.2 µ)，並在BioTek SynergyHT™分光光度計上以在280 nm之吸光度判定濃度。利用SDS-PAGE與分析性尺寸篩除HPLC（Dionex HPLC系統），評估經純化之蛋白質品質。利用濁度LAL分析法(Pyrotell®-T, Associates of Cape Cod)，測量內毒素水準。 實例 3 ：接合 mAb 與環狀 PYY 肽 方法 A ： TCEP 部分還原 mAb
將mAb於tris-乙酸酯緩衝液（20 mL，1 mM於EDTA中）中之10 mg/mL溶液用3當量的TCEP處理。將溶液調整至pH 6且在室溫(rt)下1 hr後，高壓液相層析串聯質譜儀(LCMS)顯示位置C102之雙硫鍵加成物已完全還原。將還原mAb藉由蛋白質A吸附及洗提（4 CV的100 mM乙酸）純化，以提供180 mg之還原mAb。 接合還原 mAb 與環狀 PYY 肽
將冷凍乾燥肽（5 eq相較於mAb）添加至上述還原mAb。添加EDTA至最終濃度1 mM，並將pH調整至7。將濃度調整至8 mg/mL並讓反應在輕微攪動下在室溫下繼續進行16 h。添加TCEP（0.5 eq相較於mAb），並讓反應在rt下在輕微攪動下進一步繼續進行4 hr，之後高分子量(MW)物種減少至小於3%。
將反應混合物調整至pH 5.5並藉由離子交換層析法在CaptoSP樹脂上純化，在20 CV內使用梯度100% A (100 mM TRIS-乙酸酯，pH 5.5)至100% B (100 mM TRIS-乙酸酯，pH 5.5; 0.5 M NaCl)。將含所欲接合物之流份彙集，並回收140 mg之接合物，共洗提出小量未反應肽。最終純化藉由蛋白質A吸附及洗提（4 CV的100 mM乙酸）進行。將產物之pH調整至6以給出120 mg之接合物（60%產率），其純度＞90%且含有＜3%高MW物種。 方法 B 疏水性交互作用層析法 (HIC) 純化 mAb
將mAb於tris-乙酸酯緩衝液中之20 mg/mL溶液裝載在疏水性交互作用管柱（TOSOH TSKgel苯基7.5×21 cm）上並用線性梯度（0至70% B/A，溶劑A：5% iPrOH，1M (NH 4) 2SO 4，100 mM磷酸鹽緩衝液，pH 6.0；溶劑B：20% iPrOH，100 mM磷酸鹽緩衝液）洗提。將mAb單體尖峰彙集、濃縮（5至10 mg/mL）並用3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)緩衝液(100 mM, pH 5.5)透析。 用 TCEP 部分還原及接合還原 mAb 與肽類似物
向純化mAb (27 mL, 9.28 mg/mL)添加4 eq. TCEP，隨後添加EDTA (1 mM)。在室溫下2 hr後，LCMS顯示位置C102之雙硫鍵加成物已完全還原。將還原mAb用Zebra去鹽離心管柱（7×10 mL，7K MWCO，用MOPS 100 mM pH 5.5預先平衡）處理，以移除經釋放之半胱胺酸/GSH。在還原mAb之合併流份(28 mL)中，添加環狀PYY肽於Milli Q等級水中之溶液（6.5 eq相較於mAb，15至20 mg/mL），隨後添加EDTA (1 mM)。將反應pH藉由逐滴添加1N NaOH調整至7.2至7.4。讓反應在室溫下在輕微攪動下繼續進行18 h。使反應在另外添加0.5當量TCEP後再繼續12 h以還原在反應進程期間形成的mAb-mAb二聚體，且允許轉化成所欲之mAb同二聚體。將反應之pH藉由添加2 M乙酸降低至pH 5.5，並將粗製接合物藉由疏水性交互作用層析法純化，且用線性梯度（0至100% B/A，溶劑A：5% iPrOH，1M (NH4)2SO4，100 mM磷酸鹽緩衝液，pH 6.0；溶劑B：20% iPrOH，100 mM磷酸鹽緩衝液）洗提。最終純化藉由蛋白質A吸附(PBS)及洗提(NaOAc, pH 3.5)。將產物的pH調整至6並用PBS透析以給出最終樣本(56%)。
替代地，mAb用GSH及/或Cys還原。在藉由切向流過濾(TFF)移除還原劑後，將過量的肽在可選地0.2至0.5當量之TCEP存在下添加至還原mAb。 實施例 4 ：體外研究
評估化合物1 (SEQ ID NO:2)（單株抗體偶合至環狀PYY肽，圖3）在表現人類、大鼠、小鼠、及恆河猴Y2受體、及人類Y1、Y4、及Y5受體之純株細胞(clonal cell)（HEK或CHO）中體外活化NPY受體的能力。將PYY3-36、NPY及PP包括於這些檢定中作為研究對照組。 細胞系
發展表現NPY受體之穩定轉染純株細胞系以用於cAMP檢定。簡言之，將HEK293細胞系用攜帶人類Y2受體（寄存編號：NM_000910.2）、人類Y5受體（寄存編號：NM_006174.2）、小鼠Y2受體（寄存編號：NM_008731）及恆河猴Y2受體（寄存編號：NM_001032832）編碼序列之表現質體轉染，其中使用Lipofectamine 2000套組(Invitrogen)根據其方案進行。在轉染四十八小時後，將細胞以選擇介質（DMEM高葡萄糖含10%胎牛血清(FBS)、50 I.U.青黴素、50 µg/ml鏈黴素、2 mM L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉及600 µg/ml G418）再接種。使細胞保持在選擇介質中2週，接著使用有限稀釋方法挑選單一細胞株。轉染細胞後續藉由培養於補充有10%胎牛血清、1% L-麩醯胺酸、1%丙酮酸鈉、1%青黴素/鏈黴素及600 µg/ml G418之DMEM-高葡萄糖介質(Cellgro)中維持。
此外，自DiscoverX Corporation獲得表現人類Y1受體（目錄編號：93-0397C2）及人類Y4受體（目錄編號：95-0087C2）之CHO-K1細胞系。DiscoverX細胞培養於補充有10% FBS且在G418選擇(800 µg /mL)下之F12介質(Gibco)中。大鼠Y2受體表現於自Promega Corporation獲得之Glo-Sensor CHO-K1細胞系。這些細胞經pGloSensor™-23F cAMP質體轉染以進行基於發光之cAMP檢定，但結果使用Perkin-Elmer LANCE cAMP檢定進行測試及驗證。大鼠Y2細胞生長於補充有10% FBS及800 µg/ml G418之F12介質(Gibco)中。
將所有細胞系存庫於小瓶（4 × 10 6個細胞/小瓶）並儲存於液體氮中直到使用。在檢定前一天，將小瓶解凍並添加15 mls適當介質。將細胞以450 × g離心5 min、吸出上清液、並將細胞以0.2 × 10 6個細胞/ml之密度再懸浮於不含G418之介質中。將細胞分配（25 µl/孔）至Biocoat膠原蛋白塗佈白色384孔盤中，最終密度為5000個細胞/孔。將細胞盤在37℃增濕組織培養培養箱中、在5% CO 2/90% O 2氣氛下培養整夜。 實驗方案
各種受體檢定之cAMP檢定皆相同。所有實驗使用LANCE cAMP套組(Perkin Elmer Corporation; Waltham, MA)定量細胞內cAMP水準。在檢定當天，將細胞介質自細胞傾析並將6 µl之肽（2×濃度）添加至孔。將肽以刺激緩衝液配製成11點劑量反應（始於100 nM或10 µM經連續1:3稀釋）。刺激緩衝液由5 mM HEPES（4-(2-羥乙基)-1-哌
Figure 02_image001
乙磺酸）、500 µM IBMX及0.1%牛血清白蛋白(BSA)於HBSS（Hank’s平衡鹽溶液）中組成。接下來將6 µl之含有弗斯可林(forskolin)（2×，5 µM最終濃度）及LANCE cAMP抗體(1:100)的刺激緩衝液添加至細胞。在rt下培養25分鐘後，將12 µl之檢定偵測混合物添加至各孔。LANCE cAMP套組所提供之偵測混合物係藉由將生物素-cAMP (1:750)及銪-W8044 (1:2250)稀釋於偵測緩衝液中製備。將盤在rt下培養2小時，接著以TR-FRET檢定在Envision盤讀取儀上讀取（激發320 nm，發射615 nm及665 nm）。通道1螢光（在615 nm之相對螢光單位）及通道2螢光（在665 nm之相對螢光單位）連同彼等之比例輸出至Excel檔案。 數據分析
來自Envision盤讀取儀之數據係以相對螢光單位(RFU)表示，計算方式為(615 nm/ 665 nm) × 10,000。所有樣本皆以三重複測量。數據分析使用Eudean Shaw設計的Crucible內部資料分析軟體。各孔內未知的cAMP濃度係自包括在各盤內之已知cAMP濃度之參考標準品內插計算。參數諸如EC 50、Log(EC 50)、HillSlope (nH)、頂部(top)、及底部(bottom)係藉由將cAMP濃度值對對數化合物濃度作圖衍生而來，以4-P模型擬合，使用在R環境內之非線性加權最小平方法應用程式（開放來源http://cran.us.r-project.org/），由楊森研發(Janssen R&D)公司之非臨床統計及計算(Non-Clinical Statistics & Computing)部門實施。 表 1 ：體外數據
人類異構體效力 (EC 50nM) 跨物種效力 (EC 50nM)
化合物 hY2 hY1 hY4 hY5 小鼠 Y2 大鼠 Y2 恆河猴 Y2
化合物1 0.006 ＞2910 ＞2910 345.7 0.004 0.04 0.004
PYY3-36 0.08 66.4 136.7 12.3 0.03 0.50 0.06
實例 5 ：藥物動力學 (PK) DIO 小鼠 PK
雄性DIO C57BL/6N小鼠（20週齡，14週採食高脂肪飲食）獲自Taconic Laboratory。小鼠係以每籠一隻小鼠飼養，鼠籠鋪有AlphaDri墊料且置於12-h光/暗循環之溫控室中。允許小鼠任意採食水與高脂肪飼料(D12492, Research Diet)。
小鼠經皮下(s.c.)給藥1 mg/kg化合物1，在t=4、8、24、48、72、120、及168小時各時間點犧牲3隻動物並收集血液。亦收集來自3隻未用藥動物之血液。在以70% CO 2及30% O 2混合物誘導氣體麻醉下施行斷頭術後，自各動物經由頸靜脈收集大約300 µL的血液。血液樣本（大約300 µL）收集於含有12 µl（4%比例）的完全蛋白酶抑制劑溶液及3 µL（1%比例）的DPP-IV抑制劑的K3E (EDTA)塗佈Sarstedt Microvette®試管。在各時間點收集後30分鐘內，將血液樣本放置在濕冰上，接著以10,000 rpm在冷藏條件下（約5℃）離心約4分鐘以移除細胞，並將所有獲得之血漿轉移至96孔盤。將孔盤儲存在乾冰上直到放置於-80℃冷凍庫中。數據顯示於表2及圖4。 大鼠 PK
將化合物1以1.0 mg/kg於PBS中（pH 7.0至7.6）之劑量水準經皮下及靜脈內投予至雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)。每個時間點自三隻動物經由隱靜脈收集大約500 µL的血液（t=給藥後1、4、24、48、72、96、168、及240小時）。在以70% CO 2及30% O 2混合物誘導氣體麻醉下施行斷頭術後，經由頸靜脈收集給藥後336小時的血液樣本。血液樣本收集於含有20 µl（4%比例）的完全蛋白酶抑制劑溶液及5 µL（1%比例）的DPPIV抑制劑的K3E (EDTA)塗佈Sarstedt Microvette®試管。在各時間點收集後60分鐘內，將血液樣本放置在濕冰上，接著以10,000 rpm在冷藏條件下（約5℃）離心約4分鐘以移除細胞，並將所有獲得之血漿轉移至96孔盤。使用下述之LCMS方法測量化合物1水準。數據顯示於表3。 石蟹獼猴 (Cyno) PK
使所有動物在給藥前禁食至少八小時，且禁食直到血液樣本收集的第一個四小時。三隻動物接受單一IV劑量的1 mg/kg化合物1且三隻動物接受單一SC劑量的1 mg/kg化合物1。在給藥前收集血液，並在給藥後1、6、10、24、36、48、72、120、168、240、336、432、及504小時收集血液。IV組在給藥後0.5小時收集額外樣本。自各動物收集大約1 ml的血液於含有4%比例的完全蛋白酶抑制劑溶液及1%比例的DPPIV抑制劑的K3E (EDTA)塗佈Sarstedt Microvette®試管。在各時間點收集後30分鐘內，將血液樣本放置在濕冰上接著離心，並將所得血漿分成三份且轉移至三重複96孔盤。將孔盤儲存在乾冰上直到放置於-80℃冷凍庫中。數據顯示於表4及圖5。 完整質譜檢定判定血漿水準
將血漿樣本使用抗人類Fc抗體進行免疫親和性捕捉處理，隨後在三重TOF（飛行時間）質譜儀上進行逆相LC-高解析全掃描MS分析。將粗MS譜圖解摺積以闡明注射樣本中之組分的分子量。使用完整接合物之分子離子尖峰進行定量。藉由將參考標準加入血漿中並與檢測樣本(incurred sample)在相同時間使用相同程序處理，以製備標準曲線及品質管制樣本。DIO小鼠、大鼠、及cyno之PK數據係分別顯示於表2至表4。DIO小鼠及Cyno之PK數據亦分別顯示於圖4及圖5。 表 2 ： DIO 小鼠之 PK
檢定 劑量 (mg/kg) T 1/2hr T maxhr C maxng/mL AUC lasthr*ng/mL
完整 1.0 81.05 48 8750 995460
表 3 ：大鼠之 PK
途徑 劑量 (mg/kg) T 1/2hr T maxhr C maxng/mL AUC lasthr*ng/mL
IV 1.0 93.0 1 19.5 809.2
SC 1.0 88.7 48 4.2 602.0
表 4 ： Cyno 之 PK
途徑 劑量 (mg/kg) T 1/2hr T maxhr C maxng/mL AUC lasthr*ng/mL
IV 1.0 178.39 0.67 30290 1207.39
SC 1.0 104.32 10 5590 712.19
實例 6 ：體內療效研究 飲食誘導肥胖 (DIO) 小鼠的重量減輕：急性給藥
雄性DIO C57B1/6小鼠經過單次給藥後，評估化合物1對於降低攝食量及體重的能力。雄性DIO C57BL/6N小鼠（20週齡，14週採食高脂肪飲食）獲自Taconic Laboratory。小鼠係以每籠一隻小鼠飼養，鼠籠鋪有AlphaDri墊料且置於12-h光/暗循環之溫控室中。允許小鼠任意採食水與高脂肪飼料(D12492, Research Diet)。使動物適應環境至少一週，然後才開始實驗。
在給藥前一天，將小鼠基於個別體重分組為每組八隻動物。在隔天3:00至4:00 pm，將動物稱重並經由皮下(s.c.)投予用媒劑(dPBS, pH 7.2)、化合物1（劑量0.1、0.3、1.0、3.0、或7.5 nmol/kg）、或度拉魯肽(Dulaglutide) (0.3 nmol/kg)處理。給藥後24 h、48 h及72 h測量體重及攝食量，並計算重量減輕及攝食量減少百分比。統計分析使用二因子重複測量ANOVA與杜凱(Tukey)事後檢定在Prism中進行。所有數據以平均值± SEM表示（圖6及圖7）。 飲食誘導肥胖小鼠的重量減輕：慢性給藥
雄性DIO之C57B1/6小鼠在8天期間經過重複給藥，評估化合物1對於減少攝食量與體重且改善葡萄糖恆定的能力。雄性DIO C57BL/6N小鼠（20週齡，14週採食高脂肪飲食）獲自Taconic Laboratory。小鼠係以每籠一隻小鼠飼養，鼠籠鋪有AlphaDri墊料且置於12-h光/暗循環之溫控室中。允許小鼠任意採食水與高脂肪飼料(D12492, Research Diet)。使動物適應環境至少一週，然後才開始實驗。
在給藥前一天，將小鼠基於個別體重分組。接下來8天每天3:00至4:00 pm，將動物及攝食量稱重。將動物經由皮下每天投予媒劑(dPBS, pH 7.2)或度拉魯肽（0.3 nmol/kg）或經由皮下每三天投予化合物1（劑量0.1、0.3、1.0、3.0 nmol/kg）處理。在8天後，使小鼠禁食5小時，且接著在t=0時經口給予2 g/kg推注葡萄糖。在t=葡萄糖挑戰後0、30、60、90、及120分鐘測量血液葡萄糖並在t=0、30、及90分鐘時抽血測量血漿胰島素。統計分析使用單因子ANOVA或雙因子重複測量ANOVA與杜凱事後檢定在Prism中進行。所有數據以平均值± SEM表示（圖8及圖9、及表5至表8）。 表 5 ：化合物 1 在 8 天處理期間對體重 (g) 之效應
處理 媒劑 化合物 1 (nmol/kg) 度拉魯肽 (nmol/kg)
天 n/a 0.1 0.3 1.0 3.0 0.3
-1 46.3 ± 0.6 46.3 ± 0.6 46.7 ± 0.8 46.3 ± 0.6 46.3 ± 0.6 46.3 ± 0.6
0 46.1 ± 0.7 46.0 ± 0.6 46.8 ± 0.7 46.3 ± 0.6 46.3 ± 0.6 45.9 ± 0.6
1 45.8 ± 0.7 45.0 ± 0.6 45.2 ± 0.7 43.9 ± 0.5 43.9 ± 0.6 44.1 ± 0.6
2 45.2 ± 0.7 43.9 ± 0.6 43.6 ± 0.7 42.4 ± 0.7* 41.8 ± 0.7* 42.2 ± 0.6*
3 45.1 ± 0.7 43.9 ± 0.6 42.8 ± 0.6 41.0 ± 0.6* 40.1 ± 0.6* 40.6 ± 0.6*
4 44.7 ± 0.7 43.4 ± 0.6 42.0 ± 0.6 39.9 ± 0.6* 38.5 ± 0.6* 39.3 ± 0.6*
5 44.5 ± 0.7 43.0 ± 0.6 41.5 ± 0.5* 39.1 ± 0.6* 36.8 ± 0.7* 38.1 ± 0.7*
6 44.5 ± 0.7 43.1 ± 0.6 41.4 ± 0.5* 38.6 ± 0.6* 35.5 ± 0.8* 37.1 ± 0.8*
7 44.3 ± 0.7 43.1 ± 0.7 41.3 ± 0.5* 38.2 ± 0.6* 34.8 ± 0.9* 36.4 ± 1.0*
8 45.2 ± 0.6 46.3 ± 0.7 41.9 ± 0.5* 38.8 ± 0.6 34.7 ± 1.0* 36.5 ± 1.1*
數值代表來自每組每時間點8隻動物的數據之平均值± SEM *p＜0.05，與媒劑比較；二因子ANOVA RM、杜凱多重比較檢定 表 6 ：化合物 1 在 8 天處理後在 OGTT 期間對血糖 (mg/dL) 水準的效應
葡萄糖挑戰後的時間(min)
處理 劑量(nmol/ kg) 0 30 60 90 120 總AUC (mg/dl/ 120min) ΔAUC (mg/dl/ 120min)
媒劑 NA 148±6 227±15 272±12 206±9 209±13 26492± 1232 8702± 1082
Comp. 1 0.1 151±4 213±9 249±10 186±11 194±15 24598±849 6433±677
0.3 137±6 191±11 208±10 * 146±8* 160±8* 20786±728 * 4379±364 *
1.0 117±5 146±9 * 203±10 * 135±8* 136±5* 18285±769 * 4319±522 *
3.0 73±11 * 129±5 * 149±10 * 93±9 * 101±9* 13703± 913 * 5004±585
度拉魯肽 0.3 76±9 * 151±14 * 174±17 * 104±10 * 119±9* 15758± 1054 * 6668± 1846
數值代表來自每組每時間點8隻動物的數據之平均值± SEM *p＜0.05，與媒劑比較；二因子ANOVA RM、杜凱多重比較檢定，用於葡萄糖值；單因子ANOVA、杜凱多重比較檢定，用於AUC 表 7 ：化合物 1 在 8 天處理後在 OGTT 期間對胰島素 (ng/mL) 水準的效應
葡萄糖挑戰後的時間(min)
處理 劑量(nmol/kg) 0 30 90 總AUC (mg/dl/120min)
媒劑 NA 5.6±1.4 11.3±3.0 4.0±0.6 711.4± 164.1
Comp. 1 0.1 3.0±0.4 6.6±0.8* 2.4±0.2 415.6±44.2
0.3 2.3±0.2 4.0±0.6* 1.7±0.2 264.3±33.0*
1.0 1.3±0.2* 2.2±0.1* 1.1±0.2 151.6±12.5*
3.0 0.4±0.1* 1.2±0.1* 0.4±0.1* 73.9± 9.0*
度拉魯肽 0.3 0.6±0.1* 1.7±0.2* 0.7±0.2 108.8± 12.3*
數值代表來自每組每時間點8隻動物的數據之平均值± SEM *p＜0.05，與媒劑比較；二因子ANOVA RM、杜凱多重比較檢定，用於葡萄糖值；單因子ANOVA、杜凱多重比較檢定，用於AUC 表 8 ：化合物 1 在 8 天處理後對餐後血糖 (mg/dL) 水準的效應
處理 劑量 (nmol/kg) 血糖 (mg/dL)
媒劑 NA 180±5
化合物1 0.1 164±6
0.3 160±5
1.0 149±6
3.0 105±12*
度拉魯肽 0.3 114±13*
數值代表來自每組每時間點8隻動物的數據之平均值± SEM *p＜0.05，與媒劑比較；單因子ANOVA、杜凱多重比較檢定 實例 7 ：製備 mAb- 調酸素 (mAb-OXM) 化合物之合成策略
人類調酸素(OXM)係37個胺基酸內源性肽(SEQ ID NO: 23)，其已在患有第2型糖尿病之患者中顯示出具有有益的藥理作用。藥理作用係對GLP1R及GCGR兩者之促效作用的結果。探討OXM類似物顯露在嚙齒動物模型中展現出良好葡萄糖控制及重量減輕之肽變體。OXM於體內之半衰期在人類中大約為數分鐘。因此，從事OXM之額外設計以賦予相當於每週一次劑量的半衰期。半衰期增加係藉由增加OXM肽對蛋白質水解之穩定性、及藉由共價附接單株抗體(mAb)來增加肽之循環半衰期而完成。藉由DPP4之肽有效負載(payload)的蛋白質水解係藉由將位置2之絲胺酸用胺基異丁酸(Aib)取代而減輕。肽之螺旋形貌係藉由將分叉鹽橋引入Q20R至S16E及Q24E而穩定化，且藉由M27L變體而減輕潛在氧化傾向。選擇親本mAb MSCB97（如上所述）以具有低固有抗原結合，且重鏈之HCDR3 (SEQ ID NO:18)區中異白胺酸至半胱胺酸的點突變(I102C)作為合成肽有效負載之附接點。藉由使用IgG4 PAA同型靜默效應功能。將短的低聚乙二醇間隔物併入mAb與肽之間，以確保肽未受阻地接近GLP1R及GCGR。間隔物亦賦予促進接合化學之有利的水溶性。肽-間隔物至mAb之附接係藉由在乙二醇間隔物之遠端引入反應性溴乙醯胺基團而完成。間隔物之近端係經由K30之側鏈附接至OXM變體。升糖素及OXM肽之胺基酸序列分別係由SEQ ID NO:22及24提供。接合係藉由與mAb重鏈中之半胱胺酸點突變的硫醇官能基反應而完成。mAb重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別係由SEQ ID NO:13及15提供。 mAb-OXM 化合物之化學合成
產生mAb-OXM化合物之總體合成方案係顯示於圖10。
調酸素(OXM)肽變體之製備：樹脂結合經保護肽係使用標準9-芴甲氧羰基(Fmoc)胺基酸（除了N端His, Nα-Boc-His(Boc)-OH及Lys30, Nα-Fmoc-Lys(ivDDE)-OH)之外）在PAL-PEG-聚苯乙烯樹脂上合成。整程使用標準胺基酸活化及Fmoc去保護策略。序列完成後，將C端離胺酸之側鏈用於N,N-二甲基甲醯胺(DMF)中之稀釋無水胼處理，選擇性地去保護。將Fmoc-dPEG 12-CO 2H使用二異丙基碳二亞胺(DIC)/乙基(羥基亞胺基)活化，偶合至經釋放胺。移除Fmoc基團，且使用溴乙酐於DMF中之溶液將所得之胺溴乙醯化。
藉由用作為清除劑之含有酚、水、及三異丙基矽烷的三氟乙酸(TFA)處理，同時去保護所有保護基而自樹脂移除肽。粗製肽係藉由用醚冷沉澱而單離，且藉由逆相高效液相層析法(RP-HPLC)使用具有0.1% v/v TFA之乙腈/水作為洗提液而純化。冷凍乾燥後收集呈蓬鬆白色固體之純肽，並儲存於-80℃。
單株抗體MSCB97之還原：將單株抗體單離成具有雙硫鍵結至外來半胱胺酸或麩胱甘肽殘基的經工程改造之Cys102殘基，其係自細胞質液或自生長培養基清除。因此，在接合OXM肽變體之前，需要進行這些雙硫鍵之初步還原隨後進行非所要半胱胺酸之移除。以mAb固定化在蛋白質A樹脂珠上完成還原。使還原劑（三羧乙基膦，TCEP）在pH 5下通過管柱循環直到還原完成(1 hr)。TCEP作為還原劑在這些條件下之優勢係當還原生效時，雙硫鍵在較低pH下之再形成係可忽略的。在洗去副產物之後，使用酸性緩衝液（pH 3.5之乙酸鈉）自管柱洗提出經還原之吸附蛋白質。將還原mAb用50 mM 3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)在pH 5.5下透析兩次。
藉由用相較於mAb之2.5當量於溶液中的TCEP在pH 5下還原，製備類似探索批次。讓還原在室溫下繼續進行2小時。藉由凝膠過濾（PD10管柱）移除小分子副產物，且將還原MSCB97用pH 5.5之10 mM MOPS洗提。
mAb-OXM化合物之製備：將還原MSCB97之溶液添加至7.6倍過量的冷凍乾燥OXM肽變體。添加1 mM EDTA溶液以保護反應性硫醇免受金屬催化氧化的影響，且藉由添加MOPS緩衝液(1 M, pH 8.1)將反應溶液之pH升至7.3。讓反應在室溫下在輕微攪動下繼續進行18 h。將反應藉由添加2 M乙酸調整至pH 5.5來淬熄，並將粗製接合物藉由吸附在蛋白質A上加上洗滌來純化，以移除過量肽、未折疊產物、及副產物。產物洗提（乙酸鈉，pH 3.6）之後透析至pH 5乙酸酯緩衝液中。
執行三個獨立合成，以250 mg、500 mg、及500 mg的MSCB97開始，且將產物合併成單一批次。 mAb-OXM 化合物之分析
使用下列分析所製備之mAb-OXM化合物的性質：(i)分析性疏水性交互作用層析法(HIC)、(ii)藉由液相層析電灑游離質譜儀(LC-ESIMS)之完整質量測量、(iii)分析性尺寸篩除層析法(SEC)、及(iv) SDS-聚丙醯胺凝膠電泳。 於人類及猴血漿中之穩定性
OXM係由血漿肽酶快速代謝。為判定mAb-OXM化合物（「化合物2」）（圖11）在人類及猴血漿中對酶降解之抗性，評估化合物2之離體穩定性。將化合物2以20 nM與新鮮（從未經冷凍）肝素化血漿在37℃下培養至多168小時。使用功能性基於細胞之生物檢定進行生物分析，其測量於人類GLP-1受體轉染HEK細胞中之cAMP生產。所生產之cAMP量係與活性OXM類似物之濃度成正比，且在此檢定中，藉由自已知濃度之參考標準品內插判定活性OXM類似物在穩定性樣本中之水準。此檢定係用於將穩定性相對於先前判定較穩定之對照（對照1）及先前判定較不穩定之對照（對照2）排序。數據係用於排序相對穩定性，並顯示於圖12及圖13。 實例 8 ：體外研究：化合物 2 對人類、小鼠、大鼠、及石蟹獼猴 GLP1 和升糖素受體之體外效力。
在檢定中，使用經轉染以穩定表現人類、石蟹獼猴、大鼠、或小鼠GLP1或GCG受體之HEK293細胞，以特徵化受到關注之化合物（包括化合物2）之效力及物種特異性。針對各受體檢定，將純株細胞以2000至5000個細胞/每孔之範圍內的適當密度接種至384孔盤。將化合物稀釋於補充有5 mM HEPES、0.1% BSA、及0.5 mM IBMX之HBSS中，並將其添加至細胞。取決於細胞殖株，將細胞盤在室溫下培養5或10分鐘，接著進行裂解以用於cAMP測量。使用LANCE cAMP套組以EnVision盤讀取儀定量cAMP濃度。將標準曲線包括在各檢定盤中以用於cAMP濃度之反算。分析劑量反應曲線，且用Graphpad Prism或Crucible計算化合物EC 50值。EC 50數據係概括於表9至表10。 表 9 ：來自人類 GLP1 及升糖素受體 cAMP 檢定之 EC 50 值 (nM) 的彙總。
  人類
  GCGR GLP1R
升糖素 0.05 ±0.01 0.96 ±0.21
Ser-8 GLP1 ＞100 0.07 ±0.01
OXM 3.01 ±0.35 2.40 ±0.59
化合物 2 3.31 ±0.22 0.43 ±0.02
度拉魯肽 ＞100 0.17 ±0.04
值代表來自3至7個實驗之平均值± SEM。 表 10 ：來自小鼠、大鼠、及石蟹獼猴 GLP1 及升糖素受體 cAMP 檢定之 EC50 值 (nM) 的彙總。
小鼠 大鼠 石蟹獼猴
GCGR GLP1R GCGR GLP1R GCGR GLP1R
升糖素 0.09 ±0.01 2.13 ±0.42 1.57 ±0.33 4.73 ±0.20 0.03 ±0.002 1.96 ±0.38
Ser-8 GLP1 ＞100 0.06 ±0.005 ＞100 0.14 ±0.03 ＞100 0.08 ±0.002
OXM 6.31 ±2.58 1.90 ±0.31 12.74 ±3.54 0.98 ±0.16 0.49 ±0.08 0.80 ±0.07
化合物 2 0.82 ±0.38 0.11 ±0.02 5.90 ±1.46 0.97 ±0.13 2.03 ±0.14 0.40 ±0.03
度拉魯肽 ＞100 0.035 ±0.002 ＞100 0.13 ±0.03 ＞100 0.18 ±0.01
值代表來自3至8個實驗之平均值± SEM。 實例 9 ：對其他相關 GPCR 的效力
在檢定中，使用表現數種B類GPCR之細胞評估化合物2之效力。在一組六個體外cAMP檢定中，使用表現CALCR、PTHR1、PTHR2、CRHR1、CRHR2、及VIPR1之細胞測試化合物2。檢定係根據供應商之標準操作程序執行檢定，其中針對各測試受體包括陽性對照。
此外，在表現人類GIP受體之穩定細胞系中測試化合物2。將細胞接種至384孔盤，並在24小時候用化合物在室溫下處理5分鐘。使用CisBio HTRF cAMP套組測量cAMP濃度，並使用GraphPad Prism分析結果。數據係顯示於表11至表12。 表 11 ： cAMP 檢定中化合物 2 效力的彙總。
化合物 目標 RC 50(µM) Hill 曲線底部 曲線頂部 最大反應
降鈣素 CALCR 0.0007764259 1.5254 -6.2187 105 101.04
PTH(1-34) PTHR1 0.001080165 1.8672 -5.9767 101 93.574
蛙皮降壓肽(sauvagine) CRHR1 0.0003082264 1.8133 -3.2011 102.19 106.16
蛙皮降壓肽(sauvagine) CRHR2 0.003395158 1.3095 -1.175 102.76 107.04
TIP-39 PTHR2 0.0003934505 1.1032 -3.7746 100.33 100.71
VIP VIPR1 0.0003567715 1.9827 -0.96244 105 104.01
化合物2 CALCR ＞0.1 0.070838
化合物2 CRHR1 ＞0.1 1.5625
化合物2 CRHR2 ＞0.1 0.928
化合物2 PTHR1 ＞0.1 0.86197
化合物2 PThR2 ＞0.1 2.2789
化合物2 VIPR1 ＞0.1 0.60373
表 12 ：人類 GIP 受體檢定中化合物 2 的效力
檢定 1 檢定 2
EC 50(nM) R 平方 (R square) EC 50(nM) R 平方 (R square)
GIP 2.31 1.00 1.28 0.99
化合物 2 ≥100 ≥100 ≥100 ≥100
調酸素 ≥100 ≥100 ≥100 ≥100
實例 10 ：體內研究： DIO 小鼠中單次給藥療效
在化合物2、或GLP1R促效劑度拉魯肽之單次給藥之後，評估DIO小鼠之攝食量、體重、葡萄糖耐受性、及血漿FGF21水準。給藥前一天，將動物稱重，並按BW分組。藉由皮下注射如所指示對小鼠給藥。隔天早晨，移除食物並開始6小時禁食。記錄BW及食物重量(FW)。在12:00 pm測量空腹血糖並收集血液以用於胰島素測量。一小時候，用葡萄糖（1 g/kg，20%葡萄糖，5 mL/kg）對小鼠腹膜內給藥。經由尾部採血10分鐘收集額外20 µL的血液以用於血漿胰島素。在葡萄糖挑戰10、30、60、及90分鐘後，藉由血糖儀測量血糖水準。接著，用CO 2將小鼠安樂死，且經由心臟穿刺收集最終血液樣本。數據係顯示於表13至表19。 表 13 ：化合物 2 及度拉魯肽在處理後 18 小時內對 DIO 小鼠之攝食量（克）的效應
處理 給藥前 24 小時 給藥後 18 小時
媒劑 3.1±0.1 2.9±0.1
度拉魯肽(0.3 nmol/kg) 3.1±0.1 1.5±0.1*^
化合物2 (1.0 nmol/kg) 3.2±0.1 2.5±0.1^#
化合物2 (2.0 nmol/kg) 3.4±0.1 2.2±0.1*^#
化合物2 (4.0 nmol/kg) 3.2±0.1 1.7±0.1*^
化合物2 (8.0 nmol/kg) 3.4±0.1 1.4±0.2*^
*p＜0.01，與媒劑比較（給藥後18小時）；^p＜0.001，各別與給藥前24小時比較；#p＜0.0001，與度拉魯肽(0.3 nmol/kg)給藥後18小時比較 二因子ANOVA、Sidak多重比較檢定 數值代表每組每時間點8隻動物的數據之平均值± SEM，除了媒劑給藥前24小時之外(n=7) 表 14 ：化合物 2 及度拉魯肽在處理 18 小時後對 DIO 小鼠之體重變化百分比的效應
處理 重量變化 (%)
媒劑 -0.7±0.3
度拉魯肽(0.3 nmol/kg) -4.1±0.3*
化合物2 (1.0 nmol/kg) -1.9±0.3*^
化合物2 (2.0 nmol/kg) -2.8±0.4*^
化合物2 (4.0 nmol/kg) -4.4±0.3*
化合物2 (8.0 nmol/kg) -5.2±0.3*^
*p＜0.01，與媒劑比較；^p＜0.05，與度拉魯肽(0.3 nmol/kg)比較 二因子ANOVA RM、杜凱多重比較檢定。數據僅顯示18小時時間點 重量變化百分比係相對於第0天（給藥前）之體重計算 數值代表來自每組8隻動物的數據之平均值± SEM 表 15 ：化合物 2 及度拉魯肽在處理 24 小時後在 IPGTT 期間對 DIO 小鼠之血糖 (mg/dL) 的效應
處理 時間 (min)
0 10 30 60 90
媒劑 215±9 353±20 436±19 424±25 391±25
度拉魯肽(0.3 nmol/kg) 140±7 264±18 267±22 228±12 193±9
化合物2 (1.0 nmol/kg) 169±6 349±17 411±30 411±19 384±18
化合物2 (2.0 nmol/kg) 138±11 288±19 349±27 303±29 229±20
化合物2 (4.0 nmol/kg) 114±8 235±23 237±34 239±30 195±25
化合物2 (8.0 nmol/kg) 96±7 206±13 168±22 166±19 131±12
數值代表取自每組每時間點8隻動物的數據之平均值±SEM 表 16 ：處理 24 小時後 DIO 小鼠在 IPGTT 期間之血糖淨 AUC
處理 血糖淨 AUC
媒劑 16539±1400
度拉魯肽(0.3 nmol/kg) 8471±1204*
化合物2 (1.0 nmol/kg) 19214±1596^
化合物2 (2.0 nmol/kg) 13805±1840
化合物2 (4.0 nmol/kg) 9827±1046*
化合物2 (8.0 nmol/kg) 6035±742*
*p＜0.05，與媒劑比較；^p＜0.05，與度拉魯肽(0.3 nmol/kg)及JNJ-64151789（4.0及8.0 nmol/kg）比較 單因子ANOVA、杜凱多重比較檢定 數值代表來自每組8隻動物的數據之平均值±SEM 表 17 ：化合物 2 及度拉魯肽在處理 24 小時後對 DIO 小鼠之 6 小時空腹葡萄糖 (mg/dL) 的效應
處理 血糖 (mg/dL)
媒劑 215±9
度拉魯肽(0.3 nmol/kg) 140±7*
化合物2 (1.0 nmol/kg) 169±6*
化合物2 (2.0 nmol/kg) 138±11*
化合物2 (4.0 nmol/kg) 114±8*
化合物2 (8.0 nmol/kg) 96±7*^
*p＜0.05，與媒劑比較；^p＜0.05，與度拉魯肽(0.3 nmol/kg)比較 單因子ANOVA、杜凱多重比較檢定 數值代表來自每組8隻動物的數據之平均值±SEM 表 18 ：化合物 2 及度拉魯肽在 IPGTT 期間在葡萄糖挑戰前（處理 24 小時後）及在葡萄糖挑戰後 10 分鐘對 DIO 小鼠之血漿胰島素水準 (ng/ml) 的效應
處理 血漿胰島素 (ng/mL)
葡萄糖前 葡萄糖後 10 分鐘
媒劑 2.7±0.4 2.0±0.3
度拉魯肽(0.3 nmol/kg) 1.6±0.2 1.7±0.2
化合物2 (1.0 nmol/kg) 2.8±0.4 1.8±0.2
化合物2 (2.0 nmol/kg) 2.3±0.5 2.9±0.4
化合物2 (4.0 nmol/kg) 2.1±0.2 2.5±0.5
化合物2 (8.0 nmol/kg) 1.5±0.4 2.7±0.3
數值代表來自每組8隻動物的數據之平均值±SEM 表 19 ：化合物 2 及度拉魯肽在處理 26 小時後對 DIO 小鼠之血漿 FGF21 (ng/mL) 的效應
處理 血漿 FGF21 (ng/mL)
媒劑 0.4±0.1
度拉魯肽(0.3 nmol/kg) 0.8±0.2
化合物2 (1.0 nmol/kg) 0.7±0.1
化合物2 (2.0 nmol/kg) 1.5±0.3
化合物2 (4.0 nmol/kg) 2.1±0.4^
化合物2 (8.0 nmol/kg) 3.5±0.3*
*p＜0.0001，與所有組比較；^p＜0.05，與所有組比較，除了化合物2 (2.0 nmol/kg) 單因子ANOVA、杜凱多重比較檢定 數值代表來自每組8隻動物的數據之平均值± SEM 實例 11 ：體內研究：在 DIO 小鼠中重複給藥
在重複給藥9天期間，監測GLP1R/GCGR雙重促效劑、化合物2、及GLP1R促效劑度拉魯肽的效應。為控制給藥頻率，每天對所有動物給藥。基於化合物2及度拉魯肽之DIO小鼠PK數據判定給藥頻率。在度拉魯肽組之動物每天接受此藥物。媒劑處理之動物每天接受媒劑。給予1.0、2.0、或4.0 nmol/kg之化合物2的動物係以化合物每三天給藥，並在沒有注射化合物的日子接受媒劑。起始給藥前一天，將動物稱重，並按體重分組。藉由皮下注射在1至3 PM之間如所指示對所有小鼠給藥。在這些治療組中，每天1至3PM之間監測攝食量及體重。
在第一次給藥後的開始24-hr，將三組小鼠與經1.0、2.0、或4.0 nmol/kg化合物2處理之動物成對餵養(PF)。調整成對餵養小鼠之進料斗中的食物量，以使化合物處理組之小鼠先前24小時的平均食物攝取與其配對者匹配。每天以媒劑對所有PF組給藥。在第九天（或成對餵養組之第10天），使動物禁食6小時，並測量體重及空腹葡萄糖。收集血液以用於測量胰島素、FGF21、及血漿脂質。攝食量、體重、身體組成、空腹葡萄糖、空腹胰島素、空腹FGF21、及空腹血漿脂質數據係顯示於表20至表26。 表 20 ：化合物 2 及度拉魯肽在 9 天處理內對DIO 小鼠之每日攝食量（克）的效應
時間(日數)
處理 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
媒劑 2.7± 0.1 2.9± 0.0 3.1± 0.1 2.9± 0.1 2.9± 0.1 3.0± 0.1 2.9± 0.1 3.0± 0.1 3.0± 0.1 2.9± 0.1
度拉魯肽 (0.3 nmol/kg) 3.1± 0.2 1.5± 0.2* 1.3± 0.2* 1.7± 0.3* 1.9± 0.2* 2.1± 0.2* 2.2± 0.2* 2.3± 0.2 2.9± 0.4 2.5± 0.2
化合物2 (1.0 nmol/kg) 3.1± 0.1 2.3± 0.1*# 2.5± 0.1*# 2.6± 0.2 2.4± 0.1# 2.7± 0.2# 2.6± 0.1# 2.9± 0.2# 2.8± 0.1# 2.7± 0.1
化合物2 (2.0 nmol/kg) 3.1± 0.1 2.0± 0.1* 2.0± 0.1*^ 2.7± 0.1^ 2.5± 0.2^ 2.3± 0.1 2.5± 0.2 2.7± 0.1 2.8± 0.3 2.7± 0.1
化合物2 (4.0 nmol/kg) 2.9± 0.2 1.5± 0.1* 1.5± 0.2* 2.1± 0.2* 1.7± 0.1* 1.6± 0.1* 1.6± 0.1* 1.8± 0.2* 2.2± 0.3*^ 2.1± 0.1*
*p＜0.05，與媒劑比較；^p＜0.05，與度拉魯肽(0.3 nmol/kg)比較；#p＜0.05，與化合物2 (4.0 nmol/kg)比較 二因子ANOVA RM、杜凱多重比較檢定 所有PF組皆接受來自各別處理組之平均攝食量（數據未顯示）。 數值代表取自每組每時間點6至10隻動物的數據之平均值±SEM 表 21 ：化合物 2 及度拉魯肽在 9 天處理內對 DIO 小鼠之體重變化百分比的效應
時間(日數)
T 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
V 0.0 -0.1± 0.2 -0.1± 0.2* -0.2± 0.2* -0.7± 0.3* -0.5± 0.3* 0.2± 0.5* 0.1± 0.6* 0.0± 0.5* -1.7± 0.6*
1 0.0 -3.7± 0.3 -6.2± 0.6 -7.8± 0.8 -9.2± 0.8 -10.1± 0.8 -10.2± 0.8 -10.7± 1.0 -11.1± 0.9 -13.1± 1.1
2 0.0 -1.9± 0.4 -2.9± 0.5^ -3.2± 0.4^ -4.4± 0.7 ^& -4.7± 0.8^& -4.5± 0.8^& -5.3± 1.0^& -5.2± 1.1^& -6.6± 1.1^&
3 0.0 -1.6± 0.3 -2.7± 0.4^ -3.5± 0.4^ -3.8± 0.3^ -3.8± 0.4^ -3.9± 0.5^ -3.5± 0.5^ -3.4± 0.5^ -4.5± 0.5^
4 0.0 -2.8± 0.4 -4.7± 0.5 -4.9± 0.6^ -7.1± 0.7 -8.0± 0.8 -8.0± 0.8 -9.1± 0.8# -10.0± 0.9# -11.5± 0.9#
5 0.0 -3.0± 0.4 -4.5± 0.4 -5.1± 0.5^ -5.3± 0.5^ -5.8± 0.5^ -6.1± 0.5^ -5.8± 0.5^ -6.2± 0.4^ -6.9± 0.4^
6 0.0 -3.7± 0.3 -6.8± 0.3 -8.8± 0.5$ -11.6± 0.6#$ -14.2± 0.7^#$ -15.6± 0.9^#$ -18.4± 1.2^#$ -20.4± 1.5^#$ -21.9± 1.6^#$
7 0.0 -3.6± 0.1 -5.6± 0.1 -6.9± 0.1 -7.9± 0.2 -9.1± 0.2 -10.5± 0.3 -11.4± 0.3 -12.3± 0.3 -13.3± 0.3
T：處理；V：媒劑；1：度拉魯肽(0.3 nmol/kg)；2至3：化合物2 (1.0 nmol/kg)；4至5：化合物2 (2.0 nmol/kg)；6至7：化合物2 (4.0 nmol/kg) *p＜0.01，與所有其他處理比較；^p＜0.05，與度拉魯肽(0.3 nmol/kg)比較；#p＜0.05，與各別PF組比較；$p＜0.05，與JNJ-64151789（1.0及2.0 nmol/kg）比較；&p＜0.05，與JNJ-64151789 (2.0 nmol/kg)比較 二因子ANOVA RM、杜凱多重比較檢定。 重量變化%係相對於第0天（給藥前）之體重計算 數值代表取自每組每時間點10隻動物的數據之平均值±SEM 表 22 ：化合物 2 及度拉魯肽在重複給藥後對 DIO 小鼠之身體 組成（質量及體重百分比）的效應
時間(日數)
質量(g) 體重之%
處理 瘦肉 脂肪 瘦肉 脂肪
媒劑 24.0±0.2 10.6±0.5 57.5±0.8 25.4±0.8
度拉魯肽(0.3 nmol/kg) 22.1±0.3* 7.6±1.1 61.0±1.7 22.8±1.2
化合物2 (1.0 nmol/kg) 23.1±0.5 9.5±1.3 57.4±2.5 23.1±2.5
化合物2 (1.0 nmol/kg) PF 23.9±0.3 10.6±0.3 57.7±0.7 25.5±0.5
化合物2 (2.0 nmol/kg) 22.2±0.4* 8.2±0.7 59.7±1.1 22.0±1.6
化合物2 (2.0 nmol/kg) PF 23.4±0.1 9.8±0.4 58.5±0.8 24.4±0.8
化合物2 (4.0 nmol/kg) 20.9±0.3* 7.4±0.7 61.9±2.4 21.6±1.1
化合物2 (4.0 nmol/kg) PF 21.4±0.6 9.3±0.5 56.8±1.4 24.7±1.0
*p＜0.05，與媒劑比較 單因子ANOVA、杜凱多重比較檢定 數值代表來自每組5隻動物的數據之平均值± SEM 表 23 ：化合物 2 及度拉魯肽在重複給藥後對 DIO 小鼠之 6 小時空腹葡萄糖 (mg/dL) 的效應
處理 血糖(mg/dL)
媒劑 170±5
度拉魯肽(0.3 nmol/kg) 123±5*
化合物2 (1.0 nmol/kg) 164±5^
化合物2 (1.0 nmol/kg) PF 168±7^
化合物2 (2.0 nmol/kg) 140±7*
化合物2 (2.0 nmol/kg) PF 155±6^
化合物2 (4.0 nmol/kg) 98±4*#
化合物2 (4.0 nmol/kg) PF 133±6*
*p＜0.05，與媒劑比較；^p＜0.05，與度拉魯肽(0.3 nmol/kg)比較；#p＜0.05，與JNJ-64151789 (4.0 nmol/kg) PF比較 單因子ANOVA、杜凱多重比較檢定 數值代表來自每組10隻動物的數據之平均值±SEM 表 24 ：化合物 2 及度拉魯肽在重複給藥後對 DIO 小鼠之 6 小時空腹血漿胰島素 (ng/mL) 的效應
處理 血漿胰島素(ng/mL)
媒劑 3.0±0.4
度拉魯肽(0.3 nmol/kg) 1.4±0.2*
化合物2 (1.0 nmol/kg) 2.0±0.3
化合物2 (1.0 nmol/kg) PF 2.0±0.1*
化合物2 (2.0 nmol/kg) 1.1±0.1*^
化合物2 (2.0 nmol/kg) PF 2.3±0.3
化合物2 (4.0 nmol/kg) 0.5±0.1*
化合物2 (4.0 nmol/kg) PF 1.2±0.1*
*p＜0.05，與媒劑比較；^p＜0.05，與化合物2 (2.0 nmol/kg) PF比較 單因子ANOVA、杜凱多重比較檢定 數值代表來自每組10隻動物的數據之平均值±SEM 表 25 ：化合物 2 及度拉魯肽在重複給藥後對 DIO 小鼠之 6 小時空腹血漿 FGF21 (ng/mL) 的效應
處理 FGF21 (ng/mL)
媒劑 0.7±0.1
度拉魯肽(0.3 nmol/kg) 0.5±0.1
化合物2 (1.0 nmol/kg) 0.7±0.2
化合物2 (1.0 nmol/kg) PF 0.4±0.1
化合物2 (2.0 nmol/kg) 0.6±0.1
化合物2 (2.0 nmol/kg) PF 0.2±0.1
化合物2 (4.0 nmol/kg) 1.5±0.3*^
化合物2 (4.0 nmol/kg) PF 0.3±0.1
*p＜0.05，與所有組比較；^ p＜0.05，與化合物2 (4.0 nmol/kg) PF比較 單因子ANOVA、杜凱多重比較檢定 數值代表來自每組10隻動物的數據之平均值± SEM，除了化合物2 (1.0 nmol/kg)及化合物2 (4.0 nmol/kg) PF之N=9 表 26 ：化合物 2 及度拉魯肽在重複給藥後對 DIO小鼠之血漿 脂質的效應
時間(日數)
處理 游離脂肪酸(µmol/L) 游離甘油(mmol/L) 三酸甘油酯(mg/dL) 總膽固醇(mg/dL)
媒劑 66.2±3.9 0.6±0.0 30.1±2.8 142.1±5.2
度拉魯肽(0.3 nmol/kg) 73.2±12.0 0.5±0.1 24.1±2.3 146.1±3.3
化合物2 (1.0 nmol/kg) 71.8±5.4 0.5±0.0* 32.5±4.5 149.1±2.3
化合物2 (1.0 nmol/kg) PF 58.8±6.1 0.6±0.1 33.7±4.1 161.4±2.0
化合物2 (2.0 nmol/kg) 73.8±4.6 0.5±0.0* 30.4±3.4 128.0±6.6#
化合物2 (2.0 nmol/kg) PF 84.8±25.3 0.6±0.0* 34.5±3.3 149.9±4.4
化合物2 (4.0 nmol/kg) 71.2±6.4 0.4±0.0* 16.1±2.0$ 85.7±4.9^
化合物2 (4.0 nmol/kg) PF 102.6±14.5 0.7±0.0 31.8±1.1 137.8±5.7
*p＜0.05，與化合物2 (4.0 nmol/kg) PF比較；^p＜0.05，與所有其他組比較；#p＜0.05，與化合物2 (1.0 nmol/kg)及化合物2 (2.0 nmol/kg) PF比較；$p＜0.05，與所有組比較，除了度拉魯肽(0.3 nmol//kg) 單因子ANOVA、杜凱多重比較檢定 數值針對游離脂肪酸代表來自每組10隻動物、針對游離甘油代表來自每組8至10隻動物、針對游離三酸甘油酯及總膽固醇代表來自每組9至10隻動物的數據之平均值± SEM 實例 12 ：體內研究：石蟹獼猴中單次給藥療效
在處理前三週期間，每天監測生物原態(naïve)石蟹獼猴之攝食。起始處理時，將動物置於四組以達成類似平均體重（每組n=8至9，平均體重為7.4至7.9 kg）。各組之動物接受對應於1、3、5、或7.5 nmol/kg化合物2之單次皮下給藥。每天監測食物攝取達額外的14天。在給藥當天、及給藥後4、7、10、14、及21天測量體重。藉由比較當天攝食量與給藥前七天期間之平均每日攝食量，每天判定攝食量變化百分比。結果係提供於圖14及圖15。 實例 13 ：藥物動力學 (PK) 、藥物動力學 (PK)/ 藥效動力學 (PD) 分析 DIO 小鼠 PK
評估化合物2在DIO小鼠中之時程（表27）。以10 nmol/kg對動物（每時間點n=3）s.c.給藥。 表 27 ：化合物 2 之由生物檢定及免疫檢定所測量之血漿暴露量 (nM) 的時程
時間（小時） 血漿暴露量 (nM)
生物檢定 免疫檢定
0 N/A N/A
7 6.9±2.0 16.7±6.7
24 32.6±3.5 71.0±8.9
48 55.5±2.4 111.9±16.4
72 45.3±4.0 95.7±9.7
96 42.3±14.5 86.8±6.8
120 26.5±6.9 58.1±14.2
數值代表取自每組每時間點3隻動物的數據之平均值±SEM 大鼠 PK
在Sprague-Dawley大鼠中評估化合物2的藥物動力學參數。為判定藥物動力學參數（表28），使用來自在給藥後0、24、48、72、144、216、312、408、及504小時所收集之樣本的經生物檢定判定之暴露量。 表 28 ：在 Sprague-Dawley 大鼠中之化合物 2 的藥物動力學參數
參數 皮下 靜脈內
C max(nM) 5.7±2.1 N/A
T max（小時） 64.0±13.9 N/A
AUC 0-∞（nM*小時） 456±154 865±185
t 1/2（小時） 38.5±12.8 26.2±6.2
數據係平均值+/-標準差，暴露量生物檢測 石蟹獼猴 PK
在石蟹獼猴中評估化合物2之藥物動力學參數。以6.45 nmol/kg對動物i.v.或s.c.給藥。為判定藥物動力學參數（表29），使用來自在給藥後0、1、6、24、48、72、120、240、336、432、及528小時所收集之樣本的經生物檢定判定之暴露量。 表 29 ：在石蟹獼猴中之化合物 2 的藥物動力學參數
參數 皮下 靜脈內
C max(nM) 89.1±8.7 N/A
T max（小時） 56.0±13.9 N/A
AUC 0-∞（nM*小時） 11,700±1380 14,700±5260
t 1/2（小時） 51.9±6.2 55.9±41.7
數值代表平均值±標準差
所屬技術領域中具有通常知識者將領會的是，能夠對以上所述的實施例進行變更而不違背其廣義的發明概念。因此，應了解本發明並未受限於揭示之具體實施例，而是意欲涵蓋如本實施方式所定義之屬於本發明之精神及範疇內的修改。
本文中所引用之全部文件均以引用方式併入本文中。
前述發明內容以及下文中本申請案之較佳實施例的實施方式在結合附圖閱讀時可更有利理解。然而應理解的是，本申請案並不受限於圖式中所示確切實施例。
圖 1 ：顯示根據本發明之一實施例的通用肽-mAb接合策略。 X代表引入治療肽側鏈上的親電子劑，諸如溴乙醯胺或順丁烯二醯亞胺，該親電子劑與經工程改造至半衰期延長mAb之CDR中的Cys殘基的巰基位點特異性反應，以在治療肽與mAb之間建立共價鍵結。
圖 2 ：在PH9H5_VH (SEQ ID NO:4)及PH9L3_VL (SEQ ID NO:3)中經選定以供取代之CDR殘基彙總。經Cys取代之殘基係以粗體且畫底線表示。
圖 3 ：顯示化合物1 (SEQ ID NO:2)之結構。
圖 4 ：化合物1在DIO小鼠中之藥物動力學。
圖 5 ：化合物1在石蟹獼猴中之藥物動力學。
圖 6 ：化合物1處理之DIO小鼠之攝食量：急性給藥。
圖 7 ：用化合物1處理之DIO小鼠的重量減輕：急性給藥。
圖 8 ：化合物1處理之DIO小鼠之攝食量：慢性給藥。
圖 9 ：用化合物1處理之DIO小鼠的重量減輕：慢性給藥。
圖 10 ：顯示根據本發明之實施例產生單株抗體調酸素(oxyntomodulin) (mAb-OXM)化合物的反應方案。頂部反應係在mAb（例如MSCB97）之Cys102處的雙硫鍵還原。底部反應係還原mAb與OXM肽變體之接合。R係半胱胺酸或麩胱甘肽。MSCB97重鏈上之Cys102係與側翼(flanking)胺基酸以其單字母代碼顯示。OXM係指肽變體之胺基酸部分。顯示出Aib2、Lys30及溴乙醯化短鏈聚乙二醇(dPEG)12間隔物。mAb之His1係以單字母代碼顯示。
圖 11 ：顯示化合物2 (SEQ ID NO:27)之結構。
圖 12 ：顯示展現出化合物2於人類血漿中之168小時內功能穩定性的圖。OXM肽類似物mAb接合物化合物2▲、對照1（先前已在離體人類血漿中證明為穩定）♦、對照2（先前已在離體人類血漿中證明為不穩定）●和○、及額外OXM肽類似物mAb接合物化合物3（與H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRARDFVEWLLNK-(COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) 12NHCOCH 2Br)-NH 2(SEQ ID NO: 25)接合之mAb）▼和化合物4（與H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRARDFVEWLLNTK-(COCH 2CH 2(OCH 2CH 2) 12NHCOCH 2Br)-NH 2(SEQ ID NO: 26)接合之mAb）▼隨時間（以小時(hr)計）在X軸上的經正規化至時間零(t=0)之剩餘百分比。
圖 13 ：顯示展現出化合物2於猴血漿中之168小時內功能穩定性的圖。化合物2▲、對照1（先前在離體人類血漿中證明為穩定）♦、對照2（先前在離體人類血漿中證明為不穩定）●和○、及額外OXM肽類似物mAb接合物化合物3▼和化合物4▼隨時間（以小時(hr)計）在X軸上的經正規化至時間零(t=0)之剩餘百分比。
圖 14 ：顯示展現出用化合物2處理之石蟹獼猴之攝食量變化%的圖。
圖 15 ：顯示展現出用化合物2處理之石蟹獼猴之體重變化%的圖。
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Claims (41)

  1. 一種醫藥組成物，包含： a. 接合物；以及 b. 醫藥上可接受之載劑； 其中該接合物包含： a. 單株抗體，其中該單株抗體包含分別具有SEQ ID NO: 16、17、18、19、20及21之多肽序列的重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2及LCDR3；以及 b. 至少一藥理活性部份； 其中該醫藥組成物係固體醫藥組成物。
  2. 如請求項1之醫藥組成物，其中該單株抗體包含具有SEQ ID NO:12之多肽序列的重鏈可變域(VH)、及具有SEQ ID NO:14之多肽序列的輕鏈可變域(VL)。
  3. 如請求項2之醫藥組成物，其中該單株抗體進一步包含Fc部分。
  4. 如請求項3之醫藥組成物，其中該單株抗體包含具有SEQ ID NO:13之多肽序列的重鏈(HC)、及具有SEQ ID NO:15之多肽序列的輕鏈(LC)。
  5. 如請求項1之醫藥組成物，其中該藥理活性部份係治療肽。
  6. 如請求項5之醫藥組成物，其中該治療肽係於SEQ ID NO:18之多肽序列之半胱胺酸殘基接合至該單株抗體。
  7. 如請求項5之醫藥組成物，其中該治療肽係藉由連接子接合至該單株抗體。
  8. 如請求項7之醫藥組成物，其中該連接子包含肽連接子、烴連接子、聚乙二醇(PEG)連接子、聚丙二醇(PPG)連接子、多醣連接子、聚酯連接子、或由PEG及埋置雜環所組成之混合連接子。
  9. 如請求項5之醫藥組成物，其中該治療肽係選自調酸素、類升糖素肽1 (GLP1)、毒蜥外泌肽、澱粉素、α-黑色素細胞刺激素(MSH)、古柯鹼及安非他命調控之轉錄物(CART)、神經肽Y受體Y1 (NPY1)拮抗劑、神經肽Y受體Y5 (NPY5)拮抗劑、神經調壓素S、神經肽B、神經肽W、飢餓肽、鈴蟾肽樣受體3 (BRS3)、甘丙胺素、膽囊收縮素(CCK)、食慾素、黑色素濃縮激素(MCH)、催產素、及壓克肽所構成之群組。
  10. 如請求項9之醫藥組成物，其中該治療肽係包含SEQ ID NO: 24之多肽序列之調酸素。
  11. 如請求項1之醫藥組成物，其中該固體醫藥組成物係冷凍乾燥或噴霧乾燥組成物。
  12. 如請求項11之醫藥組成物，其中該固體醫藥組成物係選自錠劑、囊劑、糖衣錠、粉劑、顆粒劑、口含錠、或重構用粉劑所構成之群組。
  13. 如請求項12之醫藥組成物，其中該錠劑係壓製錠、包衣錠、或膠囊。
  14. 一種如請求項1至13中任一項之醫藥組成物用於製備在有需要之個體中減少攝食或治療疾病或病症之藥物之用途，其中該疾病或病症係選自肥胖、第II型糖尿病、代謝症候群、胰島素抗性、葡萄糖耐受不良、高血糖症、高胰島素血症、高三酸甘油酯血症、異常血脂症、動脈粥樣硬化、糖尿病腎病變、高血壓、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、和非酒精性脂肪肝炎(NASH)所構成之群組。
  15. 如請求項14之用途，其中該醫藥組成物係與至少一額外治療劑組合投予。
  16. 如請求項15之用途，其中該額外治療劑係類升糖素肽-1受體調節劑。
  17. 如請求項14之用途，其中該醫藥組成物係與利拉魯肽或度拉魯肽組合投予。
  18. 一種醫藥組成物用於製備在有需要之個體中減少攝食或治療疾病或病症之藥物之用途， 其中該疾病或病症係選自肥胖、第II型糖尿病、代謝症候群、胰島素抗性、葡萄糖耐受不良、高血糖症、高胰島素血症、高三酸甘油酯血症、異常血脂症、動脈粥樣硬化、糖尿病腎病變、高血壓、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、和非酒精性脂肪肝炎(NASH)所構成之群組； 其中該醫藥組成物包含接合物，其包含： a. 單株抗體，其中該單株抗體包含具有SEQ ID NO:12之多肽序列的重鏈可變域(VH)、及具有SEQ ID NO:14之多肽序列的輕鏈可變域(VL)；以及 b. 至少一藥理活性部份； 以及醫藥上可接受之載劑。
  19. 如請求項18之用途，其中該單株抗體包含Fc部分。
  20. 如請求項19之用途，其中該單株抗體包含具有SEQ ID NO:13之多肽序列的重鏈(HC)、及具有SEQ ID NO:15之多肽序列的輕鏈(LC)。
  21. 如請求項18之用途，其中該藥理活性部份係一治療肽。
  22. 如請求項21之用途，其中該治療肽係於SEQ ID NO:18之多肽序列之半胱胺酸殘基接合至該單株抗體。
  23. 如請求項21之用途，其中該治療肽係藉由連接子接合至該單株抗體。
  24. 如請求項23之用途，其中該連接子包含肽連接子、烴連接子、聚乙二醇(PEG)連接子、聚丙二醇(PPG)連接子、多醣連接子、聚酯連接子、或由PEG及埋置雜環所組成之混合連接子。
  25. 如請求項21之用途，其中該治療肽係選自調酸素、類升糖素肽1 (GLP1)、毒蜥外泌肽(艾塞那肽(exenatide))、澱粉素(普蘭林肽(pramlintide))、α-黑色素細胞刺激素(MSH)、古柯鹼及安非他命調控之轉錄物(CART)、神經肽Y受體Y1 (NPY1)拮抗劑、神經肽Y受體Y5 (NPY5)拮抗劑、神經調壓素S、神經肽B、神經肽W、飢餓肽、鈴蟾肽樣受體3 (BRS3)、甘丙胺素、膽囊收縮素(CCK)、食慾素、黑色素濃縮激素(MCH)、催產素、及壓克肽所構成之群組。
  26. 如請求項25之用途，其中該治療肽係包含SEQ ID NO: 24之多肽序列之調酸素。
  27. 如請求項18之用途，其中該醫藥組成物係與至少一額外治療劑組合投予。
  28. 如請求項27之用途，其中該額外治療劑係類升糖素肽-1受體調節劑。
  29. 如請求項18之用途，其中該醫藥組成物係與利拉魯肽或度拉魯肽組合投予。
  30. 一種醫藥組成物用於製備在有需要之個體中減少攝食或治療疾病或病症之藥物之用途， 其中該疾病或病症係選自肥胖、第II型糖尿病、代謝症候群、胰島素抗性、葡萄糖耐受不良、高血糖症、高胰島素血症、高三酸甘油酯血症、異常血脂症、動脈粥樣硬化、糖尿病腎病變、高血壓、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、和非酒精性脂肪肝炎(NASH)所構成之群組； 其中該醫藥組成物包含接合物，其包含： a. 單株抗體，其中該單株抗體包含分別具有SEQ ID NO: 16、17、18、19、20及21之多肽序列的重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、及輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2及LCDR3；以及 b. 二相異藥理活性部份； 以及醫藥上可接受之載劑。
  31. 如請求項30之用途，其中該單株抗體包含具有SEQ ID NO:12之多肽序列的重鏈可變域(VH)、及具有SEQ ID NO:14之多肽序列的輕鏈可變域(VL)。
  32. 如請求項31之用途，其中該單株抗體包含Fc部分。
  33. 如請求項32之用途，其中該單株抗體包含具有SEQ ID NO:13之多肽序列的重鏈(HC)、及具有SEQ ID NO:15之多肽序列的輕鏈(LC)。
  34. 如請求項30之用途，其中該二相異藥理活性部份係治療肽。
  35. 如請求項34之用途，其中該治療肽係於SEQ ID NO:18之多肽序列之半胱胺酸殘基接合至該單株抗體。
  36. 如請求項34之用途，其中該治療肽係藉由連接子接合至該單株抗體。
  37. 如請求項36之用途，其中該連接子包含肽連接子、烴連接子、聚乙二醇(PEG)連接子、聚丙二醇(PPG)連接子、多醣連接子、聚酯連接子、或由PEG及埋置雜環所組成之混合連接子。
  38. 如請求項34之用途，其中該治療肽係選自調酸素、類升糖素肽1 (GLP1)、毒蜥外泌肽(艾塞那肽)、澱粉素(普蘭林肽)、α-黑色素細胞刺激素(MSH)、古柯鹼及安非他命調控之轉錄物(CART)、神經肽Y受體Y1 (NPY1)拮抗劑、神經肽Y受體Y5 (NPY5)拮抗劑、神經調壓素S、神經肽B、神經肽W、飢餓肽、鈴蟾肽樣受體3 (BRS3)、甘丙胺素、膽囊收縮素(CCK)、食慾素、黑色素濃縮激素(MCH)、催產素、及壓克肽所構成之群組。
  39. 如請求項30之用途，其中該醫藥組成物係與至少一額外治療劑組合投予。
  40. 如請求項39之用途，其中該額外治療劑係類升糖素肽-1受體調節劑。
  41. 如請求項30之用途，其中該醫藥組成物係與利拉魯肽或度拉魯肽組合投予。
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