CN103429616B - 结合人胶原ii的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对人胶原II的抗体、编码人胶原II抗体或其片段的多肽和多核苷酸、以及制备和使用前述物质的方法。

Description

结合人胶原II的抗体
技术领域
本发明涉及针对人胶原II的抗体、编码人胶原II抗体或其片段的多肽和多核苷酸、以及制备和使用前述物质的方法。
背景技术
造成关节内软骨破坏的疾病和病症提出了一个重大的公共卫生问题，特别是考虑到老年人群的人口统计数据。在诸如类风湿性关节炎(RA)和骨关节炎(OA)等关节炎中，在关节软骨的退化中涉及多种机理。RA是炎症性关节炎的最常见形式，其影响3％的女性和1％的男性。OA(一种非炎症性关节炎)是关节病的最常见形式，并且是仅次于心血管疾病的提前退休和失能原因。
大多数对关节疾病的治疗通常是全身性的。使药物局部地靶向关节将具有几个优点：增加的效力、减少的副作用、改善的定量给药方案和降低的货品成本。
当前的局部治疗(包括糖皮质激素、可注射的透明质酸溶液、NSAID或其它小分子)在被注射进关节中以后具有相对较短的半衰期以及全身分布(Gerwin等人，Adv DrugDeliv Rev，58：226-42，2006；Lindenhayn等人，Eur J Clin Chem Biochem，35：355-63，1997)。通过使治疗剂与关节靶向剂偶联，可以实现治疗剂的关节保留(Rothenfluh等人，Nature Materials 7：248-54，2008；WO05/097073；美国专利号7,067,144)。但是，治疗可能需要用递送媒介物(诸如脂质体)进行关节内注射，从而增加复杂性程度和磨损关节表面的可能性。
因而，需要开发另外的媒介物，用于有效地递送治疗剂并随后使其保留在关节中。
附图说明
图1.用于制备从头pIX文库的人骨架。根据Chothia进行残基编号。CDR序列标有下划线。
图2.结合人胶原II的Fab的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的序列。指示了与野生型人骨架不同的残基。X表示与野生型相比在所述序列中缺失的残基。
图3.针对人和大鼠胶原I和II的Fab的交叉反应性。
图4.抗-胶原II Fab与人软骨的结合。
图5.抗-胶原II Fab在骨关节炎的关节中的保留。*P＜0.05，**P＜0.01；相对于对照CNTO 4234。在CNTO 3631注射后10min和1小时时的计数因为太高而不能读出。
图6.抗-胶原II Fab在骨关节炎的滑液中的保留。*P＜0.05；**P＜0.01；相对于对照CNTO 4234。
发明内容
本发明的一个方面是一种分离的结合人胶原II的单克隆抗体或其片段，其包含重链可变区(VH区)和轻链可变区(VL区)，其中所述VH区包含如下所示的重链互补性决定区(CDR)1、2和3(HCDR1、HCDR2和HCDR3)序列
i. SEQ ID NO：8、14和20；
ii SEQ ID NO：9、15和21；
iii SEQ ID NO：9、15和22；
iv. SEQ ID NO：9、15和23；
v. SEQ ID NO：9、15和24；
vi. SEQ ID NO：9、15和25；
vii. SEQ ID NO：9、15和26；
viii SEQ ID NO：9、15和27；
ix. SEQ ID NO：9、15和28；
x. SEQ ID NO：10、16和29；
xi. SEQ ID NO：11、17和30；
xii SEQ ID NO：12、18和31；或
xiii SEQ ID NO：13、19和32；并且
所述VL区包含如下所示的轻链CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2和LCDR3)序列
xiv. SEQ ID NO：33、42和46；
xv. SEQ ID NO：34、42和47；
xvi. SEQ ID NO：35、43和48；
xvii SEQ ID NO：36、44和49；
xviii SEQ ID NO：37、42和50；
xix. SEQ ID NO：38、42和51；
xx. SEQ ID NO：35、44和52；
xxi. SEQ ID NO：39、42和53；
xxii SEQ ID NO：40、45和54；或
xxiii. SEQ ID NO：41、42和55。
本发明的另一个方面是一种分离的结合人胶原II的单克隆抗体或其片段，其包含VH区和VL区，其中所述VH区包含具有SEQ ID NO：56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中所示的序列的氨基酸序列，并且所述VL区包含具有SEQ ID NO：69、70、71、72、73、74、75、76、5或7中所示的序列的氨基酸序列。
本发明的另一个方面是一种分离的结合人胶原II的抗体，其包含VH区和VL区，其中所述VH区包含如SEQ ID NO：9、15和28中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，并且所述VL区包含如SEQ ID NO：39、42和53中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
本发明的另一个方面是一种分离的结合人胶原II的单克隆抗体或其片段，其包含VH区和VL区，其中所述VH区包含如SEQ ID NO：11、17和30中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，并且所述VL区包含如SEQ ID NO：34、42和47中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
本发明的另一个方面是一种分离的抗体重链可变区，其包含SEQ ID NO：56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中所示的氨基酸序列。
本发明的另一个方面是一种分离的抗体轻链可变区，其包含SEQ ID NO：69、70、71、72、73、74、75或76中所示的氨基酸序列。
本发明的另一个方面是分离的多核苷酸，其编码本发明的抗体重链可变区和抗体轻链可变区。
本发明的另一方面是一种载体，其包含至少一种本发明的多核苷酸。
本发明的另一方面是一种宿主细胞，其包含本发明的载体。
本发明的另一个方面是一种制备结合人胶原II的抗体的方法，所述方法包括：培养本发明的宿主细胞，以及回收由所述宿主细胞产生的抗体。
具体实施方式
本说明书中所引用的所有出版物(包括但不限于：专利和专利申请)均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。本文描述了示例性的组合物和方法，不过类似或等同于本文所述的组合物和方法的任何组合物和方法都可用于本发明实践或测试。
术语“抗体”包括整个抗体及其任何片段。抗体片段包含免疫球蛋白分子的至少一部分，诸如得自抗体重链或轻链的互补性决定区(CDR)、可变区、恒定区或构架区。抗体可以是Fab、F(ab)、F(ab)2、scFv、dsFv或双体。抗体可以是单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、人源化或人源性抗体、二聚抗体、四聚抗体或多聚抗体。上述抗体片段的结构、制备技术、以及所述抗体及其片段的用途本领域众所周知的(Ausubel等人编，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，NY 1987-2001；Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，NY，1989；Harlow和Lane，Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY，1989；Colligan等人编，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.，NY 1994-2001；Colligan等人，Current Protocols in Protein Science，John Wiley & Sons，NY，NY，1997-2001；Kohler等人，Nature，256：495-497，1975；Queen等人，Proc Natl Acad Sci，86：10029-33，1989；美国专利号4,816,567)。例如，鼠单克隆抗体可以由Kohler等人的杂交瘤方法(Nature 256：495-497，1975)来制造。嵌合的mAb可以通过在美国专利号4,816,567中公开的方法来制备。可以通过本领域技术人员已知的技术(例如美国专利号5,225,539所公开的技术)来制备这样的人适应mAb，其具有衍生自非人供体免疫球蛋白(通常是鼠)的CDR和其分子的衍生自一种或多种人免疫球蛋白的剩余免疫球蛋白衍生部分。可用于人适应的人构架序列可以由本领域技术人员从相关数据库选择。任选地，通过诸如在Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：10029-10032，1989和Hodgson等人，Bio/Technology，9：421，1991中公开的那些技术来掺入改变的构架支持残基以保留结合亲和力，可以进一步修饰人适应mAb。
缺乏任何非人序列的完全人单克隆抗体，可通过在例如下述文献中提到的技术从人免疫球蛋白转基因小鼠制备：Lonberg等人，Nature 368：856-859，1994；Fishwild等人，Nature Biotechnology14：845-851，1996；和Mendez等人，Nature Genetics15：146-156，1997。还可以通过在例如下述文献中提到的技术从噬菌体展示文库制备和优化人mAb：Knappik等人，J.Mol.Biol.296：57-86，2000；和Krebs等人，J.Immunol.Meth.254：67-842001。抗体的片段例如Fab、F(ab’)2、Fd和dAb片段可通过抗体的切割或者通过重组工程来产生。例如，Fab和F(ab’)2片段可通过用酶如胃蛋白酶处理抗体来产生。
免疫球蛋白可以根据重链恒定域氨基酸序列分为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步再被分为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
抗体可变区由被3个“抗原结合位点”中断的“构架”区组成。使用不同的术语来定义抗原结合位点：(i)三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)且三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)的互补性决定区(CDR)是基于序列变异性(Wu和Kabat，J.Exp.Med.132：211-250，1970；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版。PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1991)。(ii)三个在VH(H1、H2、H3)中和三个在VL(L1、L2、L3)中的“超变区”、“HVR”或“HV”，指抗体可变区中的在结构上超变的区域，如Chothia和Lesk(Chothia和Lesk，Mol.Biol.196：901-917，1987)所定义。其它术语包括“IMGT-CDR”(Lefranc等人，Dev.Comparat.Immunol.27：55-77，2003)和“特异性决定残基选择”(SDRU)(Almagro，Mol.Recognit.17：132-143，2004)。International ImMunoGeneTics(IMGT)数据库(http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。CDR、HV和IMGT描绘(delineation)之间的对应性参见Lefranc等人，Dev.Comparat.Immunol.27：55-77，2003。
“构架”或“构架序列”是可变区的除了被定义为抗原结合位点的那些序列之外的其余序列。构架通常分成四个区域FR1、FR2、FR3和FR3，它们形成每个可变区中的三个抗原结合位点的骨架。因为抗原结合位点可以由上面所述的各种术语定义，所以构架的精确氨基酸序列取决于如何定义抗原结合位点。
本文使用的术语“结合人胶原II的抗体”表示，根据在实例2中描述的方法，使用用10μg/mL人胶原II包被的平板，在ELISA测定中以1μg/ml或更小的EC50结合人胶原II的抗体。
本文使用的术语“人胶原II”或huColII表示，从软骨分离出的人II型胶原。人胶原II被合成为前胶原αCol2A1链(SEQ ID NO：79)。所述前胶原分子被分泌进细胞外基质中，在此处它形成原纤维。原纤维形成伴有特异性蛋白水解酶对C-和N-前肽的去除。原纤维hucolII的加工是众所周知的。
术语“载体”是指能够在生物系统内复制或可以在此类系统间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记之类的元件，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或保持。此类生物系统的例子可包括细胞、病毒、动物、植物和用能够复制载体的生物组分再造的生物系统。包含载体的多核苷酸可以是DNA或RNA分子或这些分子的杂合分子。
术语“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽的翻译的载体。
术语“多核苷酸”是指包含由糖-磷酸主链或其它等同的共价化学方式所共价连接的核苷酸链的分子。双链DNA和单链DNA以及双链RNA和单链RNA是多核苷酸的典型例子。
术语“多肽”或“蛋白质”是指包含至少两个由肽键连接以形成多肽的氨基酸残基的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。
本文使用如下的常规单字母和三字母氨基酸代码：
物质的组成
本发明提供了结合人胶原II的单克隆抗体。这些抗体可用作研究试剂、诊断试剂和用于例如向关节递送治疗剂的媒介物。
本发明提供了衍自人免疫球蛋白基因文库的新型抗原结合位点和免疫球蛋白链。
本发明的一个实例是分离的结合人胶原II的单克隆抗体或其片段，其包含重链可变区(VH区)和轻链可变区(VL区)，其中所述VH区包含重链互补性决定区(CDR)1、2和3(HCDR1、HCDR2和HCDR3)序列，且所述VL区包含轻链互补性决定区(CDR)1、2和3(LCDR1、LCDR2和LCDR3)序列，如表1所示。
表1
在本发明的范围内包括，具有表1所示的重链和轻链序列(SEQ ID NO：8-76)中的保守置换的抗体。所述保守置换可以位于构架区或抗原结合位点中，只要它们不会不利地影响所述抗体的性质。可作出置换以改善抗体性质，例如稳定性或亲和力。保守置换会产生这样的分子：所述分子具有与在其中做出这种修饰的那些分子类似的功能和化学特征。示例性氨基酸置换示于2表中。此外，多肽中的任何天然残基还可以用丙氨酸来置换，如此前对于丙氨酸扫描诱变所述(MacLennan等人，Acta Physiol.Scand.Suppl.643：55-67，1998；Sasaki等人，Adv.Biophys.35：1-24，1998)。氨基酸置换可以例如通过PCR诱变来进行(美国专利号4,683,195)。变体的文库可以使用众所周知的方法产生，例如使用随机(NNK)或非随机密码子，例如编码11个氨基酸(ACDEGKNRSYW)的DVK密码子。使用众所周知的方法，可以表征得到的变体与人胶原II的结合(如在实例中所述)或其它性质(诸如稳定性)。
表2
原始残基 示例性置换
Ala(A) Val，Leu，Ile
Arg(R) Lys，Gln，Asn
Asn(N) Gln
Asp(D) Glu
Cys(C) Ser，Ala
Gln(Q) Asn
Gly(G) Pro，Ala
His(H) Asn，Gln，Lys，Arg
Ile(I) Leu，Val，Met，Ala，Phe
Leu(L) Ile，Val，Met，Ala，Phe
Lys(K) Arg，Gln，Asn
Met(M) Leu，Phe，Ile
Phe(F) Leu，Val，Ile，Ala，Tyr
Pro(P) Ala
Ser(S) Thr，Ala，Cys
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr，Phe
Tyr(Y) Trp，Phe，Thr，Ser
Val(V) Ile，Met，Leu，Phe，Ala
在其它实例中，本发明提供了一种分离的结合人胶原II的单克隆抗体或其片段，其包含VH区和VL区，其中所述VH区包含具有在SEQ ID NO：56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中所示的序列的氨基酸序列，且所述VL区包含具有在SEQ ID NO：69、70、71、72、73、74、75、76、5或7中所示的序列的氨基酸序列。
尽管“实例”中所示的实例包括成对的可变区，一个来自重链，一个来自轻链，但本领域技术人员将认识到另选的实例可以包括单一重链或轻链可变区。可以使用单个可变区来筛选第二可变区，所述第二可变区能够形成双结构域特异性的抗原结合片段，后者能够例如结合人胶原II。所述筛选可以通过噬菌体展示筛选方法来完成，其中使用例如在国际公开号WO92/01047中公开的分级双重组合方案。在此方法中，包含H或L链克隆的单个菌落被用来感染编码另一链(L或H)的克隆的完全文库，所得的二链特异性抗原结合域根据所描述的噬菌体展示技术来选择。
在另一个方面，本发明提供了分离的抗体重链和轻链，其中所述重链包含在SEQID NO：56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中所示的氨基酸序列，且所述轻链包含在SEQ ID NO：69、70、71、72、73、74、75、76、77、78和79中所示的氨基酸序列。
本发明的另一方面是分离的多核苷酸，其编码本发明抗体的任一种或它们的互补序列。本文公开了某些示例性的多核苷酸，但是，鉴于在给定表达系统中的遗传密码简并性或密码子优先性而编码本发明抗体的其它多核苷酸也在本发明的范围内。通过众所周知的方法，制备编码本发明抗体的多核苷酸。这些方法包括，但不限于：从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)，或通过寡核苷酸介导的(或定位)诱变、PCR诱变和化学基因合成来制备。
示例性的本发明抗体可以属于IgG、IgD、IgE、IgA或IgM同种型。另外，本发明的抗体可以通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(诸如添加聚乙二醇(PEG)部分(聚乙二醇化)和脂质化)等过程进行翻译后修饰。这种修饰可在体内或体外出现。例如，本发明的抗体可以与聚乙二醇缀合(聚乙二醇化)以改善其药动学性质。缀合可以通过本领域技术人员已知的技术来执行。已经证实，治疗性抗体与PEG的缀合会增强药效学而不干扰功能(Deckert等人，Int.J.Cancer87：382-390，2000；Knight等人，Platelets 15：409-418，2004；Leong等人，Cytokine 16：106-119，2001；Yang等人，Protein Eng.16：761-770，2003)。
本发明抗体的药动学特性可以通过本领域技术人员已知的技术经由Fc修饰来增强。抗体的“Fc”不直接参与抗体对抗原的结合，但是显示出多种效应子功能。抗体“Fc”是熟知的术语，并且基于抗体的木瓜蛋白酶裂解来定义。抗体的Fc直接参与ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和基于补体激活的CDC(补体依赖性细胞毒性)、C1q结合和Fc受体结合。补体激活(CDC)通过补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的Fc的结合而启动。尽管抗体对补体系统的影响依赖于某些条件，与C1q的结合是由Fc中的确定结合位点造成。这样的结合位点是在现有技术中已知的，且参见：例如，Boakle等人，Nature 282：742-43，1979；Lukas等人，J.Immunol.127：2555-60，1981；Brunhouse和Cebra，Mol.Immunol.16：907-17，1979；Burton等人，Nature 288：338-44，1980；Thommesen等人，Mol.Immunol.37：995-1004，2000；Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-84，2000；Hezareh等人，J.Virology 75：12161-68，2001；Morgan等人，Immunology 86：319-24，1995；EP 0307434。这样的结合位点是，例如，L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引进行编号)。亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常显示出补体激活和C1q结合，而IgG4不会激活补体系统且不会结合C1q。
本发明的抗体的特征在于，恒定链是人起源的。这样的恒定链是众所周知的，且被例如Kabat(参见例如Johnson和Wu，Nuc Acids Res.28，214-18，2000)描述过。例如，一种有用的人重链恒定区包含SEQ ID NO：77。例如，一种有用的人轻链恒定区包含SEQ ID NO：78的κ-轻链恒定区的氨基酸序列。
本发明的抗体可以以小于或等于约10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11或10-12M的Kd结合人胶原II。使用任意合适的方法，可以实验性地确定抗体与人胶原II的亲和力。这类方法可以采用本领域技术人员已知的Biacore或KinExA仪器、ELISA或竞争结合分析。
本发明的另一实例是包含至少一个本发明多核苷酸的载体。本发明的重链和轻链可变结构域与启动子序列、翻译起始序列、恒定区序列、3′非翻译区序列、聚腺苷酸化序列和转录终止序列相组合，以形成表达载体构建体。重链和轻链表达构建体可以组合在单个载体中，将其共转染、连续转染或分别转染进宿主细胞中，然后将所述宿主细胞融合，以形成表达两条链的单个宿主细胞。
本发明的另一个实例是包含本发明载体的宿主细胞。这类宿主细胞可以是真核细胞、细菌细胞、植物细胞或古菌细胞。示例性真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽类或其它动物来源。哺乳动物真核细胞包括永生细胞系，例如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，如SP2/0(美国模式培养物保藏所(ATCC)，Manassas，VA，CRL-1581)、NS0(欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)，Salisbury，Wiltshire，UK，ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL-1646)和Ag653(ATCC CRL-1580)鼠细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是U266(ATTC CRL-TIB-196)。其它可用的细胞系包括衍生自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的那些细胞系，例如CHO-K1SV(Lonza Biologics，Walkersville，MD)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。
本发明的另一个实例是一种制备结合人胶原II的抗体的方法，所述方法包括：培养本发明的宿主细胞，和回收由所述宿主细胞生产的抗体。制造抗体并将其纯化的方法是本领域公知的。
本发明的用途
本发明的抗体可用作研究试剂，和用作治疗性分子向表达人胶原II的部位(诸如关节)的递送剂。
关节炎(包括骨关节炎、类风湿性关节炎、由损伤引起的关节炎的关节等)是将受益于抗炎蛋白和治疗性分子的局部递送和关节保留的常见炎性病症。
治疗性分子可以与本发明的抗体偶联，以改善关节保留。治疗性分子可以是蛋白或化学化合物。示例性的治疗性分子是：生长因子、细胞因子和抗炎剂、诱导胶原的生长和修复的蛋白质、以及抑制关节组织的蛋白水解性破坏的小分子。通过使用众所周知的重组方法制备融合蛋白质，可以使治疗性蛋白与本发明的抗-胶原抗体或其片段偶联。例如，通过酰胺键或肽接头，可以使治疗性蛋白的N-端与本发明抗体的C-端直接连接。示例性的融合构建体在例如美国专利号5116964、美国专利号5709859、国际公开号WO04/002417和WO05/081687中已有描述。使用本领域众所周知的化学交联，例如使用腙或缩氨基脲连接，也可以使治疗性分子与本发明的抗体偶联。
具有任选地偶联的治疗性分子的本发明抗体可以制备成药物组合物，其含有在药学上可接受的载体中的有效量的治疗性分子作为活性成分。术语“载体”是指据以施用该活性化合物的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类药物媒介物可以是液体，例如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，如，花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等等。例如，可以使用0.4％生理盐溶液和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，通常不含颗粒物质。它们可通过常规的公知的灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可按需含有药物可接受的辅助物质以模拟生理条件，如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。本发明的物质在这种药物组合物中的浓度可变动很大，即从小于约0.5％、通常为或至少约1％到高达15或20％(以重量计)，且将根据所选择的具体施用方式主要基于所需的剂量、流体体积、粘度等进行选择。用于制备可肠胃外施用的组合物的方法是众所周知的，且更详细地描述在，例如，“Remington′s Pharmaceutical Science”，第15版，Mack PublishingCompany，Easton，PA。
可以将本发明的抗体低压冻干用于贮存，并在使用前在合适的载体中重构。已证实此技术对常规免疫球蛋白和蛋白制备有效，并且可以采用本领域已知的低压冻干法和复原技术。
本发明现结合以下具体的、非限制性实例进行描述。
实例1
结合胶原II的mAb的鉴别
结合人胶原II的Fab选自从头pIX噬菌体展示文库(Shi等人，J.Mol.Biol.397：385-396，2010；WO2009085462A1；美国系列号US201012/546850)。通过使人种系VH基因IGHV1-69*01、IGHV3-23*01和IGHV5-51*01和人种系VLκ基因O12(IGKV1-39*01)、L6(IGKV3-11*01)、A27(IGKV3-20*01)和B3(IGKV4-1*01)多样化，产生所述文库。为了装配完整的VH和VL结构域，使IGHV基因经由H3环与人IGHJ-4微基因重组，并使IGKV基因与IGKJ-1微基因重组。选择在H1、H2、L1、L2和L3环周围的重链和轻链可变区中的位置用于多样化，所述位置与被鉴别为经常与蛋白和肽抗原接触的位置相对应。在选定位置处的序列多样性限于在各个IGHV或IGLV基因的IGHV或IGLV种系基因家族的每个位置处出现的残基。通过使用长度为7-14个氨基酸的短至中等大小的合成环，产生在H3环处的多样性。设计在H3处的氨基酸分布，以模仿在人抗体中观察到的氨基酸变异。文库设计详见：Shi等人，J.Mol.Biol.397：385-396，2010。制备的VH H1和H2的文库中的多样性显示在表4中，H3的文库中的多样性显示在表4中，VL L1、L2和L3的文库中的多样性显示在表5中。根据它们的人VH和VL种系基因起源，命名用于制备文库的骨架。用于多样化的构建的VH和VL骨架的序列显示在SEQ ID NO：1-7中(3-23：SEQ ID NO：1；1-69：SEQ ID NO：2；5-51：SEQ ID NO：3；O12：SEQ ID NO：4；L6：SEQID NO：5；L27：SEQ ID NO：6；B3：SEQ ID NO：7)(图1)。将3个重链文库与4个种系轻链或种系轻链文库相组合，以产生24个独特的VH:VL组合用于筛选。
表3
*根据Kabat进行残基编号
使用以10μg/mL在1x胶原稀释缓冲液(Chondrex)中涂布在Maxisorp平板(Nunc)上的纯化的人胶原II(Chondrex，#2015，用3M胍、DEAE-纤维素和0.5mg/mL的Na2HPO4在0.05M醋酸中的溶液处理过)，淘选文库。用在TBST中的3％奶，在室温封闭所述文库1小时。将100μl每个文库与重链组合，以产生6个HV:HL文库对，并应用于预封闭(在3％的奶在TBST中的溶液中预封闭1小时)的人胶原II包被的平板。温育1h以后，分别在TBST和PBS中洗涤孔各5次。将200μL MC1061F’细胞(OD600～1.0)加到孔上在37℃保持30分钟，然后将受感染的细胞铺板在2xYT(Carb/Glu)平板上，并在37℃放置过夜。从所述平板上刮下已经培养过夜的菌落到每个平板2mL的2xYT(Carb/Glu/20％甘油)中。使用50ml再悬浮的细菌接种在2xYT(Carb)中的20mL培养物，将剩余的细菌冷冻。将所述培养物在37℃培养至OD6000.5-1.0，然后以大约10∶1的感染复数将1mL辅助噬菌体VCSM13(Stratagene，目录号200251)加入所述培养物中，并在没有摇动下在37℃温育30分钟。将卡那霉素和IPTG加入所述培养物中，并在30℃培养过夜。用2％PEG/0.25M NaCl沉淀出噬菌体，并再悬浮于1ml PBS中。使用1/5的PEG-沉淀的噬菌体开始下一轮淘选，将剩余的噬菌体在-20℃保存。
表4
H3长度 密码子构型2
7 A，(NNS)×3，F/L，D，Y
8 A，(NNS)×4，F/L，D，Y
9 A，B×5，F/L，D，Y
10 A，B×6，F/L，D，Y
11 A，B×6，(B+BY)×1，F/L，D，Y
12 A，B×4，(B+BY)×4，F/L，D，Y
13 A，B×6，(B+BY)×3，F/L，D，Y
14 A，B×6，(B+BY)×4，F/L，D，Y
根据Kabat等人进行编号
2 密码子碱基组成[A-C-G-T]
A：位置1＝[15-15-68-2]
位置2＝[43-11-33-13]
位置3＝[2-29-24-45]
B：位置1＝[19-14-41-26]
位置2＝[28-25-33-14]
位置3＝[0-34-36-30]
B+BY：在该位置设置的混合引物。BY含有连续替代这些位置中的B密码子的酪氨酸密码子(TAT)，且与含有B密码子的引物以1∶7的比例混合。因此，就含有1个(B+BY)密码子的CDR长度11而言，使用2个引物。一个具有在该位置处的TAT密码子，第二个具有B密码子，且这些以1∶7的比例混合。就CDR长度13而言，3个(B+BY)密码子需要4个引物，一个具有B密码子，3个具有在3个位置中的每个位置处的TAT密码子和在剩余2个位置处的B密码子。在该情况下，TAT引物与完全B密码子引物以1∶1∶1∶7的比例混合。类似地，用5个引物制备CDR-12和CDR-14。
将所述选择循环重复4次。在最后一个选择循环以后，将菌落刮入2mL 2xYT Carb/Glu/20％甘油中，并使用100μL细胞混悬液来分离质粒DNA。通过Nhe1/SpeI消化，切离pIX，并使分离的DNA自连接。连接以后，将所述DNA电穿孔进电感受态的MC1061F’细胞中，并在2xYTCarb/Glu上铺板为单个菌落。
表5
*根据Kabat进行残基编号
实例2
胶原II mAb与其它胶原的交叉反应性
关于与人胶原I、IV和V和大鼠胶原I和II的交叉反应性，筛选从初次淘选得到的结合人胶原II的Fab。
Fab裂解物的制备
从pIX-切离的转化体挑选菌落，并在2xYT Carb中培养。次日，使用50μL饱和的培养物接种含有400μL/孔的2xYT Carb的表达板，并将所述板在37℃培养6小时。通过加入1mMIPTG，诱导Fab表达，并将所述板在30℃放置过夜。次日，将诱导的Fab培养物在2000rpm离心10分钟，将澄清的裂解物用于后续测定中。
ELISA
根据生产商的说明书，用10μg/ml的人胶原I(Chondrex)、人胶原II(Chondrex)、大鼠胶原I(Chondrex)、大鼠胶原II(Chondrex)，或用5μg/ml的人胶原IV(Chemicon)或人胶原V(Chemicon)，或用1μg/ml的抗-Fd(the Binding Site)，它们都在PBS中，包被MaxisorpELISA平板(Nunc)。在TBST中洗涤孔3次，并用200μL在TBST中的3％奶封闭1小时。将100μLFab裂解物加到包被的ELISA平板的孔上，并在室温温育1小时。将所述孔洗涤3次，随后加入100μL在PBS中的1∶5000稀释的抗-κ-HRP(Southern Biotech)。将所述平板在室温温育1小时，用TBST洗涤3次，并用BM化学发光ELISA底物(Roche Applied Science)显影。将与人和大鼠胶原II结合、而不与人胶原I、IV或V或大鼠胶原I结合的克隆测序，并进一步表征独特的克隆。图3显示了为进一步表征选择的13个克隆的ELISA数据。Fab的序列显示在图2和表1中。
实例3
胶原II mAb结合人软骨
小规模Fab纯化
在30℃用1mM IPTG诱导在2xYT Carb(除了将TurboBroth(Athena ES)用于表达Fab551-3以外)中的大肠杆菌的Fab表达过夜。将诱导的细菌在4500rpm离心30min，将细胞沉淀物再悬浮于含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(20mM Tris，pH8.5，350mM NaCl，7.5mM咪唑)中，并通过穿过微射流机2次进行破碎。通过在10,000rpm离心10分钟2次，澄清细胞裂解物。用裂解缓冲液平衡Talon树脂(Clontech)，并将2mL加入澄清的裂解物中。通过使用洗脱缓冲液(150mM EDTA，20mM Tris，pH8.5)温育2次各5分钟，洗脱结合的Fab，并在20mM Tris(pH8.5)中透析。使用Q-sepharose Fast Flow树脂(QFF树脂；GE Healthcare)，进一步纯化透析的Fab，并用于实验。
软骨-结合测定
从骨关节炎患者得到人软骨(Northland Laboratories)。首先将所述软骨粉末化，并作为在含有蛋白酶抑制剂的PBS中的混悬液在4℃保存。为了试验软骨结合，将每个数据点的2.5μL软骨混悬液加入97.5μL含有3％奶的TBST中，并将所述混合物在室温离心1小时。使用真空管汇，使用MultiScreen HTS板(Millipore)，试验Fab与软骨的结合。简而言之，将100μL混悬液加入预湿的MultiScreen板中，并施加真空，以将软骨沉积在孔滤器上，此后用TBST洗涤孔2次。将2.4μg每种Fab(在100μL PBS中)加入孔中，并在室温温育1小时。用TBST洗涤孔3次，并将抗-κ-HRP(Southern Biotech)加到孔上。温育1小时以后，在PBST中洗涤孔，加入BM化学发光ELISA底物(Roche Applied Science)，并将得到的软骨碎片混悬液转移至黑孔ELISA板用于发光检测。所有13种Fab表现出软骨结合(图4)。
实例4
mAb对胶原II的亲和力
ELISA
使用如上所述的ELISA测定，得到选定的Fab的EC50值。在所述测定中，在10ng/ml-10μg/ml的浓度范围，将100微升每种Fab加到孔上。EC50值显示在表6中。
Biacore
使用针对人和大鼠胶原II的标准方法，进行Biacore结合动力学(表6b)。
表6a
Fab EC50(ng/ml)
551-3 113.5
323-G1 123.1
169-31 113.1
表6b
实例5
抗-胶原II mAb在体内保留在关节中
将2种抗-胶原II Fab(323-G1(CNTO 3631)和169-31(CNTO 4093)和1种不结合细胞外基质组分的对照mAb(CNTO 4234)碘化，并注射进切除半月板的(menisectomized)大鼠的膝中，以评价mAb与胶原的结合对关节停留时间的影响。使用Na125I(Perkin Elmer)和Iodo-GEN试管(Pierce)，将Fab放射性标记。使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)，除去游离碘，并使用Amicon Ultra离心过滤机装置(Millipore；10,000MWCO)，将Fab浓缩至2.2mg/mL。碘化以后，试验Fab与胶原II的结合，没有观察到由碘化导致的显著损伤。
将32只雄性Sprague-Dawley大鼠的右侧和左侧后肢进行关节盘横断。用2-4％异氟烷麻醉剂麻醉大鼠，并将内侧副韧带横断，并切割关节盘，以模拟撕裂损伤。模拟骨关节炎的关节损伤在接下来的3周中形成。手术后21天，向关节内注射125I-标记的Fab。通过向右侧和左侧膝关节中的5μl关节内注射，给动物施用11μg试验物。在4个时间点(注射后10min、1小时、6小时和24小时)将动物安乐死，从双膝收集滑液灌洗物和膝关节。从每个样品测量放射性。将每分钟的计数(cpm)与各种Fab的未注射剂量的值进行对比，以计算保留百分比(例如作为注射剂量的百分比)。323-G1(CNTO 3631)和169-31(CNTO 4093)在膝关节(图5)和滑液(图6)中的保留时间长于对照抗体。在注射后6和24小时，分别有大约60％和32％的Fab323-G1、60％和18％的Fab169-31保留在膝中(合并的关节和滑液保留)。对照Fab保留了17％和5％。因而，本发明的抗体由于它们与固有关节蛋白的结合而表现出增加的关节保留。

Claims (9)

1.一种分离的结合人胶原II的抗体或其片段，包含VH区和VL区，其中所述VH区包含如SEQ ID NO: 9、15和28中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，并且所述VL区包含如SEQ IDNO: 39、42和53中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
2.一种分离的结合人胶原II的单克隆抗体或其片段，包含VH区和VL区，其中所述VH区包含如SEQ ID NO: 11、17和30中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，并且所述VL区包含如SEQ ID NO: 34、42和47中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
3.一种分离的结合人胶原II的单克隆抗体或其片段，包含VH区和VL区，
其中所述VH区由SEQ ID NO: 64中所示的氨基酸序列组成，并且所述VL区由SEQ IDNO: 75中所示的氨基酸序列组成；或
其中所述VH区由SEQ ID NO: 66中所示的氨基酸序列组成，并且所述VL区由SEQ IDNO: 5中所示的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包含Fab片段。
5.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码
SEQ ID NO: 64的抗体重链可变区和SEQ ID NO: 75的抗体轻链可变区；或
SEQ ID NO: 66的抗体重链可变区和SEQ ID NO: 5的抗体轻链可变区。
6.一种载体，包含至少一种权利要求5的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，包含权利要求6的载体。
8.一种制备结合人胶原II的抗体的方法，包括：培养权利要求7的宿主细胞，以及回收由所述宿主细胞产生的抗体。
9.权利要求1-4中任一项的分离的抗体在制备向关节递送治疗剂的媒介物中的用途。
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