CN106632674A - 一种抗pd-1单克隆抗体、其药物组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及一种抗PD-1抗体、其药物组合物及其用途。具体地，本发明涉及一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体的重链可变区包含：氨基酸序列为SEQ ID NO:13－15的CDR；和/或所述单克隆抗体的轻链可变区包含：氨基酸序列为SEQ ID NO:16－18的CDR。本发明的单克隆抗体能够很好地特异性与PD-1结合，特异地解除PD-1对机体免疫抑制，激活T淋巴细胞。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，涉及一种抗PD-1抗体、其药物组合物及其用途。具体地，本发明涉及一种抗PD-1的单克隆抗体。
背景技术
跨膜受体PD-1(programmed cell death 1，程序性细胞死亡因子1)是CD28基因家族成员之一，在活化的T细胞，B细胞以及骨髓系细胞都有表达。PD-1的配体PDL-1和PDL-2均属于B7超家族，其中PDL-1多种细胞都有表达，包括T细胞，B细胞以及内皮细胞和上皮细胞，PDL-2则仅表达于抗原呈递细胞如树突状细胞和巨噬细胞。
T细胞对清除病毒感染起着非常重要的作用，但T细胞抗病毒反应通常与免疫病理相关。PD-1在负调节T细胞的活化过程中起着非常重要的作用，PD-1介导的对T细胞负调节作用可减少促感染过程引起的组织损伤，但是阻断或抑制PD-1的负调节作用可导致自身免疫性疾病，例如，PD-1基因敲除小鼠能更有效的清除胰腺病毒感染，但是却导致了更严重的肝脏损伤(Isai et al.,2003,J.Exp.Med.198:39-50)。另外，高表达PD-1的肿瘤伴随着很难被检测到的癌症(Hamanishi et al.,2007,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:3360-5)。一种实施有效的方法是通过体内注射抗体对PD-1的表达进行调控。
由于PD-1抗体的广谱抗肿瘤前景和惊人的药效，业界普遍认为针对PD-1通路的抗体将带来治疗多种肿瘤治疗的突破性的进展：用于治疗非小细胞性肺癌，肾细胞癌，卵巢癌，黑色素瘤(Homet M.B.,ParisiG.,et al.,Anti-PD-1 Therapy in Melanoma.Semin Oncol.2015Jun；42(3):466-473)，白血病以及贫血病(Held SA,Heine A,et al.,Advances in immunotherapy of chronic myeloid leukemia CML.CurrCancer Drug Targets.2013 Sep；13(7):768-74)。
在2012年和2013年的美国癌症协会(AACR)年会以及美国临床肿瘤协会(ASCO)年会上揭晓的前所未有的临床药效数据后，抗PD-1抗体已成为全球制药行业最炙手可热的在研新药靶点。
目前，尚需要开发新的具有更好的结合效率的抗PD-1抗体，以有效地阻断PD-1与PDL-1的结合。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，利用哺乳动物细胞表达系统表达出重组的PD-1作为抗原免疫小鼠，经小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。发明人通过进行对大量样本的筛选，得到了如下的杂交瘤细胞株：杂交瘤细胞株LT004，其于2015年8月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2015132。
本发明人惊奇地发现，杂交瘤细胞株LT004能够分泌产生与PD-1特异性结合的特异性单克隆抗体(命名为6F5)，并且该单克隆抗体能够十分有效地阻断PD-1与PDL-1的结合。
进一步地，本发明人通过人工表达制得了6F5(命名为6F5(Re))，并创造性地制得了抗PD-1的人源化抗体(分别命名为6F5H1L1、6F5H2L2)。
本发明人还惊奇地发现，本发明的抗体6F5/6F5(Re)、6F5H1L1、6F5H2L2能有效地结合人T细胞，并且激活T细胞，诱导人淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2；具有用于制备防治肺癌、黑色素瘤、肾肿瘤、卵巢癌、白血病等癌症以及贫血病的药物的潜力。
由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述单克隆抗体的重链可变区(VH)包含：氨基酸序列为SEQ IDNO:13－15的CDR；
和/或
所述单克隆抗体的轻链可变区(VL)包含：氨基酸序列为SEQ IDNO:16－18的CDR。
根据本发明任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10；
和/或
所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12。
在本发明的一个实施方案中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体包括：
(1)如SEQ ID NO:2所示的VH和如SEQ ID NO:4所示的VL；
(2)如SEQ ID NO:6所示的VH和如SEQ ID NO:8所示的VL；
(3)如SEQ ID NO:10所示的VH和如SEQ ID NO:12所示的VL。
轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；其由Kabat等人命名，见Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition(1991),第1-3卷,NIH Publication 91-3242,Bethesda Md)。
通过本领域技术人员所熟知的技术手段，例如通过VBASE2数据库分析上面的(1)-(3)项中的单克隆抗体序列的CDR区的氨基酸序列：
本发明的抗体6F5/6F5(Re)、6F5H1L1、6F5H2L2具有相同的CDR；
其重链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
HCRD1:GFTFSSYG(SEQ ID NO:13)
HCDR2:ISGGGSDT(SEQ ID NO:14)
HCDR3:ARQLNYAWFAY(SEQ ID NO:15)；
其轻链可变区的3个CDR区的氨基酸序列如下：
LCRD1:ESVDNYGISF(SEQ ID NO:16)
LCDR2:TSS(SEQ ID NO:17)
LCDR3:QQSKEVPWT(SEQ ID NO:18)。
根据本发明任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
根据本发明任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体以小于大约100nM，例如小于大约10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM或更小的EC50结合PD-1蛋白。具体地，所述EC50通过间接ELISA方法测得。
根据本发明任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的KD结合PD-1蛋白。
根据本发明任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。
根据本发明任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是有杂交瘤细胞株LT004产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株LT004保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2015132。
本发明的另一方面涉及一种分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，其中，
所述抗体的重链可变区包含：氨基酸序列为SEQ ID NO:13-15的CDR；
具体地，所述抗体的重链具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQID NO:10所示的氨基酸序列；
更具体地，所述核酸分子具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQID NO:9所示的核苷酸序列。
本发明的再一方面涉及一种分离的核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，其中，
所述抗体轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:16－18的CDR；
具体地，所述抗体轻链可变区具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；
更具体地，所述核酸分子具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7或SEQID NO:11所示的核苷酸序列。
本发明的再一方面涉及一种载体，其包本发明中任一项所述的分离的核酸分子。
本发明的再一方面涉及一种宿主细胞，其包含本发明中任一项所述的分离的核酸分子，或者本发明的载体。
本发明的再一方面涉及一种制备本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段的步骤。
本发明的再一方面涉及杂交瘤细胞株LT004，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2015132。
本发明的再一方面涉及一种偶联物，其包括单克隆抗体或其抗原结合片段以及偶联部分，其中，所述单克隆抗体为本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为可检测的标记；具体地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包括本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包括本发明的偶联物；
具体地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PD-1在样品中的存在或其水平。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明所述的偶联物；可选地，其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗和/或诊断肿瘤或者贫血病的药物中的用途；具体地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌、非小细胞性肺癌、卵巢癌和白血病。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物在制备如下药物中的用途：
阻断PD-1与PD-1的配体结合的药物，
调节(例如下调)PD-1活性或水平的药物，
解除PD-1对机体免疫抑制的药物，或者
提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达的药物；
具体地，所述PD-1的配体为PDL-1或PDL-2，优选为PDL-1。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外方法，包括施加细胞以有效量的本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明的偶联物的步骤，所述方法选自如下：
阻断PD-1与PD-1的配体结合的方法，
调节(例如下调)PD-1活性或水平的方法，
解除PD-1对机体免疫抑制的方法，或者
提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达的方法；
具体地，所述PD-1的配体为PDL-1或PDL-2，优选为PDL-1。
在本发明的一个具体的实施方案中，所述体外方法是非治疗或诊断目的的。
本发明的再一方面涉及一种预防和/或治疗和/或辅助治疗和/或诊断肿瘤或者贫血病的方法，包括给予受试者有效量的本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者本发明所述的单克隆抗体偶联物的步骤；具体地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌、非小细胞性肺癌、卵巢癌和白血病。
根据本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其用于预防和/治疗和/或辅助治疗和/或诊断肿瘤或者贫血病；具体地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌、非小细胞性肺癌、卵巢癌和白血病。
根据本发明中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其用于：
阻断PD-1与PD-1的配体结合，
调节(例如下调)PD-1活性或水平，
解除PD-1对机体免疫抑制，或者
提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达；
具体地，所述PD-1的配体为PDL-1或PDL-2，优选为PDL-1。
在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的单克隆抗体仅阻断PD-1与PDL-1的结合。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，当提及PD-1蛋白(Programmed cell deathprotein 1,NCBI GenBank:NM_005018)的氨基酸序列时，其包括PD-1蛋白的全长，或者PD-1的胞外片段PD-1ECD(SEQ ID NO:19中波浪下划线部分)或者包含PD-1ECD的片段；还包括PD-1ECD的融合蛋白，例如与小鼠或人IgG的Fc蛋白片段(mFc或hFc)进行融合的片段(参见制备例1中的描述)。然而，本领域技术人员理解，在PD-1蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“PD-1蛋白”应包括所有此类序列，包括SEQ ID NO:19中波浪下划线部分所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述PD-1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO:19中波浪下划线部分的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。
如本文中所使用的，当提及PDL-1蛋白(Programmed death-ligand1,NCBI Gene ID:29126)的氨基酸序列时，其包括PDL-1蛋白的全长，或者PDL-1的胞外片段PDL-1ECD(SEQ ID NO:23中波浪下划线部分)或者包含PDL-1ECD的片段；还包括PDL-1ECD的融合蛋白，例如与小鼠或人IgG的Fc蛋白片段(mFc或hFc)进行融合的片段(参见制备例1中的描述)。然而，本领域技术人员理解，在PDL-1蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“PDL-1蛋白”应包括所有此类序列，包括SEQ ID NO:23中波浪下划线部分所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述PDL-1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO:23中波浪下划线部分的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。
如本文中所使用的，术语EC50是指半最大效应浓度(concentrationfor 50％of maximal effect)，是指能引起50％最大效应的浓度。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544-546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的单克隆抗体6F5/6F5(Re)、6F5H1L1或6F5H2L2)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P4,816,567)。
如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567 to Cabilly etal.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851 6855(1984))。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.,Nature,321:522 525(1986)；Reichmann et al.,Nature,332:323 329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593 596(1992)；和Clark,Immunol.Today 21:397 402(2000)。
如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体(例如，本发明的单克隆抗体6F5/6F5(Re)、6F5H1L1或6F5H2L2)以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，L1蛋白)，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及术语“杂交瘤”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如，当提及杂交瘤细胞株LT004时，其还指杂交瘤细胞株LT004的亚克隆和后代细胞。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack PublishingCompany,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
发明的有益效果
本发明的单克隆抗体均能够很好地特异性与PD-1结合，并且能够十分有效地阻断PD-1与PDL-1的结合，特异地解除PD-1对机体免疫抑制，激活T淋巴细胞。
附图说明
图1：融合蛋白PD-1ECD-TEV-mFc的SDS-PAGE检测结果。从左至右的2个泳道的样品依次为：Marker；PD-1ECD-TEV-mFc融合蛋白。
图2：融合蛋白PD-1ECD-TEV-hFc的SDS-PAGE检测结果。从左至右的2个泳道的样品依次为：Marker；PD-1ECD-TEV-hFc融合蛋白。
图3：单克隆人源化抗体6F5H1L1的SDS-PAGE检测结果。从左至右的4个泳道的样品依次为：BSA；Marker；还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体；非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体。
图4：单克隆人源化抗体6F5H2L2的SDS-PAGE检测结果。从左至右的4个泳道的样品依次为：非还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体；还原型蛋白电泳上样缓冲液样品抗体；Marker；BSA。
图5：单抗6F5H2L2的动力学特征参数检测结果。
图6：阳性对照抗体5C4的动力学特征参数检测结果。
图7：间接ELISA检测抗体6F5、6F5(Re)与PD-1的结合。
图8：间接ELISA检测抗体6F5H1L1、6F5H2L2与PD-1的结合。
图9：竞争ELISA检测抗体6F5与PDL-1竞争结合PD-1。
图10：竞争ELISA检测抗体6F5H1L1、6F5H2L2与PDL-1竞争结合PD-1。
图11：抗体6F5H2L2与细胞表面抗原PD-1的结合活性。
图12：阳性对照抗体5C4与细胞表面抗原PD-1的结合活性。
图13：抗体6F5H2L2和阳性对照抗体5C4阻断细胞表面抗原PD-1与PDL-1的结合活性。
图14：抗体6F5H2L2对混合淋巴细胞的IFN-γ分泌的影响。
图15：抗体6F5H2L2对混合淋巴细胞的IL-2分泌的影响。
杂交瘤细胞株LT004，其于2015年8月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2015132，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
制备例1：抗原PD-1-mFc、PD-1-hFc和PDL-1-hFc的合成
1.基因PD-1-mFc和PD-1-hFc的合成
对基因PD-1(Programmed cell death protein 1,NCBI GenBank:NM_005018)的胞外片段PD-1ECD所对应的氨基酸分别与TEV及小鼠IgG的Fc蛋白片段(mFc)和TEV及人IgG的Fc蛋白片段(hFc)进行融合设计，为提高目的基因在293F细胞表达系统中的表达效率，委托金斯瑞公司分别对融合蛋白序列相对应的核酸序列进行优化，优化主要考虑密码子的偏好性、GC含量、mRNA的二级结构、重复序列等因素。最终将PD-1 ECD-TEV-mFc和PD-1 ECD-TEV-hFc融合蛋白基因优化后的序列，委托金斯瑞公司合成。
2.pUC57simple-PD-1ECD-TEV-mFc质粒的获得
分别将金斯瑞公司将合成的PD-1ECD-TEV-mFc和PD-1ECD-TEV-hFc融合基因克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)表达载体中，获得pUC57simple-PD-1ECD-TEV-mFc和pUC57simple-PD-1ECD-TEV-hFc质粒。
3.pcDNA3.1-PD-1ECD-TEV-mFc和pcDNA3.1-PD-1ECD-TEV-hFc重组质粒的构建
分别将质粒pUC57simple-PD-1ECD-TEV-mFc和pUC57simple-PD-1ECD-TEV-hFc进行酶切(Xba I和BamH I)，电泳回收得到的融合基因片段PD-1ECD-TEV-mFc和PD-1ECD-TEV-hFc与pcDNA3.1表达载体(购自Invitrogen公司)进行连接反应，分别获得pcDNA3.1-PD-1ECD-TEV-mFc和pcDNA3.1-PD-1ECD-TEV-hFc，转染感受态大肠杆菌细胞DH5a(购自TIANGEN公司)，转染和培养按照说明书进行。筛选得到阳性的pcDNA3.1-PD-1ECD-TEV-mFc和pcDNA3.1-PD-1ECD-TEV-hFc克隆菌落，按照常规方法扩增大肠杆菌，然后采用试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，DP103-03)并按照试剂盒的说明书提取得到pcDNA3.1-PD-1ECD-TEV-mFc和pcDNA3.1-PD-1ECD-TEV-hFc重组质粒。
4.按照lipofectamin转染试剂盒(购自Invitrogen公司)方法分别将重组质粒pcDNA3.1-PD-1ECD-TEV-mFc和pcDNA3.1-PD-1ECD-TEV-hFc转染293F细胞(购自Invitrogen公司)。
5.分别将重组质粒pcDNA3.1-PD-1ECD-TEV-mFc和pcDNA3.1-PD-1ECD-TEV-hFc转染293F细胞7天后，将培养液通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤以及Mabselect SuRe柱进行纯化PD-1ECD-TEV-mFc和PD-1ECD-TEV-hFc融合蛋白，并取纯化后样品加入还原型蛋白电泳上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果如图1，图2所示。
6.抗原PDL-1-hFc的合成
抗原PDL-1-hFc(PDL-1：Programmed death-ligand 1,NCBI GeneID:29126)的合成方法同PD-1-hFc的合成方法，将所获得的融合蛋白进行纯化并进行SDS-PAGE电泳检测。
本制备例中涉及的序列信息如下：
PD-1:Programmed cell death protein 1,NCBI GenBank:NM_005018；
mFc：Ig gamma-2A chain C region：ACCESSION：P01863，99-330；
hFc:Ig gamma-1 chain C region，ACCESSION：P01857，106-330；
PDL-1:Programmed death-ligand 1,NCBI Gene ID:29126。
PD-1-mFc融合蛋白序列：(389aa)
enlyfqgPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGG PSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEV HTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKD LPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDF MPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKK NWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:19)
其中，带波浪下划线的为PD-1ECD部分，小写字母部分为TEV酶切位点，带实线下划线的为mFc部分。
PD-1-mFc融合蛋白相对应的基因编码序列：(1167bp)
gagaatctgtatttccagggaCCACGAGGCCCCACAATTAAGCCATGTCCCCCTTGCAAATGT CCTGCACCAAACCTGCTGGGAGGACCAAGCGTGTTCATCTTTC CACCCAAGATCAAGGACGTGCTGATGATCTCACTGAGCCCCA TTGTGACCTGCGTGGTCGTGGACGTGAGCGAGGACGATCCTG ATGTGCAGATCAGTTGGTTCGTCAACAATGTGGAAGTCCACAC AGCTCAGACTCAGACCCATAGGGAGGATTACAATAGTACTCT GCGCGTCGTGTCAGCACTGCCCATTCAGCACCAGGACTGGAT GAGCGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTGAACAACAAGGATCT GCCCGCACCTATCGAGAGAACTATTTCCAAGCCTAAAGGGTCT GTGAGGGCCCCACAGGTGTATGTCCTGCCTCCACCCGAGGAA GAGATGACTAAGAAACAGGTGACACTGACTTGTATGGTCACC GACTTCATGCCCGAAGATATCTACGTGGAGTGGACTAACAAT GGGAAGACCGAACTGAACTATAAAAATACAGAGCCTGTGCTG GACTCAGATGGAAGCTACTTTATGTATAGCAAGCTGCGAGTG GAAAAGAAAAACTGGGTCGAGCGGAACAGCTACTCTTGTAGT GTGGTCCACGAAGGGCTGCATAATCACCACACCACTAAATCAT TCTCCCGAACTCCAGGCAAA(SEQ ID NO:20)
其中，带波浪下划线的为PD-1ECD部分，小写字母部分为TEV酶切位点，带实线下划线的为mFc部分。
PD-1-hFc融合蛋白序列：(382aa)
enlyfqgTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:21)
其中，带波浪下划线的为PD-1ECD部分，小写字母部分为TEV酶切位点，带实线下划线的为hFc部分。
PD-1-hFc融合蛋白相对应的基因编码序列：(1149bp)
gaaaacctgtattttcagggcACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGG GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGG ACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCA CCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGT GCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGT ACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGG TCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTA CAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTC CTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG GGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAA TGA(SEQ ID NO:22)
其中，带波浪下划线的为PD-1ECD部分，小写字母部分为TEV酶切位点，带实线下划线的为hFc部分。
PDL-1-hFc融合蛋白序列：(456aa)
enlyfqgTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:23)
其中，带波浪下划线的为PDL-1ECD部分，小写字母部分为TEV酶切位点，带实线下划线的为hFc部分。
PDL-1-hFc融合蛋白相对应的基因编码序列：(1371bp)
gaaaacctgtattttcagggcACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTG AACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACC CAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATG CGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAC AAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGT CAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAA GGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAC CAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCC GGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGA CGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG TCTCCCGGGAAATGA(SEQ ID NO:24)
其中，带波浪下划线的为PDL-1ECD部分，小写字母部分为TEV酶切位点，带实线下划线的为hFc部分。
实施例1：杂交瘤细胞株LT004的获得以及单克隆抗体6F5的制备
利用哺乳动物细胞表达系统表达出重组的PD-1ECD-TEV-mFc作为抗原免疫小鼠，经小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。通过大量的样本筛选，得到了一种杂交瘤细胞株LT004，该细胞株能够分泌产生与PD-1特异性结合的单克隆抗体6F5。具体方法如下：
1.杂交瘤细胞株LT004的建立
用PD-1ECD-TEV-mFc融合蛋白(即PD-1-mFc，见制备例1)作为抗原，取免疫BALB/C小鼠(购自广东医学实验动物中心)的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，参照目前已确立的方法(e.g.,Stewart,S.J.,“Monoclonal Antibody Production”,in Basic Methods inantibody Production and Characterization,Eds.G.C.Howard and D.R.Bethell,Boca Raton:CRC Press,2000)。
用PD-1-hFc作为抗原包被酶标板，进行间接ELISA法筛选，得到分泌与PD-1特异性结合的新的抗体的杂交瘤细胞。对间接ELISA筛选得到的杂交瘤细胞，通过竞争ELISA筛选出能够分泌与配体PDL-1(见制备例1)竞争结合PD-1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经过有限稀释法得到稳定的杂交瘤细胞株，并经过有限稀释法得到PD-1-6F5稳定细胞株。本发明中将该杂交瘤细胞株命名为LT004，其分泌的单克隆抗体命名为6F5。
杂交瘤细胞株LT004的保藏编号：CCTCC C2015132。
2.抗体6F5的制备：
用含10％的低IgG胎牛血清的IMDM培养基对本发明LT004细胞株进行培养，7天后收集细胞培养上清进行纯化制备抗体6F5。
3.抗体6F5的SDS-PAGE电泳检测：
将纯化后的样品分别加入还原型蛋白电泳上样缓冲液和非还原型蛋白电泳上样缓冲液，煮沸后进行检测。
实施例2：单克隆抗体6F5的轻链和重链序列的获得
按照培养细胞细菌总RNA提取试剂盒(Tiangen，货号DP430)的方法，从实施例1制得的杂交瘤细胞株LT004中提取mRNA。
按照TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(Transgen，AT301)试剂盒说明书合成cDNA，并进行PCR扩增。PCR扩增产物直接进行TA克隆，具体操作参照pEASY-T1Cloning Kit(Transgen CT101)试剂盒说明书进行。
将TA克隆的产物直接进行测序，测序结果如下：
重链可变区的DNA测序结果：(426bp)
GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGTCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGTAGTGACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGACAACTTAATTACGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATAGATCTTCCAAGGGCAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGT(SEQ ID NO:1)
其编码的蛋白序列：(142aa)
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPEKSLEWVATISGGGSDTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARQLNYAWFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYRSSKGNSSTLAAVTS(SEQ ID NO:2)
轻链可变区的DNA测序结果：(336bp)
GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTGATAATTATGGCATTAGTTTTATGAACTGGTTCCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATACTTCATCCAACCAAGGATCCGGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCATCCTATGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATAAAACGG(SEQ ID NO:3)
其编码的蛋白序列：(112aa)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYTSSNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:4)
实施例3：人源化抗体6F5H1L1、6F5H2L2的轻链和重链序列的设
计
根据PD-1蛋白的三维晶体结构(Shinohara T,et al.,Structure andchromosomal localization of the human PD-1 gene(PDCD1).Genomics1995,23(3):704–6)以及实施例2获得的抗体6F5的序列，通过计算机模拟抗体模型，根据模型设计突变，得到抗体6F5H1L1、6F5H2L2的可变区序列(重链恒定区为Ig gamma-1 chain C region，ACCESSION:P01857，轻链恒定区为Ig kappa chain C region，ACCESSION:P01834)，可变区序列如下：
6F5H1L1重链可变区的DNA序列：(354bp)
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCAGGAGGGGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCCCTGCGACTGTCTTGCGCCGCTAGTGGCTTCACCTTTAGCTCCTACGGGATGTCCTGGGTCAGACAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGCTACTATCTCAGGAGGCGGGAGCGACACCTACTATCCTGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACAATTTCCAGAGACAACTCTAAAAACAATCTGTATCTGCAGATGTCTAGTCTGAGGGCTGAAGATACTGCAGTCTACTATTGTGCCCGCCAGCTGAATTACGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCAAGC(SEQ ID NO:5)
其编码的蛋白序列：(118aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGSDTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMSSLRAEDTAVYYCARQLNYAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:6)
6F5H1L1轻链可变区的DNA序列：(333bp)
GACATTGTGCTGACTCAGAGCCCCGCCTCACTGGCTGTGTCTCCAGGGCAGCGGGCAACCATCACATGCAGAGCCTCTGAGAGTGTGGACAACTACGGAATTAGCTTCATGAATTGGTTTCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAACTGCTGATCTATACCAGCTCCAACCAGGGCACAGGGGTGCCAGCCAGGTTCTCAGGAAGCGGCTCCGGGACTGATTTTACCCTGAACATTAATCCCATGGAAGCCGACGATACCGCTATGTACTTCTGTCAGCAGAGCAAGGAGGTCCCTTGGACATTTGGCGGGGGAACTAAGCTGGAAATCAAA(SEQID NO:7)
其编码的蛋白序列：(111aa)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYTSSNQGTGVPARFSGSGSGTDFTLNINPMEADDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:8)
6F5H2L2重链可变区的DNA序列：(354bp)
GAGGTGCAGCTGGTCGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGGTCACTGCGACTGAGCTGCGCCGCTTCCGGCTTCACCTTTAGCTCCTACGGGATGTCCTGGGTCAGACAGGCACCTGGAAAGGGACTGGAGTGGGTCGCTACTATCTCTGGAGGCGGGAGTGACACCTACTATGCCGATTCCGTGAAGGGCCGGTTCACAATTTCAAGAGACAACAGCAAAAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCTGAAGATACAGCAGTCTACTATTGTGCCCGCCAGCTGAATTACGCATGGTTTGCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACAGTCTCTAGT(SEQ ID NO:9)
其编码的蛋白序列：(118aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGSDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLNYAWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:10)
6F5H2L2轻链可变区的DNA序列：(333bp)
GACATCGTCCTGACTCAGTCCCCTGCTTCCCTGGCTGTGTCTCCAGGCCAGCGGGCAACCATCACATGCAGAGCCTCTGAGAGTGTGGACAACTACGGCATTAGCTTCATGAATTGGTATCAGCAGAAGCCCGGGCAGCCCCCTAAACTGCTGATCTACACCAGCTCCAACAAGGATACAGGAGTGCCAGCAAGGTTCTCAGGAAGCGGATCCGGAACTGACTTTACTCTGACCATTAATCCCATGGAGGCCGAAGATACAGCTGTGTACTATTGTCAGCAGAGCAAAGAGGTCCCTTGGACATTTGGCGGGGGAACTAAGCTGGAAATCAAA(SEQID NO:11)
其编码的蛋白序列：(111aa)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVDNYGISFMNWYQQKPGQPPKLLIYTSSNKDTGVPARFSGSGSGTDFTLTINPMEAEDTAVYYCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:12)
实施例4：6F5(Re)以及人源化抗体6F5H1L1、6F5H2L2的制备和SDS-PAGE电泳检测
1.6F5重组抗体6F5(Re)的制备
将6F5的重链cDNA序列(重链可变区序列如SEQ ID NO:1所示)(恒定区序列为immunoglobulin gamma 2b heavy chain precursor[Mus musculus]140-475，ACCESSION:ACX70084.1)和轻链的cDNA序列(轻链可变区序列如SEQ ID NO:3所示)(恒定区为antibody kappalight chain,partial[Mus musculus],106-213GenBank:BAB33404.1)分别克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-6F5H和pUC57simple-6F5L质粒。
分别将质粒pUC57simple-6F5H和pUC57simple-6F5L进行酶切(HindIII&EcoRI)，电泳回收得到的重链轻链分别亚克隆到pcDNA3.1载体中，提取重组质粒共转染293F细胞。细胞培养7天后，将培养液通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤后，上样至HiTrap MabSelectSuRe柱，用Elution Buffer一步洗脱蛋白，回收目标样品并用HiTrapDesalting换液至PBS。
2.6F5人源化抗体6F5H1L1、6F5H2L2的制备和SDS-PAGE电泳检测
参照上面6F5(Re)的制备步骤进行。
将6F5H1L1、6F5H2L2的重链cDNA(重链可变区序列分别为SEQID NO:5、9)和轻链的cDNA(轻链可变区序列分别为SEQ ID NO:7、11)分别克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，获得pUC57simple-6F5H1L1、pUC57simple-6F5H2L2质粒，并亚克隆到pcDNA3.1载体中，方法同前述6F5(Re)。
将重组质粒转染293F细胞，将培养液纯化后进行检测(同上所述6F5(Re)的方法)，结果如图3-4所示，还原型蛋白样品目标蛋白大约在24.5kD和49KD处，非还原型蛋白样品目标蛋白大约在147kD处。
实施例5：抗体的动力学参数测定
使用Fortebio分子相互作用仪测定抗体6F5H2L2和阳性对照抗体5C4与抗原PD-1结合的动力学参数。
1.用TEV蛋白酶酶切PD-1-mFc蛋白(见制备例1)，并过柱纯化获得PD-1抗原。
2.抗原PD-1(抗原浓度为1μg/ml)经生物素标记后固定于SA传感器表面，于PBST中平衡后，与抗体6F5H2L2或5C4结合，抗体用PBST从200nM往下三倍稀释，于PBST中解离。
抗体6F5H2L2和5C4的动力学参数见表1，动力学特征参数检测结果分别如图5、6所示。
表1：抗体6F5H2L2动力学参数
| 抗体名称 | KD(M) | kon(1/Ms) | kon误差 | kdis(1/s) | kdis误差 |
| 6F5H2L2 | 2.34E-10 | 4.39E+05 | 7.05E+03 | 1.03E-04 | 7.41E-06 |
| 5C4 | 1.11E-10 | 9.27E+05 | 1.77E+04 | 1.03E-04 | 6.37E-06 |
KD为亲和力常数；kon为抗原抗体结合速率；kdis为抗原抗体解离速率；KD＝kdis/kon。
结果表明，6F5H2L2与抗原PD-1有良好的亲和力。
实施例6：间接ELISA方法检测抗体与抗原PD-1的结合活性
采用间接ELISA方法分别测定杂交瘤抗体6F5，重组抗体6F5(Re)和人源化抗体6F5H1L1、6F5H2L2及阳性对照抗体5C4的结合活性。将PD1-mFc或PD1-hFc用CBS稀释成0.5μg/ml，加至酶标板96孔中，每孔50μL，4℃下孵育过夜。洗板一次后用1％BSA+PBS封闭，每孔300μL，37℃下孵育2小时。洗板三次后，抗体分别用PBS稀释成1μg/ml起始作1:3梯度稀释，以PBS做空白对照。每孔50μl，室温下孵育10分钟。洗板三次后，分别对应加入HRP标记的羊抗人或羊抗鼠二抗，每孔50μL，37℃下孵育30分钟洗板四次后，加TMB显色液，每孔50μL，室温下避光显色5分钟。直接加终止液终止反应，每孔50μL。终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处检测OD值，保存原始数据。将原始数据输入到软件SoftMax Pro 6.2.1中进行数据处理。
检测杂交瘤抗体6F5，重组抗体6F5(Re)和人源化抗体6F5H1L1、6F5H2L2及阳性对照抗体5C4与抗原PD-1结合结果如图7、图8所示。
由图可见，抗体6F5、6F5(Re)、6F5H1L1、6F5H2L2、阳性对照抗体5C4均能有效地结合PD-1蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系，各剂量的吸光度强度见表2，表3。
表2：抗体6F5、6F5(Re)与PD-1的结合(间接ELISA)
表3：抗体6F5H1L1、6F5H2L2以及阳性对照抗体5C4与PD-1的结合(间接ELISA)
在对6F5、6F5(Re)以及阳性对照抗体5C4与人PD-1结合活性的平行对比实验中，曲线模拟结合效率EC50分别为0.091nM,0.028nM，0.199nM。不拘于理论的限制，重组抗体6F5(Re)跟杂交瘤抗体6F5用的表达系统不一样，6F5(Re)由人293F细胞表达产生，杂交瘤抗体6F5用小鼠杂交瘤细胞产生，抗体在产生过程中表达糖基化程度有差异，亲和力也会有差别。
在对6F5H1L1、6F5H2L2以及阳性对照抗体5C4与人PD-1结合活性的平行对比实验中，曲线模拟结合效率EC50分别为0.118nM，0.100nM和0.233nM。可见，6F5H1L1、6F5H2L2的EC50约为阳性对照抗体5C4的1/2，结合效率显著优于阳性对照抗体5C4。
实施例7：竞争ELISA方法检测抗体与PDL-1竞争结合抗原PD-1
的活性
采用竞争ELISA方法分别测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体6F5及人源化抗体6F5H1L1、6F5H2L2与PDL-1竞争结合抗原PD-1的能力。将PD-1-mFc或PD-1-hFc用CBS稀释成0.5μg/ml，加至酶标板96孔中，每孔50μL，4℃下孵育过夜。洗板一次后用1％BSA+PBS封闭，每孔300μL，37℃下孵育2小时。洗板三次后，抗体分别用PBS稀释成浓度为1.5μg/ml起始作1:3梯度稀释，以PBS做空白对照。每孔50μl，室温下孵育10分钟。将PDL-1-hFc或PDL-1-mFc用PBS稀释成2μg/ml，每孔50μl，与抗体充分混匀，37℃下孵育45分钟。洗板三次后，分别对应加入HRP标记的羊抗人二抗，每孔50μL，37℃下孵育30分钟。洗板四次后，加TMB显色液，每孔50μL，室温下避光显色5分钟。直接加终止液终止反应，每孔50μL。终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处检测OD值，保存原始数据。将原始数据输入到软件SoftMax Pro 6.2.1中进行数据处理。
检测抗体6F5及人源化抗体6F5H1L1、6F5H2L2与PDL-1竞争结合抗原PD-1的结果如图9，图10所示。由图可见，6F5及人源化抗体6F5H1L1、6F5H2L2均能有效地与PDL-1竞争结合PD-1蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系。通过对结合的抗体6F5及人源化抗体6F5H1L1、6F5H2L2和阳性对照抗体5C4进行吸光度检测分析，曲线模拟结合效率EC50分别为：0.198nM、0.979nM、1.175nM和1.461nM。
各剂量的吸光度强度见表4-5。
表4：抗体6F5与PDL-1竞争结合PD-1 ELISA
表5：抗体6F5H1L1、6F5H2L2与PDL-1竞争结合PD-1 ELISA
实施例8：流式细胞仪方法检测抗体与细胞表面抗原PD-1的结合
活性
首先构建表达PD-1抗原的宿主细胞293T，然后用本发明中制备的人源化抗体6F5H2L2(见实施例4)对改宿主细胞进行标记。然后采用流式细胞术分析验证抗体6F5H2L2对细胞表面天然构象的抗原特异性的结合能力。
具体步骤如下：
1.达PD-1抗原的宿主细胞293T的构建
表按照lipofectamin转染试剂盒(购自Invitrogen公司)方法将包含PD-1的载体pLenti6.3-PD-1(载体pLenti6.3购自Invitrogen公司)转染293T细胞，经筛选获得稳定表达PD-1的克隆群体293T-PD-1。
2.抗体标记和流式细胞仪检测
采用常规胰酶消化方法上述步骤获得的表达PD-1抗原的宿主细胞293T-PD-1，并使每个收集管细胞数为2×105，用PBS(1％BSA)配制浓度分别为50nM，20nM，10nM，3nM，1nM，0.1nM，0.01nM的PD-1抗体6F5H2L2和阳性对照抗体5C4稀释液，冰上与表达PD-1的293T细胞孵育1小时，每管加入100μL FITC羊抗人IgG(1：500)冰上孵育30min后，用PBS洗3次后加入300μL PBS重悬细胞，在流式细胞仪上用FITC通道检测荧光信号。
人源化抗体6F5H2L2与293T-PD-1细胞的结合结果如图11、12所示。由图可见，6F5H2L2抗体能有效地结合宿主细胞293T-PD-1表面的靶标PD-1蛋白，并且其结合效率呈剂量依赖关系，各剂量的荧光强度见表6。
表6：流式细胞仪检测6F5H2L2结合PD-1宿主细胞293T-PD-1表面抗原的荧光强度分析
通过对结合的6F5H2L2和阳性对照抗体5C4进行荧光定量分析，曲线模拟6F5H2L2和阳性对照抗体5C4的结合效率EC50分别是5.022和4.171nM。
实施例9：流式细胞仪方法检测抗体阻断细胞表面抗原PD-1与PDL-1
的结合活性
采用常规胰酶消化方法实施例8中获得的表达PD-1抗原的宿主细胞293T-PD-1，并使每个收集管细胞数为2×105，用PBS(1％BSA)配制浓度分别为100nM，50nM，20nM，10nM，3nM，1nM的PD-1抗体6F5H2L2和阳性对照抗体5C4稀释液，冰上与表达PD-1的293T细胞孵育1小时，每管细胞稀释液中加入适量的PDL-1-mFc蛋白，使其终浓度均为20nM，冰上孵育30min。用PBS洗涤一次后，每管加入100μL FITC羊抗人IgG(1：500)冰上孵育1小时用PBS洗3次后加入300μL PBS重悬细胞，在流式细胞仪上用FITC通道检测荧光信号。
人源化抗体6F5H2L2和阳性对照抗体5C4阻断人PDL-1与PD-1结合的结果如图13所示。由图可见，6F5H2L2和5C4能有效地抑制人PDL-1与PD-1的结合，并且其抑制效率呈剂量依赖关系，各剂量的荧光强度见表7。
表7：流式细胞仪检测6F5H2L2阻断人的PDL-1与PD-1结合活性的荧光强度分析
通过对6F5H2L2和阳性对照抗体5C4抗体进行荧光定量分析，曲线模拟6F5H2L2和5C4的抑制效率EC50分别是8.088nM和2.208nM。
实施例10：混合淋巴细胞反应：细胞因子IFN-γ，IL-2的分泌
采用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare LOT No.:171440-02)分离PBMC，将分离出来的PBMC加入IL-4(Peprotech K2513，1000U/ml)和GM-CSF(Peprotech H1513，1000U/ml)诱导6天后，加入TNF-α(Peprotech G1513，200U/ml)诱导3天获得DC细胞。
PBMC中分离得到T细胞，将获得的DC细胞与T细胞按1:10的比例混合培养，同时加入不同比例的抗体6F5H2L2(hIgG做为阴性对照，Isotype control)培养5-6天后，采用ELISA试剂盒检测IFN-γ(购自达科为公司)和IL-2(购自达科为公司)的分泌量。
DC细胞和T细胞混合培养后IFN-γ和IL-2的分泌检测结果分别如图14、图15所示：6F5H2L2抗体能有效地诱导混合淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-2，并且其分泌量与抗体6F5H2L2呈剂量依赖关系。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (19)
1.单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述单克隆抗体的重链可变区包含：氨基酸序列为SEQ ID NO:13－15的CDR；
和/或
所述单克隆抗体的轻链可变区包含：氨基酸序列为SEQ ID NO:16－18的CDR。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10；
和/或
所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体(例如，scFv)、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的单克隆抗体以小于大约100nM，例如小于大约10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM或更小的EC50结合PD-1蛋白；优选地，所述EC50通过间接ELISA方法测得。
5.根据权利要求1至2中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
所述的单克隆抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是有杂交瘤细胞株LT004产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株LT004保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2015132。
7.分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，其中，
所述抗体的重链可变区包含：氨基酸序列为SEQ ID NO:13-15的CDR；
优选地，所述抗体的重链具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQID NO:10所示的氨基酸序列；
更优选地，所述核酸分子具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5或SEQID NO:9所示的核苷酸序列。
8.分离的核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，其中，
所述抗体轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO:16－18的CDR；
优选地，所述抗体轻链可变区具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；
更优选地，所述核酸分子具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7或SEQID NO:11所示的核苷酸序列。
9.一种载体，其包含权利要求7和/或8所述的分离的核酸分子。
10.一种宿主细胞，其包含权利要求7和/或8所述的分离的核酸分子，或者权利要求9所述的载体。
11.制备权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在合适的条件下培养权利要求10的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段的步骤。
12.杂交瘤细胞株LT004，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2015132。
13.偶联物，其包括单克隆抗体或其抗原结合片段以及偶联部分，其中，所述单克隆抗体为权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为可检测的标记；优选地，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
14.试剂盒，其包括权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包括权利要求13所述的偶联物；
优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
15.权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求13所述的偶联物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PD-1在样品中的存在或其水平。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求13所述的偶联物；可选地，其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
17.权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求13所述的偶联物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗和/或诊断肿瘤或者贫血病的药物中的用途；优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌、非小细胞性肺癌、卵巢癌和白血病。
18.权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求13所述的偶联物在制备如下药物中的用途：
阻断PD-1与PD-1的配体结合的药物，
调节(例如下调)PD-1活性或水平的药物，
解除PD-1对机体免疫抑制的药物，或者
提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达的药物；
优选地，所述PD-1的配体为PDL-1或PDL-2，更优选为PDL-1。
19.一种在体内或体外方法，包括施加细胞以有效量的权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或者权利要求13所述的偶联物的步骤，所述方法选自如下：
阻断PD-1与PD-1的配体结合的方法，
调节(例如下调)PD-1活性或水平的方法，
解除PD-1对机体免疫抑制的方法，或者
提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达的方法；
优选体地，所述PD-1的配体为PDL-1或PDL-2，更优选为PDL-1。
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