CN110903391B - 一组pd-l1单克隆抗体及其医药用途 - Google Patents

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Abstract

一组PD‑L1单克隆抗体及其医药用途。本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域；具体涉及一组抗PD‑L1的单克隆抗体及其医药用途。本发明通过杂交瘤技术获得了一组在阻断PD‑L1与PD‑1的相互作用方面有优异效果的抗PD‑L1单克隆抗体，并成功地对其进行了人源化改造以及亲和力成熟。所述抗体在制备用于阻断和调节PD‑L1的作用与水平以及显著增强机体免疫力的相关药物，尤其是治疗癌症相关药物方面表现出巨大的应用前景。

Description

一组PD-L1单克隆抗体及其医药用途
技术领域
本发明属于肿瘤及免疫学药物领域，具体地，本发明涉及一组抗PD-L1的单克隆抗体及其医药用途。
技术背景
程序性死亡配体PD-L1，又被称作为B7-H1或者CD274，是一种由CD274基因编码的I型跨膜糖蛋白，属于B7家族成员，其分子量大约为40KDa。PD-L1是由一个IgV样结构域、一个IgC样结构域、跨膜区、以及一个短的胞质区肽段组成(Keir et al.,(2008)Annu RevImmunol 26:677-704；Lin et al.,(2008)PNAS 105:3011-3016)。PD-L1在体内表达广泛，不仅在B细胞、T细胞、骨髓细胞和树突细胞中表达，同时也低水平的表达于一些非淋巴器官，如心脏，肺等(Yamazaki et al.,(2002)Journal of Immunology 169:5538–45；Eppihimer et al.,(2002)Microcirculation 9:133–45；Liu J et al.,(2007)Blood110:296–304；Liang et al.,(2003)Eur J Immunol 33:2706–2716)。PD-L1胞外N端的IgV结构域可以与其受体PD-1(程序性死亡受体1)结合。PD-1主要表达于胸腺细胞(Nishimuraet al.,(2001)Trends Immunol 22:265–268；Blank et al.,(2003)J Immunol 171:4574–4581)、激活的T细胞、B细胞(Agata et al.,(1996)Int Immunol 8:765–772；Blank etal.,(2004)Cancer Res 64:1140–1145)、以及骨髓细胞(Nishimura et al.,(2001)TrendsImmunol 22:265–268；Freeman et al.,(2000)J Exp Med 192:1027–1034)。通过与PD-1和CD80的相互作用，PD-L1在机体的免疫系统调节中发挥重要作用。PD-L1还参与维持外周耐受性，如胎母耐受，并且在慢性病毒感染过程中诱导T细胞衰竭或无反应性(Butte et al.,(2007)Immunity 27:111–122；Black et al.,(2007)Cancer Immunol Immunother 56:739-745；Dong et al.,(2003)JMol Med 81:281-287)。PD-L1基因的敲除导致T细胞反应上调，产生自身反应性T细胞(Latchman et al.,(2004)PNAS 101:10691-10696)。
临床前数据表明，当PD-L1与其受体PD-1结合后，就会抑制免疫反应，甚至使肿瘤细胞实现免疫逃逸(Marincola et al.,(2000)Adv Immunol 181–273；Iwai et al.,(2002)PNAS 99:12293–12297)。肿瘤细胞表面的PD-L1分子与T细胞表面的PD-1结合后可以抑制由T细胞受体(TCR)介导的T细胞激活，降低白介素-2(IL-2)，γ-干扰素(IFN-γ)等细胞因子的表达，阻碍了活化T细胞的形成(Fife et al.(2011)Nature Immunology 10:1185-1193)。在多种肿瘤模型中，阻断PD-L1和PD-1的相互作用，可以抑制肿瘤组织的生长并提高实验动物的生存率(Iwai et al.,(2005)Int Immunol 17:133–144；Okudaira etal.,(2009)Int J Oncol 35:741–749；Hirano et al.,(2005)Cancer Res 65:1089–1096)。此外，阻断PD-L1/PD-1信号可以使在病毒感染过程中处于衰竭状态的的T细胞恢复活力(Freeman et al.,(2006)J Exp Med 203:2223-2227)。因此，PD-1/PD-L1信号通路的研究对于肿瘤治疗以及病毒性慢性感染疾病的治疗具有重要价值(Keir et al.,(2008)Annu Rev Immunol 26:677-704)。
PD-L1在多种肿瘤细胞中高表达，例如黑色素瘤、胃肠癌、肺癌、肾癌、头部颈部癌症、膀胱癌、卵巢癌以及血液恶性肿瘤，而且其表达水平与癌症患者的预后密切相关(Junget al.,(2017)Cancer Res Treat 49:246-254；Wu et al.,(2015)PLoS ONE 10:e0131403)。近年来，能够阻断PD-L1与PD-1相互作用的抗体在癌症治疗方面取得了许多令人振奋的临床疗效(Brahmer et al.,(2012)N Engl J Med 366:2455-2465；Topalian etal.,(2012)N Engl J Med 366:2443–2454；Topalian et al.,(2014)J Clin Oncol 32:1020–1030)。尽管PD-L1抗体在临床试验中副作用低，但是其肿瘤抑制效果往往低于PD-1抗体。因此，开发疗效更高的新型PD-L1抗体在肿瘤免疫治疗领域仍然具有重要价值。
发明内容
针对上述问题，本发明通过杂交瘤技术获得了一组在阻断PD-L1与PD-1相互作用方面具有优异效果的抗PD-L1单克隆抗体，并成功的对其进行了人源化改造。所述抗体在制备用于阻断、调节PD-L1水平相关药物以及治疗癌症相关药物方面有巨大的应用前景。
本发明提供一组PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链的CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：13、19、25中的一种；所述重链的CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：14、20、26中的一种；所述重链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ IDNO：15、21、27中的一种；所述轻链的CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO：16、22、28中的一种；所述轻链的CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：17、23、29中的一种；所述轻链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：18、24、30中的一种；其中所述抗原结合片段的重链和轻链包含分别跨越所述抗体的重链和轻链的CDR1到CDR3的氨基酸序列。
进一步的，本发明公开了上述PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、7、11、63、67、71、75、79中的一种；所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4、8、12、64、68、72、76、80中的一种。
进一步的，本发明公开了对上述PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段的重链和轻链进行人源化改造，所述经过人源化改造的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：31、33、35中的一种；所述经过人源化改造的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：32、34、36中的一种。
进一步的，本发明公开了上述经过人源化改造的一组PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，所述人源化改造的重链的全长氨基酸选自SEQ ID NO：37、39、41中的一种；所述人源化改造的轻链的全长氨基酸选自SEQ ID NO：38、40、42中的一种。
进一步的，本发明公开了对上述经过人源化改造的一组PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段进行抗体亲和力成熟改造，所述亲和力成熟改造后重链的CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：13、19、25中的一种；所述亲和力成熟改造后重链的CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：51、53、57、58中的一种；所述亲和力成熟改造后重链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：15、21、27中的一种；所述亲和力成熟改造后轻链的CDR1的氨基酸序列选自SEQID NO：16、54、59中的一种；所述亲和力成熟改造后轻链的CDR2的氨基酸序列选自SEQ IDNO：52、23、29中的一种；所述亲和力成熟改造后轻链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：18、55、56、60中的一种；其中所述抗原结合片段的重链和轻链包含分别跨越所述抗体的重链和轻链的CDR1到CDR3的氨基酸序列。
进一步的，本发明公开了上述经过抗体亲和力成熟改造的PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，所述亲和力成熟改造后重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：43、45、48、49中的一种；所述亲和力成熟改造后轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：44、46、47、50中的一种。
进一步的，本发明公开了编码上述PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段的的核苷酸序列，包括SEQ ID NO：1、2、5、6、9、10、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81、82、85、86、89、90。
进一步的，本发明公开了一组表达载体，包含上述核苷酸序列以及与该序列相关的表达调控序列。
进一步的，本发明公开了上述PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段在制备如下药物中的用途：阻断PD-L1与PD-1结合的药物、调节PD-L1活性或PD-L1水平的药物、解除PD-L1对机体免疫抑制的药物、激活T淋巴细胞的药物或者提高T淋巴细胞中IL-2表达的药物。
进一步的，本发明公开了一种单克隆抗体偶联物，包括单克隆抗体和偶联部分，其中，所述单克隆抗体为权利要求1-6任一项所述的PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、细胞因子受体片段、酶、荧光素、和生物素中的一种或多种。
进一步的，本发明公开了上述单克隆抗体偶联物在制备如下药物中的用途：阻断PD-L1与PD-1结合的药物、调节PD-L1活性或PD-L1水平的药物、解除PD-L1对机体免疫抑制的药物、激活T淋巴细胞的药物或者提高T淋巴细胞中IL-2表达的药物。
进一步的，本发明公开了上述单克隆抗体偶联物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的用途。
本发明的进步性表现为：本发明采用哺乳动物细胞表达系统制备重组PD-L1作为抗原免疫小鼠，将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞。通过对大量杂交瘤细胞的多次克隆及筛选后，得到一些单克隆杂交瘤细胞株。这些杂交瘤细胞株能够产生和PD-L1特异性高亲和力结合的单克隆抗体，并且这些单克隆抗体能够有效阻断PD-L1与PD-1的结合，并能促进混合淋巴细胞反应中IL-2，INF-γ的分泌。通过RT-PCR克隆编码抗体轻链和重链可变区的基因，采用互补决定簇嫁接方法构建人源化抗体。体外功能试验表明，这些人源化的PD-L1抗体能特异性高亲和力结合PD-L1蛋白，高效的阻断PD-L1与PD-1的结合，并能促进T细胞分泌细胞因子IL-2和INF-γ。以上实验结果表明本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包含本发明所述单克隆抗体或其抗原结合片段的单克隆抗体偶联物在制备阻断PD-L1与PD-1结合的药物、调节PD-L1活性或PD-L1表达水平的药物、解除PD-L1对机体免疫抑制的药物、激活T淋巴细胞的药物、提高T淋巴细胞表达IL-2和INF-γ的药物、以及在预防和治疗或者辅助治疗肿瘤的药物方面具有良好的应用前景。
说明书附图
图1为用ELSIA方法检测鼠源PD-L1杂交瘤抗体与PD-L1-hFc蛋白结合的EC50；
图2为用ELSIA方法检测鼠源PD-L1杂交瘤抗体阻断PD-1-biotin结合PD-L1-hFc的IC50；
图3为用FACS方法检测鼠源PD-L杂交瘤抗体结合293T-PD-L1细胞的EC50；
图4为用FACS方法检测鼠源PD-L1杂交瘤抗体阻断PD-1-biotin结合293T-PD-L1细胞的IC50；
图5为用ELSIA方法检测人源化PD-L1抗体与PD-L1-hFc蛋白结合的EC50；
图6为用ELSIA方法检测人源化PD-L1抗体阻断PD-1-biotin结合PD-L1-hFc的IC50；
图7为用FACS方法检测人源化PD-L1抗体结合293T-PD-L1细胞的EC50；
图8为用FACS方法检测人源化PD-L1抗体阻断PD-1-biotin结合293T-PD-L1细胞的IC50；
图9为用ELISA方法检测鼠源PD-L1杂交瘤抗体对活化的T细胞分泌IL-2的刺激作用；
图10为用ELISA方法检测鼠源PD-L1杂交瘤抗体对活化的T细胞分泌IFN-γ的刺激作用；
图11为用ELISA方法检测人源化PD-L1抗体对活化的T细胞分泌IL-2的刺激作用；
图12为用ELISA方法检测人源化PD-L1抗体对活化的T细胞分泌IFN-γ的刺激作用；
图13为用ELISA方法检测亲和力成熟的人源化PD-L1抗体对活化的T细胞分泌IL-2的刺激作用；
图14为用ELISA方法检测亲和力成熟的人源化PD-L1抗体对活化的T细胞分泌IFN-γ的刺激作用。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制；下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；本发明所涉及的抗体的氨基酸和核酸序见序列表。
实施例1－鼠源杂交瘤抗体的构建
鼠源杂交瘤抗体的构建包括以下6个步骤。
(1)小鼠免疫和杂交瘤细胞融合。用人的PD-L1-ECD-mFc融合蛋白作为抗原，与等体积完全弗氏佐剂(Sigma,Cat No:F5581)充分乳化后，经皮下免疫6-8周龄Balb/c小鼠(购自昭衍(苏州)新药研究中心有限公司)，抗原免疫量为20μg/只。随后每隔2周，用相同剂量的抗原与不完全弗氏佐剂(Sigma,Cat No:F5506)充分乳化后，经皮下免疫小鼠三次。免疫三次后测定小鼠血清效价，融合前3天经腹腔进行加强免疫。以PEG Hybri-Max(Sigma,CatNo:7181)作为融合剂，将小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞按照4:1的比例混合。将融合后的细胞加入到96孔板中(1×105细胞/孔)，每孔含有0.1mL 1X HAT培养基(Invitrogen,Cat No:21060-017)。在第3天加入0.1mL HT(Invitrogen,Cat No:11067-030)培养基，在第7天吸掉96孔板中的培养基，补加0.2mL新鲜的HT培养基。在第9天，收取上清液进行ELISA和FACS检测。
(2)与PD-L1-ECD结合抗体的ELISA筛选。用PD-L1-ECD-hFc包被96孔ELISA板(Corning，Cat No:9018)，置4度过夜，用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween20)洗涤3次后，加入封闭缓冲液(PBS+1％BSA(Sigma,Cat No:V90093)孵育1小时；洗涤96孔板3次；加入杂交瘤上清孵育1小时，洗涤3次；每孔加入100μL 1:10000倍稀释的羊抗鼠IgG二抗(Thermo,CatNo:31432)，室温孵育1小时后洗涤3次；每孔加入100μL TMB(北京百奥赛博，Cat No:ES-002)显色3分钟，再加入100μL/孔的终止液(2N H2SO4)终止反应，用Tecan Spark酶标仪测定各样品的OD450信号。
(3)与PD-L1-ECD结合抗体的FACS筛选。取50μL在上述ELISA检测中呈阳性的杂交瘤上清与50μL 293T-PD-L1细胞混合(1×105细胞/孔)加入到U形底96孔板中孵育1小时，用FACS缓冲液(PBS+3％FCS)离心洗涤2次后加入1:400倍稀释的PE标记羊抗鼠二抗(Biolegend，Cat No:405307)，孵育30分钟，经FACS缓冲液洗涤后，用BD C6流式细胞仪检测293T-PD-L1细胞的PE信号。
(4)具阻断PD-L1与PD-1结合的抗体的ELISA筛选。采用竞争ELISA筛选能够阻断PD-L1与PD-1结合的杂交瘤抗体。用PD-L1-ECD-hFc包被96孔ELISA板，孵育过夜，用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween 20)洗涤3次后，加入200μL封闭缓冲液，孵育1小时；洗涤3次后加入100μL杂交瘤上清，室温孵育1小时；继续向样品孔中加入100μL PD-1-Biotin，室温孵育1小时；洗涤3次，加入二抗Avidin HRP(Invitrogen，Cat No:18-4100-51)，孵育30分钟，加入TMB显色3分钟，用100μL/孔的终止液(2N H2SO4)终止反应，用Tecan Spark酶标仪测定各样品的OD450信号。
(5)具阻断PD-L1与PD-1结合的抗体的FACS筛选。采用竞争FACS筛选能够阻断PD-L1与PD-1结合的杂交瘤抗体。在U形底96孔板中，将杂交瘤上清或纯化的抗体与293T-PD-L1细胞(1×105细胞/孔))孵育1小时，加入0.05μg/mL的PD-1-biotin孵育1小时，离心后用FACS缓冲液洗涤2次，加入anti-biotin-PE(Biolegend，Cat No:409004)孵育30分钟，离心洗涤后，用BD C6流式细胞仪检测293T-PD-L1细胞的PE信号。
(6)杂交瘤的亚克隆。用有限稀释法，对能够阻断PD-L1与PD-1结合的杂交瘤进行亚克隆，随后再重复采用ELISA和FACS方法进行检测筛选，进而获得阳性杂交瘤单克隆。将阳性单克隆杂交瘤置50mL无血清培养基中(Invitrogen,Cat No:12045-076)培养9天，离心收取上清液。用Protein A亲和层析纯化单克隆抗体。纯化后的抗体样品经超滤离心管(Millipore，Cat No:ACS500024)换液浓缩后，用BCA方法测定蛋白浓度，用鳌试剂(厦门鲎试剂生物科技股份有限公司)检测抗体样品的内毒素含量。用ELISA和FACS检测纯化的抗体样品与PD-L1的结合及其阻断PD-L1与PD-1结合的活性，具体结果见表1-4和图1-4。
表1.用ELSIA方法检测PD-L1杂交瘤抗体与PD-L1结合的EC50
10E9C7G2 6F9B1A6 6C8D8
EC50(ng/mL) 2.336 0.5591 1.131
表2.用ELSIA方法检测PD-L1杂交瘤抗体阻断PD-L1结合PD-1的IC50
10E9C7G2 6F9B1A6 6C8D8
IC50(ng/mL) 94.37 58.71 54.39
表3.用FACS方法检测PD-L1杂交瘤抗体结合293T-PD-L1细胞的EC50
10E9C7G2 6F9B1A6 6C8D8
EC50(ng/mL) 7.015 11.29 28.41
表4.用FACS方法检测PD-L1杂交瘤抗体阻断PD-1结合293T-PD-L1细胞的IC50
10E9C7G2 6F9B1A6 6C8D8
IC50(ng/mL) 11.36 14.09 10.35
根据表1和图1可以看到，用ELISA测定所得到3个鼠源PD-L1杂交瘤抗体对于人PD-L1的结合EC50大多小于1.5ng/ml,表明上述抗体对人PD-L1有高度的亲和力。
根据表2和图2可以看到，用ELISA测定所得到3个鼠源PD-L1杂交瘤抗体对人PD-L1与其配体结合的阻断作用，阻断IC50最低可以低于55ng/ml,表明上述抗体对人PD-L1与其配体结合的有高度的阻断作用。
根据表3和图3可以看到，用FACS测定所得到3个鼠源PD-L1杂交瘤抗体对于人PD-L1的结合EC50最低的小于7.5ng/ml,再次表明上述抗体对人PD-L1有高度的亲和力。
根据表4和图4可以看到，用ELISA测定所得到3个鼠源PD-L1杂交瘤抗体对人PD-L1与其配体结合的阻断作用，阻断IC50最低可以低于11ng/ml,表明上述抗体对人PD-L1与其配体结合的有高度的阻断作用。
综合表1-4和图1-4可以得出，经过筛选得到的鼠源PD-L1杂交瘤抗体10E9C7G2、6F9B1A6、6C8D8在对人PD-L1的亲和力和对人PD-L1与其配体结合的阻断作用非常优异。
实施例2－PD-L1抗体可变区基因的克隆
用TRIzon(Cwbiotech,Cat No:CW0580)裂解PD-L1单克隆杂交瘤细胞株，提取杂交瘤细胞的总RNA。用HiFi Script cDNA合成试剂盒(Cwbiotech，Cat No:CW2569)将杂交瘤细胞的RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，用简并引物通过PCR方法(Kettleborough et al.(1993)Eur J Immunology 23:206-211；Strebe et al.(2010)Antibody Engineering 1:3-14)扩增抗体的重链和轻链的可变区基因。将PCR扩增产物连接到T/A载体后，转化DH5a感受态细胞，涂板并置37℃过夜培养。从培养板上挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒，测定抗体的基因序列。根据抗体的基因序列，分析其互补决定簇(CDR)和骨架区。一些抗体的重链和轻链的可变区基因序列和氨基酸序列编号见下表A：
表A：抗体的重链和轻链的可变区基因序列和氨基酸序列编号。
Figure BDA0002247896390000141
Figure BDA0002247896390000151
实施例3－鼠源PD-L1抗体6C8D8、6F9B1A6和10E9C7G2的人源化
(1)采用互补决定簇嫁接法来进行PD-L1抗体的人源化。首先，在IMGT数据库中分别搜寻与鼠源6C8D8、6F9B1A6和10E9C7G2抗体的轻、重链可变区同源性最高的人胚系抗体(germline antibody)序列。6C8D8抗体轻链可变区人源化选取的胚系为IGKV6-21*02，重链可变区人源化选取IGHV2-5*01。6F9B1A6抗体轻链可变区人源化选取的胚系为IGKV1-9*01，重链可变区人源化选取IGHV1-69*08。10E9C7G2抗体轻链可变区人源化选取的胚系为IGKV1-39*01，重链可变区人源化选取IGHV6-1*01。
(2)保留鼠源抗体的CDR区，将鼠源抗体的框架区(framework)序列用人胚系抗体的框架区序列置换。
(3)建立鼠源抗体的结构模型。逐个对比人源抗体与相应鼠源抗体框架区中每个位点的氨基酸，如果框架区的某个位点采用人的氨基酸序列没有导致CDR区域空间结构的破坏或改变，则该位点使用人的氨基酸序列，否则在该位点使用对应的鼠源序列(即回复突变为鼠源序列)。根据结构模拟，将6C8D8抗体人源化重链的第24位Phe回复突变为Val，第30位Ser回复突变为Thr，第49位Ala回复突变为Gly，第73位Thr回复突变为Asn，第96位Ala回复突变为Val。将6F9B1A6抗体人源化轻链的第46位Leu回复突变为Pro，第47位Leu回复突变为Trp，第71位Phe回复突变为Tyr。将6F9B1A6抗体人源化重链的第27位Gly回复突变为Tyr，第30位Ser回复突变为Ile，第48位Met回复突变为Ile，第68位Val回复突变为Ala，第70位Ile回复突变为Leu，第79位Ala回复突变为Val。将10E9C7G2抗体人源化轻链的第72位Phe回复突变为Tyr。10E9C7G2抗体人源化重链的第47位Trp回复突变为Tyr，第48位Leu回复突变为Met，第71位Pro回复突变为Arg，第78位Phe回复突变为Tyr。
6C8D8人源化抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：31和SEQID NO：32。6F9B1A6人源化抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34。10E9C7G2人源化抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36。将6C8D8、6F9B1A6和10E9C7G2人源化抗体构建为IgG1亚型。6C8D8人源化完整抗体的重链和轻链氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38。6F9B1A6人源化完整抗体的重链和轻链氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40。10E9C7G2人源化完整抗体的重链和轻链氨基酸序列号分别为SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42。
合成编码6C8D8、6F9B1A6和10E9C7G2人源化抗体轻链和重链的核酸序列(见序列表)，并插入到表达载体pcDNA3.1。用抗体轻链和重链表达质粒各0.5mg共转染1升293细胞(细胞密度为1×106)，在37度振摇培养6天，离心收集上清液，用Protein A纯化人源化抗体，纯化后的人源化抗体用于活性检测。
实施例4－人源化PD-L1抗体的活性检测
采用ELISA和FACS检测纯化的人源化抗体样品与PD-L1的结合，及其阻断PD-L1与PD-1结合的活性，具体方法参考实施例1。人源化抗体的活性测定结果见表5-8和图5-8。
表5用ELSIA方法检测人源化PD-L1抗体与PD-L1蛋白结合的EC50。
hu10E9C7G2 hu6F9B1A6 hu6C8D8
EC50(ng/mL) 0.684 4.482 2.238
表6.用ELSIA方法检测人源化PD-L1抗体阻断PD-L1和PD-1结合的IC50。
hu10E9C7G2 hu6F9B1A6 hu6C8D8
IC50(ng/mL) 146.7 107.6 139
表7.用FACS方法检测人源化PD-L1抗体与293T-PD-L1细胞结合的EC50。
hu10E9C7G2 hu6F9B1A6 hu6C8D8
EC50(ng/mL) 39.18 41.21 41.25
表8.用FACS方法检测人源化PD-L1抗体阻断PD-1结合293T-PD-L1细胞的IC50。
hu10E9C7G2 hu6F9B1A6 hu6C8D8
IC50(ng/mL) 32.69 36.51 43.75
根据表5和图5可以看到，用ELISA测定所得到3个人源化抗体对于人PD-L1的结合EC50在0.6-4.4ng/ml之间,表明上述抗体对人PD-L1有高度的亲和力。
根据表6和图6可以看到，用ELISA测定所得到3个人源化抗体对人PD-L1与其配体结合的阻断作用，阻断IC50最低可以低于108ng/ml,表明上述抗体对人PD-L1与其配体结合的有高度的阻断作用。
根据表7和图7可以看到，用FACS测定所得到3个人源化抗体对人PD-L1的结合EC50最低的小于40ng/ml,表明上述抗体对人PD-L1有高度的亲和力。
根据表8和图8可以看到，用ELISA测定所得到3个人源化抗体对人PD-L1与其配体结合的阻断作用，阻断IC50最低可以低于33ng/ml,表明上述抗体对人PD-L1与其配体结合的有高度的阻断作用。
综合表5-8和图5-8可以得出结论，人源化抗体hu10E9C7G2、hu6F9B1A6、hu6C8D8在对人PD-L1的亲和力和对人PD-L1与其配体结合的阻断作用特别优异。
实施例5－鼠源PD-L1杂交瘤抗体在混合淋巴细胞反应中对细胞因子分泌的影响
(1)用磁珠分选试剂盒，从人的外周血单个核细胞(PBMC)中分选出CD4+T细胞(Miltenyi,Cat No:130-096-533)和CD14+单核细胞(Miltenyi,Cat No:130-050-201)。
(2)将分选出的CD14+单核细胞重悬于树突状细胞分化培养基(Miltenyi,Cat No:130-094-812)中，置37℃，5％CO2培养箱中培养7天后，加入树突状细胞成熟培养基(Miltenyi,Cat No:130-0940813)继续培养3天。用完全培养基(RPMI 1640+10％FBS+1％L-glutamine+1％Sodium pyruvate)配置不同浓度的抗体。在U形底96孔板中，每孔加入50μLCD4+T细胞，50μL已分化的树突状细胞(DC)以及100μL不同浓度的PD-L1抗体(20μg/mL,2μg/mL…)，置37℃培养5天，收集上清液，用IL-2(R&D Systems,Cat No:DY202)以及IFN-γ(R&DSystems,Cat No:DY285)ELISA试剂盒检测上清液中细胞因子的浓度，测定结果见图9和10。混合淋巴细胞反应实验表明，PD-L1抗体能够促进活化的T细胞分泌IL-2以及IFN-γ。
实施例6－人源化PD-L1抗体在混合淋巴细胞反应中对细胞因子分泌的影响。
将CD4+T细胞，分化的DC细胞以及PD-L1人源化抗体混合，置37℃培养5天，收集上清，检测上清液中IL-2，IFN-γ的浓度，具体测定方法参考实施例5，结果如图11和12。实验表明，人源化的PD-L1抗体能够促进活化的T细胞分泌IL-2以及IFN-γ。
实施例7－人源化抗体的亲和力成熟
(1)将人源化hu6F9B1A6抗体,hu6C8D8抗体以及hu10E9C7G2抗体分别转换成对应的单链抗体(scFv)形式,采用大肠杆菌偏好的密码子优化其编码的核酸序列，然后交由基因合成公司合成，并将其克隆到噬菌体展示载体PAK100中。使用Aglient公司的随机突变试剂盒GeneMorph II Random Mutagenesis Kit(Cat NO:200550)，按照说明书通过PCR对其编码的核酸序列进行随机突变，用限制性内切酶NcoI和EcoRI酶切PCR产物以及噬菌体展示载体PAK100，纯化并回收核酸片段，用DNA连接酶将PCR产物片段与噬菌体展示载体连接。随后将连接产物电转化至感受态XL-Blue大肠杆菌中，构建hu6F9B1A6,hu6C8D8以及hu10E9C7G2抗体的随机突变文库。取10μl转化液通过梯度稀释铺板，将剩余转化液全部涂布与15cm的平皿中，37℃培养过夜。次日，刮取平皿中的菌落并冻存。取部分冻存菌接种于200ml 2YT培养基中，培养至OD600达到0.5时加入1012M13KO7进行超感染，32℃培养过夜，第二天经PEG/NaCl沉淀浓缩成1ml的噬菌体文库。
(2)将500μl噬菌体文库与生物素标记的PD-L1蛋白在室温混合孵育2小时，然后加入50μl用牛血清白蛋白封闭的链霉素亲和素磁珠，室温孵育30min。将混合液置于磁力架上，吸干液体，并用1ml的PBST反复洗涤，以洗掉结合弱的噬菌体，然后加入未标记的PD-L1蛋白竞争过夜，次日再反复用1ml PBST清洗，最后用胰酶将吸附在磁珠上的噬菌体消化下来，并感染对数生长期的大肠杆菌XL-Blue，经过超感染，生产并浓缩新一轮的噬菌体用于下一轮的淘选。重复5轮上述步骤，富集高亲和力的克隆。
(3)采用竞争ELISA筛选scFv噬菌体。将最后一轮淘选的单克隆大肠杆菌分别接种于96孔深孔板中，每孔加入300μl含胺苄青霉素和M13-KO7辅助噬菌体的2YT培养基，37℃过夜培养，制备单克隆的scFv噬菌体。将含有scFv噬菌体的培养上清液用PBST缓冲液稀释5倍，加入10nM PD-L1抗原或者BSA，置室温孵育1小时，将混合物转移到包埋了PD-L1并经BSA封闭的96孔ELISA板上，室温孵育15分钟，用PBST清洗8遍，加入偶联了辣根过氧化物酶的抗M13抗体，孵育30分钟。用PBST洗板，加入TMB显色，用1.0M H2SO4终止显色，测定样品在450nm波长的吸光度。挑选对应于低吸光度的单克隆大肠杆菌进行测序。与人源化的抗体序列相比，亲和力成熟后抗体的重轻链序列突变见表9。
表9.人源化PD-L1抗体亲和力成熟前后抗体的重轻链序列突变
Figure BDA0002247896390000211
Figure BDA0002247896390000221
实施例8－人源化及亲和力成熟的PD-L1抗体的亲和力检测
将人源化抗体轻重链发生的各种点突变组合表达后，用Biacore3000测定各人源化抗体及其亲和力成熟抗体样品与PD-L1的结合。
测定方法包括如下步骤：以氨基偶联的方式将anti-human IgG固定于CM5芯片上，接着以10μL/min的流速捕获亲和力成熟的人源化抗体。切换流速到30μL/min，将不同浓度的带组氨酸标签的PD-L1抗原(100nM，50nM，25nm等)依次流经实验通道和参比通道，结合时间为3min，解离时间为10min。最后用pH1.7的甘氨酸缓冲液再生芯片。
结果表明，与人源化的6C8D8抗体相比，将其重链第58位Asn突变为Thr(重链SeqID 43)，轻链第51位Ala突变为Val后(轻链Seq ID 44)，抗体的亲和力提高了9.25倍；与人源化的6F9B1A6抗体相比，将其重链第51位Phe突变为Ile(重链Seq ID 45)，轻链第31位Ser突变为Asn，第90位Pro突变成Thr(轻链Seq ID 46)后，抗体的亲和力提高了4.2倍；与人源化的6F9B1A6抗体相比，将其重链第51位Phe突变为Ile(重链Seq ID 45)，轻链第31位Ser突变为Asn，第90位Pro突变成Ser(轻链Seq ID 47)后，抗体的亲和力提高了3.7倍；与人源化的10E9C7G2抗体相比，将其重链第60位Asn突变为Ser(重链Seq ID 48)，轻链第27位Ser突变为Ile，第93位Ser突变成Gly(轻链Seq ID 50)后，抗体的亲和力提高了7.2倍；与人源化的10E9C7G2抗体相比，将其重链第60位Asn突变为Asp(重链Seq ID 49)，轻链第27位Ser突变为Ile，第93位Ser突变成Gly(轻链Seq ID 50)后，抗体的亲和力提高了4.8倍。具体结果见表10。
表10.人源化及其亲和力成熟的PD-L1抗体与PD-L1-His的亲和力。
Figure BDA0002247896390000231
实施例9－亲和力成熟的人源化PD-L1抗体在混合淋巴细胞反应中对细胞因子分泌的影响
将CD4+T细胞，分化的DC细胞以及PD-L1抗体混合，置37℃培养5天，收集上清液，检测上清液中IL-2和IFN-γ的浓度，具体测定方法参考实施例2，结果如图13和14。实验表明，亲和力成熟的人源化PD-L1抗体能够促进活化的T细胞分泌IL-2以及IFN-γ。
以上实施例的结果表明本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者包含本发明所述单克隆抗体或其抗原结合片段的单克隆抗体偶联物在制备阻断PD-L1与PD-1结合的药物、调节PD-L1活性或PD-L1表达水平的药物、解除PD-L1对机体免疫抑制的药物、激活T淋巴细胞的药物、提高T淋巴细胞表达IL-2和INF-γ的药物、以及在预防和治疗或者辅助治疗肿瘤的药物方面具有良好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 东大生物技术（苏州）有限公司
<120> 一组PD-L1单克隆抗体及其医药用途
<130> 2019
<160> 92
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 鼠
<223> 6C8D8重链可变区DNA序列
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gaagttaagc tggagcagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatt 60
acctgcactg tctctgggtt ctcattaacc agctatgata taagctggat tcgccagcca 120
ccaggaaagg gtctggagtg gcttggagta atatggactg gtggaggcac aaattataat 180
tcagctttca tgtccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatatatt actgtgtaag aggacgggac 300
tgggactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348
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<212> DNA
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gatattgtga tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60
ttctcctgca gggccagtca gagcattggc acaagcatac actggtatca gcaaagaaca 120
aatggttctc caaggcttct cattaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180
aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240
gaagatattg catattatta ctgtcaacaa agtaatagct ggccattcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataaa a 321
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Glu Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Gly Arg Asp Trp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Tyr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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tctggacagg gtcttgagtg gattgggtgg ttttaccctg gaagtggtag tataaagtac 180
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Gly Tyr
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Thr Val His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
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Lys Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
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Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
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Ala Arg His Gly Thr Gly Lys Phe Asn Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr
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Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser
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Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Thr Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Phe Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu
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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Pro Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
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Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Leu Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Arg Asn Gln Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
His Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Asp Tyr Gly Ser Asp Trp Pro Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 12
<211> 108
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 10E9C7G2轻链可变区氨基酸序列
<400> 12
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Thr Thr Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Gly Leu Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6C8D8重链CDR1区氨基酸序列
<400> 13
Ser Tyr Asp Ile Ser
1 5
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6C8D8重链CDR2区氨基酸序列
<400> 14
Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met Ser
1 5 10 15
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6C8D8重链CDR3区氨基酸序列
<400> 15
Gly Arg Asp Trp Asp Phe Asp Tyr
1 5
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6C8D8轻链CDR1区氨基酸序列
<400> 16
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser Ile His
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6C8D8轻链CDR2区氨基酸序列
<400> 17
Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6C8D8轻链CDR3区氨基酸序列
<400> 18
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe Thr
1 5
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6F9B1A6重链CDR1区氨基酸序列
<400> 19
Gly Tyr Thr Val His
1 5
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6F9B1A6重链CDR2区氨基酸序列
<400> 20
Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6F9B1A6重链CDR3区氨基酸序列
<400> 21
His Gly Thr Gly Lys Phe Asn Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6F9B1A6轻链CDR1区氨基酸序列
<400> 22
Arg Ala Ser Ser Thr Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6F9B1A6轻链CDR2区氨基酸序列
<400> 23
Ala Thr Phe Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6F9B1A6轻链CDR3区氨基酸序列
<400> 24
Gln Pro Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 10E9C7G2重链CDR1区氨基酸序列
<400> 25
Ser Gly Tyr Trp Asn
1 5
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 10E9C7G2重链CDR2区氨基酸序列
<400> 26
Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Leu Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 10E9C7G2重链CDR3区氨基酸序列
<400> 27
Gly Asp Tyr Gly Ser Asp Trp Pro Pro Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 10E9C7G2轻链CDR1区氨基酸序列
<400> 28
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn Ser Leu Gln
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 10E9C7G2轻链CDR2区氨基酸序列
<400> 29
Arg Thr Thr Asn Leu Pro Ser
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 10E9C7G2轻链CDR3区氨基酸序列
<400> 30
Gln Gln Ser Ser Gly Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 31
<211> 116
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 人源化抗体6C8D8重链可变区氨基酸序列
<400> 31
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Gly Arg Asp Trp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 人源化抗体6C8D8轻链可变区氨基酸序列
<400> 32
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 人源化抗体6F9B1A6重链可变区氨基酸序列
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Gly Tyr
20 25 30
Thr Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Thr Gly Lys Phe Asn Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 106
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 人源化抗体6F9B1A6轻链可变区氨基酸序列
<400> 34
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Thr Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Phe Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Pro Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 121
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 人源化抗体10E9C7G2重链可变区氨基酸序列
<400> 35
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Leu Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Asp Tyr Gly Ser Asp Trp Pro Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 108
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 人源化抗体10E9C7G2轻链可变区氨基酸序列
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Thr Thr Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Gly Leu Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 446
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 人源化抗体6C8D8重链全长氨基酸序列
<400> 37
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Gly Arg Asp Trp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 38
<211> 214
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 人源化抗体6C8D8轻链全长氨基酸序列
<400> 38
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 39
<211> 450
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 人源化抗体6F9B1A6重链全长氨基酸序列
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Gly Tyr
20 25 30
Thr Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Thr Gly Lys Phe Asn Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 40
<211> 213
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 人源化抗体6F9B1A6轻链全长氨基酸序列
<400> 40
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Thr Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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Ala Thr Phe Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
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Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Pro Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
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Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
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Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 41
<211> 451
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 人源化抗体10E9C7G2重链全长氨基酸序列
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
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Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Tyr Met
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Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 42
<211> 215
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 人源化抗体10E9C7G2轻链全长氨基酸序列
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Thr Thr Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 43
<211> 116
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 亲和力成熟人源化抗体6C8D8重链可变区氨基酸序列
<400> 43
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Gly Arg Asp Trp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 亲和力成熟人源化抗体6C8D8轻链可变区氨基酸序列
<400> 44
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Val Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 45
<211> 120
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 亲和力成熟人源化抗体6F9B1A6重链可变区氨基酸序列
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Gly Tyr
20 25 30
Thr Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Thr Gly Lys Phe Asn Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 46
<211> 106
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 亲和力成熟人源化抗体6F9B1A6轻链可变区氨基酸序列1
<400> 46
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Thr Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Phe Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 106
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 亲和力成熟人源化抗体6F9B1A6轻链可变区氨基酸序列2
<400> 47
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Thr Val Asn Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Phe Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 121
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 亲和力成熟人源化抗体10E9C7G2重链可变区氨基酸序列1
<400> 48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Leu Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Asp Tyr Gly Ser Asp Trp Pro Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 49
<211> 121
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 亲和力成熟人源化抗体10E9C7G2重链可变区氨基酸序列2
<400> 49
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asp Leu Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Asp Tyr Gly Ser Asp Trp Pro Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 108
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 亲和力成熟人源化抗体10E9C7G2轻链可变区氨基酸序列
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ile Ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Thr Thr Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gly Gly Leu Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 16
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6C8D8亲和力成熟重链CDR2区氨基酸序列
<400> 51
Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Phe Met Ser
1 5 10 15
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6C8D8亲和力成熟轻链CDR2区氨基酸序列
<400> 52
Tyr Val Ser Glu Ser Ile Ser
1 5
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6F9B1A6亲和力成熟重链CDR2区氨基酸序列
<400> 53
Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6F9B1A6亲和力成熟轻链CDR1区氨基酸序列
<400> 54
Arg Ala Ser Ser Thr Val Asn Tyr Met His
1 5 10
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6F9B1A6亲和力成熟轻链CDR3区氨基酸序列1
<400> 55
Gln Thr Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 6F9B1A6亲和力成熟轻链CDR3区氨基酸序列2
<400> 56
Gln Ser Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 57
<211> 16
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 10E9C7G2亲和力成熟重链CDR2区氨基酸序列1
<400> 57
Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Leu Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 58
<211> 16
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 10E9C7G2亲和力成熟重链CDR2区氨基酸序列2
<400> 58
Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asp Leu Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 10E9C7G2亲和力成熟轻链CDR1区氨基酸序列
<400> 59
Ser Ala Ser Ile Ser Ile Ser Ser Asn Ser Leu Gln
1 5 10
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠
<223> 10E9C7G2亲和力成熟轻链CDR3区氨基酸序列
<400> 60
Gln Gln Ser Gly Gly Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 61
<211> 354
<212> DNA
<213> 鼠
<400> 61
gaggtgcagc ttcaggagtc aggacctggc ctggcaaaac cttctcagac tctgtccctc 60
acctgttctg tcactggcta ctccatcacc agtgattact ggacctggat ccggaaattc 120
ccagggaata gacttgagta catggggtac ataagctaca ctggtagcac ttactacaat 180
ccatctgtca aaagtcgaat ctccttgact cgagacacat ccaagaacca gtattacctg 240
cagttgaatt ctgtgactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag atcccgcgga 300
tggttagatt tcttcgatgt ctggggcaca gggaccgcgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 62
<211> 339
<212> DNA
<213> 鼠
<400> 62
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60
atgacctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctccttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatggctat 300
ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339
<210> 63
<211> 118
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 63
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ala Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Val Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Leu Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Arg Gly Trp Leu Asp Phe Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr
100 105 110
Ala Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 64
<211> 113
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 64
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Gly Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 65
<211> 360
<212> DNA
<213> 鼠
<400> 65
caggtccagc tgcagcagtc tggagctgag ctggtgaaac ccggggcatc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcact gagtatatta tacactgggt aaagcagagg 120
tctggacagg gtcttgagtg gattgggtgg ttttaccctg gaagtggtag tataaagtac 180
aatgagaaat tcaaggacaa ggccacattg actgcggaca aatcctccag cacagtctat 240
atggagctta gtagattgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagacacgaa 300
gggttattcc tacctcactt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 360
<210> 66
<211> 321
<212> DNA
<213> 鼠
<400> 66
gatattgtga tgacacagtc tccagcatcc ctgtccatgg ctataggaga aaaagtcacc 60
atcagatgca taaccagcac tgatattgat gatgatatgg actggtacca gcagaagcca 120
ggggaacctc ctaagctcct tatttcagag ggcaatactc ttcgtcctgg agtcccatcc 180
cgattctcca gcagtggcta tggtacagat tttgttttta caattgaaaa catggtctca 240
gatgatgttg cagattacta ctgtttgcaa agtgataact tgccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 67
<211> 120
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 67
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Ile Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg His Glu Gly Leu Phe Leu Pro His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 68
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 68
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Met Val Ser
65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 69
<211> 360
<212> DNA
<213> 鼠
<400> 69
caggtccagc tgcagcagtc tggagctgag ctggtgaaac ccggggcatc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta catcttcact gcatatacta tacactgggt aaagcagagg 120
tctggacagg gtcttgagtg gattgggtac ttttaccctg gcagtggtag tataaagtac 180
aatgagaaat tcaaggacaa ggccacattg actgcggaca aatcctccag cacagtctat 240
atggagctta gtagattgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aaaacacggc 300
actgggacgt ggaactactt tgactactgg ggccaaggca ccgctctcac agtctcctca 360
<210> 70
<211> 318
<212> DNA
<213> 鼠
<400> 70
caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60
atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 120
tcctccccca aaccctggat ttttgtcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcaatgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300
accaagctgg agctgaaa 318
<210> 71
<211> 120
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 71
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys His Gly Thr Gly Thr Trp Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ala Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 72
<211> 106
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 72
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Phe
35 40 45
Val Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 73
<211> 354
<212> DNA
<213> 鼠
<400> 73
gaggtgcagc ttcaggagtc aggacctggc ctggcaaaac cttctcagac tctgtccctc 60
acctgttctg tcactggcta ctccatcacc agtgattact ggaactggat ccggaaattc 120
ccagggaata aacttgagta catggggtac ataagctaca gtggtagcac ttactccaat 180
ccatctctca aaagtcgaat ctccataact cgagacacat ccaagaacca gtattacctg 240
cagttgaatt ctgtgactac tgaggacaca gccacatatt actgtgcaag atctggggaa 300
tggttagtcc cgtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354
<210> 74
<211> 339
<212> DNA
<213> 鼠
<400> 74
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctacctgtgt cagttggaga gaaggttact 60
atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atgaaaagaa ctccttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180
gaatctggag tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgaagcctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatgggtat 300
ccgttcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339
<210> 75
<211> 118
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 75
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ala Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Gly Glu Trp Leu Val Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 76
<211> 113
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 76
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Glu Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Pro Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Gly Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 77
<211> 354
<212> DNA
<213> 鼠
<400> 77
gaggtgcagc ttcaggagtc aggacctggc ctggcaaagc cttctcagac tctgtccctc 60
acctgttctg tcactggcta ctccatcacc agtgattact ggcactggat ccggaaactc 120
ccagggaata aacttgagta catggggtac ataagctaca ctggtagtac ttactacact 180
ccatctctca aaagtcgaat ctccataact cgagacacat ccaagaacca gtattacctg 240
cagttgaatt ctgtgactac tgaggacaca gccacatatt actgtacaag agttggggga 300
tggttactgt acttcgatgt ctggggcaca gggaccgcgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 78
<211> 339
<212> DNA
<213> 鼠
<400> 78
gacattgtga tgtcacagtt tccatcctcc ctagctatgt cagttggaga gaaggttact 60
atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctccttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
attaccagtg tgaagactga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatggctat 300
ccattcacgt tcggctcggg gacacaattg gaaataaaa 339
<210> 79
<211> 118
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 79
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ala Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Trp His Trp Ile Arg Lys Leu Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Val Gly Gly Trp Leu Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr
100 105 110
Ala Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 80
<211> 113
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 80
Asp Ile Val Met Ser Gln Phe Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Thr Ser Val Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Gly Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 81
<211> 360
<212> DNA
<213> 鼠
<400> 81
caggtgcaat tgcagcagtc tggggctcag ctggttaggc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggtta ctcattcacc agttattgga tgcactgggt gaagcagagg 120
cctggacaag gtcttgagtg gattggcatg attgatcctt ccgatggtga acctaggtta 180
aatcagaagt tcagggacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccaa cacagcctac 240
atgcaactca gcagcccggc atctgatgac tctgcggtct attactgtgt aagacggggt 300
agctacgcct tatactactt tccctactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 360
<210> 82
<211> 333
<212> DNA
<213> 鼠
<400> 82
gatattgtga tgacacagac tacagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatt ctgcatctaa tctagaatct 180
gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaggtaatga ggatccgtac 300
acgttcggag gggggaccca gctggaaata aaa 333
<210> 83
<211> 120
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 83
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Gln Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Gly Glu Pro Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Ala Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Arg Gly Ser Tyr Ala Leu Tyr Tyr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 84
<211> 111
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 84
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 85
<211> 357
<212> DNA
<213> 鼠
<400> 85
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt acctatggca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccagacaaga ggctggagtt ggtcgcaatc attaatggta atggtggtaa cacctattat 180
ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc acgtttttac 300
gcacgttact atcctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357
<210> 86
<211> 336
<212> DNA
<213> 鼠
<400> 86
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120
ttgttacaga ggccgggcca gtctccaaag cgcctattct atctggtgtc taaactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggattt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 87
<211> 119
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ile Ile Asn Gly Asn Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Ala Arg Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 88
<211> 112
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 88
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Phe Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Phe Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 89
<211> 354
<212> DNA
<213> 鼠
<400> 89
caggttactg tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtgtg 60
agttgttctt tttctgggtt ttcagtgagc acttctggta tgggtgtgac ctggtttcgt 120
cagccttcag gaaagggtct ggagtggctg gcacacattt actgggatga tgacaagcac 180
tataacccat ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg ctacctccag caaccaggta 240
ttcctcacga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca catacttctg tactcgaacc 300
tactataggc ccatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354
<210> 90
<211> 336
<212> DNA
<213> 鼠
<400> 90
aacattatga tgacacagtc gccatcatct ctggctgtgt ctgcaggaga aaaggtcact 60
atgacctgta agtccagtca aagtgtttta tacagttcaa atcagaagaa ttatttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180
gaatctggtg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt tactcttacc 240
atcagcagtg tacaacctga agacctggca gtttattact gttatcaata tttctcctcg 300
cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 91
<211> 118
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 91
Gln Val Thr Val Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Val Ser Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Thr Trp Phe Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys His Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Ala Thr Ser Ser Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Thr Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Thr Arg Thr Tyr Tyr Arg Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 92
<211> 112
<212> PRT
<213> 鼠
<400> 92
Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Gln
85 90 95
Tyr Phe Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (12)

1.一组PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链和轻链，其特征在于，
所述重链CDR1的序列为SEQ ID ：13 、CDR2的序列为SEQ ID ：14、CDR3的序列为SEQ ID：15，所述轻链CDR1的序列为SEQ ID ：16、CDR2的序列为SEQ ID ：17、CDR3的序列为SEQ ID：18；
或者：所述重链CDR1的序列为SEQ ID ：19 、CDR2的序列为SEQ ID ：20、CDR3的序列为SEQ ID ：21，所述轻链CDR1的序列为SEQ ID ：22、CDR2的序列为SEQ ID ：23、CDR3的序列为SEQ ID ：24；
或者：所述重链CDR1的序列为SEQ ID ：25 、CDR2的序列为SEQ ID ：26、CDR3的序列为SEQ ID ：27，所述轻链CDR1的序列为SEQ ID ：28、CDR2的序列为SEQ ID ：29、CDR3的序列为SEQ ID ：30；
上述单克隆抗体或其抗原结合片段与人PD-L1-hFc蛋白结合的EC50值经过ELISA法测定在0.5591至2.336ng/ml之间。
2.根据权利要求1所述的一组PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、7、11中的一种；所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO： 4、8、12中的一种。
3.根据权利要求2所述的一组PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链和轻链经过人源化；所述人源化后的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：31、33、35中的一种；所述人源化后的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：32、34、36中的一种。
4.根据权利要求3所述的一组PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源化后的重链的全长氨基酸选自SEQ ID NO：37、39、41中的一种；所述人源化后的轻链的全长氨基酸选自SEQ ID NO：38、40、42中的一种。
5.根据权利要求4所述的一组PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述人源化抗体经亲和力成熟；所述亲和力成熟后的重链的CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：13、19、25中的一种；所述亲和力成熟后的重链的CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：51、53、57、58中的一种；所述亲和力成熟后的重链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：15、21、27中的一种；所述亲和力成熟后的轻链的CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：16、54、59中的一种；所述亲和力成熟后的轻链的CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：52、23、29中的一种；所述亲和力成熟后的轻链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：18、55、56、60中的一种；其中所述抗原结合片段的重链和轻链包含分别跨越所述抗体的重链和轻链的CDR1到CDR3的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的一组PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述亲和力成熟后的重链的可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：43、45、48、49中的一种；所述亲和力成熟后的轻链的可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：44、46、47、50中的一种。
7.一组核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-6任一项所述的PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段。
8.一组表达载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求7所述的核酸分子的序列以及与该序列相关的表达调控序列。
9.权利要求1-6任一项所述的一组PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段在制备如下药物中的用途：阻断PD-L1与PD-1结合的药物、调节PD-L1活性或PD-L1水平的药物、解除PD-L1对机体免疫抑制的药物、激活T淋巴细胞的药物或者提高T淋巴细胞中IL-2表达的药物。
10.一种单克隆抗体偶联物，包括单克隆抗体和偶联部分，其中，所述单克隆抗体为权利要求1-6任一项所述的一组PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、细胞因子受体片段、酶、荧光素、和生物素中的一种或多种。
11.权利要求10中所述的单克隆抗体偶联物在制备如下药物中的用途：阻断PD-L1与PD-1结合的药物，调节PD-L1活性或PD-L1水平的药物、解除PD-L1对机体免疫抑制的药物、激活T淋巴细胞的药物或者提高T淋巴细胞中IL-2表达的药物。
12.权利要求10中所述的单克隆抗体偶联物在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的用途。
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