CN112574307A - 抗人Claudin18.2抗体及其应用 - Google Patents

抗人Claudin18.2抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种结合人Claudin18.2的抗体或其片段，以及它们的编码核酸等。本发明的抗人Claudin18.2抗体对抗原Claudin18.2具有强亲和力，对靶点表达细胞具有显著的补体依赖性细胞毒(CDC)活性和抗体依赖性细胞毒(ADCC)活性，并且表现出与人CLDN18.2的高特异性。

Description

抗人Claudin18.2抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种新的抗人Claudin18.2抗体或其功能性片段。本发明还涉及所述抗体或其功能性片段的应用。
背景技术
人紧密连接蛋白Claudin18(CLDN18)属于密连接蛋白家族，这类蛋白生物学上在构建细胞紧密连接、维持细胞屏障功能和参与细胞间分子传递等方面发挥作用。Claudin18蛋白分子量约26KD，可以通过选择性剪接使Claudin蛋白变成具有不同特性的Claudin亚型：CLDN18.1和CLDN18.2。其中CLDN18.2在多种人上皮肿瘤类型的原发病灶和转移灶中表达，并在弥散性癌细胞中持续表达。在食管癌、胰腺癌、肺癌和胃癌细胞中，CLDN18.2的表达水平更是有显著的增高。Sahin等人研究认为CLDN18.2是个重要的胃癌生物标志物，它存在于70％的胃癌病人中，其中90％至95％被诊断为腺癌，另外5-10％包括淋巴瘤、胃肠道间质瘤(GIST)和类癌肿瘤。
德国的生物科技公司Ganymed开发了一种针对CLDN18.2的单克隆抗体IMAB362，目前处于临床III期临床试验中，用于治疗胃食管癌晚期患者。单独的IMAB362抗体结合在体外和体内均导致表达CLDN18.2的靶细胞的增殖抑制，其抑制肿瘤生长和清除癌细胞作用机制一是通过补体依赖的细胞毒性作用(CDC)，二是抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)，各种作用模式被证明独立存在但有协同作用。IMAB362抗体针对转移性食管癌、转移性胃癌适应症，目前美国和欧盟处于临床3期，预期将于2021年申请上市。
然而，IMAB362是一个嵌合抗体，还有较多的鼠源氨基酸，在人体内引起排斥免疫反应的概率相对比较高。因此，本领域仍然存在对人CLDN18.2具有更高特异性、亲和力和生物活性的抗体、特别是人源化抗体的需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，通过杂交瘤筛选和人源化技术，获得特异性结合人CLDN18.2的高亲和力抗体，其中通过人源化设计，该抗体最大程度减少了鼠源氨基酸的数目，预期拥有更好的体内安全性和应用前景。
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种特异性结合人CLDN18.2的抗体或其片段，并提供其用途。其中，本发明所述的抗体的片段涵盖抗体的各种功能性片段，例如其抗原结合部分，如Fab、F(ab’)2或scFv片段。
本发明的技术方案如下。
一方面，本发明提供一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)包含选自以下的CDR组合(VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3；VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3)：
(1)如SEQ ID NO:31所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:32所示的VH-CDR2、如SEQ IDNO:33所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:34所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:35所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO:36所示的VL-CDR3；
(2)如SEQ ID NO:37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:38所示的VH-CDR2、如SEQ IDNO:39所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:40所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO:42所示的VL-CDR3；
(3)如SEQ ID NO:43所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:44所示的VH-CDR2、如SEQ IDNO:45所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:46所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO:47所示的VL-CDR3；
(4)如SEQ ID NO:48所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:49所示的VH-CDR2、如SEQ IDNO:50所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:40所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO:51所示的VL-CDR3；
(5)如SEQ ID NO:52所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:53所示的VH-CDR2、如SEQ IDNO:54所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:55所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO:56所示的VL-CDR3；
(6)如SEQ ID NO:57所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:58所示的VH-CDR2、如SEQ IDNO:33所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:34所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:59所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO:60所示的VL-CDR3；
(7)如SEQ ID NO:61所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:62所示的VH-CDR2、如SEQ IDNO:63所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:46所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO:64所示的VL-CDR3；
(8)如SEQ ID NO:65所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:66所示的VH-CDR2、如SEQ IDNO:67所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:68所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO:69所示的VL-CDR3；
(9)如SEQ ID NO:65所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:70所示的VH-CDR2、如SEQ IDNO:71所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:72所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO:73所示的VL-CDR3；
(10)如SEQ ID NO:74所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:75所示的VH-CDR2、如SEQ IDNO:76所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:77所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO:78所示的VL-CDR3；
(11)如SEQ ID NO:79所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:80所示的VH-CDR2、如SEQ IDNO:81所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:82所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO:83所示的VL-CDR3；
(12)如SEQ ID NO:37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:38所示的VH-CDR2、如SEQ IDNO:39所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:85所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO:42所示的VL-CDR3；
(13)如SEQ ID NO:37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:38所示的VH-CDR2、如SEQ IDNO:39所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:85所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO:86所示的VL-CDR3；
(14)如SEQ ID NO:37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:38所示的VH-CDR2、如SEQ IDNO:39所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:85所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO:87所示的VL-CDR3；
(15)如SEQ ID NO:74所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:75所示的VH-CDR2、如SEQ IDNO:76所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:89所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO:90所示的VL-CDR3；和
(16)如SEQ ID NO:79所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:91所示的VH-CDR2、如SEQ IDNO:81所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:92所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO:93所示的VL-CDR3。
优选地，在本发明提供的抗体或其片段中，所述重链可变区包含：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29中任一个所示的氨基酸序列或与所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或
所述轻链可变区包含：
选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30中任一个所示的氨基酸序列或与所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的具体实施方式，所述抗体或其片段包含的重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
(1)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(2)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(3)如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(4)如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(5)如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(6)如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与如SEQ IDNO:12所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(7)如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与如SEQ IDNO:14所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(8)如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或与如SEQ IDNO:16所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(9)如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或与如SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(10)如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或与如SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(11)如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或与如SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(12)如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与如SEQ IDNO:24所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(13)如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或与如SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(14)如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或与如SEQ IDNO:26所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(15)如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或与如SEQ IDNO:28所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(16)如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或与如SEQ IDNO:30所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
本发明的上下文中，所述至少75％同一性为例如至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性等≥75％的任何百分比的同一性。
本发明提供的抗体或其片段可以为单克隆抗体、单链抗体、双功能抗体、单域抗体、纳米抗体、完全或部分人源化的抗体或者嵌合抗体等任意形式，或者，所述抗体或其片段为半抗体或半抗体的抗原结合片段，例如scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv；关于本发明提供的抗体的片段，优选地，所述片段为抗体的能够特异性结合人Claudin18.2的任何片段。
优选地，所述抗体或其片段还包含人或鼠的恒定区，优选包含人或鼠的轻链恒定区(CL)和/或重链恒定区(CH)；
更优选地，所述抗体或其片段包含选自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区。
优选地，所述抗体为单克隆抗体，优选为鼠源、嵌合或人源化的单克隆抗体；更优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区为IgG1或IgG4亚型，轻链恒定区为κ型；
根据本发明的具体实施方式，所述单克隆抗体的重链恒定区包含如SEQ ID NO:124所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
根据本发明的具体实施方式，所述单克隆抗体的轻链恒定区包含如SEQ ID NO:125所示氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供一种核酸分子，其编码本发明所述的抗体或其片段或者编码所述抗体或其片段中包含的重链CDR、轻链CDR、轻链可变区、重链可变区、重链或轻链。
根据本发明的具体实施方式，所述核酸分子编码本发明所述的抗体或其片段中的重链可变区或轻链可变区，例如，所述核酸分子包含如SEQ ID NOs:96-125中任一个所示的核苷酸序列。
本发明的核酸分子可以被克隆到载体中，进而转化或转染宿主细胞。因此，还一方面，本发明提供一种载体，其包含本发明的核酸分子。所述载体可以为真核表达载体、原核表达载体、人工染色体及噬菌体载体等。
本发明的载体或核酸分子可以用于转化或转染宿主细胞或以任何方式进入宿主细胞内，用于保存或表达抗体等目的。因此，又一方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的核酸分子和/或载体，或者所述宿主细胞被本发明的核酸分子和/或载体转化或转染。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。
本发明提供的抗体可以利用本领域已知的任何方法获得。例如，可以先由本发明提供的核酸分子获得所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区，或者获得所述抗体的重链和/或轻链，然后与所述抗体的任选其他结构域组装成抗体；或者，在允许本发明提供的宿主细胞表达所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区或者所述抗体的重链和/或轻链以组装成所述抗体的情况下，培养所述宿主细胞。任选地，所述方法还包括回收产生的抗体的步骤。
本发明提供的抗体或其片段还可与其他部分结合，例如细胞表面受体、小分子化合物如氨基酸和糖类、小分子聚合物或对本发明所述抗体进行修饰的任何其它部分，或者甚至是活性蛋白或多肽。因此，另一方面，本发明提供一种缀合物或融合蛋白，其包含本发明提供的抗体或其片段。例如，该缀合物或融合蛋白可以是包含本发明所述抗体或其片段的双特异性抗体。
本发明提供的抗体或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或缀合物或融合蛋白可以被包含在药物组合物中，更特别地被包含在药物制剂中，从而根据实际需要用于各种目的。因此，在又一方面，本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明所述的抗体或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或缀合物或融合蛋白，以及可选的药学上可接受的辅料。
出于任何使用目的，本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗体分子或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞、药物组合物和/或缀合物或融合蛋白。
另一方面，本发明提供上述抗体或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞、药物组合物和/或缀合物或融合蛋白在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的用途，所述癌症选自胰腺癌、胃癌、结肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、胆囊癌和头颈癌。
再一方面，本发明还提供所述抗体或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞、药物组合物和/或缀合物或融合蛋白在制备用于诊断癌症的试剂中的用途，所述癌症选自胰腺癌、胃癌、结肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、胆囊癌和头颈癌。
另一方面，本发明还提供一种治疗或诊断癌症的方法，所述方法包括使本发明的抗体或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞、药物组合物和/或缀合物或融合蛋白与来自受试者的样品相接触，所述癌症选自胰腺癌、胃癌、结肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、胆囊癌和头颈癌；
优选地，所述受试者为哺乳类动物；更优选地，所述受试者为人。
将本发明的抗人Claudin18.2抗体的编码基因通过慢病毒载体转导到原代健康供者的T细胞上，发现所制备的CART细胞能够被表达人Claudin18.2的细胞有效活化。因此，还一方面，本发明还提供本发明的抗体或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞、药物组合物和/或缀合物或融合蛋白在制备CART细胞中的用途。
本发明提供了一种新型的能够特异性结合人Claudin18.2的抗体。与现有抗人Claudin18.2抗体相比，本发明的抗体具有以下特点：
本发明提供的抗人Claudin18.2抗体对抗原Claudin18.2具有强亲和力，对靶点表达细胞具有显著的补体依赖性细胞毒(CDC)活性和抗体依赖性细胞毒(ADCC)活性，且所述性质强于IMAB362或与其相当。此外，与IMAB362相比，本发明的抗体表现出与人CLDN18.2更高的特异性。
此外，将本发明的抗人Claudin18.2抗体的编码基因通过慢病毒载体转导到原代健康供者的T细胞上，制备CART细胞。经靶细胞刺激后，检测CART细胞的表面活化蛋白CD25和分泌的IFNγ，发现制得的CART细胞能够被表达人Claudin18.2的细胞有效活化，同样证明了本发明的抗体与人CLDN18.2的靶点特异性。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示了抗人CLDN18.2嵌合抗体的体外细胞结合实验结果。
图2显示了抗人CLDN18.2人源化抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)实验结果，其中2A：CHOK1；2B：BxPC3；2C：NCI-N87。
图3显示了抗人CLDN18.2人源化抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)实验结果，其中3A：CHOK1；3B：BxPC3；3C：NCI-N87。
图4显示了抗人CLDN18.2人源化抗体的同族蛋白结合特征分析结果。
图5显示了抗人CLDN18.2人源化抗体在不同浓度下与人CLDN18.1表达细胞的结合情况。
图6显示了抗人CLDN18.2人源化抗体的种属交叉结合特征分析结果。
图7显示了制备的各组CART细胞的阳性率检测结果。
图8显示了构建的各CHO细胞株的不同抗原表达情况。
图9显示了各组CART细胞与靶细胞孵育后上清中IFN-γ检测结果。
图10显示了各组CART细胞与靶细胞孵育后CD25表达的检测结果。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
其中：
IMAB362的重链和轻链序列参见SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:127。
抗原人CLDN18.2参见NP_001002026.1，抗原人CLDN18.1参见NP_057453.1。
附图中的阴性对照Isotype control(同型对照)为抗CD33全长IgG抗体Lintuzumab。
实施例1鼠源单克隆抗体的筛选
使用细胞表面稳定表达人CLDN18.2蛋白的CHOK1细胞免疫Balb/c小鼠，1个月后用流式细胞仪术(FACS)分析小鼠血清，取血清抗体滴度高的小鼠取其脾脏，标准方法分离得到的脾细胞与骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653使用PEG或者电融合方法进行融合。将融合后的杂交瘤细胞接种于384孔板中，培养10-14天后，取上清用FACS分析杂交瘤细胞分泌的抗体，筛选得到若干克隆，所述克隆能够结合细胞表面稳定表达人CLDN18.2蛋白的CHOK1细胞而不能够结合细胞表面稳定表达人CLDN18.1蛋白的CHOK1细胞。通过有限稀释的方法将筛选到的克隆单细胞化，3轮之后得到的每个杂交瘤细胞克隆只分泌一个抗体。
将分泌抗人CLDN18.2抗体的杂交瘤细胞扩大培养后，按照RNAfast200试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)说明书步骤提取细胞总RNA；利用5×PrimeScript RT MasterMix(Takara)将杂交瘤细胞总RNA反转录成cDNA；使用简并引物(Anke Krebber.1997)和Extaq PCR试剂(Takara)扩增抗体轻链可变区IgVL(κ)和重链可变区VH序列；利用PCRclean-up Gel extraction试剂盒(Macherey-Nagel公司)纯化PCR扩增产物；按照pClone007 Simple Vector Kit试剂盒(擎科生物科技有限公司)说明书将扩增PCR产物连接至T载体并转化大肠杆菌感受态细胞，菌株扩增、抽提质粒后进行DNA测序获得单克隆抗体可变区序列。
表1.鼠源抗体的轻重链可变区
Figure BDA0002219884960000101
Figure BDA0002219884960000111
>11M23_vh(SEQ ID NO:1)
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实施例2抗人CLDN18.2嵌合抗体的制备
将鼠源抗人CLDN18.2单克隆抗体的重链可变区序列和公开发表的人单克隆抗体IgG1亚类的重链恒定区序列(参见SEQ ID NO:124)拼接在一起，构建到哺乳动物细胞表达载体中；将鼠源抗人CLDN18.2单克隆抗体的轻链可变区序列和公开发表的人单克隆抗体κ亚类的轻链恒定区序列(参见SEQ ID NO:125)拼接在一起，构建到哺乳动物细胞表达载体中。构建好的抗人CLDN18.2嵌合抗体的重链载体和轻链载体配对混合，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染HEK293细胞，约7天后收集细胞上清，使用ProteinA纯化得到抗人CLDN18.2嵌合抗体蛋白。
本发明的嵌合抗体命名为“鼠源抗体简称-xiIgG”。
实施例3抗人CLDN18.2嵌合抗体的体外细胞结合实验
将抗人CLDN18.2嵌合抗体从100nM的起始浓度开始做2倍的梯度倍比稀释，共16个浓度点，各个浓度点的抗体取10ul加入384孔板。100g室温离心5分钟收集细胞表面表达CLDN18.2的CHOK1细胞，用含0.5％BSA的PBS洗涤细胞一次，100g室温离心5分钟，重悬细胞为密度约2x106个细胞/毫升，取10ul加入到已加抗体的384孔板的孔中。4℃孵育1小时后，加入荧光标记的羊抗人IgG二抗。继续于4℃孵育1小时后，用流式细胞仪分析细胞群的平均荧光读值。
结果显示嵌合抗体与表达人CLDN18.2细胞有nM级别的特异结合，见图1。
实施例4抗人CLDN18.2鼠源抗体的人源化
综合Kabat、Chothia的抗体编码方案，确定鼠源抗体的重链和轻链的6个抗原互补决定簇(CDR)的氨基酸序列区域及支撑抗体保守三维构象的框架区域(frameworkregion)。随后通过分析搜索已知人源抗体序列，选择与鼠源抗体最为相似接近的人源抗体重链可变区序列，如IGHV1|IGHJ4*01，选择其抗体框架区序列作为模板，将鼠源抗体重链CDR与人源抗体框架区结合，最终生成人源化抗体重链可变区序列。同样过程，生成人源化抗体轻链可变区序列。
鼠源抗体CDR直接移植至人框架区的抗体常出现结合活性急剧下降，因此需要将框架区个别氨基酸从人源的改回鼠源的。确定回复突变位点，一是对照设计好的人源化抗体序列和原始的鼠源抗体序列，检查有哪些氨基酸的不同；二是检查这些氨基酸是否对支持抗体结构起重要作用或者对与抗原的结合起重要作用。人源化设计后的序列的同时需要检查是否有一些潜在的翻译后修饰位点(PTM)，如N(天冬酰胺)糖基化位点、N脱酰胺化位点、D(天冬氨酸)异构化位点等。
将人源化抗体重链可变区基因构建到含人单克隆抗体IgG1亚类的重链恒定区基因的哺乳动物细胞表达载体中；轻链可变区基因构建到含人单克隆抗体κ亚类的轻链恒定区基因的哺乳动物细胞表达载体中。构建好的抗人CLDN18.2人源化抗体的重链载体和轻链载体配对混合，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染HEK293细胞，约7天后收集细胞上清，使用ProteinA纯化得到抗人CLDN18.2人源化抗体蛋白。
本发明的人源化抗体命名为“鼠源抗体简称-hz”。鼠源抗体CDR直接移植至人框架区的抗体命名为“鼠源抗体简称-hz00”。进一步改造得到的抗体根据序列不同进行编号。
利用Fortebio(BLITZ pro1.1.0.28)仪器分析鼠源嵌合抗体及其人源化抗体与抗原人CLDN18.2的结合动力学参数。测定前先将NTA生物探针浸泡于PBS中10分钟；然后将该探针置于含100nM的抗原的PBS中300秒，捕获带His标签的抗原；进一步将探针与100nM抗体进行结合反应，结合时间400秒；之后将探针转移至PBS中，进行解离反应，时间为600秒。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1：1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数。结果见表2。
表2.鼠源抗体人源化后的结合动力学参数比较
Figure BDA0002219884960000151
Figure BDA0002219884960000161
结果显示，人源化并移除了关键的翻译后修饰位点(PTM)后，11M23-hz22相对鼠源嵌合抗体，解离常数值上升了10倍以上，因此将其从候选分子名单中去除。其余的8K13-hz24、16K15-hz22和52E22-hz12的解离常数值与原始鼠源嵌合抗体比，上升幅度在1-4倍之间，可以选做先导分子继续开展后续的研究。其中16K15-hz22轻链氨基酸序列中包含2个连续的“NN”残基，做了进一步优化的16K15-hz22_2和16K15-hz22_3突变抗体，分别将“NN”残基变为“SN”和“QN”残基。
表3.人源化抗体的轻重链可变区
Figure BDA0002219884960000162
Figure BDA0002219884960000171
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实施例5抗人CLDN18.2人源化抗体的体外结合亲和力的动力学实验
采用GE公司BIAcore仪器S200测定抗体抗原相互作用力。
参考GE公司Human antibody capture kit(货号BR-1008-39，Lot10261753)操作说明，首先在传感芯片CM5分析通道和对照样品通道都饱和偶联最大量抗人Fc抗体，然后在分析通道流过含有7.5μg/ml抗人CLDN18.2嵌合抗体、人源化抗体或对照抗体IMAB362的缓冲液使其均匀分布，最后在分析通道和对照样品通道一起流过梯度稀释的抗原样品(起始浓度20nM，1:3稀释8个浓度点，并且设定0.741nm浓度点重复)，测定抗体抗原结合后发生的光反应值。经仪器软件拟合分析，最终得到抗体的结合常数Kon和解离常数Koff，以及亲和力常数KD。
结果表明，抗人CLDN18.2人源化抗体的体外结合亲和力常数与原始鼠源抗体比没有显著的改变，与IMAB362相比低了1个数量级，见表4。
表4.本发明抗体的结合动力学
抗体 ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(M)
8K13-xiIgG 8.19E+04 5.73E-04 6.99E-09
8K13-hz24 7.09E+04 2.02E-03 2.85E-08
16K15-xiIgG 1.07E+05 1.44E-03 1.35E-08
16K15-hz22 5.71E+04 5.63E-04 9.85E-09
52E22-xiIgG 4.90E+05 5.45E-04 1.11E-09
52E22-hz12 1.46E+05 1.72E-04 1.18E-09
IMAB362 1.48E+06 0.201 1.36E-07
实施例6抗人CLDN18.2人源化抗体的体外细胞学试验
6.1补体依赖性细胞毒性(CDC)
使用Quidel公司的商品化人血清全补体对本发明人源化抗体进行分析，分析其对稳定表达人CLDN18.2的CHOK1、BxPC3和NCI-N87细胞诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。
将细胞与终浓度为250μg/ml至3.8ng/ml的待测抗体混匀；加入溶于细胞培养基RPMI-1640中的6.25％人血清全补体，在37℃下孵育3小时；然后通过CCK-8试剂盒进行细胞毒性检测；最终通过MD酶标仪检测450nm吸光度。通过吸光值采用softmax pro7软件进行4参数拟合曲线，计算样品的EC50值。
结果表明，抗人CLDN18.2人源化抗体针对靶点表达细胞有特异的补体依赖性细胞毒(CDC)活性，并且细胞杀伤活性显著优于IMAB362，见图2和表5。
表5.本发明抗体的CDC
靶点表达细胞 a.CHOK1 b.BxPC3 c.NCI-N87
抗体 EC50(nM) EC50(nM) EC50(nM)
8K13-hz24IgG 21.27 28.53 57.7
16K15-hz22IgG 5.2 12.22 17.36
52E22-hz12IgG 2.08 NA NA
IMAB362 30.45 52.23 474.2
6.2抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
使用工程改造的Jurkat细胞作为效应细胞，该细胞稳定表达FcγRIIIa-FcεRIaγ杂合受体，由NFAT应答元件驱动表达萤火虫萤光素酶。抗体在ADCC作用机制中的生物活性通过NFAT通路活化产生的萤光素酶定量。将1.5E5个效应细胞与终浓度33μg/ml至85pg/ml的待测抗体混匀，然后将2.5E4个靶细胞加入其中(效应细胞与靶细胞E:T比例6:1)，在37℃下孵育16小时；然后通过Promega公司试剂盒Bio-GloTMLuciferase Assay System进行检测；最终通过MD酶标仪检测LUM值。
数据处理方式如下，诱导倍数＝(受检孔读值–背景值)/(阴性对照孔读值–背景值)，用prism软件进行4参数拟合曲线，计算出样品的EC50值。
结果表明，抗人CLDN18.2人源化抗体针对靶点表达细胞有特异的抗体依赖性细胞毒(ADCC)活性，细胞杀伤活性与IMAB362相当，见图3和表6。
表6.本发明抗体的ADCC
靶点表达细胞 a.CHOK1 b.BxPC3 c.NCI-N87
抗体 EC50(nM) EC50(nM) EC50(nM)
8K13-hz24IgG 0.5894 0.3045 0.1499
16K15-hz22IgG 0.7122 0.1759 0.0677
52E22-hz12IgG 0.5672 NA NA
IMAB362 0.5929 0.1056 0.0909
实施例7抗人CLDN18.2人源化抗体的同簇蛋白结合特征分析
将人CLDN18.2和CLDN18.1的基因分别构建到真核表达载体中，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染HEK293细胞。转染后第三天离心收集细胞，用PBS洗涤细胞1次，重悬细胞密度为2×106/ml，每个384孔板中加入10ul的细胞；第二步往384孔板中加入不同浓度的人源化抗体，4℃孵育1小时；第三步加入荧光标记的羊抗人IgG二抗，4℃孵育1小时；使用流式细胞仪读取384孔板的荧光值。分析数据获得细胞与抗人CLDN18.2人源化抗体的结合特征。实验用的阳性对照为商品化抗人CLDN18兔单抗34H14L15(购自Abcam公司)，阴性Isotype control(同型对照)为抗CD33全长IgG抗体Lintuzumab。
结果表明，抗人CLDN18.2人源化抗体表现出结合人CLDN18.2而不结合人CLDN18.1的特征，见图4；并且，在低、中、高三种浓度下与人CLDN18.1细胞的非特异结合均比IMAB362低，见图5。
实施例8抗人CLDN18.2人源化抗体的人、猴、鼠种属交叉结合特征分析
将人、鼠和恒河猴(Rhesus)的CLDN18.2基因分别构建到真核表达载体中，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染HEK293细胞，2天后收集细胞。使用流式细胞仪术分析细胞与抗人CLDN18.2人源化抗体的结合特异性。流式细胞实验方法参见实施例7。
结果表明，抗人CLDN18.2人源化抗体16K15-22 IgG和三个种属的CLDN18.2均有结合，8K13-24 IgG和52E22-12 IgG与猴子的CLDN18.2结合但不与小鼠的CLDN18.2结合。结果见图6。
实施例9采用抗人CLDN18.2人源化抗体的CART细胞制备及其活化
9.1慢病毒包装
按照表7分组情况，进行慢病毒包装。首先构建了包含不同抗体基因的慢病毒载体质粒pLTR，测序正确以后使用Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取它们的质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间。同时提取两种辅助包装元件载体质粒pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.2的DNA。准备转染用的HEK293T细胞，需新鲜传代，生长至约60％的汇合度。使用磷酸钙作为转染试剂将3种质粒共转入HEK293T细胞。转染48小时后，低温离心收集含包装好病毒的细胞上清，使用0.45μm的过滤器去除细胞碎片。使用超滤离心管对病毒进行浓缩换液，分装后保存在-80℃冰箱。取少量病毒浓缩液用FACS法测定病毒滴度。
表7.慢病毒分组
编号 病毒 病毒滴度 组别
135 LV-135.N 8.75E+06 阴性对照
417 LV-417.N 1.65E+07 16k15(16K15-hz22)scfv*
418 LV-418.N 1.38E+07 52E22(52E22-hz12)scfv*
419 LV-419.N 5.13E+07 8K13(8K13-hz24)scfv*
420 LV-420.N 1.50E+07 阳性对照
表7中阴性对照是不结合CLDN18.2的其他抗体，阳性对照是科济生物hu8E5抗体(参见WO2018006882A1)。*所示单链抗体为相应的人源化VH、VL通过短肽(GSTSGGGSGGGSGGGGSS)连接形成。
9.2 CART细胞制备
选择HBV、HCV和HIV检测阴性的健康供者，肘正中静脉抽血100ml，Ficoll密度梯度离心分离PBMC白膜层，按DynaBeads CD3/CD28(Lifetechnologies，货号：40203D)与CD3+T细胞比例3:1，分离CD3+T细胞，活化24小时后流式检测CD25+CD69+T细胞比例。CD3+T活化后，进行慢病毒转导，MOI为5。用Novonectin包被24孔板37℃孵育2小时，将上述操作后得到的细胞悬液分别与制备得到的各种慢病毒(MOI＝5)、
Figure BDA0002219884960000211
F108(Sigma，货号：07579-250G-F)、Tscm(2U/ml)配制成转导体系置于包被的24孔板中，细胞密度调整至1.0E+06/ml，500g离心30min，离心后37℃CO2培养箱静置培养48h。转染后以含5％FBS X-vivo15培养液(LONZA，货号：04-418Q)培养，隔日补充Tscm(终浓度2U/ml)，计数细胞，调整细胞密度至0.5E+06/ml，培养至第8-10天收获细胞。
得到的各组CART细胞的阳性率检测结果见图7。
9.3 CART细胞活化
用CHO构建表达人CLDN18.1抗原和人CLDN18.2抗原的细胞，作为靶细胞。
细胞的相关抗原表达检测结果见图8。CHO-BLANK(空白对照)、CHO-CLDN18.1无CLDN18.2抗原的表达，CHO-CLDN18.2高表达CLDN18.2抗原。
于1.5mL的离心管中将上述调整好密度的效应细胞，包括各组CAR-T细胞和未转导慢病毒T细胞，分别与靶细胞混合，效靶比16:1，用T细胞培养液X-vivo15培养液(不含自体血清以及Tscm)将总体积补足至200μL；将配制的200μL体系分别移入96孔V型板中共孵育24小时。
孵育结束后，取各组培养体系的上清检测人IFNγ。发现417组CART与CHO-CLDN18.1以及CHO-CLDN18.2孵育后，IFNγ释放显著增加，418、419、420组CART仅与CHO-CLDN18.2孵育后，IFNγ释放增加。结果见表8和图9。
表8.培养体系的上清中检测到的人IFNγ
组别 T:CHO-BLANK T:CHO-claduin18.1 T:CHO-claduin18.2
nc 1020.1 912 1095.2
135 1441.2 1458.6 1877
417 9016 60328.2 79178.6
418 3940.8 4540 78903.4
419 4486.2 4670.6 75516.8
420 7381.1 6973.2 78247
取各组CART细胞检测T细胞活化标志蛋白CD3/CD25。发现417CART与CHO-CLDN18.1以及CHO-CLDN18.2孵育后，CD25表达上调，418、419、420CART仅与CHO-CLDN18.2孵育后，CD25表达上调。见图10。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
序列表
<110> 迈威（上海）生物科技有限公司
上海普铭生物科技有限公司
<120> 抗人Claudin18.2抗体及其应用
<130> LC19110048
<160> 133
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Asn
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Asn Tyr Ile Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
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Lys
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<223> 重链可变区
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20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Arg Pro Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ala Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ser Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Arg Gly Asn Thr Leu Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr
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<223> 轻链可变区
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20 25 30
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<223> 重链可变区
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<223> 轻链可变区
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<223> 重链可变区
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Ser Ser Ile Ile Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
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<223> 重链CDR3
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<222> ()..()
<223> 重链CDR2
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Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Asn Glu Arg Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 重链CDR3
<400> 71
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1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
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<223> 轻链CDR1
<400> 72
Lys Ser Ser Gln Gly Leu Phe Asn Asn Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
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<213> 人工(Artificial)
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<223> 轻链CDR3
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1 5 10 15
Gly
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Thr
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Thr
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<223> 重链可变区
<400> 84
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Trp Ser Asp Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
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Arg His Pro Ala Phe Gly Pro His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<223> 轻链CDR1
<400> 85
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1 5 10 15
Thr
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<220>
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<223> 轻链CDR3
<400> 86
Gln Ser Asn Tyr Phe Tyr Pro Leu Thr
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Gln Gln Asn Tyr Phe Tyr Pro Leu Thr
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<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 88
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Pro Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Tyr
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 89
<211> 17
<212> PRT
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<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 轻链CDR1
<400> 89
Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Ser Ser Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
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Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Phe Thr
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<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 重链CDR2
<400> 91
Gln Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Ser Gly Lys Phe Gln
1 5 10 15
Ser
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<220>
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<222> ()..()
<223> 轻链CDR1
<400> 92
Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Ser Gly Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
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<220>
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<222> ()..()
<223> 轻链CDR3
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Gln Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr
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<221> gene
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 94
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctgac ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
acatgcaccg tctcagggtt ctccttaacc aactatggtg tacactgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggaatg gctggtagtg atatggagtg atggaagaat aaactataat 180
tcagctctca aatccagact gagcatcacc aaggacaatt ccaagaggca agttttccta 240
aaaatgaaca gtctccaaat tgatgacaca gccatttatt attgtgtcag acatcccgcc 300
ttcggtcccc atgctatgga ctactggggt caaggaatct cagtcaccgt ctcctca 357
<210> 95
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
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<221> gene
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 95
gatattgtga tgactcagga tgcaccctct atacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg aatagtaatg gcaacactta cttatattgg 120
ttcttgcaga ggccaggcca gtctcctcac ctcctgcttt atcggatgtc caaccctgcc 180
tcaggagccc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggga ctgaattcac actgagaatc 240
agtagagtgg aggctgaaga tgtgggtgtt tattactgta tgcaatatct ggaatatccg 300
cccacgttcg gtgctgggac caggctggag ctgaaa 336
<210> 96
<211> 352
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 96
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaggc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag gctctggaat cactctcagt acctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccagagagga ggctggagtg ggtcgcatcc attattagtg gtggtatcac ctattattta 180
gacagtgtga agggccgctt caccatctcc agagataatg ccaggaacat cctgtacctg 240
caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatttatt actgtgcaag aaaataccac 300
gggaatgctt tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcttt ag 352
<210> 97
<211> 340
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 97
gacattgtga tgacacagtc tccatcgtcc ctgcctgtga cagcaggaga gacggtcact 60
atgcgctgca agtccagtca gagtctttta aacagtggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120
tggtaccagc ggaaaccagg acagcctcct aagaaactga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagtggtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaataa ttatttttat 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac 340
<210> 98
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 98
cagatccaga tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaggatc 60
tcctgcaagg cttctgggta ttccttcaca actgctggaa tgcagtgggt gcgaaagatg 120
cctggagagg gtttgaagtg gattggctgg ataatcgccc actctggaga gccaaaatat 180
acagaagact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactacatat 240
ttacagataa gtaacctcaa aaatgaggac acggctacgt atttctgtgc gagatgggga 300
aagggaaata ctatggacta ttggggtcaa ggaacctcag tcatcgtctc ctca 354
<210> 99
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 99
gacattgtga tgacacagtc gccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacggtggaa atcagaggaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aaacttttga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacacattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatgc ttattttttt 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagcta gagctgaaa 339
<210> 100
<211> 358
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
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<221> gene
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 100
gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120
ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg gcagtagtac catctactat 180
ccagacacag tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc 240
ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgt aagattgggt 300
ccacggggga atgttatgga ccattggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcag 358
<210> 101
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 101
gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatgt ttatttttat 300
ccactcacgt tcggtactgg gaccaagctg gagctgaga 339
<210> 102
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
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<221> gene
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 102
gatgtgcagc ttcaggagtc aggacctgac ctggtaaaac cctctcagtc actttcactc 60
acctgcactg tcagtggcta ctccatcagc ggtgcttata actggcactg gatccggcag 120
tttccaggaa acaaactgga gtggctggcc tacatgcagt acagtggtag ctctaactac 180
aacccatctt tcaaaagtcg aatctctatc agtcgagaca cgtccaagaa ccaattcttc 240
ctgcagttga aatctgtgac tactgaagac acagccacat attactgtgc aagaatgtat 300
aacggaaact cgtttcttta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354
<210> 103
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 103
gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggcga gaaggtcact 60
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tggtatcagc aaaaaccagg gcagcctcct agattgttga tctattgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctgtca ctttattact gtcagaattc ttatagttat 300
cctctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagttgaaa 339
<210> 104
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
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<221> gene
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 104
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctgac ctggtggcgc cctcacagag cctgtccctc 60
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tcaggtctca aatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttctctta 240
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ttcggtcccc atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357
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<212> DNA
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<221> gene
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 105
gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60
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gtcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336
<210> 106
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 106
gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60
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<210> 107
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 107
aacattttga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcgggaga gaaggtcact 60
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ccgctcacgt tcggtgctgg taccaagctg gagctgaaa 339
<210> 108
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 108
gaggtccagc tgcggcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
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<210> 109
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
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<221> gene
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 109
gacattgtga tgacacagtc tccgtcctcc ctgcctgtga cagtaggaga gagggtcact 60
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ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagttg gagctgaaa 339
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<211> 354
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
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<221> gene
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 110
gaggtccagc tgcggcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact acctatatta taaactgggt gaagcagaag 120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactaggtac 180
aatgagaggg tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag tacagcctac 240
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tttggtaatt cgtttactta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354
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<211> 339
<212> DNA
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<221> gene
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 111
gacattgtga tgacacagtc tccgtcctcc ctgcctgtga caacaggaga gaaggtcact 60
atgacttgca agtccagtca gggtctgttt aacaatggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca atttattact gtcagaataa ttatattttt 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagttg gagctgaaa 339
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<211> 354
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 112
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60
tcctgcaagg cttctggata taccctcaca aactatggaa tgaattgggt gaggcaggct 120
ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaggccca acactggaga gccaacatat 180
gctgaagact tcaagggacg atttgtcttc tctttggaaa cctctgccgc cactgcctat 240
ttacagatca ccaacctcaa aagtgaggac acgtctacat atttctgtgc aagactgtac 300
aggggaaata ctttggacaa ctggggtcaa ggaacctcag tcatcgtctc ctca 354
<210> 113
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 113
gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga caacagggga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gaatctgtta aacagtggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaagccagg acagtctcct aaactattga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tcccttatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tacagactga tgacctggct atttattact gtcagaatgg ttatagtttt 300
ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339
<210> 114
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 114
caggttcacc tgcagcagtc tggggctgaa ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60
tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt aattactgga tgaactgggt gaggcagagg 120
cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gaaatggtga tactaagtac 180
agtggaaagt tcaacagtaa agacacactg actgcagaca aatcctccaa cacagcctac 240
atgcaactca acagcctaac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagattttac 300
tacggtaatg ttatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcg 354
<210> 115
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 115
gacattgtgt tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gactctgtta aacggtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaaatcagg gcagcctcct aaactgttga tctattgggc atcaactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
attagcagtg tccaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatgg ttatagttat 300
ccgctcacgt tcggtgttgg gaccaagctg gagctgaaa 339
<210> 116
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 116
gaggtgcagc tggtggagag cgggggggga ctggtgcagc caggaggaag cctgagactg 60
agctgtgccg gcagtggcat taccctgagc acatatgcca tgagctgggt gagacaggcc 120
cctggcaaag gactggagtg ggtgagcagc attatcagcg gaggaatcac ctactatctg 180
gatagcgtga agggacggtt cacaatcagc agggataacg ccaagaacac actgtatctg 240
cagatgagct ctctgagggc cgaagacacc gccgtgtatt attgcgccag aaagtaccac 300
ggaaacgccc tggactactg gggccagggg accctggtga cagtgagctc c 351
<210> 117
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 117
gacattgtga tgacccagag ccccgactcc ctggccgtga gcctgggaga aagagccacc 60
atcaactgca agagcagcca gagcctgctg agcagcggca accagagaaa ctacctgacc 120
tggtaccagc agaaacccgg ccagcccccc aaaaagctga tctactgggc ctccacccgg 180
gaatccggcg tgccagacag attctccggc tccggctccg gaaccgactt caccctgacc 240
atcagctccc tgcaggctga ggacctggcc gtgtactact gccagaacaa ctacttctac 300
cccctgacct tcggccaggg caccaaactg gagatcaag 339
<210> 118
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 118
gacattgtga tgacccagag ccccgactcc ctggccgtga gcctgggaga aagagccacc 60
atcaactgca agagcagcca gagcctgctg agcagcggca accagagaaa ctacctgacc 120
tggtaccagc agaaacccgg ccagcccccc aaaaagctga tctactgggc ctccacccgg 180
gaatccggcg tgccagacag attctccggc tccggctccg gaaccgactt caccctgacc 240
atcagctccc tgcaggctga ggacctggcc gtgtactact gccagagcaa ctacttctac 300
cccctgacct tcggccaggg caccaaactg gagatcaag 339
<210> 119
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 119
gacattgtga tgacccagag ccccgactcc ctggccgtga gcctgggaga aagagccacc 60
atcaactgca agagcagcca gagcctgctg agcagcggca accagagaaa ctacctgacc 120
tggtaccagc agaaacccgg ccagcccccc aaaaagctga tctactgggc ctccacccgg 180
gaatccggcg tgccagacag attctccggc tccggctccg gaaccgactt caccctgacc 240
atcagctccc tgcaggctga ggacctggcc gtgtactact gccagcagaa ctacttctac 300
cccctgacct tcggccaggg caccaaactg gagatcaag 339
<210> 120
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 120
cagatccagc tggtgcagag cggcagcgaa ctgaagaagc ccggcgccag cgtgaaagtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccctgacc aactacggca tgaactgggt gagacaggct 120
cccggccagg ggctggaatg gatgggatgg atcagaccca acaccggaga gccaacctac 180
gccgaggact tcaagggcag attcgtgttc agcctggaca cctctgtggc caccgcttac 240
ctgcagatca ccagcctgaa agccgaggac accgccgtgt actactgtgc ccgcctgtat 300
agaggaaaca ccctggacaa ctggggccag ggcactctgg tgaccgtgag ctcc 354
<210> 121
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 121
gacattgtga tgacccagag ccccgactcc ctggccgtga gcctgggaga aagagccacc 60
atcaactgca agagcagcca gaacctgctg agcagcggca accagagaaa ctacctgacc 120
tggtaccagc agaaacccgg ccagcccccc aaactgctga tctactgggc ctccaccaga 180
gaaagcggcg tgcccgacag attctccgga agcggcagcg gcaccgactt caccctgact 240
atcagcagcc tgcaggctga ggacctggcc gtgtactact gccagcaggg ctacagcttc 300
cccttcacct tcggccaggg caccaaactg gagatcaaa 339
<210> 122
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 122
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaaaaagc ccggctcctc agtgaaagtg 60
agctgcaagg ccagcggcta cgccttctcc aactactgga tgaactgggt gagacaggcc 120
ccaggccagg gcctggaatg gatgggacag atctaccccg gcagcggcga tacaaagtac 180
agcggaaagt tccagagcag agtgaccatc accgccgaca aaagcaccaa caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgag aagtgaggac accgccgtgt actactgcgc cagattctac 300
tacggcaacg tgatggacta ttggggccag ggaaccctgg tgaccgtgag ctct 354
<210> 123
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 123
gacattgtgc tgacccagag ccccgactcc ctggctgtga gcctgggaga gagagccacc 60
atcaactgca agagcagcca gaccctgctg agtggaggaa accagaaaaa ctacctgact 120
tggtaccagc agaaacccgg ccagcccccc aaactgctga tctactgggc ctccacaaga 180
gaaagcggag tgcccgacag attcagcggc agcggcagcg gaaccgactt caccctgact 240
atcagcagcc tgcaggctga ggacctggcc gtgtactact gccagcaggg ctacagctac 300
ccactgacct tcggacaggg caccaagctg gagattaaa 339
<210> 124
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 重链恒定区
<400> 124
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 125
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 轻链恒定区
<400> 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 126
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> IMAB362，重链
<400> 126
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 127
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> IMAB362，轻链
<400> 127
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 128
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 128
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asn Tyr Phe Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 129
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 129
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ile Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Lys Tyr His Gly Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 130
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 130
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Gly Tyr Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 131
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 131
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Arg Pro Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Arg Gly Asn Thr Leu Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 132
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 轻链可变区
<400> 132
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Asn Gly
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Gly Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 133
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 重链可变区
<400> 133
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Ser Gly Lys Phe
50 55 60
Asn Ser Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Tyr Gly Asn Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115

Claims (14)

1.一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)包含选自以下的CDR组合(VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3；VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3)：
(1)如SEQ ID NO:31所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:32所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO:33所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:34所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:35所示的VL-CDR2、如SEQID NO:36所示的VL-CDR3；
(2)如SEQ ID NO:37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:38所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO:39所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:40所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQID NO:42所示的VL-CDR3；
(3)如SEQ ID NO:43所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:44所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO:45所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:46所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQID NO:47所示的VL-CDR3；
(4)如SEQ ID NO:48所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:49所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO:50所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:40所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQID NO:51所示的VL-CDR3；
(5)如SEQ ID NO:52所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:53所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO:54所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:55所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQID NO:56所示的VL-CDR3；
(6)如SEQ ID NO:57所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:58所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO:33所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:34所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:59所示的VL-CDR2、如SEQID NO:60所示的VL-CDR3；
(7)如SEQ ID NO:61所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:62所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO:63所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:46所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQID NO:64所示的VL-CDR3；
(8)如SEQ ID NO:65所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:66所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO:67所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:68所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQID NO:69所示的VL-CDR3；
(9)如SEQ ID NO:65所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:70所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO:71所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:72所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQID NO:73所示的VL-CDR3；
(10)如SEQ ID NO:74所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:75所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO:76所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:77所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQID NO:78所示的VL-CDR3；
(11)如SEQ ID NO:79所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:80所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO:81所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:82所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQID NO:83所示的VL-CDR3；
(12)如SEQ ID NO:37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:38所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO:39所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:85所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQID NO:42所示的VL-CDR3；
(13)如SEQ ID NO:37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:38所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO:39所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:85所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQID NO:86所示的VL-CDR3；
(14)如SEQ ID NO:37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:38所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO:39所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:85所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQID NO:87所示的VL-CDR3；
(15)如SEQ ID NO:74所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:75所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO:76所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:89所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQID NO:90所示的VL-CDR3；和
(16)如SEQ ID NO:79所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:91所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO:81所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO:92所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO:41所示的VL-CDR2、如SEQID NO:93所示的VL-CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述重链可变区包含：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29中任一个所示的氨基酸序列或与所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或
所述轻链可变区包含：
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30中任一个所示的氨基酸序列或与所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含的重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
(1)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(2)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(3)如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(4)如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(5)如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(6)如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(7)如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(8)如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(9)如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(10)如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(11)如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(12)如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(13)如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(14)如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(15)如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(16)如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段为单克隆抗体、单链抗体、双功能抗体、单域抗体、纳米抗体、完全或部分人源化的抗体或者嵌合抗体等任意形式，或者，所述抗体或其片段为半抗体或半抗体的抗原结合片段，例如scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv；
优选地，所述抗体或其片段还包含人或鼠的恒定区，优选包含人或鼠的轻链恒定区(CL)和/或重链恒定区(CH)；
更优选地，所述抗体或其片段包含选自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体，优选为鼠源、嵌合或人源化的单克隆抗体；优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区为IgG1或IgG4亚型，轻链恒定区为κ型；
优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区包含如SEQ ID NO:124所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述单克隆抗体的轻链恒定区包含如SEQ ID NO:125所示氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
6.一种核酸分子，其编码权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段或者编码所述抗体或其片段中包含的重链CDR、轻链CDR、轻链可变区、重链可变区、重链或轻链。
7.一种载体，其包含权利要求6所述的核酸分子。
8.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求6所述的核酸分子和/或权利要求7所述的载体，或者所述宿主细胞被权利要求6所述的核酸分子和/或权利要求7所述的载体转化或转染。
9.一种缀合物或融合蛋白，所述缀合物或融合蛋白包含权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞和/或权利要求9所述的缀合物或融合蛋白，以及可选地药学上可接受的辅料。
11.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1至5中任一项所述的抗体分子或其片段、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞、权利要求9所述的缀合物或融合蛋白和/或权利要求10所述的药物组合物。
12.权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞、权利要求9所述的药物组合物或权利要求10所述的缀合物或融合蛋白在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的用途，所述癌症选自胰腺癌、胃癌、结肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、胆囊癌和头颈癌。
13.权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞、权利要求9所述的药物组合物或权利要求10所述的缀合物或融合蛋白在制备用于诊断癌症的试剂中的用途，所述癌症选自胰腺癌、胃癌、结肠癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、胆囊癌和头颈癌。
14.权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞、权利要求9所述的药物组合物或权利要求10所述的缀合物或融合蛋白在制备CART细胞中的用途。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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Denomination of invention: Anti human Claudin 18.2 antibody and its application

Granted publication date: 20231128

Pledgee: Agricultural Bank of China Limited Shanghai Baoshan Branch

Pledgor: Maiwei (Shanghai) Biotechnology Co.,Ltd.

Registration number: Y2024980005083

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