CN117777306B - 一种靶向cldn18.2的增强型嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents
一种靶向cldn18.2的增强型嵌合抗原受体及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种靶向CLDN18.2的增强型嵌合抗原受体及其用途，还公开了基于所述增强型嵌合抗原受体制备得到的嵌合抗原受体免疫细胞、衍生物、生物制剂和药物组合物，所述嵌合抗原受体免疫细胞中包含靶向CLDN18.2的抗体和p40亚基，两者联合能够实现免疫细胞长效清除肿瘤的作用，可用于CLDN18.2阳性相关疾病的免疫治疗中，临床应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及一种靶向CLDN18.2的增强型嵌合抗原受体及其用途。
背景技术
Claudins(CLDN)是一个整合膜蛋白家族，是构成细胞紧密连接的重要组成部分。它们建立了控制细胞间分子流动的细胞间屏障，可控制细胞之间分子的流动。不同的Claudins蛋白在不同的组织上表达，其异常表达可导致上皮细胞、内皮细胞结构破坏、功能受损，Claudins可能在多种疾病的发病过程中起着重要作用，现已证明其功能的改变与各个组织的癌症形成有关，例如Claudin-1在结肠癌中高表达并且具有预后价值，Claudin-18在胃癌、胰腺癌中高表达，Claudin-10在肝细胞癌中高表达。癌细胞中细胞膜表面蛋白Claudins的表达失调，肿瘤细胞间的紧密连接结构在癌细胞中被破坏，这些特性使得抗体能够选择性地结合肿瘤组织而非正常组织中的Claudins蛋白，以发挥治疗肿瘤的效果。
CLDN18.1是CLDN18的同工型1，具有肺部特异性，在肺腺癌中明显减少。CLDN18.2是CLDN18的同工型2，在生理上局限于胃粘膜紧密连接处，其表位在恶性转化时将暴露在癌细胞表面，此外，CLDN18.2在相当一部分胃腺癌和胰腺癌中高度表达，并且在许多其它类型的肿瘤中也异常活化，例如食管癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌，这使得CLDN18.2成为治疗胃腺癌和胰腺癌等CLDN18.2高表达癌症的理想靶标。尽管抗CLDN18.2抗体和嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)已经研究了多年，但是如何进一步提高靶向CLDN18.2抗体和嵌合抗原受体的肿瘤杀伤效果以更有效或更高效地应用于CAR-T细胞疗法中仍是本领域亟需解决的难题之一。
发明内容
有鉴于此，针对上述现有技术中存在的不足和实际需求，本发明的目的在于提供一种靶向CLDN18.2的增强型嵌合抗原受体、靶向CLDN18.2的增强型嵌合抗原受体免疫细胞及其在肿瘤治疗中的应用。
在本发明中，所述靶向CLDN18.2的增强型嵌合抗原受体包含靶向CLDN18.2的抗体和p40亚基，本发明通过体内和体外实验验证首次发现两者联合能够实现免疫细胞长效清除肿瘤的作用。同时表达分泌型p40 CLDN18.2 CAR-T细胞能够释放高浓度的IL-23，在低效靶比多轮杀伤肿瘤中具有明显的杀伤优势，且可以显著缩小小鼠体内的肿瘤，显示出比常规CAR-T更优异的实体瘤抗肿瘤能力。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了一种靶向CLDN18.2的增强型嵌合抗原受体。
进一步，所述嵌合抗原受体包含靶向CLDN18.2的抗体和p40亚基；
所述抗体包含重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；
所述HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO:7所示的重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3；所述LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3；
所述p40亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示或与SEQ ID NO:17具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列；
优选地，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示或分别为与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列；优选地，所述LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示或分别为与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列；
更优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示或与SEQ ID NO:7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列；更优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示或与SEQ ID NO:8具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含铰链区；更优选地，所述铰链区包括下列分子的铰链区：CD8、4-1BB、IgG1、IgG4、PD-1、CD28、CD34、OX40、CD3ε；最优选地，所述铰链区为CD8铰链区；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域；更优选地，所述跨膜结构域包括下列分子的跨膜结构域：CD8、4-1BB、IgG1、IgG4、PD-1、CD28、CD34、OX40、CD3ε；最优选地，所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含共刺激信号结构域；更优选地，所述共刺激信号结构域包括下列分子的共刺激信号结构域：4-1BB、HVEM、CD27、CD19、CD28、ICOS、CD4、CD8α、CD8β、CD40、OX40、DR3、CD2、GITR、CD30、TIM1、CD226、CD278；最优选地，所述共刺激信号结构域为4-1BB共刺激信号结构域；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含胞内信号传导结构域；更优选地，所述胞内信号传导结构域包括下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD278、CD21、CD22、FcεRI、FcRγ、FcRβ、CD4、CD5、CD8、CD79a、CD79b、DAP10、DAP12、CD66d；最优选地，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；
最优选地，所述嵌合抗原受体还包含CD8α信号肽、T2A、GMCSF信号肽、EGFR DⅢ～DⅣ；最优选地，所述嵌合抗原受体选自以下组中的任一种：
(1)由所述CD8α信号肽、所述抗体、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、p40亚基、T2A、GMCSF信号肽、EGFR DⅢ～DⅣ依次串联得到的嵌合抗原受体；
(2)在(1)中所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列的基础上，经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸后形成的衍生嵌合抗原受体；
最优选地，所述CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；最优选地，所述CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；最优选地，所述CD8跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；最优选地，所述4-1BB共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO:14所示；最优选地，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；最优选地，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；最优选地，所述GMCSF信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；最优选地，所述EGFR DⅢ～DⅣ的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
在本发明中，所述p40是白细胞介素12(IL-12)和白细胞介素23(IL-23)的一个共享蛋白元件。在正常细胞功能中，p40亚单位对于调节细胞免疫反应和炎症反应至关重要。在激活的T细胞中，T细胞能上调IL-23受体和IL-23αp19亚基。因此，当将T细胞基因编辑为CAR-T细胞时，可人为增加p40亚基的表达，使得CAR-T细胞分泌IL-23因子，并活化自身IL-23下游信号通路使T细胞获得选择增殖活性。
在一些实施方案中，本发明所述抗体的重链可变区和轻链可变区对应的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列可基于上述重链可变区和轻链可变区的全长序列根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号系统定义获得，根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM、Contact编号系统或其他编号系统中的任意一种或任意几种组合定义的CDR序列同样包含在本发明的保护范围内。
本发明的第二方面提供了一种核酸分子。
进一步，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体；优选地，编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体中的抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；优选地，编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体中的抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；优选地，编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体中的p40亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；优选地，编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体中的CD8α信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；优选地，编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体中的CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；优选地，编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体中的CD8跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；优选地，编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体中的4-1BB共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQ IDNO:23所示；优选地，编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体中的CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；优选地，编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体中的T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；优选地，编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体中的GMCSF信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；优选地，编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体中的EGFR DⅢ～DⅣ的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。
在一些实施方案中，本领域技术人员可以根据实际情况或需要改变信号肽、铰链区和跨膜区、共刺激信号结构域和胞内信号传导结构域等的组合类别和序列，无论基于何种形式的改变，只要该嵌合抗原受体具有本发明第一方面所述的靶向CLDN18.2的抗体和p40亚基的序列，其均包含在本发明的保护范围内。
本发明的第三方面提供了一种表达载体。
进一步，所述表达载体包含本发明第二方面所述的核酸分子；优选地，所述载体包括质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体、病毒来源的载体；更优选地，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、杆状病毒载体、乳头状瘤病毒载体、乳头多瘤空泡病毒载体。
在一些实施方案中，本发明提供的核酸分子可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸分子可被克隆入如此载体，其包括但不限于：质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
本发明的第四方面提供了一种嵌合抗原受体免疫细胞。
进一步，所述嵌合抗原受体免疫细胞包含本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子和/或本发明第三方面所述的表达载体；优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、单核细胞、髓样细胞、树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞和/或其任意组合；更优选地，所述免疫细胞为T淋巴细胞。
本发明的第五方面提供了一种嵌合抗原受体免疫细胞群体。
进一步，所述嵌合抗原受体免疫细胞群体包含本发明第四方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞；优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞群体还包含不包含本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子和/或本发明第三方面所述的表达载体的免疫细胞；优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、单核细胞、髓样细胞、树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞和/或其任意组合；更优选地，所述免疫细胞为T淋巴细胞。
本发明的第六方面提供了一种衍生物。
进一步，所述衍生物包括可检测标记的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体和/或本发明第二方面所述的核酸分子、赋予抗生素抗性的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体和/或本发明第二方面所述的核酸分子、与治疗剂结合或偶联的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体和/或本发明第二方面所述的核酸分子；
优选地，所述可检测标记包括荧光染料、胶体金、化学发光标记物、化学发光催化剂；更优选地，所述化学发光标记物包括鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯、吖啶酯衍生物、金刚烷、稀土元素、联吡啶钌配合物；更优选地，所述化学发光催化剂包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶；
优选地，所述抗生素抗性的基因包括青霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因；
优选地，所述治疗剂包括放射性核素、细胞因子、金纳米颗粒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶、化疗剂；更优选地，所述细胞因子包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IFN-γ、TNF-β、TNF-α、G-CSF、M-CSF；更优选地，所述化疗剂包括顺铂、紫杉醇、长春新碱、门冬酰胺酶、奥沙利铂、草酸铂、乐沙定。
本发明的第七方面提供了一种用于治疗和/或预防CLDN18.2阳性相关疾病的生物制剂。
进一步，所述生物制剂包含本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞、本发明第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞群体和/或本发明第六方面所述的衍生物；
优选地，所述CLDN18.2阳性相关疾病包括实体瘤、血液瘤和/或其任意组合；更优选地，所述CLDN18.2阳性相关疾病包括胃癌、胰腺癌、食管癌、胆管癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌、肺癌、骨癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、脑癌、子宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结直肠癌、肛门癌、胃肠道癌、皮肤癌、前列腺癌、垂体癌、阴道癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤。
本发明的第八方面提供了一种用于治疗和/或预防CLDN18.2阳性相关疾病的药物组合物。
进一步，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞、本发明第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞群体、本发明第六方面所述的衍生物和/或本发明第七方面所述的生物制剂；
优选地，所述药物组合物还包括用于辅助治疗和/或预防CLDN18.2阳性相关疾病的治疗剂；更优选地，所述治疗剂包括烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄激素、免疫调节剂和/或细胞毒素；
更优选地，所述CLDN18.2阳性相关疾病包括实体瘤、血液瘤和/或其任意组合；更优选地，所述CLDN18.2阳性相关疾病包括胃癌、胰腺癌、食管癌、胆管癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌、肺癌、骨癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、脑癌、子宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结直肠癌、肛门癌、胃肠道癌、皮肤癌、前列腺癌、垂体癌、阴道癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤。
在一些实施方案中，所述烷化剂包括双氯乙基甲胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、溴丙哌嗪、松龙苯芥、磷雌氮芥、环磷酰胺、三胺硫磷、卡氮芥、链唑霉素、顺铂、卡铂；所述抗代谢物包括甲氨喋呤、5-氟脲嘧啶、氟苷、5-氟脱氧尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨；所述抗肿瘤抗生素包括柔红霉素、阿霉素、去甲氧正定霉素、光神霉素、丝裂霉素C、戊柔比星、盐酸米托蒽醌、博来霉素；所述有丝分裂抑制剂包括紫杉萜、长春碱、紫杉醇、长春新碱、长春酰胺、长春瑞滨；所述染色质功能抑制剂包括依立替康、依托扑沙、托泊替康、磷酸依托扑沙、鬼臼噻吩甙；所述抗血管生成剂包括普啉司他、坦诺司他、伊洛马司他、丙亚胺、巴马司他；所述抗雌激素包括托瑞米芬、雷洛昔芬、它莫西芬、阿纳托唑、依西美坦；所述抗雄激素包括尼鲁米特、比卡鲁胺、西咪替丁；所述免疫调节剂包括白介素、肿瘤坏死因子、干扰素、蘑菇多糖、西佐糖、罗喹美克、匹多莫特、甲氧聚乙二醇琥珀酰胺腺甙脱氨酶、胸腺肽制剂；所述细胞毒素包括DM4、MMAE、DM1、Ozogamicin、Dxd、SN-38、MMAF、PBD、DM2、Amanitin、PNU-159682、IR700、PE-38、PE4E、PE40、PE25、PE35。
在一些实施方案中，所述药物组合物还可包含药学上可接受的载体和/或辅料，适合的药学上可接受的载体和/或辅料在Remington's Pharmaceutical Sciences(19thed.,1995)中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或活性物质的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。如此配制的药物组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式将药物进行给药，使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明所述的药物组合物施用于人。
本发明的第九方面提供了如下任一种方法：
(1)一种制备本发明第四方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞的方法，所述方法包括如下步骤：提供待改造的免疫细胞，将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的表达载体导入到所述免疫细胞内，获得本发明第四方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞；
优选地，所述待改造的免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、单核细胞、髓样细胞、树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞和/或其任意组合；更优选地，所述待改造的免疫细胞为T淋巴细胞；
(2)一种刺激哺乳动物靶细胞群或组织产生免疫应答的方法，所述方法包括如下步骤：给哺乳动物施用有效量的本发明第四方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞和/或本发明第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞群体。
此外，本发明还提供了一种治疗CLDN18.2阳性相关疾病或延迟其进展的方法，所述方法包括如下步骤：给有需要的受试者施用有效量的本发明第四方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞、本发明第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞群体、本发明第六方面所述的衍生物、本发明第七方面所述的生物制剂和/或本发明第八方面所述的药物组合物。
本发明的第十方面提供了如下任一方面应用：
(1)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞、本发明第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞群体、本发明第六方面所述的衍生物、本发明第七方面所述的生物制剂和/或本发明第八方面所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防CLDN18.2阳性相关疾病的药物中的应用；
(2)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞、本发明第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞群体和/或本发明第六方面所述的衍生物在制备用于治疗和/或预防CLDN18.2阳性相关疾病的生物制剂中的应用；
(3)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子和/或本发明第三方面所述的表达载体在制备用于治疗和/或预防CLDN18.2阳性相关疾病的嵌合抗原受体免疫细胞中的应用；
(4)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子和/或本发明第三方面所述的表达载体在制备用于治疗和/或预防CLDN18.2阳性相关疾病的嵌合抗原受体免疫细胞群体中的应用；
(5)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子和/或本发明第三方面所述的表达载体在制备用于制备治疗和/或预防CLDN18.2阳性相关疾病的嵌合抗原受体免疫细胞的试剂盒中的应用；
优选地，所述CLDN18.2阳性相关疾病包括实体瘤、血液瘤或其组合；更优选地，所述CLDN18.2阳性相关疾病包括胃癌、胰腺癌、食管癌、胆管癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、支气管癌、肺癌、骨癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、脑癌、子宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结直肠癌、肛门癌、胃肠道癌、皮肤癌、前列腺癌、垂体癌、阴道癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤。在一些实施方案中，本发明所述的CLDN18.2阳性相关疾病并不局限于上述疾病，与表达CLDN18.2相关的任何疾病和/或病症均在本发明的保护范围内。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：
本发明提供了一种靶向CLDN18.2的增强型嵌合抗原受体、增强型嵌合抗原受体免疫细胞(CAR-T细胞)，所述增强型CAR-T细胞中包含靶向CLDN18.2的抗体和p40亚基，本发明通过体内和体外实验验证发现两者联合能够实现T细胞长效清除肿瘤的作用，能够有效用于CLDN18.2阳性相关疾病的免疫治疗中，临床应用前景广阔。
附图说明
图1为不包含p40的嵌合抗原受体(CAR)图谱；
图2为包含p40的嵌合抗原受体(CAR)图谱；
图3为p40 CAR-T细胞(CLDN18.2-p40 CAR-T)和普通的CAR-T细胞(CLDN18.2 CAR-T)的杀伤效果验证结果图；
图4为p40 CAR-T细胞(CLDN18.2-p40 CAR-T)和普通的CAR-T细胞(CLDN18.2 CAR-T)与肿瘤细胞分别共孵育后细胞因子表达情况的结果图；
图5为将p40 CAR-T细胞(CLDN18.2-p40 CAR-T)和普通的CAR-T细胞(CLDN18.2CAR-T)分别与肿瘤细胞共孵育进行长效多轮杀伤比较的示意图；
图6为将p40 CAR-T细胞(CLDN18.2-p40 CAR-T)和普通的CAR-T细胞(CLDN18.2CAR-T)分别与肿瘤细胞共孵育进行长效多轮杀伤比较的结果图；
图7为p40 CAR-T细胞(CLDN18.2-p40 CAR-T)和普通的CAR-T细胞(CLDN18.2 CAR-T)对小鼠体内肿瘤杀伤效果的结果图，其中，A图：体内实验示意图，B图：小鼠实验期间体重检测结果，C图：肿瘤测量大小统计结果，D图：CAR-T输注35天后，取出肿瘤大小对比情况，E图：取出肿瘤重量对比结果。
具体实施方式
为了可以更容易地理解本公开，首先定义如本申请中所使用的某些术语，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有如下给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
在本文中使用，术语“包括”或“包含”，是指包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
在本文中使用，术语“同源性”，是指与需要比对的氨基酸序列或核苷酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明提供的氨基酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。所述75％或75％以上同源性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同源性。
在本文中使用，术语“嵌合抗原受体(CAR)”，包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常是指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。其中，术语“GMCSF信号肽”同“CSF2信号肽”，术语“EGFR DⅢ～DⅣ”同“hEGFR”或“EGFR”。
在本文中使用，术语“嵌合抗原受体免疫细胞(CAR-免疫细胞)”，是指嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，可用于将一种或多种抗原特异性移植到免疫效应细胞(诸如T细胞)的基因工程受体，所述嵌合抗原受体免疫细胞细胞可表达嵌合抗原受体。本发明涉及靶向CLDN18.2嵌合抗原受体结构的构建、靶向CLDN18.2嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法及其活性鉴定。
在本文中使用，术语“载体”，是指递送编码期望分子的核酸序列的载体。本发明提供的核酸分子可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸分子可被克隆入如此载体，其包括但不限于：质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以启动转录。
合适的启动子包括但不限于：即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子、延伸生长因子-1α(EF-1α)启动子、类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子(诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子)。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarborLaboratory,New York)。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在本文中使用，术语“有效量”，是指可有效地抑制、预防、阻止、延迟或治疗特定的疾病、病症或副作用的症状的本文所述嵌合抗原受体免疫细胞、嵌合抗原受体免疫细胞群体、衍生物、生物制剂和/或药物组合物的量。这种疾病、病症和副作用包括但不限于与CLDN18.2阳性相关疾病有关的那些病理学状况(例如，与CLDN18.2阳性相关疾病的治疗和/或预防有关的病理学状况)。治疗有效量可根据施用途径和剂型、对象的年龄和体重、和/或被治疗的疾病或状况而变化。
在本文中使用，术语“药物组合物”或“生物制剂”，可具有选自如下的任一种制剂：片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、悬浮液、溶液剂、乳剂、糖浆、灭菌水溶液剂、非水溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。此外，可以一次或多次施用。此时，以液体制剂、粉剂、气雾剂、胶囊、阴道片剂、胶囊或栓剂的形式施用所述药物组合物和/或生物制剂。施用途径可包括但不限于：腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、经口、局部、鼻内、肺内、直肠内等。当口服施用时，可配制成保护药物组合物中的活性成分以防止其在胃中降解的包衣。此外，可通过任何能够转移至靶组织的装置施用活性成分。在具体实施方案中，本发明提供的药物组合物可根据实际需要制成各种剂型，并可由临床医师根据受试者的种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它本领域技术人员公知的任何合适的给药方式。
在本文中使用，术语“受试者”，包括人类和非人类动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物和非哺乳动物)例如非人灵长类(例如，食蟹猴)、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在一些实施方案中，所述“受试者”优选为人。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1靶向CLDN18.2的增强型CAR-T细胞的构建及其杀伤效果验证
1、实验方法
(1)构建CAR慢病毒表达载体质粒
靶向CLDN18.2的单克隆抗体F2H的序列如下表1和表2所示。
表1单克隆抗体F2H的氨基酸序列
表2单克隆抗体F2H的核苷酸序列
基于上述靶向CLDN18.2的单克隆抗体F2H分别构建包含p40的CAR病毒表达载体质粒和不包含p40的CAR病毒表达载体质粒，所述CAR慢病毒表达载体质粒的具体构建方法如下：经密码子优化合成包含p40的嵌合抗原受体序列和不包含p40的嵌合抗原受体序列。
其中，所述包含P40的嵌合抗原受体序列由CD8α信号肽、F2H抗体(轻链可变区-Linker-重链可变区)、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、p40、T2A、GMCSF信号肽、EGFR DⅢ～DⅣ依次串联得到，其图谱如图2所示。
其中，所述不包含P40的嵌合抗原受体序列由CD8α信号肽、F2H抗体(轻链可变区-Linker-重链可变区)、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、GMCSF信号肽、EGFR DⅢ～DⅣ依次串联得到，其图谱如图1所示。
使用BstBI和XbaI两酶切位点，通过同源重组方式将合成序列接入pCDH-EF1α慢病毒表达质粒中。上述CAR中CD8α信号肽、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、p40、GMCSF信号肽、EGFR DⅢ～DⅣ对应的氨基酸序列和核苷酸序列分别见下表3和下表4。
表3CAR中各部分对应的氨基酸序列
表4CAR中各部分对应的核苷酸序列
(2)CAR-T细胞的构建
基于上述构建得到的包含p40的嵌合抗原受体序列和不包含p40的嵌合抗原受体序列进一步分别构建p40 CAR-T细胞和普通的CAR-T细胞。CAR-T细胞的具体构建方法如下：将慢病毒系统质粒(pCDH-EF1α慢病毒表达质粒、PsPAX2、pMD2.G三质粒系统，按质量比3:2:1混合)转染到对数生长期的贴壁293T细胞，收获转染48-72小时的细胞培养上清，通过浓缩过滤后，获得CAR慢病毒存于-80℃条件下备用。从人外周血分离外周血单个核细胞(PBMC)，使用人源CD3/28磁珠分离T细胞，并在激活72小时内进行病毒转导，转导24小时后换液培养至第8天，离心收集细胞并重悬于生理盐水中。使用流式细胞鉴定T细胞表面CAR分子，确保阳性率大于30％以上，低于则使用EGFR-PE磁珠进行富集分选。按照CAR-T细胞收获的阳性比例与靶细胞混合进行后续杀伤实验。
(3)CAR-T细胞的杀伤验证
采用1:5、1:1、5:1三个效靶比，采用胃癌细胞系AGS(AGS Cell)和过表达CLDN18.2的胃癌细胞系AGS(AGS-CLDN18.2 Cell)分别对上述构建得到的p40 CAR-T细胞(CLDN18.2-p40 CAR-T)和普通的CAR-T细胞(CLDN18.2 CAR-T)进行杀伤效果的验证。其中，AGS是胃癌细胞系，弱表达CLDN18.2，AGS-CLDN18.2为过表达CLDN18.2的AGS细胞系。
(4)CAR-T细胞的细胞因子表达情况
将普通对照T细胞(Control-T)、普通的CAR-T细胞(CLDN18.2 CAR-T)、p40 CAR-T细胞(CLDN18.2-p40 CAR-T)分别与胃癌细胞系AGS共孵育后，检测细胞因子的表达情况，其中，效靶比为1:10。
(5)CAR-T细胞与肿瘤细胞共孵育进行长效多轮杀伤比较
将p40 CAR-T细胞(CLDN18.2-p40 CAR-T)和普通的CAR-T细胞(CLDN18.2 CAR-T)与胃癌细胞系AGS共孵育，待72小时后(第一轮)，取出CAR-T细胞(或对照T细胞)后对培养皿内肿瘤计数，并将CAR-T放入新的含有肿瘤细胞的培养皿中共培养、进行长效多轮杀伤(后三轮间隔24小时)比较，示意图见图5，其中，起始效靶比为1:10。
2、实验结果
结果显示，普通T细胞、CLDN18.2 CAR-T细胞和CLDN18.2-p40 CAR-T细胞三者相比，在肿瘤识别杀伤方面，CLDN18.2 CAR-T细胞和CLDN18.2-p40 CAR-T细胞能够识别CLDN18.2表达的细胞，对CLDN18.2高表达的细胞杀伤更强，CLDN18.2-p40 CAR-T细胞的杀伤效果与CLDN18.2 CAR-T细胞效果接近(见图3)。在细胞因子释放方面，CLDN18.2-p40CAR-T在细胞因子释放上与CLDN18.2 CAR-T相比除了p40和IL-23有明显差异外，IL-2、INF-γ、TNF-α无明显差异(见图4)。提示p40元件增加对常规体外杀伤影响较小。
将细胞与肿瘤细胞共孵育，进行长效多轮杀伤比较时，发现在低效靶比(E:T＝1:10)起始时，CLDN18.2-p40 CAR-T细胞对肿瘤的清除能力在前2轮明显优于CLDN18.2 CAR-T，到第3轮时仍与对照组有显著差异(见图6)，表明了CLDN18.2-p40 CAR-T在连续杀伤时，具有较好的杀伤持续能力。
实施例2体内实验进一步验证靶向CLDN18.2的CAR-T细胞的杀伤效果
1、实验方法
在小鼠体内实验中，本实施例使用5×106个AGS-CLDN18.2细胞皮下接种肿瘤后14天，在不同组内小鼠的尾静脉注射入2×106个T细胞、CLDN18.2 CAR-T细胞或CLDN18.2-p40CAR-T细胞，观察治疗效果。体内治疗肿瘤的实验示意图如图7A所示。
2、实验结果
结果显示，CLDN18.2 CAR-T细胞、CLDN18.2-p40 CAR-T细胞均能够降低小鼠体内肿瘤负荷，但是CLDN18.2-p40 CAR-T细胞可以在细胞输注后实现肿瘤的清除(见图7B-E)，体现了p40表达的CAR-T细胞在体内的强杀伤能力，以上实验结果证明了CLDN18.2-p40CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果显著优于CLDN18.2 CAR-T细胞。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (64)
1.一种靶向CLDN18.2的增强型嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含靶向CLDN18.2的抗体和p40亚基；
所述抗体包含重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3；
所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3；
所述HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；
所述LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示；
所述p40亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包含铰链区。
5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区选自下列分子的铰链区：CD8、4-1BB、IgG1、IgG4、PD-1、CD28、CD34、OX40或CD3ε。
6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区为CD8铰链区。
7.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域。
8.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域选自下列分子的跨膜结构域：CD8、4-1BB、IgG1、IgG4、PD-1、CD28、CD34、OX40或CD3ε。
9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域。
10.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包含共刺激信号结构域。
11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激信号结构域选自下列分子的共刺激信号结构域：4-1BB、HVEM、CD27、CD19、CD28、ICOS、CD4、CD8α、CD8β、CD40、OX40、DR3、CD2、GITR、CD30、TIM1或CD226。
12.根据权利要求11所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激信号结构域为4-1BB共刺激信号结构域。
13.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包含胞内信号传导结构域。
14.根据权利要求13所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号传导结构域选自下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD278、CD21、CD22、FcεRI、FcRγ、FcRβ、CD4、CD5、CD8、CD79a、CD79b、DAP10、DAP12或CD66d。
15.根据权利要求14所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域。
16.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包含CD8α信号肽、T2A、GMCSF信号肽、EGFR D Ⅲ~D Ⅳ。
17.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由所述CD8α信号肽、所述抗体、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、p40亚基、T2A、GMCSF信号肽、EGFR D Ⅲ~D Ⅳ依次串联得到的嵌合抗原受体。
18.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
19.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
20.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
21.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述4-1BB共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
22.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
23.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述T2A的氨基酸序列如SEQID NO:16所示。
24.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述GMCSF信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
25.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述EGFR D Ⅲ~D Ⅳ的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
26.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体。
27.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体中的抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
28.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体中的抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
29.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体中的p40亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。
30.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体中的CD8α信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
31.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体中的CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。
32.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体中的CD8跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。
33.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体中的4-1BB共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。
34.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体中的CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
35.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体中的T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。
36.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体中的GMCSF信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。
37.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体中的EGFR DⅢ~D Ⅳ的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。
38.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求26-37中任一项所述的核酸分子。
39.根据权利要求38所述的表达载体，其特征在于，所述载体选自质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体或病毒来源的载体。
40.根据权利要求39所述的表达载体，其特征在于，所述病毒来源的载体选自慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、杆状病毒载体、乳头状瘤病毒载体或乳头多瘤空泡病毒载体。
41.一种嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞包含权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求26-37中任一项所述的核酸分子和/或权利要求38-40中任一项所述的表达载体。
42.根据权利要求41所述的嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞选自T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、单核细胞、髓样细胞、树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞和/或其任意组合。
43.根据权利要求42所述的嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞为T淋巴细胞。
44.一种嵌合抗原受体免疫细胞群体，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞群体包含权利要求41-43中任一项所述的嵌合抗原受体免疫细胞。
45.根据权利要求44所述的嵌合抗原受体免疫细胞群体，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞群体还包含不包含权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求26-37中任一项所述的核酸分子和/或权利要求38-40中任一项所述的表达载体的免疫细胞。
46.根据权利要求45所述的嵌合抗原受体免疫细胞群体，其特征在于，所述免疫细胞选自T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、单核细胞、髓样细胞、树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞和/或其任意组合。
47.根据权利要求46所述的嵌合抗原受体免疫细胞群体，其特征在于，所述免疫细胞为T淋巴细胞。
48.一种检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包含可检测标记的权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体和/或权利要求26-37中任一项所述的核酸分子、和/或赋予抗生素抗性的权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体和/或权利要求26-37中任一项所述的核酸分子。
49.根据权利要求48所述的检测试剂，其特征在于，所述可检测标记选自荧光染料、胶体金、化学发光标记物和/或化学发光催化剂。
50.根据权利要求49所述的检测试剂，其特征在于，所述化学发光标记物选自鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、金刚烷、稀土元素和/或联吡啶钌配合物。
51.根据权利要求49所述的检测试剂，其特征在于，所述化学发光催化剂选自辣根过氧化物酶和/或碱性磷酸酶。
52.根据权利要求48所述的检测试剂，其特征在于，赋予所述抗生素抗性的基因选自青霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因和/或卡那霉素抗性基因。
53.一种用于治疗和/或预防CLDN18.2阳性相关疾病的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包含权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求26-37中任一项所述的核酸分子、权利要求38-40中任一项所述的表达载体、权利要求41-43中任一项所述的嵌合抗原受体免疫细胞和/或权利要求44-47中任一项所述的嵌合抗原受体免疫细胞群体；
所述CLDN18.2阳性相关疾病选自胃癌、胰腺癌、食管癌、胆管癌、乳腺癌、肝癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、结直肠癌或黑色素瘤。
54.一种用于治疗和/或预防CLDN18.2阳性相关疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求26-37中任一项所述的核酸分子、权利要求38-40中任一项所述的表达载体、权利要求41-43中任一项所述的嵌合抗原受体免疫细胞、权利要求44-47中任一项所述的嵌合抗原受体免疫细胞群体和/或权利要求53所述的生物制剂；
所述CLDN18.2阳性相关疾病选自胃癌、胰腺癌、食管癌、胆管癌、乳腺癌、肝癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、结直肠癌或黑色素瘤。
55.根据权利要求54所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含用于辅助治疗和/或预防CLDN18.2阳性相关疾病的治疗剂。
56.根据权利要求55所述的药物组合物，其特征在于，所述治疗剂选自烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄激素、免疫调节剂和/或细胞毒素。
57.一种制备权利要求41-43中任一项所述的嵌合抗原受体免疫细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：提供待改造的免疫细胞，将权利要求26-37中任一项所述的核酸分子或权利要求38-40中任一项所述的表达载体导入到所述免疫细胞内，获得权利要求41-43中任一项所述的嵌合抗原受体免疫细胞。
58.根据权利要求57所述的方法，其特征在于，所述待改造的免疫细胞选自T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、单核细胞、髓样细胞、树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞和/或其任意组合。
59.根据权利要求58所述的方法，其特征在于，所述待改造的免疫细胞为T淋巴细胞。
60.权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求26-37中任一项所述的核酸分子、权利要求38-40中任一项所述的表达载体、权利要求41-43中任一项所述的嵌合抗原受体免疫细胞、权利要求44-47中任一项所述的嵌合抗原受体免疫细胞群体、权利要求53所述的生物制剂和/或权利要求54-56中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防CLDN18.2阳性相关疾病的药物中的应用；
所述CLDN18.2阳性相关疾病选自胃癌、胰腺癌、食管癌、胆管癌、乳腺癌、肝癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、结直肠癌或黑色素瘤。
61.权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求26-37中任一项所述的核酸分子、权利要求38-40中任一项所述的表达载体、权利要求41-43中任一项所述的嵌合抗原受体免疫细胞和/或权利要求44-47中任一项所述的嵌合抗原受体免疫细胞群体在制备用于治疗和/或预防CLDN18.2阳性相关疾病的生物制剂中的应用；
所述CLDN18.2阳性相关疾病选自胃癌、胰腺癌、食管癌、胆管癌、乳腺癌、肝癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、结直肠癌或黑色素瘤。
62.权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求26-37中任一项所述的核酸分子和/或权利要求38-40中任一项所述的表达载体在制备用于治疗和/或预防CLDN18.2阳性相关疾病的嵌合抗原受体免疫细胞中的应用；
所述CLDN18.2阳性相关疾病选自胃癌、胰腺癌、食管癌、胆管癌、乳腺癌、肝癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、结直肠癌或黑色素瘤。
63.权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求26-37中任一项所述的核酸分子和/或权利要求38-40中任一项所述的表达载体在制备用于治疗和/或预防CLDN18.2阳性相关疾病的嵌合抗原受体免疫细胞群体中的应用；
所述CLDN18.2阳性相关疾病选自胃癌、胰腺癌、食管癌、胆管癌、乳腺癌、肝癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、结直肠癌或黑色素瘤。
64.权利要求1-25中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求26-37中任一项所述的核酸分子和/或权利要求38-40中任一项所述的表达载体在制备用于制备治疗和/或预防CLDN18.2阳性相关疾病的嵌合抗原受体免疫细胞的试剂盒中的应用；
所述CLDN18.2阳性相关疾病选自胃癌、胰腺癌、食管癌、胆管癌、乳腺癌、肝癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、结直肠癌或黑色素瘤。
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