CN115873117A - 一种pd-l1单克隆抗体或其抗原结合片段及检测试剂盒 - Google Patents
一种pd-l1单克隆抗体或其抗原结合片段及检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种PD‑L1单克隆抗体或其抗原结合片段及检测试剂盒。该单克隆抗体或其抗原结合片段与PD‑L1的特异性强、亲和力高，可用于检测PD‑L1在样品中的存在或含量、PD‑L1相关的疾病的诊断或预后评估、用于预防和/或治疗PD‑L1相关的疾病的药物筛选、治疗和/或预防与PD‑L1相关的疾病。同时采用包含上述PD‑L1单克隆抗体或其抗原结合片段的试剂盒对PD‑L1进行检测时，所述试剂盒的灵敏度、准确性和重复性好。
Description
技术领域
本发明属于抗体技术领域，具体涉及一种PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段及检测试剂盒。
背景技术
细胞程序性死亡-配体1(Programmed cell death 1ligand 1，PD-L1)是一种大小为40kDa的一型跨膜蛋白。PD-L1主要表达于T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞等。研究表明PD-L1在肿瘤组织中有较高表达。PD-L1是细胞程序性死亡受体-1(PD-1)的主要配体之一。PD-1主要在T细胞中表达，表达于肿瘤细胞表面的PD-L1与PD-1结合后，能抑制局部T细胞的抗肿瘤免疫应答，使肿瘤细胞可逃逸NK细胞或T细胞的免疫监视。PD-L1信号传导的抑制已经证实为增强T细胞免疫以用于治疗癌症的手段(例如，肿瘤免疫)。已经开发出使用抗PD-1或抗PD-L1抗体的疗法并用于治疗不同类型的癌症。在此项技术中需要检测生物样本中的PD-L1。研究表明，血清中PD-L1浓度与肿瘤疾病进展及治疗效果评价和疾病转归等方面有重要关系，在疾病的诊断及预测疾病治疗等方面存在很大的应用价值。
近年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。用于检测血清学指标的方法主要包括放射性同位素免疫分析、酶联免疫吸附法和化学发光免疫分析。这些方法既可以作为初筛试验也可以作为确认试验，其中化学发光法具有检测线性范围宽、检测仪器简单、操作方便等优点。
现有技术中针对PD-L1检测用的PD-L1抗体的特异性和亲和力等方面还存在进一步的提升可能。因此一株高灵敏度、强特异性的PD-L1抗体，对识别和检测样本中PD-L1含量具有非常重要的作用。
发明内容
本申请第一方面的目的，在于提供一种PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段。
本申请第二方面的目的，在于提供与本申请第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段相关的生物材料。
本申请第三方面的目的，在于提供一种包含本申请第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的偶联物。
本申请第四方面的目的，在于提供一种本申请第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段、第二方面的生物材料和/或第三方面的偶联物在制备产品中的应用。
本申请第五方面的目的，在于提供一种包含本申请第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或本发明第三方面的偶联物的产品，所述产品例如可以为试剂盒或药物。
本申请第六方面的目的，在于提供本申请第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法。
本申请第七方面的目的，在于提供一种方法。
本申请第八方面的目的，在于提供一种预防和/或治疗与PD-L1相关的疾病的方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本申请的第一方面提供一种PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，所述PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段为A1或A2，且包含重链可变区和轻链可变区；
所述A1的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3；
所述A1的重链可变区的CDR1的氨基酸序列为：
a11)SGYWN(如SEQ ID NO：25所示)；或
a12)将SEQ ID NO：25经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：25所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a13)与SEQ ID NO：25具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％以上的同源性，且与SEQ ID NO：25所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A1的重链可变区的CDR2的氨基酸序列为：
a21)FINFSGSTYYNPSLKS(如SEQ ID NO：26所示)；或
a22)将SEQ ID NO：26经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：26所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a23)与SEQ ID NO：26具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％以上的同源性，且与SEQ ID NO：26所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A1的重链可变区的CDR3的氨基酸序列为：
a31)YNYFDSTSNYFDY(如SEQ ID NO：27所示)；或
a32)将SEQ ID NO：27经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：27所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a33)与SEQ ID NO：27具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％以上的同源性，且与SEQ ID NO：27所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A1的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3；
所述A1的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列为：
a41)RASKSIGKYLA(如SEQ ID NO：28所示)；或
a42)将SEQ ID NO：28经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：28所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a43)与SEQ ID NO：28具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％以上的同源性，且与SEQ ID NO：28所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A1的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列为：
a51)SGSILQS(如SEQ ID NO：29所示)；或
a52)将SEQ ID NO：29经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：29所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a53)与SEQ ID NO：29具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％以上的同源性，且与SEQ ID NO：29所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A1的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列为：
a61)QQHNEYPFT(如SEQ ID NO：30所示)；或
a62)将SEQ ID NO：30经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：30所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a63)与SEQ ID NO：30具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％以上的同源性，且与SEQ ID NO：30所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A2的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3；
所述A2的重链可变区的CDR1的氨基酸序列为：
a71)DIYMH(如SEQ ID NO：31所示)；或
a72)将SEQ ID NO：31经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：31所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a73)与SEQ ID NO：31具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的以上同源性，且与SEQ ID NO：31所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A2的重链可变区的CDR2的氨基酸序列为：
a81)RIGPANGDIKYDPKFQG(如SEQ ID NO：32所示)；或
a82)将SEQ ID NO：32经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：32所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a83)与SEQ ID NO：32具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％以上的同源性，且与SEQ ID NO：32所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A2的重链可变区的CDR3的氨基酸序列为：
a91)YGSYFAMDY(如SEQ ID NO：33所示)；或
a92)将SEQ ID NO：33经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：33所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a93)与SEQ ID NO：33具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％以上的同源性且与SEQ ID NO：33所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A2的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3；
所述A2的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列为：
a101)RASGNIHNYLA(如SEQ ID NO：34所示)；或
a102)将SEQ ID NO：34经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：34所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a103)与SEQ ID NO：34具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％以上的同源性且与SEQ ID NO：34所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A2的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列为：
a111)NAKTLAD(如SEQ ID NO：35所示)；或
a112)将SEQ ID NO：35经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：35所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a113)与SEQ ID NO：35具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％以上的同源性且与SEQ ID NO：35所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A2的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列为：
a121)QHFWSTPYT(如SEQ ID NO：36所示)；或
a122)将SEQ ID NO：36经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：36所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a123)与SEQ ID NO：36具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％以上的同源性且与SEQ ID NO：36所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述A1的重链可变区的氨基酸序列包含：
a131)EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYMGFINFSGSTYYNPSLKS RISITRDTSKNQFYLQLNSVTTEDTATYYCARYNYFDSTSNYFDYWGQGTTLTVSS(如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列)；或
a132)将SEQ ID NO：6经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：6所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a133)与SEQ ID NO：6具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：6所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A1的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a141)DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSIGKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSILQSGIPSTFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPFTFGSGTKLEIK(如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列)；或
a142)将SEQ ID NO：12经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：12所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a143)与SEQ ID NO：12具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：12所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A2的重链可变区的氨基酸序列包含：
a151)EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASAFNIKDIYMHWMKQRPEQGLEWIGRIGPANGDIKYDPKFQGKATITADASSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCAHYGSYFAMDYWGQGTSVTVSS(如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列)；或
a152)将SEQ ID NO：18经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：18所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a153)与SEQ ID NO：18具有80％、85％或90％以上的同源性且与SEQ ID NO：18所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A2的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a161)DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGNYYCQHFWSTPYTFGGGTKLEIK(如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列)；或
a162)将SEQ ID NO：24经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：24所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a163)与SEQ ID NO：24具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：24所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区中还均包含前导肽。
优选地，所述A1的重链可变区的前导肽的氨基酸序列包含：
a171)MVLSLLYLLTALPGILS(如SEQ ID NO：5所示)或
a172)将SEQ ID NO：5经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：5所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a173)与SEQ ID NO：5具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：5所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A1的轻链可变区的前导肽的氨基酸序列包含：
a181)MRFQVQVLGLLLLWISGAQC(如SEQ ID NO：11所示)；或
a182)将SEQ ID NO：11经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：11所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a183)与SEQ ID NO：11具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：11所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A2的重链可变区的前导肽的氨基酸序列包含：
a191)MKCSWVIFFLMAVVTGVNS(如SEQ ID NO：17所示)；或
a192)将SEQ ID NO：17经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：17所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a193)与SEQ ID NO：17具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：17所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A2的轻链可变区的前导肽的氨基酸序列包含：
a201)MSVLTQVLALLLLWLTGARC(如SEQ ID NO：23所示)；或
a202)将SEQ ID NO：23经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：23所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a203)与SEQ ID NO：23具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：23所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、双特异性抗体、多特异性抗体中的至少一种。
本申请第二方面提供一种与本申请第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段相关的生物材料，所述生物材料包含b1)-b8)中至少一种：
b1)编码如本申请第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子；
b2)包含b1)所述核酸分子的表达盒；
b3)包含b1)所述核酸分子的载体；
b4)包含b2)所述表达盒的载体；
b5)包含b1)所述核酸分子的转基因细胞系；
b6)包含b2)所述表达盒的转基因细胞系；
b7)包含b3)所述载体的转基因细胞系；
b8)包含b4)所述载体的转基因细胞系。
在一些实施方式中，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。
在一些实施方式中，所述编码如本申请第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子包含编码如本申请第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子和编码如本申请第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子；
所述编码A1的重链可变区的核酸分子的核苷酸序列包含：
a211)如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；或
a212)将SEQ ID NO：3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：3所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
a213)与SEQ ID NO：3具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：3所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；
所述编码A1的轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列包含：
a221)如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；或
a222)将SEQ ID NO：9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：9所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
a223)与SEQ ID NO：9具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：9所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；
所述编码A2的重链可变区的核酸分子的核苷酸序列包含：
a231)如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列；或
a232)将SEQ ID NO：15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：15所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
a233)与SEQ ID NO：15具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：15所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；
所述编码A2的轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列包含：
a241)如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列；或
a242)将SEQ ID NO：21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO：21所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
a243)与SEQ ID NO：21具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：21所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列。
本申请第三方面提供一种偶联物，其包含：如本申请第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及偶联部分；所述偶联部分选自可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒和病毒外壳蛋白中的至少一种。
在一些实施方式中，所述可检测标记物为荧光或发光标记物。
在一些具体实施方式中，所述可检测标记物选自吖啶酯、吖啶磺酰胺、鲁米诺、异鲁米诺、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的任意一种。
在一些实施方式中，所述放射性核素为诊断用同位素和治疗用同位素中的至少一种。
在一些具体实施方式中，所述诊断用同位素选自Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177和Re-188中的至少一种。
在一些具体实施方式中，所述治疗用同位素选自Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169和Yb-177中的至少一种。
在一些实施方式方式中，所述药物为细胞毒性药物。
在一些具体实施方式中，所述细胞毒性药物选自抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂和长春花生物碱中的至少一种；在一些更为具体的实施方式中，所述细胞毒性药物选自奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepinecontaining drugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines)和长春花生物碱(vincaalkaloids)中的至少一种。
本申请第四方面提供了一种如本申请第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、第二方面所述的生物材料和/或第三方面所述的偶联物在制备产品中的应用；
所述产品选自药物、试剂、检测板、芯片、试纸和试剂盒中的至少一种。
在一些实施方式中，所述产品包含试剂、检测板、芯片、试纸和试剂盒中的至少一种。
在一些实施方式中，所述药物具有治疗和/或预防与PD-L1相关的疾病的功能。
在一些实施方式中，所述试剂、检测板、试纸、芯片和试剂盒具有d1)-d3)中至少一种功能：
d1)检测PD-L1在样品中的存在或水平；
d2)对PD-L1相关的疾病的诊断或预后评估；
d3)药物筛选，所述药物用于预防和/或治疗PD-L1相关的疾病。
在一些实施方式中，所述样品选自血液样品、组织样品和细胞样品中的至少一种。在本一些优选的实施方式中，所述样品选自血清和血浆中的至少一种。
在一些实施方式中，所述疾病包括肿瘤。
在一些具体实施方式中，所述肿瘤选自血液肿瘤、实体瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌、头颈癌和肾癌中的至少一种。
本申请第五方面提供了一种产品，所述产品包含e1)-e3)中至少一种：
e1)本申请第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
e2)本申请第二方面所述的生物材料；
e3)本申请第三方面所述的偶联物；
所述产品选自药物、试剂、检测板、芯片、试纸和试剂盒中的至少一种。
在一些实施方式中，所述产品包含试剂、检测板、芯片、试纸和试剂盒中的至少一种。在一些实施方式中，所述药物具有治疗和/或预防与PD-L1相关的疾病的功能。
在一些实施方式中，所述药物还包含药学上可接受的辅料。
在一些具体实施方式中，所述药学上可接受的辅料选自稀释剂、粘合剂、致湿剂、表面活性剂、润滑剂和崩解剂中的至少一种。
在一些实施方式中，所述疾病包括肿瘤。
在一些具体实施方式中，所述肿瘤选自血液肿瘤、实体瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、胃肿瘤、膀胱癌、子宫内膜癌、头颈癌和肾癌中的至少一种。
在一些实施方式中，所述试剂、检测板、试纸、芯片和试剂盒具有d1)-d3)中至少一种功能：
d1)检测PD-L1在样品中的存在或含量；
d2)对PD-L1相关的疾病的诊断或预后评估；
d3)药物筛选，所述药物用于预防和/或治疗PD-L1相关的疾病。
在一些实施方式中，所述样品选自血液样品、组织样品和细胞样品中的至少一种。在本一些优选的实施方式中，所述样品选自血清和血浆中的至少一种。
在一些实施方式中，所述疾病包括肿瘤。
在一些具体实施方式中，所述肿瘤选自血液肿瘤、实体瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌、头颈癌和肾癌中的至少一种。
在一些具体实施方式中，所述产品为试剂盒，所述试剂盒中包括包被抗体和检测抗体，所述包被抗体和所述检测抗体中的至少一种为如本申请第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；且所述包被抗体和所述检测抗体分别针对PD-L1不同的抗原表位。
也即，本申请中的所述包被抗体可以为本申请第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段(A1或A2)，所述检测抗体可以为其他PD-L1抗体或其抗原结合片段(不同于A1和A2)。
本申请中，所述包被抗体和所述检测抗体分别针对PD-L1不同的抗原表位，从而使包被抗体和检测抗体能够与PD-L1结合形成夹心复合物，且包被抗体和检测抗体与PD-L1结合不会产生竞争关系。
在一些实施方式中，所述包被抗体与固相载体结合。
在一些优选的实施方式中，所述固相载体选自磁珠和微孔板中的至少一种。
在一些实施方式中，所述检测抗体标记有可检测标记物。
在一些优选的实施方式中，所述可检测标记物包含荧光或发光标记物。例如，本申请的可检测标记物为吖啶酯。
在一些具体实施方式中，所述包被抗体为本申请第一方面中的A1，所述检测抗体为本申请第一方面中的A2；或所述包被抗体为本申请第一方面中的A2，所述检测抗体为本申请第一方面中的A1。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包含固相载体、包被缓冲液、洗涤液、封闭液、显色底物、终止液和PD-L1标准品溶液中的至少一种。
本申请中，所述包被缓冲液、洗涤液、封闭液、显色底物和终止液为本领域的试剂，本领域技术人员可以根据需要进行常规选择使用。
本申请中，利用所述试剂盒检测待测样本中的PD-L1原理为夹心法检测，具体为：将第一抗体(包被抗体)包被固相载体(磁珠)，与样本混合得到混合液1，对所述混合液1进行孵育，若样本中含有PD-L1，此时PD-L1将会与与磁珠结合的第一抗体结合，形成磁珠-抗PD-L1抗体(包被抗体)-PD-L1抗原复合物；对混合液1进行固液分离，洗涤除去其他未结合的物质，再加入含有吖啶酯标记的第二抗体(检测抗体)溶液，混合后形成混合液2，对混合液2进行温育，此时吖啶酯标记的第二抗体与固相复合物中的PD-L1抗原结合进而形成夹心复合物(磁珠-抗PD-L1抗体(包被抗体)-PD-L1抗原-抗PD-L1抗体(检测抗体)-吖啶酯)；对混合液2进行固液分离，洗涤除去其他未结合的物质；然后加入发光底物溶液(含过氧化氢的碱性溶液)进行发光，检测样本的发光强度(RLU)，样本的RLU值与PD-L1浓度呈正比，根据PD-L1浓度-RLU值的标准曲线即可算出样本中PD-L1的含量。
本申请第六方面提供了本申请第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法，通过培养本申请第二方面中的转基因细胞系得到。
本申请第七方面提供了一种方法，所述方法包含：本申请第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、本申请第三方面所述的偶联物和本申请第五方面提供的产品(例如产品中的试剂盒)的使用步骤；
在一些实施方式中，所述方法用于d1)-d3)中至少一种功能：
d1)检测PD-L1在样品中的存在或含量；
d2)PD-L1相关的疾病的诊断或预后评估；
d3)药物筛选，所述药物用于预防和/或治疗PD-L1相关的疾病。
在一些具体实施方式中，所述方法包含本申请第五方面提供的产品中的试剂盒的使用步骤，具体如下：
1)将包被抗体包被于固相载体，得到含包被抗体的固相载体；
2)将含包被抗体的固相载体与待测样品接触，洗涤固相载体；
3)将步骤2)得到的洗涤后的固相载体与检测抗体接触，洗涤固相载体；
4)将步骤3)得到的洗涤后的固相载体与显色底物接触，终止反应，检测。
在一些实施方式中，所述待测样品选自血液样品、组织待测和细胞样品中的至少一种。在一些优选的实施方式中，所述待测样品选自血清和血浆中的至少一种。
在一些实施方式中，所述疾病包括肿瘤。
在一些具体实施方式中，所述肿瘤选自血液肿瘤、实体瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌、头颈癌和肾癌中的至少一种。
本申请第八方面提供了一种预防和/或治疗与PD-L1相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的物质A，所述物质A包含g1)-g4)中至少一种；
g1)本申请第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
g2)本申请第二方面所述的生物材料；
g3)本申请第三方面所述的偶联物；
g4)本申请第五方面所述产品中的药物。
在一些实施方式中，所述疾病包括肿瘤。
在一些具体实施方式中，所述肿瘤包含血液肿瘤、实体瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、胃肿瘤、膀胱癌、子宫内膜癌、头颈癌和肾癌中的至少一种。
本申请的有益效果为：本申请提供了一种PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段与PD-L1结合的特异性强、亲和力高，可用于检测PD-L1在样品中的存在或水平、PD-L1相关的疾病的诊断或预后评估、预防和/或治疗PD-L1相关的疾病的药物筛选、治疗和/或预防与PD-L1相关的疾病。
附图说明
图1是采用实施例2的试剂盒绘制的PD-L1浓度-RLU值的标准曲线图。
图2是采用实施例3的试剂盒绘制的PD-L1浓度-RLU值的标准曲线图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
本申请中，术语“单克隆抗体”是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。
本申请中，术语“可变区”是指抗体轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域；其中重链可变区占重链的1/4，轻链可变区占轻链的1/2。
本申请中，术语“前导肽”是指信号肽的一种，位于成熟蛋白的N端，引导蛋白穿膜，并且在后来被剪切掉。
实施例1：PD-L1单克隆抗体的制备
PD-L1单克隆抗体的制备为本领域的常规方法，包括如下步骤：重组免疫原的制备、采用所制备的重组免疫原对小鼠进行免疫、对免疫后的小鼠的血清进行效价检测、将免疫后的小鼠的脾细胞与骨髓细胞进行融合制备杂交瘤细胞、阳性杂交瘤细胞的筛选、阳性杂交瘤细胞接种小鼠进行腹水生产和抗体的纯化，制得6株针对PD-L1的单克隆抗体。本实施例中，上述制备过程均委托第三方公司进行。
采用双抗体夹心ELISA实验对获得的6株针对PD-L1的单克隆抗体进行筛选，筛选最优单克隆抗体。筛选过程：将上述6株针对PD-L1的单克隆抗体分别包被于酶标板上；然后将梯度稀释的PD-L1抗原溶液(0、3.2pg/mL、16pg/mL、80pg/mL、400pg/mL、2ng/mL、10ng/mL和50ng/mL)分别添加到上述酶标板上；再加入生物素化多克隆抗体及标记有辣根过氧化物酶的链霉亲和素，温育后加入显色底物液，用酶标仪检测OD450值。
以PD-L1抗原浓度为横坐标X值，OD450值为纵坐标Y值，建立剂量反应曲线，结果发现上述6株单克隆抗体中，相较于其他4株单克隆抗体，单克隆抗体A11-7-21和C10-1-J4的检测性能较佳，该两种单克隆抗体(C10-1-J4和A11-7-21)的检出限均低于80pg/mL，且所建立的剂量反应曲线的线性系数均大于0.99。表明上述两种单克隆抗体(C10-1-J4和A11-7-21)对PD-L1的特异性强，亲和力高。
分别提取分泌上述单克隆抗体A11-7-21和C10-1-J4的杂交瘤细胞的mRNA，反转录合成cDNA，然后对上述cDNA进行PCR扩增后测序分别获得单克隆抗体A11-7-21和C10-1-J4的核苷酸序列和氨基酸序列，具体如表1和表2所示。
表1：单克隆抗体A11-7-21的核苷酸和氨基酸序列
表2：单克隆抗体C10-1-J4的核苷酸和氨基酸序列
实施例2：用于检测样本中PD-L1含量的试剂盒
该试剂盒组成如下：
连接包被抗体的磁珠(免疫磁珠)和检测抗体：包被抗体为实施例1中的PD-L1单克隆抗体C10-1-J4，其浓度为50μg/mL；检测抗体为吖啶酯标记的实施例1中的PD-L1单克隆抗体A11-7-21，A11-7-21的浓度0.5μg/mL；
包被缓冲液：50mmol/L的吗啉乙磺酸(MES)；
洗涤液：三(羟甲基)氨基甲烷20mmol/L，氯化钠0.15mol/L，吐温-20 0.05wt％和Proclin300 0.1wt％；
封闭液：50mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)；
显色底物：包括底物A和底物B；其中底物A的组成为：30％过氧化氢0.1wt％和硝酸0.1mol/L，底物B的组成为：氢氧化钠0.2mol/L和十六烷基三甲基氯化铵0.1wt％；
系列浓度的PD-L1标准品溶液：浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL和20ng/mL。
实施例3：用于检测待测样本中PD-L1含量的试剂盒
该试剂盒组成如下：
连接包被抗体的磁珠(免疫磁珠)和检测抗体：包被抗体为实施例1中的PD-L1单克隆抗体A11-7-21，其浓度为50μg/mL；检测抗体为吖啶酯标记的实施例1中的PD-L1单克隆抗体C10-1-J4，C10-1-J4的浓度0.5μg/mL；
包被缓冲液：组成同实施例2；
洗涤液：组成同实施例2；
封闭液：组成同实施例2；
显色底物：组成同实施例2；
系列浓度的PD-L1标准品溶液：浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL和20ng/mL。
实施例4：试剂盒的性能检测
1.线性范围检测
(1)采用实施例2的试剂盒对浓度分别为0、0.1ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL和20ng/mL的系列浓度PD-L1标准品溶液进行检测。检测过程中使用的仪器为全自动化学发光免疫自动仪，检测结果如表3所示。根据表3的检测结果绘制PD-L1浓度-RLU值的标准曲线，标准曲线图如图1所示。
表3
从图1可知，实施例2的试剂盒在0～20ng/mL浓度范围内，线性相关系数为0.9999，线性好。另外，从表3可知，实施例2的试剂盒的批内变异系数(CV)最高为6.3％，均小于7％，表明该试剂盒的检测重复性良好。
(2)采用实施例3所述的试剂盒对浓度分别为0、0.1ng/mL、0.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL和20ng/mL的系列浓度PD-L1标准品溶液进行检测。检测过程中使用的仪器为全自动化学发光免疫自动仪，检测结果如表4所示。根据表4的检测结果绘制PD-L1浓度-RLU值的标准曲线，标准曲线图如图2所示。
表4
从图2可知，实施例3的试剂盒在0～20ng/mL浓度范围内，线性相关系数为0.9987，线性好。另外，从表4可知，实施例3的试剂盒的批内变异系数(CV)最高为3.7％，均小于5％，表明实施例3的试剂盒的检测重复性良好。
2.灵敏度检测
采用实施例2的试剂盒对已知浓度的4个PD-L1溶液进行检测，上述PD-L1溶液的浓度分别为3.2pg/mL、16pg/mL、80pg/mL和400pg/mL。结果显示，实施例2的试剂盒的检出限低于3.2pg/mL，说明实施例2的试剂盒的灵敏度较高。
采用实施例3的试剂盒对已知浓度的4个PD-L1溶液进行检测，上述PD-L1溶液的浓度分别为3.2pg/mL、16pg/mL、80pg/mL和400pg/mL。结果显示，实施例3的试剂盒的检出限低于16pg/mL，说明实施例3的试剂盒的灵敏度较高。
实施例5：待测样本中PD-L1的检测
(1)采用实施例2中的试剂盒对5名肺癌患者的血浆样本中的PD-L1含量进行检测，检测过程中使用的仪器为全自动化学发光免疫自动仪，各样本检测的RLU值如表5所示。根据各样本的RLU值以及实施例4绘制的标准曲线对各样本中PD-L1的拟合浓度进行检测，结果如表5所示。
采用实施例2中的试剂盒对5名健康人的血浆样本中的PD-L1含量进行检测，检测过程中使用的仪器为全自动化学发光免疫自动仪，各样本检测的RLU值如表6所示。根据各样本的RLU值以及实施例4绘制的图1所示的标准曲线对各样本中PD-L1的拟合浓度进行检测，结果如表6所示。
表5
| RLU值 | 拟合浓度(ng/mL) | |
| 患者1 | 26383 | 0.16 |
| 患者2 | 43403 | 0.27 |
| 患者3 | 29552 | 0.18 |
| 患者4 | 38149 | 0.24 |
| 患者5 | 116341 | 0.78 |
表6
| RLU值 | 拟合浓度(ng/mL) | |
| 健康人1 | 4920 | 0.02 |
| 健康人2 | 5429 | 0.03 |
| 健康人3 | 6982 | 0.04 |
| 健康人4 | 6300 | 0.03 |
| 健康人5 | 6754 | 0.03 |
从表5、6可知，采用本申请实施例2中的试剂盒对5名患者和5名健康人的血浆样本进行检测后，5名患者血浆样本中PD-L1的浓度均高于0.15ng/mL，5名健康人血浆样本中PD-L1的浓度均低于0.04ng/mL。检测结果符合预期，说明实施例2的试剂盒检测准确性高，能准确对样本中的PD-L1进行检测。
(2)采用实施例3中的试剂盒对5个阳性样本(样本1-5，阳性样本中PD-L1的浓度高于0.15ng/mL)和1个阴性样本(样本6，阴性样本中PD-L1的浓度低于0.04ng/mL)中的PD-L1含量进行检测，检测过程中使用的仪器为全自动化学发光免疫自动仪，各样本检测的RLU值如表7所示。根据各样本的RLU值以及实施例4绘制的图2所示的标准曲线对各样本中PD-L1的拟合浓度进行检测，结果如表7所示。
从表7可知，采用本申请实施例3的试剂盒对上述6例样本进行检测的结果符合预期。说明实施例3的试剂盒的检测准确性高，能准确对样本中的PD-L1进行检测。
表7
| RLU值 | 拟合浓度(ng/mL) | |
| 样本1 | 3944037 | 33.40 |
| 样本2 | 748174 | 6.27 |
| 样本3 | 129166 | 1.02 |
| 样本4 | 65015 | 0.47 |
| 样本5 | 31275 | 0.18 |
| 样本6 | 12430 | 0.02 |
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述PD-L1单克隆抗体或其抗原结合片段为A1或A2，且包含重链可变区和轻链可变区；
所述A1的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3；
所述A1的重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；
所述A1的重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示；
所述A1的重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示；
所述A1的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3；
所述A1的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示；
所述A1的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；
所述A1的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示；
所述A2的重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3；
所述A2的重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；
所述A2的重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示
所述A2的重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示；
所述A2的轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3；
所述A2的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示；
所述A2的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示；
所述A2的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
所述A1的重链可变区的氨基酸序列包含：
a131)如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；或
a132)将SEQ ID NO：6经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ IDNO：6所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a133)与SEQ ID NO：6具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：6所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A1的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a141)如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；或
a142)将SEQ ID NO：12经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID NO：12所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a143)与SEQ ID NO：12具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：12所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A2的重链可变区的氨基酸序列包含：
a151)如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；或
a152)将SEQ ID NO：18经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID NO：18所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a153)与SEQ ID NO：18具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：18所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述A2的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a161)如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列；或
a162)将SEQ ID NO：24经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID NO：24所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a163)与SEQ ID NO：24具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：24所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、双特异性抗体和多特异性抗体中的至少一种。
4.一种与权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段相关的生物材料，所述生物材料包含b1)-b8)中至少一种：
b1)编码如权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子；
b2)包含b1)所述核酸分子的表达盒；
b3)包含b1)所述核酸分子的载体；
b4)包含b2)所述表达盒的载体；
b5)包含b1)所述核酸分子的转基因细胞系；
b6)包含b2)所述表达盒的转基因细胞系；
b7)包含b3)所述载体的转基因细胞系；
b8)包含b4)所述载体的转基因细胞系。
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：
所述编码如权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子包含编码如权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子和编码如权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子；其中，
编码所述A1的重链可变区的核酸分子的核苷酸序列包含：
a211)如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；或
a212)将SEQ ID NO：3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ IDNO：3所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
a213)与SEQ ID NO：3具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：3所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；
编码所述A1的轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列包含：
a221)如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；或
a222)将SEQ ID NO：9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ IDNO：9所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
a223)与SEQ ID NO：9具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：9所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；
编码所述A2的重链可变区的核酸分子的核苷酸序列包含：
a231)如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列；或
a232)将SEQ ID NO：15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID NO：15所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
a233)与SEQ ID NO：15具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：15所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；
编码所述A2的轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列包含：
a241)如SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列；或
a242)将SEQ ID NO：21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID NO：21所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
a243)与SEQ ID NO：21具有80％、85％或90％以上的同源性，且与SEQ ID NO：21所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列。
6.一种偶联物，其包含：如权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及偶联部分；所述偶联部分选自可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素和酶中的至少一种。
7.一种产品，所述产品包含e1)-e3)中至少一种：
e1)如权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
e2)如权利要求4或5中所述的生物材料；
e3)如权利要求6所述的偶联物；
所述产品选自药物、试剂、检测板、芯片、试纸和试剂盒的至少一种；
优选地，药物具有治疗和/或预防与PD-L1相关的疾病的功能；
优选地，所述试剂、检测板、试纸、芯片和试剂盒具有d1)-d3)中至少一种功能：
d1)检测PD-L1在样品中的存在或含量；
d2)对PD-L1相关的疾病的诊断或预后评估；
d3)药物筛选，所述药物用于预防和/或治疗PD-L1相关的疾病。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述试剂盒中包括包被抗体和检测抗体，所述包被抗体和所述检测抗体中的至少一种为如权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；且所述包被抗体和所述检测抗体分别针对PD-L1不同的抗原表位。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述包被抗体与固相载体结合；优选地，所述固相载体选自磁珠和微孔板中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述检测抗体标记有可检测标记物；
优选地，所述可检测标记物包含荧光或发光标记物。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的产品，其特征在于：所述包被抗体为A1，所述检测抗体为A2；或
所述包被抗体为A2，所述检测抗体为A1。
12.根据权利要求8-10中任一项所述的产品，其特征在于：所述试剂盒还包含包被缓冲液、洗涤液、封闭液、显色底物、终止液和PD-L1标准品溶液中的至少一种。
13.一种如权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法，其通过培养如权利要求4或5中所述的转基因细胞系得到。
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2022
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