CN110095612B

CN110095612B - 一种基于spr快速筛选单克隆抗体的方法

Info

Publication number: CN110095612B
Application number: CN201910294696.6A
Authority: CN
Inventors: 姜薇; 商涛; 李雪健; 赵帆
Original assignee: Hebei Renbo Technology Co ltd
Current assignee: Hebei Renbo Technology Co ltd
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2039-04-12
Also published as: CN110095612A

Abstract

本发明公开了一种基于SPR快速筛选单克隆抗体的方法及其所筛选的PD‑1单克隆抗体。本发明的单克隆抗体筛选方法，能够同时筛选上百种抗体，并同时比较抗体与抗原的亲和力，选出亲和力最大的抗体株，该方法解决了传统的ELISA检测方法存在的技术缺陷，使其满足快速高通量筛选高亲和力抗体的要求，并能减少抗体毒副作用、延长半衰期、降低免疫源性，对单克隆抗体作为药物进入临床治疗研究具有重要的现实意义。

Description

一种基于SPR快速筛选单克隆抗体的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于SPR快速筛选单克隆抗体的方法。

背景技术

目前，单克隆抗体筛选过程中，通常使用酶联免疫吸附法(Enzyme LinkedImmunosorbent Assay，ELISA)，费时费力，灵敏度低，难以满足大量抗体的快速筛选以及筛选特异性高、亲和力高的抗体。

表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术是一种分析生物分子间相互作用的生物传感分析技术，目前常用的是生物大分子相互作用分析系统(Biomolecular Interaction Assay，BIA)。表面等离子体共振是基于物理光学现象的一种分析技术。当偏振光以共振角入射照在金属和电介质的界面上时，发生全反射，入射光的一部分能量与表面等离子体波发生耦合，引起表面等离子体共振，产生光强急剧减少的反射光。利用光学SPR技术测定时，一般是将一种功能反应物(如配体)固定在传感芯片表面金属膜上，当加入待测样品(受体)并使其与传感芯片上的功能反应物相互作用时，引起体系的折射率变化，从而引起SPR光学信号的改变。通过分析传感图谱及分子相互作用的响应值获取分子相互作用的模式和动力学常数等方面的信息，并且获得的信息是能够定性和定量。

自1990年第一台商业化SPR检测仪问世以来，基于SPR原理的传感器及其应用研究有了快速发展。与传统的单克隆抗体筛选法-ELISA相比，它具有高灵敏度、响应快、体积小、机械强度大、检测过程快捷、能够获得实时数据、操作方便、无需标记、可保持分子的生物活性、既可定性也可定量、可再生重复利用、抗电磁干扰能力强和光纤相连可实现数据的远程采集和连续在线监控等突出优点。而SPR生物传感技术恰恰由于它的实时、连续分析，使之在生物分子反应的亲和力和动力学分析上具有极大的优越性。SPR传感技术现已被广泛应用于生命科学研究、药物筛选、食品分析、环境监测、农业生产等领域。SPR技术现在已广泛应用于生物、化学、免疫学研究及新药开发等领域。

目前筛选的抗体在机体易产生严重的特异性体液免疫反应，导致其被快速清除，静脉注射后血药浓度很快降低，限制了其治疗效果。现如今制备基因工程抗体，但对抗体的基因工程改造，不可避免的导致抗体与抗原结合能力的大幅度降低，且容易带来细胞毒性。

因此，研发出一种基于SPR生物传感技术应用于单克隆抗体筛选过程中，解决传统的ELISA检测方法存在的技术缺陷，使其满足快速高通量筛选高亲和力抗体的要求，并能减少抗体毒副作用、延长半衰期、降低免疫源性，对单克隆抗体作为药物进入临床治疗研究具有重要的现实意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的主要目的在于提供一种基于SPR快速筛选单克隆抗体的方法及其所筛选的鼠源PD-1单克隆抗体(即抗体21)。

本发明一个方面提供一种基于SPR快速筛选单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：

1)清洗镀金芯片表面；

2)清洗后的芯片用PEG2000溶液进行表面修饰，得到修饰后的芯片；

3)修饰后的芯片用pH4.75的0.01-1mg/mL单克隆抗体样本及阴性对照抗体蛋白的10mM醋酸钠缓冲液进行包被，得到包被后的芯片；

4)通过使目标抗原溶液流经所述包被后的芯片，从而目标抗原与所述芯片上的单克隆抗体发生免疫反应，进行SPR检测筛选得到高亲和力的目标单克隆抗体。

在本发明上述方面的一些实施方案中，步骤1)所述清洗的具体过程为：将镀金芯片在80℃的水：30％过氧化氢：25％氨水的比例为5:1:1的混合溶液中保温10min，再自然冷却10min；然后取出芯片，用去离子水和乙醇依次自上而下冲洗芯片三次，再用氮气吹干以除去镀金芯片在镀金膜过程中残留的杂质和溶剂；接着用等离子清洗机清洗，得到清洗后的芯片。

在本发明上述方面的一些实施方案中，步骤2)所述修饰的具体过程为：将清洗后的芯片置于1％10mM的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG2000)溶液中，常温过夜14h，然后取出芯片用乙醇自上而下淋洗，再用氮气吹干，得到修饰后的芯片。

在本发明上述方面的一些实施方案中，步骤3)所述包被的具体过程为：首先将修饰后的芯片进行抗体固定，即把70μl含50mM NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和200mM EDC(N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亚胺)的水溶液，滴加到所述修饰后的芯片上进行表面活化，然后再滴加0.01-1mg/mL(优选1mg/mL)单克隆抗体(如PD-1抗体)的醋酸钠缓冲液(10mM，pH4.75)，在阴性对照点滴加0.01-1mg/mL(优选1mg/mL)的阴性对照抗体蛋白(如市售的鼠源PD-1抗体)的醋酸钠缓冲液(10mM，pH4.75)，以此反应来联接配体；最后以70μl 1M乙醇胺溶液(pH 8.6)封闭残存的活性位点，得到包被后的芯片。

在本发明上述方面的一些实施方案中，步骤4)所述检测筛选的具体过程为：首先使用PBST溶液去除吸附在芯片上多余的抗体，然后将目标抗原(如人PD-1抗原)溶解于PBS中并制备为1μg/mL的溶液作为流动相上机检测，流过所述包被后的芯片表面时与标记抗体结合，25μl/min，免疫反应约5min后，通入PBST溶液进行洗脱，洗掉非特异性结合的蛋白；同时根据SPR仪检测的响应值绘制吸附平衡曲线，利用Bioevoluation软件计算该SPR芯片上标记的抗体对抗原的解离常数(K_D)，确定亲和力最高的单克隆抗体，从而筛选得到高亲和力的目标单克隆抗体。

本发明另一个方面还提供一种PD-1单克隆抗体，所述单克隆抗体的氨基酸序列包括轻链和重链；其中，

所述轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO:1(CMRDYNVSAESP，即Cys Met Arg Asp Tyr Asn Val Ser Ala Glu SerPro)、SEQ ID NO:2(SAYGIDTCVPA，即Ser Ala Tyr Gly Ile Asp Thr Cys Val Pro Ala)、SEQ ID NO:3(QPASTYDVQ，即Gln Pro Ala Ser Thr Tyr Asp Val Gln)所示；

所述重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:4(SFTICMASLCA，即Ser Phe Thr Ile Cys Met Ala Ser Leu Cys Ala)、SEQ ID NO:5(TGPSVYWLFNS，即Thr Gly Pro Ser Val Tyr Trp Leu Phe Asn Ser)、SEQ IDNO:6(YGSRMFVSTLCYP，即Tyr Gly Ser Arg Met Phe Val Ser Thr Leu Cys Tyr Pro)所示。

本发明又一个方面还提供上述PD-1单克隆抗体的编码基因，该编码基因含有编码如SEQ ID NOs:1-3所示的单克隆抗体轻链可变区中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列，以及编码如SEQ ID NOs:4-6所示的单克隆抗体重链可变区中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列。

本发明一个方面还提供含有上述PD-1单克隆抗体的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

本发明另一个方面还提供上述PD-1单克隆抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明又一个方面还提供一种抗肿瘤制剂，其包含上述PD-1单克隆抗体。

有益效果

本发明提供了一种基于SPR快速筛选单克隆抗体的方法及其所筛选的鼠源PD-1单克隆抗体。本发明的单克隆抗体筛选方法，能够同时筛选上百种抗体，并同时比较抗体与抗原的亲和力，选出亲和力最大的抗体株，该方法解决了传统的ELISA检测方法存在的技术缺陷，使其满足快速高通量筛选高亲和力抗体的要求，并能减少抗体毒副作用、延长半衰期、降低免疫源性，对单克隆抗体作为药物进入临床治疗研究具有重要的现实意义。

附图说明

图1所示为本发明实施例2中制备的PD-1抗体芯片上不同抗体与抗原结合后的状况，图中每个斑点代表一个PD-1抗体点。

图2所示为实施例2中抗体芯片上对照抗体(来自Abcam公司的鼠源PD-1单克隆抗体；货号：ab140950)以及来自不同克隆的众多PD-1抗体点与PD-1抗原的结合曲线，其中横坐标为抗体和抗原结合的反应时间即Time(s)，纵坐标为抗体芯片上不同抗体对应的SPR检测信号强度(反映为折射率的变化)，即Signal(a.u.)。

图3所示为实施例2中上述对照抗体以及亲和力较高的代表性抗体(分别为抗体21、抗体28、抗体16、抗体83和抗体41)与PD-1抗原的结合曲线，其中抗体21的亲和力最高，对照抗体亲和力最低，其中横坐标为抗体和抗原结合的反应时间即Time(s)，纵坐标为抗体芯片上不同抗体对应的SPR检测信号强度，即Signal(a.u.)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

在本发明的上下文中，术语“高亲和力”是指抗体和抗原的解离常数低于1*10e^-11值

PD-1(Programmed Death 1,程序性死亡受体1)是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员；以PD-1为靶点的免疫调节在抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等方面均有重要的意义。其配体PD-L1(Programmed Cell Death-Ligand 1,程序性死亡受体-配体1)和PD-L2(程序性死亡受体-配体2)也可作为靶点，相应的抗体也可以起到相同的作用。正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促进具有抗原特异性的T细胞增生。当PD-1与PD-L1或PD-L2结合时，可以传导抑制性的信号，降低T细胞的增生、细胞因子的分泌和功能。基于这种原理，通过制备PD-1免疫抑制剂，以使得PD-1抑制剂和T细胞表面的PD-1相结合，从而阻断PD-L1和癌细胞表面的PD-L1或PD-L1相结合。这样，癌细胞就不能向T细胞传递信号，T细胞会正常识别癌细胞，并消灭它。特异性结合PD-1的PD-1单克隆抗体就是属于这种PD-1免疫抑制剂，可以用来制备肿瘤免疫治疗药物。

以下实施例以筛选鼠源PD-1单克隆抗体为例来说明本发明的筛选方法。

实施例

实施例1构建鼠源抗人PD-1单克隆抗体杂交瘤细胞株

1.1免疫抗原的制备

将编码人PD-1(NCBI参考序列：NP_005009.2和NM_005018.2)片段的氨基酸序列(VVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPS，该段序列结构较为特殊，且更易产生抗体)的核苷酸序列插入原核表达载体pET28a的NdeI/XhoI位点，成功构建重组表达质粒pET28a-PD-1，经转化大肠杆菌TOP10感染态细菌，用卡那抗性进行筛选，鉴定出阳性克隆。具体地，将重组质粒分别转化大肠杆菌，涂布于卡那抗性的平板，37℃倒置培养过夜，挑取单克隆于LB培养基，37℃震荡培养至OD 0.6～0.8，加入终浓度1mM IPTG，诱导PD-1蛋白表达，并进行纯化以用作PD-1抗原序列。

1.2动物免疫

用以上述原核表达的PD-1抗原序列，免疫5周龄的雌性健康Balb/c小鼠；首次免疫的剂量为100μg/只，具体地，将100μg抗原与等体积的福氏完全佐剂混合，经腹腔注射；3周后，用等量抗原与不完全佐剂混合，经腹腔免疫；5周后，不加佐剂进行第3次免疫。经3次免疫后，于7d采血并测血清中抗体的效价，选择血清呈阳性的Balb/c小鼠用于进行细胞融合，具体地，在融合前3d用不加佐剂的抗原，经腹腔进行加强免疫注射，注射剂量为50μg/只。

1.3收集B淋巴细胞

进行加强免疫后3-5d，将小鼠摘眼球取血，然后处死；离心后获得血清，通过ELISA检测有无特异性抗体产生；无菌状态下取小鼠脾脏，置灭菌平皿中，分离脾细胞，计数后备用。

1.4小鼠骨髓瘤细胞的制备

融合前一周，复苏小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0至OPTI-MEM培养基(含10％的胎牛血清)，置于37℃、5％CO₂培养箱中扩大培养；融合前2-3d，细胞应处于对数生长期。融合前，将对数生长期小鼠骨髓瘤细胞收集到离心管中，计数并取5.0×10⁷骨髓瘤细胞，离心，弃上清，用无血清培养基洗涤2次后备用。

1.5细胞融合

融合前将50％PEG置37℃、5％CO₂细胞培养箱中调整温度，将等同于小鼠1/2脾脏的脾细胞与骨髓瘤细胞混合，移至一个50mL离心管中，补加30mL不完全培养基，在转速1200rpm的条件下离心10min，弃去上清液，轻轻弹击管底，使细胞团松散，一边均匀地转动离心管，一边加入1mL预温的PEG融合剂，边加边转动离心管，从加入到加完的时间控制在2min，然后在10min内加入20ml的无血清培养基，边加边摇匀。把经PEG融合的细胞在1000rpm离心4min，除去上清液后，加150ml的HAT选择培养基重悬，将融合细胞接种至无菌96孔板150μl/孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养4d，每孔补加100μl选择培养基。

1.6杂交瘤细胞的筛选和克隆

将经上述操作后的所有细胞在HAT培养基中培养，未融合的骨髓瘤细胞和未融合的淋巴细胞逐渐死亡；融合的PD-1单克隆抗体杂交瘤细胞能在HAT培养基中存活和增殖。

实施例2基于SPR技术筛选单克隆抗体

培养获自实施例1中所述的PD-1单克隆抗体杂交瘤细胞株，吸取杂交瘤细胞培养物的上清，制备抗体芯片(芯片表面用PEG2000修饰后，芯片上的PEG可通过其-COOH与抗体蛋白的-NH₂结合)；将对应目标抗原(人PD-1抗原序列，VVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPS)溶解于PBS中并制备为1μg/mL的溶液作为流动相；根据结合曲线拟合，计算抗体与抗原的解离常数KD，筛选出与抗原结合时亲和力最高的抗体。

1.抗体芯片的制备

(1)用PEG2000修饰芯片表面的步骤：

清洗芯片表面：将镀金芯片(购自日本HORIBA公司)在80℃的水：30％过氧化氢：25％氨水的比例为5:1:1的混合溶液中保温10min，再自然冷却10min；然后取出芯片，用去离子水和乙醇依次自上而下冲洗芯片三次，再用氮气吹干以除去镀金芯片在镀金膜过程中残留的杂质和溶剂；接着用等离子清洗机清洗，得到清洗后的芯片。

用PEG2000修饰：将经清洗后的芯片置于1％10mM的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG2000)溶液中，常温过夜14h，然后取出芯片用乙醇自上而下淋洗，再用氮气吹干，得到修饰后的芯片。

(2)单克隆抗体及阴性对照抗体蛋白包被

在上述PEG2000修饰的芯片上进行抗体固定：把70μl含50mM NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和200mM EDC(N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亚胺)的水溶液，滴加到PEG2000修饰的镀金芯片上进行表面活化，然后再滴加0.01-1mg/mL(优选1mg/mL)PD-1单克隆抗体的醋酸钠缓冲液(10mM，pH4.75)，在阴性对照点滴加0.01-1mg/mL(优选1mg/mL)阴性对照抗体蛋白(来自Abcam公司的鼠源PD-1单克隆抗体，货号：ab140950)的醋酸钠缓冲液(10mM，pH4.75)，以此反应来联接配体；最后以70μl 1M乙醇胺溶液(pH 8.6)封闭残存的活性位点，得到包被后的芯片。

2.样本检测过程

使用PBST溶液去除吸附在芯片上多余的抗体后，将PD-1抗原制备为1μg/mL的溶液作为流动相上机检测，流过所述包被后的芯片表面时与标记抗体结合，25μl/min，免疫反应约5min后，通入PBST溶液进行洗脱，洗掉非特异性结合的蛋白；图1显示了所述PD-1抗体芯片上不同抗体与抗原结合后的状况，图中每个斑点代表一个PD-1抗体点。同时根据SPR仪检测的响应值绘制吸附平衡曲线，利用Bioevoluation软件计算该SPR芯片上标记的抗体对抗原的解离常数(K_D)，确定亲和力最高的单克隆抗体，从而筛选得到高亲和力的目标单克隆抗体(即抗体21)。图2所示为所述抗体芯片上对照抗体(来自Abcam公司的鼠源PD-1单克隆抗体；货号：ab140950)以及来自不同克隆的众多PD-1抗体点与PD-1抗原的结合曲线，其中横坐标为免疫反应时间即Time(s)，纵坐标为抗体芯片上不同抗体对应的SPR检测信号强度(反映为折射率的变化)，即Signal(a.u.)；图3所示为上述对照抗体以及亲和力较高的代表性抗体(分别为抗体21、抗体28、抗体16、抗体83和抗体41)与所述PD-1抗原的结合曲线，其中抗体21的亲和力最高，对照抗体亲和力最低，横坐标为免疫反应时间即Time(s)，纵坐标为抗体芯片上不同抗体对应的SPR检测信号强度，即Signal(a.u.)。

筛选后获得的亲和力最高的所述PD-1单克隆抗体(即抗体21)，其与PD-1的解离常数是2.53*10e^-12(抗体和抗原的解离常数低于1*10e^-11值则具有高亲和力)，说明抗体和抗原表位的识别具有很高的亲和力，高于市面上销售的抗体(上述对照抗体)。

针对筛选到的目标单克隆抗体(即抗体21)，进行可变区氨基酸序列和互补决定区氨基酸序列的测序分析。所述鼠源PD-1单克隆抗体包括轻链和重链；其中所述轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO:1(CMRDYNVSAESP，即Cys Met Arg Asp Tyr Asn Val Ser Ala Glu Ser Pro)、SEQ ID NO:2(SAYGIDTCVPA，即Ser Ala Tyr Gly Ile Asp Thr Cys Val Pro Ala)、SEQ ID NO:3(QPASTYDVQ，即Gln Pro Ala Ser Thr Tyr Asp Val Gln)所示；重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:4(SFTICMASLCA，即SerPhe Thr Ile Cys Met Ala Ser Leu Cys Ala)、SEQ ID NO:5(TGPSVYWLFNS，即Thr GlyPro Ser Val Tyr Trp Leu Phe Asn Ser)、SEQ ID NO:6(YGSRMFVSTLCYP，即Tyr Gly SerArg Met Phe Val Ser Thr Leu Cys Tyr Pro)所示。

本文所述鼠源PD-1单克隆抗体(即抗体21)的轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，以及重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可用于产生任何抗体同类型的抗体基因片段或全长抗体基因。本发明的PD-1单克隆抗体可通过基因重组技术在原核或真核细胞中表达。所述PD-1单克隆抗体可用于制备抗肿瘤药物。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 河北仁博科技有限公司

<120> 一种基于SPR快速筛选单克隆抗体的方法

<130> P190105

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Cys Met Arg Asp Tyr Asn Val Ser Ala Glu Ser Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Ser Ala Tyr Gly Ile Asp Thr Cys Val Pro Ala

1 5 10

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Gln Pro Ala Ser Thr Tyr Asp Val Gln

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Ser Phe Thr Ile Cys Met Ala Ser Leu Cys Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Thr Gly Pro Ser Val Tyr Trp Leu Phe Asn Ser

1 5 10

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Tyr Gly Ser Arg Met Phe Val Ser Thr Leu Cys Tyr Pro

1 5 10

Claims

1.一种PD-1单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的氨基酸序列包括轻链和重链；其中，

所述轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；

所述重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。

2.权利要求1所述的PD-1单克隆抗体的编码基因，其特征在于，该编码基因含有编码如SEQ ID NOs:1-3所示的所述单克隆抗体轻链可变区中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列，以及编码如SEQ ID NOs:4-6所示的所述单克隆抗体重链可变区中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

4.权利要求1所述的PD-1单克隆抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.一种抗肿瘤制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的PD-1单克隆抗体。