CN117412991A - 抗人msln人源化抗体及其应用 - Google Patents

抗人msln人源化抗体及其应用 Download PDF

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CN117412991A CN202280037440.7A CN202280037440A CN117412991A CN 117412991 A CN117412991 A CN 117412991A CN 202280037440 A CN202280037440 A CN 202280037440A CN 117412991 A CN117412991 A CN 117412991A
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Abstract

本公开涉及抗人MSLN人源化抗体及其应用。具体而言，本公开涉及抗人MSLN人源化抗体，编码其的核酸，抗体制备方法，含有所述抗体的药物组合物，以及药物组合物用于治疗肿瘤的相关用途。

Description

抗人MSLN人源化抗体及其应用
本公开要求于2021年6月18日提交中国专利局、申请号为202110681168.3、发明名称为“抗人MSLN人源化抗体及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本公开中。
技术领域
本公开涉及抗体领域，具体涉及抗人MSLN人源化抗体及其应用。
背景技术
间皮素(Mesothelin，MSLN)是一种存在于正常间皮细胞上的分化抗原，可表达于正常胸膜、心包和腹膜的间皮细胞中。在正常组织中表达有限，但MSLN被发现表达在90％的上皮样恶性胸膜间皮瘤细胞、69％的肺腺癌细胞、60％的乳腺癌细胞、46％的食管癌细胞、胰腺肿瘤细胞和卵巢癌细胞。因此MSLN有可能成为癌症治疗的重要靶点。
MSLN基因位于染色体16p13.3，其基因全长8kb，cDNA大小为2138bp，含有1884bp的开放阅读框，17个外显子，编码628个氨基酸。MSLN基因编码一个71kDa的前体蛋白。MSLN前体蛋白由糖磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜上，可被弗林蛋白酶(furin)水解为两个部分：分子量为31kDa的N端可溶性蛋白，被称为巨核细胞增强因子(megakaryocyte-potentiating factor，MPF)和分子量为40kDa的细胞表面糖蛋白，即为成熟的MSLN(Chang K等，Proc Natl Acad Sci U S A.1996；93(1):136-140；Manzanares 等，Hepatol Commun.2017；2(2):155-172)。
间皮素的生物学功能尚未完全阐明。研究人员曾对敲除MSLN基因的小鼠进行研究，发现小鼠在发育、繁殖和血细胞计数方面均未表现出异常，表明其不影响小鼠正常的生长发育。(Bera TK等，Mol Cell Biol.2000；20(8):2902-2906)。
MSLN的异常表达在肿瘤细胞的增殖分化、黏附及耐药性方面起着重要作用。MSLN的过表达可激活NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)，MAPK(mitogen-activated protein kinase)和PI3K(Phosphoinositide 3-kinases)多条信号通路，从而诱导细胞凋亡或者通过诱导MMP7(matrix metalloproteinase 7，基质金属蛋白酶-7)和MMP9(matrix metalloproteinase 9，基质金属蛋白酶-9)的激活和表达促进细胞增殖，迁移和转移。研究表明MSLN通过同时激活PI3K/AKT(Protein Kinase B，PKB)和MAPK/ERK(extracellular regulated protein kinases)信号通路可以阻断紫杉醇诱导的肿瘤细胞凋亡，增加癌细胞对药物的耐受性(Bharadwaj U等，Mol Cancer.2011；10:106；Cheng WF等，Br J Cancer.2009；100(7):1144-1153)。
靶向MSLN的药物研发方向包含免疫毒素、疫苗、嵌合单克隆抗体、ADC和CAR-T。抗体类药物主要通过抗体中和、抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖细胞介导的吞噬作用(ADCP)、抗体与效应分子(毒素或抑制剂)结合等方式来介导肿瘤细胞凋亡或抑制肿瘤细胞增殖，靶向杀伤肿瘤细胞。
传统的单克隆抗体分子量大，组织渗透性差，治疗效果有限；鼠源单克隆抗体具有很高的免疫原性，而改造后的嵌合抗体和人源化抗体的亲和力成熟更具挑战性；全人源单克隆抗体的制备成本高、开发周期长、产出低等因素也限制了研发和推广。
1993年比利时科学家首次发现在骆驼血液中有一类缺失轻链的重链抗体，该类抗体只包含一个重链可变区和两个常规的CH2和CH3区，但其具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，克隆其可变区可以得到只由重链可变区组成的单域抗体，也称为VHH(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)或纳米抗体(nanobody)。单域抗体的分子量只有普通抗体的1/10，是最小的功能性抗原结合片段，在药物开发中具有重要意义。因此，本领域迫切需要开发新的有效针对MSLN的特异性单域抗体及其人源化抗体。
发明内容
本公开提供抗人MSLN人源化抗体，编码其的核酸，抗体制备方法，含有所述抗体的药物组合物，以及药物组合物用于治疗肿瘤的相关用途。
在第一个方面，本公开提供一种特异性结合人MSLN的人源化抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区包括互补决定区CDR1-3和框架区FR1-4：
(1)所述CDR1-3分别具有如SEQ ID NO：3-5所示的序列，所述FR1-3具有衍生自人种系IGHV3-11*05的FR1-3，所述FR4具有衍生自IGHJ3*01的FR4；或
(2)所述CDR1-3分别具有如SEQ ID NO：6-8所示的序列，所述FR1-3具有衍生自IGHV3-30*01的FR1-3，所述FR4具有衍生自IGHJ3*01的FR4。
在一些具体的实施方式中，所述重链可变区包括选自(1)或(2)所示序列：
(1)与SEQ ID NO：12-16任一项所示序列相比，具有至多90％同一性的序列，优选为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；或
(2)与SEQ ID NO：17-26任一项所示序列相比，具有至多90％同一性的序列，优选为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
进一步的，在一些具体的实施方式中，所述重链可变区具有以下特性，其中氨基酸的位置编号由IMGT规则确定：
(1)第1位为E或Q；和/或，
(2)第40位为S或G；和/或，
(3)第42位为I或Y；和/或，
(4)第49位为G或E；和/或，
(5)第50位为L或R；和/或，
(6)第52位为W或L；和/或，
(7)第54位为A或T；和/或，
(8)第55位为Y或T；和/或，
(9)第87位为L或V；
优选地，所述重链可变区具有以下特性，其中，氨基酸的位置编号由IMGT规则确定：
(1)第40位为G，第42位为Y，第52位为L、第54位为A和第55位为T；或，
(2)第40位为G，第42位为Y，第49位为E，第50位为R，第52位为L，第54位为A和第55位为T；或，
(3)第1位为Q，第40位为G，第42位为Y，第49位为E，第50位为R，第52位为L，第54位为A和第55位为T；或，
(4)第40位为G，第42位为Y，第49位为E，第50位为R，第52位为L，第54位为A，第55位为T和第87位为V。
进一步的，在一些具体的实施方式中，所述重链可变区具有以下特性，其中氨基酸位置编号由IMGT规则确定：
(1)第39位为M或V；和/或，
(2)第40位为H或A；和/或，
(3)第42位为V或Y；和/或，
(4)第49位为G或E；和/或，
(5)第50位为L或R；和/或，
(6)第52位为W或A；和/或，
(7)第66位为Y或K；和/或，
(8)第81位为D或Y；和/或，
(9)第83位为S或A；和/或，
(10)第86位为T或I；和/或，
(11)第87位为L或A；和/或，
(12)第95位为R或K；和/或，
(13)第96位为A或P；
优选地，所述重链可变区具有以下特性，其中氨基酸位置编号由IMGT规则确定：
(1)第40位为A，第42位为Y和第52位为A；或，
(2)第40位为A，第42位为Y，第49位为E，第50位为R和第52位为A；或，
(3)第39位为V，第40位为A，第42位为Y，第49位为E，第50位为R和第52位为A；或，
(4)第39位为V，第40位为A，第42位为Y，第49位为E，第50位为R，第52位为A和第66位为K；或，
(5)第39位为V，第40位为A，第42位为Y，第49位为E，第50位为R，第52位为A和第87位为A；或，
(6)第39位为V，第40位为A，第42位为Y，第49位为E，第50位为R，第52位为A和第83位为A；或，
(7)第39位为V，第40位为A，第42位为Y，第49位为E，第50位为R，第52位 为A，第66位为K，第83位为A和第87位为A；或，
(8)第39位为V，第40位为A，第42位为Y，第50位为R，第49位为E，第52位为A，第81位为Y，第83位为A和第86位为I；或，
(9)第39位为V，第40位为A，第42位为Y，第49位为E，第50位为R，第52位为A，第95位为K和第96位为P。
进一步的，在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段与人MSLN结合的平衡解离常数KD小于1E-7M、1E-8M、1E-9M、1E-10M、1E-11M或1E-12M。
在一些具体的实施方式中，所述抗体或抗原结合片段还结合猴MSLN，优选地，所述抗体或抗原结合片段与猴MSLN结合的平衡解离常数KD小于1E-7M、1E-8M、1E-9M、1E-10M、1E-11M或1E-12M。
进一步的，在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包含或不包含抗体重链恒定区；可选的，所述抗体重链恒定区可选自人、羊驼、小鼠、大鼠、兔或羊；可选地，所述抗体重链恒定区可选自IgG、IgM、IgA、IgE或IgD，所述IgG可选自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4；可选地，所述重链恒定区可选自Fc区、CH3区、不存在CH1片段的重链恒定区或完整重链恒定区；优选地，所述重链恒定区为人Fc区；优选地，所述抗体或抗原结合片段为重链抗体。
进一步的，在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、细胞毒性剂或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂；更优选地，所述细胞毒性剂选自生物碱类(alkaloids)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蒽环类抗生素(doxorubicin)、紫杉烷类(taxanes)或毒素化合物。
进一步的，在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段还连接有另一功能性分子，所述功能性分子可选自以下一种或多种：信号肽、蛋白标签或细胞因子；优选地，所述细胞因子可选自IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-21、IFN或TNF-alpha。
在第二个方面，本公开提供一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包含第一方面所述的抗体或抗原结合片段；优选地，所述多特异性抗体进一步包含特异性结合MSLN以外的抗原或结合与第一方面所述抗体或抗原结合片段不同的MSLN表位的抗体或抗原结合片段。
在一些实施例中，优选地，所述MSLN以外的抗原可选自：CD3，优选CD3ε；CD16，优选CD16A；CD32B；PD-1；PD-2；PD-L1；VEGF；NKG2D；CD19；CD20；CD40；CD47；4-1BB；CD137；EGFR；EGFRvIII；TNF-alpha；CD33；HER2；HER3；HSA；CD5；CD27；EphA2；EpCAM；MUC1；MUC16；CEA；Claudin18.2；叶酸受体；Claudin6；WT1；NY-ESO-1；MAGE3；ASGPR1或CDH16。
在一些实施例中，优选地，所述多特异性抗体可为双特异性、三特异性或四特异性，所述多特异性抗体可为二价、四价或六价。
在第三个方面，本公开提供一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含任选自第一方面所述抗体或抗原结合片段。
在第四个方面，本公开提供一种免疫效应细胞，所述免疫效应细胞表达第三方面所述的 嵌合抗原受体，或包含编码第三方面所述嵌合抗原受体的核酸片段；优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、DNT细胞(double negative T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞，所述T细胞优选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞；优选地，所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞。
在第五个方面，本公开提供能够编码上述第一方面抗体或抗原结合片段，第二方面所述多特异性抗体，或第三方面所述的嵌合抗原受体的分离的核酸片段。
在第六个方面，本公开提供包含第五方面所述分离的核酸片段的载体。
在第七个方面，本公开提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述第六方面所述的载体；优选地，所述细胞为原核细胞或真核细胞，例如细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293T细胞系)。
在第八个方面，本公开还提供一种抗体或抗原结合片段、或多特异性抗体的制备方法，所述方法包括培养上述第七方面所述细胞，以及在适合的条件下分离所述细胞表达的抗体或抗原结合片段，或分离所述细胞表达的多特异性抗体。
在第九个方面，本公开还提供一种制备免疫效应细胞的方法，所述方法包括将编码第三方面所述CAR的核酸片段导入所述免疫效应细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达第三方面所述CAR。
在第十个方面，本公开还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段，或任选自第二方面所述的多特异性抗体，或第四方面所述免疫效应细胞，或第五方面所述的核酸片段，或第六方面所述载体；或第八和第九方面所述方法制备获得的产品；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；可选地，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
在第十一个方面，本公开提供一种任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段，或任选自第二方面所述的多特异性抗体，或第四方面所述免疫效应细胞，或第五方面所述的核酸片段，或第六方面所述载体；或第八和第九方面所述方法制备获得的产品；或第十方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途；所述肿瘤优选间皮瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌或胸膜癌；更优选上皮样恶性胸膜间皮瘤、肺腺癌。
在第十二个方面，本公开还提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，包含向有此需要的患者施用有效量的任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段，或任选自第二方面所述的多特异性抗体，或第四方面所述免疫效应细胞，或第五方面所述的核酸片段，或第六方面所述载体；或第八和第九方面所述方法制备获得的产品；或第十方面所述的药物组合物。所述肿瘤优选间皮瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌或胸膜癌；更优选上皮样恶性胸膜间皮瘤、肺腺癌。
在第十三个方面，本公开还提供第一方面所述的抗体或抗原结合片段，或第二方面所述的多特异性抗体，或第四方面所述免疫效应细胞，或第五方面所述的核酸片段，或第六方面所述载体，或第八或第九方面所述方法制备获得的产品，或第十方面所述药物组合物，用于预防和/或治疗肿瘤；所述肿瘤优选间皮瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌或胸膜 癌；更优选上皮样恶性胸膜间皮瘤、肺腺癌。
在第十四个方面，本公开提供一种试剂盒，其包含任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段，或任选自第二方面所述的多特异性抗体，或第四方面所述免疫效应细胞，或第五方面所述的核酸片段，或第六方面所述载体；或第八和第九方面所述方法制备获得的产品。
在第十五个方面，本公开提供一种体外抑制表达MSLN细胞增殖或迁移的方法，在任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段与MSLN之间能够形成复合物的条件下，使所述细胞与任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段接触。
在第十六个方面，本公开提供一种检测MSLN表达的方法，在任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段与MSLN之间能够形成复合物的条件下，使所述细胞与任选自第一方面所述的抗体或抗原结合片段接触。
术语定义和说明
除非本公开另外定义，与本公开相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。
此外，除非本文另有说明，本文单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非另外明确指出，否则单数形式“一种”和“这种”包括复数指示物。
如本文所用，术语“包括”、“包含”和“具有”之间可互换使用，旨在表示方案的包含性，意味着所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同时应当理解，在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述，也提供“由……组成”方案。
术语“和/或”在本文使用时，包括“和”、“或”和“由所属术语链接的要素的全部或任何其他组合”的含义。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必然发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着抗体重链可变区可以但不必须存在；存在时，可以是1个，2个或3个。
如本文所用，术语“MSLN”是指间皮素(Mesothelin，MSLN)，是一种存在于正常间皮细胞上的分化抗原，可表达于正常胸膜、心包和腹膜的间皮细胞中。在正常组织中表达有限，但MSLN被发现高表达在上皮样恶性胸膜间皮瘤、肺腺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺肿瘤和卵巢癌等细胞上。术语“MSLN”包括任何人类和非人类动物物种的MSLN蛋白，并且具体地包括人类MSLN以及非人类哺乳动物的MSLN。
如本文所用，术语“特异性结合”是指抗原结合分子(例如抗体)通常以高亲和力特异性结合抗原和实质上相同的抗原，但不以高亲和力结合不相关抗原。亲和力通常以平衡解离常数(equilibrium dissociation constant，KD)来反映，其中较低KD表示较高亲和力。以抗体为例，高亲和力通常指具有约10 -7M或更低、约10 -8M或更低、约1×10 -9M或更低、约1×10 -10M或更低、1×10 -11M或更低或1×10 -12M或更低的KD。KD计算方式如下：KD＝Kd/Ka，其中Kd表示解离速率，Ka表示结合速率。可采用本领域周知的方法测量平衡解离常数KD，如表面等离子共振(例如Biacore)或平衡透析法测定。
如本文所用，术语“抗体”(Ab)是指与目标抗原特异性结合或具有免疫反应性的免疫球蛋白分子，包括抗体的多克隆、单克隆、基因工程化和其他修饰形式(包括但不限于嵌合抗体，人源化抗体，全人源抗体，异源偶联抗体(例如双特异性、三特异性和四特异性抗体，双抗体，三抗体和四抗体)，抗体缀合物)以及抗体的抗原结合片段(包括例如Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、rIgG和scFv片段)。
由于免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将本文“免疫球蛋白”分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA可分为IgA1和IgA2。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
本文“抗体”还包括不包含轻链的抗体，例如，由单峰驼(Camelus dromedarius)、双峰驼(Camelus bactrianus)、大羊驼(Lama glama)、原驼(Lama guanicoe)和羊驼(Vicugna pacos)等产生的重链抗体(heavy-chain antibodies,HCAbs)以及在鲨等软骨鱼纲中发现的免疫球蛋白新抗原受体(Ig new antigen receptor,IgNAR)。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指保留特异性结合靶抗原的能力的一个或更多个抗体片段。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。抗体片段可以是Fab、F(ab’) 2、scFv、SMIP、双抗体、三抗体、亲和体(affibody)、纳米抗体、适体或结构域抗体。涵盖术语抗体的“抗原结合片段”的结合片段的实例包括但不限于：(i)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(ii)由VH结构域组成的dAb片段或VHH；(iii)分离的互补决定区(CDR)；(iv)由VHH和CH2、CH3组成的重链抗体片段；以及(v)两个或更多个分离的CDR的组合，所述CDR可以任选地由合成接头连接。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且这些片段被筛选用于与完整抗体相同的方式使用。可以通过重组DNA技术、完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解、或在一些实施方式中通过本领域已知的化学肽合成程序来产生抗原结合片段。
如本文所用，术语“重链抗体”是指缺乏常规抗体的轻链的抗体。该术语具体包括但不限于在不存在CH1结构域的情况下包含VH抗原结合结构域以及CH2和CH3恒定结构域的同型二聚体抗体。
如本文所用，术语“纳米抗体”是指骆驼体内存在天然的缺失轻链的重链抗体，克隆其可变区可以得到只有重链可变区组成的单域抗体，也称为VHH(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)，它是最小的功能性抗原结合片段。
如本文所用，术语“VHH结构域”和“纳米抗体(nanobody)”、“单域抗体”(single domain antibody,sdAb)具有相同的含义并可互换使用，是指克隆重链抗体的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的重链抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。
关于“重链抗体”和“单域抗体”、“VHH结构域”和“纳米抗体”的进一步描述可参见： Hamers-Casterman等，Nature.1993；363；446-8；Muyldermans的综述文章(Reviews inMolecular Biotechnology 74：277-302，2001)；以及以下专利申请，其被作为一般背景技术提及：WO 94/04678，WO 95/04079和WO 96/34103；WO94/25591，WO 99/37681，WO 00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP 1134231和WO 02/48193；WO97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO 03/054016和WO 03/055527；WO 03/050531；WO 01/90190；WO03/025020；以及WO 04/041867，WO 04/041862，WO 04/041865，WO 04/041863，WO 04/062551，WO 05/044858，WO 06/40153，WO 06/079372，WO 06/122786，WO 06/122787和WO 06/122825以及这些申请中提到的其他现有技术。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指来源于单个克隆(包括任何真核、原核、或噬菌体克隆)的抗体，而不限于该抗体的产生方法。
如本文所用，术语“多特异性”是指具有至少两个抗原结合位点，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。因此，诸如“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等术语是指抗体/抗原结合分子可以结合的不同靶点或表位的数目。
如本文所用，术语“价”表示抗体/抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。因此,术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗体/抗原结合分子中一个结合位点、两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点的存在。
本文“抗体”可以来源于任何动物，包括但不限于人和非人动物，所述非人动物可选自灵长类动物、哺乳动物、啮齿动物和脊椎动物，例如骆驼科动物、大羊驼、原驼、羊驼、羊、兔、小鼠、大鼠或软骨鱼纲(例如鲨)。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指以下抗体，其具有源自一种来源生物(如大鼠、小鼠、兔或羊驼)的免疫球蛋白的可变序列以及源自不同生物体(例如人)的免疫球蛋白的恒定区。用于生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison,1985,Science 229(4719):1202-7；Oi等人，1986,Bio Techniques 4:214-221；Gillies等人，1985 J Immunol Methods 125:191-202；以上通过援引加入并入本文。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留或部分保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。
如本文所用，术语“全人抗体”是指具有其中FR和CDR二者都源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本文全人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文“全人抗体”不包括其中来源于另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。
如本文所用，术语“可变区”是指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的区域，“重链可变区”与“VH”、“HCVR”可互换使用，“轻链可变区”与“VL”、“LCVR”可互换使用。天然抗体 的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。单个VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。如本文所用，术语“互补决定区”与“CDR”可互换使用，通常指重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的高变区(HVR)，该部位因在空间结构上可与抗原表位形成精密的互补，故又称为互补决定区，其中，重链可变区CDR可缩写为HCDR，轻链可变区CDR可缩写为LCDR。本术语“构架区”或“FR区”可互换，是指抗体重链可变区或轻链可变区中除CDR以外的那些氨基酸残基。通常典型的抗体可变区由4个FR区和3个CDR区按以下顺序组成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(参见Kabat等人，Sequences of Protein sofImmunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,Md.1987；其通过援引加入并入本文)。例如在本文中，CDR1-VH、CDR2-VH和CDR3-VH分别是指重链可变区(VH)的第一个CDR、第二个CDR和第三个CDR，这三个CDR构成了重链(或其可变区)的CDR组合(VHCDR组合)；CDR1-VL、CDR2-VL和CDR3-VL分别是指轻链可变区(VL)的第一个CDR、第二个CDR和第三个CDR，这三个CDR构成了轻链(或其可变区)的CDR组合(VLCDR组合)。
如本文所用，术语“IMGT编号系统”通常是指基于由Lefranc等人发起的国际免疫遗传学信息系统(The international ImMunoGeneTics information system(IMGT))的编号系统，可参阅Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003。
如本文所用，术语“重链恒定区”是指抗体重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用，其相对于抗体的可变结构域具有更保守的氨基酸序列。“重链恒定区”至少包含：CH1结构域，铰链区，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。“重链恒定区”包括“全长重链恒定区”和“重链恒定区片段”，前者具有基本上与天然抗体恒定区基本相似的结构，而后者仅包括“全长重链恒定区的一部分”。示例性地，典型的“全长抗体重链恒定区”由CH1结构域-铰链区-CH2结构域-CH3结构域组成；当抗体为IgE时，其还包括CH4结构域；当抗体为重链抗体时，则其不包括CH1结构域。示例性地，典型的“重链恒定区片段”可选自Fc或CH3结构域。
如本文所用，术语“轻链恒定区”是指抗体轻链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，所述轻链恒定区可选自恒定κ结构域或恒定λ结构域。
如本文所用，术语“Fc区”用于定义抗体重链中含有恒定区的至少一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。示例性地，人IgG重链Fc区可自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞生成的抗体可经历翻译后切割，自重链的C端切除一个或多个，特别是一个或两个氨基酸。因此,通过编码全长重链的特定核酸分子的表达由宿主细胞生成的抗体可包括全长重链,或者它可包括全长重链的切割变体。当重链的最终两个C端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447,编号方式依照Kabat EU索引)时可能就是这种情况。因此,Fc区的C端赖氨酸(Lys447),或C端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。
IgG Fc区包含IgG CH2和IgG CH3域，可选地，在此基础上还可包含完整或部分铰链区，但不包含CH1域。人IgG Fc区的“CH2域”通常自约位置231处的氨基酸残基延伸至约位置340处的氨基酸残基。在一个实施方案中,碳水化合物链附着于CH2域。本文中的CH2域可以是天然序列CH2域或变体CH2域。“CH3域”包含Fc区中在CH2域C端的那段残基(即自 IgG的约位置341处的氨基酸残基至约位置447处的氨基酸残基)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3域或变体CH3域(例如具有在其一条链中引入的“隆起”(“节”，knob)和在其另一条链中相应引入的“空腔”(“穴”，hole)的CH3域；参见美国专利No.5,821,333,通过援引明确收入本文)。如本文中描述的，此类变体CH3域可用于促进两条不相同抗体重链的异二聚化。
除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照EU编号系统,也称作EU索引,如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中描述的。
如本文所用，术语“种系”或“种系序列”是指存在于生物体的基因组DNA中的由未重排的(unrearranged)免疫球蛋白V、D和/或J区或其部分编码的氨基酸序列。种系表示在所述基因的编码序列中的任何功能性重排之前从亲本传播到子代(sibling)的基本的遗传信息。在编码可变(V)、多样性(D，重链特异的)和连接基因(J)的个体种系基因的抗体同源重组的情况中，产生非种系基因产物；VDJ用于重链，以及VJ用于轻链。在种系基因重组阶段的核苷酸插入和缺失的潜力，负责由人免疫谱产生的几乎无限多样的抗体。一旦重组，组装的基因形成功能性免疫球蛋白基因，其不再从亲本传播到子代，因此不再是种系实体。人V、D和J基因的种系序列可以从权威的(curated)数据库(如IMGT、UNSWIg、NCBI和VBASE2)获得并询问。
如本文所用，术语“衍生自指定序列”是指序列的起源。在一个实施方案中，衍生自特定起始序列的衍生序列，具有与起始序列基本相同的氨基酸序列或其部分相同的氨基酸序列，示例性地，“衍生序列”与“起始序列”具有至少80％、85％、90％或95％的同一性。
如本文所用，术语“保守氨基酸”通常是指属于同一类或具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性、亲水性、主链构象和刚性)的氨基酸。示例性地，以下六组是被认为是互为保守性置换的氨基酸的实例：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
如本文所用，术语“百分比(％)序列一致性”与“百分比(％)同一性”可以互换使用，是指在为达到最大百分比序列一致性而比对序列和引入空位(如果需要)(例如，为了最佳比对，可以在候选和参比序列中的一个或两个中引入空位，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)之后，候选序列的氨基酸(或核苷酸)残基与参比序列的氨基酸(或核苷酸)残基相同的百分比。出于确定百分比序列一致性的目的，可以用本领域技术人员熟知的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAIi)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。例如，用于与候选序列进行比较而比对的参比序列可以显示候选序列在候选序列的全长或候选序列的连续氨基酸(或核苷酸)残基的选定部分上表现出从50％ 至100％的序列同一性。出于比较目的而比对的候选序列的长度可以是例如参比序列的长度的至少30％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。当候选序列中的位置被与在参比序列中的相应位置相同的氨基酸(或核苷酸)残基占据时，则这些分子在那个位置是相同的。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体(CAR)”是指经改造以在免疫效应细胞上表达并且特异性结合抗原的人工细胞表面受体，其包含至少(1)细胞外抗原结合结构域，例如抗体的可变重链或轻链，(2)锚定CAR进入免疫效应细胞的跨膜结构域，和(3)胞内信号传导结构域。CAR能够利用细胞外抗原结合结构域以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫效应细胞重定向至所选择的靶标，例如癌细胞。
如本文所用，术语“抗体缀合物”是指抗体分子直接或者通过连接接头与另一个分子化学键合而形成的偶联体/缀合物。例如抗体-药物缀合物(ADC)，其中药物分子就是所述的另一个分子。其中所述“另一个分子”可选自治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、细胞毒性剂或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂；更优选地，所述细胞毒性剂选自生物碱类(alkaloids)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蒽环类抗生素(doxorubicin)或紫杉烷类(taxanes)。
如本文所用，术语“核酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团组成。通常，核酸分子由碱基的序列描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基的序列通常表示为5′至3′。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)，包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA、核糖核酸(RNA)，特别是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA的合成形式，以及包含两种或更多种这些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链二者，以及单链和双链形式。而且，本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架键合或化学修饰的残基的修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖DNA和RNA分子，其适合作为载体用于在体外和/或体内，例如在宿主或患者中，直接表达本公开的抗体。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或被编码分子的表达，从而可以将mRNA注入到受试者内以在体内产生抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，published online 2017年6月12日，doi：10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。本文“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括在下述细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
如本文所用，术语“载体”包括核酸载体，例如DNA载体(如质粒)，RNA载体，病毒或其他适合的复制子(例如病毒载体)。已经开发了多种载体用于将编码外源蛋白质的多核苷酸递送到原核或真核细胞中。本公开的表达载体含有多核苷酸序列以及例如用于表达蛋白质和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中的附加序列元件。可以用于表达本公开的抗体和抗体片段的某些载体包括含有指导基因转录的调控序列(如启动子和增强子区域)的质粒。用于表达抗体和抗体片段的其他有用的载体含有多核苷酸序列，其增强这些基 因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出。这些序列元件包括例如5’和3’非翻译区、内部核糖体进入位点(IRES)和聚腺苷酸化信号位点，以便指导表达载体上携带的基因的有效转录。本公开的表达载体还可以含有以下多核苷酸，该多核苷酸编码用于选择含有这种载体的细胞的标记。适合的标记的实例包括编码抗生素(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或诺尔丝菌素)抗性的基因。
本公开中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。获得的转化子可以用常规方法培养，以及表达本公开的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。宿主细胞在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。
如本文所用，术语“药物组合物”是指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不含有对施用所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
如本文所用，术语“受试者”、“对象”和“患者”是指接受对如本文所述的特定疾病或病症(如癌症或传染性疾病)的治疗的生物体。对象和患者的实例包括接受疾病或病症(例如细胞增殖性病症，如癌症或传染性疾病)的治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物、猪、山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛科家族成员(如家牛、野牛、水牛、麋鹿和牦牛等)、牛、绵羊、马和野牛等。
如本文所用，术语“治疗”是指外科手术或药物处理(surgical or therapeutic treatment)，其目的是预防、减缓(减少)治疗对象中不希望的生理变化或病变，如细胞增殖性病症(如癌症或传染性疾病)的进展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解)，无论是可检测的或不可检测的。需要治疗的对象包括已患有病症或疾病的对象以及易于患上病症或疾病的对象或打算预防病症或疾病的对象。当提到减缓、减轻、减弱、缓和、缓解等术语时，其含义也包括消除、消失、不发生等情况。
如本文所用，术语“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。“有效量”还指足以缓解症状，例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症，或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将活性成分单独给予个体时，治疗有效剂量单指该成分。当应用某一组合时，治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量，而无论是组合、连续或同时给予。
如本文所用，术语“癌症”指向或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。此定义中包括良性和恶性癌症。如本文所用，术语“肿瘤”或“瘤”是指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
附图说明
图1.huNB149-95-graft和huNB149-70-graft的氨基酸编号(IMGT)；
图2.SDS-PAGE测定人MSLN蛋白的纯度情况；
图3.为ELISA检测人MSLN-FL-his蛋白与anti-MSLN抗体的结合活性；
图4.为FACS检测对照抗体与人肿瘤细胞OVCAR3的结合反应；
图5.人MSLN蛋白转染的HEK293T细胞FACS筛选结果；
图6A为NB149抗血清检测HEK293T-猴MSLN细胞表达量的FACS结果；
图6B为FACS检测对照抗体与HEK293T-猴MSLN细胞的结合反应；
图7A～7C为ELISA检测人源化抗体与人MSLN全长蛋白的结合反应；
图8A～8C为FACS检测人源化抗体与HEK293T-人MSLN细胞的结合反应；
图9A～9C为FACS检测人源化抗体与OVCAR3细胞的结合反应；
图10A～10C为ELISA检测人源化抗体与猴MSLN全长蛋白的结合反应；
图11A～11C为FACS检测人源化抗体与HEK293T-猴MSLN细胞的结合反应。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本公开，本公开的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本公开实施例仅是范例性的，并不对本公开的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本公开的精神和范围下可以对本公开技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本公开的保护范围内。
实施例1 抗人MSLN单域抗体VHH
采用人MSLN(Glu296-Gly580)-Fc蛋白(购自Acro，货号：MSN-H5253)免疫羊驼(Alpaca，编号为NB149)。收集羊驼外周血，分离PBMC，提取总RNA，并反转录为cDNA。经巢式PCR扩增编码单域抗体可变区的核酸片段，克隆进入噬菌体展示用载体，电转化至大肠杆菌电转感受态细胞TG1中。构建针对人MSLN的单域抗体噬菌体展示文库并对文库进行检定。经过多轮淘选，从文库中筛选得到抗人MSLN单域抗体阳性克隆。经测序和序列分析获得阳性克隆的VHH序列信息和CDRs信息，详见表1。
表1.VHH序列信息
将NB149-95、NB149-70的VHH序列重组到人IgG1 Fc表达载体，得重组质粒。质粒的构建和抗体的表达纯化工作由泰州市百英生物科技有限公司完成，获得经纯化的嵌合抗体NB149-95 VHH-hFc和NB149-70 VHH-hFc。人IgG1 Fc序列信息来源于WO1997000319A2，具体如下所示：
经ELISA和FACS鉴定，NB149-95 VHH-hFc、NB149-70 VHH-hFc结合人MSLN蛋白和表达人MSLN蛋白的细胞，且与表达猴MSLN蛋白的细胞有较好的特异性结合活性。
通过Biacore技术进一步检测VHH-hFc与带His标签的人MSLN蛋白(人MSLN-FL-his蛋白，具体序列信息和制备方法详见实施例3.3)的亲和力，具体检测方法包括：使用Protein A芯片(GE Helthcare；29-127-558)捕获抗人MSLN VHH-hFc。样品和运行缓冲液是HBS-EP+(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％surfactant P20)(GE Healthcare；BR-1006-69)。流经池设置为25℃。样品块设置为16℃。两者都用运行缓冲液预处理。在每一个循环中，首先用Protein A芯片捕获待测抗体，然后注入单一浓度的带his标签人MSLN蛋白(人MSLN-FL-his蛋白)，记录抗体和抗原蛋白的结合和解离过程，最后用Glycine pH1.5(GE Helthcare；BR-1003-54)完成芯片再生。通过注射溶液中不同浓度的人MSLN-FL-his持续240秒来测量结合，其中流速为30μL/分钟，从200nM起始(测试的实际浓度见详细结果)，以1：1稀释，总共5个浓度。监测解离相长达600秒，并通过从样品溶液切换到运行缓冲液触发。通过用10mM甘氨酸溶液(pH 1.5)以30μL/分钟的流速洗涤30秒，再生表面。通过减去从山羊抗人Fc表面获得的响应来校正本体折射率(Bulk refractive index)差异。也减去空白注射(＝双重参照)。为了计算表观KD和其他动力学参数，使用Langmuir 1：1模型。VHH-hFc与人MSLN-FL-his蛋白的结合速率(Ka)、解离速率(Kd)及结合亲和力(KD)如表2所示，NB149-95、NB149-70与人MSLN蛋白的亲和力分别为2.34E-11和7.95E-10。
表2.VHH-hFc与人MSLN-FL-his蛋白的结合亲和力
抗体名称 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
NB149-95 1.39E+06 3.24E-05 2.34E-11
NB149-70 1.46E+06 1.16E-03 7.95E-10
实施例2 抗人MSLN单域抗体的人源化设计
通过比对IMGT(http://imgt.cines.fr)人类抗体重轻链可变区种系基因数据库，挑选IGHV3-11*05和IGHJ3*01作为羊驼源抗体NB149-95的人源化重链模板，挑选IGHV3-30*01和IGHJ3*01作为羊驼源抗体NB149-70选择的人源化重链模板。将羊驼抗体的CDR分别移植到其人源模板的FR中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。根据抗体的三维结构模拟，将人源化抗体的FR区序列中关键氨基酸进行回复突变为羊驼抗体对应的氨基酸，以保证原有的亲和力。通过上述方法设计得到的人源化抗体VH分别见表 3和表4，具体序列信息参见表5。本实施例抗体氨基酸残基的编号和CDR区均由IMGT编号系统确定并注释，示例性地，huNB149-95-graft和huNB149-70-graft的氨基酸编号参见图1。
表3.NB149-95的人源化VH的设计
VH FR Template FR mutations
huNB149-95-graft IGHV3-11*05+IGHJ3*01 无突变
huNB149-95-H4 IGHV3-11*05+IGHJ3*01 S40G/I42Y/W52L/S54A/Y55T
huNB149-95-H6 IGHV3-11*05+IGHJ3*01 S40G/I42Y/G49E/L50R/W52L/S54A/Y55T
huNB149-95-H7 IGHV3-11*05+IGHJ3*01 E1Q/S40G/I42Y/G49E/L50R/W52L/S54A/Y55T
huNB149-95-H8 IGHV3-11*05+IGHJ3*01 S40G/I42Y/G49E/L50R/W52L/S54A/Y55T/L87V
注：S40G表示第40位由S突变为G，余下由此类推，其中，氨基酸残基编号由IMGT确定。
表4.NB149-70的人源化VH的设计
VH FR Template FR mutations
huNB149-70-graft IGHV3-30*01+IGHJ3*01 无突变
huNB149-70-H1 IGHV3-30*01+IGHJ3*01 H40A/V42Y/W52A
huNB149-70-H3 IGHV3-30*01+IGHJ3*01 H40A/V42Y/G49E/L50R/W52A
huNB149-70-H4 IGHV3-30*01+IGHJ3*01 M39V/H40A/V42Y/G49E/L50R/W52A
huNB149-70-H5 IGHV3-30*01+IGHJ3*01 M39V/H40A/V42Y/G49E/L50R/W52A/Y66K
huNB149-70-H6 IGHV3-30*01+IGHJ3*01 M39V/H40A/V42Y/G49E/L50R/W52A/L87A
huNB149-70-H7 IGHV3-30*01+IGHJ3*01 M39V/H40A/V42Y/G49E/L50R/W52A/S83A
huNB149-70-H8 IGHV3-30*01+IGHJ3*01 M39V/H40A/V42Y/G49E/L50R/W52A/Y66K/S83A/L87A
huNB149-70-H9 IGHV3-30*01+IGHJ3*01 M39V/H40A/V42Y/G49E/L50R/W52A/D81Y/S83A/T86I
huNB149-70-H10 IGHV3-30*01+IGHJ3*01 M39V/H40A/V42Y/G49E/L50R/W52A/R95K/A96P
注：H40A表示第40位由H突变为A，余下由此类推，其中，氨基酸残基编号由IMGT确定。
表5.人源化重链模板和人源化抗体序列信息
注：下划线处为CDR区域，其余为框架区，带字符边框表示发生突变的位置。
实施例3 抗体及蛋白的制备
3.1 MSLN人源化抗体的制备
MSLN人源化抗体以VHH-his的形式进行表达。抗体表达纯化由泰州市百英生物科技有限公司负责。将纯化的人源化抗体进行蛋白浓度、纯度、内毒素(Lonza试剂盒)等检测分析，结果如表6所示，结果显示，除huNB149-95-H4的纯度低于90％，内毒素浓度在5.0EU/mg以内外，其余抗体的纯度均>98％，内毒素浓度在1.0EU/mg以内。
表6.MSLN人源化抗体的质量控制情况
3.2对照抗体的制备
阳性对照抗体和阴性对照抗体均由泰州市百英生物科技有限公司完成质粒构建及抗体的生产纯化。
阳性对照：NB149-95(SEQ ID NO：1)构建VHH-his形式的抗体，命名为NB149-95-his。Amatuximab序列来自专利US20140127237A1，为hIgG1形式，命名为Tab142。YP223序列来自专利US20150252118A1，构建为兔IgG1形式的抗体，命名为Tab020。
阴性对照：MSLN人源化抗体的同型阴性对照为不结合MSLN蛋白的无关抗体m971，其重链可变区和轻链可变区序列来自专利US 8591889B，构建成VH-(G4S)3-VL-his的形式，命名为Tab084。Amatuximab的同型阴性对照为针对Hen Egg Lysozyme鸡卵溶菌酶的抗体(购自百英，货号：B117901)，命名为hIgG1。
表7 部分对照抗体的序列信息来源
3.3人MSLN-FL-his的制备：
MSLN蛋白胞外具有3个类IgG样结构域，其中Region1(R1)位于最远膜端，Region3(R3)位于最近膜端。将含有编码人MSLN蛋白(NCBI：AAH09272.1)胞外区氨基酸序列Glu296-Gly580(MSLN-FL)的核苷酸序列克隆到pTT5载体(由通用生物系统(安徽)有限公司完成)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。对HEK293E细胞(购自苏州益研生物科技有限公司)进行瞬时转染(PEI，Polysciences，货号：24765-1)并使用FreeStyle TM 293(Thermofisher scientific，货号：12338018)在37℃下进行扩大培养。6天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，获得含人MSLN蛋白胞外区的培养上清液。将培养上清液上样到镍离子亲和层析柱HisTrap TM Excel(GE Healthcare，货号：GE17-3712-06)，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用20mM PB，0.5M NaCl(pH7.4)清洗镍离子亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用buffer A：20mM PB，0.5M NaCl(pH7.4)和buffer B：20mM PB，0.5M NaCl，500mM咪唑进行梯度洗脱(2％,4％,8％,16％,50％,100％)，收集从镍离子亲和层析柱上洗脱下来的带His标签的人MSLN蛋白，用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的人MSLN胞外区蛋白，SDS-PAGE还原胶和非还原胶检测样品目的条带如图2所示。
对制备的上述人MSLN蛋白应用阳性对照抗体进行ELISA检测，检测结果如图3所示，人MSLN-FL-his蛋白与对照抗体有结合活性，与文献报道的Tab142(Amatuximab)的结合特性一致，说明已经制备获得具有结合活性的人MSLN蛋白。
实施例4 细胞株的鉴定
4.1内源性表达人MSLN蛋白的细胞株鉴定
将所需细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，吸除培养基，用PBS缓冲液洗涤2次，用胰酶消化细胞，然后用完全培养基终止消化，并吹打细胞至单细胞悬液。细胞计数后，离心，细胞沉淀用PBS洗涤2次，将细胞沉淀用FACS缓冲液(PBS+2％胎牛血清)重悬至2×10 6细胞每毫升，按每孔50μl加入到96孔FACS反应板中，加入50μl待测抗体(200nM为起始浓度，5倍梯度稀释)，与细胞悬液混匀，4℃孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次，加入每孔50μl FITC标记的二抗(购自Invitrogen，货号：A18830)，4℃孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次，100μl PBS重悬后用FACS(FACS Canto TM，购自BD公司)检测和分析结果。通过软件(CellQuest)进行数据分析，得到细胞的平均荧光密度(MFI)，再通过软件(GraphPad Prism8)分析，进行数据拟合。结果如图4所示，说明OVCAR3细胞与Tab142有较好的结合活性，其表达内源性人MSLN蛋白。
4.2表达人MSLN蛋白的重组HEK293T细胞株制备
编码人MSLN全长氨基酸序列(NCBI：AAH09272.1)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体并制备质粒。对HEK293T细胞系(购自ATCC)进行质粒转染( 3000Transfection Kit，购自Invitrogen，货号：L3000-015)后，在含5μg/mL嘌呤霉素和含10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周，用兔抗人MSLN抗体(Tab020)和山羊抗兔IgG Fab抗体(cell signaling，货号：4414S)在流式细胞仪FACSAriaII(购自BD Biosciences)上分选阳性单克隆细胞到96孔板，并置于37℃，5％(v/v)CO 2培养，大约2周后选择部分单克隆孔进行扩增。对扩增后的克隆用Tab020抗体经FACS流式细胞仪检测和分析，选择长势较好、荧光强度较高的细胞株继续扩大培养并液氮冻存。表达量的结果如表8和图5，显示经过嘌呤霉素加压筛选后的HEK293T-人MSLN具有单一的阳性峰，B8、2A4、2A7为高水平表达人MSLN蛋白的重组HEK293T细胞株，均可用于FACS检测抗体与人MSLN膜蛋白的结合活性，后续检测选择B8克隆。
表8.表达人MSLN全长蛋白的HEK293T重组细胞系FACS检测结果
4.3表达猴MSLN蛋白的重组HEK293T细胞株制备
编码猴MSLN全长氨基酸序列(NCBI：XP_028696439.1)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1载体并制备质粒。对HEK293T细胞系(购自ATCC)进行质粒转染( 3000Transfection Kit，购自Invitrogen，货号：L3000-015)后，在含5μg/mL嘌呤霉素和含10％(w/w)胎牛血清的DMEM/F12培养基中选择性培养2周，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃，5％(v/v)CO 2培养，大约2周后选择部分多克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用羊驼抗血清NB149(已证实NB149为猴MSLN阳性血清)经FACS流式细胞仪检测和分析，选择长势较好、荧光强度较高的细胞株继续扩大培养并液氮冻存。表达量的结果如表9和图6A，显示经过嘌呤霉素加压筛选后的HEK293T-猴-MSLN具有相对单一的阳性峰，可用于FACS检测抗体与猴MSLN蛋白的交叉活性。图6B表明阳性对照抗 体Tab142与HEK293T-猴-MSLN有交叉结合活性(具体方法参照实施例4.1)，再次验证了HEK293T-猴-MSLN可用于后续的实验。
表9.表达猴MSLN全长蛋白的HEK293T重组细胞系FACS检测结果
实施例5 MSLN人源化抗体与MSLN蛋白的结合能力鉴定
5.1酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体与人MSLN蛋白的结合
为检测MSLN人源化抗体与人MSLN蛋白的结合活性，将人MSLN蛋白(购自Acro，货号：MSN-H5253)用PBS稀释到终浓度2μg/mL，然后以50μl/孔加到96孔ELISA板，用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用PBST洗板2次，加入封闭液[PBS+2％(w/w)BSA]室温封闭2小时。倒掉封闭液，PBST洗板2次，按50μl/孔加入起始浓度100nM，1:10梯度稀释的待测抗体或对照抗体。37℃孵育2小时后，用PBST洗板3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的Anti-his二抗(购自Genscript，货号：A00612)，37℃孵育半小时后，用PBST洗板5次。按50μl/孔加入TMB底物，室温孵育10～15分钟后，按50μl/孔加入终止液(1.0N HCl)。用ELISA读板机(Multimode Plate Reader，EnSight，购自Perkin Elmer)读取OD450nm数值。实验结果如图7A～7C和表10-11所示。其中Tab084为阴性对照；NB149-95-his为阳性对照。表中的数据为OD450nm值。结果显示，所有抗体均结合人MSLN蛋白。
表10.NB149-95人源化抗体与人MSLN蛋白结合ELISA水平的结合反应
表11.NB149-70人源化抗体与人MSLN蛋白结合ELISA水平的结合反应
5.2流式细胞实验(FACS)检测抗体与表达人MSLN-HEK293T重组细胞结合
将所需细胞在T-175细胞培养瓶中扩大培养至对数生长期，吸除培养基，用PBS缓冲液洗涤2次，用胰酶消化细胞，然后用完全培养基终止消化，并吹打细胞至单细胞悬液。细胞计数后，离心，细胞沉淀用PBS洗涤2次，将细胞沉淀用FACS缓冲液(PBS+2％胎牛血清)重悬至2x10 6细胞/mL，按每孔50μl加入到96孔FACS反应板中，按50μl/孔加入待测抗体或对照抗体(200nM为起始浓度，5倍梯度稀释)，与细胞悬液混匀，4℃孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次，加入每孔50μl iFluor 647标记的Anti-His二抗(购自Genescript，货号：A01802-100)，4℃孵育1小时。用PBS缓冲液离心洗涤3次，100μl PBS重悬后用FACS(FACS Canto TM，购自BD公司)检测和分析结果。通过软件(CellQuest)进行数据分析，得到细胞的平均荧光密度(MFI)。再通过软件(GraphPad Prism8)分析，进行数据拟合，计算EC50。分析结果如图8A-8C以及表12-13所示，其中Tab084为阴性对照；NB149-95-his为阳性对照。结果可见所有人源化抗体与表达人MSLN蛋白的HEK293T重组细胞均有结合活性，且不与HEK293T空细胞结合，表明人源化抗体是特异性地结合人MSLN膜蛋白。
表12.NB149-95人源化抗体与HEK293-人MSLN的结合反应
表13.NB149-70人源化抗体与HEK293-人MSLN的结合反应
5.3流式细胞实验(FACS)检测抗体与表达人MSLN的内源细胞的结合
检测细胞和待测抗体的准备以及检测方法参照实施例5.2。结果如图9A-9C以及表14-15所示，huNB149-95-H6、huNB149-95-H7、huNB149-95-H8和huNB149-70-H6与表达人MSLN蛋白的OVCAR3内源细胞有较好的结合活性，且与不表达人MSLN蛋白的A431细胞无结合活。其余人源化抗体的结合活性有不同程度的减弱，甚至完全丢失。
表14.NB149-95人源化抗体与OVCAR3的结合反应
表15.NB149-70人源化抗体与OVCAR3的结合反应
实施例6 MSLN人源化抗体交叉结合活性的鉴定
6.1酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体与猴MSLN蛋白的交叉结合
为检测MSLN人源化抗体与猴MSLN全长蛋白的结合活性，将猴MSLN全长蛋白(购自Biointron，货号：20210308A031)用PBS稀释到终浓度2μg/mL，按照实施例5.1的方法进行ELISA检测与数据分析。结果如图10A～10C及表16-17所示，人源化huNB149-95-H6、huNB149-95-H7、huNB149-95-H8、huNB149-70-H6和huNB149-70-H8对猴MSLN蛋白的结合活性有较好的保留。
表16.NB149-95人源化抗体与猴MSLN蛋白结合ELISA水平的结合反应
表17.NB149-70人源化抗体与猴MSLN蛋白结合ELISA水平的结合反应
6.2流式细胞实验(FACS)检测抗体与表达猴MSLN的重组细胞的结合
收集HEK293T-猴MSLN细胞和HEK293T细胞，按照实施例5.2的方法进行FACS检测与数据分析。分析结果如图11A-11C以及表18-19所示，其中Tab084为阴性对照；NB149-95-his为阳性对照。结果表明，人源化抗体huNB149-95-H6、huNB149-95-H7、huNB149-95-H8、huNB149-70-H6和huNB149-70-H8与表达猴MSLN蛋白的重组细胞保留着较好的结合活性。
表18.MSLN人源化抗体与表达猴MSLN蛋白的细胞FACS水平的结合反应
表19.MSLN人源化抗体与表达猴MSLN蛋白的细胞FACS水平的结合反应
实施例7 表面等离子共振(SPR)检测抗体与人MSLN蛋白的亲和力
7.1表面等离子共振(SPR)检测抗体与人MSLN蛋白的亲和力
应用BIAcore 8K仪器，采用抗人抗体捕获法检测抗体与抗原的结合强度。首先，根据Human Antibody Capture Kit试剂盒(Cytiva；29-2346-00)的指导，应用氨基偶联法，将Anti-Human IgG抗体固定到CM5芯片(Cytiva；29-1496-03)上，以HBS-EP+pH7.4(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％surfactant P20)(Cytiva；BR-1006-69)为流动相，将NHS和EDC混合后，活化芯片约600秒，用10mM乙酸钠pH5.0将Anti-Human IgG抗体稀释至15μg/mL，注射420秒，最后用乙醇胺对剩余的活化位点进行封闭。然后，采用多循环动力学法测定抗体与抗原的亲和力，在每一个循环中，首先用抗人抗体捕获人MSLN-Fc蛋白(购自Acro，货号：MSN-H5253)，然后注入单一浓度的MSLN人源化抗体蛋白，记录抗体和抗原蛋白的结合和解离过程，最后用3M MgCl 2完成芯片再生，其中流动相为HBS-EP+pH7.4，流速30μL/min，再生时间30秒，检测温度25℃。最后，根据1:1结合模型，对数据进行分析，拟合抗体抗原结合动力学参数，包括结合速率常数Ka、解离速率常数Kd、平衡解离常数KD、最大结合信号Rmax。MSLN人源化抗体与人MSLN蛋白的结合速率(Ka)、解离速率(Kd)及结合亲和力(KD)如表20所示，所有抗体的亲和力均优于1pM。
表20.SPR检测MSLN人源化抗体与人MSLN蛋白结合的亲和力
抗体名称 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
huNB149-95-H6 5.72E+08 7.18E-05 1.26E-13
huNB149-95-H7 6.70E+08 3.10E-05 4.63E-14
huNB149-95-H8 5.82E+08 9.37E-08 1.61E-16
huNB149-70-H6 1.77E+08 9.00E-05 5.08E-13
NB149-95-his 6.96E+07 3.63E-08 5.21E-16
7.2表面等离子共振(SPR)检测抗体与猴MSLN蛋白的亲和力
使用表面等离子共振(SPR)方法来测定MSLN人源化抗体与猴MSLN蛋白(购自Biointron，货号：20210308A031)的亲和力，实验方法参照实施例7.1。MSLN人源化抗体与猴MSLN蛋白的结合速率(Kd)、解离速率(Ka)及结合亲和力(KD)如表21所示。
表21.SPR检测MSLN人源化抗体与猴MSLN蛋白结合的亲和力
抗体名称 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
huNB149-95-H6 8.78E+08 8.09E-04 9.21E-13
huNB149-95-H7 5.15E+08 2.72E-04 5.29E-13
抗体名称 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
huNB149-95-H8 8.24E+07 1.02E-07 1.23E-15
huNB149-70-H6 5.03E+07 2.98E-04 5.91E-12
NB149-95-his 1.56E+08 4.45E-07 2.86E-15

Claims (26)

  1. 一种特异性结合人MSLN的人源化抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区包括互补决定区CDR1-3和框架区FR1-4：
    (1)所述CDR1-3分别具有如SEQ ID NO：3-5所示的序列，所述FR1-3具有衍生自人种系IGHV3-11*05的FR1-3，所述FR4具有衍生自IGHJ3*01的FR4；或
    (2)所述CDR1-3分别具有如SEQ ID NO：6-8所示的序列，所述FR1-3具有衍生自IGHV3-30*01的FR1-3，所述FR4具有衍生自IGHJ3*01的FR4。
  2. 根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述重链可变区包括选自(1)或(2)所示序列：
    (1)与SEQ ID NO：12-16任一项所示序列相比，具有至少90％同一性的序列，优选为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性；或
    (2)与SEQ ID NO：17-26任一项所示序列相比，具有至少90％同一性的序列，优选为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
  3. 根据权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述重链可变区具有以下特性，其中氨基酸位置编号由IMGT规则确定：
    (1)第1位为E或Q；和/或，
    (2)第40位为S或G；和/或，
    (3)第42位为I或Y；和/或，
    (4)第49位为G或E；和/或，
    (5)第50位为L或R；和/或，
    (6)第52位为W或L；和/或，
    (7)第54位为A或T；和/或，
    (8)第55位为Y或T；和/或，
    (9)第87位为L或V；
    优选地，所述重链可变区具有以下特性，其中，氨基酸位置编号由IMGT规则确定：
    (1)第40位为G，第42位为Y，第52位为L、第54位为A和第55位为T；或，
    (2)第40位为G，第42位为Y，第49位为E，第50位为R，第52位为L，第54位为A和第55位为T；或，
    (3)第1位为Q，第40位为G，第42位为Y，第49位为E，第50位为R，第52位为L，第54位为A和第55位为T；或，
    (4)第40位为G，第42位为Y，第49位为E，第50位为R，第52位为L，第54位为A，第55位为T和第87位为V。
  4. 根据权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述重链可变区具有以下特性，其中氨基酸的位置编号由IMGT规则确定：
    (1)第39位为M或V；和/或，
    (2)第40位为H或A；和/或，
    (3)第42位为V或Y；和/或，
    (4)第49位为G或E；和/或，
    (5)第50位为L或R；和/或，
    (6)第52位为W或A；和/或，
    (7)第66位为Y或K；和/或，
    (8)第81位为D或Y；和/或，
    (9)第83位为S或A；和/或，
    (10)第86位为T或I；和/或，
    (11)第87位为L或A；和/或，
    (12)第95位为R或K；和/或，
    (13)第96位为A或P；
    优选地，所述重链可变区具有以下特性，其中氨基酸的位置编号由IMGT规则确定：
    (1)第40位为A，第42位为Y和第52位为A；或，
    (2)第40位为A，第42位为Y，第49位为E，第50位为R和第52位为A；或，
    (3)第39位为V，第40位为A，第42位为Y，第49位为E，第50位为R和第52位为A；或，
    (4)第39位为V，第40位为A，第42位为Y，第49位为E，第50位为R，第52位为A和第66位为K；或，
    (5)第39位为V，第40位为A，第42位为Y，第49位为E，第50位为R，第52位为A和第87位为A；或，
    (6)第39位为V，第40位为A，第42位为Y，第49位为E，第50位为R，第52位为A和第83位为A；或，
    (7)第39位为V，第40位为A，第42位为Y，第49位为E，第50位为R，第52位为A，第66位为K，第83位为A和第87位为A；或，
    (8)第39位为V，第40位为A，第42位为Y，第50位为R，第49位为E，第52位为A，第81位为Y，第83位为A和第86位为I；或，
    (9)第39位为V，第40位为A，第42位为Y，第49位为E，第50位为R，第52位为A，第95位为K和第96位为P。
  5. 根据权利要求1～4任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段与人MSLN结合的平衡解离常数KD小于1E-7M、1E-8M、1E-9M、1E-10M、1E-11M或1E-12M。
  6. 根据权利要求1～5任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段还结合猴MSLN，优选地，所述抗体或抗原结合片段与猴MSLN结合的平衡解离常数KD小于1E-7M、1E-8M、1E-9M、1E-10M、1E-11M或1E-12M。
  7. 根据权利要求1～6任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片 段包含或不包含抗体重链恒定区；可选的，所述抗体重链恒定区可选自人、羊驼、小鼠、大鼠、兔或羊；可选地，所述抗体重链恒定区可选自IgG、IgM、IgA、IgE或IgD，所述IgG可选自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4；可选地，所述重链恒定区可选自Fc区、CH3区、不存在CH1片段的重链恒定区或完整重链恒定区；优选地，所述重链恒定区为人Fc区；优选地，所述抗体或抗原结合片段为重链抗体。
  8. 根据权利要求1～7任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段还偶联有治疗剂或示踪剂；优选地，所述治疗剂选自放射性同位素、细胞毒性剂或免疫调节剂，所述示踪剂选自放射学造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂和光敏剂；更优选地，所述细胞毒性剂选自生物碱类(alkaloids)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蒽环类抗生素(doxorubicin)、紫杉烷类(taxanes)或毒素化合物。
  9. 根据权利要求1～8任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段还连接有另一功能性分子，所述功能性分子可选自以下一种或多种：信号肽、蛋白标签或细胞因子；优选地，所述细胞因子可选自IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-21、IFN或TNF-alpha。
  10. 一种多特异性抗体，其中，所述多特异性抗体包含权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段；优选地，所述多特异性抗体进一步包含特异性结合MSLN以外的抗原或结合与权利要求1～9任一项所述抗体或抗原结合片段不同的MSLN表位的抗体或抗原结合片段。
  11. 根据权利要求10所述的多特异性抗体，其中，所述MSLN以外的抗原可选自：CD3，优选CD3ε；CD16，优选CD16A；CD32B；PD-1；PD-2；PD-L1；VEGF；NKG2D；CD19；CD20；CD40；CD47；4-1BB；CD137；EGFR；EGFRvIII；TNF-alpha；CD33；HER2；HER3；HSA；CD5；CD27；EphA2；EpCAM；MUC1；MUC16；CEA；Claudin18.2；叶酸受体；Claudin6；WT1；NY-ESO-1；MAGE3；ASGPR1或CDH16。
  12. 根据权利要求10或11所述的多特异性抗体，其中，所述多特异性抗体可为双特异性、三特异性或四特异性，所述多特异性抗体可为二价、四价或六价。
  13. 一种嵌合抗原受体(CAR)，其中，所述嵌合抗原受体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含权利要求1～9任一项所述抗体或抗原结合片段。
  14. 一种免疫效应细胞，其中，所述免疫效应细胞表达权利要求13所述的嵌合抗原受体，或包含编码权利要求13所述嵌合抗原受体的核酸片段；优选地，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞(natural killer cell)、NKT细胞(natural killer T cell)、DNT细胞(double negative T cell)、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞，所述T细胞优选自细胞毒性T细胞、调节性T细胞或辅助性T细胞；优选地，所述免疫效应细胞为自体免疫效应细胞或同种异体免疫效应细胞。
  15. 一种分离的核酸片段，其中，所述核酸片段编码权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求10～12任一项所述多特异性抗体，或权利要求13所述的嵌合抗原受体。
  16. 一种载体(vector)，其中，所述载体包含权利要求15所述的核酸片段。
  17. 一种宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含权利要求16所述的载体；优选地，所述细 胞为原核细胞或真核细胞，例如细菌(大肠杆菌)、真菌(酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞(CHO细胞系或293T细胞系)。
  18. 一种制备权利要求1～9任一项所述抗体或抗原结合片段或权利要求10～12任一项所述多特异性抗体的方法，其中，所述方法包括培养权利要求17所述细胞，以及分离所述细胞表达的抗体或抗原结合片段，或分离所述细胞表达的多特异性抗体。
  19. 一种制备权利要求14所述免疫效应细胞的方法，其中，所述方法包括将编码权利要求13所述CAR的核酸片段导入所述免疫效应细胞，可选地，所述方法还包括启动所述免疫效应细胞表达权利要求13所述CAR。
  20. 一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求10～12任一项所述的多特异性抗体，或权利要求14所述免疫效应细胞，或权利要求15所述的核酸片段，或权利要求16所述载体；或权利要求18～19任一项所述方法制备获得的产品；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的运载体(carrier)、稀释剂或助剂；可选地，所述药物组合物还包含额外的抗肿瘤剂。
  21. 权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求10～12任一项所述的多特异性抗体，或权利要求14所述免疫效应细胞，或权利要求15所述的核酸片段，或权利要求16所述载体；或权利要求18～19任一项所述方法制备获得的产品；或权利要求20所述药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途；所述肿瘤优选间皮瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌或胸膜癌；更优选上皮样恶性胸膜间皮瘤、肺腺癌。
  22. 一种预防和/或治疗肿瘤的方法，包含向有此需要的患者施用有效量的权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求10～12任一项所述的多特异性抗体，或权利要求14所述免疫效应细胞，或权利要求15所述的核酸片段，或权利要求16所述载体，或权利要求18～19任一项所述方法制备获得的产品，或权利要求20所述药物组合物；所述肿瘤优选间皮瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌或胸膜癌；更优选上皮样恶性胸膜间皮瘤、肺腺癌。
  23. 权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求10～12任一项所述的多特异性抗体，或权利要求14所述免疫效应细胞，或权利要求15所述的核酸片段，或权利要求16所述载体，或权利要求18～19任一项所述方法制备获得的产品，或权利要求20所述药物组合物，其中，用于预防和/或治疗肿瘤；所述肿瘤优选间皮瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌或胸膜癌；更优选上皮样恶性胸膜间皮瘤、肺腺癌。
  24. 一种试剂盒，其包含权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求10～12任一项所述的多特异性抗体，或权利要求14所述免疫效应细胞，或权利要求15所述的核酸片段，或权利要求16所述载体，或权利要求18～19任一项所述方法制备获得的产品，或权利要求20所述药物组合物。
  25. 一种检测MSLN表达的方法，其中，在权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段与MSLN之间能够形成复合物的条件下，使待检测样品与权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段接触。
  26. 一种体外抑制表达MSLN细胞增殖或迁移的方法，其中，在权利要求1～9任一项所 述的抗体或抗原结合片段与MSLN之间能够形成复合物的条件下，使所述细胞与权利要求1～9任一项所述的抗体或抗原结合片段接触。
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