CN106596926A - 一种氨基糖苷类抗生素的检测方法 - Google Patents

一种氨基糖苷类抗生素的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，所述氨基糖苷类抗生素的检测方法中氨基糖苷类抗生素通过表面等离子共振成像生物传感器进行检测，所述表面等离子共振成像生物传感器中芯片包括基底层、表面化学修饰层、生物分子固定层，其中，所述基底层为纳米金膜层，表面化学修饰层为改性葡聚糖，所述表面化学修饰层位于所述基底层上方，所述生物分子固定层位于所述表面化学修饰层上方。

Description

一种氨基糖苷类抗生素的检测方法
技术领域
本发明涉及表面等离子共振传感技术领域，具体地说，本发明提供一种利用表面等离子共振生物传感器的生物检测方法。
背景技术
动物源性食品中兽药残留是近几年来国际社会开始研究的公共卫生问题之一，且越来越受到国内外人们的普遍关注。氨基糖苷类抗生素(Aminoglycosides)是一种由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素药物。该类抗生素的主要毒副作用表现为对于听觉、脑神经以及肾脏的损害，因此为了保障食品安全，欧盟和美国食品药品监督管理局(FoodandnrugAdministration，FDA)及许多国家和机构针对该类药物在食品中的残留都规定了明确的最大残留限量。
我国在基本解决食物量的安全(Foodsecurity)的同时，食物质的安全(Foodsafety)越来越引起全社会的关注。尤其是我国作为WTO的成员，与世界各国间的贸易往来日益增加，食品安全己经成为影响农业和食品工业竞争力的关键因素，并在某种程度上约束了我国农业和农村经济产品结构和产业结构的战略性调整。目前，全球食品安全形势不容乐观，主要表现为食源性疾病不断上升、恶性食品污染事件接二连三、以及食品生产、加工新技术与新工艺带来新的危害和世界范围内由于食品安全卫生质量而引起的食品贸易纠纷不断。
因此针对上述问题，本发明提供一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，所述检测方法具有高效、灵敏度高优异特点，且所使用检测仪器表面等离子共振生物传感器中的芯片可以多次使用，使用寿命长。
发明内容
为了解决上述问题，本发明第一方面提供一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，所述氨基糖苷类抗生素的检测方法中氨基糖苷类抗生素通过表面等离子共振成像生物传感器进行检测，所述表面等离子共振成像生物传感器中芯片包括基底层、表面化学修饰层、生物分子固定层，其中，所述基底层为纳米金膜层，表面化学修饰层为改性葡聚糖，所述表面化学修饰层位于所述基底层上方，所述生物分子固定层位于所述表面化学修饰层上方。
在一种实施方式中，所述改性葡聚糖为葡聚糖上接枝苯并噻唑类化合物和/或磺化石墨烯。
在一种实施方式中，所述改性葡聚糖为葡聚糖上接枝苯并噻唑类化合物和磺化石墨烯。
在一种实施方式中，所述苯并噻唑类化合物与所述磺化石墨烯的重量比为1：(0.5～1.3)。
在一种实施方式中，所述苯并噻唑类化合物包括2-巯基-6-硝基苯并噻唑、2-巯基-6-氨基苯并噻唑、2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑、2-巯基-5-甲氧基苯并噻唑、2-巯基-6-乙氧基苯并噻唑中一种或多种。
在一种实施方式中，所述苯并噻唑类化合物为2-巯基-6-硝基苯并噻唑、2-巯基-6-氨基苯并噻唑、2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑。
在一种实施方式中，所述2-巯基-6-硝基苯并噻唑与所述2-巯基-6-氨基苯并噻唑、所述2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑的重量比为1：(0.8～1.5)：(0.2～0.7)。
在一种实施方式中，所述2-巯基-6-硝基苯并噻唑与所述2-巯基-6-氨基苯并噻唑、所述2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑的重量比为1：(1.0～1.3)：(0.3～0.5)。
在一种实施方式中，所述生物分子固定层为氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物。
本发明另一方面提供一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将芯片固定在SPRI装置上，经过程序选择牛血清白蛋白和氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物所固定位置进行共振波长的观测，将芯片表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描；
(2)氨基糖苷类抗生素多克隆抗体用PBS缓冲液稀释50倍后，温育5分钟后，以2μL/min的流速通入芯片表面；
(3)进行强度图像的记录和处理；
(4)反应3分钟后通入0.1mol/LHCl溶液，0.1mol/L NaOH溶液各30秒使芯片再生。
参考以下详细说明更易于理解本申请的上述以及其他特征、方面和优点。
具体实施方式
参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
“聚合物”意指通过聚合相同或不同类型的单体所制备的聚合化合物。通用术语“聚合物”包含术语“均聚物”、“共聚物”、“三元共聚物”与“共聚体”。
“共聚体”意指通过聚合至少两种不同单体制备的聚合物。通用术语“共聚体”包括术语“共聚物”(其一般用以指由两种不同单体制备的聚合物)与术语“三元共聚物”(其一般用以指由三种不同单体制备的聚合物)。其亦包含通过聚合更多种单体而制造的聚合物。“共混物”意指两种或两种以上聚合物通过物理的或化学的方法共同混合而形成的聚合物。
本发明第一方面提供一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，所述氨基糖苷类抗生素的检测方法中氨基糖苷类抗生素通过表面等离子共振成像生物传感器进行检测，所述表面等离子共振成像生物传感器中芯片包括基底层、表面化学修饰层、生物分子固定层，其中，所述基底层为纳米金膜层，表面化学修饰层为改性葡聚糖，所述表面化学修饰层位于所述基底层上方，所述生物分子固定层位于所述表面化学修饰层上方。
本发明中，所述氨基糖苷类抗生素包括链霉素、双氢链霉素、庆大霉素、安普霉素、巴龙霉素、新霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、潮霉素B。
表面等离子共振成像生物传感器(SPRI)
表面等离子体共振(SurfacePlasmonResonance，SPR)是一种表面等离子体被激发的物理现象，能够被电子和光波激发。
SPR现象的光学原理如下：如果光波从光密介质射向光疏介质，即从折射率大的介质射向折射率小的介质，比如由玻璃射向水，当入射角大于临界角时，没有折射光产生，入射光全部反射，这一现象就是全反射。此时，全反射的光波会透入光疏介质约为光波波长的一个深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质。透入光疏介质的光波被称为瞬逝波(evanescentwave)。瞬逝波是沿界面方向传播、在垂直于界面方向呈指数衰减的波。隐失波最后依然返回光密介质，光的总能量没有发生改变。如果在两介质之间的界面上镀上一层很薄的金属膜(约为50nm)，当一束单频线偏振光以大于临界角的角度入射时，在其频率等于金属表面振荡的等离子频率时，金属表面的等离子就吸收入射光的能量发生共振，即表面等离子共振(SPR)，此时的入射角为共振角。
SPR传感器工作原理为：一束极化(偏振)光照到棱镜上被反射，棱镜上贴有一个芯片，芯片上镀着一层金膜，金膜的表面被化学修饰，并固定有分析物，当抗体流经芯片表面时，就与芯片表面的分析物结合，从而使反射光发生变化，这种变化变成电信号被记录下来。
SPRI传感技术是基于SPR原理建立起来的，通过在SPR传感芯片上设计阵列来提高检测通量，优化原来的SPR传感结构，在CCD上对阵列上每个检测点的SPR信号进行并行分析来实现高遁量检测，同时获得相关空间信息，从而实现SPRI传感。
在一种实施方式中，所述改性葡聚糖为葡聚糖上接枝苯并噻唑类化合物和/或磺化石墨烯。
在一种实施方式中，所述改性葡聚糖为葡聚糖上接枝苯并噻唑类化合物和磺化石墨烯。
磺化石墨烯
石墨烯是一种单原子厚度的二维碳纳米材料，具有优异的光、电、热和力学性能，以及巨大的比表面积。石墨烯与高分子之间能够通过共价或非共价作用(氢键、π-π作用、静电作用等)进行复合。这些相互作用既增加了石墨烯在高分子中的溶解性或分散性，也可以提高复合材料的性能或拓展其功能。
磺化反应是指向有机分子引入磺酸基(SO3H)、磺酸盐基(如SO3Na)或磺酰卤基(SO2X)的化学反应，其中引入磺酰卤基的反应又可以定义为卤磺化反应。根据磺化反应所引入的取代基，磺化反应的产物可以是磺酸(RSO3H)、磺酸盐(RSO3M，M为铵或金属离子)或磺酰卤(RSO2X)。根据磺酸基中硫原子和有机物分子中相连的原子不同，得到的产物可以是与碳原子相连的磺酸化合物(RSO3H)；与氧原子相连的硫酸酯(ROSO3H)；与氮原子相连的磺胺化合物(RNHSO3H)。
所述磺化石墨烯的制备方法如下：
(1)氧化石墨烯：在干燥的反应器中加入质量浓度98％的浓硫酸和硝酸钠，冰水浴下冷却，0-5℃条件下，搅拌加入鳞片石墨，混合均匀后缓慢加入高锰酸钾，控制反应温度为10-15℃，反应2h，35℃条件下继续搅拌反应2h，加入去离子水，控制反应液温度在98℃，继续搅拌0.5h，再加入质量浓度为30％的双氧水，趁热过滤，并用稀盐酸(1mol/L)对产物进行洗涤至中性，60℃条件下减压干燥24h，即到的氧化石墨烯；所述鳞片石墨与所述硝酸钠、所述高锰酸钾的重量比为1：0.56：2；所述鳞片石墨与所述质量浓度98％的浓硫酸、所述质量浓度为30％的双氧水、所述去离子水的质量体积比为1：20：2.5：25；
(2)磺化石墨烯：将步骤(1)得到的氧化石墨烯加入到DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中，超声处理1h，得到分散均匀的氧化石墨烯后，分别加入缩合剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应2h后，加入对氨基苯磺酸，室温下连续搅拌反应24h，待反应完成后，反复用水洗涤，再次超声剥离1h，60℃条件下减压干燥24h，得到磺化石墨烯；所述氧化石墨烯与所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、所述N-羟基琥珀酰亚胺、所述对氨基苯磺酸的重量比为1：6.4：3.3：4；所述氧化石墨烯与所述DMF的质量体积比为1：1。
在一种实施方式中，所述苯并噻唑类化合物与所述磺化石墨烯的重量比为1：(0.5～1.3)；优选地，所述苯并噻唑类化合物与所述磺化石墨烯的重量比为1：(0.5～0.85)；更优选地，所述苯并噻唑类化合物与所述磺化石墨烯的重量比为1：0.63。
在一种实施方式中，所述苯并噻唑类化合物包括2-巯基-6-硝基苯并噻唑(CAS号：4845-58-3)、2-巯基-6-氨基苯并噻唑(CAS号：7442-07-1)、2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑(CAS号：2182-73-2)、2-巯基-5-甲氧基苯并噻唑(CAS号：55690-60-3)、2-巯基-6-乙氧基苯并噻唑(CAS号：120-53-6)中一种或多种。
在一种实施方式中，所述苯并噻唑类化合物为2-巯基-6-硝基苯并噻唑、2-巯基-6-氨基苯并噻唑、2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑。
在一种实施方式中，所述2-巯基-6-硝基苯并噻唑与所述2-巯基-6-氨基苯并噻唑、所述2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑的重量比为1：(0.8～1.5)：(0.2～0.7)。
在一种实施方式中，所述2-巯基-6-硝基苯并噻唑与所述2-巯基-6-氨基苯并噻唑、所述2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑的重量比为1：(1.0～1.3)：(0.3～0.5)；优选地，所述2-巯基-6-硝基苯并噻唑与所述2-巯基-6-氨基苯并噻唑、所述2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑的重量比为1：1.15：0.36。
改性葡聚糖
葡聚糖(dextran，glucan)又称右旋糖酐，为一种多糖。存在于某些微生物在生长过程中分泌的粘液中。主要由D-葡萄吡喃糖以α，1→6键连接，支链点有1→2、1→3、1→4连接的。葡聚糖具有较高的分子量，随着微生物种类和生长条件的不同，其结构也有差别。它具有高的比旋光度[α]厍+199°(水)；部分水解主要得到异麦芽糖。
所述改性葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)按重量比加入葡聚糖、磺化石墨烯、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐、4-二甲氨基吡啶溶于装有二甲基亚砜的玻璃瓶中，在30℃温度下反应48h；所述葡聚糖与所述磺化石墨烯、所述3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐、所述4-二甲氨基吡啶重量比为1：(0.01～0.1)：(0.8～2)：(0.01～0.05)；
(2)向步骤(1)中加入7-羧基苯并噻唑、3-(羧甲基)苯并噻唑溴嗡盐、4-二甲氨基吡啶溶于装有二甲基亚砜的玻璃瓶中，在29℃温度下反应52h；然后放置于透析袋中透析并除去杂质，冻干；所述葡聚糖与所述7-羧基苯并噻唑的重量比为1：(0.1～0.7)；所述7-羧基苯并噻唑与所述3-(羧甲基)苯并噻唑溴嗡盐、所述4-二甲氨基吡啶的重量比为1：(0.5～1.2)：(0.01～0.03)；
(3)将步骤(2)中所得固体、苯并噻唑类化合物溶解于pH＝7.4的Tris-Hcl缓冲溶液中，通入氧气2h，然后在室温下搅拌36h，随后使用去离子水透析50h，冻干溶液得到所述改性葡聚糖；所述步骤(2)中所得固体与所述苯并噻唑类化合物的重量比为1:(0.1～1)。
在一种实施方式中，所述生物分子固定层为氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物。
本发明中，所述表面等离子共振成像生物传感器中镀金芯片的选择：形状完好，表面用肉眼观察不明显大颗粒，金膜完整均匀。
金膜的制作以及表面的预处理：在玻璃片上甩以均匀的光刻胶，用光刻法除去在玻片表面需要覆盖金膜的区域的光刻胶。采用真空蒸发镀膜的方法，在18mmx18mmx0.14mm的玻璃片上先沉积上大约2nm的铬，然后沉积上50nm的纯第三章检测芯片的制备度为99.9999％的金，在金膜正式使用前，用新配制的piranha溶液(30％H2O2:H2SO4＝1:3)处理2min，或用离子刻蚀机对芯片表面进行处理，去除有机污染物，然后用大量去离子水清洗，无水乙醇清洗，最后自然晾干。
所述表面等离子共振成像生物传感器芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)表面清洗：镀金芯片在80℃的水：30％过氧化氢：25％氨水为5:1:1的比例的混合溶液中保温10min，自然冷却10min，取出芯片用去离子水和乙醇依次自上而下冲洗芯片三次，用氮气吹干(除去镀金芯片在镀金膜的过程中的残留杂质和溶剂)，用等离子清洗机清洗；
(2)配制质量分数为1％的聚乙二醇二丙烯酸酯/PEG1000溶液，常温过夜14h，取出芯片用乙醇自上而下淋洗，氮气吹干；常温下，，将芯片在改性葡聚糖水溶液中浸泡4h，然后加入EDC/NHS(0.02mol/0.01mol)混合液，反应1h，取出芯片，用去离子水自上而下淋洗，氮气吹干,将0.2mg/mL氨基糖苷类抗生素抗体在芯片表面上打印4个点；
(3)将牛血清白蛋白用pH＝4.4醋酸缓冲液稀释后以10μL/min的流速注入仪器中，静止反应0.5h，用Imol/L乙醇胺以10μL/min的流速注入7min，取出芯片，用去离子水自上而下淋洗，氮气吹干，得所述表面等离子共振成像生物传感器芯片。
本发明另一方面提供一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将芯片固定在SPRI装置上，经过程序选择牛血清白蛋白和氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物所固定位置进行共振波长的观测，将芯片表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描；
(2)氨基糖苷类抗生素多克隆抗体用PBS缓冲液稀释50倍后，温育5min后，以2μL/min的流速通入芯片表面；
(3)进行强度图像的记录和处理；
(4)反应3min后通入0.1mol/LHCl溶液，0.1mol/LNaOH溶液各30s使芯片再生。
金是一种稳定性极高的惰性金属，表面没有稳定的氧化层，所以其表面吸附的物理或化学污染物很容易通过简单的方法去除。
静态接触角越大，亲水性越弱，修饰剂的亲疏水性直接影响芯片的亲疏水性，随着亲水性的增加，单位面积上的样品量低，导致表面修饰层固定蛋白的能力减弱。
本发明对表面等离子共振成像生物传感器芯片中表面化学修饰层-葡聚糖进行化学改性，通过对葡聚糖上接枝苯并噻唑类化合物和磺化石墨烯，引入苯并噻唑基团、巯基、磺酸基，增加了很多的可移动的活性端基不仅固定蛋白能力强，响应值高，静态接触角变大，而且非特异性吸附也较小，响应值大幅提高；另外氨基糖苷类抗生素的检测完毕后，使用酸、碱或强极性溶剂对氨基糖苷类抗生素多克隆抗体进行洗脱，苯并噻唑类基团，及磺化石墨烯的引入增强了表面化学修饰层的耐酸、耐碱及耐强极性溶剂，提高了表面等离子共振成像生物传感器使芯片再生能力，可以多次重复使用，节约成本。
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售的，购于国药化学试剂。
实施例1
待测品：脱脂牛奶用PBS稀释后，加入阿米卡星使其终浓度为1g/ml，与工作浓度的抗体混合。
一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将芯片固定在SPRI装置上，经过程序选择牛血清白蛋白和氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物所固定位置进行共振波长的观测，将芯片表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描；所述氨基糖苷类抗生素为阿米卡星；
(2)氨基糖苷类抗生素多克隆抗体用PBS缓冲液稀释50倍后，温育5min后，以2μL/min的流速通入芯片表面；
(3)进行强度图像的记录和处理；
(4)反应3min后通入0.1mol/LHCl溶液，0.1mol/LNaOH溶液各30s使芯片再生。
所述表面等离子共振成像生物传感器芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)表面清洗：镀金芯片在80℃的水：30％过氧化氢：25％氨水为5:1:1的比例的混合溶液中保温10min，自然冷却10min，取出芯片用去离子水和乙醇依次自上而下冲洗芯片三次，用氮气吹干(除去镀金芯片在镀金膜的过程中的残留杂质和溶剂)，用等离子清洗机清洗；
(2)配制质量分数为1％的聚乙二醇二丙烯酸酯/PEG1000溶液，常温过夜14h，取出芯片用乙醇自上而下淋洗，氮气吹干；常温下，将芯片在改性葡聚糖水溶液中浸泡4h，然后加入EDC/NHS(0.02mol/0.01mol)混合液，反应1h，取出芯片，用去离子水自上而下淋洗，氮气吹干，将0.2mg/mL氨基糖苷类抗生素抗体在芯片表面上打印4个点；
(3)将牛血清白蛋白用pH＝4.4醋酸缓冲液稀释后以10μL/min的流速注入仪器中，静止反应0.5h，用Imol/L乙醇胺以10μL/min的流速注入7min，取出芯片，用去离子水自上而下淋洗，氮气吹干，得所述表面等离子共振成像生物传感器芯片。
所述改性葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)按重量比加入葡聚糖、磺化石墨烯、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐、4-二甲氨基吡啶溶于装有二甲基亚砜的玻璃瓶中，在30℃温度下反应48h；所述葡聚糖与所述磺化石墨烯、所述3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐、所述4-二甲氨基吡啶重量比为1：0.053：1.1：0.03；
(2)向步骤(1)中加入7-羧基苯并噻唑、3-(羧甲基)苯并噻唑溴嗡盐、4-二甲氨基吡啶溶于装有二甲基亚砜的玻璃瓶中，在29℃温度下反应52h；然后放置于透析袋中透析并除去杂质，冻干；所述葡聚糖与所述7-羧基苯并噻唑的重量比为1：0.42；所述7-羧基苯并噻唑与所述3-(羧甲基)苯并噻唑溴嗡盐、所述4-二甲氨基吡啶的重量比为1：0.8：0.016；
(3)将步骤(2)中所得固体、苯并噻唑类化合物溶解于pH＝7.4的Tris-Hcl缓冲溶液中，通入氧气2h，然后在室温下搅拌36h，随后使用去离子水透析50h，冻干溶液得到所述改性葡聚糖；所述苯并噻唑类化合物与所述磺化石墨烯的重量比为1：0.63；所述苯并噻唑类化合物包括2-巯基-6-硝基苯并噻唑、2-巯基-6-氨基苯并噻唑、2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑；所述2-巯基-6-硝基苯并噻唑与所述2-巯基-6-氨基苯并噻唑、所述2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑的重量比为1：1.15：0.36。
所述磺化石墨烯的制备方法，包括以下步骤：
(1)氧化石墨烯：在干燥的反应器中加入质量浓度98％的浓硫酸和硝酸钠，冰水浴下冷却，0-5℃条件下，搅拌加入鳞片石墨，混合均匀后缓慢加入高锰酸钾，控制反应温度为10-15℃，反应2h，35℃条件下继续搅拌反应2h，加入去离子水，控制反应液温度在98℃，继续搅拌0.5h，再加入质量浓度为30％的双氧水，趁热过滤，并用稀盐酸(1mol/L)对产物进行洗涤至中性，60℃条件下减压干燥24h，即到的氧化石墨烯；所述鳞片石墨与所述硝酸钠、所述高锰酸钾的重量比为1：0.56：2；所述鳞片石墨与所述质量浓度98％的浓硫酸、所述质量浓度为30％的双氧水、所述去离子水的质量体积比为1：20：2.5：25；
(2)磺化石墨烯：将步骤(1)得到的氧化石墨烯加入到DM F(N，N-二甲基甲酰胺)中，超声处理1h，得到分散均匀的氧化石墨烯后，分别加入缩合剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应2h后，加入对氨基苯磺酸，室温下连续搅拌反应24h，待反应完成后，反复用水洗涤，再次超声剥离1h，60℃条件下减压干燥24h，得到磺化石墨烯；所述氧化石墨烯与所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、所述N-羟基琥珀酰亚胺、所述对氨基苯磺酸的重量比为1：6.4：3.3：4；所述氧化石墨烯与所述DMF的质量体积比为1：1。
所述氨基糖苷类抗生素的检测方法中能测出脱脂牛奶用PBS稀释12800倍溶液。
实施例2
待测品：脱脂牛奶用PBS稀释后，加入阿米卡星使其终浓度为2g/ml，与工作浓度的抗体混合。
一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将芯片固定在SPRI装置上，经过程序选择牛血清白蛋白和氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物所固定位置进行共振波长的观测，将芯片表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描；所述氨基糖苷类抗生素为阿米卡星；
(2)氨基糖苷类抗生素多克隆抗体用PBS缓冲液稀释50倍后，温育5min后，以2μL/min的流速通入芯片表面；
(3)进行强度图像的记录和处理；
(4)反应3min后通入0.1mol/LHCl溶液，0.1mol/LNaOH溶液各30s使芯片再生。
所述表面等离子共振成像生物传感器芯片的制备方法，所述改性葡聚糖的制备方法及所述磺化石墨烯的制备方法同实施例1，所述苯并噻唑类化合物包括2-巯基-6-硝基苯并噻唑、2-巯基-6-氨基苯并噻唑、2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑；所述2-巯基-6-硝基苯并噻唑与所述2-巯基-6-氨基苯并噻唑、所述2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑的重量比为1：1.15：0.36。
所述氨基糖苷类抗生素的检测方法中能测出脱脂牛奶用PBS稀释25600倍溶液。
实施例3
待测品：脱脂牛奶用PBS稀释，加入链霉素使其终浓度为1g/ml，与工作浓度的抗体混合。
一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将芯片固定在SPRI装置上，经过程序选择牛血清白蛋白和氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物所固定位置进行共振波长的观测，将芯片表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描；所述氨基糖苷类抗生素为链霉素；
(2)氨基糖苷类抗生素多克隆抗体用PBS缓冲液稀释50倍后，温育5min后，以2μL/min的流速通入芯片表面；
(3)进行强度图像的记录和处理；
(4)反应3min后通入0.1mol/LHCl溶液，0.1mol/LNaOH溶液各30s使芯片再生。
所述表面等离子共振成像生物传感器芯片的制备方法，所述改性葡聚糖的制备方法及所述磺化石墨烯的制备方法同实施例1，区别在于所述改性葡聚糖的制备方法中所述苯并噻唑类化合物与所述磺化石墨烯的重量比为1：0.5；所述苯并噻唑类化合物包括2-巯基-6-硝基苯并噻唑、2-巯基-6-氨基苯并噻唑、2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑；所述2-巯基-6-硝基苯并噻唑与所述2-巯基-6-氨基苯并噻唑、所述2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑的重量比为1：1.15：0.36。
所述氨基糖苷类抗生素的检测方法中能测出脱脂牛奶用PBS稀释10000倍溶液。
实施例4
待测品：脱脂牛奶用PBS稀释，加入阿米卡星使其终浓度为1g/ml，与工作浓度的抗体混合。
一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将芯片固定在SPRI装置上，经过程序选择牛血清白蛋白和氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物所固定位置进行共振波长的观测，将芯片表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描；所述氨基糖苷类抗生素为阿米卡星；
(2)氨基糖苷类抗生素多克隆抗体用PBS缓冲液稀释50倍后，温育5min后，以2μL/min的流速通入芯片表面；
(3)进行强度图像的记录和处理；
(4)反应3min后通入0.1mol/LHCl溶液，0.1mol/LNaOH溶液各30s使芯片再生。
所述表面等离子共振成像生物传感器芯片的制备方法，所述改性葡聚糖的制备方法及所述磺化石墨烯的制备方法同实施例1，区别在于所述改性葡聚糖的制备方法中所述苯并噻唑类化合物与所述磺化石墨烯的重量比为1：1.3；所述苯并噻唑类化合物包括2-巯基-6-硝基苯并噻唑、2-巯基-6-氨基苯并噻唑、2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑；所述2-巯基-6-硝基苯并噻唑与所述2-巯基-6-氨基苯并噻唑、所述2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑的重量比为1：1.15：0.36。
所述氨基糖苷类抗生素的检测方法中能测出脱脂牛奶用PBS稀释12000倍溶液。
实施例5
待测品：脱脂牛奶用PBS稀释，加入阿米卡星使其终浓度为1g/ml，与工作浓度的抗体混合。
一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将芯片固定在SPRI装置上，经过程序选择牛血清白蛋白和氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物所固定位置进行共振波长的观测，将芯片表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描；所述氨基糖苷类抗生素为阿米卡星；
(2)氨基糖苷类抗生素多克隆抗体用PBS缓冲液稀释50倍后，温育5min后，以2μL/min的流速通入芯片表面；
(3)进行强度图像的记录和处理；
(4)反应3min后通入0.1mol/LHCl溶液，0.1mol/LNaOH溶液各30s使芯片再生。
所述表面等离子共振成像生物传感器芯片的制备方法，所述改性葡聚糖的制备方法及所述磺化石墨烯的制备方法同实施例1，区别在于所述改性葡聚糖的制备方法中所述苯并噻唑类化合物与所述磺化石墨烯的重量比为1：0.63，所述苯并噻唑化合物为2-巯基-6-硝基苯并噻唑。
所述氨基糖苷类抗生素的检测方法中能测出脱脂牛奶用PBS稀释8600倍溶液。
实施例6
待测品：脱脂牛奶用PBS稀释，加入阿米卡星使其终浓度为1g/ml，与工作浓度的抗体混合。
一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将芯片固定在SPRI装置上，经过程序选择牛血清白蛋白和氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物所固定位置进行共振波长的观测，将芯片表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描；所述氨基糖苷类抗生素为阿米卡星；
(2)氨基糖苷类抗生素多克隆抗体用PBS缓冲液稀释50倍后，温育5min后，以2μL/min的流速通入芯片表面；
(3)进行强度图像的记录和处理；
(4)反应3min后通入0.1mol/LHCl溶液，0.1mol/LNaOH溶液各30s使芯片再生。
所述表面等离子共振成像生物传感器芯片的制备方法，所述改性葡聚糖的制备方法及所述磺化石墨烯的制备方法同实施例1，区别在于所述改性葡聚糖的制备方法中所述苯并噻唑类化合物与所述磺化石墨烯的重量比为1：0.63，所述苯并噻唑化合物为2-巯基-6-氨基苯并噻唑。
所述氨基糖苷类抗生素的检测方法中能测出脱脂牛奶用PBS稀释8800倍溶液。
实施例7
待测品：脱脂牛奶用PBS稀释，加入阿米卡星使其终浓度为1g/ml，与工作浓度的抗体混合。
一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将芯片固定在SPRI装置上，经过程序选择牛血清白蛋白和氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物所固定位置进行共振波长的观测，将芯片表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描；所述氨基糖苷类抗生素为阿米卡星；
(2)氨基糖苷类抗生素多克隆抗体用PBS缓冲液稀释50倍后，温育5min后，以2μL/min的流速通入芯片表面；
(3)进行强度图像的记录和处理；
(4)反应3min后通入0.1mol/LHCl溶液，0.1mol/LNaOH溶液各30s使芯片再生。
所述表面等离子共振成像生物传感器芯片的制备方法，所述改性葡聚糖的制备方法及所述磺化石墨烯的制备方法同实施例1，区别在于所述改性葡聚糖的制备方法中所述苯并噻唑类化合物与所述磺化石墨烯的重量比为1：0.63，所述苯并噻唑化合物为2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑。
所述氨基糖苷类抗生素的检测方法中能测出脱脂牛奶用PBS稀释8000倍溶液。
对比例1
待测品：脱脂牛奶用PBS稀释，加入阿米卡星使其终浓度为1g/ml，与工作浓度的抗体混合。
一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将芯片固定在SPRI装置上，经过程序选择牛血清白蛋白和氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物所固定位置进行共振波长的观测，将芯片表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描；所述氨基糖苷类抗生素为阿米卡星；
(2)氨基糖苷类抗生素多克隆抗体用PBS缓冲液稀释50倍后，温育5min后，以2μL/min的流速通入芯片表面；
(3)进行强度图像的记录和处理；
(4)反应3min后通入0.1mol/LHCl溶液，0.1mol/LNaOH溶液各30s使芯片再生。
所述表面等离子共振成像生物传感器芯片的制备方法，所述磺化石墨烯制备方法同实施例1，区别在于所述改性葡聚糖为葡聚糖接枝磺化石墨烯。
所述改性葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：
按重量比加入葡聚糖、磺化石墨烯、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐、4-二甲氨基吡啶溶于装有二甲基亚砜的玻璃瓶中，在30℃温度下反应48h；所述葡聚糖与所述磺化石墨烯、所述3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐、所述4-二甲氨基吡啶重量比为1：0.053：1.1：0.03；然后放置于透析袋中透析并除去杂质，冻干。
所述氨基糖苷类抗生素的检测方法中能测出脱脂牛奶用PBS稀释5500倍溶液。
对比例2
待测品：脱脂牛奶用PBS稀释，加入阿米卡星使其终浓度为1g/ml，与工作浓度的抗体混合。
一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将芯片固定在SPRI装置上，经过程序选择牛血清白蛋白和氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物所固定位置进行共振波长的观测，将芯片表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描；所述氨基糖苷类抗生素为阿米卡星；
(2)氨基糖苷类抗生素多克隆抗体用PBS缓冲液稀释50倍后，温育5min后，以2μL/min的流速通入芯片表面；
(3)进行强度图像的记录和处理；
(4)反应3min后通入0.1mol/LHCl溶液，0.1mol/LNaOH溶液各30s使芯片再生。
所述表面等离子共振成像生物传感器芯片的制备方法同实施例1，区别在于所述改性葡聚糖为葡聚糖接枝苯并噻唑化合物。
所述改性葡聚糖制备方法，包括以下步骤：
(1)按重量比加入葡聚糖、7-羧基苯并噻唑、3-(羧甲基)苯并噻唑溴嗡盐、4-二甲氨基吡啶溶于装有二甲基亚砜的玻璃瓶中，在29℃温度下反应52h；然后放置于透析袋中透析并除去杂质，冻干；所述葡聚糖与所述7-羧基苯并噻唑的重量比为1：0.42；所述7-羧基苯并噻唑与所述3-(羧甲基)苯并噻唑溴嗡盐、所述4-二甲氨基吡啶的重量比为1：0.8：0.016；
(2)将步骤(1)中所得固体、苯并噻唑类化合物溶解于pH＝7.4的Tris-Hcl缓冲溶液中，通入氧气2h，然后在室温下搅拌36h，随后使用去离子水透析50h，冻干溶液得到所述改性葡聚糖；所述苯并噻唑类化合物包括2-巯基-6-硝基苯并噻唑、2-巯基-6-氨基苯并噻唑、2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑；所述2-巯基-6-硝基苯并噻唑与所述2-巯基-6-氨基苯并噻唑、所述2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑的重量比为1：1.15：0.36。
所述氨基糖苷类抗生素的检测方法中能测出脱脂牛奶用PBS稀释5800倍溶液。
对比例3
待测品：脱脂牛奶用PBS稀释，加入链霉素使其终浓度为1g/ml，与工作浓度的抗体混合。
一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，包括以下步骤：
(1)将芯片固定在SPRI装置上，经过程序选择牛血清白蛋白和氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物所固定位置进行共振波长的观测，将芯片表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描；所述氨基糖苷类抗生素为链霉素；
(2)氨基糖苷类抗生素多克隆抗体用PBS缓冲液稀释50倍后，温育5min后，以2μL/min的流速通入芯片表面；
(3)进行强度图像的记录和处理；
(4)反应3min后通入0.1mol/LHCl溶液，0.1mol/LNaOH溶液各30s使芯片再生。
所述表面等离子共振成像生物传感器芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)表面清洗：镀金芯片在80℃的水：30％过氧化氢：25％氨水为5:1:1的比例的混合溶液中保温10min，自然冷却10min，取出芯片用去离子水和乙醇依次自上而下冲洗芯片三次，用氮气吹干(除去镀金芯片在镀金膜的过程中的残留杂质和溶剂)，用等离子清洗机清洗；
(2)配制质量分数为1％的聚乙二醇二丙烯酸酯/PEG1000溶液，常温过夜14h，取出芯片用乙醇自上而下淋洗，氮气吹干；常温下，将芯片在葡聚糖水溶液中浸泡4h，然后加入EDC/NHS(0.02mol/0.01mol)混合液，反应1h，取出芯片，用去离子水自上而下淋洗，氮气吹干；
(3)将氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物用pH＝4.4醋酸缓冲液稀释后以10μL/min的流速注入仪器中，静止反应0.5h，用Imol/L乙醇胺以10μL/min的流速注入7min，取出芯片，用去离子水自上而下淋洗，氮气吹干，得所述表面等离子共振成像生物传感器芯片。
所述氨基糖苷类抗生素的检测方法中能测出脱脂牛奶用PBS稀释1000倍溶液。
性能测试：
1、芯片的耐化学性
将芯片在溶剂N，N-二甲基甲酰胺50℃浸泡48h，观察芯片表面，
耐化学性好：表面无变化，无溶解；
耐化学性不好：表面有变化，有溶解。
2、芯片的耐酸性
将芯片在1mol/L盐酸溶液中50℃浸泡48h，观察芯片表面，
耐酸性好：表面无变化，无溶解；
耐酸性不好：表面有变化，有溶解。
3、芯片的耐碱性
将芯片在1mol/L氢氧化钠溶液中50℃浸泡48h，观察芯片表面，
耐碱性好：表面无变化，无溶解；
耐碱性不好：表面有变化，有溶解。
4、灵敏度
传感器的灵敏度S是指输出信号变化量△Y与待测溶液变化量△X的比，即输出信号和溶液浓度信号的标定曲线斜率，可用下式来表达
S＝△Y/△X。
表1性能测试结果
从上述结果可以看出，与未改性的葡聚糖及葡聚糖接枝苯并咪唑化合物、葡聚糖接枝磺化石墨烯相比，本发明提供的一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，所述检测方法具有高效、灵敏度高优异特点，且所使用检测仪器表面等离子共振生物传感器中的芯片可以多次使用，使用寿命长。
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (10)

1.一种氨基糖苷类抗生素的检测方法，其特征在于，所述氨基糖苷类抗生素的检测方法中氨基糖苷类抗生素通过表面等离子共振成像生物传感器进行检测，所述表面等离子共振成像生物传感器中芯片包括基底层、表面化学修饰层、生物分子固定层，其中，所述基底层为纳米金膜层，表面化学修饰层为改性葡聚糖，所述表面化学修饰层位于所述基底层上方，所述生物分子固定层位于所述表面化学修饰层上方。
2.根据权利要求1所述氨基糖苷类抗生素的检测方法，其特征在于，所述改性葡聚糖为葡聚糖上接枝苯并噻唑类化合物和/或磺化石墨烯。
3.根据权利要求2所述氨基糖苷类抗生素的检测方法，其特征在于，所述改性葡聚糖为葡聚糖上接枝苯并噻唑类化合物和磺化石墨烯。
4.根据权利要求3所述氨基糖苷类抗生素的检测方法，其特征在于，所述苯并噻唑类化合物与所述磺化石墨烯的重量比为1：(0.5～1.3)。
5.根据权利要求2所述氨基糖苷类抗生素的检测方法，其特征在于，所述苯并噻唑类化合物包括2-巯基-6-硝基苯并噻唑、2-巯基-6-氨基苯并噻唑、2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑、2-巯基-5-甲氧基苯并噻唑、2-巯基-6-乙氧基苯并噻唑中一种或多种。
6.根据权利要求5所述氨基糖苷类抗生素的检测方法，其特征在于，所述苯并噻唑类化合物为2-巯基-6-硝基苯并噻唑、2-巯基-6-氨基苯并噻唑、2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑。
7.根据权利要求6所述氨基糖苷类抗生素的检测方法，其特征在于，所述2-巯基-6-硝基苯并噻唑与所述2-巯基-6-氨基苯并噻唑、所述2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑的重量比为1：(0.8～1.5)：(0.2～0.7)。
8.根据权利要求7所述氨基糖苷类抗生素的检测方法，其特征在于，所述2-巯基-6-硝基苯并噻唑与所述2-巯基-6-氨基苯并噻唑、所述2-巯基-6-甲氧基苯并噻唑的重量比为1：(1.0～1.3)：(0.3～0.5)。
9.根据权利要求1所述氨基糖苷类抗生素的检测方法，其特征在于，所述生物分子固定层为氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物。
10.根据权利要求1所述氨基糖苷类抗生素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将芯片固定在SPRI装置上，经过程序选择牛血清白蛋白和氨基糖苷类抗生素的牛血清白蛋白偶联物所固定位置进行共振波长的观测，将芯片表面通入磷酸缓冲液进行基线的扫描；
(2)氨基糖苷类抗生素多克隆抗体用PBS缓冲液稀释50倍后，温育5分钟后，以2μL/min的流速通入芯片表面；
(3)进行强度图像的记录和处理；
(4)反应3分钟后通入0.1mol/LHCl溶液，0.1mol/L NaOH溶液各30秒使芯片再生。
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