CN104194027A - 一种抗生物污染聚合物生物芯片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含芳酮基团聚合物为基体的抗生物污染可功能化阵列芯片制作方法。该方法主要包括两个关键步骤:第一步,一种抗生物污染单体在紫外光照射下,通过掩膜在聚合物芯片表面接枝形成非阵列区域;第二步,另外一种抗生物污染和可功能化单体在紫外光照射下,与上一步中被掩膜保护的聚合物芯片表面进行接枝聚合,形成阵列区域,从而获得整个芯片表面具有抗生物污染,而阵列区域还可以进一步功能化的生物芯片。该生物芯片具有制备简单、探针分子密度高、超级抗吸附的特性,采用该生物芯片进行临床样品分析,具有背景噪音小、检测信号强、灵敏度高等特点,在医学诊断领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物芯片制备技术领域,具体涉及两步紫外光聚合接枝两种不同的抗生物污染单体于含芳酮基团的聚合物芯片表面,使芯片全表面具有抗生物污染功能,接枝了抗生物污染和可功能化的阵列表面可以固定蛋白质、基因及其它生物组分来制备阵列式生物芯片。
背景技术
阵列芯片,是伴随人类基因组计划的进展而发展起来的具有广阔应用前景的生物技术之一。但迄今为止,生物芯片并没有真正大规模生产和应用于临床中,主要是因为芯片的制作复杂,分析性能难以满足复杂样品的分析要求,特别是以疾病诊断为目的的阵列芯片,由于人体体液样品中大量的生物大分子使核酸、蛋白质阵列芯片分析过程中非特异性吸附现象严重,降低反应的特异性、信号灵敏度以及结果重复性,制约了诊断微阵列的应用。
目前常用的生物芯片基体大多是无机材料,如硅片、玻片和金属等,这些材料具有表面平整、不易变形、荧光本底低的优点。更重要的是,对于传统的无机和金属材料,由于表面高活性羟基或配位点的存在,已经有一套成熟的实验室和工业化表面化学修饰方法。与无机载体相比,合成高分子基体具有低比重、柔性、低成本、易加工成型等优良特性,更适于大规模工业化生产。虽然在传统的western blot 印迹法中常用的硝酸纤维素薄膜、尼龙膜等也已被用于芯片基体,并且这些膜材料由于多孔性而能够吸附大量生物分子,但是也存在微阵列点易扩散、点阵密度低、背景荧光随检测次数增强、杂交速度慢的缺点,制约了其实际应用。因此,目前发展的聚合物基体都为致密的实性材料,常用的基材为环烯烃共聚物(COC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和聚碳酸酯(PC)等,在这些聚合物基体表面加工阵列芯片,生物污染问题是不可避免的。
本发明针对以上问题,采用光照条件下可产生自由基的含芳酮结构的高分子聚合物作为芯片基体,并就该基体的化学结构进一步加工成具有抗生物污染性能的阵列式生物芯片。该聚合物生物芯片是通过化学键使生物组分与抗生物污染表面形成生物探针阵列区域,而非阵列区域同样具有抗生物污染的作用。该生物芯片特征包括:表面接枝的抗生物污染单体可以降低生物分子在芯片基体的非特异性吸附、提高探针分子制备密度、降低背景噪音、提高信号灵敏度和准确度;聚合物为基体的阵列芯片加工方法简单、经济,基体表面基团易于活化而参加化学反应,该发明所涉及技术对于推广生物芯片的临床应用非常重要。
发明内容
本发明提供了以含芳酮聚合物为基体的抗生物污染的阵列芯片的制作方法。该阵列芯片是两维结构,含芳酮聚合物为阵列芯片基体,在紫外光照射下,一种抗生物污染单体溶液和另外一种抗生物污染兼可功能化单体溶液分别与聚合物基体反应,制备抗生物污染阵列芯片。非阵列区域仅具有抗生物污染的功能,阵列区域不仅具有抗生物污染作用,还可以与生物组分进一步反应制作诊断型生物芯片。该生物芯片制作工艺简单、经济、设备要求低;由于芯片表面接枝了抗生物污染单体,所以对生物样品进行分析时,非特异性吸附的降低,使背景噪音低,检测信号强,准确度与灵敏度优于传统方法制作的芯片,为医学诊断芯片的广泛应用提供了技术支持。
为了实现上述发明任务,本发明提供的技术方案如下:
(1)在玻璃、硅片、聚乙烯、聚丙烯等基质平面上,将溶于有机溶剂中的含芳酮结构的聚合物旋涂于上述基质上,室温风干;将一种含有抗生物污染单体的溶液旋涂于聚合物表面,在紫外光照射及掩膜的覆盖下,在聚合物表面接枝抗生物污染组分形成非阵列区域,用50%的甲醇水溶液清洗后待用;
(2)将含有另外一种抗生物污染可功能化的单体溶液旋涂于生物芯片表面,紫外灯照射整个芯片表面,该单体将与第一步接枝反应时掩膜覆盖的聚合物基体材料部分发生接枝聚合形成阵列区域,而第一步已经接枝的非阵列部分由于抗污染组份的隔离作用不再发生接枝聚合。通过两步法制备的抗生物污染芯片,全表面都具有抗生物污染性能,阵列区域可以进一步与生物组分反应构建探针阵列。该生物芯片采用50%甲醇的水溶液清洗、干燥后置于4℃冰箱保存;
(3)配置一定浓度的生物组分溶液,置于阵列芯片表面,在一定的反应条件下,芯片阵列部分形成大量高密度的活性功能化基团,与相应的生物组分反应,生成具有高密度生物探针分子的生物芯片,该阵列可以直接应用到医学样品分析与诊断。
所述的聚合物生物芯片的制备方法为:含芳酮聚合物的浓度1%-20%,旋涂速度100-5000 rpm,旋涂时间20 - 300秒。溶解含芳酮聚合物的溶剂为甲基吡咯烷酮,或二甲基乙酰胺,或二甲基甲酰胺,或上述溶剂的几种溶剂混合物。
所述的含芳酮结构聚合物生物芯片的基体材料结构如下:
其中,R为任意结构的有机基团。该结构式包括:聚芳醚酮系列聚合物,如聚醚醚酮(PEEK)、聚醚酮(PEK)、聚醚酮酮(PEKK)、聚醚醚酮酮(PEEKK)和聚醚酮醚酮酮(PEKEKK)等均聚物;聚酰亚胺系列等均聚合物;其它符合该结构片段的均聚物;上述聚合物混合物或与其它聚合物的共聚物或共混物。
所述紫外光源为: 低压、中压、高压汞灯、碘钨灯、氙灯或卤素灯;光强值为0.5-50 mW/cm2。
所述聚合物表面接枝抗生物污染单体结构如下:
丙烯酸磺酸基甜菜碱结构式
丙烯酸磷酸基甜菜碱结构式
丙烯酸乙二醇酯结构式 丙烯酸羟乙酯结构式
丙烯酸甘油酯结构式
其中,丙烯酸磺酸基甜菜碱结构式(1),x可以为2-10的整数,y可以为2、3、4,R可以为H或者CH3;
丙烯酸磺酸基甜菜碱结构(2),x可以为2-10的整数,y可以为2、3、4,R可以为H或者CH3;
丙烯酸磷酸基甜菜碱结构式(3),x可以为2-18的整数,R可以为H或者CH3;
丙烯酸磷酸基甜菜碱结构式(4),x可以为2-18的整数,R可以为H或者CH3;
丙烯酸乙二醇酯结构式(5),x可以为2-10的整数,R可以为H或者CH3;
丙烯酸羟乙酯结构式(6),x可以为1-10的整数,R可以为H或者CH3;
丙烯酸甘油酯结构式(7),R可以为H或者CH3。
所述聚合物表面接枝抗生物污染单体溶液的浓度为0.1%-50%,溶液中的溶剂为丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、水、0.1%-5%氯化钠溶液的中的一种或几种。
所述聚合物表面接枝抗生物污染可功能化组分为:丙烯酸碳酸基甜菜碱类化合物,其结构式如下:
其中,丙烯酸碳酸基甜菜碱结构式(1),x可以为2、3、4的整数,y可以为1、2、3,R可以为H或者CH3;
丙烯酸碳酸基甜菜碱结构式(2),x可以为2、3、4的整数,y可以为1、2、3,R可以为H或者CH3。
所述聚合物生物芯片为两维结构,与抗生物污染可功能化阵列反应的生物组分包括分子结构中含有伯胺或仲胺的蛋白质、核酸、氨基酸和多糖以及表面含有伯胺或仲胺的功能化粒子。偶联反应发生在pH=7-10的碱性缓冲溶液中,反应的时间为5-300分钟。
该发明的优点在于:1)聚合物芯片表面均匀、平整、聚合物生物芯片制作工艺简单、设备要求低;2)通过两步反应在聚合物表面分别与抗生物污染单体以及抗生物污染可功能化单体形成阵列芯片,使该芯片阵列区域既具有抗生物污染功能又可与生物组分反应,非阵列区域仅具有抗生物污染功能;3)该聚合物阵列式生物芯片能有效防止生物大分子吸附,降低背景信号,提高检测荧光信号的灵敏度。
具体实施方式:
实施例1: 区域选择性加工抗生物污染阵列芯片
将5%酚酞基聚醚酮(PEK-C)的甲基吡咯烷酮溶液,旋涂于玻璃片表面,旋涂速度为3000 rpm,时间为200秒。室温风干后,将该聚合物芯片浸入0.2%的3-[[2-( 甲基丙烯酰氧)乙基](二甲基)-铵]-1-丙磺酸(SBMA)两性离子单体的50%甲醇水溶液中,单体结构如下:
在单体溶液中浸泡1分钟后,取出来铺上有阵列图案的掩膜,转移到高压汞灯下(功率300 W, 光照强度为20 mW/cm2)照射60秒,然后洗去聚合物表面残留的未反应溶液得到具有抗生物污染作用的非阵列区域,该芯片采用50%甲醇的水溶液清洗并干燥后,置于4℃冰箱保存。
将上述得到阵列芯片浸入0.5% 2-羧基-N,N-二甲基-N-(1’-丙烯酰氧乙基)乙铵盐(CBA)单体水溶液中1分钟,单体结构如下:
取出后置于25 mW/cm2卤素灯下照射30 秒,用50%的甲醇水溶液洗净并干燥后,得到具有抗生物污染和可功能化阵列区域。将抗吸附芯片置于4℃冰箱保存。
实施例2: 区域选择性加工抗生物污染阵列芯片
将10%酮酐型聚酰亚胺(PI)溶液(溶剂:二甲基乙酰胺)旋涂于聚乙烯表面,旋涂速度为2000 rpm,旋涂时间250秒。室温风干后,将该聚合物芯片在1%的丙烯酸甘油酯单体的50%异丙醇水溶液中浸泡,单体结构如下:
浸泡1分钟后,铺上有阵列图案的掩膜,转移到高压汞灯下(功率200 W, 光照强度为10 mW/cm2)照射60秒,用50%的甲醇水溶液洗去聚合物表面残留的未反应溶液得到具有抗生物污染作用的非阵列区域。
将上述得到阵列芯片浸入0.5% 2-羧基-N,N-二甲基-N-(1’-丙烯酰氨乙基)乙铵盐(CBA)甜菜碱单体溶液中,单体结构如下:
浸泡1分钟后,取出置于10 mW/cm2卤素灯下照射100 秒,用50%的甲醇水溶液洗净并干燥后得到具有抗生物污染和可功能化阵列区域。将抗吸附芯片置于4℃冰箱保存。
实施例3:区域选择性加工抗生物污染阵列芯片
将15% 聚醚酮酮 (PEKK)的二甲基甲酰胺溶液旋涂于硅片表面。旋涂速度为3500 rpm,旋涂时间200秒。室温风干后,该聚合物芯片在1%的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱单体的50%异丙醇水溶液中浸泡。单体结构如下:
浸泡1分钟后,铺上有阵列图案的掩膜,转移到碘钨灯下(功率100 W, 光照强度为10 mW/cm2)照射150秒,然后洗去聚合物表面残留的未反应溶液得到具有抗生物污染作用的非阵列区域。
将上述得到阵列芯片浸入0.5% 2-羧基-N,N-二甲基-N-(2’-甲基丙烯酰氧乙基)乙铵盐(CBMA)单体的的乙醇溶液中,单体结构如下:
浸泡1分钟后,取出置于10 mW/cm2卤素灯下照射100 秒,用50%的甲醇水溶液洗净并干燥后得到抗生物污染和可功能化的阵列区域,置于4℃冰箱保存。
实施例4: 区域选择性加工抗生物污染阵列芯片
将20%酚酞基聚醚醚酮(PEEK)的甲基吡咯烷酮溶液,旋涂于玻璃片表面,旋涂速度为4000 rpm,时间为100秒。室温风干后,将该聚合物芯片浸入3%的甲基丙烯酸六缩乙二醇乙酯(EGMA)单体的异丙醇溶液中,单体结构如下:
浸泡1分钟后,铺上有阵列图案的掩膜,转移到高压汞灯下(功率200 W, 光照强度为20 mW/cm2)照射100秒,然后洗去聚合物表面残留的未反应溶液得到具有抗生物污染作用的非阵列芯片区域。
将上述得到阵列芯片浸入1% 2-羧基-N,N-二甲基-N-(丙烯酰氨乙基)甲铵盐(CBAA)单体的乙醇溶液中,单体结构如下:
浸泡1分钟后,取出置于20 mW/cm2高压汞灯下照射50 秒,用50%的甲醇水溶液洗净并干燥后得到抗生物污染和可功能化阵列区域,置于4℃冰箱保存。
实施例5: 区域选择性加工抗生物污染阵列芯片
将5% 聚醚醚酮酮(PEEKK)的二甲基乙酰胺溶液旋涂于硅片表面。旋涂速度为3000 rpm,旋涂时间200秒。室温风干后,该聚合物芯片在2%的丙烯酸六缩乙二醇单体的50%异丙醇水溶液中浸泡。单体结构如下:
浸泡1分钟后,铺上有阵列图案的掩膜,转移到碘钨灯下(功率100 W, 光照强度为10 mW/cm2)照射150秒,然后洗去聚合物表面残留的未反应溶液得到具有抗生物污染作用的非阵列芯片区域。
将上述得到阵列芯片浸入0.5% CBMA单体的乙醇溶液中,浸泡1分钟后,取出置于5 mW/cm2低压汞灯下照射400 秒,用50%的甲醇水溶液洗净并干燥后得到抗生物污染和可功能化阵列区域。将芯片置于4℃冰箱保存。
实施例6:蛋白质阵列芯片、核酸阵列芯片、纳米粒子阵列芯片的制备
将制得的聚醚酮酮 (PEKK)抗生物污染阵列芯片与pH=5的35 mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和15 mM N-羟基琥珀酰亚胺(溶于10 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液)在室温下反应15分钟后用缓冲溶液洗净芯片。
将3个制得的生物芯片分别置于1000 μL 100 μg/mL的抗甲胎蛋白、1000μL 1×10-5 M/mL 5’-NH2-GGTTGGTGTGGTTGG-3’溶液、异硫氰酸荧光素标记的金纳米粒子(5 nm直径,浓度1×10-4%)的硼砂缓冲溶液(pH=9),置于恒温震荡箱中30℃反应,分别得到了抗体阵列、DNA阵列、金纳米粒子阵列。其中,在荧光显微镜下可以直接观察阵列区域的金纳米粒子阵列。将另外两个制得的芯片分别在抗体阵列表面滴加含有异硫氰酸荧光素标记的甲胎蛋白的血液、DNA芯片表面滴加含有羧基四甲基罗丹明标记的凝血酵素的血液,分别反应10分钟后,用PBS缓冲溶液冲洗芯片,然后置于荧光显微镜下观察阵列区域的荧光阵列,并拍照,测量荧光强度。将芯片置于原子力显微镜下扫描,测量阵列的表面形貌。
实施例7:抗生物污染芯片的表征
紫外可见光度法标准曲线的制作:
先配置1 mg/mL的牛血清白蛋白(全组分BSA)母液,再用PBS溶液稀释为不同浓度。共9组,浓度分别为0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL。浓度为0 mg/mL 的溶液为校准归零液。
紫外可见分光光谱仪校准归零后,取不同浓度的溶液1 mL 于比色皿,定点扫描278 nm 处吸收,即A278。结果重复3遍,取平均值。
利用得到的A278值用origin 作图,并拟合,得到标准曲线 A= 0.695×C + 0.009。
不同抗生物污染单体接枝后抗生物污染性能测试。
取0.02 mg/mL的BSA 50 μL用水稀释10倍,得到0.002 mg/mL、500 μL的BSA溶液,分别取该稀溶液100 μL 滴加到1 cm2接枝了SBMA(样品1)、CBMA(样品2)、EGMA(样品3)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)(样品4)、甲基丙烯酸甘油酯(GOHMA)(样品5)的聚醚醚酮(PEEK)表面室温下静置,吸附30分钟后,收集残留液体,并用PBS缓冲溶液清洗,最终浓缩到10μL。经紫外可见光度法测得吸光度分别为A1= 0.0216;A2= 0.0212;A3= 0.0177;A4= 0.0173;A5=0.0166。对应的BSA浓度为C1= 0.0182 mg/mL;C2= 0.0175 mg/mL;C3= 0.0125 mg/mL;C4= 0.0120 mg/mL;C5= 0.0110 mg/mL;所以对于接枝聚合了不同组分的聚醚醚酮表面对BSA的吸附量经计算为,SBMA甜菜碱聚合物表面为 18 ng/cm2, CBMA甜菜碱聚合物25 ng/cm2, EGMA聚合物表面75 ng/cm2, HEMA聚合物表面80 ng/cm2, GOHMA聚合物表面为 90 ng/cm2。
Claims (9)
1.一种抗生物污染聚合物生物芯片的制备方法,包括以下步骤:
第一步,在玻璃、硅片、聚乙烯、聚丙烯等基质平面上,旋涂一层溶于有机溶剂中的含芳酮结构的聚合物,形成聚合物生物芯片基体,室温风干;
第二步,将一种可聚合抗生物污染单体的溶液旋涂于聚合物表面,紫外光透过有阵列图案的掩膜照射在聚合物表面,被紫外光照射的聚合物表面区域与抗生物污染组分发生接枝聚合,用溶剂洗涤芯片,洗去未反应的单体,形成抗生物污染非阵列区域;
第三步,将另外一种可聚合抗生物污染并且可功能化单体的溶液旋涂在整个芯片表面,采用紫外光照射整个芯片表面,该单体只与第二步中掩膜覆盖部分、即未接枝抗生物污染单体的聚合物表面反应得到可功能化的阵列区域,而不再与第二步中已经接枝抗生物污染单体的表面反应;
第四步,将如蛋白质、基因等的生物组分,通过偶联反应固定在抗生物污染可功能化阵列区域表面,形成聚合物为基体的抗生物污染阵列芯片。
2.如权利1所述的抗生物污染聚合物生物芯片的制备方法,其特征在于:含芳酮结构聚合物基质具有如下结构片段:
其中,R为任意结构的有机基团;聚合物基体具体包括:聚芳醚酮系列,如聚醚醚酮(PEEK)、聚醚酮(PEK)、聚醚酮酮(PEKK)、聚醚醚酮酮(PEEKK)和聚醚酮醚酮酮(PEKEKK)等均聚物;聚酰亚胺系列等均聚合物;其它符合该结构片段的均聚合物;上述聚合物混合物或与其它聚合物的共聚物或共混物。
3.如权利1所述的抗生物污染聚合物生物芯片的制备方法,其特征在于:含芳酮结构聚合物的旋涂条件为:含芳酮聚合物的浓度1%-20%,100-5000 rpm旋涂速度,20 - 300秒的旋涂时间,聚合物厚度为1μm-100μm;溶解含芳酮聚合物的溶剂为甲基吡咯烷酮,或二甲基乙酰胺,或二甲基甲酰胺,或含上述溶剂的几种溶剂混合物。
4.如权利1所述的抗生物污染聚合物生物芯片的制备方法,其特征在于:能与聚合物基体反应形成非阵列区域的具有抗生物污染性能的单体包括:丙烯酸磺酸基甜菜碱、丙烯酸磷酸基甜菜碱,丙烯酸乙二醇酯,丙烯酸羟乙酯、丙烯酸甘油酯类化合物中的一种或几种,各种单体的结构如下:
丙烯酸磺酸基甜菜碱结构式
丙烯酸磷酸基甜菜碱结构式
丙烯酸乙二醇酯结构式 丙烯酸羟乙酯结构式
丙烯酸甘油酯结构式
其中,丙烯酸磺酸基甜菜碱结构式(1),x可以为2-10的整数,y可以为2、3、4,R可以为H或者CH3;
丙烯酸磺酸基甜菜碱结构式(2),x可以为2-10的整数,y可以为2、3、4,R可以为H或者CH3;
丙烯酸磷酸基甜菜碱结构式(3),x可以为2-18的整数,R可以为H或者CH3;
丙烯酸磷酸基甜菜碱结构式(4),x可以为2-18的整数,R可以为H或者CH3;
丙烯酸乙二醇酯结构式(5),x可以为2-10的整数,R可以为H或者CH3;
丙烯酸羟乙酯结构式(6),x可以为1-10的整数,R可以为H或者CH3;
丙烯酸甘油酯结构式(7),R可以为H或者CH3。
5. 如权利1所述的抗生物污染聚合物生物芯片的制备方法,其特征在于:能与聚合物基体反应形成非阵列区域的抗生物污染单体的浓度为0.1%-50%,溶剂为丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、水、0.1%-5%氯化钠溶液的中的一种或几种混合物。
6.如权利1所述的抗生物污染聚合物生物芯片的制备方法,其特征在于:抗生物污染兼可功能化单体为丙烯酸碳酸基甜菜碱类化合物,其结构如下:
其中,丙烯酸碳酸基甜菜碱结构式(1),x可以为2、3、4的整数,y可以为1、2、3,R可以为H或者CH3;
丙烯酸碳酸基甜菜碱结构式(2),x可以为2、3、4的整数,y可以为1、2、3,R可以为H或者CH3。
7.如权利1所述的抗生物污染聚合物生物芯片的制备方法,其特征在于:抗生物污染兼可功能化单体的浓度为0.1%-50%,溶剂为丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、水、0.1%-5%氯化钠溶液的中的一种或几种混合物。
8.如权利1所述的聚合物点阵式生物芯片的制备方法,其特征在于:紫外光源为:低压、中压、高压汞灯、碘钨灯、氙灯或卤素灯;光强值为0.5-50 mW/cm2;紫外辐照时间为10 -300秒。
9.如权利1所述的抗生物污染聚合物生物芯片的制备方法,其特征在于:与抗生物污染可功能化阵列区域反应的生物组分包括分子结构中含有伯胺或仲胺的蛋白质、核酸、氨基酸和多糖以及表面含有伯胺或仲胺的功能化粒子,偶联反应发生在pH=7-10的碱性缓冲溶液中,反应的时间为5-300分钟。
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