CN103966321A - 一种区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法 - Google Patents

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Harbin Institute of Technology Weihai
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Abstract

本发明公开了一种基于玻璃、硅片、聚二甲基硅氧烷基体的抗生物污染阵列芯片的加工方法。采用不同抗生物污染材料分别构建芯片阵列区域和非阵列区域，使整个芯片表面都具有抗生物污染的功能，阵列区域可与生物组分反应制得功能化的生物探针阵列。具体步骤包括：基体材料表面的硅烷化；一种抗生物污染单体的接枝聚合；另外一种抗生物污染并可功能化单体的接枝聚合；生物组分与阵列区域的偶联反应。采用该方法制得的阵列式生物芯片，生物分子非特异性吸附大大减弱、探针分子密度高、信号灵敏度高。

Description

一种区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法
技术领域
本发明涉及一种抗生物污染阵列芯片的制备方法，属于生物芯片技术领域。
背景技术
生物芯片技术的实质是在基片上构建有序点阵，并固定探针分子，使之与被测物质结合或反应，再通过检测分析获得被测物质的分子结构以及浓度等信息。该技术具有高通量、高信息量、微型化、自动化、快速响应等优点，可应用于临床诊断、环境监测、食品安全等领域。但迄今为止，生物芯片，尤其是蛋白质芯片并没有广泛应用于临床检验。其主要原因在于，临床样品，如血液、尿样等含有大量的生物大分子，在进行分析检测时，易于在芯片表面非特异性吸附，造成芯片的背景信号强，具有分子识别能力的阵列区域也易于发生吸附，导致分析的灵敏度、特异性和准确性较差,临床误诊率较高。现有的具有抗非特异性吸附功能的芯片多采用物理吸附的方法进行表面修饰。该方法虽然操作简单，但修饰后得到的表面不牢固，重现性较差。而采用化学法修饰的生物抗吸附芯片由于反应条件苛刻，操作难度大，不易大规模批量生产。
生物芯片的基体材料包括玻璃、硅片、金属材料以及一些高分子材料。其中，玻璃、硅片由于易于实现大规模微加工而应用广泛。现有的阵列加工方法，多借助于复杂的仪器设备，如机器手点样装置等，易于造成样品点扩散、阵列大小不易控制等问题。因此，采用光聚合的方法在常用的玻璃、硅片基质表面构建阵列区域大小可控的阵列可以解决上述问题。
针对上述技术问题，本发明提供了一种抗生物污染阵列芯片的制备方法。该方法以玻璃、硅片、聚二甲基硅氧烷作为基片，以共价键的形式在基片表面接枝抗生物污染功能的单体。该方法制备步骤简单，易于程序化。制得的阵列芯片表面包含两部分，分别为具有抗生物污染功能的非阵列区域和具有抗生物污染功能并可进行功能化的阵列区域。可功能化的阵列区域可通过进一步反应与蛋白质、核酸、氨基酸、多糖或具有伯胺或仲胺的粒子等生物组分偶联制得生物探针阵列。
该生物芯片的特点包括：无需点样设备，实现阵列区域和非阵列区域选择性功能化；生物分子非特异性吸附弱，探针分子密度高，背景噪音小，信号灵敏度高；尤其在复杂生物样品中的微量蛋白质定量分析，如癌症标志物的检测方面意义重大 。
发明内容
本发明提供了一种抗生物污染阵列芯片的制备方法。该方法工艺简单，对设备要求低，制得的阵列式生物芯片探针分子密度高、背景噪音小、信号灵敏度高。该芯片的特点在于表面具有抗生物污染的功能，可以有效减少生物组分的非特异性吸附，其中阵列部分可与蛋白质、核酸、氨基酸、多糖或具有伯胺或仲胺的粒子等生物组分偶联制得生物探针阵列，在微量生物分子检测领域具有应用前景。
本发明的目的是通过以下技术方法实现的：
方法1：
一种抗生物污染阵列芯片的制备方法1，包括以下步骤：
第一步，将清洗后的玻璃或硅片或聚二甲基硅氧烷芯片，置于含不饱和键的硅烷偶联剂溶液里浸泡一定时间后，取出、干燥；
第二步，将一种含有抗生物污染单体的溶液旋涂于芯片表面，紫外光透过掩膜照射在芯片表面，引发该单体与芯片表面的接枝聚合反应，光照部分形成抗生物污染的非阵列区域，未光照部分不发生反应；用50%甲醇水溶液清洗芯片，洗去未反应的单体；
第三步，将另外一种抗生物污染并且可功能化单体的溶液旋涂在整个芯片表面，紫外光照射下，第二步中未与抗生物污染单体反应的区域与该单体发生接枝聚合反应，形成抗生物污染并可功能化的阵列区域，洗净后得到全芯片抗生物污染、阵列区域可功能化的生物芯片；
第四步，将如蛋白质、基因等生物组分，通过偶联反应固定在阵列区域表面，制得具有抗生物污染表面的新型生物芯片。
本发明的上述方法1中，所述的含不饱和键的硅烷偶联剂的结构为以下三类中的任意一种或几种：
其中R为Me或Et，R’为H或者Me，n为1-10的整数。
本发明的上述方法1中，所述的含不饱和键的硅烷偶联剂与芯片的反应时间为5分钟-20小时，反应温度为25℃-80℃，浓度为0.1%-30%，溶剂包括：苯、甲苯、丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、四氢呋喃中的一种或几种。
本发明的上述方法1中，所述的抗生物污染单体包括以下列举的五类中的任意一种或几种：
（1）丙烯酸磺酸基甜菜碱类化合物
其中x为2-10的整数，y为2、3或4，R为H或者Me；
（2）丙烯酸磷酸基甜菜碱类化合物
其中x为2-18的整数，R为H或者Me；
（3）丙烯酸乙二醇酯类化合物
其中x为2-10的整数，R为H或者Me；
（4）丙烯酸羟基酯类化合物
其中x为1-10的整数，R为H或者Me；
（5）丙烯酸甘油酯类化合物
其中R为H或者Me。
本发明的上述方法1中，所述的抗生物污染单体与芯片表面的接枝反应，单体浓度为0.1%-50%，溶剂包括：丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、己烷，石油醚、环己烷、苯及其衍生物、烷基醚类化合物中的一种或几种。
本发明的上述方法1中，所述的抗生物污染并可功能化单体指下列丙烯酸甜菜碱类化合物中的任意一种或几种：
其中x为2、3或4，y为1、2或3，R为H或者Me。
本发明的上述方法1中，所述的抗生物污染并可功能化单体与芯片表面的接枝反应，单体浓度为0.1%-50%，溶剂包括：N-甲基吡咯烷酮，二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、水中的一种或几种。
本发明的上述方法1中，所述的紫外光波长315-420nm，强度8-50mW/cm2，曝光时间0.5-10分钟。
本发明的上述方法1中，所述的阵列的生物组分包括蛋白质、核酸、氨基酸、多糖或具有伯胺或仲胺的粒子。偶联反应发生在pH=7-10的缓冲溶液中，反应的时间为5-300分钟。
一种抗生物污染阵列芯片的制备方法2，包括以下步骤：
第一步，将清洗后的玻璃或硅片或聚二甲基硅氧烷芯片，置于含氨基的硅烷偶联剂溶液里浸泡一定时间后，洗净、干燥；
第二步，将芯片浸入含有丙烯酸缩水甘油酯结构试剂的溶液中，在一定的条件下反应后，洗净、干燥；
第三步，将一种含有抗生物污染单体的溶液旋涂于芯片表面，紫外光透过掩膜照射在芯片表面，引发该单体与芯片表面的接枝聚合反应，光照部分形成抗生物污染的非阵列区域，未光照部分不发生反应；用50%的甲醇水溶液洗去未反应的单体；
第四步，将另外一种抗生物污染并且可功能化单体的溶液旋涂在整个芯片表面，紫外光照射下，第三步中未与抗生物污染单体反应的区域与该单体发生接枝聚合反应，形成抗生物污染并可功能化的阵列区域，洗净后得到全芯片抗生物污染、阵列区域可功能化的生物芯片；
第五步，将如蛋白质、基因等生物组分，通过偶联反应固定在阵列区域表面，制得具有抗生物污染表面的新型生物芯片。
本发明的上述方法2中，所述的氨基硅烷偶联剂的结构为：
其中R为Me或Et，n为1-10的整数。
本发明的上述方法2中，所述的氨基硅烷偶联剂与芯片的反应时间为5分钟-20小时，反应温度为25℃-80℃，浓度为0.1%-30%，溶剂包括：苯、甲苯、丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、四氢呋喃中的一种或几种。
本发明的上述方法2中，所述的与芯片表面反应的丙烯酸缩水甘油酯的结构为：
其中R为H或者Me，反应时间为10分钟-24小时，反应温度为20℃-100℃，浓度为0.1%-50%，溶剂包括：丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、环己烷、苯及其衍生物、乙醚中的一种或几种。
本发明的上述方法2中，所述的抗生物污染单体包括以下列举的五类中的任意一种或几种：
（1）丙烯酸磺酸基甜菜碱类化合物
其中x为2-10的整数，y为2、3或4，R为H或者Me；
（2）丙烯酸磷酸基甜菜碱类化合物
其中x为2-18的整数，R为H或者Me；
（3）丙烯酸乙二醇酯类化合物
其中x为2-10的整数，R为H或者Me；
（4）丙烯酸羟基酯类化合物
其中x为1-10的整数，R为H或者Me；
（5）丙烯酸甘油酯类化合物
其中R为H或者Me。
本发明的上述方法2中，所述的抗生物污染单体与芯片表面的接枝反应，单体浓度为0.1%-50%，溶剂包括：丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、己烷，石油醚、环己烷、苯及其衍生物、烷基醚类化合物中的一种或几种。
本发明的上述方法2中，所述的抗生物污染并可功能化单体指下列丙烯酸甜菜碱类化合物中的任意一种或几种或几种：
其中x为2、3或4，y为1、2或3，R为H或者Me。
本发明的上述方法2中，所述的抗生物污染并可功能化单体与芯片表面的接枝反应，单体浓度为0.1%-50%，溶剂包括：N-甲基吡咯烷酮，二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、水中的一种或几种。
本发明的上述方法2中，所述的紫外光波长315-420nm，强度8-50mW/cm2，曝光时间0.5-10分钟。
本发明的上述方法2中，所述的阵列的生物组分包括蛋白质、核酸、氨基酸、多糖或具有伯胺或仲胺的粒子。偶联反应发生在pH=7-10的缓冲溶液中，反应的时间为5-300分钟。
方法3：
一种抗生物污染阵列芯片的制备方法3，包括以下步骤：
第一步，将清洗后的玻璃或硅片或聚二甲基硅氧烷芯片，置于含环氧基团的硅烷偶联剂溶液里浸泡一定时间后，洗净、干燥；
第二步，将芯片浸入含有两个或两个以上伯胺基团试剂的溶液中，在一定的条件下反应后，洗净、干燥；
第三步，将芯片浸入含有丙烯酸缩水甘油酯结构试剂的溶液中，在一定的条件下反应后，洗净、干燥；
第四步，将一种含有抗生物污染单体的溶液旋涂于芯片表面，紫外光透过掩膜照射在芯片表面，引发该单体与芯片表面的接枝聚合反应，光照部分形成抗生物污染的非阵列区域，未光照部分不发生反应；用50%的甲醇水溶液洗去未反应的单体；
第五步，将另外一种抗生物污染并且可功能化单体的溶液旋涂在整个芯片表面，紫外光照射下，第四步中未与抗生物污染单体反应的区域与该单体发生接枝聚合反应，形成抗生物污染并可功能化的阵列区域，洗净后得到全芯片抗生物污染、阵列区域可功能化的生物芯片；
第六步，将如蛋白质、基因等的生物组分，通过偶联反应固定在阵列区域表面，制得具有抗生物污染表面的新型生物芯片。
本发明的上述方法3中，所述的含有环氧基团的硅烷偶联剂结构为：
其中R为Me或Et，n为1-10的整数。
本发明的上述方法3中，所述的含有环氧基团的硅烷偶联剂与芯片的反应时间为5分钟-20小时，反应温度为25℃-80℃，浓度为0.1%-30%，溶剂包括：苯、甲苯、丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、四氢呋喃中的一种或几种。
本发明的上述方法3中，所述的与芯片表面反应的伯胺基团试剂的结构为以下两类中的任意一种或几种：
其中n为1-10的整数，反应时间为10分钟-24小时，温度为20℃-100℃，浓度为0.1%-50%，溶剂包括：丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙醚中的一种或几种。
本发明的上述方法3中，所述的与芯片表面反应的丙烯酸缩水甘油酯的结构为：
其中R为H或者Me，反应时间为10分钟-24小时，温度为20℃-100℃，浓度为0.1%-50%，溶剂包括：丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、环己烷、苯及其衍生物、乙醚中的一种或几种。
本发明的上述方法3中，所述的抗生物污染单体包括以下列举的五类中的任意一种或几种：
（1）丙烯酸磺酸基甜菜碱类化合物
其中x为2-10的整数，y为2、3或4，R为H或者Me；
（2）丙烯酸磷酸基甜菜碱类化合物
其中x为2-18的整数，R为H或者Me；
（3）丙烯酸乙二醇酯类化合物
其中x为2-10的整数，R为H或者Me；
（4）丙烯酸羟基酯类化合物
其中x为1-10的整数，R为H或者Me；
（5）丙烯酸甘油酯类化合物
其中R为H或者Me。
本发明的上述方法3中，所述的抗生物污染单体与芯片表面的接枝反应，单体浓度为0.1%-50%，溶剂包括：丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、己烷，石油醚、环己烷、苯及其衍生物、烷基醚类化合物中的一种或几种。
本发明是上述方法3中，所述的抗生物污染并可功能化单体指下列丙烯酸甜菜碱类化合物中的任意一种或几种：
其中x为2、3或4，y为1、2或3，R为H或者Me。
本发明的上述方法3中，所述的抗生物污染并可功能化单体与芯片表面的接枝反应，单体浓度为0.1%-50%，溶剂包括：N-甲基吡咯烷酮，二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、水中的一种或几种。
本发明的上述方法3中，所述的紫外光波长315-420nm，强度8-50mW/cm2，曝光时间0.5-10分钟。
本发明的上述方法3中，所述的阵列的生物组分包括蛋白质、核酸、氨基酸、多糖或具有伯胺或仲胺的粒子，偶联反应发生在pH=7-10的缓冲溶液中，反应的时间为5-300分钟。
具体实施方式
实施例1：一种区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法
将经过Piranha溶液(H2SO4/H2O2=4/1，v/v)清洗后的1cm×1cm硅片置于2%(v/v)的5-己烯基三甲氧基硅烷的甲醇溶液中，25℃反应30分钟，用甲醇洗净并干燥。5-己烯基三甲氧基硅烷的结构如下：
将40g/L的抗生物污染单体—3-[[2-( 甲基丙烯酰氧基)乙基](二甲基)-铵]-1-丙磺酸（SBMA）甜菜碱的甲醇溶液旋涂于芯片表面，旋涂速度为2000 rpm，时间为10秒。SBMA甜菜碱的结构为：
将芯片表面铺上带有阵列图案的掩膜，转移至20mW/cm2、365nm紫外光下，照射3分钟，引发SBMA甜菜碱与芯片表面的接枝聚合形成非阵列区域。用50%甲醇水溶液洗净后，将40g/L的抗生物污染并可功能化的单体——2-羧基-N，N-二甲基-N-（2’-甲基丙烯酰氧基乙基）乙铵盐（CBMA）的甜菜碱甲醇溶液旋涂在整个芯片表面，旋涂速度为2500rpm，时间为10秒。CBMA甜菜碱的结构为：
将芯片迅速转移至18mW/cm2、365nm紫外光下照射5分钟，上一步中未与SBMA甜菜碱反应的区域与CBMA发生接枝聚合反应，形成抗生物污染并可功能化的阵列区域。用超纯水洗净后得到全芯片抗生物污染、阵列区域可功能化的生物芯片。
实施例2：一种区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法
将1cm×1cm聚二甲基硅氧烷基片置于5%(v/v)的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，25℃反应2小时，用50%的甲醇水溶液洗净并干燥。3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的结构为：
将30g/L抗生物污染单体—甲基丙烯酸甘油酯单体的甲醇/水(甲醇/水=1/1，v/v)溶液旋涂于芯片表面，旋涂速度为1500 rpm，时间为60秒。甲基丙烯酸甘油酯的结构为：
将芯片表面铺上带有阵列图案的掩膜，转移至20mW/cm2、365nm紫外光下，紫外光透过掩膜照射在芯片表面5分钟，引发甲基丙烯酸甘油酯与芯片表面的接枝聚合形成抗生物污染非阵列区域。芯片表面用50%的甲醇水溶液洗净后，将60g/L的抗生物污染并可功能化的单体—2-羧基-N，N-二甲基-N-（丙烯酰氨基丙基）甲铵盐甜菜碱的甲醇/水(甲醇/水=1/1，v/v)溶液旋涂在整个芯片表面，旋涂速度为1500 rpm，时间为20秒。2-羧基-N，N-二甲基-N-（丙烯酰氨基丙基）甲铵盐甜菜碱的结构为：
将芯片迅速转移至18mW/cm2、365nm紫外光下照射3分钟，上一步中未与甲基丙烯酰胺磺酸基甜菜碱反应的区域与2-羧基-N，N-二甲基-N-（丙烯酰氨基丙基）甲铵盐甜菜碱发生接枝聚合反应，形成抗生物污染并可功能化的阵列区域。用50%甲醇的水溶液洗净后得到全芯片抗生物污染、阵列区域可功能化的生物芯片。
实施例3：一种区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法
将经过Piranha溶液(H2SO4/H2O2=4/1，v/v)清洗后的1cm×1cm玻璃片置于2%(v/v)的3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液中，70℃反应5小时，用甲苯洗净并在120℃真空干燥1小时。3-氨丙基三乙氧基硅烷的结构为：
将芯片浸入10%(v/v)的甲基丙烯酸缩水甘油酯的丙酮溶液中，25℃反应8小时，用丙酮洗净并干燥。甲基丙烯酸缩水甘油酯的结构为：
将4%（v/v）的抗生物污染单体—甲基丙烯酸羟乙酯的甲醇溶液旋涂于芯片表面，旋涂速度为2500 rpm，时间为10秒。甲基丙烯酸羟乙酯的结构为：
将芯片表面铺上带有阵列图案的掩膜，转移至15mW/cm2、365nm紫外光下，紫外光透过掩膜照射在芯片表面5分钟，引发甲基丙烯酸羟乙酯与芯片表面的接枝聚合形成非阵列区域。芯片表面用超纯水（50%甲醇水溶液）洗净后,将30g/L的抗生物污染并可功能化的单体—2-羧基-N，N-二甲基-N-（丙烯酰氨基丙基）甲铵盐甜菜碱的甲醇溶液旋涂在整个芯片表面，旋涂速度为3000 rpm，时间为10秒。将芯片迅速转移至18mW/cm2、365nm紫外光下照射3分钟，上一步中未与甲基丙烯酸羟乙酯反应的区域与2-羧基-N，N-二甲基-N-（丙烯酰氨基丙基）甲铵盐甜菜碱发生接枝聚合反应，形成抗生物污染并可功能化的阵列区域。用50%的甲醇水溶液洗净后得到全芯片抗生物污染、阵列区域可功能化的生物芯片。
实施例4：一种区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法
将经过Piranha溶液(H2SO4/H2O2=4/1，v/v)清洗后的1cm×1cm玻璃片置于2%(v/v)的3-氨丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液，70℃反应5小时，用甲苯洗净后140℃真空干燥1小时。3-氨丙基三甲氧基硅烷的结构为：
将芯片浸入5%(v/v)的丙烯酸缩水甘油酯的异丙醇溶液中，55℃反应5小时，用异丙醇洗净并干燥。丙烯酸缩水甘油酯的结构为：
将40g/L的抗生物污染单体——丙烯酸乙氧基五缩乙二醇酯的乙醇/水(乙醇/水=1/1，v/v)溶液旋涂于芯片表面，旋涂速度为3000 rpm，时间为15秒。丙烯酸乙氧基五缩乙二醇酯的结构为：
将芯片表面铺上带有阵列图案的掩膜，转移至14mW/cm2、365nm紫外光下，紫外光透过掩膜照射在芯片表面2分钟，引发丙烯酸乙氧基五缩乙二醇酯与芯片表面的接枝聚合反应形成非阵列区域。芯片表面用超纯水（50%甲醇水溶液）洗净后将40g/L的抗生物污染并可功能化的单体—CBMA甜菜碱的乙醇/水(乙醇/水=1/1，v/v)溶液旋涂在整个芯片表面，旋涂速度为3000 rpm，时间为15秒。将芯片迅速转移至18mW/cm2、365nm紫外光下照射2分钟，上一步中未与丙烯酸乙氧基五缩乙二醇酯反应的区域与CBMA甜菜碱发生接枝聚合反应，形成抗生物污染并可功能化的阵列区域。用超纯水洗净后得到全芯片抗生物污染、阵列区域可功能化的生物芯片。
实施例5：一种区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法
将经过Piranha溶液(H2SO4/H2O2=4/1，v/v)清洗后的1cm×1cm玻璃片置于2%(v/v)的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷甲苯溶液中，25℃反应12小时，用甲苯洗净后140℃干燥1小时。3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的结构为：
将芯片浸入10%(v/v)的三乙烯四胺的异丙醇溶液中，35℃反应2小时，用异丙醇洗净并干燥。三乙烯四胺的结构为：
将芯片浸入10%(v/v)的甲基丙烯酸缩水甘油酯的异丙醇溶液中，55℃反应5小时，用异丙醇洗净并干燥。将80g/L的抗生物污染单体—2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱甜菜碱的甲醇溶液旋涂于芯片表面，旋涂速度为3000 rpm，时间为10秒。2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱甜菜碱的结构为：
将芯片表面铺上带有阵列图案的掩膜，转移至10mW/cm2、365nm紫外光下，紫外光透过掩膜照射在芯片表面5分钟，引发2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱甜菜碱与芯片表面的接枝聚合反应形成非阵列区域。芯片表面用50%甲醇水溶液洗净后将40g/L的抗生物污染并可功能化的单体—CBMA甜菜碱的甲醇溶液旋涂在整个芯片表面，旋涂速度为2000rpm，时间为10秒。将芯片迅速转移至15mW/cm2、365nm紫外光下照射3分钟，上一步中未与2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱甜菜碱反应的区域与CBMA甜菜碱发生接枝聚合反应，形成抗生物污染并可功能化的阵列区域。用超纯水洗净后得到全芯片抗生物污染、阵列区域可功能化的生物芯片。
实施例6：一种区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法
将1cm×1cm聚二甲基硅氧烷置于1% (v/v)的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷甲醇溶液中，25℃反应2小时，用甲醇洗净并干燥。再将芯片浸入10% (v/v) 1,4-二氨基丁烷的乙醇溶液中，35℃反应2小时，用乙醇洗净并干燥。二氨基丁烷的结构为：
将芯片浸入5% (v/v)的甲基丙烯酸缩水甘油酯的异丙醇溶液中，55℃反应5小时，用异丙醇洗净并干燥。将5% (v/v)的抗生物污染单体—丙烯酸甘油酯的乙醇溶液旋涂于芯片表面，旋涂速度为2500rpm，时间为10秒。丙烯酸甘油酯的结构为：
将芯片表面铺上带有阵列图案的掩膜，转移至14mW/cm2、365nm紫外光下，紫外光透过掩膜照射在芯片表面3分钟，引发丙烯酸甘油酯与芯片表面的接枝聚合反应形成非阵列区域。芯片表面用50%甲醇水溶液洗净后将40g/L的抗生物污染并可功能化的单体—CBMA甜菜碱的甲醇溶液旋涂在整个芯片表面，旋涂速度为2500rpm，时间为15秒。将芯片迅速转移至10mW/cm2、365nm紫外光下照射3分钟，上一步中未与丙烯酸甘油酯反应的区域与CBMA甜菜碱发生接枝聚合反应，形成抗生物污染并可功能化的阵列区域。用超纯水洗净后得到全芯片抗生物污染、阵列区域可功能化的生物芯片。
实施例7：一种区域选择性抗生物污染阵列芯片的应用
芯片的制备方法同实施例1。将制得的芯片置于新鲜配置的30 mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和15 mM N-羟基琥珀酰亚胺（溶于10 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液）的混合液（pH=5）中活化芯片表面羧基基团，15分钟后用PBS缓冲溶液洗净芯片。
将洗净后的芯片分为三组，分别置于1000 μL 100 μg/mL的抗甲胎蛋白、1000μL 1×10-5 M/mL 5’-NH2-GGTTGGTGTGGTTGG-3’溶液、异硫氰酸荧光素标记的金纳米粒子（5 nm直径，浓度1×10-4%）的硼砂缓冲溶液(pH=9)中，恒温震荡箱中30℃反应，得到抗体阵列、DNA阵列、金纳米粒子阵列。
将金纳米粒子阵列芯片置于荧光显微镜488nm激发光下，可观察阵列区域处绿色荧光显示的阵列形貌；在抗体阵列表面滴加含有异硫氰酸荧光素标记的甲胎蛋白的血液，反应10分钟后，用PBS缓冲溶液冲洗芯片，置于荧光显微镜488nm激发光下，可观察阵列区域处绿色荧光显示的阵列形貌；将DNA阵列芯片表面滴加含有羧基四甲基罗丹明标记的凝血酵素的血液，反应10分钟后，用PBS缓冲溶液冲洗芯片，置于荧光显微镜543nm激发光下，可观察阵列区域处红色荧光显示的阵列形貌。分别将阵列形貌拍照，测量荧光强度。将芯片置于原子力显微镜下扫描，测量阵列的表面形貌。
实施例8：抗生物污染芯片的表征
紫外可见光度法标准曲线的制作：
配置1 mg/mL的牛血清白蛋白（全组分BSA）母液，用PBS溶液稀释至0.05 mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL、0.10 mg/mL、0.11mg/mL、0.12mg/mL、0.13mg/mL、0.14mg/mL、0.15 mg/mL。浓度为0 mg/mL 的溶液为校准归零液。将紫外可见分光光度计校准并归零，从低到高依次取不同浓度的溶液1 mL 于比色皿中，测定278 nm 处吸光度。结果重复3遍，取平均值。以蛋白浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线并拟合，得到吸光度对应蛋白浓度关系为： A= 0.56×C-0.008，R2=0.9952。
不同抗生物污染单体接枝后抗生物污染性能测试：
芯片的制备方法同实施例1。取大小为2.5×2.5cm、分别接枝了3-[[2-( 甲基丙烯酰氧基)乙基](二甲基)-铵]-1-丙磺酸（样品1）、2-羧基-N，N-二甲基-N-（2’-甲基丙烯酰氧基乙基）乙铵盐（样品2）、丙烯酸乙氧基五缩乙二醇酯（样品3）、甲基丙烯酸羟乙酯（样品4）、丙烯酸甘油酯（样品5）的硅片，表面滴加200 μL 0.01 mg/mL 的BSA溶液，室温下静置1小时后，收集表面剩余溶液，浓缩至15 μL，经紫外可见光度法测得吸光度分别为A1= 0.060；A2= 0.059；A3= 0.051；A4= 0.049；A5=0.045；对应的BSA浓度为C1= 0.1214 mg/mL；C2= 0.1196 mg/mL；C3= 0.1054 mg/mL；C4= 0.1018 mg/mL；C5= 0.0946 mg/mL；经计算，表面接枝不同组分的芯片表面对BSA的吸附量分别为：3-[[2-( 甲基丙烯酰氧基)乙基](二甲基)-铵]-1-丙磺酸28.64 ng/cm2, 2-羧基-N，N-二甲基-N-（2’-甲基丙烯酰氧基乙基）乙铵盐32.96 ng/cm2, 丙烯酸乙氧基五缩乙二醇酯 67.04 ng/cm2, 甲基丙烯酸羟乙酯75.68 ng/cm2，丙烯酸甘油酯92.96 ng/cm2。

Claims (15)

1.一种抗生物污染阵列芯片的制备方法1，包括以下步骤：
第一步，将清洗后的玻璃或硅片或聚二甲基硅氧烷芯片置于含不饱和键的硅烷偶联剂溶液里浸泡一定时间后，取出、干燥；
第二步，将一种含有抗生物污染单体的溶液旋涂于芯片表面，紫外光透过掩膜照射在芯片表面，引发该单体与芯片表面的接枝聚合反应，光照部分形成抗生物污染的非阵列区域，未光照部分不发生反应；用50%甲醇水溶液清洗芯片，洗去未反应的单体；
第三步，将另外一种抗生物污染并且可功能化单体的溶液旋涂在整个芯片表面，紫外光照射下，第二步中未与抗生物污染单体反应的区域与该抗生物污染并且可功能化单体发生接枝聚合反应，形成抗生物污染并可功能化的阵列区域，洗净后得到全芯片抗生物污染、阵列区域可功能化的生物芯片；
第四步，将如蛋白质、基因等生物组分，通过偶联反应固定在阵列区域表面，制得具有抗生物污染表面的新型生物芯片。
2.一种抗生物污染阵列芯片的制备方法2，包括以下步骤：
第一步，将清洗后的玻璃或硅片或聚二甲基硅氧烷芯片，置于氨基硅烷偶联剂溶液里浸泡一定时间后，洗净、干燥；
第二步，将芯片浸入含有丙烯酸缩水甘油酯结构的试剂溶液中，在一定的条件下反应后，洗净、干燥；
第三步，将一种含有抗生物污染单体的溶液旋涂于芯片表面，紫外光透过掩膜照射在芯片表面，引发该单体与芯片表面的接枝聚合反应，光照部分形成抗生物污染的非阵列区域，未光照部分不发生反应；用50%甲醇水溶液清洗芯片，洗去未反应的单体；
第四步，将另外一种抗生物污染并且可功能化单体的溶液旋涂在整个芯片表面，紫外光照射下，第三步中未与抗生物污染单体反应的区域与该抗生物污染并且可功能化单体发生接枝聚合反应，形成抗生物污染并可功能化的阵列区域，洗净后得到全芯片抗生物污染、阵列区域可功能化的生物芯片；
第五步，将如蛋白质、基因等生物组分，通过偶联反应功能化在阵列区域表面，制得具有抗生物污染表面的新型生物芯片。
3. 一种抗生物污染阵列芯片的制备方法3，包括以下步骤：
第一步，将清洗后的玻璃或硅片或聚二甲基硅氧烷芯片，置于含环氧基团的硅烷偶联剂溶液里浸泡一定时间后，洗净、干燥；
第二步，将芯片浸入含有两个或两个以上伯胺基团试剂的溶液中，在一定的反应条件下反应后，洗净、干燥；
第三步，将芯片浸入含有丙烯酸缩水甘油酯结构试剂的溶液中，在一定的反应条件下反应后，洗净、干燥；
第四步，将一种含有抗生物污染单体的溶液旋涂于芯片表面，紫外光透过掩膜照射在芯片表面，引发该单体与芯片表面的接枝聚合反应，光照部分形成抗生物污染的非阵列区域，未光照部分不发生反应；用50%甲醇水溶液清洗芯片，洗去未反应的单体；
第五步，将另外一种抗生物污染并且可功能化单体的溶液旋涂在整个芯片表面，紫外光照射下，第四步中未与抗生物污染单体反应的区域与该抗生物污染并且可功能化单体发生接枝聚合反应，形成抗生物污染并可功能化的阵列区域，洗净后得到全芯片抗生物污染、阵列区域可功能化的生物芯片；
第六步，将如蛋白质、基因等生物组分，通过偶联反应功能化在阵列区域表面，制得具有抗生物污染表面的新型生物芯片。
4.如权利1所述的抗生物污染阵列芯片的制备方法1，其特征在于：含不饱和键的硅烷偶联剂的结构为以下三类中的任意一种或几种：
其中R为Me或Et，R’为H或Me，n为1-10的整数。
5.如权利2所述的区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法2，其特征在于：氨基硅烷偶联剂的结构为：
其中R为Me或Et，n为1-10的整数。
6.如权利3所述的区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法3，其特征在于：含环氧基团的硅烷偶联剂结构为：
其中R为Me或Et，n为1-10的整数。
7.如权利2或3所述的区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法2或3，其特征在于：与芯片表面反应的丙烯酸缩水甘油酯的结构为：
其中R为H或Me，反应时间为10分钟-24小时，反应温度为20℃-100℃，浓度为0.1%-50%，溶剂包括：丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、己烷，石油醚、环己烷、苯及其衍生物、烷基醚类中的一种或几种。
8.如权利3所述的区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法3，其特征在于：与芯片表面反应的伯胺基团试剂的结构为以下两类中任意一种或几种：
其中n为1-10的整数，反应时间为10分钟-24小时，温度为20℃-100℃，浓度为0.1%-50%，溶剂包括：丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙醚中的一种或几种。
9.如权利1、2或3所述的任意一项区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法，其特征在于：硅烷偶联剂与芯片的反应时间为5分钟-20小时，温度为25℃-80℃，浓度为0.1%-30%，溶剂包括：苯、甲苯、丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇、四氢呋喃中的一种或几种。
10.如权利1、2或3所述的任意一项区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法，其特征在于：抗生物污染单体包括下面列举的五类中的任意一种或几种：
（1）丙烯酸磺酸基甜菜碱类化合物
其中x为2-10的整数，y为2、3或4，R为H或者Me；
（2）丙烯酸磷酸基甜菜碱类化合物
其中x为2-18的整数，R为H或者Me；
（3）丙烯酸乙二醇酯类化合物
其中x为2-10的整数，R为H或者Me；
（4）丙烯酸羟基酯类化合物
其中x为1-10的整数，R为H或者Me；
（5）丙烯酸甘油酯类化合物
其中R为H或者Me。
11.如权利1、2或3所述的任意一项区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法，其特征在于：抗生物污染性能单体与芯片表面的接枝反应，其单体浓度为0.1%-50%，溶剂包括丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、己烷，石油醚、环己烷、苯及其衍生物、烷基醚类化合物中的一种或几种。
12.如权利1、2或3所述的任意一项区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法，其特征在于：抗生物污染并可功能化单体指下列丙烯酸甜菜碱类化合物中的任意一种或几种：
其中x为2、3或4，y为1、2或3，R为H或者Me。
13.如权利1、2或3所述的任意一项抗生物污染阵列芯片的制备方法，其特征在于：抗生物污染并可功能化单体与芯片表面的接枝反应，单体浓度为0.1%-50%，溶剂包括：N-甲基吡咯烷酮，二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃、水中的一种或几种。
14.如权利1、2或3所述的任意一项抗生物污染阵列芯片的制备方法，其特征在于：紫外光波长315-420nm，强度5-50mW/cm2，曝光时间0.5-10分钟。
15.如权利1、2或3所述的任意一项抗生物污染阵列芯片的制备方法，其特征在于：阵列的生物组分包括蛋白质、核酸、氨基酸、多糖或具有伯胺或仲胺的粒子；偶联反应发生在pH=7-10的缓冲溶液中，反应的时间为5-300分钟。
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