CN103233274A - 一种聚合物基三维生物芯片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种聚合物基三维生物芯片的制备方法属于生物芯片制备技术领域。本发明公开了一种利用表面活性接枝聚合技术制备生物组分含量可控的三维生物芯片的方法。以聚合物膜为基底，先通过UV照射在膜表面耦合上半频哪醇休眠基团，再通过可见光/紫外光接枝具有抗生物污染性能的单体，使表面具备抗生物污染性能，最后采用光掩膜在可见光/紫外光下再引发接枝单体混合溶液，单体混合溶液中含有可固定生物分子的功能性基团，最终得到厚度可控的表面功能性微凝胶阵列。利用该微阵列上的功能性基团与蛋白质、基因等生物组分结合，能形成价格低廉、工艺环保简便、阵点密度高，生物分子的密度高，荧光信号强的新型三维生物芯片，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物芯片制备技术领域，具体涉及光引发聚合物膜表面活性接枝聚合及共价固定基因、蛋白质及其他生物组分来制备生物芯片的方法。
背景技术
随着人类基因组计划的顺利完成，基因芯片技术得到进一步的完善和发展。然而，很多研究表明：仅从基因组学的研究并不能完整得到生物功能的信息。尽管基因芯片在生物医学研究领域获得了广泛的应用，但它只能检测DNA和RNA，这种以核酸为基础的芯片检测只能间接提供蛋白质的信息。因此研究者们将研究聚焦到了蛋白质芯片、糖芯片、细胞芯片上。蛋白质是生命活动体现者，多糖能一定程度地反应生命活动的水平，细胞是生物学机器。深入研究生物芯片，使其更好的运用于医学和生物研究，是目前生物芯片技术研究和开发的重点内容。
生物芯片技术利用了特定功能性基团与生物组分化学键合的特性，在载体表面通过不同的方式连接上氨基、羧基、醛基、羟基、巯基、环氧基等基团后，使表面与DNA、抗体、多肽等生物组分发生化学反应，最终连接上生物组分形成生物芯片。生物芯片技术的优点主要体现在：所需的生物组分含量剂量少；能够快速、高通量定量分析样品。
生物芯片技术本身也面临着诸多函待解决的问题：（1）生物芯片载体往往亲水性不够好，极易发生生物组分的吸附，及表面被生物组分提前污染，导致后续试验受到影响，同时荧光背景增大，不利医学观察；（2）表面二维结构决定了能结合生物组分的量极为有限，无法形成大容量的生物组分容器，导致荧光强度不高，不利于医学观察；（3）生物芯片制作速度很慢，这取决于传统的点样机将微升至纳升的样品加到芯片载体表面的速度，对仪器的依赖性太强；（4）生物芯片在灵敏性、可重复性方面有待进一步提高；（5）昂贵的精密点样设备一定程度上限制了生物芯片的发展；（6）生物组分样品来源不足；等等。
从医学观察的角度来看，选择一个理想的芯片载体以降低其背景强度，增加生物组分的连接容量就显得尤为重要。
目前常用的生物芯片载体大多是无机材料，如硅片、玻片和金属等，这些材料具有表面平整、不易变形、荧光本底低的优点。更重要的是，对于传统的无机和金属材料，由于表面高活性羟基，氢或配位点的存在，已经有一套成熟的实验室和工业表面化学修饰方法，并被广泛用于生物芯片的表面处理。如用碱液处理过的玻璃片吸附聚赖氨酸以引入胺基；用硅烷偶联剂在玻璃片表面引入胺基、醛基等官能团。但是，与无机载体相比，合成高分子载体具有低比重、柔性、低成本、易加工成型等优良特性，更适于大规模工业化生产及与微流体装置整合为芯片实验室，有替代无机基材的趋势，已逐渐成为发展/实用生物芯片载体的主体方向。虽然在传统的Soμthern印迹法中常用的硝酸纤维素薄膜、尼龙膜等也已被用于芯片载体，并且这些膜材料由于多孔性而能大大提高生物分子的吸附量，但是也存在微阵列点易扩散、阵点密度低、背景荧光随检测次数增强、杂交速度慢的缺点，制约了其实际应用。因此，目前发展的聚合物载体都为致密的实性材料，常用的基材为环烯烃共聚物COC、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA和聚碳酸酯PC等。
因此，有必要设计合成一种阵点密度高、低背景、高荧光强度的生物芯片载体，合成生物芯片具备更好的医学观察特征。
发明内容
为克服上述现有技术中的缺陷，本发明提供了一种聚合物基三维生物芯片，芯片载体以聚合物为基体，由紫外/可见光引发活性聚合形成的多层聚合物复合膜，结构为三维凝胶微阵列结构，具有抗生物组分污染的特性，同时能够连接大容量的生物组分，最终得到低背景、高强度的生物芯片。该生物芯片的制备方法简便，设备要求低，价格低廉；芯片上的生物分子密度高，背景强度低，荧光信号强，利于医学观察和科学研究。
为了实现上述发明任务，本发明提供的技术方案如下：
（1）将光引发剂的溶液涂覆在聚合物基材表面或将聚合物基材浸渍在光引发剂溶液中，通过紫外/可见光照射激发使光引发剂夺取聚合物基材表面上的氢原子，并在表面引入半频哪醇休眠基。用大量溶剂洗去表面吸附或残留的光引发剂，干燥后低温储存。
（2）在紫外光/可见光照射下，半频哪醇休眠基团断裂，生成表面自由基和半频哪醇自由基。表面自由基在光照条件下不断引发抗生物污染性单体溶液进行可控聚合反应，形成第一层聚合物的接枝层，使表面具备抗核酸、蛋白质、多糖或细胞等生物吸附的性能。用大量溶剂彻底洗去表面吸附或残留的单体或游离的聚合物后，干燥后低温储存。
（3）在紫外光/可见光照射下，处于聚合物最外层的半频哪醇休眠基团再次断裂，生成表面自由基和半频哪醇自由基，在光照及光掩模的掩盖下，引发带有氨基、羧基、巯基、醛基、羟基、环氧基其中一种或多种基团的烯类单体和交联剂的单体溶液，发生活性自由基共聚合，形成第二层聚合物接枝层。该接枝层为三维微凝胶阵列，三维凝胶阵列中带有用于固定生物组分的功能性基团。用大量溶剂彻底洗去表面吸附或残留的单体或游离的聚合物后，干燥后低温储存。形成了三维高密度的生物芯片基材。
（4）配置一定浓度的生物组分溶液，将生物芯片基材至于溶液中或者将生物溶液平铺在基材表层，将在合适的温度和湿度下，芯片载体上的大量高密度的功能性基团与生物组分溶液结合，形成生物芯片。
所述光引发剂为(氧)硫杂蒽酮、(氧)硫杂蒽酮衍生物、二苯甲酮或二苯甲酮衍生物，用量为0.01 M～0.8 M。
所述紫外光（可见光）光源为可发射紫外光和可见光的设备，包括低压、中压、高压汞灯，碘钨灯，氙灯或卤素灯。光强值为0.1-20mW/cm2。
所述具备抗生物污染能力的单体包括：聚乙二醇类单体或两性离子类单体。
所述带有结合生物组分的功能性基团的烯类单体为含有环氧基团、氨基、羧基、酸酐基、醛基、巯基中一种或多种基团的单体；交联剂包括：PEG衍生物类交联剂及其他含有多个双键的交联剂单体；交联剂质量分数为0-60%。
所述聚合物基材为聚合物链含有碳－氢键的能够进行光引发剂夺氢反应的有机材料。包括聚合物基材为聚合物链含有碳－氢键的能够进行光引发剂夺氢反应的有机材料。包括聚乙烯PE、聚乙烯PE共聚物、聚丙烯PP、聚丙烯PP共聚物、聚对苯二甲酸乙二醇酯PET、聚对苯二甲酸丁二醇酯PBT、聚酰胺PAM、聚氯乙烯PVC、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA的共聚物、聚醋酸乙烯酯PVAC、聚碳酸酯PC、聚己内酯PCL、纤维素、纤维素酯、环氧树脂、环烯烃共聚物COC、含氟单体共聚物或聚二甲基硅氧烷PDMS。
所述聚合物基三维生物芯片的制备方法，其特征在于：三维微阵列底面形状可以是正方形、圆形或其他不规则图形，三维凝胶微阵列的底面积为1-10000μm2，厚度为100-4000nm。
所述聚合物基三维生物芯片的制备方法，其特征在于：生物组分为蛋白质、核酸、多糖或细胞。
该发明的优点在于：1）在聚合物表层接枝的第一层为抗生物污染层，使表面有很好的亲水性，具有很好的生物相容性，起到抗生物污染作用，使芯片背景强度低；2）接枝聚合的第二层带有大量具备固定生物分子功能的功能性基团，为三维微凝胶阵列层，厚度可控，功能性基团数量可控，可以通过增加厚度使生物组分的密度增大，从而增大生物芯片的荧光强度；3）连接生物组分的凝胶微阵列层与基材通过共价键连接，复合结构提高了交联网络的机械强度，克服了凝胶网络易被破坏的缺点，同时凝胶网络的吸水性有利于生物组分的活性和稳定，提高了生物组分的稳定性。
具体实施方式
实施例1：
将LDPE膜用丙酮（抽提及洗涤溶液）抽提72小时，室温晾干。将BOPP膜覆盖于LDPE膜上方，取150μL异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液（浓度为0.3M）注入双层聚合物之间，然后用两片石英片将双层聚合物压实，异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀分布在双层聚合物之间，形成三明治结构，移入高压汞灯照射装置（功率1000W，光照强度为10mW/cm2）中室温下照射180秒。将已引入能够继续引发自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提12小时以去除表面吸附的异丙基硫杂蒽酮，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液（单体分子量1100，溶液浓度0.3M）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），照射30min。将完成一层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL混合溶液（PEGDA、GMA、丙酮，质量比为1:2:2；PEGDA分子量为575）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，上层石英片为光掩模。移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射20-90min。形成40μm直径大小的圆形微阵列。将完成二层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将接枝后的复合膜置于700μL的500μg/mL的罗丹明荧光素标记的IgG蛋白溶液中，置于恒温振荡箱中反应。温度设为30°C，转速60r/min，反应时间2h。得到蛋白质芯片。水溶液冲洗后，于水溶液中浸泡30min。
将蛋白质芯片平铺在载玻片上，芯片表面保持湿润。在荧光显微镜下观察，并拍照，测量荧光强度。再将芯片置于原子力显微镜下扫描，测量凝胶阵列的形貌及其厚度。
该实例设有6组实验样本，不同之处在于第二层光掩模再引发接枝时间分别为20min、30min、40min、50min、60min、90min。请考虑补充其他的实验结果。例如机械强度，生物组分的活性和稳定，密度增大，生物相容性。其余实施例子修改参照本例子。
表1 不同时间对应凝胶层厚度及荧光强度差。
实施例2：
紫外可见分光光度法标准曲线的制作：
先配置1mg/mL的BSA母液，再用PBS溶液稀释为不同浓度。共9组，浓度分别是0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1000μg/mL。浓度为0μg/mL的溶液为校准归零液。
紫外可见分光光谱仪校准归零后，取不同浓度的溶液，1mL于比色皿，定点扫描278nm处吸收，即A278。结果重复3遍，取平均值。
利用得到的A278值用origin作图，并拟合，得到标准曲线A=（6.31475E-4）c – 0.01853。
不同抗生物污染性单体接枝前后抗生物污染性能测试：
分别将大小为9cm2的1张LDPE（1号）、1张LDPE-g-p（PEGMEMA）（2号）、1张LDPE-g-p(PEGDA)(3号）、1张LDPE-g-p(SBMA)(4号）、1张LDPE-g-p(CBAA)(5号）、1张LDPE-g-p(CBMA)(6号）放入烧杯中，加入5mL1mg/mL的BSA溶液，室温反应4h，冲膜溶液体积为5mL，如果无任何吸附，浓度将是500μg/mL。
PEGMEMA为单甲基聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯，数均分子量为950；PEGDA为聚乙二醇双甲基丙烯酸酯，数均分子量为575。SBMA为硫代甜菜碱丙烯酸甲酯，CBAA为羧基甜菜碱丙烯酰胺；CBMA为羧基甜菜碱丙烯酸甲酯。PEGDA、PEGMEMA为亲水性单体；SBMA、CBMA、CBAA为两性离子类单体。
测紫外A275值。得到A1=0.2332；A2=0.2895；A3=0.2853；A4=0.2862；A5=0.2880；A6=0.2874，带入标准曲线计算得出C1=398.9μg/mL；C2=488.1μg/mL；C3=481.5μg/mL；C4=482.9μg/mL；C5=485.7μg/mL；C6=484.8μg/mL。
经过计算得出吸附蛋白的质量。
表2 不同接枝层对应蛋白非特异性吸附量
由以上结果可以得知，接枝亲水性单体和接枝两性离子类单体后表面的抗生物污染性得到很明显的改善，基本达到了零污染表面的要求。
实施例3：
将PET膜用丙酮（抽提及洗涤溶液）抽提72小时，于25℃的真空烘箱中干燥2h。将BOPP膜覆盖于PET膜上方，取150μL二苯甲酮的丙酮溶液（浓度为0.3M）注入双层聚合物之间，然后用两片石英片将双层聚合物压实，二苯甲酮丙酮溶液均匀分布在双层聚合物之间，形成三明治结构，移入高压汞灯照射装置（功率1000W，光照强度为16mW/cm2）中室温下照射180秒。将已引入聚合休眠基的PET膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的二苯甲酮，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液（单体分子量1100，溶液浓度0.3M）滴于BOPP膜和接有休眠基的PET膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，移入氙灯照射装置（功率500W，光照强度为7mW/cm2），可见光照射30min。将完成一层接枝的PET膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL混合溶液（PEGDA、甜瓜醛、丙酮，丙酮质量百分数为40%，甜瓜醛质量百分比为40%，PEGDA的质量比例为20%；PEGDA分子量为575）滴于BOPP膜和接有休眠基的PET膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，上层石英片为光掩模。移入氙灯照射装置，室温下照射60min。形成长为20μm的正方形微阵列。将完成二层接枝的PET膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
复合膜共3组，分别将其置于1000μL的100μg/mL的异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白溶液、Cy2荧光素标记的mRNA、CAG-DsRed-1荧光标记的小鼠造血干细胞，置于恒温振荡箱中反应。温度设为30°C，转速60r/min，反应时间4h。分别得到了蛋白质芯片、基因芯片、细胞芯片。大量水溶液冲洗后，于水溶液中浸泡30min。
将蛋白质芯片、基因芯片、细胞平铺在载玻片上，芯片表面保持湿润。在荧光显微镜下观察，并拍照，测量荧光强度。再将芯片置于原子力显微镜下扫描，测量凝胶阵列的形貌及其厚度。测得厚度分别为1.54μm、1.62μm、1.45μm，荧光光强差（灰度单位）为54、37、67。
实施例4：
将COC膜用丙酮（抽提及洗涤溶液）抽提72小时，于25℃的真空烘箱中干燥2h。将BOPP膜覆盖于COC膜上方，取150μL异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液（浓度为0.3M）注入双层聚合物之间，然后用两片石英片将双层聚合物压实，异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀分布在双层聚合物之间，形成三明治结构，移入高压汞灯照射装置（功率1000W，光照强度为9mW/cm2）中室温下照射180秒。将已引入能够继续引发自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的异丙基硫杂蒽酮，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液（单体分子量1100，溶液浓度0.3M）滴于BOPP膜和接有休眠基的COC膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射30min。将完成一层接枝的COC膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL混合溶液（PEGDA、GMA、丙酮，质量比为1:11:8；PEGDA分子量分别为575、4105）滴于BOPP膜和接有休眠基的COC膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，上层石英片为光掩模。移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射60min。形成10μm直径大小的圆形微阵列。将完成二层接枝的COC膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将接枝后的复合膜置于700μL的500μg/mL的罗丹明荧光素标记的IgG蛋白溶液中，置于恒温振荡箱中反应。温度设为30°C，转速60r/min，反应时间为2h。得到蛋白质芯片。大量水溶液冲洗后，于水溶液中浸泡30min。
将蛋白质芯片平铺在载玻片上，芯片表面保持湿润。在荧光显微镜下观察，并拍照，测量荧光强度。
该实例设有2组实验样本，不同之处在于第二层使用的PEGDA分子量不同。分子量分别为575和4105。
表3 不同交联剂分子量对应荧光强度差。
实施例5：
将PVAc膜用丙酮（抽提及洗涤溶液）抽提72小时，于25℃的真空烘箱中干燥2h。将BOPP膜覆盖于PVAc膜上方，取150μL异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液（浓度为0.3M）注入双层聚合物之间，然后用两片石英片将双层聚合物压实，异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀分布在双层聚合物之间，形成三明治结构，移入高压汞灯照射装置（功率1000W，光照强度为9mW/cm2）中室温下照射180秒。将已引入聚合休眠基的PVAc膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的异丙基硫杂蒽酮，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液（单体分子量1100，溶液浓度0.3M）滴于BOPP膜和接有休眠基的PVAc膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，移入氙灯照射装置（功率500W，光照强度为10mW/cm2），室温下照射30min。将完成一层接枝的PVAc膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL混合溶液（PEGDA、GMA、丙酮，丙酮质量百分数为40%，GMA质量百分比为40%，PEGDA的质量比例为20%；PEGDA分子量为575）滴于BOPP膜和接有休眠基的PVAc膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，上层石英片为光掩模。移入氙灯照射装置，室温下照射60min。形成边为20μm，底面积为400μm2的正方形微阵列。将完成二层接枝的PVAc膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将接枝后的复合膜置于1000μL的100μg/mL的异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白溶液中，置于恒温振荡箱中反应。温度设为30°C，转速60r/min，反应时间4h。得到蛋白质芯片。大量水溶液冲洗后，于水溶液中浸泡30min。
将蛋白质芯片平铺在载玻片上，芯片表面保持湿润。在荧光显微镜下观察，并拍照，测量荧光强度。再将芯片置于原子力显微镜下扫描，测量凝胶阵列的形貌及其厚度。测得厚度为0.9μm，荧光光强差（灰度单位）为92。
实施例6：
将LDPE膜用丙酮（抽提及洗涤溶液）抽提72小时，于25℃的真空烘箱中干燥2h。将BOPP膜覆盖于LDPE膜上方，取150μL异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液（浓度为0.3M）注入双层聚合物之间，然后用两片石英片将双层聚合物压实，异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀分布在双层聚合物之间，形成三明治结构，移入高压汞灯照射装置（功率1000W，光照强度为9mW/cm2）中室温下照射180秒。将已引入能够继续引发自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的异丙基硫杂蒽酮，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL聚乙二醇双丙烯酸酯溶液（单体分子量575，溶液浓度0.5M）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，使石英片间液面严格平整。移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射10min。将完成一层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL混合溶液（PEGDA、GMA、丙酮，质量比为1:2:2；PEGDA分子量为575）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，上层石英片为光掩模。移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射10-60min。形成40μm直径大小的圆形微阵列。将完成二层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将接枝后的复合膜置于700μL的500μg/mL的罗丹明荧光素标记的IgG蛋白溶液中，置于恒温振荡箱中反应。温度设为30°C，转速60r/min，反应时间2h。得到蛋白质芯片。水溶液冲洗后，于水溶液中浸泡30min。
将蛋白质芯片平铺在载玻片上，芯片表面保持湿润。在荧光显微镜下观察，并拍照，测量荧光强度。再将芯片置于原子力显微镜下扫描，测量凝胶阵列的形貌及其厚度。
该实例设有5组实验样本，不同之处在于第二层光掩模再引发接枝时间分别为10min、20min、30min、40min、50min。
表4 不同时间对应凝胶层厚度及荧光强度差。
实施例7：
将BOPP膜用丙酮（抽提及洗涤溶液）抽提72小时，于25℃的真空烘箱中干燥2h。将一张BOPP膜覆盖在另一张BOPP膜上方，取150μL氧杂蒽酮的丙酮溶液（浓度为0.3M）注入双层聚合物之间，然后用两片石英片将双层聚合物压实，氧杂蒽酮丙酮溶液均匀分布在双层聚合物之间，形成三明治结构，移入高压汞灯照射装置（功率1000W，光照强度为1mW/cm2）中室温下照射540秒。将已引入能够继续引发自由基聚合休眠基的BOPP膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的氧杂蒽酮，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液（单体分子量1100，溶液浓度0.3M）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，然后用两片石英片压实，移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射30min。将完成一层接枝的下层的BOPP膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL混合溶液（PEGDA、GMA、丙酮，丙酮质量百分数为40%，GMA质量百分比为40%，PEGDA的质量比例为20%，PEGDA分子量为575）滴于BOPP膜和接有休眠基的BOPP膜之间，然后用两片石英片压实，上层石英片为光掩模。移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射60min。形成直径为1μm的圆形微阵列。将完成二层接枝的BOPPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将接枝后的复合膜置于700μL的200μg/mL的异硫氰酸荧光素标记的人血清白蛋白溶液中，置于恒温振荡箱中反应。温度设为30°C，转速60r/min，反应时间2h。得到蛋白质芯片。大量水溶液冲洗后，于水溶液中浸泡30min。
将蛋白质芯片平铺在载玻片上，芯片表面保持湿润。在荧光显微镜下观察，并拍照，测量荧光强度。再将芯片置于原子力显微镜下扫描，测量凝胶阵列的形貌及其厚度，测得厚度为1.55μm，荧光光强差（灰度单位）为112。
实施例8：
将LDPE膜用丙酮（抽提及洗涤溶液）抽提72小时，于25℃的真空烘箱中干燥2h。将BOPP膜覆盖于LDPE膜上方，取150μL异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液（浓度为0.3M）注入双层聚合物之间，然后用两片石英片将双层聚合物压实，异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀分布在双层聚合物之间，形成三明治结构，移入高压汞灯照射装置（功率1000W，光照强度为10mW/cm2）中室温下照射180秒。将已引入能够继续引发自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的异丙基硫杂蒽酮，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL聚乙二醇双丙烯酸酯溶液（单体分子量575，溶液浓度0.5M）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，并额外施加夹持力，使石英片间液面严格平整。移入氙灯照射装置（功率500W，光照强度为10mW/cm2），室温下照射10min。将完成一层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL混合溶液（PEGDA、GMA、丙酮，质量比为1:2:2；PEGDA分子量为575）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，上层石英片为光掩模。移入氙灯照射装置（功率500W，光照强度为10mW/cm2），室温下照射10-50min。形成40μm直径大小的圆形微阵列。将完成二层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将接枝后的复合膜置于700μL的500μg/mL的罗丹明荧光素标记的IgG蛋白溶液中，置于恒温振荡箱中反应。温度设为30°C，转速60r/min，反应时间2h。得到蛋白质芯片。大量水溶液冲洗后，于水溶液中浸泡30min。
将蛋白质芯片平铺在载玻片上，芯片表面保持湿润。在荧光显微镜下观察，并拍照，测量荧光强度。再将芯片置于原子力显微镜下扫描，测量凝胶阵列的形貌及其厚度。
该实例设有5组实验样本，不同之处在于第二层光掩模再引发接枝时间分别为10min、20min、30min、40min、50min。
表5 不同时间对应凝胶层厚度及荧光强度差。
实施例9：
将LDPE膜用丙酮（抽提及洗涤溶液）抽提72小时，于25℃的真空烘箱中干燥2h。将BOPP膜覆盖于LDPE膜上方，取150μL异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液（浓度为0.3M）注入双层聚合物之间，然后用两片石英片将双层聚合物压实，异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀分布在双层聚合物之间，形成三明治结构，移入高压汞灯照射装置（功率1000W，光照强度为10mW/cm2）中室温下照射180秒。将已引入能够继续引发自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的异丙基硫杂蒽酮，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液（单体分子量1100，溶液浓度0.3M）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射30min。将完成一层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL混合溶液（PEGDA、GMA、丙酮，质量比为1:2:2；PEGDA分子量为575）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，上层石英片为光掩模。移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射60min。形成40μm直径大小的圆形微阵列。将完成二层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
另一组实验样本则省略第一层接枝的步骤，无抗生物污染层的LDPE表面直接接枝带环氧基团微阵列。
将两组接枝后的膜置于700μL的500μg/mL的罗丹明荧光素标记的IgG蛋白溶液中，置于恒温振荡箱中反应。温度设为30°C，转速60r/min，反应时间为2h。得到蛋白质芯片。大量水溶液冲洗后，于水溶液中浸泡30min。
将蛋白质芯片平铺在载玻片上，芯片表面保持湿润。在荧光显微镜下观察，并拍照，测量荧光强度差。
该实例设有2组实验样本，不同之处在于有无第一层的抗生物污染层。
表6 有无抗生物污染层对应的荧光强度差。
实施例10：
将LDPE膜用丙酮（抽提及洗涤溶液）抽提72小时，于25℃的真空烘箱中干燥2h。将BOPP膜覆盖于LDPE膜上方，取150μL异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液（浓度为0.3M）注入双层聚合物之间，然后用两片石英片将双层聚合物压实，异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀分布在双层聚合物之间，形成三明治结构，移入高压汞灯照射装置（功率1000W，光照强度为10mW/cm2）中室温下照射180秒。将已引入能够继续引发自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的异丙基硫杂蒽酮，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液（单体分子量1100，溶液浓度0.3M）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射30min。将完成一层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL混合溶液（PEGDA质量比为20%， GMA的质量比分别为20%、30%、40%、50%、60%，余量为丙酮； PEGDA分子量为575）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，上层石英片为光掩模。移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射60min。形成40μm直径大小的圆形微阵列。将完成二层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将接枝后的复合膜置于700μL的500μg/mL的罗丹明荧光素标记的IgG蛋白溶液中，置于恒温振荡箱中反应。温度设为30°C，转速60r/min，反应时间2h。得到蛋白质芯片。去离子水冲洗后，于去离子水中浸泡30min。
将蛋白质芯片平铺在载玻片上，芯片表面保持湿润。在荧光显微镜下观察，并拍照，测量荧光强度差。原子力显微镜扫描，测量凝胶层厚度。
该实例设有5组实验样本，不同之处在于第二层光掩模再引发接枝时混合溶液中，PEGDA质量比为20%， GMA的质量比分别为20%、30%、40%、50%、60%，余量为丙酮溶剂。
表7 不同时间对应凝胶层厚度及荧光强度差。
实施例11：
将LDPE膜用丙酮（抽提及洗涤溶液）抽提72小时，于25℃的真空烘箱中干燥2h。将BOPP膜覆盖于LDPE膜上方，取150μL异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液（浓度为0.3M）注入双层聚合物之间，然后用两片石英片将双层聚合物压实，异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀分布在双层聚合物之间，形成三明治结构，移入高压汞灯照射装置（功率1000W，光照强度为10mW/cm2）中照射180秒。将已引入能够继续引发自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的异丙基硫杂蒽酮，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液（单体分子量1100，溶液浓度0.3M）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射30min。将完成一层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL混合溶液（PEGDA、GMA、丙酮，质量比为1:2:2；PEGDA分子量为575）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，上层石英片为光掩模。移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射60min。形成40μm直径大小的圆形微阵列。将完成二层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将接枝后的复合膜置于700μL的500μg/mL的罗丹明荧光素标记的IgG蛋白溶液中，置于恒温振荡箱中反应。温度设为30°C，转速60r/min，反应时间分别为1h、2h、4h、6h、12h。得到蛋白质芯片。大量水溶液冲洗后，于水溶液中浸泡30min。
将蛋白质芯片平铺在载玻片上，芯片表面保持湿润。在荧光显微镜下观察，并拍照，测量荧光强度。
该实例设有5组实验样本，不同之处在于与IgG蛋白反应时间分别为1h、2h、4h、6h、12h。
表8 不同蛋白反应时间对应荧光强度差。
实施例12：
将LDPE膜用丙酮（抽提及洗涤溶液）抽提72小时，于25℃的真空烘箱中干燥2h。将BOPP膜覆盖于LDPE膜上方，取150μL异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液（浓度为0.3M）注入双层聚合物之间，然后用两片石英片将双层聚合物压实，异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀分布在双层聚合物之间，形成三明治结构，移入高压汞灯照射装置（功率1000W，光照强度为10mW/cm2）中室温下照射180秒。将已引入能够继续引发自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的异丙基硫杂蒽酮，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液（单体分子量1100，溶液浓度0.3M）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射30min。将完成一层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL混合溶液（PEGDA、GMA、丙酮，丙酮质量百分数为40%，单体质量百分比为60%，PEGDA的质量比例为20%；PEGDA分子量为575）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，上层石英片为光掩模。移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射60min。形成40μm直径大小的圆形微阵列。将完成二层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将接枝后的复合膜置于700μL的500pg/mL的罗丹明荧光素标记的IgG蛋白溶液中，置于恒温振荡箱中反应。温度设为30°C，转速60r/min，反应时间2h。得到蛋白质芯片。大量水溶液冲洗后，于水溶液中浸泡30min。
将蛋白质芯片平铺在载玻片上，芯片表面保持湿润。在荧光显微镜下观察，并拍照，荧光显微镜观察。结果显示500pg/mL浓度制备的蛋白质芯片强度差为8，依然能够满足观察要求。
实施例13：
将LDPE膜用丙酮（抽提及洗涤溶液）抽提72小时，于25℃的真空烘箱中干燥2h。将BOPP膜覆盖于LDPE膜上方，取150μL异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液（浓度为0.3M）注入双层聚合物之间，然后用两片石英片将双层聚合物压实，异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀分布在双层聚合物之间，形成三明治结构，移入高压汞灯照射装置（功率1000W，光照强度为10mW/cm2）中室温下照射180秒。将已引入能够继续引发自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的异丙基硫杂蒽酮，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液（单体分子量1100，溶液浓度0.3M）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射30min。将完成一层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL混合溶液（PEGDA、GMA、丙酮，丙酮质量百分数为40%，单体质量百分比为60%，PEGDA的质量比例分别为0%、12%、20%、30%、36%、50%、55%、60%；PEGDA分子量为575）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，上层石英片为光掩模。移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射60min。形成40μm直径大小的圆形微阵列。将完成二层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将接枝后的复合膜置于700μL的500μg/mL的罗丹明荧光素标记的IgG蛋白溶液中，置于恒温振荡箱中反应。温度设为30°C，转速60r/min，反应时间2h。得到蛋白质芯片。大量水溶液冲洗后，于水溶液中浸泡30min。
将蛋白质芯片平铺在载玻片上，芯片表面保持湿润。在荧光显微镜下观察，并拍照，测量荧光强度。再将芯片置于原子力显微镜下扫描，测量凝胶阵列的形貌及其厚度。
该实例设有8组实验样本，不同之处在于第二层光掩模再引发接枝时所用的溶液组分：PEGDA的质量比例分别为0%、12%、20%、30%、36%、50%、55%、60%；60%单体组分的余量为GMA单体，溶剂为丙酮。
表9为不同PEGDA和GMA百分数下对应凝胶层厚度及荧光强度差。
实施例14：
将PC膜用丙酮（抽提及洗涤溶液）抽提72小时，于25℃的真空烘箱中干燥2h。将BOPP膜覆盖于PC膜上方，取150μL二苯甲酮的丙酮溶液（浓度为0.3M）注入双层聚合物之间，然后用两片石英片将双层聚合物压实，二苯甲酮丙酮溶液均匀分布在双层聚合物之间，形成三明治结构，移入高压汞灯照射装置（功率1000W，光照强度为10mW/cm2）中室温下照射180秒。将已引入能够继续引发自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的二苯甲酮，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL聚乙二醇双丙烯酸酯溶液（单体分子量575，溶液浓度0.5M）滴于BOPP膜和接有休眠基的PC膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射30min。将完成一层接枝的PC膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL混合溶液（PEGDA、丙烯酸酐、丙酮，质量比为1:1:1；PEGDA分子量分别为575）滴于BOPP膜和接有休眠基的PC膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，上层石英片为光掩模。移入卤素灯照射装置（功率200W，光照强度为3mW/cm2），室温下照射60min。形成20μm直径大小的条纹状微阵列。将完成二层接枝的PC膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将接枝后的复合膜置于700μL的500μg/mL的Fitc荧光素标记的甘露糖溶液中，置于恒温振荡箱中反应。温度设为30°C，转速60r/min，反应时间为6h。得到糖芯片。大量水溶液冲洗后，于水溶液中浸泡30min。
将糖芯片平铺在载玻片上，芯片表面保持湿润。在荧光显微镜下观察，并拍照，测量荧光强度。将膜片置于原子力显微镜下，扫描得到厚度。
原子力显微镜下扫描得到厚度为1.13μm，荧光强度差（灰度单位）为58。
实施例15：
将PMMA膜用丙酮（抽提及洗涤溶液）抽提72小时，于25℃的真空烘箱中干燥2h。将BOPP膜覆盖于PMMA膜上方，取150μL异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液（浓度为0.3M）注入双层聚合物之间，然后用两片石英片将双层聚合物压实，异丙基硫杂蒽酮丙酮溶液均匀分布在双层聚合物之间，形成三明治结构，移入高压汞灯照射装置（功率1000W，光照强度为10mW/cm2）中室温下照射180秒。将已引入能够继续引发自由基聚合休眠基的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的异丙基硫杂蒽酮，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液（单体分子量1100，溶液浓度0.3M）滴于BOPP膜和接有休眠基的LDPE膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，移入氙灯照射装置（功率500W，光照强度为10mW/cm2），室温下照射30min。将完成一层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将150μL混合溶液（有四组：PEGDA、GMA、丙酮，质量比为1:2:2；二乙烯基苯、GMA、丙酮，质量比为1:2:2；TMPTA、GMA、丙酮，质量比为1:2:2;MBA、GMA、丙酮，质量比为1:2:2）滴于BOPP膜和接有休眠基的PMMA膜之间，其中BOPP膜位于三明治结构上方，然后用两片石英片压实，上层石英片为光掩模。移入氙灯照射装置（功率500W，光照强度为10mW/cm2），室温下照射60min。形成40μm直径大小的圆形微阵列。将完成二层接枝的LDPE膜用丙酮抽提12小时，去除表面吸附的单体及均聚物，于25℃的真空烘箱中干燥2h。
将接枝后的复合膜置于700μL的500μg/mL的罗丹明荧光素标记的IgG蛋白溶液中，置于恒温振荡箱中反应。温度设为30°C，转速60r/min，反应时间2h。得到蛋白质芯片。大量水溶液冲洗后，于水溶液中浸泡30min。
将蛋白质芯片平铺在载玻片上，芯片表面保持湿润。在荧光显微镜下观察，并拍照，测量荧光强度。再将芯片置于原子力显微镜下扫描，测量凝胶阵列的形貌及其厚度。
该实例设有3组实验样本，不同之处在于第二层光掩模再引发接枝时所用的交联剂不同，分别是PEGDA、二乙烯基苯、TMPTA、MBA。
表10 不同交联剂对应凝胶层厚度及荧光强度差。
Claims (8)
1.一种聚合物基三维生物芯片的制备方法，包括以下步骤：
第一步，在UV照射下激发光引发剂，在聚合物膜表面共价连接光感应的半频哪醇休眠自由基；
第二步，在UV/可见光的照射下，表面休眠基可逆断裂/偶合，引发具备抗生物污染能力的单体发生表面活性接枝聚合，形成均匀平整的完全抗核酸、蛋白、多糖、细胞吸附的聚合物层；
第三步，在UV/可见光的照射下，光掩模遮盖下，继续利用第二步形成的抗污染层上的休眠基，实施二次区域选择性活性表面接枝聚合，将带有可结合生物组分的功能性基团的烯类单体与交联剂单体接枝共聚，形成功能性基团密度和接枝层高度可控的三维微阵列构造；
第四步，将膜置于生物组分溶液中反应，得到聚合物基三维生物芯片。
2.如权利要求1所述的聚合物基三维生物芯片的制备方法，其特征在于：光引发剂为（氧）硫杂蒽酮、（氧）硫杂蒽酮衍生物、二苯甲酮、二苯甲酮衍生物，浓度为0.01 M～0.8 M。
3.如权利要求1所述的聚合物基三维生物芯片的制备方法，其特征在于：所用光源为低压、中压、高压汞灯、碘钨灯、氙灯或卤素灯；光强值为0.1-20mW/cm2。
4.如权利要求1中所述聚合物基三维生物芯片的制备方法，其特征在于：具备抗生物污染能力的单体包括：聚乙二醇类单体或两性离子类单体。
5.如权利要求1中所述聚合物基三维生物芯片的制备方法，其特征在于：第三步中，带有结合生物组分的功能性基团的烯类单体为含有环氧基团、氨基、羧基、醛基、巯基、酸酐基中一种或多种基团的单体；交联剂为PEG衍生物类交联剂或含有多个双键的交联剂单体；交联剂质量分数为0-60%。
6.如权利要求1中所述聚合物基三维生物芯片的制备方法，其特征在于：聚合物基材为聚合物链含有碳－氢键的能够进行光引发剂夺氢反应的有机材料。包括聚乙烯PE、聚乙烯PE共聚物、聚丙烯PP、聚丙烯PP共聚物、聚对苯二甲酸乙二醇酯PET、聚对苯二甲酸丁二醇酯PBT、聚酰胺PAM、聚氯乙烯PVC、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA的共聚物、聚醋酸乙烯酯PVAC、聚碳酸酯PC、聚己内酯PCL、纤维素、纤维素酯、环氧树脂、环烯烃共聚物COC、含氟单体共聚物或聚二甲基硅氧烷PDMS。
7.如权利要求1中所述聚合物基三维生物芯片的制备方法，其特征在于：三维微阵列底面形状是正方形、圆形或不规则图形，三维凝胶微阵列的底面积为1-10000μm2，厚度为100-4000nm。
8.如权利要求1中所述聚合物基三维生物芯片的制备方法，其特征在于：生物组分包括：蛋白质、核酸、多糖或细胞。
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