CN104761745B - 一种三维生物芯片基片制备方法 - Google Patents

一种三维生物芯片基片制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三维生物芯片基片制备方法。生物芯片的基材可以是玻璃基片或聚合物基片，制备三维结构基片包括如下步骤：(1)在基片表面引入羟基，并硅烷化处理引入双键；(2)在双键化基材表面通过紫外光接枝，得到具有一定厚度表面含有环氧基团的基片；(3)将上述基片置于含氨基的溶液中反应，制得表面含有氨基的基片。通过该方法制备出的三维氨基基片探针固定量高，结合稳定，克服了传统的表面改性‑硅烷偶联剂法制备的二维基片探针固定量少，检出限高，结果不稳定等缺点，在生物芯片领域中有较好的应用前景。

Description

一种三维生物芯片基片制备方法
技术领域
本发明涉及具有三维结构的生物芯片基片的制备方法。
背景技术
生物芯片技术具有高通量、高集成、微型化、平行化、多样化和自动化等特点，自报道以来一直受到生物、医学领域的广泛关注，在体外诊断、基因组学、药物开发等方向均具有重要的应用前景。基材表面的化学处理是芯片制备的基础，合适的表面化学修饰策略也是实现高灵敏度芯片制备的最直接的途径。目前生物芯片常用的载体主要分为无机(硅片、玻片和金属等)及有机基材两类，通过对基材的适当处理，使用成熟的硅烷偶联剂表面改性方法，可以方便地引入醛基、氨基、环氧、巯基等多种单层二维表面官能团以固定DNA/蛋白分子。但是，该类表面存在不能高密度固定生物分子的缺点，灵敏度和重复性方面仍然面临巨大的挑战，也制约了生物芯片在临床常规诊断中的广泛应用。
与二维表面相比，具有三维表面结构的基材可以在垂直表面的方向上固定更多的生物分子，是实现生物分子在基材表面高密度固定化的基础。因此，有必要根据不同材质固相载体的特点开发合适的表面化学修饰策略，制备出具有表面三维结构的生物芯片基片，提高探针分子的固定密度，实现对被检测生物分子可重复的高灵敏度的定性和定量分析。
发明内容
1.本发明的目的是提供一种三维生物芯片基片制备方法。
2.本发明所提供的制备生物芯片基片的方法，包括如下步骤：(1)首先在基片表面引入羟基，然后硅烷化处理引入双键(2)在双键化基材表面通过紫外光接枝，得到具有一定厚度表面含有环氧基团的基片(3)将上述基片置于含氨基的溶液中反应，制得表面含有氨基的基片，为了方便下面表述，该方法记为I。
3.上述方法I中所述的基片表面引入羟基的处理工艺：
如果是玻璃基片，将玻片放入按氢氧化钾：水：异丙醇质量比为1:18:21配置的混合液中，超声5～90min，再用去离子水清洗3次，然后用丙酮清洗、晾干；
如果是聚合物基片，将聚合物基片在丙酮中清洗并晾干，将30wt％的过硫酸铵水溶液夹在双向拉伸的BOPP和聚合物膜中间，形成100nm～10μm的液层。然后用紫外灯在室温下从BOPP表面照射0.5～3min，将得到的改性聚合物膜用去离子水冲洗，并浸入超纯水中1～16h，用超纯水冲洗后室温晾干。
4.上述过程中所述聚合物基片为聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸甲酯的共聚物、环氧树脂(EP)、环烯烃共聚物(COC)或聚二甲基硅氧烷(PDMS)片基。
5.上述方法I中所述的表面双键化的工艺：配制乙烯基三甲氧基硅烷和冰醋酸的乙醇溶液，其中乙烯基三甲氧基硅烷的质量浓度为1-10％，冰醋酸的质量浓度为0.05％-0.2％，将表面活化的基片放入上述溶液中，浸泡10-30min，然后用乙醇清洗，吹干。
6.上述方法I中所述的通过光接枝法引入三维凝胶层的工艺：
①配置接枝混合溶液，包括光引发剂，聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)组成的单体，余量为溶剂；
②将接枝混合液滴在基片上，并用石英片覆盖在表面使接枝液均匀分布在基片上，置于紫外光下照射1～60min，之后将接枝基片用乙醇浸泡1～10h，晾干；
7.所述的接枝混合溶液中PEGDA：GMA的摩尔比为1：0.1～0.1：1，单体所占混合溶液的质量分数为5～80％；
所述的接枝混合溶液中的溶剂为丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃中的一种或两种以上的混合物；
所述的接枝混合溶液中的光引发剂为1-羟基环己基苯基甲酮、安息香双甲醚、2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮中的一种或两种以上的混合物，质量浓度为0.05～5％；
所述紫外光的波长为100～350nm，紫外光的强度为2000～12000μW/cm2。
8.上述方法I中所述的制备表面接有氨基的三维凝胶结构基片的工艺：配置质量浓度为0.01％～5％的含氨基化合物水溶液，将含有环氧基团的基片置于此溶液中浸泡0.5h～24h，用去离子水清洗3次后在室温下晾干。
9.上述方法I中所述的含氨基的化合物可以是乙醇胺、乙二胺、丙二胺、羟乙基乙二胺、异丙醇胺、丁醇胺、丝氨醇及三羟甲基氨基甲烷、壳聚糖(CTS)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸(PLL)中的一种或两种以上的混合物。
10.由上述任一所述方法制备得到的生物芯片基片也属于本发明的保护范围。
11.由上述任一所述基片制得的生物芯片也属于本发明的保护范围。
12.本发明的基片是一种三维凝胶结构表面具有氨基修饰的基片，固相载体可以是无机材料，也可以是聚合物膜。具体的说是先将固相载体经过表面改性处理，然后表面羟基化-表面烷基化-表面接枝三维凝胶层-最后通过环氧基活性基团接枝上富含氨基的分子，在基片上接枝形成的一定厚度的凝胶层，在生物芯片的点样过程中，可以在深度上固定更多量的探针，这样可以制备出固定密度高，检测灵敏度高的生物芯片基片。本发明基片针对不同的固相载体分别做了介绍，为不同应用领域生物芯片的制备提供了前提和依据，所述基片制备方法操作简单，探针固定固定效率高且重复性好。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制，在附图中：
图1是根据本发明实施例1制备的三维结构氨基化的玻璃基片，根据本发明实施例11进行的生物芯片点样固定后的扫描结果图。
图2是根据本发明实施例1制备的三维结构氨基化的玻璃基片，根据本发明实施例11进行的生物芯片点样固定后，经过包含5×SSC，0.1％SDS和1.0％BSA的清洗液清洗后的扫描结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
三维结构氨基化玻璃基片制备
(1)片基的羟基化：将玻片放在配置好的KOH，水，异丙醇(质量比1：18：21)的混合溶液中，超声15min，用去离子水清洗2次，再用丙酮清洗备用。
(2)片基的硅烷化：配制乙烯基三甲氧基硅烷和冰醋酸的乙醇溶液，其中乙烯基三甲氧基硅烷的质量浓度为1％，冰醋酸的质量浓度为0.1％，将表面活化的基片放入上述溶液中，浸泡30min，然后用乙醇清洗，吹干。
(3)片基的三维结构制备：配置光引发剂(1-羟基环己基苯基甲酮)、PEGDA和GMA的混合液，丙酮为溶剂，其中光引发剂的质量浓度为5％，PEGDA：GMA的摩尔比为10:1，单体所占混合溶液的质量分数为20％，将配置好的混合液滴到步骤2处理过的玻片上，在紫外灯下室温照射10min，用乙醇室温浸泡10h，晾干。
(4)片基三维结构表面氨基化：将步骤3中处理后的玻片置于PEI溶液中(质量浓度为0.5％)，室温浸泡30min，清洗。
实施例2
三维结构氨基化环烯烃共聚物(COC)基片制备
(1)片基的羟基化：将COC膜在乙醇中清洗并晾干，将30wt％的过硫酸铵水溶液夹在双向拉伸的BOPP和COC膜中间，形成大约0.5μm的液层。然后用紫外灯在室温下从BOPP表面照射2min，将得到的改性的COC膜用去离子水冲洗，并浸入超纯水中16h，用超纯水冲洗后室温晾干。
(2)片基的硅烷化：配制乙烯基三甲氧基硅烷和冰醋酸的乙醇溶液，其中乙烯基三甲氧基硅烷的质量浓度为3％，冰醋酸的质量浓度为0.05％，将表面活化的基片放入上述溶液中，浸泡25min，然后用乙醇清洗，吹干。
(3)片基的三维结构制备：配置光引发剂(1-羟基环己基苯基甲酮)、PEGDA和GMA的混合液，乙醇为溶剂，其中光引发剂的质量浓度为3％，PEGDA：GMA的摩尔比为9:2，单体所占混合溶液的质量分数为30％，将配置好的混合液滴到步骤2处理过的COC膜上，，在紫外光下室温照射15min，用乙醇室温浸泡8h，晾干。
(4)片基三维结构表面氨基化：将步骤3中处理后的COC膜置于PEI溶液中(质量浓度为0.01％)，室温浸泡24h，清洗。
实施例3
三维结构氨基化聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)基片制备
(1)片基的羟基化：将PMMA膜在乙醇中清洗并晾干，将30wt％的过硫酸铵水溶液夹在双向拉伸的BOPP和PMMA膜中间，形成大约0.5μm的液层。然后用紫外灯在室温下从BOPP表面照射3min，将得到的改性的PMMA膜用去离子水冲洗，并浸入超纯水中16h，用超纯水冲洗后室温晾干。
(2)片基的硅烷化：配制乙烯基三甲氧基硅烷和冰醋酸的乙醇溶液，其中乙烯基三甲氧基硅烷的质量浓度为5％，冰醋酸的质量浓度为0.08％，将表面活化的基片放入上述溶液中，浸泡20min，然后用乙醇清洗，吹干。
(3)片基的三维结构制备：配置光引发剂(1-羟基环己基苯基甲酮)、PEGDA和GMA的混合液，甲醇为溶剂，其中光引发剂的质量浓度为1％，PEGDA：GMA的摩尔比为8:3，单体所占混合溶液的质量分数为40％，将配置好的混合液滴到步骤2处理过的PMMA膜上，在紫外光下室温照射20min，用乙醇室温浸泡7h，晾干。
(4)片基三维结构表面氨基化：将步骤3中处理后的PMMA膜置于PEI溶液中(质量浓度为4％)，室温浸泡40min，清洗。
实施例4
三维结构氨基化聚碳酸酯(PC)基片制备
(1)片基的羟基化：将PC膜在乙醇中清洗并晾干，将30wt％的过硫酸铵水溶液夹在双向拉伸的BOPP和PC膜中间，形成大约0.5μm的液层。然后用紫外灯在室温下从BOPP表面照射1min，将得到的改性的PC膜用去离子水冲洗，并浸入超纯水中16h，用超纯水冲洗后室温晾干。
(2)片基的硅烷化：配制乙烯基三甲氧基硅烷和冰醋酸的乙醇溶液，其中乙烯基三甲氧基硅烷的质量浓度为7％，冰醋酸的质量浓度为0.12％，将表面活化的基片放入上述溶液中，浸泡15min，然后用乙醇清洗，吹干。
(3)片基的三维结构制备：配置光引发剂(1-羟基环己基苯基甲酮)、PEGDA和GMA的混合液，乙醇和甲醇的混合物为溶剂，其中光引发剂的质量浓度为0.5％，PEGDA：GMA的摩尔比为7:4，单体所占混合溶液的质量分数为50％，将配置好的混合液滴到步骤2处理过的PC膜上，在紫外光下室温照射30min，用乙醇室温浸泡5h，晾干。
(4)片基三维结构表面氨基化：将步骤3中处理后的PC膜置于PEI溶液中(质量浓度为3％)，室温浸泡60min，清洗。
实施例5
三维结构氨基化聚苯乙烯(PS)基片制备
(1)片基的羟基化：将PS膜在乙醇中清洗并晾干，将30wt％的过硫酸铵水溶液夹在双向拉伸的BOPP和PS膜中间，形成大约0.5μm的液层。然后用紫外灯在室温下从BOPP表面照射0.5min，将得到的改性的PS膜用去离子水冲洗，并浸入超纯水中16h，用超纯水冲洗后室温晾干。
(2)片基的硅烷化：配制乙烯基三甲氧基硅烷和冰醋酸的乙醇溶液，其中乙烯基三甲氧基硅烷的质量浓度为10％，冰醋酸的质量浓度为0.15％，将表面活化的基片放入上述溶液中，浸泡10min，然后用乙醇清洗，吹干。
(3)片基的三维结构制备：配置光引发剂(1-羟基环己基苯基甲酮)、PEGDA和GMA的混合液，用乙醇为溶剂，其中光引发剂的质量浓度为0.1％，PEGDA：GMA的摩尔比为6:5，单体所占混合溶液的质量分数为60％，将配置好的混合液滴到步骤2处理过的PS膜上，在紫外光下室温照射40min，用乙醇室温浸泡4h，晾干。
(4)片基三维结构表面氨基化：将步骤3中处理后的PS膜置于PEI溶液中(质量浓度为2％)，室温浸泡12h，清洗。
实施例6
三维结构氨基化环氧树脂(EP)基片制备
(1)片基的羟基化：将EP膜在乙醇中清洗并晾干，将30wt％的过硫酸铵水溶液夹在双向拉伸的BOPP和PS膜中间，形成大约0.5μm的液层。然后用紫外灯在室温下从BOPP表面照射3min，将得到的改性的EP膜用去离子水冲洗，并浸入超纯水中16h，用超纯水冲洗后室温晾干。
(2)片基的硅烷化：配制乙烯基三甲氧基硅烷和冰醋酸的乙醇溶液，其中乙烯基三甲氧基硅烷的质量浓度为6％，冰醋酸的质量浓度为0.2％，将表面活化的基片放入上述溶液中，浸泡15min，然后用乙醇清洗，吹干。
(3)片基的三维结构制备：配置光引发剂(1-羟基环己基苯基甲酮)、PEGDA和GMA的混合液，用乙醇为溶剂，其中光引发剂的质量浓度为0.05％，PEGDA：GMA的摩尔比为5:6，单体所占混合溶液的质量分数为70％，将配置好的混合液滴到步骤2处理过的EP膜上，在紫外光下室温照射60min，用乙醇室温浸泡2h，晾干。
(4)片基三维结构表面氨基化：将步骤3中处理后的EP膜置于PEI溶液中(质量浓度为1％)，室温浸泡16h，清洗。
实施例7
三维结构氨基化玻璃基片制备
(1)片基的羟基化：同实施例1中的步骤1。
(2)片基的硅烷化：同实施例1中的步骤2。
(3)片基的三维结构制备：配置光引发剂(1-羟基环己基苯基甲酮)、PEGDA和GMA的混合液，用二甲基甲酰胺为溶剂，其中光引发剂的质量浓度为5％，PEGDA：GMA的摩尔比为4:7，单体所占混合溶液的质量分数为80％，将配置好的混合液滴到步骤2处理过的玻片上，在紫外光下室温照射10min，用乙醇室温浸泡1h，晾干。
(4)片基三维结构表面氨基化：将步骤3中处理后的玻片置于羟乙基乙二胺溶液中(质量浓度为0.5％)，室温浸泡18h，清洗。
实施例8
三维结构氨基化玻璃基片制备
(1)片基的羟基化：同实施例1中的步骤1。
(2)片基的硅烷化：同实施例1中的步骤2。
(3)片基的三维结构制备：配置光引发剂(1-羟基环己基苯基甲酮)、PEGDA和GMA的混合液，用氯仿为溶剂，其中光引发剂的质量浓度为5％，PEGDA：GMA的摩尔比为4:7，单体所占混合溶液的质量分数为5％，将配置好的混合液滴到步骤2处理过的玻片上，在紫外光下室温照射1min，用乙醇室温浸泡6h，晾干。
(4)片基三维结构表面氨基化：将步骤3中处理后的玻片置于异丙醇胺溶液中(质量浓度为0.5％)，室温浸泡50min，清洗。
实施例9
三维结构氨基化环烯烃共聚物(COC)基片制备
(1)片基的羟基化：同实施例2中的步骤1。
(2)片基的硅烷化：同实施例2中的步骤2。
(3)片基的三维结构制备：配置光引发剂(1-羟基环己基苯基甲酮和安息香双甲醚的混合物)、PEGDA和GMA的混合液，用丙酮为溶剂，其中光引发剂的质量浓度为1％，PEGDA：GMA的摩尔比为3:8，单体所占混合溶液的质量分数为50％，将配置好的混合液滴到步骤2处理过的(COC)膜上，在紫外光下室温照射30min，在乙醇中室温浸泡4h，晾干。
(4)片基三维结构表面氨基化：将步骤3中处理后的COC膜置于乙醇胺的水溶液中(质量浓度为5％)，室温浸泡8h，清洗。
实施例10
三维结构氨基化聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)基片制备
(1)片基的羟基化：同实施例3中的步骤1。
(2)片基的硅烷化：同实施例3中的步骤2。
(3)片基的三维结构制备：配置光引发剂(2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮)、PEGDA和GMA的混合液，用乙醇为溶剂，其中光引发剂的质量浓度为0.5％，PEGDA：GMA的摩尔比为1:10，单体所占混合溶液的质量分数为50％，将配置好的混合液滴到步骤2处理过的玻片上，在紫外光下室温照射60min，乙醇室温浸泡4h，晾干。
(4)片基三维结构表面氨基化：将步骤3中处理后的PMMA膜置于乙二胺的水溶液中，室温浸泡10h，清洗。
实施例11
三维结构氨基化玻璃基片固定能力的检测
本实施例所用到的三维结构氨基化玻璃基片是按实施例1所述的方法制备的，本实施例是通过Personal Arrayer TM 16点样仪对三维结构氨基化玻璃基片进行点样试验，点样矩阵设计自左向右为同一浓度的三个5×5阵列，自上往下为不同浓度的阵列，然后再通过LuxScan 3.0扫描仪检测其荧光信号强度来反映三维结构氨基化玻璃基片的固定能力，具体操作如下：
(1)点样过程
a、室温下，将Cy3标记的DNA探针以5μM、2.5μM、1μM的浓度分别到50％DMSO/50％H2O的缓冲液中。
b、将样品转移到样品孔板中，并且保证没有气泡。
c、启动点样仪，将与点样玻片和三维结构氨基化玻璃基片装在正确的位置，设置阵列结构及相关参数，温度控制在25℃室温，湿度控制在70％左右，开始进行点样。
d、点样完成后，将芯片用水蒸汽熏过后放在125-400mJ紫外灯下交联固定，然后将三维结构氨基化玻璃基片放置在恒湿盒中24h。
(2)用LuxScan 3.0扫描仪对上述完成的基片进行扫描，扫描图记为图1。
(3)洗片
a、配置清洗液洗片，包含5×SSC，0.1％SDS和1.0％BSA。
b、将扫描后的基片放在上述溶液中在42℃培育45min，然后用去离子水清洗五次，晾干。
(4)扫描
a、同样用LuxScan 3.0扫描仪对上述3完成的基片进行扫描，扫描图记为图2。
b、读取Cy3的信号数据，背景数据，计算SD值、CV值和信噪比S/N值，列表1如下。
表1：三维结构氨基化玻片扫描数据

Claims (10)

1.一种制备生物芯片基片的方法，包括如下步骤：
步骤1：对基片表面活化处理；
步骤2：在活化基片表面通过硅烷偶联剂处理引入双键；
步骤3：在双键化基片表面通过光接枝法引入三维凝胶层，具体如下：
①配置接枝混合溶液，包括光引发剂，聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA和甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA组成的单体，余量为溶剂；所述的接枝混合溶液中PEGDA：GMA的摩尔比为1：0.1～0.1：1，单体所占接枝混合溶液的质量分数为5～80％；
②将接枝混合溶液滴在基片上，并用石英片覆盖在表面使接枝液均匀分布在基片上，置于紫外光下照射1～60min，之后将接枝基片用乙醇浸泡1～10h，晾干；
步骤4：使三维凝胶层与含氨基化合物反应，得到表面接有氨基的三维凝胶结构基片。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中如果是玻璃基片，表面活化处理工艺为：将玻片放入按氢氧化钾：水：异丙醇质量比为1：18：21配置的混合液中，超声5～90min，再用去离子水清洗3次，然后用丙酮清洗、晾干。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中如果是聚合物基片，表面活化处理工艺为：将聚合物基片在丙酮中清洗并晾干，将30wt％的过硫酸铵水溶液夹在双向拉伸的聚丙烯膜BOPP和聚合物膜中间，形成100nm～10μm的液层；然后用紫外灯在室温下从BOPP表面照射0.5～3min，将得到的改性聚合物膜用去离子水冲洗，并浸入超纯水中1～16h，用超纯水冲洗后室温晾干。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述聚合物基片为聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯的共聚物、环氧树脂、环烯烃共聚物或聚二甲基硅氧烷基片。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2所述表面双键化的工艺为：配制乙烯基三甲氧基硅烷和冰醋酸的乙醇溶液，其中乙烯基三甲氧基硅烷质量浓度为1-10％，冰醋酸的质量浓度为0.05-0.2％，将表面活化的基片放入上述溶液中，浸泡10-30min，然后用乙醇清洗，吹干。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：
所述的接枝混合溶液中的溶剂为丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、二甲基甲酰胺、四氢呋喃中的一种或两种以上的混合物；
所述的接枝混合溶液中的光引发剂为1-羟基环己基苯基甲酮、安息香双甲醚、2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮中的一种或两种以上的混合物，质量浓度为0.05～5％；
所述紫外光的波长为100～350nm，紫外光的强度为2000～12000μW/cm2。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4所述的制备表面接有氨基的三维凝胶结构基片的工艺为：配置质量浓度为0.01％～5％的含氨基化合物水溶液，将基片置于此溶液中浸泡0.5～24h，用去离子水清洗3次后在室温下晾干。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：含氨基的化合物是乙醇胺、乙二胺、丙二胺、羟乙基乙二胺、异丙醇胺、丁醇胺、丝氨醇及三羟甲基氨基甲烷中的一种或两种以上的混合物。
9.由权利要求1-8中任一所述方法制备得到的生物芯片基片。
10.由权利要求9所述基片制备得到的生物芯片。
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