CN101238371B - 固定有探针的载体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

制备用于检测目标物质的固定有探针的载体，从而在固定有探针的载体的制备中，一个点样点被防止受另一个点样点污染，和探针被防止非特异性地吸附背景区域，并且即使在阵列形成后，也不能发生非特异吸附。使用了含有用来固定探针于其上的反应基团的基板，进行了下述步骤：(i)在基板上提供含有探针的液滴；(ii)失活存在于基板的提供区域以外的区域中的反应基；和(iii)去除存在于所提供的液滴中的未反应探针。

Description

固定有探针的载体的制备方法
技术领域
本发明涉及制备固定有探针的载体的方法，该载体含有固定在基板上并能够检测目标物质的探针。 
背景技术
作为用于快速而精确地测定核酸的碱基序列、检测样品中具有特异性目标碱基序列的核酸和鉴定不同细菌物种的技术之一，这里提出了具有许多排列在固相支持物上的探针的固定有探针的载体(探针阵列)的应用。这里使用的术语“探针”指的是通过杂交反应特异地和目标核酸结合的物质，当所述物质是核酸时，它可以指的是探针核酸。已经知道多种可用于将探针固定在固相支持物上的方法。具体而言，例如，作为例示性的方法有：通过在固相支持物上连续合成探针来进行探针的固定的方法(即芯片上(on-chip)法)，和通过使用针法、压印等将探针提供到基板上来固定先前准备好的探针的方法。美国专利No.5143854公开了下述方法，所述方法通过活化剂从基板的选定区域去除保护性基团，具有可去除的保护性基团的单体被反复地结合在所述区域来在基板上合成具有不同序列的多聚物。更进一步地，例如，日本专利申请公开号H08-023975公开了下述方法，通过该方法将用于固定探针的材料与生物活性物质接触因而将探针固定在基板上，其中，用于固定探针的材料由基板和携带在基板上的由具有碳二亚胺基团的聚合体化合物构成的用于固定的材料组成，生物活性物质具有与碳二亚胺基团的反应性。进一步，例如，日本专利申请公开号2001-178442公开了下述方法，通过该方法使其末端含有巯基的DNA片段在液相中与固相载体接触，其中，线性分子的一端固定在固相载体的表面，该线性分子具有能够和巯基反应并共价结合巯基的反应基团。这样，由于 DNA和线性分子可以共价相互结合，DNA片段被固定在固相载体的表面。更进一步，例如，日本专利申请公开号2000-295990描述了下述方法，所述方法通过溶解或分散DNA片段和亲水聚合物到水性介质中而制备水溶液，将该水溶液点样在固相载体的表面来稳定DNA片段和固相载体表面的结合。 
像上面描述制备的探针阵列通常被期望具有高灵敏度。这是因为当待用探针阵列检测的目标物质的浓度低时，由于S/N比例降低，就会出现检测结果的可靠性的问题。因而，对通过提高探针浓度来改善探针阵列敏感度的方法进行了尝试，从而需要提高想要固定在基板上的探针的数量。 
然而，对于像上面描述而制备的探针阵列来说，相对于可以和基板上的探针结合的反应基的数量，结合的探针的数量可能变为饱和。结果，在已点样在基板上的包含探针的液滴中，未反应的探针可能以原状存在。进一步，当在这种条件下的所述液滴通过用水、清洁剂等进行液相处理而被去除时，所述未反应的探针可能流到已点样有未反应探针的区域(“点样区域”)以外的区域。结果，所述探针可以被固定在位于所述基板的点样区域以外的区域(“背景区域”)中的反应基上，因此导致非特异吸附。术语“非特异吸附”代表在和检测不相关的位置上的目标核酸的吸附或结合，并且其与吸附和结合的方式无关。另外，当经点样的液滴被去除到液相中，同时未反应的探针存在其中时，流出的探针可能会污染临近的点样区域。结果，仅仅应该固定一种探针的点样区域可能被另一种探针污染。 
除了这些因素之外，探针可以结合的基板本身具有导致在其上的探针非特异吸附的因素，因此可能出现问题。换句话说，当目标物质被非特异地吸附在探针阵列的整个背景区域上时，不再能找出点样区域与点样区域周围的背景区域间的分界，结果导致不能判断这是否是检测信号。例如，当在水溶液中显示正电荷的反应基例如氨基存在于基板上，并且被静电吸附在目标核酸的负电荷上时，这个问题便产生了。 
按照惯例，为了解决这些问题，尝试了防止目标物质对探针阵列的背景区域非特异吸附的方法。 
为了防止目标物质对背景区域非特异吸附，已知的对探针阵列的处理是使用脱脂乳等在探针阵列上进行封闭处理。还已知，通过在探针被固定在基板上之后将探针浸在水性聚合物溶液中来进行封闭处理。例如，像在日本专利号2794728中描述的那样，存在一种通过把探针固定在硝化纤维素膜上，然后把该膜浸在含有PVA和/或PVP的溶液中来进行封闭处理的方法。 
然而，无论使用这些封闭试剂中的哪一种，所述封闭试剂通过吸附而不是通过化学键合而结合到固相支持物上。因而，封闭效果不一定是足够的，以至于结果不是总是可重复的。进一步，在制备探针阵列的步骤中，这个方法不能避免未反应探针的非特异吸附。 
相反，作为用化学键进行封闭的例子，已报道了用琥珀酸酐封闭多聚-L-赖氨酸包被的载玻片的方法(参见，例如，P.O.Brown等人，Genome Res.，6：639-645，1996)。这是试图通过用琥珀酸酐偶联氨基基团来消除来自于载玻片上的氨基基团的电荷的方法。然而，即使在这个方法中，在制备探针阵列的工艺中，当未反应的探针存留在被点样在固相支持物上的液滴中时，在封闭反应中所述未反应的探针可能流到背景区域，以至于所述封闭试剂可以竞争性地和流出来的探针反应，从而导致非特异吸附。 
发明内容
本发明提供了制备固定有探针的载体的方法，该载体检测目标物质(靶)，在该方法中，防止一个点样点被另一个点样点污染，和防止探针非特异吸附到背景区域，并且甚至在阵列形成后也不能发生非特异吸附。 
换句话说，本发明提供了制备固定有探针的载体的方法，其使用含有用来在其上固定探针的反应基的基板，所述方法包括步骤： 
(i)在基板上提供含有探针的液滴； 
(ii)失活存在于所述基板的提供区域以外的区域中的反应基；和 
(iii)去除存在于所提供的液滴中的未反应探针。 
常规的封闭方法由于在封闭反应期间已点样的DNA流出而可能导致非特异吸附。相反，本发明使得能够在提供液滴之后在不改变液滴的形式的情况下使背景区域失活。 
通过下面的描述以及结合附图，本发明其他的特征和优势是显而易见的，相似的字符在全部附图中指明了相同或类似的部分。 
附图简述 
图1.图示了使用经巯基标记的探针时的例示性的封闭化合物。 
图2.图示了使用经氨基标记的探针时的例示性的封闭化合物。 
图3.是显示相对于探针浓度的1-丙硫醇的封闭效果的图。 
图4.是显示相对于探针浓度的乙醇胺的封闭效果的图。 
具体实施方式
现在将依照附图详细地描述本发明的优选实施方案。 
本发明涉及制备固定有探针的载体的方法，其使用含有用来在其上固定探针的反应基的基板，所述方法包括步骤： 
(i)在基板上提供含有探针的液滴； 
(ii)失活存在于所述基板的提供区域以外的区域中的反应基；和 
(iii)去除存在于所提供的液滴中的未反应探针。 
优选通过点样液滴来进行上述提供。这种情况下，本发明的特征性特征是通过保持所提供的液滴的形式的方式来进行失活。详细地，本发明的特征性特征是失活可以和点样部分(点样区域)的外部区域(背景区域)上的探针结合的反应基团，同时点样在基板上的液滴的形式保持原状。 
这种情况下，上述步骤(ii)可能包括用封闭化合物进行失活的工艺。作为用于用封闭化合物进行失活而又不改变被点样的液滴的形式的方式，可以列举气相处理、喷雾处理等。当使用在常温下或用加热 器加热等而蒸发的封闭化合物(例如，低分子量的化合物)时，气相处理特别有效，因而可以通过把已经完成点样的固定有探针的载体和封闭化合物密封地放入封闭室或具有加热器的封闭室里，并让它们持续一定时间，来使反应基因失活。当使用在常温下不能被蒸发的封闭化合物(例如，高分子量化合物，或具有强的分子间吸引力的极性化合物)时，喷雾处理是特别有效的。喷雾处理可以通过下述方法获得，把封闭化合物溶解在适当的溶剂中以制备封闭化合物溶液，用例如喷雾器的喷雾装置把封闭化合物溶液变为雾，和把封闭化合物溶液喷在已经完成点样的固定有探针的载体上。 
或者，使用蒸发的封闭化合物来进行的失活可以在真空蒸发器中或在由聚碳酸酯制成的简化了的真空干燥器中进行，并且优选地在能够形成真空空间的装置里进行。在使用固体形式或具有高沸点的液体形式的封闭化合物的情况下，使用真空空间来降低沸点，由此允许将要蒸发的封闭化合物甚至在相比而言很低的温度下可以蒸发。因此，该方法对于热敏感的封闭化合物是有效的。 
进一步地，喷雾处理优选地在下述工艺中进行，例如，建造在其中安装了喷嘴的生产线，从喷嘴里喷出封闭化合物溶液，这样以包被已经在其上点样了液滴的固相支持物。优选地，在此时，从喷嘴里喷出的封闭化合物在雾形式中具有大约10μm至20μm的雾尺寸，理想地1μm至5μm。如果其雾尺寸高出这个范围，则可能辨认出雾的痕迹并且可能引起视觉的不快。此外，因为包含有被点样的探针的液滴具有大约50μm至500μm的直径，所以当雾的直径和含有点样探针的液滴的直径几乎相同时，经点样的液滴能物理性地发生变形。因此从本发明的这一发明来看，这不是优选的雾尺寸。 
或者，有不使用封闭化合物来进行封闭而同时保持液滴的形状完整的方法。例如，在基板上形成液滴后，具有液滴的形状轮廓的掩模以数百微米的距离悬在基板上，随后背景区域的反应基团经高能量电磁射线或粒子射线的照射而失活，高能量电磁射线或粒子射线例如为X-射线、α-射线、β-射线、γ-射线、高能量中子射线、电子射线、 真空紫外线或紫外线。 
进一步，根据本发明去除存在于已点样的液滴中的未反应探针的步骤是通过用水、清洁剂等进行液相处理来去除该液滴。液相处理之后可以进行干燥，即用压缩空气或通过旋转基板然后自然干燥或用加热等干燥，来从基板上去除水分。 
进一步，用于本发明的探针只要它是可以特异性地结合标准物质的物质，包括但是不特别局限于生物大分子，例如，蛋白质(包括复合蛋白质)、核酸、糖链(包括复合糖)和脂质(包括复合脂)。其中具体的例子包括：酶、激素、信息素、抗体、抗原、半抗原、肽、合成肽、DNA、合成DNA、RNA、合成RNA、PNA、合成PNA、神经节苷脂和凝集素。特别地，优选寡核苷酸、多核苷酸或肽核酸。进一步，其核酸衍生物或类似物也包含其中。 
另外，当巯基被引入到探针中时，例如，当自动合成的DNA被用作探针时，Thiol-Modifier(由Glen Research公司生产)可以用于使用自动DNA合成仪的合成。不过，只要巯基能被有效地引入，对方法没有特别的限制。 
另一方面，当氨基被引入到探针中时，例如，当自动合成的DNA被用作探针时，Amino-Modifier(由Glen Research公司生产)可以用于使用自动DNA合成仪的合成，不过，只要氨基基团能被有效地导入，对方法没有特别的限制。 
进一步，用于在固相支持物上进行点样以固定探针的方式可以是其中探针被溶解或分散在水溶液中的用于对溶液进行点样的一种方式，其通过喷墨方法、针法、针环法等中的任一方法。 
在上述提到的方法中，因为喷墨方法具有进行高密度、精确点样的能力，因此喷墨方法是合适的点样方法。喷墨方法是下述的方法，在这种方法中，含有探针的溶液被置于极细的喷嘴里，压力或热量瞬间施加到接近喷嘴顶端的部分，以从喷嘴顶端准确地喷出体积非常小的含有探针的溶液，进而允许溶液飞过间隔并附着在基板的表面。对于用喷雾方法点样，包含在探针溶液中的组分没有特别的限制，只要 当它们作为探针溶剂的组分被喷出时基本不影响探针，并且符合对于使用喷墨头可以被正常地喷在基板上的溶剂组分的要求。例如，当喷墨头是具有运用热能卸载溶剂的机理的气泡喷射头时，包含在探针溶剂中的优选组分是含有甘油、硫二甘醇、异丙醇和炔醇的液体。进一步，特别地，含有5wt％至10wt％的甘油、5wt％至10wt％的硫二甘醇和0.5wt％至1wt％的炔醇的液体被适合用作探针介质。另外，当喷墨头是使用压电元件来喷出溶液的压电喷射头时，包含在探针溶剂中的优选组分是含有乙二醇和异丙醇的液体。更具体地，含有5wt％至10wt％的乙二醇和0.5wt％至2wt％的异丙醇的液体被适合用作探针溶剂。 
当如上面描述而获得的探针溶液从喷墨头喷出并附着在基板上时，点样点的形状是圆形的，并且没有引起在其上喷射了探针溶液的区域的扩展(expansion)。另外，即使探针溶液被高密度地点样时，和临近的点样点的连接可以被有效地防止。在这种情况下，本发明的探针溶液的特征性特征不局限于上面描述的特征。 
进一步，上面描述的针法是这样的方法，其通过使用接触针把探针点样在基板上，因而可以用简单的装置固定探针。因而，它可以用于评价探针的可行性。 
进一步，本发明的基板可以包括无机材料和聚合材料，只要在使用通过将探针固定在基板上而制备的固定有探针的基板来检测待检物质(靶物质)时不带来麻烦，对基板没有特别的限制。优选地，这些基板中的任一种可以具有被导入到其表面上的反应基，比如氨基、马来酰亚胺基团、丙烯酰胺基团、N-羟基琥珀酰亚胺酯基团、甲酰基、羧基或环氧基，或者可以是选自于原来含有这些反应基但不局限于这些反应基的材料。 
特别地，当用无机材料作为基板时，为了在基板上引入碱性基团，例如，其表面通过具有氨基的硅烷偶联试剂来处理的基板是优选的。这种情况下，能够被硅烷偶联试剂有效处理的材料，例如石英、玻璃、硅石、氧化铝、滑石、粘土、铝、氢氧化铝、铁、云母等是特别优选的，并且也可以使用氧化物例如氧化钛、氧化锌和氧化铁。考虑到目 标物质的检测和作为材料的其普遍性，特别优选不含有碱组分等的无碱玻璃或者晶体基板材料。具有氨基的硅烷偶联试剂的例子包括N-β(氨基乙基)γ-氨丙基三烷氧基硅烷、N-β(氨基乙基)γ-氨丙基甲基二烷氧基硅烷、γ-氨丙基三烷氧基硅烷和γ-氨丙基甲基二烷氧基硅烷。对于烷氧基甲硅烷基(alkoxysilyl)来说，优选能够被快速水解的甲氧基甲硅烷基或乙氧基甲硅烷基。 
进一步，聚合材料包括优选地那些具有碱性基团例如氨基的材料或那些其中可以容易地导入碱性基团的材料。例如，这里给出在其末端具有氨基的聚酰胺的利用方法，和通过允许经保护的氨基和具有乙烯基的物质进行共聚来脱除保护性基团的方法。 
在这种情况下，本发明的硅烷偶联试剂是指具有下述两部分的化合物中的任何一种，即能和有机化合物例如树脂反应的有机官能团，和能通过硅氧烷键与无机化合物例如玻璃结合的部分。 
基板的形状不受限制，但是例如，由于DNA芯片在检测方法、装置等方面的多功能性，在基板的形状中DNA芯片可以是最优选的。进一步，基板材料优选是具有高度表面光滑度的材料。特别地，它优选是具有大约1英寸×3英寸大小的并且具有大约0.7至1.5mm厚度的基板。 
进一步，本发明的封闭化合物优选地是一种这样的化合物，其在分子中含有和待与基板反应的探针所具有的反应基一样的反应基。因此，由于在封闭化合物的分子中具有和探针一样的反应基，这样的封闭化合物就具有它可以容易地被控制的优势，这是因为背景区域的封闭反应可以用和将探针固定在基板上的结合方法一样的机理来进行。 
进一步，优选地本发明的封闭化合物具有不吸附目标物质的化学基本骨架。进一步，在完成封闭反应后，为了防止封闭化合物和目标物质相互作用，封闭化合物在分子中优选地可以具有单个反应基。不过，只要活性基团是和目标物质不相互作用的种类，可以使用在分子中具有两个或更多活性基团的封闭化合物。 
对于特定的封闭化合物，当探针的反应基是巯基时，具有图1所示的化学基本结构的化合物是所希望的。图1中，n＝0至100，m＝0 至25，R1至R22各自独立地选自于：H、OH、CH3、NH2、CH2-CH3、CH＝CH3、X、CH2X、CHX2、CH2-CH2X、CX3、CX2-(CX2)m-CX3、O-(CH2)m-CH3、(CH2)m-OH、(CH2)m-C(＝O)-OH、(CH2)m-NH2、(CH2)m-SH和C(＝O)-(CH2)m-CH3，每个X选自于卤素；但是，条件是，关于CX2-(CX2)m-CX3、O-(CH2)m-CH3、(CH2)m-OH、(CH2)m-C(＝O)-OH、(CH2)m-NH2和(CH2)m-SH中的每一个，对应于(CX2)m和(CH2)m的每个部分可能是分枝的，每个分枝末端选自于：CX3、CH3、OH、C(＝O)-OH、C(＝O)-H、NH2和SH。 
另外，当探针的一个反应基是氨基时，具有图2所示的化学基本结构的化合物是所期望的。图2中，n＝0至100，m＝0至25，R23至R95各自独立地选自于：H、OH、CH3、NH2、CH2-CH3、CH＝CH3、X、CH2X、CHX2、CH2-CH2X、CX3、CX2-(CX2)m-CX3、O-(CH2)m-CH3、(CH2)m-OH、(CH2)m-C(＝O)-OH、(CH2)m-NH2、(CH2)m-SH和C(＝O)-(CH2)m-CH3，每个X选自于卤素；条件是，关于CX2-(CX2)m-CX3、O-(CH2)m-CH3、(CH2)m-OH、(CH2)m-C(＝O)-OH、(CH2)m-NH2和(CH2)m-SH中的每一个，对应于(CX2)m 和(CH2)m的每个部分可能是分枝的，每个分枝末端选自于：CX3、CH3、OH、C(＝O)-OH、C(＝O)-H、NH2和SH。 
进一步，可以通过表面分析方法来证实这些封闭化合物中的任一个和基板表面的反应，通过所述方法将来自于TOF-SIMS(飞行时间-次级离子质谱法)或类似方法的片段检测值表现在二维图谱中，然后加以分析。具体地，将在其上已经完成封闭反应的固定有探针的载体用纯水洗涤，然后用N2吹风或类似方法干燥。随后，将得到的产物用TOF-SIMS进行表面分析。通过关注关于经巯基标记的探针与含有巯基的封闭化合物的组合的硫(S)原子，和通过关注关于经氨基标记的探针与含有氨基的封闭化合物的组合的氮(N)原子，将固定有探针的载体的片段检测值分别表现在二维图谱中，然后加以分析。结果发现在点样区中和未点样区的S和N原子的检测值是这样的，即与未封闭的固定有探针的载体的检测值间的差异相比较，在所述检测值间的差异减少。进一步，在这个分析方法中，如果探针的反应基和封闭化合物的反应基是一样的，则不必受限于硫(S)或氮(N)原子，而可以关注 特异于反应基的片段并且进行分析。 
[实施例] 
<实施例1>当使用经巯基标记的DNA探针时的封闭 
(i)探针的合成和荧光标记的目标物质(靶)的合成 
用单链DNA探针作为能够特异结合于目标物质的探针。使用自动DNA合成仪合成SEQ ID No.1的单链核酸。另外，当用自动DNA合成仪合成时，使用Thiol-Modifier(由Glen Research公司制备)在SEQ IDNo.1的单链DNA末端引入巯基(SH)基团。随后，进行正常的脱保护工艺，然后回收并使用高效液相色谱纯化DNA，接着进行下面描述的实验。 
SEQ ID No.1.： 
5’-HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’ 
进一步，通过自动DNA合成仪合成具有与上述SEQ ID No.1的单链DNA探针互补的碱基序列的、未标记的单链DNA，然后将Cy3连接到单链DNA探针的5’末端，从而获得标记的单链DNA(靶)。 
(ii)固定有探针的载体的制备 
[底板的清洗] 
作为用于固定有探针的载体的基板，使用1英寸×3英寸方形的由合成石英玻璃制成的底板。石英玻璃底板依照常规的程序进行如下洗涤：以纯水用刷子洗涤、用纯水漂洗、用碱性清洁剂超声波清洗、用纯水漂洗、用纯水超声波清洗，用纯水漂洗，和用N2吹风干燥，从而准备了具有干净表面的石英玻璃底板。 
[表面处理] 
将氨基硅烷偶联试剂(商品名称：KBM-603，由Shin-Etsu ChemicalCo.，Ltd生产)以1wt％溶解，然后搅拌30分钟以允许甲氧基被水解。在得到的水溶液中浸入载玻片30分钟(在热浴中加热到80℃)，然后取出并用纯水洗涤，接着放在烤箱中在120℃进行1小时的烘烤处理。 
随后，称重2.7mg N-马来酰亚胺基-己酰氧基-琥珀酰亚胺(由DOJINDO LABORATORIES生产，在下文中缩写为EMCS)并溶解在二甲亚砜(DMSO)/乙醇(1∶1)溶液中，使终浓度为0.3mg/ml，由此制备EMCS溶液。将该引入了氨基的石英玻璃底板(其已经过烘烤处理)浸在EMCS溶液中，在室温下2小时，以便把马来酰亚胺基团引入到底板的表面。在用EMCS溶液处理后，基顺次续用二甲亚砜(DMSO)/乙醇混合液和乙醇洗涤，然后在氮气气氛中干燥。 
[探针的固定] 
将在上面(i)中合成的单链DNA探针片段(SEQ ID No.1)溶解在含有7.5wt％的甘油、7.5wt％的尿素、7.5wt％的硫二甘醇和1.0wt％的炔醇(商品名：Acetylenol E100，由Kawaken Fine Chemicals Co.、Ltd.生产)的水溶液中。配制五个不同种类的上面的水溶液，以至于其中的探针浓度分别是8.75、26.25、43.75、61.25和87.5μM。这种情况下，已知关于底板上马来酰亚胺基团的数量，在反应中经巯基标记的探针的饱和浓度大约是50μM。用含有探针的溶液充满用于气泡喷射打印机(商品名：BJF-850，由Canon公司制造)的墨盒并安装在打印头上。这种情况下，改进所使用的气泡喷射打印机，使它能在平板上进行喷墨打印。另外，依照预先确定的文件创建方法，通过把打印模式输入打印机，这个改进的气泡喷射打印机可以以大约120μm的间距将大约5-p1的DNA溶液的液滴进行点样。随后，使用该改进的气泡喷射打印机把探针DNA溶液点样在玻璃底板的表面上。随后，这个底板被放置在恒温恒湿室中，让探针和底板反应以使得探针被固定在其上，从而获得固定有探针的载体。 
(iii)固定有探针的载体的封闭 
使用1-丙硫醇来研究封闭试剂，1-丙硫醇是图1中表示的化合物(1)，其中R1＝CH3和n＝2。 
为了封闭，将含有10ml 1-丙硫醇的皮氏培养皿放置在封闭室内。随后，在上述(ii)中制备的点样溶液被保留在其上的固定有探针的载体被安置在盒子里，然后将盒子放在并封闭在上述封闭室中。在这样的条件下在常温中放置1小时后，通过气相处理在点样点周围进行封闭反应。随后，用1M NaC l/50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤该固定有探针的载体，然后用纯水轻轻洗涤，接着用氮气吹风干燥，从而获得用来杂交的固定有探针的载体。另外，作为比较，制备不经过封闭处理的另一个固定有探针的载体。这种情况下，用1M NaC l/50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤已用上述(ii)中制备的点样溶液点样的固定有探针的载体。然后用纯水轻轻洗涤，接着用氮气吹风干燥。 
(iv)杂交和荧光评价 
将上面(i)中合成的荧光标记的目标物质溶解在1M NaC l/50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，使终浓度为5nM。将已经洗涤过的固定有探针的载体浸在这个溶液中，然后在45℃的温度进行杂交处理2小时。处理后，用1M NaC l/50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤该固定有探针的载体以冲掉未杂交的单链DNA。然后用纯水轻轻洗涤，去掉盐分，接着用氮气吹风干燥。 
用荧光扫描仪(商品名：GeneP i x4000B，由Axon Instrumen t s、Inc.生产)测定固定有探针的载体上的点样点的荧光强度。这种情况下，对于实施例如比较实施例采用相同的测量条件(荧光强度的测量波长是532nm)。 
(v)结果 
在用1-丙硫醇的封闭存在或不存在的条件下，把从点样点周围的荧光亮度(背景)所获得的平均亮度水平对于探针的浓度进行绘图，获得了图3所示的结果(在没有封闭时探针具有8.75μM的最低浓度的条件下，定义背景的标准水平)。 
在没有封闭的条件下，在不低于探针的饱和浓度的61.25μM时可以观察到背景的突然增加(在荧光图像中，证实该点已经强烈地出现)。另一方面，在封闭存在的条件下，即使在不低于探针的饱和浓度的61.25μM或更高时不能够观察到背景的不增加。换句话说，这表明通过不使本发明的经点样的探针的形状变形的方式达到了失活(封闭)。 
<实施例2>当使用经氨基标记的DNA探针时的封闭
(i)探针及其互补链探针的合成，以及荧光标记的目标物质(靶)的合成 
用单链DNA探针作为可以特异地结合目标物质的探针。用自动DNA合成仪合成SEQ ID No.2的单链核酸。另外，当用自动DNA合成仪合成时，使用Amino-Modifier(由Glen Research公司制备)在SEQ ID No.2的单链DNA末端引入氨基(NH2)。随后，进行正常的脱保护工艺，然后回收并使用高效液相色谱纯化DNA，接着进行下面描述的实验。 
SEQ ID No.2.： 
5’-NH2-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA-3’ 
进一步，通过自动DNA合成仪合成具有与上述SEQ ID No.2的单链DNA探针互补的碱基序列的、未标记的单链DNA，然后将Cy3连接到该单链DNA探针的5’末端，从而获得标记的单链DNA(靶)。 
(ii)固定有探针的载体的制备 
[底板的清洗] 
作为用于固定有探针的载体的基板，使用1英寸×3英寸方形的由合成石英玻璃制成的底板。石英玻璃底板依照常规的程序进行如下洗涤：以纯水用刷子洗涤、用纯水漂洗、用碱性清洁剂超声波清洗、用纯水漂洗、用纯水超声波清洗，用纯水漂洗，和用N2吹风干燥，从而准备了具有干净表面的石英玻璃底板。 
[表面处理] 
含有1wt％的硅烷偶联试剂(商品名：KBM403，由Shin-EtsuChemical Co.，Ltd.生产)的50wt％甲醇水溶液在室温搅拌3小时，以使硅烷化合物中的甲氧基被水解，其中硅烷偶联试剂含有和环氧树脂偶联的硅烷化合物(γ-环氧丙氧基丙基-三甲氧基硅烷)。然后，使用旋转涂布机在上述底板的表面上施加该溶液，在100℃加热5分钟，并干燥以提供具有环氧基的底板的表面。 
[探针的固定] 
在含有浓度为50mM的NaCl的TE溶液(pH 8)中，溶解经氨基标记的DNA探针和未标记的单链DNA探针中的每一个，使终浓度为200μM，从而制备了经氨基标记的DNA探针溶液和未标记的单链DNA探针溶液。随后，将100μl含有未标记的单链DNA探针的溶液加入到100μl含有经氨基标记的DNA探针的溶液中，然后一起混合。将该得到的混合溶液从90℃线性冷却2小时到25℃，从而在每一DNA探针和每一单链核酸间形成杂交体。随后，将含有上述SEQ ID No.2的经氨基标记的DNA探针的杂交体的溶液加到含有7.5wt％的甘油、7.5wt％的尿素、7.5wt％的硫二甘醇和1.0wt％的炔醇(商品名：Acetylenol EH，由Kawaken FineChemicals Co.，Ltd.生产)的水溶液中，以调整杂交体的终浓度分别到8、24、40、56、72、88和104μM(即，在7个不同浓度进行研究)。这种情况下，已知关于底板上的环氧基的数量，反应中的经氨基标记的探针的饱和浓度大约是65μM。 
和实施例1的方法一样把含有探针的溶液点样在底板上，然后放在恒温恒湿室中12小时，让探针上的氨基基团和底板上的环氧基反应以至于被固定在其上，从而获得固定有探针的载体。在这种情况中，探针碱基的氨基和完全互补的单链DNA形成杂交体，所以它不能和底板上的环氧基反应。 
(iii)固定有探针的载体的封闭 
用图2中所表示的乙醇胺化合物(9)来研究封闭试剂，其中R23＝OH和n＝2。 
为了封闭，将含有10ml乙醇胺的皮氏培养皿放置在封闭室中，同时把皮氏平培养皿置于热板上。将在其上保留有上述(ii)中制备的点样溶液的固定有探针的载体安放在盒中，然后将盒子放在并封闭在上述封闭室中。随后，设置热板在60℃以使乙醇胺从皮氏培养皿中蒸发，然后放置6小时使之在点样点周围进行封闭反应。随后，用纯水在80℃洗涤底板10分钟，以解离与结合在底板上的探针杂交的互补链并同时将其洗去，然后用氮气吹气干燥，从而获得用于杂交的固定有探针的载体。另外，作为比较，制备另一个没有经过封闭处理的固定有探针 的载体。这种情况下，将已点样了上述(ii)中制备的点样溶液的固定有探针的载体用纯水在80℃洗涤10分钟，以解离与结合在底板上的探针杂交的互补链并同时将其洗去，然后用氮气吹气干燥。 
(i v)杂交和荧光评价 
将上面(i)中合成的荧光标记的目标物质溶解在1M NaC l/50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，使终浓度为5nM。将已经洗涤过的固定有探针的载体浸在这个溶液中，然后在45℃的温度进行杂交处理2小时。处理后，用1M NaC l/50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤该固定有探针的载体以洗涤掉未杂交的单链DNA，然后用纯水轻轻洗涤以去掉盐分，接着用氮气吹风干燥。 
用荧光扫描仪(商品名：GeneP i x4000B，由Axon Ins t rumen t s，I nc.生产)测定固定有探针的载体上的点样点的荧光强度。这种情况下，对于实施例和比较实施例采用相同的测量条件(荧光强度的测量波长为532nm)。 
(v)结果 
在用乙醇胺封闭存在或不存在的条件下，将从点样点周围的荧光亮度(背景)所获得的平均亮度水平对于探针的浓度进行绘图，获得了图4所示的结果(在没有封闭时探针具有8μM的最低浓度的条件下，定义背景的标准水平)。 
从结果看，在没有封闭的条件下，在不低于探针的饱和浓度的72μM时可以观察到背景的突然增加(在荧光图像中，证实该点已经强烈地出现)。另一方面，在封闭存在的条件下，即使在不低于探针的饱和浓度的72μM或更高时不能够观察到背景的不增加。因而，这表明通过不使本发明的经点样的探针的形状变形的方式达到了失活(封闭)。 
从上面描述的实施例明显得出，当探针在给定时期高密度被固定时，本发明的制备方法是特别有用的。换句话说，如果探针以高密度被固定，在待提供的液滴中的探针数量应该增加(即，它应该被更加浓缩)。然而，可能产生不和底板上的反应基反应的过量的探针，并且其和外围结合，因而引起背景噪音更多增加的问题。本发明可以消 除这个问题。 
进一步，依照本发明制备的固定有探针的载体的实施方案包括在载体表面上的已固定探针核酸的第一区域，和在第一区域外围且具有封闭试剂的第二区域。构建第一区域，其基本没有固定在第一区域上的探针住所，同时，在第一区域上构建第二区域，其基本上没有固定在第一区域上的探针核酸。 
因此，可以获得具有高检测灵敏度的适当的固定有探针的载体，对于该载体，在周围区域没有标准核酸的非特异性吸附，同时具有高检测灵敏度。 
本发明不局限于上面的实施方案，在本发明的实质和范围内可以进行不同的变化和修改。因而为了使公众知晓本发明的范围制定了下述权利要求。 
本申请要求提交于2005年6月10日的日本专利申请号No.2005-170777的优先权，其被引入此处作为参考。 

Claims (17)

1.制备固定有探针的载体的方法，其使用含有用来在其上固定探针的反应基的基板，所述方法包括步骤：
(i)在基板上提供含有探针的液滴；
(ii)失活存在于所述基板的提供有液滴的区域以外的区域中的反应基，其中所述失活是通过保留所提供的液滴的形式的方式来进行的；和
(iii)在步骤(ii)之后去除存在于所提供的液滴中的未反应探针。
2.根据权利要求1的制备固定有探针的载体的方法，其中所述液滴的提供是通过点样来进行的。
3.根据权利要求1的制备固定有探针的载体的方法，其中所述失活是通过封闭化合物来进行的。
4.制备固定有探针载体的方法，其使用含有用来在其上固定探针的反应基的基板，所述方法包括步骤：
(i)在基板上提供含有探针的液滴；
(ii)失活存在于所述基板的液滴提供区域以外的区域中的反应基；和
(iii)在步骤(ii)之后去除存在于所提供的液滴中的未反应探针，
其中的失活步骤是通过使用含有在分子中有能结合于基板的下述反应基的封闭化合物来进行的，所述下述反应基选自巯基、氨基、马来酰亚胺基团、N-羟基琥珀酰亚胺酯基团、甲酰基、羧基、丙烯酰胺基团和环氧基。
5.根据权利要求4的制备固定有探针的载体的方法，其中所述保留所提供的液滴的形式的方式是气相处理。
6.根据权利要求5的制备固定有探针的载体的方法，其中所述气相处理是将已经完成所述步骤(i)的基板封在充有蒸发的封闭化合物的封闭室中的工艺。
7.根据权利要求4的制备固定有探针的载体的方法，其中所述保留所提供的液滴的形式的方式是喷雾处理。
8.根据权利要求7的制备固定有探针的载体的方法，其中所述喷雾处理是把溶解有封闭化合物的封闭溶液以雾形式通过喷雾装置喷雾在基板上的工艺。
9.根据权利要求2的制备固定有探针的载体的方法，其中所述点样是通过喷墨工艺来进行的。
10.根据权利要求9的制备固定有探针的载体的方法，其中所述喷墨工艺包含气泡喷射系统。
11.根据权利要求9的制备固定有探针的载体的方法，其中所述喷墨工艺包含压电喷射系统。
12.根据权利要求2的制备固定有探针的载体的方法，其中所述点样是使用针法来进行的。
13.根据权利要求3的制备固定有探针的载体的方法，其中如果在液滴中的探针的能和基板结合的反应基被定义为X，那么所述封闭化合物在分子中含有该反应基X。
14.根据权利要求13的制备固定有探针的载体的方法，其中所述反应基X是选自于下述中的一种：巯基、氨基、马来酰亚胺基团、N-羟基琥珀酰亚胺酯基团、甲酰基、羧基、丙烯酰胺基团和环氧基。
15.根据权利要求3的制备固定有探针的载体的方法，其中所述封闭化合物具有对于目标物质无活性的化学结构。
16.根据权利要求1的制备固定有探针的载体的方法，其中所述探针是寡核苷酸、多核苷酸、或肽核酸。
17.根据权利要求1的制备固定有探针的载体的方法，其中所述探针是核苷酸衍生物或它的类似物。
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