KR100700462B1 - 프로브 매체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표적 물질에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 프로브와 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질 및(또는) 기재 표면에 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질을 포함하는 프로브 매체이다. 프로브가 고정된 기재의 제조 방법은 기재를 준비하는 단계 및 프로브 매체를 기재에 부여하는 단계을 포함한다. DNA 어레이의 제조 방법은 기재를 준비하는 단계 및 프로브 매체를 기재에 부여하는 단계을 포함한다. 표적 물질의 검출 방법은 기재를 준비하는 단계, 상기 프로브 매체를 기재에 부여하는 단계 및 프로브가 고정된 기재를 이용하여 표적 물질을 검출하는 단계를 포함한다. 또한, 프로브 매체의 제조 방법은 프로브, 프로브와 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질 및 기재 표면에 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질을 준비하는 단계, 동일한 결합을 할 수 있는 부위를 갖는 물질을 각각 포함하는 용액을 용기 중에 수납하는 단계, 및 상기 프로브를 기재에 고정시킬 때에 프로브와 상기 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질을 혼합시키는 단계를 포함한다.
프로브 매체, DNA 어레이

Description

프로브 매체 {Probe Medium}
본 발명은 프로브를 기재에 고정하는 프로브 매체 및 그의 고정 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 프로브 매체를 기재에 고정함으로써 얻어진 프로브 고정 기재를 이용하여 표적 물질을 검출하는 검출 방법에 관한 것이다.
프로브를 기재에 고정하는 방법으로서 다양한 방법들이 공지되어 있다. 상세하게는, 프로브를 기재 상에서 합성함으로써 기재에 고정하는 방법, 및 핀 또는 스탬프 등에 의해 미리 준비된 프로브를 기재에 부여함으로써 고정하는 방법이 있다. 구체적으로는, 미국 특허 제51438545호 공보(USP5,143,854)에 기재되어 있는 바와 같이, 기재의 선택된 영역에서 활성자(activator)에 의해서 보호기를 제거하고, 제거가능한 보호기를 갖는 단량체를 상기 영역에 결합시키는 것을 반복함으로써, 기재 상에서 다양한 배열을 갖는 중합체를 합성하는 방법이 공지되어 있다. 또한, 일본 특허 공개 (평)8-23975에 기재되어 있는 바와 같이, 기재, 및 상기 기재 상에 담지된 카르보디이미드기를 갖는 고분자 화합물로 이루어지는 고정용 재료와, 카르보디이미드기에 대해 반응성이 있는 생물학적 활성 물질을 접촉시키는 것을 포함하는 고정 방법이 공지되어 있다. 유사하게, 일본 특허 공개 (평)8-334509에 기재되어 있는 바와 같이, 카르보디이미드를 함유하는 화합물 상에 물질을 카르 보디이미드기를 통해 고정시킴으로써 생물학적 활성 물질을 검출하는 방법이 공지되어 있다. 또한, 일본 특허 공개 2001-178442에 기재되어 있는 바와 같이, 말단부에 티올기를 갖는 DNA 단편과, 상기 티올기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 반응성 치환기를 갖는 쇄상 분자가 한쪽 말단에서 표면에 고정된 고상 담체를 액상으로 접촉시킴으로써, 상기 DNA 단편과 쇄상 분자 사이에서 공유 결합을 형성시키는 것에 의한 DNA 단편의 고상 담체 표면에의 고정 방법이 공지되어 있다.
또한, 생체 성분의 검출 방법으로서도 많은 방법이 공지되어 있다. 일본 특허 공개 2001-116699에는 RNA, cDNA, 올리고뉴클레오티드 등의 생체 성분 등의 물질의 검사를 백그라운드 노이즈(background noise)로부터의 영향을 배제하면서 고감도, 고정밀도로 간편하게 측정하는 방법이 기재되어 있다. 또한, 일본 특허 공개 2001-116750에 기재되어 있는 바와 같이, 반응하는 기재 상의 원하는 위치에 반응성 물질을 포함하는 용액을 노즐로부터 배출시킴으로써 반응성 물질을 기재에 고정하는 방법이 공지되어 있다. 기재가 유리 또는 실리콘제이고, 그의 표면은 친화성 부여를 위해 표면 처리되어 있는 것으로, 반응성 물질은 DNA 단편, cDNA, RNA, 효소, 항원, 항체, 에피토프, 단백질, 폴리뉴클레오티드, 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.
프로브를 기재에 고정시킬 때에 수용성 고분자 재료를 블로킹 처리에 이용하는 것이 공지되어 있다. 구체적으로는, 일본 특허 제2794728호에 기재되어 있는 바와 같이, 샘플 핵산을 막에 고정시키고, PVA 및(또는) PVP를 함유하는 용액에 막을 침지시켜 블로킹 처리하는 방법이다. 그 외에 핵산을 막 상에 고정한 후의 처 리 방법에 대해서는, 스킴 밀크 등을 이용하여 블로킹 처리하는 것도 공지되어 있다. 구체적으로는, 일본 특허 공고 (평)06-034756에 기재되어 있는 바와 같이, 샘플 핵산을 막에의 고정시킨 후, 이 막을 스킴 밀크와 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜티오)프로피오네이트를 반응시킴으로써 얻어진 용액으로 블로킹 처리하는 방법을 포함한다.
또한, DNA 프로브를 기재에 고정한 프로브 고정 기재에 있어서, 프로브를 기재에 부여한 후 DNA 프로브의 건조를 막는 것이 공지되어 있다. 구체적으로는, 일본 특허 공개 2001-178459에 기재되어 있는 바와 같이, DNA 단편이 용해 또는 분산되어 이루어지는 수용액 중에 고비점 용매를 첨가하는 것이다.
또한, 의료 용구를 고분자 재료(중합체)로 코팅하는 것에 대해서는, 중합체 및 약제로 의료 용구를 코팅하는 것이 공지되어 있다. 구체적으로는, 일본 특허 공보 2000-512519에 기재되어 있는 바와 같이, 생물적합성 생분해성 중합체 및 약제를 포함하는, 의료 용구를 코팅하기 위한 조성물이 공지되어 있다.
그러나, 표적 물질에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함하는 종래 이용되었던 프로브 매체 중에, 프로브, 상기 프로브와 결합할 수 있는 부위 및 기재 상에 결합할 수 있는 부위를 1개의 매체 중에 포함하는 것은 없었다. 또한, 표적 물질에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 프로브를 기재에 고정시키는 종래의 방법은, 프로브와 결합할 수 있는 부위를 포함하는 재료를 기재에 코팅하거나 또는 기재를 처리함으로써 프로브와 결합할 수 있는 부위를 형성시키는 것에 의해 기재 상에 결합층을 형성한 후, 상기 기재에 적어도 프로브를 포함하는 매체를 부여함으로써 프로브를 고정시켰다. 이 때문에, 프로브 매체를 기재에 부여하기 전에, 기재 상에 프로브와 결합할 수 있는 부위를 형성시키는 처리가 미리 행해져야 했다. 또한, 프로브와 결합할 수 있는 부위를 갖는 화합물과 기재를 이용하여 프로브 고정 재료를 생성하고, 프로브 고정 재료로 미리 기재를 처리함으로써 프로브를 고정하였다. 따라서, 이 방법에서는 프로브의 고정화를 행하기 전에, 프로브 고정 재료에서의 기재 처리가 필요하였다.
또한, 종래 이용되었던 표적 물질에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함하는 프로브 매체 중에서는, 프로브 및 수용성 고분자 재료를 1개의 프로브 매체에 포함하는 것은 없었다. 프로브 고정 기재를 이용하여 표적 물질을 검출하는 검출 방법 중 한 단계인 블로킹 처리에 있어서, 비록 수용성 고분자 재료를 이용하는 것은 공지되어 있었지만, 수용성 고분자 재료를 함유하는 프로브 매체를 이용하는 것 또는 프로브를 기재에 고정시킬 때에 프로브 및 수용성 고분자 재료를 혼합시키는 것은 없었다. 또한, 종래 이용되었던, 표적 물질에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 프로브를 기재에 고정시킨 프로브 고정 기재에 대해, 프로브 종류 중 하나인 DNA 단편을 기재에 고정시킨 후에 DNA 단편의 건조를 막는 것이 공지되어 있었다. 이를 위해서는, DNA 단편이 용해 또는 분산된 수용액 중에 고비점 용매가 반드시 첨가되어야 한다.
<발명의 개시>
본 발명은 표적 물질에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 프 로브와 결합할 수 있는 부위 및 기재와 결합할 수 있는 부위를 포함하는 프로브 매체를 제공한다.
또한, 본 발명은 표적 물질에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 수용성 고분자 재료 및 고비점 용매를 포함하는 프로브 매체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프로브 매체를 스폿팅(spotting) 방법에 의해 기재에 부여하는 것을 포함하는, 프로브의 고정 방법을 제공한다. 이 프로브 고정 방법에 의해 제조된 프로브 고정 기재의 프로브가 DNA 프로브인 DNA 어레이를 제공한다. 또한, 프로브 매체를 스폿팅 방법에 의해 기재에 부여함으로써 고정시키고, 이로써 얻어진 프로브 고정 기재를 이용하는 것을 포함하는 표적 물질의 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 프로브 및 상기 프로브를 기재에 고정하는 물질을 각각 용기 중에 수납하고, 기재에 고정시킬 때에 혼합시키는, 프로브 및 상기 물질을 포함하는 프로브 매체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프로브, 수용성 고분자 재료 및 고비점 용매를 포함하며, 이들을 각각 용기 중에 수납하고, 기재에 고정시킬 때 혼합되어 이루어진 프로브 매체를 제공한다.
<발명의 실시 형태>
본 발명의 제1 실시 양태인 프로브 매체 및 프로브를 기재에 고정시키는 방법은 프로브, 상기 프로브와 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질 및 기재 상에 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질을 포함한다. 본 발명의 제2 실시 양태인 프로브 매 체 및 프로브를 기재에 고정시키는 방법은 프로브, 수용성 고분자 재료 및 고비점 용매를 포함한다.
프로브의 예에는 단일 가닥 핵산 프로브, 단일 가닥 DNA 프로브, 단일 가닥 RNA 프로브 및 단일 가닥 PNA 프로브가 포함된다. 매체 중에 포함되는 프로브의 양은 프로브 매체로서 이용되는 핵산 프로브 안정성을 고려하면, 매체 중 예를 들면 2 mer 내지 500 mer, 특히 2 mer 내지 80 mer의 핵산 프로브를, 0.05 내지 500 μmol/l, 특히 0.5 내지 50 μmol/l의 농도가 되도록 조정되는 것이 바람직하다. 이들 프로브는 프로브 그 자체로 이용될 수도 있지만, 프로브 말단에 링커를 변형시킨 것이 바람직하다. 링커 변형의 예에는 비오틴화, 관능기 변형 등이 포함된다. 이를 위해 이용할 수 있는 관능기는 아미노(NH2)기, 카르보닐(COOH)기, 머캅토(SH)기 및 히드록실(OH)기를 포함한다. 특히, 프로브 관능기 합성의 용이성을 고려하면 관능기로서 아미노기가 바람직하고, 프로브 관능기의 반응성을 고려하면 관능기로서 머캅토기가 바람직하다.
프로브와 결합할 수 있는 부위에 대해 특별히 제약되는 것은 아니지만, 프로브 말단의 링커와 결합하는 것이 바람직하다. 프로브 말단의 링커와 결합하는 형태로서는 다양한 것을 들 수 있지만, 화학 결합에 의한 것이 바람직하다. 프로브 링커와 결합할 수 있는 부위는 아비딘 및 관능기를 포함할 수 있다. 관능기는 에폭시(CHOCH2)기, 아미노(NH2)기, 머캅토(SH)기, 말레이미드기, 클로로프로필(C3 H6Cl)기 및 이소시아네이트(NCO)기를 포함한다. 특히 프로브와 결합할 수 있는 관능기 로서는, 프로브 관능기와의 결합을 고려하면 에폭시기, 말레이미드기, 클로로프로필기 및 이소시아네이트기가 바람직하다. 매체 중의 프로브와 결합할 수 있는 부위의 양은 프로브와 결합할 수 있는 부위에 따라 다르기 때문에, 특별히 제약되는 것은 아니지만, 프로브와의 결합성을 고려하면 프로브량에 대하여 100 내지 100000 당량이 되도록 조정하는 것이 바람직하다.
기재에 결합할 수 있는 부위는 특별히 제약되는 것은 아니지만, 기재 상에 단단히 결합할 수 있는 것이 바람직하다. 결합할 수 있는 부위는 관능기일 수도 있고, 기재와의 화학 결합을 형성하는 기가 바람직하다. 기재 상에 결합하기 위한 관능기에는 알콕시실릴(SiOR)기, 실라놀(SiOH)기 및 알콕시(OR)기가 포함된다. 특히, 기재에 결합할 수 있는 관능기로는 기재로의 고정 용이성을 고려할 때 알콕시실릴기, 실라놀기가 바람직하지만, 기재가 아미노기, 카르보닐기를 함유하는 경우에는, 이들 각각에 대하여 반응성을 갖는 기가 바람직하다. 실라놀기는 알콕시실릴기의 가수분해에 의해 형성될 수 있다. 프로브 및 상기 프로브를 기재에 고정시키는 물질은 매체 중에서 반응하여 서로 결합하는 것일 수도 있고, 관능기들 사이의 화학 반응을 통하여 공유 결합을 형성하는 것이 바람직하다.
프로브 및 상기 프로브와 결합할 수 있는 부위로서, 기재에 결합할 수 있는 부위는 다양한 조합으로 이용될 수 있지만, 이의 구체적인 예로는 프로브 관능기가 아미노기이고, 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기가 에폭시기, 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기가 실라놀기인 조합이 포함된다. 그 외에, 프로브 관능기가 머캅토기이고, 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기가 말레이미드기인 조합, 프로브 관능기가 카르보닐기이고, 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기가 아미노기이며, 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기가 실라놀기인 조합, 및 프로브 관능기가 아미노기이고, 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기가 이소시아네이트기, 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기가 실라놀기인 조합을 들 수 있다. 이들 중에서, 특히 프로브 관능기 합성의 용이성, 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기의 반응성을 고려하면, 프로브 관능기가 아미노기이고, 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기가 이소시아네이트기인 것이 바람직하다. 이들은 매체 중에서의 혼합에 의해 반응하는 것이 바람직하고, 반응시키기 위해서 소정의 조건 하에서 처리를 할 수도 있다.
프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기 및 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 단일 물질 중에 가지며, 여기서 상기 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기가 알콕시실릴기 또는 실라놀기인 경우, 이러한 단일 물질의 구체적인 예에는 실란 커플링제가 포함된다. 실란 커플링제에 있어서, 알콕시실릴기의 가수분해에 의해 실라놀기가 형성된다. 실란 커플링제 중에서 알콕시실릴기와 다른 또다른 관능기가 상기에 예시된 에폭시기, 이소시아네이트기, 머캅토기 및 클로로프로필기인 경우, 상응하는 실란 커플링제는 각각 에폭시실란, 이소시아네이트실란, 머캅토실란 및 클로로프로필실란이다. 이들 실란 커플링제는 필요에 따라서 가수분해시킨 후 프로브와 혼합시킬 수 있다.
프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기 및 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 각각 다른 물질 중에 가지며, 여기서 상기 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기가 말레이미드기이며, 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기가 알콕시실릴기 및 실라놀기인 경우, 각 물질의 조합의 구체적인 예로는, 2관능 시약 및 실란 커플링제의 조합를 들 수 있다. 2관능 시약의 구체적인 예로는, N-(4-말레이미도카프로일옥시) 숙신이미드, N-(6-말레이미도카프로일옥시) 숙신이미드, N-(8-말레이미도카프로일옥시) 숙신이미드, N-(11-말레이미도카프로일옥시) 숙신이미드 등이 있다. 특히, 이들 물질은 프로브 매체로서 취급될 때에 수용성인 것이 바람직한 경우, 이들 물질로부터 유도된 수용성 나트륨염, 즉 N-(4-말레이미도카프로일옥시) 술포숙신이미드, 나트륨염, N-(6-말레이미도카프로일옥시) 술포숙신이미드, 나트륨염, N-(8-말레이미도카프로일옥시) 술포숙신이미드, 나트륨염, N-(11-말레이미도카프로일옥시) 술포숙신이미드, 나트륨염이 이용될 수 있다. 또한, 실란 커플링제에 대해서는, 실라놀기는 알콕시실릴기의 가수분해에 의해 형성될 수도 있다. 실란 커플링제로서 2관능 시약과 반응할 수 있는 것으로 다양한 것을 들 수 있지만, 아미노기를 함유하는 아미노실란이 바람직하다. 이들 실란 커플링제는 필요에 따라서 가수분해된 후 프로브와 혼합될 수 있다.
수용성 고분자 재료의 예로는 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 파오겐, 카르복시메틸셀룰로오스(CMC), 히드록시에틸셀룰로오스(HEC), 덱스트란 및 풀룰란을 포함한다. 이들 중에서 폴리비닐 알코올(PVA) 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)은 널리 이용되는 재료이고, 프로브에 대해서도 안정하기 때문에 바람직하다. 널리 이용되는 재료인 폴리비닐 알코올(PVA)인 경우, 필요에 따라서 중합도 및 검화도를 조정하는 것이 바람직하다. 중합도 및 검화도를 조정 함으로써 프로브 매체 중 폴리비닐 알코올의 용해성 및 프로브 매체의 점도, 프로브 매체를 기재 상에 스폿팅함으로써 형성되는 스폿의 강도 및 이들의 흡습성을 조정하는 것이 가능해진다. 구체적으로는, 프로브 매체를 기재에 부여하는 데 문제가 없으면, 적절한 프로브 안정성을 얻을 수 있도록 중합도 및 검화도를 조정하는 것이 바람직하다. 또한, 프로브 매체를 기재에 부여함으로써 형성되는 프로브 고정 기재의 스폿 형상 특성 및 흡습성 등이 바람직한 상태가 되도록 조정할 수 있다. 그러나, 폴리비닐 알코올의 중합도가 너무 높은 경우에는 프로브 매체의 점도가 증가할 뿐만 아니라, 프로브 매체 중 폴리비닐 알코올의 용해성이 저하되기 때문에 프로브 매체를 기재에 안정하게 부여하는 것이 어려워진다. 폴리비닐 알코올의 검화도가 너무 높은 경우에는 프로브 매체 중 폴리비닐 알코올의 용해성이 저하될 뿐만 아니라, 프로브 매체의 점도가 향상되기 때문에 기재에 부여하는 것이 어려워진다. 이러한 문제점을 피하기 위해, 폴리비닐 알코올의 농도를 낮출 수 있지만, 이러한 농도 저하로 인해 프로브 안정성, 스폿 형상 특성 및 흡습성도 저하되기 때문에 적절한 폴리비닐 알코올의 선정 및 농도의 조정이 요구된다. 프로브 매체 중의 폴리비닐 알코올 농도는 0.001 내지 1 중량％가 되도록 조정하는 것이 바람직하다. 특히, 0.01 내지 0.2 중량％가 되도록 조정하는 것이 바람직하다. 프로브 매체 중에서의 폴리비닐 알코올 농도가 상기한 범위인 경우에는 폴리비닐 알코올의 중합도를 낮추고, 검화도를 높히는 것이 바람직하다. 폴리비닐 알코올의 중합도 및 검화도는, 예를 들면 중합도 200 내지 1700, 검화도 87 내지 99 몰％인 것이 바람직하다.
이러한 폴리비닐 알코올은 미리 용해시켜 둔 다음, 프로브 매체와 혼합할 수도 있다. 에탄올 및 디메틸술폭시드(DMSO) 등과 같은 유기 용매가 폴리비닐 알코올을 용해시키는 데에 이용될 수 있지만, 용해성을 고려한 경우에는 물 및 에탄올이 바람직하다. 용해시키는 방법으로는 폴리비닐 알코올을 물과 혼합시킨 후, 가온함으로써 불용해물을 빠르게 용해시킬 수 있다. 용해시킨 폴리비닐 알코올을 여과하여 불용해물을 제거한 후에 프로브 매체와 혼합시키는 것이 바람직하다. 이로써 얻어진 폴리비닐 알코올을 용해시킨 용액을, 프로브와 혼합하였을 때의 프로브 안정성을 고려하여, pH 6.0 내지 pH 9.0이고, 특히 pH 7.0 내지 pH 8.0로 조정하는 것이 바람직하다.
프로브 및 프로브를 기재에 고정하는 물질을 포함하는 프로브 매체의 매체는 물을 포함하는 것이 바람직하다. 물 이외에, 매체 중에 포함되는 성분으로는 에틸렌 글리콜, 티오디글리콜, 글리세린, 이소프로필 알코올, 에탄올 등의 유기 용매를 들 수 있다. 매체의 구체적인 예로는 물을 70 내지 95 중량％, 티오디글리콜 0.1 내지 3 ％, 이소프로필 알코올 5 내지 30 중량％를 포함하는 것이 있다. 보다 바람직한 매체는 물을 80 내지 90 중량％, 티오디글리콜 1 내지 2.5 중량％, 이소프로필 알코올 10 내지 20 중량％를 포함하는 것이다.
고비점 용매의 예에는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜 및 티오디글리콜이 포함된다. 이들 중에서, 티오디글리콜 및 디프로필렌 글리콜은 널리 이용되는 재료이고, 스폿팅용 매체로서도 적절하기 때문에 바람직하다. 글리콜계 고비점 유기 용매는 고점성 액체이기 때문에, 혼합시에서의 용매의 칭량이 어려워진다. 이 때문에 미리 이소프로필 알코올과 같은 저점성 액체와 혼합시키는 것이 바람직하다. 또한, 이소프로필 알코올 이외에, 알코올계 용매, 물 등이 이 목적으로 혼합되는 저점성 액체로서 이용될 수 있다. 고비점 용매의 첨가로서는, 프로브 매체로서 기재에 부여할 때의 스폿 형상 특성, 흡습성, 건조성, 건조 상태 등이 바람직한 상태가 되도록 조정하는 것이 바람직하다.
구체적인 매체로는 물을 70 내지 95 중량％, 티오디글리콜 0.1 내지 3 ％, 이소프로필 알코올 5 내지 30 중량％, 폴리비닐 알코올 0.001 내지 1 중량％를 포함하는 것을 들 수 있다. 보다 바람직한 매체는 물 80 내지 90 중량％, 티오디글리콜 1 내지 2.5 중량％, 이소프로필 알코올 10 내지 20 중량％, 폴리비닐 알코올 0.01 내지 0.2 중량％를 포함한다.
또한, 프로브 매체는 프로브가 효과적으로 기재에 고정되도록 돕는 프로브 고정 물질을 포함하는 것일 수도 있다. 프로브 고정 물질의 예에는, 프라이머, 커플링제, 실란트(sealant), 표면 처리제, 표면 개질제, 커플링제와 가교제가 서로 결합된 물질 및 커플링제와 2관능 시약이 서로 결합된 물질이 포함된다. 매체 중에 포함되는 물질의 양은 프로브의 기재로의 고정성을 고려하면, 특히 매체 중 예를 들면 0.05 내지 50000 μmol/l, 특히 10 내지 500 μmol/l의 농도가 되도록 조정하는 것이 바람직하다. 이들 물질은 프로브 또는 프로브의 관능기와 결합하는 관능기를 함유하는 것일 수 있고, 상기 관능기의 예에는 에폭시(CHOCH2)기, 아미노(NH2)기, 머캅토(SH)기, 말레이미드기, 클로로프로필(C3H6Cl)기 및 이소시아네이트(NCO)기가 포함된다. 특히, 프로브 관능기는 아미노(NH2)기, 카르보닐(COOH)기, 머캅토(SH)기, 히드록실(OH)기 등이 바람직하고, 프로브와 결합할 수 있는 관능기는 프로브 관능기와의 결합을 고려할 때, 에폭시기, 말레이미드기 및 클로로프로필기가 바람직하다. 또한, 이들 프로브를 기재에 고정하는 물질은 기재에 고정하기 위한 관능기를 갖는 것일 수도 있고, 이러한 관능기의 예에는 알콕시실릴(SiOR)기, 실라놀(SiOH)기 및 알콕시(OR)기가 포함된다. 특히, 기재 상에의 고정 용이성으로부터 알콕시실릴기 및 실라놀기가 바람직하다. 실라놀기는 알콕시실릴기의 가수분해에 의해 형성되는 것일 수도 있다. 프로브 및 상기 프로브를 기재에 고정하는 물질은 매체 중에서 반응함으로써 서로 결합하는 것일 수 있고, 반응은 관능기 사이에서의 화학 반응에 의하여 공유 결합을 형성하는 것이 바람직하다.
프로브 매체와 수용성 고분자 재료를 혼합시키기 위해, 미리 수용성 고분자 재료를 완전히 용해시킨 소정의 농도의 용액을 제조한다. 이로써 제조된 수용성 고분자 재료의 용액을 소정 농도가 되도록 칭량하여 혼합시키는 방법이 바람직하다. 구체적으로는, 이러한 수용성 고분자 재료 용액은, 폴리비닐 알코올 분말을 칭량하여 순수한 물 중에 0.5 내지 5 중량％의 농도가 되도록 혼합함으로써 제조된다. 혼합한 용액을 가온하여 폴리비닐 알코올을 용해시킨 후, 불용해물 및 불순물을 여과시켜서 제거한다. 이와 같이 하여 수용성 고분자 수용액을 제조한다. 이 수용성 고분자 수용액을, 프로브 매체에서의 농도가 0.01 내지 0.2 중량％가 되도록 프로브 매체와 혼합시키는 것이 바람직하다.
상기 프로브 매체는 다양한 절차로 혼합될 수 있다. 첫번째 방법은, 프로브와, 상기 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기 및 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 미리 혼합시킨 후, 매체, 즉 물과 같은 용매 및 유기 용매를 일정량 첨가하여 용액을 혼합시킨다. 필요에 따라서, 혼합물의 온도를 조정하여 소정 시간 경과 후, 매체의 첨가 혼합을 반복하여 행할 수도 있다. 마지막으로, 미첨가 용액 또는 첨가량이 적은 용액을 소정 비율이 될 때까지 가함으로써 프로브 매체를 제조하는 방법이 있다. 프로브 및 물질이 혼합되는 단계에서, 혼합에 의해 반응이 진행할 수 있으므로, 필요에 따라 혼합 단계의 온도, 혼합 시간, pH 등을 조정하는 것이 바람직하다. 프로브 및 물질의 혼합에 의해 반응이 진행되는 경우에는, 이들을 미리 혼합시킬 수 있고, 이로써 프로브, 물질간의 반응을 충분히 진행시키는 것이 용이해진다. 또한, 혼합의 조정에 의해 프로브 및 물질을 충분히 결합시키는 것이 용이해지므로 이 또한 바람직하다. 또한, 프로브 및 물질을 포함하는 혼합 매체로 용액을 첨가, 혼합시키는 경우, 프로브 및 물질의 혼합 후에 용액의 일부 또는 전부의 구성 성분, 예를 들면 물 및 유기 용매를 차례로 적가, 혼합, 조정할 수 있고, 별법으로 용액의 일부 또는 전부의 구성 성분, 예를 들면 물 및 유기 용매 등을 미리 혼합시킨 혼합 매체를 차례로 적가, 혼합, 조정할 수도 있다. 혼합 매체에서 프로브 및 물질이 서로 반응하는 경우에 있어서, 용액의 첨가에 의해 반응이 더욱 촉진되는 것이면, 첨가되는 매체의 구성 성분의 순서, 간격 및 첨가시의 상태를 조정하는 것이 바람직하다. 두번째 방법은, 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기 및 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 각각 다른 물질이 함유하는 경우에만 적용할 수 있는 것이지만, 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 및, 프로브 또는 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 중 어느 한쪽을, 매체의 일부 또는 전부, 예를 들면 물 및 유기 용매를 포함하는 용액과 혼합시킨 후에, 나머지 한쪽을 첨가 및 혼합시키는 것을 포함한다. 이 방법은, 프로브 또는 물질을 용액 중에 혼합 및 용해시키는 것이 곤란한 경우, 혼합 및 용해 조건을 조정할 수 있기 때문에, 또한 이들 모두를 동시에 혼합함으로써 소정의 반응 이외의 효과가 생기는 경우에 바람직하다. 특히 물질이 실란 커플링제이고 프로브와 결합할 수 있는 관능기가 용액 중에 혼합 및(또는) 용해시켰을 때에 안정한 경우에는, 물질을 미리 용액 중에 혼합 및 용해시키는 것에 의해 충분한 양의 실라놀기를 형성하는 것이 가능해지기 때문에 바람직하다. 세번째 방법은, 프로브 및 상기 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기 및 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 및 용액의 일부 또는 전부의 구성 성분을 각각 칭량하여, 이들 모두를 하나의 용기 중에 넣고, 한번에 혼합시키는 것을 포함한다. 이 방법은 프로브, 물질 및 용액의 혼합 순서에 의해 프로브 매체의 특성이 변화하지 않는 경우에 적용될 수 있고, 이는 혼합 공정을 간략화할 수 있기 때문에 바람직한 방법이다.
또한, 프로브 매체에 수용성 고분자 재료를 혼합시키는 순서는 특별히 제약되지 않지만, 다른 매체와 프로브를 혼합한 최후인 것이 바람직하다.
고비점 용매를 프로브 매체에 첨가 및 혼합시키는 방법은 그의 농도가 소정값에 도달할 수 있도록 미리 칭량해 두고 프로브 매체와 혼합시키는 방법이 바람직하다.
고비점 용매를 프로브 매체에 첨가 및 혼합시키는 순서는 특별히 제약되지 않지만, 다른 매체 및 프로브를 혼합한 후 마지막 단계에서 수용성 고분자와 함께 혼합시키는 것이 바람직하다.
이와 같이 하여 얻어진 프로브 매체는 표적 물질을 검출하는 데 바람직하다.
얻어진 프로브 매체를 기재 상에 스폿팅함으로써 프로브 고정 기재를 제조할 수 있다. 프로브가 고정되는 기재는, 특별히 제약되는 것은 아니지만, 표적 물질의 검출이나 또는 재료로서의 범용성을 고려하면, 유리 또는 석영 기재 재료가 바람직하다. 구체적인 재료로서는, 1 inch×3 inch 크기의 슬라이드 유리 기재가 바람직하고, 프로브 고정의 고정 특성 등을 고려하면, 유리 재질 중에 알칼리 성분 등이 포함되지 않는 무알칼리 재료 슬라이드 유리 기재 또는 석영 유리 재료인 것이 바람직하다. 또한, 표적 물질의 검출 방법에 따라서 기재상 등의 형상이 제약되는 것은 아니지만, 검출 방법 및 장치 등의 범용성으로 인해 기재 상태인 것이 바람직하다. 또한, 표면의 평활성이 높은 기재 재료인 것이 바람직하다.
또한, 프로브를 고정시키기 위한 기재로서, 균일하면서 확실하게 프로브를 기재 상에 고정시키기 위해서, 청정면인 것이 바람직하다. 프로브를 고정하기 전에 미리 기재를 세정함으로써 충분한 청정면을 확보해 두는 것이 바람직하다. 기재를 청소하는 방법으로는, 물에 의한 세정, 약물에 의한 세정, 플라즈마에 의한 세정 및 UV 오존에 의한 세정 등 많은 방법이 공지되어 있지만, 간이적이면서 또한 균일하게 세정하는 방법으로는, 약물에 의한 세정 방법이 적절하다. 예를 들면, 한 이용이능한 방법으로, 소정 농도의 수산화나트륨 수용액을 이용하여 기재 표면을 충분히 세정하여, 기재 상에 부착된 오염물을 제거하는 방법을 들 수 있다. 구체적으로는, 약 50 ℃로 가온한 1 mol/l 수산화나트륨 수용액을 준비하고, 수용액 중에서 기재 표면을 와이핑(wiping)하거나 또는 수용액을 샤워링(showering)하면서 브러싱함으로써 기재 상에 부착된 오염물을 확실하게 제거한다. 오염물을 제거한 후, 잔여 수산화나트륨을 물로 충분히 씻어 낸다. 마지막으로 N2 블로잉 등에 의해 물을 제거할 수 있다. 이와 같이 하여, 프로브 매체를 균일하면서 또한 확실하게 고정시킬 수 있는 기재를 얻을 수 있다.
또한, 프로브 매체 중에 프로브 고정 물질이 포함되지 않는 경우, 프로브 고정화 처리된 기재를 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 상기에 기재한 바와 같이 충분히 세정한 기재 상에 실란 커플링제를 이용하여 처리한 것이다. 예를 들면, 실란 커플링제를 물 및 에틸 알코올 혼합 용매 중에서 충분히 교반시킴으로써 형성된 용액 중에서, 세정한 기재를 침지시킨 후, 물로 세정함으로써 여분의 실란 커플링제를 제거하고 건조시킨 기재이다. 또한, 실란 커플링제를 에틸 알코올 중에 첨가한 용액을 충분히 교반시킴으로써 실란 커플링제 용액을 제조하여, 스핀 코팅법에 의해 이 용액을 세정한 기재 표면에 코팅한다.
프로브 매체를 기재 상에 스폿팅하는 방법으로 몇 가지가 공지되어 있다. 구체적인 방법으로는 핀법, 잉크젯법, 및 핀 및 링법이 공지되어 있다. 이들 중에서도 잉크젯법이 고밀도이면서 또한 정확한 스폿팅을 할 수 있기 때문에 바람직한 스폿팅 방법이다.
잉크젯법에 의한 스폿팅을 수행함에 있어서, 프로브 매체에 포함되는 성분은, 상기에 나타낸 바와 같이 잉크젯 헤드로부터 프로브 매체를 배출시켰을 때에 프로브 매체 중에서 프로브 및 상기 프로브를 기재에 고정하는 물질에 대하여 실질적으로 영향을 주지 않으며, 프로브 매체가 잉크젯 헤드를 이용하여 기재 상에 정상적으로 배출가능한 매체 조성을 만족시키는 것이라면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 잉크젯 헤드가 매체에 열 에너지를 부여하여 배출시키는 기구를 구비한 버블젯 헤드인 경우, 글리세린, 티오디글리콜 및 이소프로필 알코올을 포함하는 액체가 프로브 매체 성분으로서 바람직하다. 더욱 구체적으로는, 글리세린 5 내지 10 중량％ 및 티오디글리콜 5 내지 10 중량％를 포함하는 액체가 프로브 매체로서 바람직하다. 또한, 잉크젯 헤드가 압전 소자를 이용하여 매체를 배출시키는 피에조 젯 헤드(piezo jet head)인 경우, 에틸렌 글리콜 및 이소프로필 알코올을 포함하는 액체가 프로브 매체의 성분으로서 바람직하다. 더욱 구체적으로는, 에틸렌 글리콜 5 내지 10 중량％ 및 이소프로필 알코올 0.5 내지 2 중량％를 포함하는 액체가 프로브 매체로서 바람직하다.
이와 같이 하여 얻어진 프로브 매체를 잉크젯 헤드로부터 배출시켜 기재 상에 부착시켰을 때, 스폿의 형상은 원형이며, 또한 배출된 범위가 넓어지지 않을 것이다. 따라서, 심지어 고밀도로 프로브 매체를 스폿팅한 경우에도, 인접하는 스폿 과의 연결이 유효하게 억제된다. 또한, 수용성 고분자 및 고비점 용매가 첨가된 프로브 매체는, 심지어 스폿팅 후에 프로브 매체가 건조된, 건조 스폿 상태에서도, 프로브가 그대로 보존되고, 표적 물질이 검출되도록 한다. 또한, 건조 후에도 스폿 상태를 쉽게 관찰하는 것이 가능하고, 스폿팅에서 스폿이 성공적으로 형성되었는지를 확인하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 프로브 매체의 특성은 상기한 것으로 한정되는 것은 아니다.
프로브 및 기재에 대해서는, 프로브와 기재 사이 간의 반응을 통하여 서로 결합하는 것이 바람직하다. 이러한 반응을 통해 프로브는 기재에 단단히 고정된다. 그 결과, 프로브는 기재에 고정되어, 프로브의 스폿을 소정의 위치에 형성할 수 있다. 수용성 고분자 재료는 프로브를 기재에 고정시킬 때 악영향을 미치지 않으며, 수용성 고분자 재료를 프로브 매체 중에 첨가함으로써 스폿팅하였을 때 스폿 건조를 지연시키기 때문에, 프로브와 기재 사이의 반응이 충분히 진행되도록 한다.
기재에 부여된 프로브 매체 중에 포함되는 프로브를 소정의 위치에 고정하고, 인접하는 스폿에 포함되는 프로브로부터의 오염을 보다 확실하게 방지하며, 프로브를 기재에 단단히 고정하기 위한 유효한 수단으로서, 기재 상에 결합할 수 있는 부위에 결합하는 물질 뿐만 아니라 화학적 작용을 통해 기재에 결합하는 물질을 이용하는 방법이 있다. 이러한 화학적 작용에 의한 결합에는 다양한 것이 포함되며, 예를 들면 공유 결합, 이온 결합 등을 들 수 있다. 프로브를 기재에 단단히 고정하기 위하여 공유 결합이 바람직하다.
관능기의 바람직한 예로는, 물질측에 실라놀(SiOH)기, 기재 상에 히드록실(0H)기를 갖는 조합을 들 수 있다. 이 조합에 의해, 스폿팅에 의해 기재에 부여된 프로브 매체 중에 포함되는 물질의 실라놀기와 기재 상의 히드록실기가 반응하여 기재 상에 물질이 고정화된다. 바람직한 기재의 구체적인 예에는 기재 상에 히드록실기를 갖는 유리 재료 및 석영 기재 재료가 포함된다.
또한, 프로브 및 상기 프로브와 결합할 수 있는 부위가 화학적 작용에 의해 서로 결합한 것이 바람직하다. 화학적 작용으로서의 결합은, 예를 들면 공유 결합 및 이온 결합을 들 수 있다. 프로브를 기재에 단단히 고정시키기 위하여 공유 결합이 바람직하다. 그 결과, 프로브는 기재에 고정되어, 프로브의 스폿을 소정의 위치에 형성할 수 있다. 특히, 아미노 관능기를 갖는 프로브 및, 프로브와 결합할 수 있는 부위에 에폭시기 및 기재에 결합할 수 있는 부위에 실라놀기를 갖는 물질을 포함하는 프로브 매체를 제조하고, 소정의 비율이 되도록 글리세린, 티오디글리콜, 이소프로필 알코올과 혼합한 프로브 용액을 제조하였다. 이 프로브 용액을 관능기로서 히드록실기를 갖는 기재 상에 잉크젯 헤드를 이용하여 스폿팅을 행한 경우, 상기 프로브 용액은 기재 상에 안정한 크기의 스폿을 형성한다. 이와 같이 하여, 프로브를 기재 상의 소정의 위치에 고정시킬 수 있다. 또한, 관능기로서 아미노기를 갖는 프로브 및, 프로브와 반응할 수 있는 관능기에 이소시아네이트기를 갖고, 기재 상의 관능기와 반응할 수 있는 관능기에 실라놀기를 갖는 물질을 포함하는 프로브 매체를 제조하고, 소정의 비율이 되도록 글리세린, 티오디글리콜, 이소프로필 알코올과 혼합한 프로브 용액을 제조하였다. 이 프로브 용액을 관능기로서 히드록실기를 갖는 기재 상에 잉크젯 헤드를 이용하여 스폿팅을 행한 경우, 프로브 용액은 기재 상에 안정한 크기의 스폿을 형성한다. 이와 같이 하여, 프로브를 기재 상의 소정의 위치에 고정시킬 수 있다.
또한, 수용성 고분자 재료인 폴리비닐 알코올(PVA)을 프로브 매체 중에서 혼합시켜 둔 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 완전히 용해된 것이 바람직하다. 수용성 고분자 재료를 프로브 매체 중에서 혼합시키는 것은 기재 상의 스폿팅 상태의 관찰을 용이하게 하고, 스폿팅 후 스폿에서 프로브 매체가 건조되는 것을 지연시킴으로써, 프로브 매체 및 기재를 보다 확실하게 반응시켜 고정될 수 있게 한다. 또한, 스폿팅에 의해 제조된 프로브 고정 기재의 보관 상태를 고려한 경우, 스폿팅에 의해 형성된 프로브 매체 스폿이 건조된 경우에도, 이는 프로브 매체 스폿이 표적 물질의 보다 효율적이고 안정적으로 검출을 용이하게 한다.
예를 들면, 염기 길이 20 mer의 프로브를 포함하는 프로브 매체를 프로브 농도가 8 μmol/l가 되도록 제조하였다. 프로브 매체는 버블젯 프린터(상품명: BJF850; 캐논(주)사 제조, 단, 평판에 프린트할 수 있도록 개조한 것)를 이용하여, 1.2 내지 1.5 mm 정도로 설정된 고상과 버블젯 헤드의 노즐 간격으로 배출되며, 상기 노즐로부터 배출된(배출량은 약 4 피코리터) 프로브 매체는 기재 상에 직경 약 50 내지 80 μm의 스폿을 형성할 수 있고, 액체가 고상 표면에 착탄(着彈)하였을 때의 물방울로부터 유래한 스폿(이후 "세터라이트(satellite) 스폿"이라 함)은 돋보기를 이용한 육안 관찰에서는 전혀 확인되지 않았다.
또한, 상기 프로브 고정 기재(수용성 고분자 재료를 포함하지 않는 프로브 매체를 고정시킴으로써 형성됨)을 현미경 측정용 푸리에(Fourier) 변환 적외선 분 광 광도계(현미경 FT-IR)에 의해 분석하였다. 스폿 이외의 부위에서는, 기재로부터의 Si-O 결합 피크가 검출되었지만, 다른 결합 피크는 거의 확인되지 않았다. 이에 반하여, 스폿 형성 부위에서는 기재의 넓은 피크를 검출할 수 있었을 뿐 아니라, 매우 근소한 값이지만, 프로브 매체에 포함되는 프로브를 기재에 고정하는 물질의 -CH2- 결합의 피크가 검출되었다.
또한, 상기 프로브 고정 기재를 승온 탈리법(TDS: Thermal Desorption Spectrometry)에 의해 분석하였다. 분석을 행할 때, 스폿이 형성되어 있는 부위를 포함하는 7 mm2의 기판편과 스폿이 형성되어 있지 않은 스폿 외주 부위로 이루어진 7 mm2의 기판편을 기재로부터 절단 추출하여 비교하였다. 온도를 25 내지 500 ℃로 설정하고, 프로그래밍 속도(승온 속도)는 매분 5 ℃로 설정하였다. 그 결과, 양쪽 기판편의 이탈 성분 질량을 비교한 결과, 소정의 스폿 형성 부위에서는 CH4 및 CH3OH 등과 같은 프로브를 기재에 고정시키는 물질 및 프로브에 기여하는 많은 질량 피크가 150 ℃ 이상에서 많이 검출되었다. 이들로부터, 스폿 부위에만 프로브 매체가 스폿팅되고, 스폿 이외의 부위에는 프로브 매체 및 매체 중에 포함되는 물질이 부여되지 않은 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 프로브 고정 기재를 비행 시간형 이차 이온 질량 분석 장치(TOF-SIMS: Time Of Flight-Secondary Ion Mass Spectrometer)에 의해 분석하였다. 상기 부위를 분석할 때, 스폿 형성 부위 근방에 대하여 면 스캔을 행하여 비교하였 다. 그 결과, 스폿 형성 부위에서는 DNA로부터 유래된 PO2- 및 PO3- 이온이 검출되었다. 한편, 스폿이 형성되어 있지 않은 부분 뿐만 아니라 스폿 간극부에서는 PO2- 및 PO3- 이온이 검출되지 않았을 뿐만 아니라, 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기로부터 유래하는 이차 이온도 검출되지 않았다.
본 발명에서는, 이 프로브 고정 기재를 이용하여, 예를 들면 표적 물질의 검출 등을 행하는 경우의 검출 정밀도(S/N비)의 향상을 도모하기 위해, 상기 프로브를 고상 표면에 고정시킨 후, 상기 기재의 프로브 비결합 부분이 샘플 중에 포함되는 표적 물질 등과 결합하지 않도록 블로킹을 행할 수도 있다. 블로킹은 예를 들면, 상기 기재를 2 ％ 소혈청 알부민 수용액 중에, 예를 들면 2 시간 정도 침지시킴으로써 행해질 수 있다. 그러나, 소혈청 알부민 수용액이, 표적 물질이 기재의 프로브 고정 부위 이외의 부위에 흡착되는 것을 방지하는 효과가 있기 때문에 바람직하다. 또한, 상기 블로킹 단계는 필요에 따라 행할 수 있고, 예를 들면 샘플이 상기 프로브 고정 기재 상의 각각의 스폿에 대하여 한정적으로 공급되고, 상기 샘플이 스폿 이외의 부위에 실질적으로 부착되지 않는 경우에는 행하지 않을 수도 있다. 스폿 이외의 부위에 대한 샘플의 부착도는 기재가 되는 재료에 따라 좌우된다. 특히 기재가 유리 또는 석영인 경우에 있어서는, 블로킹 처리는 행하지 않을 수도 있다. 그러나, 프로브 매체 중에 프로브 고정 물질이 포함되지 않고, 기재가 프로브 고정화 처리된 경우에는 블로킹 처리를 하는 것이 바람직하다.
이렇게 하여 제조된 프로브 고정 기재는 그의 용도에 따라서, 예를 들면 동 일한 프로브를 포함하는 복수의 스폿을 갖도록 구성할 수도 있거나, 상이한 프로브들을 각각 함유하는 복수의 스폿을 갖도록 구성할 수도 있다. 프로브의 종류, 수량 및 배치는 필요에 따라서 적절하게 변경하는 것이 가능하다. 또한, 이와 같은 방법에 의해서 프로브가 고밀도로 배치된 프로브 고정 재료는, 그 후 표적 물질의 검출 또는 표적 물질 염기 서열의 특정 등에 이용된다. 예를 들면, 샘플 중에 포함되어 있을 가능성이 있는, 염기 서열을 알고 있는 표적 물질의 단일 가닥 핵산의 검출에 이용하는 경우에는, 상기 표적 물질인 단일 가닥 핵산의 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 핵산을 프로브로서 이용하고, 상기 프로브를 포함하는 복수의 스폿이 고상에 배치되어 있는 프로브 고정 기재를 준비한 다음, 상기 프로브 고정 기재의 각각의 스폿에 샘플을 공급하여 상기 표적 물질의 단일 가닥 핵산과 프로브와 혼성화되는 조건 하에 둔 후, 각각의 스폿에서의 혼성 유무를 형광 검출을 포함하는 통상적인 방법으로 검출한다. 이로써 샘플 중에서 표적 물질을 검출할 수 있다.
또한, 샘플 중에 포함되어 있는 표적 물질(단일 가닥 핵산)의 염기 서열의 특정에 이용하는 경우에는, 상기 표적 물질의 단일 가닥 핵산 염기 서열의 다수 후보를 설정하고, 상기 염기 서열군에 대하여 각각 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 핵산을 프로브로서 상기 기재 상에 스폿팅한다. 그 다음, 샘플을 각각의 스폿에 공급하여 상기 표적 물질의 단일 가닥 핵산이 프로브와 혼성화되는 조건 하에 둔 후, 각각의 스폿에서의 혼성 유무를 형광 검출을 포함하는 통상적인 방법으로 검출한다. 이로써, 표적 물질(단일 가닥 핵산)의 염기 서열을 특정할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 프로브 고정 기재의 다른 용도는, 예를 들면 DNA 결합 단백질이 인식하는 특이적인 염기 서열의 스크리닝이나 또는 DNA에 결합하는 성질을 갖는 화학 물질의 스크리닝을 포함한다.
프로브 매체는, 상기에 서술한 바와 같은 프로브 및 상기 프로브를 기재에 고정하는 물질을 포함할 수 있고, 프로브 및 상기 프로브를 기재에 고정하는 물질을 각각 용기 중에 수납하고, 기재에 고정시킬 때에 혼합되어 구성될 수도 있다.
프로브의 예에는 단일 가닥 핵산 프로브, 단일 가닥 DNA 프로브, 단일 가닥 RNA 프로브 및 단일 가닥 PNA 프로브 등이 포함된다. 매체 중에 포함되는 프로브의 양은, 프로브 매체로서의 핵산 프로브 안정성을 고려하면, 매체 중 예를 들면 2 mer 내지 500 mer, 특히 2 mer 내지 80 mer의 핵산 프로브를, 0.05 내지 500 μmol/l, 특히 0.5 내지 50 μmol/l의 농도가 되도록 조정하는 것이 바람직하다. 이러한 프로브는 관능기를 가질 수 있고, 이러한 관능기의 예에는 아미노(NH2)기, 이소시아네이트(NCO)기, 머캅토(SH)기 및 히드록실(OH)기 등의 관능기가 포함된다. 특히 프로브 관능기로는 프로브 관능기 합성의 용이성을 고려하면 아미노기가 바람직하고, 프로브 관능기의 반응성을 고려하면 머캅토기가 바람직하다.
프로브를 용기 중에 수납할 때, 용기는, 용기 중에 수납된 프로브로 다른 불순물이 혼입되지 않도록 밀폐가능한 용기인 것이 바람직하고, 고정시킬 때에 용이하게 개봉되어 내용물이 혼합될 수 있도록 개봉가능한 것이어야 한다. 용기의 개봉에 대해서는 특별히 한정되지 않는다. 용기 중에 수납할 때의 프로브의 상태는 특별히 한정되지 않지만, 용액상이거나 또는 분말상일 수 있다. 관능기가 머캅토기 등인 경우, 프로브의 안정성을 고려하여 동결-건조법 등에 의해 분말로 전환시키는 것이 바람직하다. 보관 상태는, 프로브의 안정성을 확보하기 위해서 냉동 보존하는 것이 바람직하지만, 보관 기간, 프로브 종류 및 프로브 관능기 등에 따라서 보관 상태를 변경할 수 있다. 이와 같이, 프로브를 용기 중에 수납하여, 보관한 상태로 기재에 고정시킬 때에 혼합할 수도 있다.
프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기 및 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질에는, 프라이머, 커플링제, 실란트, 표면 처리제, 표면 개질제 등이 포함된다. 이러한 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기로서는 에폭시(CHOCH2)기, 아미노(NH2)기, 머캅토(SH)기, 말레이미드기, 이소시아네이트(NCO)기, 클로로프로필(C3H6Cl)기 등이 포함된다. 특히, 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기로는, 프로브 관능기와의 결합을 고려하면 에폭시기, 말레이미드기, 이소시아네이트기 및 클로로프로필기가 바람직하다. 또한, 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기에는 알콕시실릴(SiOR)기, 실라놀(SiOH)기, 알콕시(OR)기 등이 포함된다. 기재 상에의 고정 용이성, 반응성으로부터 알콕시실릴기 및 실라놀기가 특히 바람직하다. 실라놀기는 알콕시실릴기의 가수분해에 의해 형성되는 것일 수도 있다. 프로브 및 상기 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기는 매체 중에서 반응함으로써 결합하는 것일 수도 있고, 반응은 관능기들 간의 화학 반응에 의하여 공유 결합을 형성하는 것이 바람직하다.
프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기 및 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 용기 중에 수납할 때, 용기는 다른 불순물이 혼입되지 않고, 물질이 휘발함으로써 감량되지 않도록 밀폐하는 것이 가능하거나, 또는 밀폐된 용기인 것이 바람직하고, 또한 고정시킬 때에 용이하게 개봉되어 내용물이 혼합될 수 있도록 용이하게 개봉될 수 있는 것이어야 한다. 그러나, 용기의 개봉에 대해서는 특별히 한정되지 않는다. 용기 중에 수납할 때의 프로브의 상태는 특별히 한정되지 않지만, 용액상이거나 또는 분말상일 수 있다. 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기 및 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 각각 다른 물질 중에 갖는 경우에는, 각각의 물질들을 동일한 용기 중에 수납하거나, 또는 상이한 별도의 용기 중에 수납하거나, 특별히 제약되지는 않지만, 프로브 매체를 형성하는 데에 적절하도록 수납하는 것이 바람직하다. 용기 중에 수납되는 물질의 상태는 특별히 제한되지 않으며, 용액상이거나 또는 분말상일 수 있다. 또한, 기재에 고정하는 데 이용되는 관능기의 일례인 실라놀기를 형성하기 위해서 가수분해한 용액일 수도 있다. 보관 상태로서는, 물질의 안정성을 확보하기 위해서 실온 보존하는 것이 바람직하지만, 보관 기간 등에 따라 보관 상태를 변경할 수 있다. 특히, 가수분해한 용액을 이용하는 경우에는 보관 중 온도가 상승하지 않도록 유지되는 것이 바람직하다. 또한, 프로브를 기재에 고정하는 물질의 관능기에 따라, 가수분해시 또는 가수분해 후의 pH를 조정함으로써 안정성을 얻는 것이 바람직하다.
프로브를 기재에 고정시킬 때에, 이들 용기에 수납된 프로브와, 상기 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기 및 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 혼합할 때, 필요에 따라서 물 등의 용액을 첨가할 수도 있다. 또한, 프로브 매체를 형성하도록 충분히 혼합할 수 있는 물질, 예를 들면 물 등의 용매를 별도의 용기에 수납해 두고, 프로브 매체 제조시에 혼합할 수도 있다.
수용성 고분자 재료의 예에는 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 파오겐, 카르복시메틸셀룰로오스(CMC), 히드록시에틸셀룰로오스(HEC), 덱스트란 및 풀룰란 등이 포함된다. 이들 중에서 폴리비닐 알코올(PVA) 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)은 널리 이용되는 재료이고, 프로브에 대해서도 안정하기 때문에 바람직하다. 널리 이용되는 재료인 폴리비닐 알코올(PVA)인 경우, 필요에 따라서 중합도 및 검화도를 조정하는 것이 바람직하다. 중합도 및 검화도를 조정함으로써 프로브 매체 중 폴리비닐 알코올의 용해성 및 프로브 매체의 점도를 조정하는 것이 가능해진다. 구체적으로는, 프로브 매체로서 기재에 부여하는 데 문제가 없으면, 적절한 프로브 안정성이 얻어지도록 중합도 및 검화도를 조정하는 것이 바람직하다. 그러나, 폴리비닐 알코올의 중합도 및 검화도가 너무 높은 경우에는, 프로브 매체의 점도가 향상될 뿐만 아니라 프로브 매체 중 폴리비닐 알코올의 용해성이 저하되기 때문에, 프로브 매체로서 조정할 때에 용해가 곤란해진다. 이것을 피하는 방법으로서 폴리비닐 알코올의 농도를 낮추는 방법을 들 수 있지만, 농도 저하에 의한 프로브 안정성, 스폿 형상 특성 및 흡습성 등이 저하되기 때문에 적절한 폴리비닐 알코올을 선정하고, 농도를 조정하는 것이 필요하다. 프로브 매체 중의 폴리비닐 알코올로의 농도는 0.001 내지 1 중량％가 되도록 용기 중에 수납하는 것이 바람직하다.
이와 같이 용해가 곤란한 경우, 수용성 고분자 재료는 미리 용해시켜 둔 후, 프로브 매체와 혼합할 수도 있다. 에탄올 및 디메틸술폭시드(DMSO)과 같은 유기 용매가 매체를 용해시키는 데에 이용될 수 있지만, 용해성을 고려한 경우에는 물 및 에탄올이 바람직하다. 용해시키는 방법으로는 폴리비닐 알코올을 물 중에 혼합한 후, 가온함으로써 불용해물을 빠르게 용해시킬 수 있다. 용해시킨 폴리비닐 알코올 중에 불순물 및 불용해물이 없도록 여과시킨 후에 프로브 매체와 혼합시키는 것이 바람직하다. 폴리비닐 알코올을 용해시킨 용액의 경우 프로브와 혼합하였을 때의 프로브 안정성을 고려하여 pH 6.0 내지 pH 9.0이고, 특히 pH 7.0 내지 pH 8.0로 조정하는 것이 바람직하다.
수용성 고분자 재료를 용기 중에 수납할 때, 용기는 다른 불순물이 용기에 혼입되지 않고, 물질이 휘발함으로써 감량되지 않도록 밀폐하는 것이 가능하거나 또는 밀폐된 용기인 것이 바람직하고, 고정시킬 때에 용이하게 개봉되어 내용물이 혼합될 수 있도록 용이하게 개봉될 수 있는 것이어야 한다. 보관 상태는 물질의 안정성을 확보하기 위해서 실온 보존하는 것이 바람직하지만, 보관 기간 등에 따라서 보관 상태를 변경할 수 있다. 특히, 수용성 고분자 재료의 용액이 이용되는 경우에는 보관 중 온도가 상승하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 프로브를 기재에 고정하는 물질의 관능기에 따라 pH를 조정함으로써 프로브 안정성을 얻는 것이 바람직하다.
고비점 용매의 예에는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 티오디글리콜 등이 포함된다. 이들 중에서, 티오디글리콜 및 디프로필렌 글리콜은 널리 이용되는 재료이고, 스폿팅용 매체로서도 적절하기 때문에 바람직하다. 고비점 용매가 첨가되는 경우, 기재 상에 부여시 프로브 매체로서의 스폿 형상 특성, 흡습성 및 건조성 등이 바람직한 상태가 되도록 조정하는 것이 바람직하다.
고비점 용매를 용기 중에 수납할 때, 용기는 다른 불순물이 용기에 혼입되지 않고, 물질이 휘발함으로써 감량되지 않도록 밀폐하는 것이 가능하거나 또는 밀폐된 용기인 것이 바람직하고, 고정시킬 때에 용이하게 개봉되어 내용물이 혼합될 수 있도록 용이하게 개봉될 수 있는 것이어야 한다. 보관 상태로서는 물질의 안정성을 확보하기 위해서 실온 보존하는 것이 바람직하지만, 보관 기간 등에 따라 보관 상태를 변경할 수 있다. 특히, 고비점 용매인 경우에는 보관 중 온도가 상승하지 않는 것이 바람직하다.
프로브를 기재에 고정시킬 때, 이들 용기에 수납된 프로브 및 프로브를 고정하는 물질을 혼합할 때, 필요에 따라 물 등의 용액을 첨가할 수도 있다. 또한, 프로브 매체를 형성하도록 충분히 혼합시킬 수 있는 물질, 예를 들면 물 등의 용매를 별도의 용기에 수납해 두고, 프로브 매체 제조시에 혼합할 수도 있다.
이하 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
<실시예 1>
(1) 프로브의 합성
표적 물질에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 프로브로서 단일 가닥 DNA 프로브를 이용하였다. DNA 자동 합성기를 이용하여 서열 1의 단일 가닥 DNA를 합성하고, 그의 5' 말단의 히드록실기에 인산기 및 헥사메틸렌을 통해 아미노기를 결합하여, 식 (1)의 18량체의 올리고머를 준비하고, 이하의 실험에 이용하였다.
5'H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTITACA3' (1)
(2) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기 및 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질(프로브 결합 물질)
프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기 및 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 제조하기 위해, 에폭시기를 갖는 실란 화합물(γ-글리시독시프로필트리메톡시 실란)을 포함하는 실란 커플링제(상품명: KBM-403; 신에츠 가가꾸 고교(주)사 제조)의 500 μmol/l 수용액을 실온하에 30 분간 교반하여 프로브 결합 물질 용액을 제조하였다. 제조한 프로브 결합 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
(3) 프로브 매체의 제조
상기 식 (1)의 단일 가닥 DNA 프로브를 최종 농도가 약 40 μmol/l가 되도록 TE 용액(10 mM Tris-HCl(pH 8)/1 mM 에틸렌디아민사아세트산(EDTA) 수용액)에 용해시켜 단일 가닥 DNA 프로브 용액을 제조하였다(정확한 농도는 흡수 강도로부터 산출).
이어서, 수용성 고분자 재료인 폴리비닐알코올(PVA)을 농도 0.5 중량％가 되도록 순수한 물 중에 용해시켰다. 상기 폴리비닐알콜을 완전히 용해시키기 위해서 생성된 용액을 고온욕 중에서 80 ℃로 가온하면서 60 분간 교반하였다. 불용해물이 없는 것을 확인한 후, 스폿팅에 있어서 노즐 막힘이 발생하지 않도록 상기 용액을 여과하여 PVA 수용액을 제조하였다.
상기와 같이 제조한 프로브 용액 100 ㎕를 준비하여, 이것에 상기와 같이 제조한 프로브 결합 물질 용액 100 ㎕를 적가한 후, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 용액을 10 분간 방치한 후, 순수한 물을 700 ㎕, 상기와 같이 제조한 PVA 수용액 100 ㎕를 적가하여 5 분간 혼합하였다. 혼합한 후, 30 분간 방치하여 프로브 매체를 제조하였다.
(4) 기재 세정
1 인치 ×3 인치의 유리 기재(두께: 1.1 mm)을 카세트에 넣고, 미리 60 ℃로 가온한 1 mol/l 수산화나트륨 수용액에 유리 기재를 10 분간 침지하였다. 이어서, 흐르는 순수한 물 중에서 충분히 헹구어 유리 기재 및 카세트에 부착된 수산화나트륨을 수세하여 제거하였다. 충분히 헹군 후, 순수한 물 중에 카세트와 함께 유리 기재를 침지하여 초음파 세정을 10 분간 행하였다. 초음파 세정한 후, 흐르는 순수한 물 중에서 충분히 헹구어, 유리 기재 및 카세트에 부착된 입자를 수세하여 제거하였다. 수세 후의 유리 기재를 1 매씩 질소 가스 블로잉에 의해 건조시켰다. 기재의 세정을 확인하기 위해서, 기재 상에서의 순수한 물의 접촉각을 측정하였다. 그 결과, 기재의 모든 부위에서 약 5 °였다.
(5) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (3)에서 제조한 프로브 매체를 버블젯 프린터(상품명: BJF850; 캐 논(주)사 제조)용 잉크 탱크에 충전하여 버블젯 헤드에 장착하였다. 또한, 여기서 이용한 버블젯 프린터(상품명: BJF850; 캐논(주)사 제조)는 평판에의 인쇄가 가능하 도록 개조를 실시한 것이다. 계속해서, 상기 프린터에 상기 단계 (4)에서 준비한 유리 기재를 장착하고, 프로브 매체를 유리 기재 상에 스폿팅하였다. 여기서 버블젯 헤드의 액체 배출면과 유리 기재의 액체 부착면과의 거리는 1.2 내지 1.5 mm였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과, 유리 기재 표면에 매트릭스상의 스폿 어레이가 형성되어 있는 것이 확인되었다. 또한, 스폿 형성 부위의 외주에서 순수한 물의 접촉각을 측정하였다. 그 결과, 기재의 모든 부위에 있어서 그 접촉각이 약 5 °였다. 이 결과로부터, 스폿 형성 부위 이외에는 프로브 매체 등에 의한 오염 등은 발생하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 데시케이터 중에 정치하였다. 이와 같이 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(6) 블로킹 처리
상기 단계 (5)에서 제조한 프로브 고정 기재를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액(pH 7.0) 용액으로 충분히 세정하여 프로브 고정 기재 상을 젖게 하고, 균일한 블로킹 처리를 할 수 있도록 하였다. 계속해서 유리 기재를 2 ％ 소혈청 알부민 수용액 중에 침지하고, 2 시간 방치하여 블로킹 처리를 행하였다.
(7) 혼성화 처리
상기 단계 (1)에 기재된 식 (1)의 단일 가닥 DNA 프로브에 대해 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 DNA를 DNA 자동 합성기로 합성하여, 5' 말단에 로다민을 결합시켜 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브를 얻었다. 이 표지화된 단일 가닥 DNA를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 최종 농도 1 μM가 되도록 용해시키고, 이 용액 중에 상기 단계 (6)에서 얻은 블로킹 처리한 프로브 고정 기재를 침지하여 실온(25 ℃)에서 3 시간 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액(pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 버렸다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로, 상기 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너(상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 형광 강도 평가시에 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V로 설정하였다.
(8) 결과
상기 단계 (7)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전 매치인 식 (1)의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 14830이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 614이었다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는, 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일한 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 μm의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
<실시예 2>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 1과 완전 동일하게 하여 단일 가닥 DNA 프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기와 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (프로브 결합 물질)
프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기와 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 제조하기 위하여 에폭시기를 갖는 실란 화합물 (γ-글리시독시프로필트리메톡시실란)을 포함하는 실란 커플링제 (상품명: KBM-403; 신에쯔 가가꾸 고교(주)사 제조)를 준비하였다. 이 실란 커플링제를 이하의 실험에 이용하였다.
(3) 프로브 매체의 제조
상기 실시예 1과 동일하게 하여 단일 가닥 DNA 프로브 용액 및 PVA 용액을 제조하였다.
상기한 대로 제조한 프로브 용액을 10 ㎖ 준비하고, 여기에 상기한 실란 커플링제 11 ㎕ 적가한 후, 20 분간 혼합하였다. 혼합한 용액을 30 분간 방치한 후, 순수 5 ㎖씩 적가, 혼합을 반복하면서 합계 80 ㎖의 순수한 물을 적가하였다. 이어서 상기한 대로 제조한 PVA 수용액을 10 ㎖ 적가하여, 10 분간 혼합하였다. 혼합한 후, 30 분간 방치하여 프로브 매체를 제조하였다 (정확한 농도는 흡수 강도로부터 산출).
(4) 기재 세정
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 기재 세정을 행하여, 유리 기재를 준비하였다.
(5) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (3)에서 제조한 프로브 매체를 상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 스폿팅을 행하여, 프로브 고정 기재를 제조하였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과 유리 기재 표면에 매트릭스상의 스폿 어레이가 형성되어 있다는 것이 확인되었다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 데시케이터 중에 정치하였다. 이와 같이 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(6) 블로킹 처리
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 블로킹 처리를 행하였다.
(7) 혼성화 처리
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가함에 있어서, 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V로 설정하였다.
(8) 결과
상기 단계 (7)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전 매치하는 식 1의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 23400였다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 672였다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
<실시예 3>
(1) 프로브의 합성
표적 물질에 대하여 특이적으로 결합 가능한 프로브로서 단일 가닥 DNA 프로브를 이용하였다. DNA 자동 합성기를 이용하여 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4의 단일 가닥 핵산을 합성하였다. 서열 2 내지 4의 단일 가닥 DNA는, 실시예 1에서 이용한 서열 1을 기본으로 하고, 1 염기 변화시킨 것을 서열 2, 3 염기 변화시킨 것을 서열 3, 그리고 6 염기 변화시킨 것을 서열 4라 하였다. 또한 각각의 서열 1 내지 4의 단일 가닥 DNA의 5' 말단의 수산기에, 인산기와 헥사메틸렌을 통해 아미노기를 결합하고 식 (1), (2), (3) 및 (4)의 18 량체의 올리고머를 얻어, 이하의 실험에 이용하였다.
5'H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTTGTTTTACA3' (2)
5'H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGCTTTTTTACA3' (3)
5'H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCATCTTGTTTACA3' (4)
(2) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기와 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (프로브 결합 물질)
프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기와 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 제조하기 위하여 에폭시기를 갖는 실란 화합물 (γ-글리시드옥시프로필트리메톡시실란)을 포함하는 실란 커플링제 (상품명: KBM-403; 신에쯔 가가꾸 고교(주)사 제조)를 준비하였다. 이 실란 커플링제를 이하의 실험에 이용하였다.
(3) 프로브 매체의 제조
상기 서열 1 내지 4의 단일 가닥 DNA를 이용하여, 상기 실시예 2의 (3)에 기재한 방법과 동일한 방법으로 4 종류의 프로브 매체를 제조하였다 (정확한 농도는 흡수강도로부터 산출).
(4) 기재 세정
상기 실시예 1과 완전 동일하게 하여 기재 세정을 행하고, 유리 기재를 준비하였다.
(5) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (3)에서 제조한 4 종류의 프로브 매체를 버블 제트 프린터 (상품명: BJF 850; 캐논(주)사 제조) 용의 4 개의 잉크 탱크에 각각 충전하고, 각각의 잉크 탱크를 버블 제트 헤드에 장착하였다. 또한 여기서 이용한 버블 제트 프린터 (상품명: BJF 85O; 캐논(주)사 제조)는 평판으로의 인쇄가 가능하도록 개조를 실시한 것이다. 계속해서 이 프린터에 상기 단계 (4)에서 준비한 유리 기재를 장착하 고, 4 종의 프로브 매체의 각각을 이 유리 기재의 3×3 mm으로 이루어지는 4개의 영역의 각각에 스폿팅하였다. 또 각 영역 내에서의 스폿팅의 패턴은 실시예 1과 동일하였다. 여기서 버블 제트 헤드의 액체 배출면과 유리 기재의 액체 부착면과의 거리는 1.2 내지 1.5 mm였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과 유리 기재 표면에 매트릭스상의 스폿 어레이가 형성되어 있는 것이 확인되었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 데시케이터 내에 정치하였다. 이와 같이 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(6) 블로킹 처리
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 블로킹 처리를 행하였다.
(7) 혼성화 처리
상기 실시예 1과 완전 동일하게 하여 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음에 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가함에 있어서 레이저 파워를 100 ％로 설정하고 PMT를 400 V로 설정하였다.
(8) 결과
상기 단계 (7)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식 1의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 14380이었다. 이에 대하여 1 염기의 미스 매치 서열을 갖는 식 (2)의 DNA 프로브의 스폿에 대해서는, 8960의 형광량이 얻어졌다. 또한, 3 염기 미스 매치를 갖는 식 (3)의 DNA 프로브의 스폿에 대해서는 2032으로, 완전 매치의 반 이하의 형광량 밖에 얻어지지 않고, 6 염기 미스 매치의 식 (4)의 DNA 프로브에 대해서는 형광 스폿의 인식할 수 없고, 스폿 해당 부위에 있어서의 형광 강도는 876이었다. 또한 DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역의 형광 강도를 관찰한 결과 637이었다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다. 이상으로부터, DNA 어레이 기재 상에서 완전 상보성의 단일 가닥 DNA를 특이적으로 검출할 수 있었다.
<실시예 4>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 1과 완전 동일하게 하여 단일 가닥 DNA 프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기와 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (프로브 결합 물질)
프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기와 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 제조하기 위하여 에폭시기를 갖는 실란 화합물 (γ-글리시독시프로필트리메톡시실란)을 포함하는 실란 커플링제 (상품명: KBM-403; 신에쯔 가 가꾸 고교(주)사 제조)를 준비하였다. 이 실란 커플링제를 이하의 실험에 이용하였다.
(3) 프로브 매체의 제조
상기 실시예 1과 완전 동일하게 하여 단일 가닥 DNA 프로브 용액을 제조하였다.
상기한 대로 제조한 프로브 용액을 1O ㎖ 준비하고, 여기에 상기한 실란 커플링제 11 ㎕ 적가한 후, 20 분간 혼합하였다. 혼합한 용액을 30 분간 방치한 후, 글리세린 7.5 중량％, 우레아 7.5 중량％, 및 티오디글리콜 7.5 중량％를 포함하는 수용액을 5 ㎖씩 적가, 혼합을 반복하면서 합계 90 ㎖의 순수한 물을 적가하였다. 계속하여, 10 분간 혼합하였다. 혼합한 후, 30 분간 방치하여, 프로브 매체를 제조하였다.
(4) 기재 세정
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 기재 세정을 행하여, 유리 기재를 준비하였다.
(5) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (3)에서 제조한 프로브 매체를 상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여스폿팅을 행하고, 프로브 고정 기재를 제조하였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과 유리 기재 표면에 매트릭스상의 스폿 어레이가 형성되어 있다는 것이 확인되었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액을 채운 용기 중에 침지하여, 용기와 함께 냉장고에 넣어 냉장 보관 (4 ℃)하였다. 이와 같이 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(6) 블로킹 처리
상기 단계 (5)에서 제조한 프로브 고정 기재를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로부터 꺼냈다. 계속해서 유리 기재를 2 ％ 소혈청 알부민 수용액을 채운 용기 중에 침지하고 2 시간 방치하여 블로킹 처리를 행하였다.
(7) 혼성화 처리
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000 B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가함에 있어서 레이저 파워를 100 ％로 설정하고 PMT를 400 V로 설정하였다.
(8) 결과
상기 단계 (7)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식 (1)의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 23400이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 628이었다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있다는 것이 관찰되었다.
<실시예 5>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 단일 가닥 DNA 프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기와 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (프로브 결합 물질)
프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기와 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 제조하기 위하여 클로로프로필기를 갖는 실란 화합물 (γ-클로로필트리메톡시실란)을 포함하는 실란 커플링제 (상품명: KBM-703; 신에쯔 가가꾸 고교(주)사 제조)의 500 μmol/l 수용액을 pH 4.0이 되도록 pH를 조정한 후, 실온하에서 30 분간 교반하여 프로브 고정 물질 용액을 제조하였다. 제조한 프로브 고정 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
(3) 프로브 매체의 제조
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 단일 가닥 DNA 프로브 용액을 제조하였다.
상기한 대로 제조한 프로브 용액을 100 ㎕ 준비하고, 여기에 상기한 대로 제조한 프로브 고정 물질 용액 100 ㎕ 적가한 후, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 용액을 10 분간 방치한 후, 순수한 물을 800 ㎕ 적가하여, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 후, 30 분간 방치하여 프로브 매체를 제조하였다.
(4) 기재 세정
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 기재 세정을 행하여, 유리 기재를 준비하였다.
(5) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (3)에서 제조한 프로브 매체를 상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여스폿팅을 행하여, 프로브 고정 기재를 제조하였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과, 유리 기재 표면에 매트릭스 상의 스폿 어레이가 형성되어 있는 것이 확인되었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액을 채운 용기 중에 침지하여, 용기와 함께 냉장고에 넣어 냉장 보관 (4 ℃)하였다. 이와 같이 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(6) 블로킹 처리
상기 실시예 4와 완전히 동일하게 하여 블로킹 처리를 행하였다.
(7) 혼성화 처리
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조 시켰다. 다음으로 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가함에 있어 서, 레이저 파워를 100 ％로 설정하고 PMT를 400 V로 설정하였다.
(8) 결과
상기 단계 (7)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식 (1)의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 11320이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 641이었다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는 각각의 스폿 형상은 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자 상으로 스폿이 배치되어 있다는 것이 관찰되었다.
<실시예 6>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 단일 가닥 DNA 프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기와 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (프로브 결합 물질)
프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기와 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 제조하기 위하여 클로로프로필기를 갖는 실란 화합물 (γ-클로로필트리메톡시실란)을 포함하는 실란 커플링제 (상품명: KBM-703; 신에쯔 가가꾸 고교(주)사 제조)를 준비하였다. 이 실란 커플링제를 이하의 실험에 이용하였 다.
(3) 프로브 매체의 제조
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 단일 가닥 DNA 프로브 용액 및 PVA 용액을 제조하였다.
상기한 대로 제조한 프로브 용액을 1O ㎖ 준비하여, 여기에 상기한 실란 커플링제 10 ㎕ 적가한 후, 20 분간 혼합하였다. 혼합한 용액을 30 분간 방치한 후, 순수한 물을 5 ㎖씩 적가, 혼합을 반복하면서 합계 80 ㎖의 순수한 물을 적가하였다. 이어서, 상기한 대로 제조한 PVA 수용액을 10 ㎖ 적가하여, 10 분간 혼합하였다. 혼합한 후, 30 분간 방치하여 프로브 매체를 제조하였다.
(4) 기재 세정
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 기재 세정을 행하여, 유리 기재를 준비하였다.
(5) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (3)에서 제조한 프로브 매체를 상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여스폿팅을 행하여, 프로브 고정 기재를 제조하였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과 유리 기재 표면에 매트릭스 상의 스폿 어레이가 형성되어 있다는 것이 확인되었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 데시케이터 내에 정치하였다. 이와 같이 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(6) 블로킹 처리
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 브로킹 처리를 행하였다.
(7) 혼성화 처리
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로, 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가에 있어서, 레이저 파워를 100 ％로 설정하고 PMT를 400 V로 설정하였다.
(8) 결과
상기 단계 (7)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식 1의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 15790이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 608이었다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는, 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
<실시예 7>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 식 1의 단일 가닥 DNA 프로브를 준비 한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기와 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (프로브 결합 물질)
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기와 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(3) 프로브 매체의 제조
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 프로브 매체를 제조하였다.
(4) 기재 세정
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 기재 세정을 행하여 유리 기재를 준비하였다.
(5) 프로브 매체의 스폿팅
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(6) 블로킹 처리
상기 실시예 1에 있어서 실시한 블로킹 처리를 완전히 수행하지 않고, 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여, 프로브 고정 기재 상을 적셔, 균일한 혼성화 처리를 할 수 있도록 하였다.
(7) 혼성화 처리
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵 산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가에 있어서, 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V로 설정하였다.
(8) 결과
상기 단계 (7)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식 1의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 23400이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 658이었다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 스폿부 이외의 영역에서 블로킹 처리를 행하지 않은 것에 기인한 형광 강도의 증가는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있다는 것이 관찰되었다.
<실시예 8>
(1) 프로브의 합성
표적 물질에 대하여 특이적으로 결합 가능한 프로브로서 단일 가닥 DNA 프로브를 이용하였다. DNA 자동 합성기를 이용하여 서열 5의 단일 가닥 핵산을 합성하고, 그 말단에는 DNA 자동 합성기에 의한 합성 동안에 티올-모디파이어 (Thiol- Modifier) (그렌 리서치 (Glen Research)사 제조)를 이용함으로써 머캅토 (SH)기를 도입하였다. 계속해서 통상의 탈보호를 행하고, DNA를 회수하여, 고속 액체 크로마토그래피로 정제하여 식 (5)의 올리고머를 얻고, 이하의 실험에 이용하였다.
5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3' (5)
(2) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (프로브 결합 물질)
프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 제조하기 위하여 말레이미드기, 히드록시숙신이미드에스테르기를 갖는 2가성 시약 N-(6-말레이미도카프로일옥시) 술포숙신이미드, 나트륨 염 (상품명: sulfo-EMCS; (주) 도진 가가꾸 겐뀨쇼사 제조)의 500 μmol/l 수용액을 실온하에서 5 분간 교반하여, 프로브 결합 물질 용액을 제조하였다. 제조한 프로브 결합 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
(3) 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (기재 결합 물질)
기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 제조하기 위하여 아미노기를 갖는 실란 화합물 (N-β(아미노에틸)γ-아미노프로필트리메톡시실란)을 포함하는 실란 커플링제 (상품명: KBM-603; 신에쯔 가가꾸 고교(주)사 제조)의 20 mmol/l 수용액을 실온하에서 30 분간 교반하여 기재 결합 물질 용액을 제조하였다. 제조한 기재 결합 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
(4) 프로브 매체의 제조
상기 식 (5)의 단일 가닥 DNA 프로브를 최종 농도가 약 40 μmol/l이 되도록 TE 용액 (10 mM Tris-HC1 (pH 8)/1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 수용액)에 용해하여, 단일 가닥 DNA 프로브 용액을 제조하였다 (정확한 농도는 흡수 강도로부터 산출).
상기한 대로 제조한 프로브 용액을 100 ㎕ 준비하여, 여기에 상기 단계 (2)에서 제조한 프로브 결합 물질 용액을 100 ㎕ 적가한 후, 5 분간 혼합하였다. 이어서 상기 단계 (3)에서 제조한 기재 결합 물질 용액을 100 ㎕ 적가한 후, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 용액을 10 분간 방치한 후, 글리세린 7.5 중량％, 우레아 7.5 중량％, 및 티오디글리콜 7.5 중량％를 포함하는 수용액을 700 ㎕ 적가하고, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 후, 30 분간 방치하여 프로브 매체를 제조하였다.
(5) 기재 세정
1 인치 ×3 인치의 유리 기재 (두께: 1.1 mm)를 카세트에 넣고, 미리 60 ℃로 가온한 1 mol/l 수산화 나트륨 수용액에 유리 기재를 10 분간 침지하였다. 계속해서 흐르는 순수한 물 중에서 충분히 헹궈, 유리 기재 및 카세트에 부착한 수산화 나트륨을 수세, 제거하였다. 충분히 헹군 후, 순수한 물 중에 카세트와 함께 유리 기재를 침지하여, 초음파 세정을 10 분간 행하였다. 초음파 세정 후, 흐르는 순수한 물 중에서 충분히 헹궈, 유리 기재 및 카세트에 부착한 입자를 수세, 제거하였다. 수세 후의 유리 기재를 1 매씩, 질소 가스 블로잉에 의해 건조시켰다. 기재의 세정을 확인하기 위해서, 기재 상에 놓인 순수한 물의 접촉각을 측정하였다. 그 결과, 기재의 모든 부위에 있어서 약 5°였다.
(6) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (4)에서 제조한 프로브 매체를 버블 제트 프린터 (상품명: BJF850; 캐논(주)사 제조) 용 잉크 탱크에 충전하여 버블 제트 헤드에 장착하였다. 또한 여기서 이용한 버블 제트 프린터 (상품명: BJF850; 캐논(주)사 제조)는 평판에의 인쇄가 가능하도록 개조를 실시한 것이다. 계속해서 이 프린터에 상기 단계 (5)에서 준비한 유리 기재를 장착하여, 프로브 매체를 유리 기재 상에 스폿팅하였다. 여기서 버블 제트 헤드의 액체 배출면과 유리 기재의 액체 부착면과의 거리는 1.2 내지 1.5 mm였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과, 유리 기재 표면에 매트릭스상의 스폿 어레이가 형성되어 있다는 것이 확인되었다. 또한, 스폿 형성 부위의 외주에서 순수한 물의 접촉각을 측정하였다. 그 결과, 기재의 모든 부위에 있어서 접촉각은 약 5°였다. 이 결과로부터, 스폿 부위 이외에는 프로브 매체 등에 의한 오염 등은 발생하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액을 채운 용기 중에 침지하여, 용기와 함께 냉장고에 넣어 냉장 보관 (4 ℃)하였다. 이와 같이 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(7) 블로킹 처리
상기 단계 (6)에서 제조한 프로브 고정 기재를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로부터 꺼냈다. 계속해서 유리 기재를 2 ％ 소혈청 알부민 수용액을 채운 용기 중에 침지하여 2 시간 방치하여 블로킹 처리를 행하였다.
(8) 혼성화 처리
상기 단계 (1)에 기재된 식 (5)의 단일 가닥 DNA 프로브에 대해 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 DNA를 DNA 자동 합성기로 합성하여, 5'말단에 로다민을 결합시켜 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브를 얻었다. 이 표지화된 단일 가닥 DNA를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 최종 농도 1 μM이 되도록 용해하여, 이 용액 중에 상기 단계 (7)에서 얻은 블로킹 처리한 프로브 고정 기재를 침지하여, 실온 (25 ℃)에서 2 시간 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음에 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가에 있어서 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V로 설정하였다.
(9) 결과
상기 단계 (8)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식 (5)의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 25730이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 639였다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는, 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있다는 것이 관찰되 었다.
<실시예 9>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 식 (5)의 단일 가닥 DNA 프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (프로브 결합 물질) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 제조하기 위하여 말레이미드기를 갖는 2가성 시약 N-(6-말레이미도카프로일옥시)술포숙신이미드, 나트륨 염 (상품명: sulfo-EMCS; (주)도진 가가꾸 겐뀨쇼사 제조)를 준비하였다. 이 프로브 결합 물질을 이하의 실험에 이용하였다.
(3) 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (기재 결합 물질)
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 기재 결합 물질 용액을 제조하였다. 제조한 기재 결합 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
(4) 프로브 매체의 제조
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 단일 가닥 DNA 프로브 용액을 제조하였다.
상기한 대로 제조한 프로브 용액을 10 ㎖ 준비하고, 여기에 상기한 프로브 결합 물질 약 2.1 mg을 칭량하여 상기 용액에 첨가한 후, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 용액을 30 분간 방치한 후, 순수한 물을 10 ㎖ 씩 프로브, 프로브 결합 물질 혼합 매체 중에 적가, 혼합을 반복하면서 합계 80 ㎖의 순수한 물을 적가하였다. 이어서, 상기 단계 (3)에서 제조한 기재 결합 물질 용액 10 ㎖를 적가하여, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 후, 30 분간 방치하여 프로브 매체를 제조하였다.
(5) 기재 세정
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 기재 세정을 행하여, 유리 기재를 준비하였다.
(6) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (4)에서 제조한 프로브 매체를 상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여스폿팅을 행하여, 프로브 고정 기재를 제조하였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과, 유리 기재 표면에 매트릭스상의 스폿 어레이가 형성되어 있는 것이 확인되었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액을 채운 용기 중에 침지하여, 용기와 함께 냉장고에 넣어 냉장 보관(4 ℃)하였다. 이와 같이 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(7) 블로킹 처리
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 블로킹 처리를 행하였다.
(8) 혼성화 처리
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음에 이 프로브 고정 기재 상의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가에 있어서, 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V에 설정하였다.
(9) 결과
상기 단계 (8)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식 (5)의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 25100이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿트부 이외의 영역의 형광 강도를 관찰한 결과 769였다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자 상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
<실시예 10>
(1) 프로브의 합성
표적 물질에 대하여 특이적으로 결합 가능한 프로브로서 단일 가닥 DNA 프로브를 이용하였다. DNA 자동 합성기를 이용하여 서열 5, 서열 6, 서열 7 및 서열 8의 단일 가닥 핵산을 합성하였다. 또한 서열 6 내지 8의 단일 가닥 DNA는, 실시예 8에서 이용한 서열 5를 기본으로 하여, 1 염기 변화시킨 것을 서열 6, 3 염기 변화시킨 것을 서열 7, 그리고 6 염기 변화시킨 것을 서열 8이라 하였다. 또한 서열 5 내지 8의 단일 가닥 DNA의 말단에는 DNA 자동 합성기에 의한 합성 동안에 티올-모디파이어 (그렌 리처치 사 제조)를 이용함으로써 티올 (SH)기를 도입하였다. 계속 해서 통상의 탈보호를 행하여 DNA를 회수하고, 고속 액체 크로마토그래피로써 정제하여, 식 (6), (7) 및 (8)의 올리고머를 얻고, 이하의 실험에 이용하였다.
5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTTGTTTACA3'(6)
5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGCTTTTTTACA3'(7)
5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCATCTTGTTTACA3' (8)
(2) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (프로브 결합 물질)
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 프로브 결합 물질 용액을 제조하였다. 제조한 프로브 결합 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
(3) 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (기재 결합 물질)
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 기재 결합 물질 용액을 제조하였다. 제조한 기재 결합 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
(4) 프로브 매체의 제조
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 단일 가닥 DNA 프로브 용액을 제조하였다.
상기 서열 5 내지 8의 단일 가닥 DNA를 이용하여, 상기 실시예 8의 (4)에 기재한 방법와 동일한 방법으로 4 종류의 프로브 매체를 제조하였다 (정확한 농도는 흡수강도로부터 산출).
(5) 기재 세정
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 기재 세정을 행하여, 유리 기재를 준비하였다.
(6) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (4)에서 제조한 4 종류의 프로브 매체를 버블 제트 프린터 (상품명: BJF 850; 캐논(주)사 제조) 용의 4 개의 잉크 탱크에 각각의 프로브 매체를 충전하고, 각각의 잉크 탱크를 버블 제트 헤드에 장착하였다. 또한 여기서 이용한 버블 제트 프린터 (상품명: BJF850; 캐논(주)사 제조)는 평판에의 인쇄가 가능하도록 개조를 실시한 것이다. 계속해서 이 프린터에 상기 단계 (5)에서 준비한 유리 기재를 장착하여, 4 종의 프로브 매체의 각각을 이 유리 기재의 3×3 mm으로 이루어지는 4개의 영역의 각각에 스폿팅하였다. 또한 각 영역 내에서의 스폿팅의 패턴은 실시예 8과 동일하게 하였다. 여기서 버블 제트 헤드의 액체 배출면과 유리 기재의 액체부착면과의 거리는 1.2 내지 1.5 mm였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과, 유리 기재 표면에 매트릭스상의 스폿 어레이가 형성되어 있는 것이 확인되었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액을 채운 용기 중에 침지하여, 용기와 함께 냉장고에 넣어 냉장 보관 (4 ℃)하였다. 이와 같이 하여 4 종류의 프로브를 고정한 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(7) 블로킹 처리
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 블로킹 처리를 행하였다.
(8) 혼성화 처리
상기 실시예 8에 기재된 식 (5)의 단일 가닥 DNA 프로브에 대해 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 DNA를 DNA 자동 합성기로 합성하여, 5'말단에 로다민을 결합시켜 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브를 얻었다. 이 표지화된 단일 가닥 DNA를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 최종 농도 1 μM이 되도록 용해하여, 이 용액 중에 상기 단계 (7)에서 얻은 블로킹 처리한 프로브 고정 기재를 침지하여, 실온 (25 ℃)에서 2 시간 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가에 있어서, 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V로 설정하였다.
(9) 결과
상기 단계 (8)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식 (5)의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 26120였다. 이에 대하여, 1 염기의 미스 매치 서열을 갖는 식 (6)의 DNA 프로브의 스폿에 대해서는 12870의 형광량이 얻어졌다. 또한, 3 염기 미스 매치를 갖는 식 (7)의 DNA 프로브의 스폿에 대해서는 4220로서 완전 매치의 반 이하의 형광량 밖에 얻어지지 않고, 6염기 미스 매치의 식 (8)의 DNA 프로브로서는 형광 스폿 거의 인식할 수 없고, 스폿 해당 부위에 있어서의 형광 강도는 791이었 다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 675였다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는, 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자상으로스폿이 배치되어 있다는 것이 관찰되었다. 이상으로부터, DNA 어레이 기재 상에서 완전 상보성의 단일 가닥 DNA를 특이적으로 검출할 수가 있었다.
<실시예 11>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 식 (5)의 단일 가닥 DNA 프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (프로브 결합 물질)
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 프로브 결합 물질 용액을 제조하였다. 제조한 프로브 결합 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
(3) 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (기재 결합 물질)
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 기재 결합 물질 용액을 제조하였다. 제조한 기재 결합 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
(4) 프로브 매체의 제조
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 프로브 매체를 제조하였다.
(5) 기재 세정
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 기재 세정을 행하여, 유리 기재를 준비하였다.
(6) 프로브 매체의 스폿팅
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(7) 블로킹 처리
상기 실시예 8에 있어서 실시한 블로킹 처리를 완전히 수행하지 않고, 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 기재 상을 세정하여, 균일한 혼성화 처리를 할 수 있도록 하였다.
(8) 혼성화 처리
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가에 있어서 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V에 설정하였다.
(9) 결과
상기 단계 (8)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식(5)의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 24380였다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 783였다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는, 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 블로킹 처리를 하지 않은 것과 관련하여, 스폿부 이외에서의 형광 강도의 증가는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
<실시예 12>
(1) 프로브의 합성
표적 물질에 대하여 특이적으로 결합 가능한 프로브로서 단일 가닥 DNA 프로브를 이용하였다. DNA 자동 합성기를 이용하여 서열 9의 단일 가닥 DNA 프로브를 합성하여, 그 5'말단의 수산기에, 인산기와 헥사메틸렌을 통해 아미노기를 결합하여, 식 (9)의 18량체의 올리고머를 준비하여 이하의 실험에 이용하였다.
5'H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3' (9)
(2) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (프로브 결합 물질)
프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 제조하기 위하여 말레이미드기를 갖는 이가성 시약 N-(8-말레이미도카프로일옥시) 술포숙신이미드, 나트륨 염 (상품명: sulfo-HMCS; (주)도진 가가꾸 겐뀨쇼사 제조)의 500 ㎛ol/l 수용 액을 실온하에서 5 분간 교반하여 프로브 결합 물질 용액을 제조하였다. 제조한 프로브 결합 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
(3) 기재상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (기재 결합 물질)
기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 제조하기 위하여 머캅토기를 갖는 실란 화합물 (γ-머캅토프로필메틸디메톡시실란)을 포함하는 실란 커플링제 (상품명: KBM-802; 신에쯔 가가꾸 고교(주)사 제조)의 20 mmol/1 수용액을 실온하에서 30 분간 교반하여 기재 결합 물질 용액을 제조하였다. 제조한 기재 결합 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
(4) 프로브 매체의 제조
상기 식 (9)의 단일 가닥 DNA 프로브를 최종 농도가 약 40 ㎛ol/l 가 되도록 TE 용액 (10 mM Tris-HCl (pH 8)/1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 수용액)에 용해하여, 단일 가닥 DNA 프로브 용액을 제조하였다 (정확한 농도는 흡수 강도로부터 산출).
이어서, 수용성 고분자 재료인 폴리비닐 알코올 (PVA)을 농도 0.5 중량％가 되도록 순수한 물 중에 용해시켰다. 완전히 용해시키기 위해서 고온욕 중에서 80 ℃로 가온하면서 60 분간 교반하였다. 불용해물이 없는 것을 확인한 후, 스폿팅에 있어서 노즐 막힘이 발생하지 않도록 여과를 행하여, PVA 수용액을 제조하였다.
상기한 대로 제조한 프로브 용액을 100 ㎕ 준비하고, 여기에 상기 단계 (2)에서 제조한 프로브 결합 물질 용액을 100 ㎕ 적가한 후, 5 분간 혼합하였다. 이어서 상기 단계 (3)에서 제조한 기재 결합 물질 용액을 100 ㎕ 적가한 후, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 용액을 10 분간 방치한 후, 순수한 물을 600 ㎕, 상기한 대로 제조한 PVA 수용액을 100 ㎕ 적가하여, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 후, 30 분간 방치하여 프로브 매체를 제조하였다.
(5) 기재 세정
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 기재 세정을 행하여, 유리 기재를 준비하였다.
(6) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (4)에서 제조한 프로브 매체를 버블 제트 프린터 (상품명: BJF850; 캐논(주)사 제조)용 잉크 탱크에 충전하여 버블 제트 헤드에 장착하였다. 또한 여기서 이용한 버블 제트 프린터 (상품명: BJF850; 캐논(주)사 제조)는 평판에의 인쇄가 가능하도록 개조를 실시한 것이다. 계속해서 이 프린터에 상기 단계 (5)에서 준비한 유리 기재를 장착하여, 프로브 매체를 유리 기재상에 스폿팅하였다. 여기서 버블 제트 헤드의 액체 배출면과 유리 기재의 액체 부착면과의 거리는 1.2 내지 1.5 mm 였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과, 유리 기재 표면에 매트릭스상의 스폿 어레이가 형성되어 있다는 것이 확인되었다. 또한, 스폿 형성부위의 외주에서 순수한 물의 접촉각을 측정하였다. 그 결과, 기재의 모든 부위에 있어서 약 5°였다. 이 결과로부터, 스폿 부위 이외로는 프로브 매체 등에 의한 오염 등은 발생되지 않는다는 것을 확인할 수 있었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 데시케이터 내에 정치하였다. 이렇게 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(7) 블로킹 처리
상기 단계 (5)에서 제조한 프로브 고정 기재를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 충분히 세정하여, 프로브 고정 기재 상을 적셔, 균일한 블로킹 처리를 할 수 있도록 하였다. 계속해서 유리 기재를 2 ％ 소혈청 알부민 수용액 중에 침지하여 2 시간 방치하여, 블로킹 처리를 행하였다.
(8) 혼성화 처리
상기에 기재의 식 (9)의 단일 가닥 DNA 프로브에 대해 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 DNA를 DNA 자동 합성기로 합성하여, 5'말단에 로다민을 결합시켜 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브를 얻었다. 이 표지화된 단일 가닥 DNA를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 최종농도 1 μM가 되도록 용해하여, 이 용액 중에 상기 단계 (7)에서 얻은 블로킹 처리한 프로브 고정 기재를 침지하여, 실온 (25 ℃)에서 2 시간 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가에 있어서, 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V에 설정하였다.
(9) 결과
상기 단계 (8)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식 (5)의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 18710였다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 664였다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
<실시예 13>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 12와 완전히 동일하게 하여 식(5)의 단일 가닥 DNA 프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질(프로브 결합 물질)
상기 실시예 12와 완전히 동일하게 하여 프로브 결합 물질 용액을 제조하였다. 제조한 프로브 결합 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
(3) 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (기재 결합 물질)상기 실시예 12와 완전히 동일하게 하여 기재 결합 물질 용액을 제조하였다. 제조한 기재 결합 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
(4) 프로브 매체의 제조
상기 실시예 12와 완전히 동일하게 하여 단일 가닥 DNA 프로브 용액 및 PVA 용액을 제조하였다.
상기한 대로 제조한 프로브 용액을 1O ㎖ 준비하고, 여기에 상기한 프로브 결합 물질을 약 2.1 mg 칭량한 것을 첨가한 후, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 용액을 30 분간 방치한 후, 순수한 물을 10 ㎖씩 프로브 및 프로브 결합 물질 혼합 매체 중에 적가, 혼합을 반복하면서 합계 70 ㎖의 순수한 물을 적가하였다. 이어서, 상기 단계 (3)에서 제조한 기재 결합 물질 용액을 10 ㎖ 적가, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 후, 30 분간 방치한 후, 상기한 대로 제조한 PVA 수용액을 10 ㎖ 적가하여, 5 분간 혼합하였다. 혼합을 완료한 후, 30 분간 방치하여 프로브 매체를 제조하였다.
(5) 기재 세정
상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여 기재 세정을 행하여, 유리 기재를 준비하였다.
(6) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (4)에서 제조한 프로브 매체를 상기 실시예 8과 완전히 동일하게 하여스폿팅을 행하여, 프로브 고정 기재를 제조하였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과, 유리 기재 표면에 매트릭스상의 스폿 어레이가 형성되어 있다는 것이 확인되었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 데시케이터 내에 정치하였다. 이와 같이 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(7) 블로킹 처리
상기 실시예 12와 완전히 동일하게 하여 블로킹 처리를 행하였다.
(8) 혼성화 처리
상기 실시예 12와 완전히 동일하게 하여 혼성화 처리를 행하였다.
그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음에 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가에 있어서, 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V로 설정하였다.
(9) 결과
상기 단계 (8)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식 (5)의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 17970였다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 723였다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있다는 것이 관찰되었다.
<실시예 14>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 12와 완전히 동일하게 하여 식 (9)의 단일 가닥 DNA 프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (프로브 결합 물질)
프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 제조하기 위하여 말레이미드기, 히드록시숙신이미드에스테르기를 갖는 2가성 시약 N-(6-말레이미도카프로일옥시) 술포숙신이미드, 나트륨 염 (상품명: sulfo-EMCS 주) 도진 가가꾸 겐뀨쇼사 제조)의 500 ㎛ol/l 수용액을 실온하에서 5 분간 교반하여, 프로브 결합 물질 용액을 제조하였다. 제조한 프로브 결합 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
(3) 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (기재 결합 물질)
기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 제조하기 위하여 아미노기를 갖는 실란 화합물 (N-β(아미노에틸)γ-아미노프로필트리메톡시실란)을 포함하는 실란 커플링제 (상품명: KBM-603; 신에쯔 가가꾸 고교(주)사 제조)의 20 mmol/l 수용액을 실온하에서 30 분간 교반하여, 기재 결합 물질 용액을 제조하였다. 제조한 기재 결합 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
(4) 프로브 매체의 제조
상기 식 (9)의 단일 가닥 DNA 프로브를 최종 농도가 약 40 ㎛ol/l이 되도록 TE 용액 (10 mM Tris-HCl(pH 8)/1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 수용액)에 용해하여 단일 가닥 DNA 프로브 용액을 제조하였다 (정확한 농도는 흡수 강도로부터 산출).
상기한 대로 제조한 프로브 용액을 100 ㎕ 준비하여, 여기에 상기 단계 (2) 에서 제조한 프로브 결합 물질 용액을 100 ㎕ 적가한 후, 5 분간 혼합하였다. 이어서 상기 단계 (3)에서 제조한 기재 결합 물질 용액을 100 ㎕ 적가한 후, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 용액을 10 분간 방치한 후, 글리세린 7.5 중량％, 우레아 7.5 중량％, 및 티오디글리콜 7.5 중량％를 포함하는 수용액을 700 ㎕ 적가하여, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 후, 30 분간 방치하여, 프로브 매체를 제조하였다.
(5) 기재 세정
1 인치×3 인치의 유리 기재 (두께: 1.1 mm)을 카세트에 넣고, 미리 60 ℃로 가온한 1 mol/l 수산화나트륨 수용액에 유리 기재를 10 분간 침지하였다. 계속해서 흐르는 순수한 물 중에서 충분히 헹궈, 유리 기재 및 카세트에 부착한 수산화나트륨을 수세, 제거하였다. 충분히 헹군 후, 순수한 물 중에 카세트와 함께 유리 기재를 침지하여, 초음파 세정을 10 분간 행하였다. 초음파 세정 후, 흐르는 순수한 물 중에서 충분히 헹궈, 유리 기재 및 카세트에 부착한 입자를 수세, 제거하였다. 수세 후의 유리 기재를 1 매씩, 질소 가스 블로잉에 의해 건조시켰다. 기재의 세정을 확인하기 위해서, 기재 상에 놓인 순수한 물의 접촉각을 측정하였다. 그 결과, 기재의 모든 부위에 있어서 약 5°였다.
(6) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (4)에서 제조한 프로브 매체를 버블 제트 프린터 (상품명: BJF850; 캐논(주)사 제조)용 잉크 탱크에 충전하여 버블 제트 헤드에 장착하였다. 또한 여기서 이용한 버블 제트 프린터 (상품명: BJF850; 캐논(주)사 제조)는 평판에의 인쇄가 가능하도록 개조를 실시한 것이다. 계속해서 이 프린터에 상기 단계 (5)에서 준비한 유리 기재를 장착하여, 프로브 매체를 유리 기재 상에 스폿팅하였다. 여기서 버블 제트 헤드의 액체 배출면과 유리 기재의 액체 부착면과의 거리는 1.2 내지 1.5 mm 였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과, 유리 기재 표면에 매트릭스상의 스폿 어레이가 형성되어 있는 것이 확인되었다. 또한, 스폿 형성 부위의 외주에서 순수한 물의 접촉각을 측정하였다. 그 결과, 기재의 모든 부위에 있어서 약 5°였다. 이 결과로부터, 스폿 부위 이외에는 프로브 매체 등에 의한 오염 등은 발생하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액을 채운 용기 중에 침지하여, 용기와 함께 냉장고에 넣어 냉장 보관 (4 ℃)하였다. 이와 같이 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(7) 블로킹 처리
상기 단계 (6)에서 제조한 프로브 고정 기재를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로부터 취출하였다. 계속해서 유리 기재를 2 ％ 소혈청 알부민 수용액을 채운 용기 중에 침지하여 2 시간 방치하여, 블로킹 처리를 행하였다.
(8) 혼성화 처리
상기 단계 (1)에 기재된 식 (9)의 단일 가닥 DNA 프로브에 대해 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 DNA를 DNA 자동 합성기로 합성하여, 5'말단에 로다민을 결합시켜 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브를 얻었다. 이 표지화된 단일 가닥 DNA를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 최종 농도 1 μM가 되도록 용해하고, 이 용액 중에 상기 단계 (7)에서 얻은 블로킹 처리한 프로브 고정 기재를 침지하여, 실 온 (25 ℃)에서 2 시간 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가에 있어서, 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V에 설정하였다.
(9) 결과
상기 단계 (8)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식 (9)의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 25730였다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 639였다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자상으로스폿이 배치되어 있다는 것이 관찰되었다.
<실시예 15>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 단일 가닥 DNA 프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다. 단일 가닥 DNA 프로브를 이용함에 있어서 마이크로 튜 브에 나누어 넣었다. 마이크로 튜브 1 개당의 단일 가닥 DNA 프로브량이 17.53 nmol이 되도록 나누어 넣은 후, 드라이업 건조시켜 단일 가닥 DNA 프로브를 얻었다.
(2) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기와 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (프로브 결합 물질)
프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기와 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 제조하기 위하여 에폭시기를 갖는 실란 화합물 (γ-글리시독시프로필트리메톡시실란)을 포함하는 실란 커플링제 (상품명: KBM-403; 신에쯔 가가꾸 고교(주)사 제조)를 이용하기로 하였다. 상기 에폭시 실란 커플링제를 프로브 결합 물질 용액으로서 이하의 실험에 이용하였다.
(3) 프로브 매체의 제조
상기 식 (1)의 단일 가닥 DNA 프로브를 나누어 넣고, 드라이업 건조시킨 마이크로 튜브 중에, 프로브 결합 물질인 에폭시 실란 커플링제를 10 ㎕ 적가 혼합하였다. 계속해서, 순수한 물을 50 ㎕ 적가 혼합하였다. 5 분간 충분히 혼합한 후에, 30 분간 정치하였다.
다음에, 고비점 용매인 에틸렌글리콜 500 ㎕ 및 에틸알코올 500 ㎕를 상기 마이크로튜브 중에 적가한 후, 1 분간 혼합하였다.
이어서, 수용성 고분자 재료인 폴리비닐알코올 (PVA)의 농도 0.5 중량％ 수용액을 100 ㎕ 적가한 후, 1 분간 혼합하였다. 마지막으로 프로브 매체 전량이 2000 ㎕가 되도록 순수한 물을 적가하여, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 후, 60 분간 방치하고, 프로브 매체를 제조하였다.
(4) 기재 세정
1 인치×3 인치의 유리 기재 (두께: 1.1 mm)를 카세트에 넣어, 미리 60 ℃로 가온한 1 mol/l 수산화 나트륨 수용액에 유리 기재를 10 분간 침지하였다. 계속해서 흐르는 순수한 물 중에서 충분히 헹궈, 유리 기재 및 카세트에 부착한 수산화 나트륨을 수세, 제거하였다. 충분히 헹군 후, 순수한 물 중에 카세트와 함께 유리 기재를 침지하여, 초음파 세정을 10 분간 행하였다. 초음파 세정 후, 흐르는 순수한 물 중에서 충분히 헹궈, 유리 기재 및 카세트에 부착한 입자를 수세, 제거하였다. 수세 후의 유리 기재를 1 매씩, 질소 가스 블로잉에 의해 건조시켰다. 기재의 세정을 확인하기 위해서, 기재 상에 있어서의 순수한 물의 접촉각을 측정하였다. 그 결과, 기재의 모든 부위에 있어서 약 5°였다.
(5) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (3)에서 제조한 프로브 매체를 버블 제트 프린터 (상품명: BJF850; 캐논(주)사 제조)용 잉크 탱크에 충전하여 버블 제트 헤드에 장착하였다. 또한 여기서 이용한 버블 제트 프린터 (상품명: BJF850; 캐논(주)사 제조)는 평판에의 인쇄가 가능하도록 개조를 실시한 것이다. 계속해서 이 프린터에 상기 단계 (4)에서 준비한 유리 기재를 장착하여, 프로브 매체를 유리 기재 상에 스폿팅하였다. 여기서 버블 제트 헤드의 액체 배출면과 유리 기재의 액체 부착면과의 거리는 1.2 내지 1.5 mm 였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과 유리 기재 표면에 매트릭스상의 스폿 어레이가 형성되어 있는 것이 확인되었다. 또한, 스폿 형성부위의 외주에서 순수한 물의 접촉각을 측정하였다. 그 결과, 기재의 모든 부위에 있어서 약 5°였다. 이 결과로부터, 스폿 부위 이외에는 프로브 매체 등에 의한 오염 등은 발생되지 않은 것을 확인할 수 있었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 데시케이터 내에 정치하였다. 이와 같이 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(6) 블로킹 처리
상기 단계 (5)에서 제조한 프로브 고정 기재를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 충분히 세정하여, 프로브 고정 기재 상을 적셔, 균일한 블로킹 처리를 할 수 있도록 하였다. 계속해서 유리 기재를 2 ％ 소혈청 알부민 수용액 중에 침지하여 2 시간 방치하여 블로킹 처리를 행하였다.
(7) 혼성화 처리
상기 단계 (1)에 기재된 식 (1)의 단일 가닥 DNA 프로브에 대해 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 DNA를 DNA 자동 합성기로 합성하여, 5'말단에 로다민을 결합시켜 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브를 얻었다. 이 표지화된 단일 가닥 DNA를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 최종 농도 1 μM가 되도록 용해하여, 이 용액 중에 상기 단계 (6)에서 얻은 블로킹 처리한 프로브 고정 기재를 침지하여, 실온 (25 ℃)에서 3 시간 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로 이 프로 브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가에 있어서, 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V로 설정하였다.
(8) 결과
상기 단계 (7)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식 1의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 15750였다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 108이었다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
<실시예 16>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 15와 완전히 동일하게 하여 단일 가닥 DNA 프로브를 나누어 넣고, 드라이업 건조시켰다.
(2) 프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기와 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질 (프로브 결합 물질)
프로브와 결합할 수 있는 부위의 관능기와 기재 상에 결합할 수 있는 부위의 관능기를 갖는 물질을 제조하기 위하여 이소시아네이트기를 갖는 실란 화합물 (3- 이소시아네이트프로필트리에톡시실란)을 포함하는 실란 커플링제 (상품명: KBE-9007; 신에쯔 가가꾸 고교(주)사 제조)를 이용하는 것으로 하였다. 상기 이소시아네이트실란 커플링제를 프로브 결합 물질 용액으로서 이하의 실험에 이용하였다.
(3) 프로브 매체의 제조
상기 식 (1)의 단일 가닥 DNA 프로브를 나누어 넣고, 드라이업 건조시킨 마이크로 튜브 중에, 프로브 결합 물질인 이소시아네이트실란 커플링제를 20 ㎕ 적가 혼합하였다. 계속해서, 순수한 물을 50 ㎕ 적가 혼합하였다. 5 분간 충분히 혼합한 후에, 30 분간 정치하였다.
다음으로, 고비점 용매인 에틸렌글리콜 500 ㎕, 에틸알코올 500 ㎕를 상기마이크로 튜브 중에 적가한 후, 1 분간 혼합하였다.
이어서, 수용성 고분자 재료인 폴리비닐 알코올 (PVA)의 농도 0.5 중량％ 수용액을 100 ㎕ 적가한 후, 1 분간 혼합하였다. 마지막으로 프로브 매체 전량이 2000 ㎕이 되도록 순수한 물을 적가하여, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 후, 60 분간 방치하여 프로브 매체를 제조하였다.
(4) 기재 세정
상기 실시예 15와 완전히 동일하게 하여 기재 세정을 행하여, 기재를 얻었다.
(5) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (3)에서 제조한 프로브 매체를 버블 제트 프린터 (상품명: BJF850; 캐논(주)사 제조) 용 잉크 탱크에 충전하여 버블 제트 헤드에 장착하였다. 또한 여기서 이용한 버블 제트 프린터 (상품명: BJF850; 캐논(주)사 제조)는 평판에의 인쇄가 가능하도록 개조를 실시한 것이다. 계속해서 이 프린터에 상기 단계 (4)에서 준비한 유리 기재를 장착하여, 프로브 매체를 유리 기재 상에 스폿팅하였다. 여기서 버블 제트 헤드의 액체 배출면과 유리 기재의 액체 부착면과의 거리는 1.2 내지 1.5 mm였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과, 유리 기재 표면에 매트릭스 상의 스폿 어레이가 형성되어 있는 것이 확인되었다. 또한 스폿 형성 부위의 외주에서 순수한 물의 접촉각을 측정하였다. 그 결과, 기재의 모든 부위에 있어서 약 5°였다. 이 결과로부터, 스폿 부위 이외에는 프로브 매체 등에 의한 오염 등은 발생되지 않은 것을 확인할 수 있었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 데시케이터 내에 정치하였다. 이와 같이 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(6) 블로킹 처리
상기 단계 (5)에서 제조한 프로브 고정 기재를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 충분히 세정하여, 프로브 고정 기재 상을 적셔, 균일한 블로킹 처리를 할 수 있도록 하였다. 계속해서 유리 기재를 2 ％ 소혈청 알부민 수용액 중에 침지하여 2 시간 방치하여 블로킹 처리를 행하였다.
(7) 혼성화 처리
상기 단계 (1)에서 기재의 식 (1)의 단일 가닥 DNA 프로브에 대해 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 DNA를 DNA 자동 합성기로 합성하여, 5'말단에 로다민을 결합시켜 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브를 얻었다. 이 표지화된 단일 가닥 DNA를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 최종 농도 1 μM가 되도록 용해하여, 이 용액 중에 상기 단계 (6)에서 얻은 블로킹 처리한 프로브 고정 기재를 침지하여, 실온 (25 ℃)에서 3 시간 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가에 있어서, 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V에 설정하였다.
(8) 결과
상기 단계 (7)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식 1의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 15750였다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 108이었다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있다는 것이 관찰되었다.
<비교예 1>
(1) 프로브의 합성
표적 물질에 대하여 특이적으로 결합 가능한 프로브로서 단일 가닥 DNA 프로브를 이용하였다. DNA 자동 합성기를 이용하여 서열 10의 단일 가닥 핵산을 합성하고, 그 말단에는 DNA 자동 합성기에 의한 합성 동안에 티올-모디파이어 (Thio1-Modifier) (글렌리사치 (GlenResearch)사 제조)를 이용함으로써 머캅토 (SH)기를 도입하였다. 계속해서 통상의 탈보호를 행하여, DNA를 회수하여, 고속 액체 크로마토그래피로써 정제하여 식 (10)의 올리고머를 얻고, 이하의 실험에 이용하였다.
5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3' (10)
(2) 프로브 매체의 제조
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여, 식 (10)의 단일 가닥 DNA 프로브 용액을 제조하였다 (정확한 농도는 흡수 강도로부터 산출). 제조한 프로브 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
상기한 대로 제조한 프로브 용액을 100 μl 준비하고, 여기에, 글리세린 7.5중량％, 우레아 7.5 중량％ 및 티오디글리콜 7.5 중량％를 포함하는 수용액을 900μl 적가하였다. 5 분간 혼합한 후, 30 분간 방치, 프로브 매체를 제조하였다.
(3) 기재 세정
상기 실시예 1과 동일하게 하여 기재 세정을 행하여, 유리 기재를 준비하였다.
(4) 프로브 고정화 처리
아미노기를 갖는 실란 화합물 (N-β(아미노에틸)γ-아미노프로필트리메톡시 실란)을 포함하는 실란 커플링제 (상품명: KBM-603; 신에쯔 가가꾸 고교(주)사 제조)의 1 중량％ 수용액을 실온하에서 30 분간 교반하여, 실란 커플링제 수용액을 제조하였다. 계속해서 이 수용액에 상기 단계 (3)에서 세정한 유리 기재를 실온 (25 ℃)에서 20 분간 침지한 후, 흐르는 물로 충분히 헹궈, 여분의 실란 커플링제 수용액을 제거하였다. 헹군 기재에 질소 가스를 기재 양면에 분무하여 건조시켰다. 다음으로 기재를 120 ℃로 가열한 오븐 중에서 1 시간 베이킹하여 실란 커플링 처리를 완결시켰다. 계속해서 N-말레이미드카프로일옥시숙신이미드 N-(6-말레이미도카프로일옥시) 술포숙신이미드 (상품명: EMCS (주)도진 가가꾸 겐뀨쇼사 제조)를 2.7 mg 칭량하고, 디메틸술폭시드 (DMSO)/에탄올의 1:1 용액에 최종 농도가 0.3 mg/ml가 되도록 용해시켜, EMCS 용액을 준비하였다. 실란 커플링 처리를 행한 기재를 이 EMCS 용액에 실온에서 30 분간 침지하였다. EMCS 용액으로부터 인상한 기재는 DMSO 및 에탄올의 혼합 용매 및 에탄올로 차례로 세정한 후, 질소 가스 분위기하에서 건조시켰다. 이와 같이 하여 프로브 고정화 처리를 완료시켰다. 프로브 고정화 처리의 효과를 확인하기 위해서 순수한 물의 접촉각을 측정하였다. 그 결과, 기재 상에 있어서의 접촉각은 25 내지 30°였다. 이 결과로부터, 기재 상으로의 프로브 고정화 처리가 적절히 실시되어 있다는 것을 확인할 수 있었다.
(5) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (2)에서 제조한 프로ㅂ 매체를 상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여스폿팅을 행하여, 프로브 고정 기재를 제조하였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과 유리 기재 표면에 매트릭스상의 스폿 어레이가 형 성되어 있는 것이 확인되었다. 또한, 프로브 고정화 처리의 효과를 확인하기 위해서 순수접촉각을 측정하였다. 그 결과, 기재 상에 있어서의 접촉각은 25 내지 30°였다. 이 결과로부터, 스폿 부위 이외에는 프로브 매체 등에 의한 오염 등은 발생하지 않은 것을 확인할 수 있었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액을 채운 용기 중에 침지하여, 용기와 함께 냉장고에 넣어 냉장 보관 (4 ℃)하였다. 이와 같이 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(6) 블로킹 처리
상기 실시예 1과 완전히 동일하게 하여 블로킹 처리를 행하였다.
(7) 혼성화 처리
상기 단계 (1)에 기재된 식 (10)의 단일 가닥 DNA 프로브에 대해 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 DNA를 DNA 자동 합성기로 합성하여, 5'말단에 로다민을 결합시켜 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브를 얻었다. 이 표지화된 단일 가닥 DNA를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 최종 농도 1 μM가 되도록 용해하고, 이 용액 중에 상기 단계 (6)에서 얻은 블로킹 처리한 프로브 고정 기재를 침지하여, 실온 (25 ℃)에서 3 시간 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가에 있어서, 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V에 설정하였다.
(8) 결과
상기 단계 (7)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식 (10)의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 12790였다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 792였다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는, 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
<실시예 17>
(1) 프로브의 합성
표적 물질에 대하여 특이적으로 결합 가능한 프로브로서 실시예 8과 동일하게 하여 식 (5)의 단일 가닥 DNA 프로브를 합성하였다.
(2) 수용성 고분자 재료 수용성 고분자 재료로서, 폴리비닐알코올 (PVA)을 선택하였다. 폴리비닐알코올 (PVA)을 포함하는 포발 (상품명: 포발 PVA-117; (주)쿠라레사 제조)를 5 g 칭량하여 비이커에 넣었다. 이 폴리비닐알코올은 중합도 1700, 비누화도 98.0 내지 99.0 mol％이다. 여기에 순수 495 g을 가함으로써 순수한 물 중에 용해시키고 농도 1.0 중량％의 포발 수용액을 제조하였다. 용해시에, 완전히 용해시키기 위해서 고온욕 중에서 80 ℃로 가온하면서 60 분간 교반하였다. 불용해물이 없는 것을 확인한 후, 스폿팅에 있어서 노즐 막힘이 발생하지 않도록 여과를 행하였다. 여과에는 0.22 ㎛의 멤브레인 필터를 이용하였다. 이상과 같이하여, PVA 수용액을 제조하였다.
(3) 프로브 매체의 제조
상기 식 (5)의 단일 가닥 DNA 프로브를 최종 농도가 약 40 μmol/l이 되도록 TE 용액 (10 mM Tris-HCl (pH 8)/1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 수용액)에 용해하여, 단일 가닥 DNA 프로브 용액을 제조하였다 (정확한 농도는 흡수 강도로부터 산출).
이어서, 프로브 고정 물질로서 아미노기를 갖는 실란 화합물 (N-β(아미노에틸)아미노프로필트리메톡실란)을 포함하는 실란 커플링제 (상품명: KBM-603; 신에쯔 가가꾸 고교(주)사 제조)의 500 ㎛ol/l 수용액을 실온하에서 30 분간 교반하여, 아미노실란 수용액을 제조하였다. 다음으로 말레이미드기, 히드록시숙신이미드에스테르기를 갖는 2가성 시약 N-(6-말레이미도카프로일옥시)술포숙신이미드, 나트륨 염 (상품명: sulfo-EMCS; (주)도진 가가꾸 겐뀨쇼사 제조)의 500 ㎛ol/l 수용액을 실온하에서 5 분간 교반하여, EMCS 수용액을 제조하였다. 상기 아미노실란 수용액과 EMCS 수용액을 등용량씩 혼합, 5 분간 교반함으로써 프로브 고정 물질 용액을 얻었다. 제조한 프로브 고정 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다. 상기한 대로 제조한 프로브 용액을 100 ㎕ 준비하여, 여기에 상기한 대로 제조한 프로브 고정 물질 용액 100 ㎕ 적가한 후, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 용액을 10 분간 방치한 후, 순수한 물을 700 ㎕, 상기한 대로 제조한 수용성 고분자 재료인 PVA 수용액 을 100 ㎕ 적가하여, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 후, 30 분간 방치하여 프로브 매체를 제조하였다.
(4) 기재 세정
1 인치 정사각형의 유리 기재를 카세트에 넣어, 미리 60 ℃로 가온한 1 mol/1 수산화 나트륨 수용액에 유리 기재를 10 분간 침지하였다. 계속해서 흐르는 순수한 물 중에서 충분히 헹궈, 유리 기재 및 카세트에 부착한 수산화 나트륨을 수세, 제거하였다. 충분히 헹군 후, 순수한 물 중에 카세트와 함께 유리 기재를 침지하여, 초음파 세정을 10 분간 행하였다. 초음파 세정 후, 흐르는 순수한 물 중에서 충분히 헹궈, 유리 기재 및 카세트에 부착한 입자를 수세, 제거하였다. 수세 후 유리 기재를 1 매씩, 질소 가스 블로잉에 의해 건조시켰다.
(5) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (3)에서 제조한 프로브 매체를 버블 제트 프린터 (상품명: BJF850; 캐논(주)사 제조)용 잉크 탱크에 충전하여 버블 제트 헤드에 장착하였다. 또한 여기서 이용한 버블 제트 프린터 (상품명; BJF850; 캐논(주)사 제조)는 평판에의 인쇄가 가능하도록 개조를 실시한 것이다. 계속해서 이 프린터에 상기 단계 (4)에서 준비한 유리 기재를 장착하여, 프로브 매체를 유리 기재 상에 스폿팅하였다. 여기서 버블 제트 헤드의 액체 배출면과 유리 기재의 액체부착면과의 거리는 1.2 내지 1.5 mm 였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과, 유리 기재 표면에 매트릭스 상의 스폿 어레이가 형성되어 있는 것이 확인되었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 데시케이터 내에 정치하였다. 이와 같이 하여 프로 브 고정 기재를 제조하였다.
(6) 보관
상기 단계 (5)에서 제조한 프로브 고정 기재를 데시게이터 속에서 7 일간 보관하였다. 보관 동안에, 프로브 고정 기재가 습도 35 ％ 이하, 온도 25℃로 유지되도록 조정하였다.
(7) 블로킹 처리
상기 단계 (6)에서 보관한 프로브 고정 기재를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여, 프로브 고정 기재 상을 적셔, 균일한 블로킹 처리를 할 수 있도록 하였다. 계속해서 유리 기재를 2 ％ 소혈청 알부민 수용액 중에 침지하여 2 시간 방치하여, 블로킹 처리를 행하였다.
(8) 혼성화 처리
상기 단계 (1)에 기재된 식 (5)의 단일 가닥 DNA 프로브에 대해 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 DNA를 DNA 자동 합성기로 합성하여, 5'말단에 로다민을 결합시켜 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브를 얻었다. 이 표지화된 단일 가닥 DNA를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 최종 농도 1 μM이 되도록 용해하고, 이 용액 중에 상기 단계 (7)에서 얻은 블로킹 처리한 프로브 고정 기재를 침지하여, 실온 (25 ℃)에서 3 시간 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음에 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가에 있어서, 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V로 설정하였다.
(9) 결과
상기 단계 (8)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식 1의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 15830였다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 611였다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
<실시예 18>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 17과 완전히 동일하게 하여 단일 가닥 DNA 프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 수용성 고분자 재료
상기 실시예 17과 동일하게 하여 수용성 고분자 재료 수용액을 제조하였다. 수용성 고분자 재료로서는, 폴리비닐알코올 (PVA)을 포함하는 포발 (상품명: 포발 PVA-110 (주)쿠라레사 제조)를 이용하였다. 이 폴리비닐알코올콜은 중합도 1000, 비누화도 98.0 내지 99.0 mol％였다.
(3) 프로브 매체의 제조
상기 실시예 17과 같이 하여 프로브 용액을 제조하였다.
상기한 대로 제조한 프로브 용액을 100 μ1 준비하고, 이것에, 글리세린 7.5중량％, 우레아 7.5 중량％ 및 티오글리콜 7.5 중량％를 포함하는 수용액을 800 ㎕적가하였다. 상기한 대로 제조한 수용성 고분자 재료 수용액을 100 ㎕ 적가한 후, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 후, 30 분간 방치하여, 프로브 매체를 얻었다.
(4) 기재 세정
상기 실시예 17과 완전히 동일하게 하여 기재 세정을 행하여, 유리 기재를 준비하였다.
(5) 프로브 고정화 처리
아미노기를 갖는 실란 화합물 (N-β(아미노에틸) 아미노프로필트리메톡실란)을 포함하는 실란 커플링제 (상품명: KBM-603; 신에쯔 가가꾸 고교(주)사 제조)의 1 중량％ 수용액을 실온하에서 30 분간 교반하여, 실란 커플링제 수용액을 제조하였다. 계속해서 이 수용액에 상기 단계 (4)에서 세정한 유리 기재를 실온 (25 ℃)에서 20 분간 침지한 후, 유수로 충분히 헹궈, 여분의 실란 커플링제 수용액을 제거하였다. 헹군 기재에 질소 가스를 기재 양면에 불어 건조시켰다. 다음에 기재를 120 ℃ 가열한 오븐 중에서 1 시간 베이킹하여 실란 커플링 처리를 완결시켰다. 계속해서 N-말레이미드카프로일옥시숙신이미드 N-(6-말레이미도카프로일옥시) 술포숙신이미드 상품명: EMCS; (주)도진 가가꾸 겐뀨쇼사 제조)를 2.7 mg 칭량하고, 디메틸술폭시드 (DMSO)/에탄올의 1:1 용액에 최종 농도가 0.3 mg/ml가 되 도록 용해 시켜 EMCS 용액을 준비하였다.
실란 커플링 처리를 행한 기재를 이 EMCS 용액에 실온에서 30 분간 침지하였다. EMCS 용액으로부터 꺼낸 기재는 DMSO 및 에탄올의 혼합 용매 및 에탄올로 차례로 세정한 후, 질소 가스 분위기하에서 건조시켰다. 이와 같이 하여 프로브 고정화 처리를 완료시켰다.
(6) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (3)에서 제조한 프로브 매체를 상기 실시예 17과 완전히 동일하게 하여스폿팅을 행하여, 프로브 고정 기재를 제조하였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과, 유리 기재 표면에 매트릭스상의 스폿 어레이가 형성되어 있다는 것이 확인되었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 데시케이터 내에 정치하였다. 이와 같이 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(7) 보존
상기 단계 (6)에서 제조한 프로브 고정 기재를 데시케이터 내에서 7 일간 보관하였다. 보관 동안에, 프로브 고정 기재가 습도 35 ％ 이하, 온도 25℃로 유지되도록 조정하였다.
(8) 블로킹 처리
상기 실시예 17과 완전히 동일하게 하여 블로킹 처리를 행하였다.
(9) 혼성화 처리
상기 실시예 17과 완전히 동일하게 하여 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서 ,순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음에 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가에 있어서, 레이저 파워를 100 ％로 설정하고 PMT를 400 V에 설정하였다.
(10) 결과
상기 단계 (9)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치하는 식 (5)의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 11520였다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 659였다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는, 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 ㎛의 간격으로 격자상으로스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
<실시예 19>
(1) 프로브의 합성
실시예 10에서 이용한 식 (5) 내지 (8)의 단일 가닥 DNA 프로브를 합성하여, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 수용성 고분자 재료
실시예 17과 완전히 동일하게 하여 PVA 수용액을 제조하였다.
(3) 프로브 매체의 제조
상기 실시예 17과 완전히 동일하게 하여 단일 가닥 DNA 프로브 용액을 제조하였다.
상기 식 (5) 내지 8의 단일 가닥 DNA를 이용하여, 상기 실시예 17의 (3)에 기재한 방법와 동일한 힘법으로 4종류의 프로브 매체를 제조하였다 (정확한 농도는 흡수강도로부터 산출)
(4) 기재 세정
상기 실시예 17과 동일하게 하여 기재 세정을 행하여, 유리 기재를 준비하였다.
(5) 프로브 매체의 스폿팅
상기 단계 (3)에서 제조한 4 종류의 프로브 매체를 버블 제트 프린터 (상품명: BJF850; 캐논(주)사 제조) 용의 4개의 잉크 탱크에 각각의 프로브 매체를 충전하여, 각각의 잉크 탱크를 버블 제트 헤드에 장착하였다. 또 여기서 이용한 버블 제트 프린터 (상품명: BJF85O; 캐논(주)사 제조)는 평판에의 인쇄가 가능하도록 개조를 실시한 것이다. 계속해서 이 프린터에 상기 단계 (4)에서 준비한 유리 기재를 장착하여, 프로브 매체를 유리 기재상에 스폿팅하였다. 여기서 버블 제트 헤드의 액체 배출면과 유리 기재의 액체 부착면과의 거리는 1.2 내지 1.5 mm였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과 유리 기재 표면에 매트릭스상의 스폿 어레이가 형성되어 있는 것이 확인되었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 데시케이터 내에 정치하였다. 이와 같이 하여 4 종류의 프로브를 고정한 프 로브 고정 기재를 제조하였다.
(6) 보관
상기 단계 (5)에서 제조한 프로브 고정 기재를 데시케이터 내에서 7 일간 보관하였다. 보관 동안에, 프로브 고정 기재가 습도 35 ％ 이하, 온도 25℃로 유지되도록 조정하였다.
(7) 블로킹 처리
상기 실시예 17에 있어서 실시한 블로킹 처리를 완전히 수행하지 않고, 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 기재 상을 세정하여, 균일한 혼성화 처리를 할 수 있도록 하였다.
(8) 혼성화 처리
상기 실시예 17과 완전히 동일하게 하여 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1M NaCl/50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 내었다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로 이 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너 (상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 평가에 있어서, 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V로 설정하였다.
(9) 결과
상기 단계 (7)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전 매치되는 식 (5)의 DNA 프로브의 스폿에서는, 532 nm에서 의 형광 강도는 15120이었다. 이에 대하여, 1 염기의 미스매치 서열을 갖는 식 (6)의 DNA 프로브의 스폿에서는 9030의 형광량이 얻어졌다. 또한, 3 염기 미스매치를 갖는 식 (7)의 DNA 프로브의 스폿에서는, 3423으로 완전 매치의 반 이하인 형광량밖에 얻어지지 않고, 6 염기 미스매치의 식 (8)의 DNA 프로브에서는 형광 스폿 대부분을 인식할 수 없었고, 스폿 해당 부위에서의 형광 강도는 973이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 653이었다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는, 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일한 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 μm의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다. 이상의 사항으로부터, DNA 어레이 기재 상에서 완전 상보성의 단일 가닥 DNA를 특이적으로 검출할 수 있었다.
<실시예 20>
(1) 프로브의 합성
표적 물질에 대하여 특이적으로 결합 가능한 프로브로서 실시예 1에서 이용한 식 (1)의 단일 가닥 DNA 프로브를 이용하였다. DNA 자동 합성기를 이용하여 식 (5)의 단일 가닥 DNA 프로브를 합성하였다. 또한, 식 (1)의 단일 가닥 DNA 말단에는 5' 말단의 수산기에 인산기와 헥사메틸렌을 통해 아미노기를 결합한 18량체의 올리고머를 준비하고, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 수용성 고분자 재료
수용성 고분자 재료로서 폴리비닐알코올(PVA)을 선택하였다. 폴리비닐알코 올(PVA)을 포함하는 포발(상품명: 포발 PVA-217E; (주)크라레사 제조) 5 g을 칭량하여 비이커 중에 넣었다. 상기 폴리비닐알코올은 중합도 1700, 비누화도 87.0 내지 89.0 몰％이다. 이것에 순수한 물 495 g을 첨가함으로써 순수한 물 중에 용해시키고, 농도 1.0 중량％의 포발 수용액을 제조하였다. 용해시에, 완전히 용해시키기 위해서 고온욕 중에서 80 ℃로 가온하면서 60 분간 교반하였다. 불용해물이 없는 것을 확인한 후, 스폿팅에 있어서 노즐 막힘이 발생하지 않도록 여과를 행하였다. 여과에는 0.22 μm의 멤브레인 필터를 이용하였다. 이상과 같이 하여 PVA 수용액을 제조하였다.
(3) 프로브 매체의 제조
상기 식 (5)의 단일 가닥 DNA 프로브를 최종 농도가 약 40 μmol/l가 되도록 TE 용액(10 mM Tris-HCl(pH 8)/1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 수용액)에 용해시켜 단일 가닥 DNA 프로브 용액을 제조하였다(정확한 농도는 흡수 강도로부터 산출).
이어서, 프로브 고정 물질로서 에폭시기를 갖는 실란 화합물(글리시독시프로필트리메톡시실란)을 포함하는 실란 커플링제(상품명: KBM-403; 신에츠 가가꾸 고교(주)사 제조)의 500 μmol/l 수용액을 실온하에 30 분간 교반함으로써 프로브 고정 물질 용액을 얻었다. 제조한 프로브 고정 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
상기와 같이 제조한 프로브 용액 100 ㎕를 준비하고, 이것에 상기와 같이 제조한 프로브 고정 물질 용액 100 ㎕를 적가한 후, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 용 액을 10 분간 방치한 후, 순수한 물을 700 ㎕, 상기와 같이 제조한 수용성 고분자 재료인 PVA 수용액 100 ㎕를 적가하여 5 분간 혼합하였다. 혼합한 후, 30 분간 방치하여 프로브 매체를 제조하였다.
(4) 기재 세정
상기 실시예 17과 같이 하여 기재 세정을 행하여 유리 기재를 준비하였다.
(5) 프로브 매체의 스폿팅
상기 실시예 17과 같이 하여 프로브 매체의 기재 상에의 스폿팅을 행하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(6) 보관
상기 단계 (5)에서 제조한 프로브 고정 기재를 데시케이터 중에서 7 일간 보관하였다. 보관 동안에, 프로브 고정 기재가 습도 35 ％ 이하, 온도 25℃로 유지되도록 조정하였다.
(7) 블로킹 처리
상기 단계 (6)에서 보관한 프로브 고정 기재를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액(pH 7.0) 용액으로 세정하여, 프로브 고정 기재 상을 적시고, 균일한 블로킹 처리를 할 수 있도록 하였다. 계속해서 유리 기재를 2 ％ 소혈청 알부민 수용액 중에 침지하여 2 시간 방치하고, 블로킹 처리를 행하였다.
(8) 혼성화 처리
상기 단계 (1)에 기재된 식 (1)의 단일 가닥 DNA 프로브에 대해 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 DNA를 DNA 자동 합성기로 합성하고, 5' 말단에 로다민을 결합시켜 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브를 얻었다. 이 표지화된 단일 가닥 DNA를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 최종 농도 1 μM가 되도록 용해시키고, 상기 용액 중에 상기 단계 (7)에서 얻은 블로킹 처리한 프로브 고정 기재를 침지하여 실온(25 ℃)에서 3 시간 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액(pH 7.0) 용액으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화되지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어버렸다. 이어서, 순수한 물로 여분의 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로, 상기 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너(상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc.제조)를 이용하여 형광 강도를 평가하였다. 형광 강도 평가시에 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V로 설정하였다.
(9) 결과
상기 단계 (8)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전 매치인 식 (1)의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도는 17110이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 이외의 영역에서의 형광 강도를 관찰한 결과 731이었다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 상태는, 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일한 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이는 거의 확인되지 않았다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 μm의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
<실시예 21>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 17과 거의 동일하게 하여 식 (1)의 단일 가닥 DNA 프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 수용성 고분자 재료
상기 실시예 17과 거의 동일하게 하여 PVA 수용액을 제조하였다.
(3) 고비점 용매
고비점 용매로서 프로필렌 글리콜(1,2-프로판디올; 크시다 가가꾸(주)사 제조)을 선택하였다. 프로필렌 글리콜 5.2 g을 칭량하고, 이것에 이소프로필 알코올(2-프로판올; 크시다 가가꾸(주)사 제조) 4 g을 칭량하여 혼합하였다.
프로브 매체 제조시의 추출성 및 혼합성을 고려하여 이소프로필 알코올을 혼합하였다. 이상과 같이 하여 고비점 용매액을 제조하였다.
(4) 프로브 매체의 제조
상기 식 (1)의 단일 가닥 DNA 프로브를 마이크로튜브 1개당 17.53 nmol을 함유하도록 분주, 건조시키고, 각각 단일 가닥 DNA 프로브를 넣은 마이크로튜브를 준비하였다.
상기와 같이 분주된 단일 가닥 DNA 프로브를 넣은 마이크로튜브를 1개 준비하고, 이것에 순수한 물 50 μl를 적가한 후, 3 분간 교반하여 DNA를 충분히 용해시켰다. 이것에 프로브 고정 물질로서 에폭시기를 갖는 실란 화합물(γ-글리시독시프로필트리메톡시 실란)을 포함하는 실란 커플링제(상품명: KBM-403; 신에츠 가가꾸 고교(주) 제조) 20 μl를 적가한 후, 10 분간 혼합하였다. 혼합한 용액을 20 분간 정치시킨 후, 상기 수용성 고분자 재료인 PVA 수용액 100 μl, 고비점 용매액 1400 μl를 적가하고 5 분간 혼합하였다. 마지막으로 430 μl의 순수한 물을 적가하고, 5 분간 혼합한 후, 30 분간 정치시켰다. 이와 같이 하여 프로브 매체를 제조하였다.
(5) 기재 세정
상기 실시예 17과 같이 하여 기재 세정을 행하여 유리 기재를 준비하였다.
(6) 프로브 매체의 스폿팅
상기 실시예 17과 같이 하여 프로브 매체의 기재 상에 스폿팅을 행하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(7) 보관
상기 단계 (6)에서 제조한 프로브 고정 기재를 데시케이터 중에서 7 일간 보관하였다. 보관 중, 프로브 고정 기재가 습도 35 ％ 이하 및 온도 25 ℃에서 유지되도록 조정하였다.
또한, 프로브 고정 기재로서의 건조 보관 특성을 확인하기 위하여, 프로브 고정 기재를 80 ℃에서 5 분간, 핫 플레이트 상에서 건조시킨 후에, 동일하게 데시케이터 중에서 7 일간 보관하였다.
(8) 혼성화 처리
상기 단계 (1)에 기재된 식 (1)의 단일 가닥 DNA 프로브와 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 DNA를 DNA 자동 합성기로 합성하여, 5' 말단에 로다민을 결합시켜 표지화한 단일 가닥 DNA 프로브를 얻었다. 이 표지화된 단일 가닥 DNA를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 최종 농도 1 μm가 되도록 용해시키고, 이 용액 중에 프로브 고정 재료를 침지시켜 인큐베이터 중(45 ℃)에서 2 시간 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 냈다. 이어서, 순수한 물로 잔여 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로, 상기 프로브 고정 기재 상의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너(상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 형광 강도 평가시에 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V로 설정하였다.
(9) 결과
상기 단계 (8)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 데시케이터 중에서 7 일간 보관한 프로브 고정 기재의 경우, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치되는 식 (1)의 DNA 프로브의 스폿에서는, 532 nm에서의 형광 강도가 12970이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 외에서의 형광 강도를 관찰한 결과 131이었다. 이에 반하여 80 ℃에서 5 분간 핫 플레이트 상에서 건조시킨 프로브 고정 기재의 경우, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치되는 식 (5)의 DNA 프로브 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도가 13540이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 외에서의 형광 강도를 관찰한 결과 96이었다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 경우, 각각의 스폿 형상은 거의 원형이고, 동일한 프로브 매체를 스폿팅함으로써 얻어진 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이가 거의 없었다. 또한, 인접하 는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 μm의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
<실시예 22>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 20과 거의 동일하게 하여 식 (1)의 단일 가닥 DNA 프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 수용성 고분자 재료
상기 실시예 17과 거의 동일하게 하여 PVA 수용액을 제조하였다.
(3) 고비점 용매
고비점 용매로서 프로필렌 글리콜(1,2-프로판디올; 크시다 가가꾸(주)사 제조)을 선택하였다. 프로필렌 글리콜 5.6 g을 칭량하고, 이것에 이소프로필 알코올(2-프로판올; 크시다 가가꾸(주)사 제조) 7.9 g을 칭량하여 혼합하였다. 프로브 매체 제조시의 추출성 및 혼합성을 고려하여 이소프로필 알코올을 혼합하였다. 이상과 같이 하여 고비점 용매액을 제조하였다.
(4) 프로브 매체의 제조
상기 식 (1)의 단일 가닥 DNA 프로브를 마이크로튜브 1개당 17.53 nmol을 함유하도록 분주, 건조시키고, 각각 단일 가닥 DNA 프로브를 넣은 마이크로튜브를 준비하였다.
상기와 같이 분주된 단일 가닥 DNA 프로브를 넣은 마이크로튜브를 1개 준비하고, 이것에 순수한 물 50 μl를 적가한 후, 3 분간 교반하여 DNA를 충분히 용해 시켰다. 이것에 프로브 고정 물질로서 이소시아네이트기를 갖는 실란 화합물(γ-이소시아네이트프로필트리에톡시실란)을 포함하는 실란 커플링제(상품명: KBE-9007; 신에츠 가가꾸 고교(주) 제조) 20 μl를 적가한 후, 10 분간 혼합하였다. 혼합한 용액을 20 분간 정치시킨 후, 상기 수용성 고분자 재료인 PVA 수용액 100 μl, 고비점 용매액 1400 μl를 적가하고 5 분간 혼합하였다. 마지막으로 430 μl의 순수한 물을 적가하고 5 분간 혼합한 후, 30 분간 정치시켰다. 이와 같이 하여 프로브 매체를 제조하였다.
(5) 기재 세정
상기 실시예 17과 같이 하여 기재 세정을 행하여 유리 기재를 준비하였다.
(6) 프로브 매체의 스폿팅
상기 실시예 17과 같이 하여 프로브 매체의 기재 상에 스폿팅을 행하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(7) 보관
상기 단계 (6)에서 제조한 프로브 고정 기재를 데시케이터 중에서 7 일간 보관하였다. 보관 중, 프로브 고정 기재가 습도 35 ％ 이하 및 온도 25 ℃에서 유지되도록 조정하였다.
또한, 프로브 고정 기재로서의 건조 보관 특성을 확인하기 위하여, 프로브 고정 기재를 80 ℃에서 5 분간, 핫 플레이트 상에서 건조시킨 후에, 동일하게 데시케이터 중에서 7 일간 보관하였다.
(8) 혼성화 처리
상기 단계 (1)에 기재된 식 (1)의 단일 가닥 DNA 프로브와 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 DNA를 DNA 자동 합성기로 합성하여, 5' 말단에 로다민을 결합시켜 표지화한 단일 가닥 DNA 프로브를 얻었다. 이 표지화된 단일 가닥 DNA를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 최종 농도 1 μm가 되도록 용해시키고, 이 용액 중에 프로브 고정 재료를 침지시켜 인큐베이터 중(45 ℃)에서 2 시간 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 냈다. 이어서, 순수한 물로 잔여 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로, 상기 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너(상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 형광 강도 평가시에 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V로 설정하였다.
(9) 결과
상기 단계 (8)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 데시케이터 중에서 7 일간 보관한 프로브 고정 기재의 경우, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치되는 식 (1)의 DNA 프로브의 스폿에서는, 532 nm에서의 형광 강도가 17790이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 외에서의 형광 강도를 관찰한 결과 89이었다. 이에 대하여 80 ℃에서 5 분간 핫 플레이트 상에서 건조시킨 프로브 고정 기재에서는, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치되는 식 (5)의 DNA 프로브 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도가 18340이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 외에서의 형광 강도를 관찰한 결과 81이었다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 경우, 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일한 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이가 거의 없었다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 μm의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다. 이상의 사항으로부터, DNA 어레이 기재 상에서 완전 상보적인 단일 가닥 DNA를 특이적으로 검출할 수 있었다.
<비교예 2>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 17과 거의 동일하게 하여 식 (5)의 단일 가닥 DNA 프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 수용성 고분자 재료
수용성 고분자 재료에 의한 효과를 확인하기 위해서, 수용성 고분자 재료를 이용하지 않고 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(3) 프로브 매체의 제조
상기 실시예 17과 거의 동일하게 하여, 식 (5)의 단일 가닥 DNA 프로브 용액을 제조하였다(정확한 농도는 흡수 강도로부터 산출). 이어서, 실시예 17과 같이 하여 아미노실란 및 2관능 시약으로 이루어진 프로브 고정 물질 용액을 제조하였다. 제조한 프로브 고정 물질 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
상기와 같이 제조한 프로브 용액 100 μl를 준비하고, 이것에 상기와 같이 제조한 프로브 고정 물질 용액 100 μl를 적가한 후, 5 분간 혼합하였다. 혼합한 용액을 10 분간 방치한 후, 순수한 물 800 μl를 적가하고 5 분간 혼합하였다. 혼합한 후, 30 분간 방치하여 프로브 매체를 제조하였다.
(4) 기재 세정
상기 실시예 17과 같이 하여 기재 세정을 행하여 유리 기재를 준비하였다.
(5) 프로브 매체의 스폿팅
상기 실시예 17과 같이 하여 프로브 매체의 기재 상에 스폿팅을 행하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(6) 보관
상기 (5)에서 제조한 프로브 고정 기재를 데시케이터 중에서 7 일간 보관하였다. 보관 중, 프로브 고정 기재가 습도 35 ％ 이하 및 온도 25 ℃에서 유지되도록 조정하였다.
(7) 블로킹 처리
상기 (6)에서 보관한 프로브 고정 기재를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 세정하여 프로브 고정 기재를 적시고, 균일한 블로킹 처리를 할 수 있도록 하였다. 계속해서 유리 기재를 2 ％ 소혈청 알부민 수용액 중에 침지시켜 2 시간 방치하고, 블로킹 처리를 행하였다.
(8) 혼성화 처리
상기 단계 (1)에 기재된 식 (5)의 단일 가닥 DNA 프로브와 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 DNA를 DNA 자동 합성기로 합성하여, 5' 말단에 로다민을 결합시켜 표지화한 단일 가닥 DNA 프로브를 얻었다. 이 표지화된 단일 가닥 DNA를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액(pH 7.0)에 최종 농도 1 μm가 되도록 용해시키고, 이 용액 중에 상기 (7)에서 얻은 블로킹 처리한 프로브 고정 재료를 침지시켜 실온(25 ℃)에서 3 시간 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 냈다. 이어서, 순수한 물로 잔여 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로, 상기 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너(상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 형광 강도 평가시에 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V로 설정하였다.
(9) 결과
상기 단계 (8)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치되는 식 (5)의 DNA 프로브의 스폿에서는, 532 nm에서의 형광 강도가 1427이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 외에서의 형광 강도를 관찰한 결과 697이었다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 경우, 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일한 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이가 거의 없었다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 μm의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다. 이와 같이, 수용성 고분자 재료를 포함하지 않는 프로브 매체를 이용한 경우에는, 완전 매치에서의 스폿 부위의 형광 강도가 얻어지지 않고, 효과적으로 검출을 행할 수 없었다.
<비교예 3>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 17과 거의 동일하게 하여 식 (5)의 단일 가닥 DNA 프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 수용성 고분자 재료
수용성 고분자 재료에 의한 효과를 확인하기 위해서, 수용성 고분자 재료를 이용하지 않고 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(3) 프로브 매체의 제조
상기 실시예 17과 거의 동일하게 하여, 식 (5)의 단일 가닥 DNA 프로브 용액을 제조하였다(정확한 농도는 흡수 강도로부터 산출). 제조한 프로브 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
상기와 같이 제조한 프로브 용액 100 μl를 준비하고, 글리세린 7.5 중량％, 요소 7.5 중량％ 및 에틸렌 글리콜 용액 7.5 중량％를 포함하는 수용액 900 μl를 적가하였다. 5 분간 혼합한 후, 30 분간 방치하여 프로브 매체를 제조하였다.
(4) 기재 세정
상기 실시예 17과 같이 하여 기재 세정을 행하여 유리 기재를 준비하였다.
(5) 프로브 고정화 처리
상기 실시예 18과 같이 하여 세정한 유리 기재 상에 프로브 고정화 처리를 행하였다.
(6) 프로브 매체의 스폿팅
상기 (3)에서 제조한 프로브 매체를 상기 실시예 17과 거의 동일하게 하여, 스폿팅을 행하여 프로브 고정 기재를 제조하였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과, 유리 기재 표면에 매트릭스상의 스폿 서열이 형성되어 있는 것이 확인되었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 데시케이터 중에 정치시켰다. 이와 같이 하여 프로브 고정 재료를 제조하였다.
(7) 보존
상기 단계 (6)에서 제조한 프로브 고정 기재를 데시케이터 중에서 7 일간 보관하였다. 보관 중, 프로브 고정 기재가 습도 35 ％ 이하 및 온도 25 ℃에서 유지되도록 조정하였다.
(8) 블로킹 처리
상기 실시예 17과 거의 동일하게 하여 블로킹 처리를 행하였다.
(9) 혼성화 처리
상기 실시예 17과 거의 동일하게 하여 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 냈다. 이어서, 순수한 물로 잔여 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로, 상기 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너(상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 형광 강도 평가시에 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V로 설정하였다.
(10) 결과
상기 (9)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치되는 식 (5)의 DNA 프로브 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도가 1527이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 외에서의 형광 강도를 관찰한 결과 792이었다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 경우, 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일한 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이가 거의 없었다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하고, 약 200 μm의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
<비교예 4>
(1) 프로브의 합성
상기 실시예 20과 거의 동일하게 하여 식 (1)의 단일 가닥 DNA 프로브를 준비한 후, 이하의 실험에 이용하였다.
(2) 수용성 고분자 재료
수용성 고분자 재료에 의한 효과를 확인하기 위해서, 수용성 고분자 재료를 이용하지 않고 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(3) 고비점 용매
고비점 용매에 의한 효과를 확인하기 위해서, 고비점 용매를 이용하지 않고 프로브 고정 기재를 제조하였다.
(4) 프로브 매체의 제조
상기 실시예 20과 거의 동일하게 하여, 식 (1)의 단일 가닥 DNA 프로브 용액을 제조하였다(정확한 농도는 흡수 강도로부터 산출). 상기 (2)의 수용성 고분자 재료인 PVA 용액 대신에 순수한 물을, 상기 (3)의 고비점 용매의 대체 용매로서 이소프로필 알코올을 적가하고 혼합하였다. 제조한 프로브 용액을 이하의 실험에 이용하였다.
(5) 기재 세정
상기 실시예 17과 동일하게 하여 기재 세정을 행하여 유리 기재를 준비하였다.
(6) 프로브 고정화 처리
상기 실시예 17과 같이 하여 세정한 유리 기재 상에 프로브 고정화 처리를 행하였다.
(7) 프로브 매체의 스폿팅
상기 (4)에서 제조한 프로브 매체를 상기 실시예 17과 거의 동일하게 하여 스폿팅을 행하여 프로브 고정 기재를 제조하였다. 스폿팅 종료 후, 유리 기재를 현미경에 의해 관찰한 결과, 유리 기재 표면에 매트릭스상의 스폿 서열이 형성되어 있는 것이 확인되었다. 스폿팅 종료 후의 유리 기재는 데시케이터 중에 정치시켰다. 이와 같이 하여 프로브 고정 기재를 제조하였다.
또한, 일부의 프로브 고정 기재에 대해서는 80 ℃에서 5 분간의 핫 플레이트 처리를 행한 후, 데시케이터 중에서 정치시켰다.
(8) 보존
상기 (7)에서 제조한 프로브 고정 기재를 데시케이터 중에서 7 일간 보관하였다. 보관 중, 프로브 고정 기재가 습도 35 ％ 이하 및 온도 25 ℃에서 유지되도 록 조정하였다.
(9) 혼성화 처리
상기 실시예 17과 거의 동일하게 하여 혼성화 처리를 행하였다. 그 후, 프로브 어레이를 1 M NaCl/50 mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 세정하여 프로브 핵산과 혼성화하지 않은 단일 가닥 DNA 프로브를 씻어 냈다. 이어서, 순수한 물로 잔여 염분을 제거한 후, 질소 블로잉에 의해 프로브 고정 기재를 건조시켰다. 다음으로, 상기 프로브 고정 기재의 스폿의 형광 강도를 형광 스캐너(상품명: Gene Pix 4000B; Axon Instruments, Inc. 제조)를 이용하여 평가하였다. 형광 강도 평가시에 레이저 파워를 100 ％로 설정하고, PMT를 400 V로 설정하였다.
(10) 결과
상기 (9)에서의 형광 스캐너 평가 결과를 해석한 결과, 데시케이터 중에서 7 일간 보관한 프로브 고정 기재의 경우, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치되는 식 (1)의 DNA 프로브의 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도가 4276이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 외에서의 형광 강도를 관찰한 결과 89이었다. 이에 대하여 80 ℃에서 5 분간 핫 플레이트 상에서 건조시킨 프로브 고정 기재에서는, 표지화된 단일 가닥 DNA 프로브와 완전히 매치되는 식 (5)의 DNA 프로브 스폿에서, 532 nm에서의 형광 강도가 1286이었다. 또한, DNA 프로브의 스폿부 외에서의 형광 강도를 관찰한 결과 81이었다. 각 DNA 프로브의 스폿을 형광으로 관찰한 경우, 각각의 스폿 형상이 거의 원형이고, 동일한 프로브 매체를 스폿팅한 스폿 사이에서는 형광 강도의 차이가 거의 없었다. 또한, 인접하는 스폿과의 간격은 거의 균등하 고, 약 200 μm의 간격으로 격자상으로 스폿이 배치되어 있는 것이 관찰되었다.
또한, 서열 1 내지 10의 다른 특징으로서 첨부하는 서열 목록에 기재한 서열 목록 프리텍스트의 내용은 하기와 같다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (20)

  1. 표적 물질에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 및
    상기 프로브와 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질 및 기재 표면에 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질
    을 포함하는, 기재에 배치하기 위한 프로브 매체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로브와 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질과 상기 기재 표면에 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질이 동일한 물질인 프로브 매체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프로브와 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질과 상기 기재 표면에 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질이 상이한 물질이지만 단일 화합물로 전환되는 것인 프로브 매체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 결합할 수 있는 부위가 관능기인 프로브 매체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 결합이 화학적 작용에 의한 공유 결합, 이온 결합 및 정전 흡착을 포함하는 물리 흡착 중 어느 하나에 의한 것인 프로브 매체.
  6. 기재를 준비하는 단계,
    표적 물질에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 및 상기 프로브와 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질, 상기 기재 표면에 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질 각각 또는 이들 모두를 포함하는 프로브 매체를 기재에 부여하는 단계
    를 포함하는, 프로브가 고정된 기재의 제조 방법.
  7. 기재를 준비하는 단계, 및
    표적 물질에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 프로브 및 상기 DNA 프로브와 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질, 상기 기재 표면에 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질 각각 또는 이들 모두를 포함하는 DNA 프로브 매체를 기재에 부여하는 단계
    를 포함하는 DNA 어레이의 제조 방법.
  8. 기재를 준비하는 단계,
    표적 물질에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 및 상기 프로브와 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질, 상기 기재 표면에 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질 각각 또는 이들 모두를 포함하는 프로브 매체를 기재에 부여하는 단계, 및
    상기 프로브가 고정된 기재를 이용하여 표적 물질을 검출하는 단계
    를 포함하는 표적 물질의 검출 방법.
  9. 프로브와, 상기 프로브와 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질, 기재 표면에 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질 각각 또는 이들 모두를 준비하는 단계,
    상기 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질을 각각 포함하는 용액을 용기 중에 수납하는 단계, 및
    상기 프로브를 기재에 고정시킬 때에 상기 프로브와 상기 결합할 수 있는 부위를 갖는 물질을 혼합시키는 단계
    를 포함하는 프로브 매체의 제조 방법.
  10. 표적 물질에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 수용성 고분자 재료 및 고비점 용매를 포함하는 프로브 매체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 수용성 고분자 재료가 폴리비닐 알코올인 프로브 매체.
  12. 제10항에 있어서, 상기 고비점 용매가 글리콜계 고비점 유기 용매인 프로브 매체.
  13. 제10항에 있어서, 상기 프로브가 DNA 프로브인 프로브 매체.
  14. 기재를 준비하는 단계, 및
    표적 물질에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 수용성 고분자 재료 및 고비점 용매를 포함하는 프로브 매체를 기재에 부여하는 단계
    를 포함하는 프로브의 고정 방법.
  15. 기재를 준비하는 단계, 및
    표적 물질에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 수용성 고분자 재료 및 고비점 용매를 포함하는 프로브 매체를 기재에 부여하는 단계
    를 포함하는 DNA 어레이의 제조 방법.
  16. 제10항에 기재된 상기 프로브 매체를 기재에 고정시키기 위해, 상기 프로브 매체를 스폿팅(spotting) 방법에 의해 기재에 부여하는 단계, 및
    얻어진 프로브 고정 기재를 이용하여 표적 물질을 검출하는 단계
    를 포함하는 표적 물질의 검출 방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 프로브, 수용성 고분자 재료 및 고비점 용매를 각각 용기 중에 수납하고, 상기 프로브를 기재에 고정시킬 때에 혼합하여 이루어지는 프로브 매체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 수용성 고분자 재료 및 고비점 용매가 프로브 매체의 건조를 지연시킴으로써 스폿팅에 의해 형성된 프로브 고정 기재에서 표적 물질의 검출을 용이하게 하는 것을 특징으로 하는 프로브 매체.
  19. 제14항에 기재된 상기 프로브 고정 방법에 의해 제조된 프로브 고정 기재의 프로브가 DNA 프로브인 DNA 어레이.
  20. 제10항에 있어서, 상기 고비점 용매가 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 또는 티오디글리콜 중에서 선택되는 1종 이상의 용매인 프로브 매체.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7534621B2 (en) * 2003-02-07 2009-05-19 Canon Kabuhsiki Kashia Method of producing probe medium and method of immobilizing probe using probe medium
US8367324B2 (en) 2003-11-17 2013-02-05 Canon Kabushiki Kaisha Method for judging change in probe-bearing substrate, probe-bearing substrate and detecting apparatus
JP4711326B2 (ja) * 2003-12-22 2011-06-29 キヤノン株式会社 検定試料および検量線の作製方法
DE102004062281A1 (de) * 2003-12-29 2005-07-28 Siemens Ag Verfahren und Spotting-Lösung zum Herstellen von Microarrays

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4307151A (en) * 1978-08-30 1981-12-22 Director-General Of The Agency Of Industrial Science And Technology Enzyme-active fibrous materials and method for preparing same
US5143854A (en) * 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5071909A (en) * 1989-07-26 1991-12-10 Millipore Corporation Immobilization of proteins and peptides on insoluble supports
US5412087A (en) * 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
JP3708567B2 (ja) * 1994-07-20 2005-10-19 日清紡績株式会社 生物学的に活性な物質を固定するための方法
US5688642A (en) * 1994-12-01 1997-11-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Selective attachment of nucleic acid molecules to patterned self-assembled surfaces
US6040295A (en) * 1995-01-13 2000-03-21 Genemedicine, Inc. Formulated nucleic acid compositions and methods of administering the same for gene therapy
JP3517031B2 (ja) * 1995-06-09 2004-04-05 日清紡績株式会社 生物学的活性物質の分析法
EP0794212A1 (en) * 1996-03-08 1997-09-10 Unitika Ltd. Polyester resin aqueous dispersion and process for preparing the same
US6143037A (en) * 1996-06-12 2000-11-07 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for coating medical devices
US6060246A (en) * 1996-11-15 2000-05-09 Avi Biopharma, Inc. Reagent and method for isolation and detection of selected nucleic acid sequences
JP4313861B2 (ja) * 1997-08-01 2009-08-12 キヤノン株式会社 プローブアレイの製造方法
US6506895B2 (en) * 1997-08-15 2003-01-14 Surmodics, Inc. Photoactivatable nucleic acids
DE69815282T2 (de) * 1997-12-25 2004-05-06 Tosoh Corp., Shinnanyo Magnetischer Träger, seine Herstellung, und Verfahren zum Extrahieren von Nukleinsäuren
US6355419B1 (en) * 1998-04-27 2002-03-12 Hyseq, Inc. Preparation of pools of nucleic acids based on representation in a sample
US6048695A (en) * 1998-05-04 2000-04-11 Baylor College Of Medicine Chemically modified nucleic acids and methods for coupling nucleic acids to solid support
US6372813B1 (en) * 1999-06-25 2002-04-16 Motorola Methods and compositions for attachment of biomolecules to solid supports, hydrogels, and hydrogel arrays
WO2001006011A2 (en) * 1999-07-14 2001-01-25 Genometrix Genomics, Inc. Arrays comprising non-covalently associated nucleic acid probes and methods for making and using them
US6171797B1 (en) * 1999-10-20 2001-01-09 Agilent Technologies Inc. Methods of making polymeric arrays
JP2001178459A (ja) * 1999-12-27 2001-07-03 Fuji Photo Film Co Ltd 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ
US20020103348A1 (en) * 1999-12-27 2002-08-01 Fuji Photo Film Co., Ltd. DNA chip and its preparation
JP2001183368A (ja) * 1999-12-27 2001-07-06 Fuji Photo Film Co Ltd 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ
JP2001183367A (ja) * 1999-12-27 2001-07-06 Fuji Photo Film Co Ltd 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ
US20010055797A1 (en) * 2000-02-17 2001-12-27 Conroy John F.T. Sol-gel biomaterial immobilization
AT408150B (de) * 2000-04-14 2001-09-25 Oesterr Forsch Seibersdorf Verfahren zur immobilisierung eines analyten an einer festen oberfläche
US6852524B2 (en) * 2001-04-27 2005-02-08 Canon Kabushiki Kaisha Probe carrier, probe fixing carrier and method of manufacturing the same
JP2004101516A (ja) * 2002-07-19 2004-04-02 Canon Inc プローブ担体およびその製造方法
US7534621B2 (en) * 2003-02-07 2009-05-19 Canon Kabuhsiki Kashia Method of producing probe medium and method of immobilizing probe using probe medium
US7534521B2 (en) * 2004-01-31 2009-05-19 Shen-Li High Tech Co., Ltd (Shanghai) Integral multi-stack system of fuel cell

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