CN1610742B - 探针介质 - Google Patents
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Abstract
一种探针介质,包括可特异性结合靶向物质的探针、及具有探针可结合部位的物质、及/或具有基材表面可结合部位的物质。固定了探针的基材的制造方法包括,准备基材的步骤及将探针介质赋予在基材上的步骤。DNA序列的制造方法包括,准备基材的步骤及将探针介质赋予在基材上的步骤。靶向物质的检测方法包括,准备基材的步骤、将该探针介质赋予在基材上的步骤及使用固定了探针的基材来检测靶向物质的步骤。另外,探针介质的制造方法包括,准备探针、含有探针可结合部位的物质、及具有基材表面可结合部位的物质的步骤;将分别合有包含该可结合部位的物质的溶液收纳在容器中的步骤;当将所述探针固定在基材上时,混合探针和所述具有可结合部位的物质的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及一种将探针固定于基材的探针介质及其固定方法。本发明还涉及一种检测方法,它是利用将探针介质固定于基材上得到的探针固定基材来检测靶向物质。
背景技术
作为将探针固定于基材上的方法,已知各种方法。详细地说,有通过在基材上合成探针实现在基材上固定的方法,也有用针状物或贴附物将事先准备好的探针赋予于基材上来实现固定的方法。具体地,如美国专利第51438545号公报(USP5143854)记载,现已已知一种方法,它是通过反复利用活化剂由基材上所选区域除去保护基,使具有可除去保护基的单体与前述区域结合,来合成基材上具有种种序列的单体。此外,如特开平8-23975记载,现还已知一种方法,它是使具有基材及基材上载有的碳化二亚胺的高分子化合物组成的固定用材料,与具有碳化二亚胺反应性的生物活性物质相接触,从而实现固定。同样地,特开平8-334509记载了在检测生物学活性物质时,在具有碳化二亚胺的化合物上,通过碳化二亚胺基进行固定,由此进行检测的方法。再有,特开2001-178442记载了一种方法,它通过使末端具有巯基的DNA片断与固相载体(具有能与巯基反应形成反应性取代基的链状分子一端固定于表面)以液相接触,使该DNA片断与链状分子之间形成共价键,从而实现将DNA片断固定于固相载体表面。
另外,作为生物体成分的检测方法,也已知很多方法。特开2001-116699记载了一种方法,该方法在排除背景噪声影响的同时能够以高灵敏度、高精度且简便地检测RNA、cDNA、寡核苷酸等生物体成分等物质。再有,特开2001-116750记载了一种方法,它用喷嘴将含有反应性物质的溶液喷于反应基板上所希望的位置,由此将反应性物质固定于基板上。基板为玻璃或硅制,反应性物质为DNA片断、cDNA、RNA、酶、抗原、抗体、表位、蛋白质、多核苷酸、肽等组成的组中选出的至少一种。
在基材上固定探针时,已知使用水溶性高分子材料进行封闭处理。具体地,特许第2794728号记载了将样品核酸固定在膜上之后,浸泡在含有PVA或/及PVP的溶液中进行封闭处理的方法。此外,对于将核酸固定于膜上之后的处理,已知使用脱脂乳等进行封闭处理。具体地,特公平06-034756记载了将核酸固定于膜上之后,在使该膜与脱脂乳及N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基硫代)丙酸酯反应的溶液中进行封闭处理的方法。
另外,对于将探针固定于基材上的探针固定基材,在将探针赋予在基材上之后,已知要防止DNA探针的干燥。具体地,特开2001-178459记载了在DNA片断溶解或分散而成的水溶液中添加高沸点溶剂。
再者,关于用高分子材料(聚合物)涂覆医疗用具,已知用聚合物及药剂涂覆医疗用具。具体地,特表2000-512519记载了一种用来涂覆医疗用具、并含有生物适应性生物分解性聚合物及药剂的组合物。
但是,作为含有可特异性结合以往使用的靶向物质的探针的探针介质,还没有将探针及探针可结合部位、及基材上可结合部位包含在1个介质中的物质.而且,作为将可特异性结合以往使用的靶向物质的探针固定于基材上的方法,是通过将含有探针可结合部位的材料涂覆于基材上、或处理基材表面而形成探针可结合部位等方法,在基材上形成结合层后,通过赋予至少含有探针的介质来固定探针.为此,在将探针介质赋予于基材上之前,为了事先在基材上形成探针可结合部位,有必要进行处理.进而,以具有探针可结合部位的化合物与基材为探针固定材料,通过在探针固定材料上予处理基材表面来固定探针.该方法在进行探针固定化前,需要在探针固定材料上处理基材.
另外,作为含有可特异性结合以往使用的靶向物质的探针介质,还没有将探针及水溶性高分子材料包含在1个介质中的物质。作为使用探针固定基材来检测靶向物质的检测方法中的1个步骤的封闭处理中,已知使用水溶性高分子材料,但是还没有在探针介质中含有水溶性高分子材料的物质,也没有在基材上固定探针时混合探针及水溶性高分子材料的物质。而且,作为将可特异性结合以往使用的靶向物质的探针固定于基材上的探针固定基材,已知在基材上固定作为1种探针的DNA片断之后,需要防止DNA片断干燥。为此,需要在DNA片断溶解或分散而成的水溶液中添加高沸点溶剂等。
发明内容
本发明提供一种探针介质,其中,包括可特异性结合靶向物质的探针、探针可结合部位及基材可结合部位。
本发明还提供一种探针介质,其中,包括可特异性结合靶向物质的探针、水溶性高分子材料及高沸点溶剂。
本发明还提供一种固定探针的固定方法,其中,该方法是通过点样法(spotting)将前述探针介质赋予基材上来实现的。通过该探针固定方法制造的探针固定基材的探针,提供作为DNA探针的DNA序列。提供一种检测靶向物质的检测方法,其中,该方法使用探针固定基材,它是通过点样法将探针介质赋予在基材上来固定并得到的。
本发明还提供了一种探针介质,其中,在容器中分别收纳了前述探针及将探针固定于基材上的物质,并在固定于基材上时进行混合。
本发明还提供了一种探针介质,它是在容器中分别收纳前述探针与水溶性高分子材料及高沸点溶剂,并在固定于基材上时进行混合而成的。
作为本发明的第一实施方式,将探针固定于探针介质及基材上的方法中使用含有具有探针与探针可结合部位的物质、及具有基材上可结合部位的物质的介质。作为本发明的第二实施方式,将探针固定于探针介质及基材上的方法中使用含有探针与水溶性高分子材料及高沸点溶剂的介质。
探针包括单链核酸探针、单链DNA探针、单链RNA探针、单链PNA探针等。如果考虑到作为探针介质的核酸探针的稳定性,介质中含有的探针的量,在介质中,例如优选将2mer~500mer、特别是2mer~80mer的核酸探针浓度调整为0.05~500μmol/1、特别是0.05~50μmol/l。这些探针也可以是探针单体,优选在探针末端进行了连接子(linker)修饰的探针。作为连接子修饰,可列举出生物素化、官能团修饰等。作为官能团,可列举出胺(NH2)基、羧(COOH)基、巯基(SH)、羟(OH)基等。特别是作为探针官能团,如果考虑到探针官能团合成的难易程度,优选氨基;如果考虑到探针官能团的反应性,优选巯基。
作为探针的可结合部位,没有特别的限制,但优选与探针末端的连接子结合.作为与探针末端的连接子结合的形态,可列举出各种例子,但优选化学键.作为探针连接子的可结合部位,可列举出抗生物素蛋白、官能团等.作为官能团,可列举出环氧基(CHOCH2)、氨基(NH2)、巯基(SH)、顺丁烯二酰亚胺基、氯丙基(C3H6Cl)、异氰酸酯基(NCO)等。特别是作为探针可结合的官能团,如果考虑到与探针官能团的结合,优选环氧基、顺丁烯二酰亚胺基、氯丙基、异氰酸酯基。作为介质中含有探针的可结合部位的量,由于探针可结合部位不同该量也不同,没有特别的限制,但如果考虑到与探针的结合性,优选将探针量调整至100~100000当量。
作为基材上可结合部位,没有特别的限制,但优选牢固地结合于基材上的部位。可结合部位也可为官能团,优选与基材形成化学键的官能团。作为结合在基材上的官能团,包括烷氧基甲硅烷基(SiOR)、硅醇基(SiOH)、烷氧基(OR)等。特别是由于容易固定于基材上,优选烷氧基甲硅烷基、硅醇基,但是,当基材上形成氨基、羰基时,优选具有与其有反应性的官能团。硅醇基也可以是通过烷氧基甲硅烷基的水解形成的硅醇基。探针及将探针固定于基材上的物质可以为在介质中通过反应发生结合的物质,但优选在官能团间发生化学反应形成共价键的反应。
作为这些探针、探针可结合部位、基材上可结合部位的各种组合,可列举出各种例子,但作为官能团的具体的组合,可列举出例如,探针官能团为氨基、探针可结合部位的官能团为环氧基、基材上可结合部位的官能团为硅醇基的组合。此外,还可列举出探针官能团为巯基、探针可结合部位的官能团为顺丁烯二酰亚胺的组合,探针官能团为羰基、探针可结合部位的官能团为氨基、基材上可结合部位的官能团为硅醇基的组合,探针官能团为氨基、探针可结合部位的官能团为异氰酸酯基、基材上可结合部位的官能团为硅醇基的组合。其中,特别是如果考虑到探针官能团合成的难易程度、探针可结合部位的官能团的反应性,优选探针官能团为氨基、探针可结合部位的官能团为异氰酸酯基。这些组合优选通过在介质中混合而进行反应,为了使其反应,也可在一定的条件下进行处理。
单一物质中具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团,且基材上可结合部位的官能团为烷氧基甲硅烷基、硅醇基的情况下,具体的单一物质可列举出硅烷偶联剂。硅烷偶联剂中,烷氧基甲硅烷基通过水解形成硅醇剂。硅烷偶联剂中与烷氧基甲硅烷基不同的另外1种官能团为上述列举的环氧基、异氰酸酯基、巯基、氯丙基时,硅烷偶联剂分别为环氧基硅烷、异氰酸酯基硅烷、巯基硅烷、氯丙基硅烷。这些硅烷偶联剂根据需要进行水解,并使之与探针混合。
不同的物质中分别含有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团,且探针可结合部位的官能团为顺丁烯二酰亚胺基、基材上可结合部位的官能团为烷氧基甲硅烷基、硅醇基时,具体的各种物质的组合可列举出二元性试剂与硅烷偶联剂.具体的二元性试剂名称可列举出,N-(4-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺、N-(6-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺、N-(8-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺、N-(11-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺等.特别是将这些物质作为探针介质处理时,如果适合为水溶性,也可以将它们变为水溶性的N-(4-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)硫代琥珀酰亚胺钠盐、N-(6-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)硫代琥珀酰亚胺钠盐、N-(8-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)硫代琥珀酰亚胺钠盐、N-(11-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)硫代琥珀酰亚胺钠盐.此外,对于硅烷偶联剂,硅醇基可以为烷氧基甲硅烷基水解形成的产物.可以列举出各种可与二元性试剂反应的硅烷偶联剂,但优选具有氨基的氨基硅烷.这些硅烷偶联剂根据需要进行水解,并使之与探针混合.
作为水溶性高分子材料,有聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、paogen(パオゲン)、羧甲基纤维素(CMC)、羟乙基纤维素(HEC)、右旋糖苷、支链淀粉等。其中,聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为常用材料,且对探针稳定,为优选。当为常用材料的聚乙烯醇(PVA)时,优选根据需要调整聚合度、皂化度。通过调整聚合度、皂化度,调整聚乙烯醇在探针介质中的溶解性、探针介质的粘度、将探针介质点样于基材上之后的斑点强度、吸湿性等成为可能。具体地说,如果在基材上赋予探针介质没有问题,优选适当地调整聚合度、皂化度。另外,可将通过在基材上赋予探针介质而形成的探针固定基材的斑点形状特性、吸湿性等调整至适当的状态。但是,在聚乙烯醇的聚合度高的情况下,不仅探针介质的粘度会上升,而且由于聚乙烯醇在探针介质中的溶解性下降,将稳定的探针介质赋予在基材上也将变得困难。在聚乙烯醇的皂化度高的情况下,不仅聚乙烯醇在探针介质中的溶解性将下降,由于探针介质的粘度增加,赋予在基材上也将变得困难。作为避免其的方法,可列举出降低聚乙烯醇浓度的方法,但由于浓度下降会引起探针稳定性、斑点形状特性、吸湿性等下降,有必要选定适当的聚乙烯醇、并调整其浓度。优选将探针介质中聚乙烯醇的浓度调整至0.001~1wt%。特别优选调整至0.01~0.2wt%。当探针介质中聚乙烯醇的浓度位于上述范围内时,优选降低聚乙烯醇的聚合度、增加聚乙烯醇的皂化度。作为聚乙烯醇的聚合度、皂化度,优选例如,聚合度200~1700、皂化度87~99mol%。
也可将这种聚乙烯醇事先溶解,并混合于探针介质中。溶解的溶剂可以为乙醇、二甲基亚砜(DMSO)等有机溶剂,如果考虑到溶解性,优选水、乙醇。溶解方法为将聚乙烯醇混合于水中之后,可通过加温使不溶物快速溶解。优选在过滤后与探针介质混合,其中,过滤是为了消除溶解的聚乙烯醇中的不溶物。对于溶解了聚乙烯醇的溶液,如果考虑到与探针混合时的探针稳定性,优选pH值为6.0~9.0,特别优选pH值为7.0~8.0。
作为含有探针及将探针固定于基材上的物质的探针介质的介质,优选含水。除水之外介质中含有的有机溶剂可列举乙二醇、硫二甘醇、甘油、异丙醇、乙醇等。具体的介质可列举出含水70~95wt%、硫二甘醇0.1~3%、异丙醇5~30wt%。更优选的介质含水80~90wt%、硫二甘醇1~2.5%、异丙醇10~20wt%。
作为高沸点溶剂,有乙二醇、丙二醇、三甘醇、二甘醇、双丙甘醇、硫二甘醇等。其中,硫二甘醇、双丙甘醇为常用的材料,也适用于用作点样用介质,为优选。由于乙二醇类高沸点有机溶剂为高粘性液体,混合时介质的称量会变得困难。为此,也可事先与异丙醇等低粘性液体混合。这时,作为混合的低粘性液体,可列举出异丙醇之外的醇类溶剂、水等。作为高沸点溶剂的添加,优选将探针介质赋予于基材上时的斑点形状特性、吸湿性、干燥性、干燥状态等调整至适当的状态。
作为具体的介质,可列举出含有水70~95wt%、硫二甘醇0.1~3%、异丙醇5~30wt%、聚乙烯醇0.001~1wt%。优选含有水80~90wt%、硫二甘醇1~2.5wt%、异丙醇10~20wt%、聚乙烯醇0.01~0.2wt%。
进而,为了在探针介质中将探针高效地固定于基材上,也可以含有探针固定物质.探针固定物质可以含有底涂剂(primer)、偶联剂、密封剂、表面处理剂、表面改性剂、偶联剂与交联剂的结合物质、偶联剂与二元性试剂的结合物质等.作为介质中含有物质的量,如果考虑到探针在基材上的固定性,优选在介质中例如,将浓度调整至0.05~50000μmol/l,特别优选10~500μmol/l.这些物质也可以是具有探针或与探针官能团可结合的官能团的物质,官能团可以包括环氧基(CHOCH2)、氨基(NH2)、巯基(SH)、顺丁烯二酰亚胺基、氯丙基(C3H6Cl)、异氰酸酯基(NCO)。特别是探针官能团优选氨基(NH2)、羧基(COOH)、巯基(SH)、羟基(OH)等。如果考虑到与探针官能团的结合,探针可结合官能团优选环氧基、顺丁烯二酰亚胺基、氯丙基等。另外,这些将探针固定于基材上的物质也可以是具有为了固定于基材上的官能团的物质,官能团也可以包括烷氧基甲硅烷基(SiOR)、硅醇基(SiOH)、烷氧基(OR)等。从容易固定于基材上方面考虑,优选烷氧基、硅醇基。硅醇基也可以是通过烷氧基甲硅烷基水解而形成的硅醇基。探针与将探针固定于基材上的物质也可以是在介质中通过反应进行结合的物质,优选在官能团间发生化学反应形成共价键。
作为向探针介质中混合水溶性高分子材料的方法,是事先使水溶性高分子材料完全溶解,配制成规定浓度的溶液。优选将调整好的水溶性高分子溶液称量至规定浓度,并进行混合的方法。边加温混合溶液,边使聚乙烯醇溶解后,过滤,以除去不溶物、异物。由此来配制水溶性高分子水溶液。优选将该水溶性高分子水溶液混合于探针介质中,以使其在探针介质中的浓度为0.01~0.2wt%。
作为混合探针介质的顺序,可以列举出若干。作为第1种方法,是将具有探针及探针可结合部位的官能团与具有基材上可结合部位的官能团的物质事先混合后,添加一定量的作为介质的水、有机溶剂等溶液,混合。根据需要,也可以调整温度并放置一定的时间,重复进行介质的添加混合。最后,增加未添加或添加量少的溶液至一定比例,由此调制探针介质的方法。混合探针及物质时,要考虑混合会导致反应进行,根据需要,优选调整混合状态的温度、混合时间、pH值等。混合探针及物质导致反应进行时,通过预先混合可使物质间的反应更容易充分进行。进而,调整混合可以使探针及物质更容易充分地结合,为优选。另外,在向探针及物质的混合介质中添加、混合溶液时,可在混合探针及物质后,采用依次滴加、混合、调整作为溶液的部分或全部构成介质的水、有机溶剂等的方法,也可以预先混合水、有机溶剂等构成介质的一部分或全部,然后采用依次滴加、混合、调整该混合介质的方法。当探针及物质在混合介质中反应时,如果添加溶液可以进一步促进反应,那么优选调整所添加构成介质的顺序、间隔、添加时的状态。第2种方法仅仅适用于在不同的物质中具有与探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的情况,它是将具有探针可结合部位的官能团的物质,及具有探针或基材上可结合部位的官能团的物质中的任何一方,与介质的部分或全部为水、有机溶剂的溶液混合后,再混合剩下的另一方。当难于将探针或物质混合、溶解于溶液中时,由于该方法可调整混合、溶解的条件,为优选,而且当同时混合会引起预定反应以外的作用时,该方法为优选。特别是当物质为硅烷偶联剂,且可稳定地混合或/及溶解探针可结合官能团时,由于事先将物质混合、溶解于溶液中可形成足够的硅醇基,所以优选。作为第3种方法,是分别称量含有探针及探针可结合部位的官能团与基材上可结合部位的官能团的物质,及溶液的部分或全部的构成介质,放入一个容器中,进行一次混合。该方法适用于不会由于探针、物质及溶液的混合顺序不同而引起探针介质特性的变化的情况,由于可以简化混合步骤,为优选。
另外,虽然将水溶性高分子材料混合于探针介质的顺序没有特别的限制,但优选在将探针与其他的介质混合后,最后进行。
将高沸点溶剂混合于探针介质的方法优选事先称量至规定浓度,然后进行混合。
虽然将高沸点溶剂混合于探针介质的顺序没有特别的限制,但优选在将探针与其他的介质混合后,最后与水溶性高分子一起混合。
由此得到的探针介质适合作为检测靶向物质的探针介质。
通过将得到的探针介质点样于基材上,可以制造探针固定基材。虽然作为用于固定探针的基材没有特别的限制,但是如果考虑到靶向物质的检测和材料的常用性,优选玻璃或石英基板材料。具体的材料优选1英寸×3英寸大小的载玻片,如果考虑到探针固定的固定特性等,优选玻璃材质中不含碱性成分的无碱材料载玻片基板或石英玻璃材料。另外,虽然检测靶向物质的方法不会限制基板形状等,但是基于检测方法及装置等的常用性,优选基板状态。进而,希望为表面平滑度高的基板材料。
另外,为了将探针均匀且可靠地固定在基材上,优选用来固定探针的基材具有清洁表面。希望在固定探针前,事先清洗基材表面,从而确保表面足够清洁。作为清洁基材表面的方法,已知有用水洗、用药液洗、用等离子体洗、用UV臭氧洗等多种方法,作为简易且均匀的清洗方法,优选用药液洗。例如,可列举出使用规定浓度的氢氧化钠水溶液充分清洗基材表面,以除去附着在基材上的污渍。具体地说,准备好加温至50℃左右的1mol/l的氢氧化钠水溶液,在水溶液中擦洗基材表面或边淋洗水溶液边刷洗,以确实地除去污渍。除去污渍后,用水充分冲洗残余的氢氧化钠。最后,可用氮气吹拂等除去水分。由此,可得到可均匀且可靠地固定探针介质的基材。
另外,如果探针介质中不含有探针固定物质,优选在基材上进行了探针固定化处理的基材。具体地说,例如有如上述记载的在充分清洗了的基材表面使用硅烷偶联剂进行过处理的基材。例如,在水、乙醇的混合溶剂中充分搅拌硅烷偶联剂,在该溶液中浸渍清洗过的基材,之后用水洗去残留的硅烷偶联剂,干燥后得到的基材。另外,通过充分搅拌在乙醇中添加了硅烷偶联剂的溶液,来调制硅烷偶联剂溶液,利用旋涂法(spin-coating)在清洗过的基材上涂布该溶液。
作为将探针介质点样在基材上的方法,已知的有几种。具体的方法有针(pin)法、喷墨(inkjet)法、针和环(pin&ring)法。其中喷墨法可高密度且正确地点样,为优选的点样方法。
对于利用喷墨法进行的点样方法,作为上述探针介质,从喷墨头喷出探针介质中含有的成分时,只要对将探针及将探针固定在基材上的物质不会有实质性的影响,且是利用喷墨头就能正常喷在基材上,就没有特别的限制。例如,喷墨头可给与介质热能且具有喷出结构时,作为探针介质中含有的成分,优选甘油、硫二甘醇、异丙醇的液体。更具体地说,作为探针介质,优选含有甘油5~10wt%、硫二甘醇5~10wt%的液体。另外,喷墨头为利用压电器件喷出介质的喷墨头时,作为探针介质中含有的成分,优选含有乙二醇、异丙醇的液体。更具体地说,作为探针介质,优选含有乙二醇5~10wt%、异丙醇0.5~2wt%的液体。
由喷墨头喷出如此得到的探针介质,并使之附着在基材上时,斑点的形状为圆形,且喷出的范围不会扩大.高密度点样探针介质时,也可有效地抑制与相邻斑点的连接.另外,添加了水溶性高分子与高沸点溶剂的探针介质即使在点样后进行干燥,且斑点处于干燥状态,探针也可没有问题地进行保存,可检测靶向物质.进而,在干燥后也可容易地观察斑点状态,且可确认在点样中是否没有问题地形成了斑点.需要注意的是,本发明的探针介质的特性并不限于上述例子.
对于探针与基材,优选通过在探针与基材间发生反应而结合。通过反应,探针被牢固地固定在基材上。结果,探针被固定在基材上,且可在预定的位置上形成探针的斑点。水溶性高分子材料不会影响探针在基材上的固定,通过将水溶性高分子材料添加在探针介质中,可以延迟点样后斑点的干燥,因此具有使探针与基材间的反应充分进行的效果。
为了将赋予在基材上的探针介质中所含有的探针固定在一定的位置上,并更确实地防止污染相邻斑点中所含有的探针,以及将探针牢固地固定在基材上,其有效的手段是利用基材上可结合部位与基材上双方互相通过化学作用进行结合的方法。作为通过化学作用进行的结合可列举出各种例子,例如,共价键、离子键等。为了将探针牢固地固定在基材上,优选共价键。
作为优选的官能团,可列举出,物质侧具有硅醇基(SiOH)、基材上具有羟基(OH)的组合。该组合可使通过点样赋予在基材上的探针介质中所含物质的硅醇基与基材上的硅醇基反应,并将物质固定在基材上。具体的基材优选基材上具有羟基的上述玻璃材料、石英基板材料。
进而,优选探针与探针可结合部位间也通过化学作用进行结合。通过化学作用进行的结合可列举出共价键、离子键。为了将探针牢固地固定在基材上,优选共价键。结果,探针被固定在基材上,且可在一定的位置上形成探针的斑点。特别是调制了一种探针介质,其中包含具有官能团为氨基的探针、及具有探针可结合部位的官能团为环氧基、基材上可结合部位的官能团为硅醇基的物质,并调制了按规定比例含有甘油、硫二甘醇、异丙醇等的探针溶液。用喷墨头将该探针溶液点样在含有官能团为羟基的基材上时,探针溶液在基材上形成稳定大小的斑点。这样就可以将探针固定在基材上一定的位置。另外,调制了另一种探针介质,其中包含具有官能团为氨基的探针、及具有探针可反应官能团为异氰酸酯基、可与基材上官能团反应的官能团为硅醇基的物质,并调制了含有规定比例的甘油、硫二甘醇、异丙醇等的探针溶液。用喷墨头将该探针溶液点样在具有官能因为羟基的基材上时,探针溶液在基材上形成稳定大小的斑点。这样就可以将探针固定在基材上一定的位置。
另外,优选事先在探针介质中混合水溶性高分子材料聚乙烯醇(PVA)。更优选事先完全使之溶解。将水溶性高分子材料混合在探针介质中,使基材上的斑点状态更容易观察,使点样后的斑点中的探针介质更难于干燥,从而可更确实地使探针介质与基材表面反应,并进行固定。进而,考虑到通过点样制造的探针固定基材的保存状态,即使当通过点样形成的探针介质斑点干燥时,也可高效、且稳定地检测靶向物质。
例如,调制含有探针的探针介质,使探针浓度达到8μmol/l,其中探针的碱基长为20mer。探针介质使用的是气泡喷墨打印机(BubbleJet Printer,商品名:BJF850;Canon(株)会社制造,但将其改造为可在平板上打印),将固相与气泡喷墨头的喷嘴的间隔设为1.2~1.5mm左右,由该喷嘴喷出时(喷出量约为4微微升(picoliter),在固相上可形成直径约50~80μm左右的斑点,而且用放大镜进行肉眼观察完全没有发现液体着弹在固相表面时飞沫产生的斑点(下面称为随体斑点(satellite spot))。
另外,用显微测定用傅立叶变换红外分光光度计(显微FT-IR)对上述探针固定基材(固定了不含水溶性高分子材料的探针介质的基材)进行了分析.在斑点以外的部位,可检测基材中的Si-O键峰,但几乎没有发现其他的键峰.与此相对,在斑点形成部位,不仅可检测基材的宽峰,而且可检测极少量的、将探针介质中含有的探针固定在基材上的物质的-CH2-键峰。
另外,用热脱附谱(TDS:Thermal Desoption Spectrometry)对上述探针固定基材进行了分析。分析时,切断、提取含有形成了斑点的部位的7mm见方的基板片与未形成斑点的斑点外周部位的7mm见方的基板片,并进行了比较。温度为25~500℃,升温速度为每分钟5℃。比较两基板片的脱离成分质量的结果为,在斑点形成部位,在150℃以上检测出大量的CH4、CH3OH等探针及将探针固定在基材上物质的质量。由此,确认了探针介质仅被点样在斑点部位,而在斑点部位之外没有赋予探针介质及介质中含有的物质。
另外,用飞行时间二次离子质谱(TOF-SIMS:Time ofFlight-Secondary Ion Mass Spectrometer)分析了上述探针固定基材。分析时,对斑点形成部位的附近进行了面扫描、比较。结果,在斑点形成部位检测出源于DNA的PO2-、PO3-离子。与此相对,在未形成斑点的部分、斑点间隙部,不仅没有检测出PO2-、PO3-离子,连源于探针结合部位的官能团的二次离子也没有检测到。
这里,利用该探针固定基材,例如以提高检测靶向物质时的检测精度(S/N之比)为目的,也可在将该探针固定在固相表面后进行封闭(blocking),以使该基材上的探针非结合部分不与样品中含有的靶向物质结合。例如,在2%牛血清白蛋白水溶液中,通过例如2小时左右的浸泡,进行封闭。但是,为了防止标识物质吸附在基材上的探针固定部位之外,考虑到这种防止效果,优选牛血清白蛋白水溶液。需要注意的是,可根据需要实施该封闭步骤,例如,相对于各斑点限定性地将样品供给于该探针固定基材,且实质上样品没有附着在斑点以外的部位时,可不实施该步骤。作为基材的材料不同,斑点以外的部位上样品的附着也不同。特别是当基材为玻璃、石英时,可不进行封闭处理。但是,当探针介质中不含探针固定物质、在基材上进行了探针固定化处理时,优选进行封闭处理。
这样制造的探针固定基材,根据其用途,例如可构成为具有含相同探针的多个斑点的形式,也可构成为具有含不同种探针的多个斑点的形式。根据需要,探针的种类、数量、配置可进行适当的变更。然后,可将用这种方法高密度配置了探针的探针固定基材用于之后的靶向物质的检测、靶向物质碱基序列的推定。例如,用于检测样品中可能含有的、碱基序列为已知的靶向物质的单链核酸时,以单链核酸为探针,其中,该单链核酸具有与该靶向物质的单链核酸的碱基序列互补的碱基序列。准备好在固相上配置了含有该探针的多个斑点的探针固定基材,在能够向该探针固定基材的各斑点供给样品、并使该靶向物质的单链核酸与探针杂交的条件下放置后,利用荧光检测等已知的方法检测各斑点中有无杂交物。这样,就可以检测样品中有无靶向物质。
另外,用于推定样品中含有的靶向物质的单链核酸中碱基序列时,设定该靶向物质的单链核酸中碱基序列的多个候补,以具有该碱基序列组各互补碱基序列的单链核酸作为探针,在该基材上点样。接下来,在能够向各斑点供给样品、并使该靶向物质的单链核酸与探针杂交的条件下放置后,利用荧光检测等已知的方法检测各斑点中有无杂交物。这样,就可以确定靶向物质的单链核酸的碱基序列。另外,作为本发明涉及的探针固定基材的其他用途,例如有适用于筛选识别DNA结合蛋白质的特异性碱基序列和筛选具有可与DNA结合性质的化学物质。
探针介质不仅仅包含上述探针及将探针固定于基材上的物质,也可以在各容器中收纳探针及将探针固定于基材上的物质、并在将它们固定于基材上时进行混合。
探针包括单链核酸探针、单链DNA探针、单链RNA探针、单链PNA探针等。考虑到作为探针介质的核酸探针的稳定性,作为介质中含有探针的量,在介质中例如,优选将2mer~500mer的核酸探针浓度调整至0.05~500μmol/l,特别优选将2mer~80mer的核酸探针浓度调整至0.5~50μmol/l。这些探针可以具有官能团,例如,可列举出氨基(NH2)、异氰酸酯基(NCO)、巯基(SH)、羟(OH)基等官能团。特别是作为官能团,考虑到探针官能团的合成难易程度,优选氨基,考虑到探针官能团的反应性,优选巯基。
将探针收纳在容器中时,优选不会混入其他杂质的可密闭的容器,而且,为了在固定时容易混合,有必要是可以开封的容器。对于容器的开封没有特别的限制。作为容器中收纳的探针的状态,没有特别的限制,既可以是溶液状,也可以是粉末状。当官能团为巯基等时,考虑到探针的稳定性,优选保存通过冷冻干燥法进行了粉末化的探针。作为保存状态,为了确保探针的稳定性,优选冷冻保存,根据保存期间、探针种类、探针官能团等可变更保存状态。由此,在将探针收纳在容器中、并进行保存的状态下,可在固定在基材上时进行混合。
具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质包括,底涂剂、偶联剂、密封剂、表面处理剂、表面改性剂等。这些探针可结合部位的官能团包括,环氧基(CHOCH2)、氨基(NH2)、巯基(SH)、顺丁烯二酰亚胺基、异氰酸酯基(NCO)、氯丙基(C3H6Cl)等。特别是作为探针可结合部位的官能团,考虑到与探针官能团的结合,优选环氧基、顺丁烯二酰亚胺基、异氰酸酯基、氯丙基。另外,这些基材上可结合部位的官能团包括,烷氧基甲硅烷基(SiOR)、硅醇基(SiOH)、烷氧基(OR)等。特别是考虑到固定在基材上的难易程度、反应性,优选烷氧基甲硅烷基、硅醇基。硅醇基也可以是通过烷氧基甲硅烷基水解而形成的硅醇基。探针及探针可结合部位的官能团也可以在介质中通过反应进行结合,但优选在官能团间发生化学反应形成共价键。
将具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质收纳在容器中时,优选不会混入其他杂质、进而不会由于物质挥发而减量的可密闭或密闭容器,而且,为了在固定时容易混合,优选可容易开封的容器。但是,容器的开封没有特别的限制。不同的物质具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团时,是将各种物质收纳在同一容器中,还是收纳在不同容器中,对此没有特别的限制,但在形成探针介质时优选适当地收纳。对容器中收纳物质的状态没有特别的限制,既可以是溶液状,也可以是粉末状。进而,硅醇基为用来固定在基材上的官能团的例子之一,为了形成硅醇基也可以是水解溶液。作为保存状态,为了确保物质的稳定性,优选室温保存,根据保存期间等可变更保存状态。特别地,当为水解溶液时,优选保存中的温度不上升。另外,根据将探针固定在基材上的物质的官能团,水解时,优选通过调整水解后的pH值来获得稳定性。
将探针固定在基材上时,混合这些容器中收纳的具有探针及探针可结合部位的官能团、基材上可结合部位的官能团的物质时,根据需要也可以添加水等溶液。另外,为了制成探针介质,事先将用来充分混合的物质,例如水等溶剂收纳在不同容器中,在调制探针介质时进行混合。
水溶性高分子材料有聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Paogen(パオゲン)、羧甲基纤维素(CMC)、羟乙基纤维素(HEC)、右旋糖苷、支链淀粉等.其中,聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为常用材料,且对探针稳定,为优选.作为常用材料的聚乙烯醇(PVA)的情况下,根据需要,优选调整聚合度、皂化度.通过调整聚合度、皂化度,使调整聚乙烯醇在探针介质中的溶解性、探针介质的粘度成为可能.具体地说,如果在基材上赋予探针介质没有问题,则优选调整聚合度、皂化度以使探针介质具有适当的稳定性.但是,在聚乙烯醇的聚合度及皂化度高的情况下,不仅探针介质的粘度会上升,而且由于聚乙烯醇在探针介质中的溶解性下降,调整探针介质时溶解也将变得困难.作为避免该问题的方法,可列举出降低聚乙烯醇浓度的方法,但由于浓度下降会引起探针稳定性、斑点形状特性、吸湿性等下降,有必要选定适当的聚乙烯醇、并调整其浓度.优选将探针介质中聚乙烯醇的浓度调整至0.001~1wt%并收纳在容器中.
当这种溶解有困难时,也可将水溶性高分子材料事先溶解,混合于探针介质中。溶解的溶剂可以为乙醇、二甲基亚砜(DMSO)等有机溶剂,如果考虑到溶解性,优选水、乙醇。溶解方法为将聚乙烯醇混合于水中之后,可通过加温使不溶物快速溶解。优选在过滤后与探针介质混合,过滤是为了消除溶解的聚乙烯醇中的不溶物。对于溶解了聚乙烯醇的溶液,如果考虑到与探针混合时的探针稳定性,优选调整pH值至6.0~9.0,特别优选调整pH值至7.0~8.0。
将水溶性高分子材料收纳在容器中时,优选不会混入其他杂质、进而不会由于物质挥发而减量的可密闭或密闭容器,而且,为了在固定时容易混合,优选可容易开封的容器。作为保存状态,为了确保物质的稳定性,优选室温保存,根据保存期间等可变更保存状态。特别是,当是溶液化的水溶性高分子材料时,优选保存中的温度不上升。另外,根据将探针固定在基材上的物质的官能团,水解时优选通过调整水解后的pH值来获得探针稳定性。
作为高沸点溶剂,有乙二醇、丙二醇、三甘醇、二甘醇、双丙甘醇、硫二甘醇等。其中,硫二甘醇、双丙甘醇为常用的材料,也适用于用作点样用介质,为优选。添加高沸点溶剂时,优选进行适当调整以使探针介质赋予在基材上时斑点形状特性、吸湿性、干燥状态等为合适的状态。
将高沸点溶剂收纳在容器中时,优选不会混入其他杂质、进而不会由于物质挥发而减量的可密闭或密闭容器,而且,为了在固定时容易混合,优选可容易开封的容器。作为保存状态,为了确保物质的稳定性,优选室温保存,根据保存期间等可变更保存状态。特别是,当是高沸点溶剂时,优选保存中的温度不上升。
将探针固定在基材上时,混合容器中收纳的探针及固定探针物质时,根据需要也可以添加水等溶液。另外,为了制成探针介质,事先将用来充分混合的物质例如水等溶剂收纳在其他容器中,在调制探针介质时进行混合。
下面,通过实施例对本发明进行更详细的说明。
实施例1
(1)探针的合成
作为可特异性结合靶向物质的探针,使用了单链DNA探针。利用DNA自动合成器合成了序列号为1的单链DNA,在其5’末端的羟基上通过磷酸基与六亚甲基结合了氨基,准备式(1)的18倍体的低聚物,用于下面的实验。
5’H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3’(1)
(2)具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
为了调制具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质,使用了含有具有环氧基的硅烷化合物(γ-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBM-403;信越化学工业(株)会社制),将其500μmol/l水溶液在室温下搅拌30分钟,调制成探针结合物质溶液。将调制的探针结合物质溶液用于下面的实验。
(3)探针介质的调制
将上述式(1)的单链DNA探针溶解于TE溶液(10mM Tris-HCl(pH 8)/1mM乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液中,使其最终浓度达到约40μmol/l,调制成单链DNA探针溶液(由吸收强度计算出正确的浓度)。
然后,在纯水中溶解水溶性高分子材料聚乙烯醇(PVA),使其浓度达到0.5wt%。为了使其完全溶解,在热水浴中边加温至80℃边搅拌60分钟。确认没有不溶物后,过滤,以使点样时喷嘴不会发生堵塞,调制成PVA水溶液。
准备好按照上述方法调制的探针溶液100μl,在其中滴加按照上述方法调制的探针结合物质溶液100μl后,混合5分钟。将混合溶液放置10分钟后,滴加纯水700μl、按照上述方法调制的PVA水溶液100μl,混合5分钟。混合后,放置30分钟,调制成探针介质。
(4)清洗基板
将1英寸×3英寸的玻璃基板(厚度:1.1mm)放入盒中,在事先加温至60℃的1mol/l氢氧化钠水溶液中浸泡玻璃基板10分钟。接着用流动的纯水充分涮洗,水洗除去附着在玻璃基板及盒上的氢氧化钠。充分涮洗后,在纯水中连盒一起浸泡玻璃基板,超声清洗10分钟。超声清洗后,用流动的纯水充分涮洗,水洗除去附着在玻璃基板及盒上的颗粒。将水洗后的玻璃基板一张一张的用氮气吹干。为了确认基板是否洗净,测定了基板上纯水的接触角。结果,在基板的所有部位都约为5°。
(5)探针介质的点样
将上述(3)中调制的探针介质填充至气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)的墨盒中,装在气泡喷头上。需要注意的是,这里使用的气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)已经被改造为能够在平板上打印。然后,在该打印机上装上上述(4)中准备的玻璃基板,将探针介质点样在玻璃基板上。这里,气泡喷头的液体喷出面与玻璃基板的液体附着面间的距离为1.2~1.5mm。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。另外,测定了斑点形成部位外周的纯水接触角。结果,在基板的所有部位都约为5°。由该结果确认了在斑点部位之外,没有发生探针介质等引起的污染。将点样结束后的玻璃基板静置在干燥器中。由此制成探针固定基材。
(6)封闭处理
用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)充分清洗上述(5)中制造的探针固定基材,润湿探针固定基材,使其可进行均匀的封闭处理。然后,在2%牛血清白蛋白水溶液中浸泡玻璃基板,放置2小时,进行封闭处理。
(7)杂交处理
用DNA自动合成器合成了单链DNA,它具有与上述(1)中记载的式(1)的单链DNA探针互补的碱基序列,在5’末端结合了若丹明(rhodamine),得到了标记的单链DNA探针。将该标记过的单链DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0),使其最终浓度达到1μM,在该溶液中浸渍上述(6)中得到的、经封闭处理的探针固定基材,室温(25℃)下进行杂交处理3小时。之后,用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(8)结果
解析上述(7)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(1)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为14830。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为614。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
实施例2
(1)探针的合成
完全按照上述实施例1的方法准备单链DNA探针,之后用于下面的实验。
(2)具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
为了调制具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质,准备含有具有环氧基的硅烷化合物(γ-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBM-403;信越化学工业(株)会社制)。将该硅烷偶联剂用于下面的实验。
(3)探针介质的调制
完全按照上述实施例1的方法,调制成单链DNA探针溶液,及PVA溶液。
准备好按照上述方法调制的探针溶液10ml,在其中滴加上述硅烷偶联剂11μl后,混合20分钟。将混合溶液放置30分钟后,每次滴加纯水5ml,边反复混合边滴加总计80ml的纯水。接着,滴加按照上述方法调制的PVA水溶液10ml,混合10分钟。混合后,放置30分钟,调制成探针介质(由吸收强度计算出正确的浓度)。
(4)清洗基板
完全按照上述实施例1的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(5)探针介质的点样
完全按照上述实施例1的方法,点样了上述(3)中调制的探针介质,制成探针固定基材。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。将点样结束后的玻璃基板静置在干燥器中。由此制成了探针固定基材。
(6)封闭处理
完全按照上述实施例1的方法,进行了封闭处理。
(7)杂交处理
完全按照上述实施例1的方法,进行了杂交处理。之后,用1MNaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针.然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材.接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(8)结果
解析上述(7)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(1)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为23400。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为672。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
实施例3
(1)探针的合成
作为可特异性结合靶向物质的探针,使用了单链DNA探针。利用DNA自动合成器合成了序列号为1、2、3及4的单链核酸。序列号2~4的单链DNA以实施例1中使用的序列号1为基础,将1个碱基变化的作为序列号2,3个碱基变化的作为序列号3,6个碱基变化的作为序列号4。在序列号1~4的单链DNA的5’末端羟基上通过磷酸基与六亚甲基结合了氨基,得到式(1)、(2)、(3)及(4)的18倍体的低聚物,用于下面的实验。
5’H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTTGTTTTACA3’(2)
5’H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGCTTTTTTACA3’(3)
5’H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCATCTTGTTTACA3’(4)
(2)具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
为了调制具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质,准备含有具有环氧基的硅烷化合物(γ-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBM-403;信越化学工业(株)会社制)。将该硅烷偶联剂用于下面的实验。
(3)探针介质的调制
利用与上述实施例2的(3)中记载的方法相同的方法,用上述序列号1~4的单链DNA调制成4种探针介质(由吸收强度计算出正确的浓度)。
(4)清洗基板
完全按照上述实施例1的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(5)探针介质的点样
将上述(3)中调制的4种探针介质分别填充至气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)的4个墨盒中,将各墨盒装在气泡喷头上。需要注意的是,这里使用的气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)已经被改造为能够在平板上打印。然后,在该打印机上装上上述(4)中准备的玻璃基板,将4种探针介质分别点样在玻璃基板上4个3×3mm的区域内。需要注意的是,各区域内的点样图案与实施例1相同。这里,气泡喷头的液体喷出面与玻璃基板的液体附着面间的距离为1.2~1.5mm。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。将点样结束后的玻璃基板静置在干燥器中。由此制成探针固定基材。
(6)封闭处理
完全按照上述实施例1的方法,进行了封闭处理。
(7)杂交处理
完全按照上述实施例1的方法,进行了杂交处理。之后,用1MNaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(8)结果
解析上述(7)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(1)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为14380。与此相对,对于具有1个碱基错配序列的式(2)的DNA探针的斑点,其荧光量为8960。而对于具有3个碱基错配序列的式(3)的DNA探针的斑点,其荧光量仅为完全配对时的一半以下,为2032;对于具有6个碱基错配序列的式(4)的DNA探针,几乎观察不到荧光斑点,斑点相应部分的荧光强度为876。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为637。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。由此可见,可以在DNA阵列基板上特异性检测出完全互补的单链DNA。
实施例4
(1)探针的合成
完全按照上述实施例1的方法准备单链DNA探针,之后用于下面的实验。
(2)具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
为了调制具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质,准备含有具有环氧基的硅烷化合物(γ-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBM-403;信越化学工业(株)会社制)。将该硅烷偶联剂用于下面的实验。
(3)探针介质的调制
完全按照上述实施例1的方法,调制成单链DNA探针溶液。
准备好按照上述方法调制的探针溶液10ml,在其中滴加上述硅烷偶联剂11μl后,混合20分钟。将混合溶液放置30分钟后,每次滴加含有甘油7.5wt%、尿素7.5wt%及硫二甘醇7.5wt%的水溶液5ml,边反复混合边滴加总计90ml的纯水。接着,混合10分钟。混合后,放置30分钟,调制成探针介质。
(4)清洗基板
完全按照上述实施例1的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(5)探针介质的点样
完全按照上述实施例1的方法,点样上述(3)中调制的探针介质,制成探针固定基材。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。将点样结束后的玻璃基板浸渍在盛满1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)的容器中,连容器一起放入冰箱,冷藏保存(4℃)。由此制成探针固定基材。
(6)封闭处理
从1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中,取出上述(5)中制造的探针固定基材。接着,将玻璃基板浸渍在盛满了2%牛血清白蛋白水溶液的容器中,放置2小时,进行了封闭处理。
(7)杂交处理
完全按照上述实施例1的方法,进行了杂交处理。之后,用1MNaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(8)结果
解析上述(7)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(1)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为23400。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为628。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
实施例5
(1)探针的合成
完全按照上述实施例1的方法准备单链DNA探针,之后用于下面的实验。
(2)具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
为了调制具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质,将含有具有氯丙基的硅烷化合物(γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBM-703;信越化学工业(株)会社制)的500μmol/l水溶液的pH值调整至4.0,之后室温下混合30分钟,调制成探针固定物质溶液。将调制成的探针固定物质溶液用于下面的实验。
(3)探针介质的调制
完全按照上述实施例1的方法,调制成单链DNA探针溶液。
准备好按照上述方法调制的探针溶液100μl,在其中滴加上述调制的探针固定物质溶液100μl后,混合5分钟。将混合溶液放置10分钟后,滴加纯水800μl,混合5分钟。混合后,放置30分钟,调制成探针介质。
(4)清洗基板
完全按照上述实施例1的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(5)探针介质的点样
完全按照上述实施例1的方法,点样了上述(3)中调制的探针介质,制成探针固定基材。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。将点样结束后的玻璃基板浸渍在盛满了1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)的容器中,连容器一起放入冰箱,冷藏保存(4℃)。由此制成探针固定基材。
(6)封闭处理
与上述实施例4完全相同,进行了封闭处理。
(7)杂交处理
完全按照上述实施例1的方法,进行了杂交处理。之后,用1MNaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(8)结果
解析上述(7)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(1)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为11320。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为641。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
实施例6
(1)探针的合成
完全按照上述实施例1的方法准备单链DNA探针,之后用于下面的实验。
(2)具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
为了调制具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质,准备含有具有氯丙基的硅烷化合物(γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBM-703;信越化学工业(株)会社制)。将该硅烷偶联剂用于下面的实验。
(3)探针介质的调制
完全按照上述实施例1的方法,调制成单链DNA探针溶液,及PVA溶液。
准备好按照上述方法调制的探针溶液10ml,在其中滴加上述硅烷偶联剂10μl后,混合20分钟。将混合溶液放置30分钟后,每次滴加纯水5ml,边反复混合边滴加总计80ml的纯水。接着,滴加按照上述方法配制的PVA水溶液10ml,混合10分钟。混合后,放置30分钟,调制成探针介质。
(4)清洗基板
完全按照上述实施例1的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(5)探针介质的点样
完全按照上述实施例1的方法,点样了上述(3)中调制的探针介质,制成探针固定基材。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。将点样结束后的玻璃基板静置在干燥器内。由此制成探针固定基材。
(6)封闭处理
完全按照上述实施例1的方法,进行了封闭处理。
(7)杂交处理
完全按照上述实施例1的方法,进行了杂交处理。之后,用1MNaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度.评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V.
(8)结果
解析上述(7)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(1)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为15790。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为608。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
实施例7
(1)探针的合成
完全按照上述实施例1的方法准备单链DNA探针,之后用于下面的实验。
(2)具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
完全按照上述实施例1的方法准备具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质,之后用于下面的实验。
(3)探针介质的调制
完全按照上述实施例1的方法,调制成探针介质。
(4)清洗基板
完全按照上述实施例1的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(5)探针介质的点样
完全按照上述实施例1的方法,制成探针固定基材。
(6)封闭处理
完全不需进行上述实施例1中的封闭处理,用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液清洗,润湿探针固定基材表面,使其可进行均匀的杂交处理。
(7)杂交处理
完全按照上述实施例1的方法,进行了杂交处理。之后,用1MNaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(8)结果
解析上述(7)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(1)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为23400。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为658。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。也没有发现由于未进行封闭处理而引起的斑点部位以外的荧光强度的增加。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
实施例8
(1)探针的合成
作为可特异性结合靶向物质的探针,使用了单链DNA探针.利用DNA自动合成器合成了序列号为5的单链核酸,在用DNA自动合成器合成时,通过使用巯基修饰剂(Thiol-Modifier)(Glen Reaearch公司制造)在其末端引入了巯基(SH)。然后进行了通常的脱保护,回收DNA,在高效液相色谱中纯化,得到了式(5)的低聚物,用于下面的实验。
5’HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3’(5)
(2)具有探针可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
为了调制具有探针可结合部位的官能团的物质,将具有顺丁烯二酰亚胺基、羟基琥珀酰亚胺酯基(hydroxy-succinimide ester)的二元性试剂N-(6-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺钠盐(商品名:sulfo-EMCS;(株)同仁化学研究所制)的500μmol/l水溶液在室温下搅拌5分钟,调制成探针结合物质溶液。将调制的探针结合物质溶液用于下面的实验。
(3)具有基材上可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
为了调制具有基材上可结合部位的官能团的物质,将含有具有氨基的硅烷化合物(N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBM-603;信越化学工业(株)会社制)的20mmo l/l水溶液在室温下搅拌30分钟,调制成基材结合物质溶液。将调制的探针结合物质溶液用于下面的实验。
(4)探针介质的调制
将上述式(5)的单链DNA探针溶解于TE溶液(10mM Tris-HCl(pH 8)/1mM乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液)中,使其最终浓度达到约40μmol/l,调制成单链DNA探针溶液(由吸收强度计算出正确的浓度)。
准备好按照上述方法调制的探针溶液100μl,在其中滴加上述(2)中调制的探针结合物质溶液100μl后,混合5分钟。将混合溶液放置10分钟后,滴加含有甘油7.5wt%、尿素7.5wt%及硫二甘醇7.5wt%的水溶液700μl,混合5分钟。混合后,放置30分钟,调制成探针介质。
(5)清洗基板
将1英寸×3英寸的玻璃基板(厚度:1.1mm)放入盒中,在事先加温至60℃的1mol/l氢氧化钠水溶液中浸泡玻璃基板10分钟。接着用流动的纯水充分涮洗,水洗除去附着在玻璃基板及盒上的氢氧化钠。充分涮洗后,在纯水中连盒一起浸泡玻璃基板,超声清洗10分钟。超声清洗后,用流动的纯水充分涮洗,水洗除去附着在玻璃基板及盒上的颗粒。将水洗后的玻璃基板一张一张的用氮气吹干。为了确认基板是否洗净,测定了基板上纯水的接触角。结果,在基板的所有部位都约为5°。
(6)探针介质的点样
将上述(4)中调制的探针介质填充至气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)的墨盒中,装在气泡喷头上。需要注意的是,这里使用的气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)已经被改造为能够在平板上打印。然后,在该打印机上装上上述(5)中准备的玻璃基板,将探针介质点样在玻璃基板上。这里,气泡喷头的液体喷出面与玻璃基板的液体附着面间的距离为1.2~1.5mm。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。另外,测定了斑点形成部位外周的纯水接触角。结果,在基板的所有部位都约为5°。由该结果确认了在斑点部位之外,没有发生探针介质等引起的污染。将点样结束后的玻璃基板浸渍在盛满了1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)的容器中,连容器一起放入冰箱,冷藏保存(4℃)。由此制成探针固定基材。
(7)封闭处理
从1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中取出上述(6)中制造的探针固定基材。然后,在盛满2%牛血清白蛋白水溶液中的容器中浸泡玻璃基板,放置2小时,进行了封闭处理。
(8)杂交处理
用DNA自动合成器合成了单链DNA,它具有与上述(1)中记载的式(5)的单链DNA探针互补的碱基序列,在5’末端结合了若丹明(rhodamine),得到了标记的单链DNA探针。将该标记过的单链DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0),使其最终浓度达到1μM,在该溶液中浸渍上述(7)中得到的、经封闭处理的探针固定基材,室温(25℃)下进行杂交处理2小时。之后,用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(5)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为25730。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为639。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
实施例9
(1)探针的合成
完全按照上述实施例8的方法准备式(5)的单链DNA探针,之后用于下面的实验。
(2)具有探针可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
为了调制具有探针可结合部位的官能团的物质,准备具有顺丁烯二酰亚胺基的二元性试剂N-(6-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺钠盐(商品名:sulfo-EMCS;(株)同仁化学研究所制)。将该探针结合物质用于下面的实验。
(3)具有基材上可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
完全按照上述实施例8的方法,调制成基材结合物质溶液。将调制的基材结合物质溶液用于下面的实验。
(4)探针介质的调制
完全按照上述实施例8的方法,调制成单链DNA探针溶液。
准备好按照上述方法调制的探针溶液10ml,称量上述探针结合物质约2.1mg并添加在其中后,混合5分钟。将混合溶液放置30分钟后,在探针、探针结合物质的混合溶剂中,每次滴加纯水10ml,边反复混合边滴加总计80ml的纯水。然后,滴加上述(3)中调制的基材结合物质溶液10ml,混合5分钟。混合后,放置30分钟,调制成探针介质。
(5)清洗基板
完全按照上述实施例8的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(6)探针介质的点样
完全按照上述实施例8的方法,点样了上述(4)中调制的探针介质,制成探针固定基材。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。将点样结束后的玻璃基板浸渍在盛满了1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)的容器中,连容器一起放入冰箱,冷藏保存(4℃)。由此制成探针固定基材。
(7)封闭处理
完全按照上述实施例8的方法,进行了封闭处理。
(8)杂交处理
完全按照上述实施例8的方法,进行了杂交处理。之后,用1MNaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(5)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为25100。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为769。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
实施例10
(1)探针的合成
作为可特异性结合靶向物质的探针,使用了单链DNA探针。利用DNA自动合成器合成了序列号为5、6、7及8的单链核酸。需要注意的是,序列号6~8的单链DNA以实施例8中使用的序列号5为基础,将1个碱基变化的作为序列号6,3个碱基变化的作为序列号7,6个碱基变化的作为序列号8。在用DNA自动合成器合成时,通过巯基修饰剂(Thiol-Modifier)(Glen Reaearch公司制造)在序列号5~8的单链DNA末端引入了巯基(SH)。然后进行了通常的脱保护,回收DNA,在高效液相色谱中纯化,得到了式(6)、(7)及(8)的低聚物,用于下面的实验。
5’HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTTGTTTTACA3’(6)
5’HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGCTTTTTTACA3’(7)
5’HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCATCTTGTTTACA3’(8)
(2)具有探针可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
完全按照上述实施例8的方法,调制成探针结合物质溶液。将调制的探针结合物质溶液用于下面的实验。
(3)具有基材上可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
完全按照上述实施例8的方法,调制成基材结合物质溶液。将调制的基材结合物质溶液用于下面的实验。
(4)探针介质的调制
完全按照上述实施例8的方法,调制成单链DNA探针溶液。
按照上述实施例8中(4)记载的方法,使用上述序列号5~8的单链DNA,调制成4种探针介质(由吸收强度计算出正确的浓度)。
(5)清洗基板
完全按照上述实施例8的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(6)探针介质的点样
将上述(4)中调制的4种探针介质分别填充至气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)用的4个墨盒中,将各墨盒分别装在气泡喷头上。需要注意的是,这里使用的气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)已经被改造为能够在平板上打印。然后,在该打印机上装上上述(5)中准备的玻璃基板,将4种探针介质分别点样在玻璃基板上4个3×3mm的区域内。需要注意的是,各区域内点样图案与实施例8相同。这里,气泡喷头的液体喷出面与玻璃基板的液体附着面间的距离为1.2~1.5mm。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。将点样结束后的玻璃基板浸渍在盛满了1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)的容器中,连容器一起放入冰箱,冷藏保存(4℃)。由此制成固定了4种探针的探针固定基材。
(7)封闭处理
完全按照上述实施例8的方法,进行了封闭处理。
(8)杂交处理
用DNA自动合成器合成了单链DNA,它具有与上述实施例8中记载的式(5)的单链DNA探针互补的碱基序列,在5’末端结合了若丹明(rhodamine),得到了标记的单链DNA探针。将该标记过的单链DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0),使其最终浓度达到1μM,在该溶液中浸渍上述(7)中得到的、经封闭处理的探针固定基材,室温(25℃)下进行杂交处理2小时。之后,用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;AxonInstruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(5)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为26120。与此相对,对于具有1个碱基错配序列的式(6)的DNA探针的斑点,其荧光量为12870。而对于具有3个碱基错配序列的式(7)的DNA探针的斑点,其荧光量仅为完全配对时的一半以下,为4220;对于具有6个碱基错配序列的式(8)的DNA探针,几乎观察不到荧光斑点,斑点相应部分的荧光强度为791。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为675。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。由此可见,可以在DNA阵列基板上特异性检测完全互补的单链DNA。
实施例11
(1)探针的合成
完全按照上述实施例8的方法准备式(5)的单链DNA探针,之后用于下面的实验。
(2)具有探针可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
完全按照上述实施例8的方法,调制成探针结合物质溶液。将调制的探针结合物质溶液用于下面的实验。
(3)具有基材上可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
完全按照上述实施例8的方法,调制成基材结合物质溶液。将调制的基材结合物质溶液用于下面的实验。
(4)探针介质的调制
完全按照上述实施例8的方法,调制成探针介质。
(5)清洗基板
完全按照上述实施例8的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(6)探针介质的点样
完全按照上述实施例8的方法,制成探针固定基材。
(7)封闭处理
完全不需进行上述实施例8中的封闭处理,用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针固定基材表面,使其可进行均匀的杂交处理。
(8)杂交处理
完全按照上述实施例8的方法,进行了杂交处理。之后,用1MNaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(5)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为24380。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为783。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。也没有发现由于未进行封闭处理而引起的斑点部位以外的荧光强度的增加。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
实施例12
(1)探针的合成
作为可特异性结合靶向物质的探针,使用了单链DNA探针。利用DNA自动合成器合成了序列号为9的单链DNA探针,在其5’末端的羟基上通过磷酸基及六亚甲基结合了氨基,准备式(9)的18倍体的低聚物,用于下面的实验。
5’H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3’(9)
(2)具有探针可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
为了调制具有探针可结合部位的官能团的物质,将具有顺丁烯二酰亚胺的二元性试剂N-(8-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺钠盐(商品名:sulfo-HMCS;(株)同仁化学研究所制)的500μmol/l水溶液在室温下搅拌5分钟,调制成探针结合物质溶液。将调制的探针结合物质溶液用于下面的实验。
(3)具有基材上可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
为了调制具有基材上可结合部位的官能团的物质,将含有具有巯基的硅烷化合物(γ-巯丙基甲基二甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBM-802;信越化学工业(株)会社制)的20mmol/l水溶液在室温下搅拌30分钟,调制成基材结合物质溶液。将调制的探针结合物质溶液用于下面的实验。
(4)探针介质的调制
将上述式(9)的单链DNA探针溶解于TE溶液(10mM Tris-HCl(pH 8)/1mM乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液中,使其最终浓度达到约40μmol/l,调制成单链DNA探针溶液(由吸收强度计算出正确的浓度)。
然后,在纯水中溶解水溶性高分子材料聚乙烯醇(PVA),使其浓度达到0.5wt%。为了使其完全溶解,在热水浴中,边加温至80℃边搅拌60分钟。确认没有不溶物后,过滤,以使点样时喷嘴不会发生堵塞,调制成PVA水溶液。
准备好按照上述方法调制的探针溶液100μl,在其中滴加上述(2)中调制的探针结合物质溶液100μl后,混合5分钟。然后,滴加上述(3)中调制的探针溶液100μl,混合5分钟。将混合溶液放置10分钟后,滴加纯水600μl、按照上述方法调制的PVA水溶液100μl,混合5分钟。混合后,放置30分钟,调制成探针介质。
(5)清洗基板
完全按照上述实施例8的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(6)探针介质的点样
将上述(4)中调制的探针介质填充至气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)的墨盒中,装在气泡喷头上。需要注意的是,这里使用的气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)已经被改造为能够在平板上打印。然后,在该打印机上装上上述(5)中准备的玻璃基板,将探针介质点样在玻璃基板上。这里,气泡喷头的液体喷出面与玻璃基板的液体附着面间的距离为1.2~1.5mm。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。另外,测定了斑点形成部位外周的纯水接触角。结果,在基板的所有部位都约为5°。由该结果确认了在斑点部位之外,没有发生探针介质等引起的污染。将点样结束后的玻璃基板静置在干燥器中。由此制成探针固定基材。
(7)封闭处理
用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)充分清洗上述(5)中制造的探针固定基材,润湿探针固定基材,使其可进行均匀的封闭处理。然后,在2%牛血清白蛋白水溶液中浸泡玻璃基板,放置2小时,进行封闭处理。
(8)杂交处理
用DNA自动合成器合成了单链DNA,它具有与上述记载的式(9)的单链DNA探针互补的碱基序列,在5’末端结合了若丹明(rhodamine),得到了标记的单链DNA探针。将该标记过的单链DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0),使其最终浓度达到1μM,在该溶液中浸渍上述(7)中得到的、经封闭处理的探针固定基材,室温(25℃)下进行杂交处理2小时。之后,用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度.评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V.
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(5)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为18710。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为664。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
实施例13
(1)探针的合成
完全按照上述实施例12的方法准备式(5)的单链DNA探针,之后用于下面的实验。
(2)具有探针可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
完全按照上述实施例12的方法,调制成探针结合物质溶液。将调制的探针结合物质溶液用于下面的实验。
(3)具有基材上可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
完全按照上述实施例12的方法,调制成基材结合物质溶液。将调制的基材结合物质溶液用于下面的实验。
(4)探针介质的调制
完全按照上述实施例12的方法,调制成单链DNA探针溶液及PVA溶液。
准备好按照上述方法调制的探针溶液10ml,称量上述探针结合物质约2.1mg并添加在其中后,混合5分钟。将混合溶液放置30分钟后,在探针、探针结合物质的混合溶剂中,每次滴加纯水10ml,边反复混合边滴加总计70ml的纯水。然后,滴加上述(3)中调制的基材结合物质溶液10ml,混合5分钟。混合后,放置30分钟,之后滴加按照上述方法调制的PVA水溶液10ml,混合5分钟。混合结束后,放置30分钟,调制成探针介质。
(5)清洗基板
完全按照上述实施例8的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(6)探针介质的点样
完全按照上述实施例8的方法,点样上述(4)中调制的探针介质,制成探针固定基材。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。将点样结束后的玻璃基板静置在干燥器内。由此制成探针固定基材。
(7)封闭处理
完全按照上述实施例12的方法,进行了封闭处理。
(8)杂交处理
完全按照上述实施例12的方法,进行杂交处理。之后,用1MNaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(5)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为17970。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为723。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
实施例14
(1)探针的合成
完全按照上述实施例12的方法准备式(9)的单链DNA探针,之后用于下面的实验。
(2)具有探针可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
为了调制具有探针可结合部位的官能团的物质,将具有顺丁烯二酰亚胺基、羟基琥珀酰亚胺酯基的二元性试剂N-(6-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺钠盐(商品名:sulfo-EMCS;(株)同仁化学研究所制)的500μml/l水溶液在室温下搅拌5分钟,调制成探针结合物质溶液。将调制的探针结合物质溶液用于下面的实验。
(3)具有基材上可结合部位的官能团的物质(基材结合物质)
为了调制具有基材上可结合部位的官能团的物质,将含有具有氨基的硅烷化合物(N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBM-603;信越化学工业(株)会社制)的20mmol/l水溶液在室温下搅拌30分钟,调制成基材结合物质溶液。将调制的基材结合物质溶液用于下面的实验。
(4)探针介质的调制
将上述式(9)的单链DNA探针溶解于TE溶液(10mM Tris-HCl(pH 8)/1mM乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液)中,使其最终浓度达到约40μmol/l,调制成单链DNA探针溶液(由吸收强度计算出正确的浓度)。
准备好按照上述方法调制的探针溶液100μl,在其中滴加上述(2)中调制的探针结合物质溶液100μl后,混合5分钟。然后,滴加上述(3)中调制的基材结合物质溶液100μl后,混合5分钟。将混合溶液放置10分钟后,滴加含有甘油7.5wt%、尿素7.5wt%及硫二甘醇7.5wt%的水溶液700μl,混合5分钟。混合后,放置30分钟,调制成探针介质。
(5)清洗基板
将1英寸×3英寸的玻璃基板(厚度:1.1mm)放入盒中,在事先加温至60℃的1mol/l氢氧化钠水溶液中浸泡玻璃基板10分钟。接着用流动的纯水充分涮洗,水洗除去附着在玻璃基板及盒上的氢氧化钠。充分涮洗后,在纯水中连盒一起浸泡玻璃基板,超声清洗10分钟。超声清洗后,用流动的纯水充分涮洗,水洗除去附着在玻璃基板及盒上的颗粒。将水洗后的玻璃基板一张一张的用氮气吹干。为了确认基板是否洗净,测定了基板上纯水的接触角。结果,在基板的所有部位都约为5°。
(6)探针介质的点样
将上述(4)中调制的探针介质填充至气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)的墨盒中,装在气泡喷头上.需要注意的是,这里使用的气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)已经被改造为能够在平板上打印.然后,在该打印机上装上上述(5)中准备的玻璃基板,将探针介质点样在玻璃基板上.这里,气泡喷头的液体喷出面与玻璃基板的液体附着面间的距离为1.2~1.5mm.点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列.另外,测定了斑点形成部位外周的纯水接触角.结果,在基板的所有部位都约为5°.由该结果确认了在斑点部位之外,没有发生探针介质等引起的污染.将点样结束后的玻璃基板浸渍在盛满了1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)的容器中,连容器一起放入冰箱,冷藏保存(4℃)。由此制成探针固定基材。
(7)封闭处理
从1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中取出上述(6)中制造的探针固定基材。然后,在盛满2%牛血清白蛋白水溶液的容器中浸泡玻璃基板,放置2小时,进行了封闭处理。
(8)杂交处理
用DNA自动合成器合成了单链DNA,它具有与上述(1)中记载的式(9)的单链DNA探针互补的碱基序列,在5’末端结合了若丹明(rhodamine),得到了标记的单链DNA探针。将该标记过的单链DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0),使其最终浓度达到1μM,在该溶液中浸渍上述(7)中得到的、经封闭处理的探针固定基材,室温(25℃)下进行杂交处理2小时。之后,用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(9)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为25730。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为639。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
实施例15
(1)探针的合成
完全按照上述实施例1的方法准备单链DNA探针,之后用于下面的实验。使用单链DNA探针时,将其分注在微管中。分注使每根微管的单链DNA探针量达到17.53nmol后,使之干透,得到单链DNA探针。
(2)具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
为了调制具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质,准备含有具有环氧基的硅烷化合物(γ-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBM-403;信越化学工业(株)会社制)。将上述环氧硅烷偶联剂作为探针结合物质溶液用于下面的实验。
(3)探针介质的调制
在分注了上述式(1)的单链DNA探针的、完全干燥的微管中,滴加探针结合物质环氧硅烷偶联剂10μl,并混合.然后,滴加纯水50μl,并混合.充分混合5分钟后,静置30分钟.
然后,在上述微管中滴加高沸点溶剂乙二醇500μl、乙醇500μl,之后混合1分钟。
接下来,滴加浓度为0.5wt%的水溶性高分子溶液聚乙烯醇(PVA)水溶液100μl,之后,混合1分钟。最后,滴加纯水,使探针介质的总量达到2000μl,混合5分钟。混合后放置60分钟,调制成探针介质。
(4)清洗基板
将1英寸×3英寸的玻璃基板(厚度:1.1mm)放入盒中,在事先加温至60℃的1mol/l氢氧化钠水溶液中浸泡玻璃基板10分钟。接着用流动的纯水充分涮洗,水洗除去附着在玻璃基板及盒上的氢氧化钠。充分涮洗后,在纯水中连盒一起浸泡玻璃基板,超声清洗10分钟。超声清洗后,用流动的纯水充分涮洗,水洗除去附着在玻璃基板及盒上的颗粒。将水洗后的玻璃基板一张一张的用氮气吹干。为了确认基板是否洗净,测定了基板上纯水的接触角。结果,在基板的所有部位都约为5°。
(5)探针介质的点样
将上述(3)中调制的探针介质填充至气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)的墨盒中,装在气泡喷头上。需要注意的是,这里使用的气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)已经被改造为能够在平板上打印。然后,在该打印机上装上上述(5)中准备的玻璃基板,将探针介质点样在玻璃基板上。这里,气泡喷头的液体喷出面与玻璃基板的液体附着面间的距离为1.2~1.5mm。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。另外,测定了斑点形成部位外周的纯水接触角。结果,在基板的所有部位都约为5°。由该结果确认了在斑点部位之外,没有发生探针介质等引起的污染。由该结果确认了在斑点部位之外,没有发生探针介质等引起的污染。将点样结束后的玻璃基板静置在干燥器中。由此制成探针固定基材。
(6)封闭处理
用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)充分清洗上述(5)中制造的探针固定基材,润湿探针固定基材,使其可进行均匀的封闭处理。然后,在2%牛血清白蛋白水溶液中浸泡玻璃基板,放置2小时,进行封闭处理。
(7)杂交处理
用DNA自动合成器合成了单链DNA,它具有与上述(1)中记载的式(1)的单链DNA探针互补的碱基序列,在5’末端结合了若丹明(rhodamine),得到了标记的单链DNA探针。将该标记过的单链DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0),使其最终浓度达到1μM,在该溶液中浸渍上述(6)中得到的、经封闭处理的探针固定基材,室温(25℃)下进行杂交处理3小时。之后,用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(8)结果
解析上述(7)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(1)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为15750.另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为108.对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异.另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列.
实施例16
(1)探针的合成
完全按照上述实施例15的方法,将单链DNA探针分注在微管中,并使其干透。
(2)具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质(探针结合物质)
为了调制具有探针可结合部位的官能团及基材上可结合部位的官能团的物质,使用了含有具有异氰酸酯基的硅烷化合物(3-异氰酸丙酯基三乙氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBE-9007;信越化学工业(株)会社制)。将上述异氰酸酯硅烷偶联剂作为探针结合物质溶液用于下面的实验。
(3)探针介质的调制
在分注了上述式(1)的单链DNA探针的、完全干燥了的微管中,滴加探针结合物质异氰酸酯硅烷偶联剂20μl,并混合。然后,滴加纯水50μl,并混合。充分混合5分钟后,静置30分钟。
然后,在上述微管中滴加高沸点溶剂乙二醇500μl、乙醇500μl,之后混合1分钟。
接下来,滴加浓度为0.5wt%的水溶性高分子溶液聚乙烯醇(PVA)水溶液100μl,之后,混合1分钟。最后,滴加纯水,使探针介质的总量达到2000μl,混合5分钟。混合后,放置60分钟,调制成探针介质。
(4)清洗基板
完全按照上述实施例15的方法清洗基板,得到了基板。
(5)探针介质的点样
将上述(3)中调制的探针介质填充至气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)的墨盒中,装在气泡喷头上。需要注意的是,这里使用的气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)已经被改造为能够在平板上打印。然后,在该打印机上装上上述(4)中准备的玻璃基板,将探针介质点样在玻璃基板上。这里,气泡喷头的液体喷出面与玻璃基板的液体附着面间的距离为1.2~1.5mm。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。另外,测定了斑点形成部位外周的纯水接触角。结果,在基板的所有部位都约为5°。由该结果确认了在斑点部位之外,没有发生探针介质等引起的污染。将点样结束后的玻璃基板静置在干燥器中。由此制成探针固定基材。
(6)封闭处理
用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)充分清洗上述(5)中制造的探针固定基材,润湿探针固定基材,使其可进行均匀的封闭处理。然后,在2%牛血清白蛋白水溶液中浸泡玻璃基板,放置2小时,进行封闭处理。
(7)杂交处理
用DNA自动合成器合成了单链DNA,它具有与上述(1)中记载的式(1)的单链DNA探针互补的碱基序列,在5’末端结合了若丹明(rhodamine),得到了标记的单链DNA探针.将该标记过的单链DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0),使其最终浓度达到1μM,在该溶液中浸渍上述(6)中得到的、经封闭处理的探针固定基材,室温(25℃)下进行杂交处理3小时。之后,用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(8)结果
解析上述(7)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(1)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为15750。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为108。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
比较例1
(1)探针的合成
作为可特异性结合靶向物质的探针,使用了单链DNA探针。利用DNA自动合成器合成了序列号为10的单链核酸,在用DNA自动合成器合成时,通过巯基修饰剂(Thiol-Modifier)(Glen Reaearch公司制造)在其末端引入了巯基(SH)。然后进行了通常的脱保护,回收DNA,在高效液相色谱中纯化,得到了式(10)的低聚物,用于下面的实验。
5’HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3’(10)
(2)探针介质的调制
完全按照上述实施例1的方法,调制式(10)的单链DNA探针溶液(由吸收强度计算出正确的浓度)。将调制的探针溶液用于下面的实验。
准备好按照上述方法调制的探针溶液100μl,在其中滴加含有甘油7.5wt%、尿素7.5wt%及硫二甘醇7.5wt%的水溶液900μl。混合5分钟后,放置30分钟,调制成探针介质。
(3)清洗基板
完全按照上述实施例1的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(4)探针固定化处理
将含有具有氨基的硅烷化合物(N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBM-603;信越化学工业(株)会社制)的1wt%水溶液在室温下搅拌30分钟,调制成硅烷偶联剂水溶液.接下来,室温(25℃)下,在该水溶液中浸泡上述(3)中清洗的玻璃基板20分钟后,用流水充分冲洗,除去残留的硅烷偶联剂水溶液.用氮气吹拂冲洗过的基板两面,使其干燥.然后,在加热至120℃的烘箱中烘烤基板1小时,使其完成硅烷偶联处理.然后,称量N-(6-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺钠盐(商品名:EMCS;(株)同仁化学研究所制)2.7mg,将其溶解于1∶1的二甲基亚砜(DMSO)/乙醇溶液中,使其最终浓度达到0.3mg/ml,将EMCS溶液备用.室温下,在该EMCS溶液中浸渍进行了硅烷偶联处理的基板30分钟.用DMSO及乙醇的混合溶剂及乙醇依次清洗从EMCS溶液中取出的基板,之后,在氮气环境下使其干燥.由此完成了探针固定化处理.为了确认探针固定化处理的效果,测定了纯水接触角.结果发现,基板上的接触角为25~30°.由该结果确认了在基板上确切地进行了固定化处理.
(5)探针介质的点样
完全按照上述实施例1的方法,点样上述(2)中调制的探针介质,制成探针固定基材。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。另外,为了确认探针固定化处理的效果,测定了纯水接触角。结果发现,基板上的接触角为25~30°。由该结果确认了在斑点部位之外,没有发生探针介质等引起的污染。将点样结束后的玻璃基板浸渍在盛满了1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)的容器中,连容器一起放入冰箱,冷藏保存(4℃)。由此制成探针固定基材。
(6)封闭处理
完全按照上述实施例1的方法,进行了封闭处理。
(7)杂交处理
用DNA自动合成器合成了单链DNA,它具有与上述(1)中记载的式(10)的单链DNA探针互补的碱基序列,在5’末端结合了若丹明(rhodamine),得到了标记的单链DNA探针。将该标记过的单链DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0),使其最终浓度达到1μM,在该溶液中浸渍上述(6)中得到的、经封闭处理的探针固定基材,室温(25℃)下进行杂交处理3小时。之后,用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(8)结果
解析上述(7)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(1)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为12790。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为792。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
实施例17
(1)探针的合成
作为可特异性结合靶向物质的探针,使用与实施例8相同的方法,合成了式(5)的单链DNA探针。
(2)水溶性高分子材料
选择聚乙烯醇(PVA)作为水溶性高分子材料。称量5g含有聚乙烯醇(PVA)的Poval(商品名:Poval PVA-117;(株)Kuraray公司制)放入烧杯中。该聚乙烯醇的聚合度为1700,皂化度为98.0~99.0mol%。在其中加入495g纯水,使之溶解,制成了浓度为1.0wt%的Poval水溶液。溶解时,为了使其完全溶解,在热水浴中边加温至80℃边搅拌60分钟。确认没有不溶物后,过滤,以使点样时不会发生喷嘴堵塞的现象。过滤使用的是0.22μm的膜过滤器。如上所述,调制成PVA水溶液。
(3)探针介质的调制
将上述式(5)的单链DNA探针溶解于TE溶液(10mM Tris-HCl(pH 8)/1mM乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液)中,使其最终浓度达到约40μmol/l,调制成单链DNA探针溶液(由吸收强度计算出正确的浓度).
然后,作为探针固定物质,将含有具有氨基的硅烷化合物(N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBM-603;信越化学工业(株)会社制)的500μmol/l水溶液在室温下搅拌30分钟,调制成氨基硅烷水溶液。然后,将具有顺丁烯二酰亚胺基、羟基琥珀酰亚胺酯基的二元性试剂N-(6-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺钠盐(商品名:sulfo-EMCS;(株)同仁化学研究所制)的500μmol/l水溶液在室温下搅拌5分钟,调制成EMCS水溶液。等容量混合上述氨基硅烷水溶液与EMCS水溶液,搅拌5分钟,由此得到了探针固定物质溶液。将调制的探针固定物质溶液用于下面的实验。准备好按照上述方法调制的探针溶液100μl,在其中滴加按照上述方法调制的探针固定物质溶液100μl后,混合5分钟。将混合溶液放置10分钟后,滴加纯水700μl、按照上述方法调制的水溶性高分子材料PVA水溶液100μl,混合5分钟。混合后,放置30分钟,调制成探针介质。
(4)清洗基板
将1英寸见方的玻璃基板放入盒中,在事先加温至60℃的1mol/l氢氧化钠水溶液中浸泡玻璃基板10分钟。接着用流动的纯水充分涮洗,水洗除去附着在玻璃基板及盒上的氢氧化钠。充分涮洗后,在纯水中连盒一起浸泡玻璃基板,超声清洗10分钟。超声清洗后,用流动的纯水充分涮洗,水洗除去附着在玻璃基板及盒上的颗粒。将水洗后的玻璃基板一张一张的用氮气吹干。
(5)探针介质的点样
将上述(3)中调制的探针介质填充至气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)的墨盒中,装在气泡喷头上。需要注意的是,这里使用的气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)已经被改造为能够在平板上打印。然后,在该打印机上装上上述(4)中准备的玻璃基板,将探针介质点样在玻璃基板上。这里,气泡喷头的液体喷出面与玻璃基板的液体附着面间的距离为1.2~1.5mm。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。将点样结束后的玻璃基板静置在干燥器中。由此制成探针固定基材。
(6)保存
在干燥器内保存上述(5)中制造的探针固定基材7天。在此期间,将湿度、温度分别调整至35%以下和25℃。
(7)封闭处理
用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗上述(6)中保存的探针固定基材,润湿探针固定基材,使其可进行均匀的封闭处理。然后,在2%牛血清白蛋白水溶液中浸泡玻璃基板,放置2小时,进行封闭处理。
(8)杂交处理
用DNA自动合成器合成了单链DNA,它具有与上述(1)中记载的式(5)的单链DNA探针互补的碱基序列,在5’末端结合了若丹明(rhodamine),得到了标记的单链DNA探针。将该标记过的单链DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0),使其最终浓度达到1μM,在该溶液中浸渍上述(7)中得到的、经封闭处理的探针固定基材,室温(25℃)下进行杂交处理3小时.之后,用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA 探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(1)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为15830。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为611。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
实施例18
(1)探针的合成
完全按照上述实施例17的方法准备单链DNA探针,之后用于下面的实验。
(2)水溶性高分子材料
完全按照上述实施例17的方法,配制了水溶性高分子材料水溶液。水溶性高分子材料使用的是含有聚乙烯醇(PVA)的Poval(商品名:PovalPVA-117;(株)Kuraray公司制)。该聚乙烯醇的聚合度为1700,皂化度为98.0~99.0mol%。
(3)探针介质的调制
完全按照上述实施例17的方法,调制成探针溶液。
准备好按照上述方法调制的探针溶液100μl,在其中滴加含有甘油7.5wt%、尿素7.5wt%及硫二甘醇7.5wt%的水溶液800μl。滴加按照上述方法调制的水溶性高分子材料水溶液100μl后,混合5分钟。混合后,放置30分钟,得到了探针介质。
(4)清洗基板
完全按照上述实施例17的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(5)探针固定化处理
将含有具有氨基的硅烷化合物(N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBM-603;信越化学工业(株)会社制)的1wt%水溶液在室温下搅拌30分钟,调制成硅烷偶联剂水溶液。接下来,室温(25℃)下,在该水溶液中浸泡上述(4)中清洗的玻璃基板20分钟后,用流水充分冲洗,除去残留的硅烷偶联剂水溶液。用氮气吹拂冲洗过的基板两面,使其干燥。然后,在加热至120℃的烘箱中烘烤基板1小时,使其完成硅烷偶联处理。然后,称量N-(6-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺钠盐(商品名:EMCS;(株)同仁化学研究所制)2.7mg,将其溶解于1∶1的二甲基亚砜(DMSO)/乙醇溶液中,使其最终浓度达到0.3mg/ml,将EMCS溶液备用。室温下,在该EMCS溶液中浸渍进行了硅烷偶联处理的基板30分钟。用DMSO及乙醇的混合溶剂及乙醇依次清洗从EMCS溶液中取出的基板,之后,在氮气环境下使其干燥。由此完成了探针固定化处理。
(6)探针介质的点样
完全按照上述实施例17的方法,点样了上述(3)中调制的探针介质,制成探针固定基材。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。将点样结束后的玻璃基板静置在干燥器中。由此制成探针固定基材。
(7)保存
在干燥器内保存上述(6)中制造的探针固定基材7天。在此期间,将湿度、温度分别调整至35%以下和25℃。
(8)封闭处理
完全按照上述实施例17的方法,进行了封闭处理。
(9)杂交处理
完全按照上述实施例17的方法,进行了杂交处理。之后,用1MNaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(10)结果
解析上述(9)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(5)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为11520。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为659。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
实施例19
(1)探针的合成
合成了实施例(10)中所用的式(5)~(8)的单链DNA探针,之后用于下面的实验。
(2)水溶性高分子材料
完全按照上述实施例17的方法,调制成PVA水溶液。
(3)探针介质的调制
完全按照上述实施例17的方法,调制成单链DNA探针溶液。
按照上述实施例17中(3)记载的方法,用上述式(5)~(8)的单链DNA,调制成4种探针介质(由吸收强度计算出正确的浓度)。
(4)清洗基板
完全按照上述实施例17的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(5)探针介质的点样
将上述(3)中调制的4种探针介质分别填充至气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)用的4个墨盒中,将各墨盒分别装在气泡喷头上。需要注意的是,这里使用的气泡喷墨打印机(商品名:BJF850;Canon(株)会社制造)已经被改造为能够在平板上打印。然后,在该打印机上装上上述(4)中准备的玻璃基板,将探针介质点样在玻璃基板上。这里,气泡喷头的液体喷出面与玻璃基板的液体附着面间的距离为1.2~1.5mm。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。将点样结束后的玻璃基板静置在干燥器中。由此制成固定了4种探针的探针固定基材。
(6)保存
在干燥器内保存上述(5)中制造的探针固定基材7天。在此期间,将湿度、温度分别调整至35%以下和25℃。
(7)封闭处理
完全不需进行上述实施例17中的封闭处理,用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗基材表面,使其可进行均匀的杂交处理。
(8)杂交处理
完全按照上述实施例17的方法,进行了杂交处理。之后,用1MNaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(9)结果
解析上述(7)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(5)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为15120。与此相对,对于具有1个碱基错配序列的式(6)的DNA探针的斑点,其荧光量为9030。而对于具有3个碱基错配序列的式(7)的DNA探针的斑点,其荧光量仅为完全配对时的一半以下,为3423;对于具有6个碱基错配序列的式(8)的DNA探针,几乎观察不到荧光斑点,斑点相应部分的荧光强度为973。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为653。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。由此可见,可以在DNA阵列基板上特异性检测完全互补的单链DNA。
实施例20
(1)探针的合成
作为可特异性结合靶向物质的探针,使用了实施例1中使用的式(1)的单链DNA探针。利用DNA自动合成器合成了式(5)的单链DNA探针。需要注意的是,在式(1)的单链DNA末端的5’末端的羟基上通过磷酸基与六亚甲基结合了氨基,准备其18倍体的低聚物,用于下面的实验。
(2)水溶性高分子材料
选择聚乙烯醇(PVA)作为水溶性高分子材料。称量5g含有聚乙烯醇(PVA)的Poval(商品名:Poval PVA-217E;(株)Kura r ay公司制)放入烧杯中。该聚乙烯醇的聚合度为1700,皂化度为87.0~89.0mol%。在其中加入495g纯水,使之溶解,制成了浓度为1.0wt%的Poval水溶液。溶解时,为了使其完全溶解,在热水浴中边加温至80℃边搅拌60分钟。确认没有不溶物后,过滤,以使点样时不会发生喷嘴堵塞的现象。过滤使用的是0.22μm的膜过滤器。如上所述,调制成PVA水溶液。
(3)探针介质的调制
将上述式(5)的单链DNA探针溶解于TE溶液(10mM Tris-HCl(pH 8)/1mM乙二胺四乙酸(EDTA)水溶液)中,使其最终浓度达到约40μmol/l,调制成单链DNA探针溶液(由吸收强度计算出正确的浓度)。
然后,作为探针固定物质,将含有具有环氧基的硅烷化合物(γ-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBM-403;信越化学工业(株)会社制)的500μmol/l水溶液在室温下搅拌30分钟,得到了探针固定物质溶液.将调制的探针固定物质溶液用于下面的实验.
准备好按照上述方法调制的探针溶液100μl,在其中滴加按照上述方法调制的探针固定物质溶液100μl后,混合5分钟。将混合溶液放置10分钟后,滴加纯水700μl、按照上述方法调制的水溶性高分子材料PVA水溶液100μl,混合5分钟。混合后,放置30分钟,调制成探针介质。
(4)清洗基板
完全按照上述实施例17的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(5)探针介质的点样
完全按照上述实施例17的方法,在探针介质的基材上进行了点样,制成探针固定基材。
(6)保存
在干燥器内保存上述(5)中制造的探针固定基材7天。在此期间,将湿度、温度分别调整至35%以下和25℃。
(7)封闭处理
用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗上述(6)中保存的探针固定基材,润湿探针固定基材,使其可进行均匀的封闭处理。然后,在2%牛血清白蛋白水溶液中浸泡玻璃基板,放置2小时,进行封闭处理。
(8)杂交处理
用DNA自动合成器合成了单链DNA,它具有与上述(1)中记载的式(1)的单链DNA探针互补的碱基序列,在5’末端结合了若丹明(rhodamine),得到了标记的单链DNA探针。将该标记过的单链DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0),使其最终浓度达到1μM,在该溶液中浸渍上述(7)中得到的、经过了封闭处理的探针固定基材,在室温下(25℃)进行杂交处理3小时。之后,用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;AxonInstruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(1)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为17110。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为731。与此相对,对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
实施例21
(1)探针的合成
完全按照上述实施例17的方法准备式(1)的单链DNA探针,之后用于下面的实验。
(2)水溶性高分子材料
完全按照上述实施例17的方法,调制成PVA水溶液。
(3)高沸点溶剂
选择丙二醇(1,2-丙二醇;Kishida化学(株)会社制)作为高沸点溶剂。称量丙二醇5.2g、异丙醇(2-丙醇;Kishida化学(株)会社制)4g,相互混合。考虑到调制探针介质时的萃取、混合性,混合了异丙醇。如上所述,调制成高沸点溶液。
(4)探针介质的调制
将上述式(1)的单链DNA探针分注在微管中,使平均每根微管中的浓度达到17.53nmol,使其干燥,准备装有单链DNA探针的微管。
准备好1根装有上述分注了单链DNA探针的微管,在其中滴加50μl纯水后,搅拌3分钟,使DNA充分溶解。在其中滴加作为探针固定物质的含有具有环氧基的硅烷化合物(γ-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBM-403;信越化学工业(株)会社制)20μl后,混合10分钟。将混合溶液静置20分钟后,滴加上述水溶性高分子材料PVA水溶液100μl、高沸点溶液1400μl,混合5分钟。最后滴加纯水430μl,混合5分钟后,静置30分钟。由此调制成探针介质。
(5)清洗基板
完全按照上述实施例17的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(6)探针介质的点样
完全按照上述实施例17的方法,在探针介质的基板上进行了点样,制成探针固定基材。
(7)保存
在干燥器内保存上述(6)中制造的探针固定基材7天。在此期间,将湿度、温度分别调整至35%以下和25℃。
另外,为了确认作为探针固定基材的干燥保存特性,80℃下在热板上干燥固探针固定基材5分钟后,同样在干燥器中保存7天。
(8)杂交处理
用DNA自动合成器合成了单链DNA,它具有与上述(1)中记载的式(1)的单链DNA探针互补的碱基序列,在5’末端结合了若丹明(rhodamine),得到了标记的单链DNA探针。将该标记过的单链DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0),使其最终浓度达到1μM,在该溶液中浸渍探针固定基材,在恒温箱中(45℃)进行杂交处理2小时。之后,用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(1)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为12970.另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为131.与此相对,对于80℃下热板上干燥了5分钟的探针固定基材而言,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(5)的DNA探针斑点在532nm处的荧光强度为13540.另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为96.对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异.另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列.
实施例22
(1)探针的合成
完全按照上述实施例20的方法准备式(1)的单链DNA探针,之后用于下面的实验。
(2)水溶性高分子材料
完全按照上述实施例17的方法,调制成PVA水溶液。
(3)高沸点溶剂
选择二甘醇(1,2-丙二醇;Kishida化学(株)会社制)作为高沸点溶剂。称量丙二醇5.6g、异丙醇(2-丙醇;Kishida化学(株)会社制)7.9g,相互混合。考虑到调制探针介质时的萃取、混合性,混合了异丙醇。如上所述,调制成高沸点溶剂。
(4)探针介质的调制
将上述式(1)的单链DNA探针分注在微管中,使平均每根微管中的浓度达到17.53nmol,使其干燥,准备装有单链DNA探针的微管。
准备好1根装有上述分注了单链DNA探针的微管,在其中滴加50μl纯水后,搅拌3分钟,使DNA充分溶解。作为固定物质,在其中滴加含有具有异氰酸酯基的硅烷化合物(γ-异氰酸丙酯基三乙氧基硅烷)的硅烷偶联剂(商品名:KBE-9007;信越化学工业(株)会社制)20μl后,混合10分钟。将混合溶液静置20分钟后,滴加上述水溶性高分子材料PVA水溶液100μl、高沸点溶液1400μl,混合5分钟。最后滴加纯水430μl,混合5分钟后,静置30分钟。由此调制成探针介质。
(5)清洗基板
完全按照上述实施例17的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(6)探针介质的点样
完全按照上述实施例17的方法,在探针介质的基板上进行了点样,制成探针固定基材。
(7)保存
在干燥器内保存上述(6)中制造的探针固定基材7天。在此期间,将湿度、温度分别调整至35%以下和25℃。
另外,为了确认作为探针固定基材的干燥保存特性,80℃下在热板上干燥探针固定基材5分钟后,同样在干燥器中保存7天。
(8)杂交处理
用DNA自动合成器合成了单链DNA,它具有与上述(1)中记载的式(1)的单链DNA探针互补的碱基序列,在5’末端结合了若丹明(rhodamine),得到了标记的单链DNA探针。将该标记过的单链DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0),使其最终浓度达到1μM,在该溶液中浸渍探针固定基材,在恒温箱中(45℃)进行杂交处理2小时。之后,用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描仪评价结果发现,对于在干燥器中保存了7天的探针固定基材而言,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(1)DNA探针的斑点在532nm处的荧光强度为17790。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为89。与此相对,对于80℃下在热板上干燥了5分钟的探针固定基材而言,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(5)的DNA探针斑点在532nm处的荧光强度为18340。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为81。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
比较例2
(1)探针的合成
完全按照上述实施例17的方法准备式(5)的单链DNA探针,之后用于下面的实验。
(2)水溶性高分子材料
为了确认水溶性高分子材料产生的效果,不使用水溶性高分子材料制成探针固定介质基材。
(3)探针介质的调制
完全按照上述实施例17的方法,调制成式(5)的单链DNA探针溶液(由吸收强度计算出正确的浓度)。然后,按照实施例17的方法,调制成由氨基硅烷及二元性试剂组成的探针固定物质溶液。将调制的探针固定物质溶液用于下面的实验。
准备好按照上述方法调制的探针溶液100μl,在其中滴加按照上述方法调制的探针固定物质溶液100μl后,混合5分钟。将混合溶液放置10分钟后,滴加800μl的纯水,混合5分钟。混合后,放置30分钟,调制成探针介质。
(4)清洗基板
完全按照上述实施例17的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(5)探针介质的点样
完全按照上述实施例17的方法,在探针介质的基板上进行了点样,制成探针固定基材。
(6)保存
在干燥器内保存上述(5)中制造的探针固定基材7天。在此期间,将湿度、温度分别调整至35%以下和25℃。
(7)封闭处理
用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液充分清洗上述(6)中保存的探针固定基材,润湿探针固定基材,使其可进行均匀的封闭处理。然后,在2%牛血清白蛋白水溶液中浸泡玻璃基板,放置2小时,进行封闭处理。
(8)杂交处理
用DNA自动合成器合成了单链DNA,它具有与上述(1)中记载的式(5)的单链DNA探针互补的碱基序列,在5’末端结合了若丹明(rhodamine),得到了标记的单链DNA探针。将该标记过的单链DNA溶解于1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0),使其最终浓度达到1μM,在该溶液中浸渍上述(7)中得到的、经过封闭处理的探针固定基材,室温下(25℃)进行杂交处理3小时.之后,用1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(9)结果
解析上述(8)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(5)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为1427。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为697。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。由此可见,当使用不含水溶性高分子材料的探针介质时,未得到完全配对时斑点部位的荧光强度,未能有效地进行检测。
比较例3
(1)探针的合成
完全按照上述实施例1的方法准备式(5)的单链DNA探针,之后用于下面的实验。
(2)水溶性高分子材料
为了确认水溶性高分子材料产生的效果,不使用水溶性高分子材料制成探针固定介质材料。
(3)探针介质的调制
完全按照上述实施例17的方法,调制成式(5)的单链DNA探针溶液(由吸收强度计算出正确的浓度)。将调制的探针溶液用于下面的实验。
准备好按照上述方法调制的探针溶液100μl,在其中滴加含有甘油7.5wt%、尿素7.5wt%及硫二甘醇7.5wt%的水溶液900μl。混合5分钟后,放置30分钟,调制成探针介质。
(4)清洗基板
完全按照上述实施例17的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(5)探针固定化处理
完全按照上述实施例18的方法,在洗净了的玻璃基板上进行了探针固定化处理。
(6)探针介质的点样
完全按照上述实施例17的方法,点样了上述(3)中调制的探针介质,制成探针固定基材。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。将点样结束后的玻璃基板静置在干燥器中。由此制成探针固定基材。
(7)保存
在干燥器内保存上述(6)中制造的探针固定基材7天。在此期间,将湿度、温度分别调整至35%以下和25℃。
(8)封闭处理
完全按照上述实施例17的方法,进行了封闭处理。
(9)杂交处理
完全按照上述实施例17的方法,进行了杂交处理.之后,用1MNaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(10)结果
解析上述(9)中的荧光扫描仪评价结果发现,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(5)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为1527。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为792。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
比较例4
(1)探针的合成
完全按照上述实施例20的方法准备式(1)的单链DNA探针,之后用于下面的实验。
(2)水溶性高分子材料
为了确认水溶性高分子材料产生的效果,不使用水溶性高分子材料制成探针固定介质材料。
(3)高沸点溶剂
为了确认高沸点溶剂产生的效果,不使用高沸点溶剂制成探针固定介质基材。
(4)探针介质的调制
完全按照上述实施例20的方法,调制成式(1)的单链DNA探针溶液(由吸收强度计算出正确的浓度)。替代上述(2)中使用的水溶性高分子材料PVA而使用纯水,替代上述(3)中的高沸点溶剂而使用异丙醇。将调制的探针溶液用于下面的实验。
(5)清洗基板
完全按照上述实施例17的方法清洗基板,并准备玻璃基板。
(6)探针固定化处理
完全按照上述实施例17的方法,在洗净了的玻璃基板上进行了探针固定化处理。
(7)探针介质的点样
完全按照上述实施例17的方法,点样了上述(4)中调制的探针介质,制成探针固定基材。点样结束后,用显微镜观察玻璃基板,确认了在玻璃基板表面上形成了矩阵状的斑点排列。将点样结束后的玻璃基板静置在干燥器中。由此制成探针固定基材。
另外,对于部分探针固定基材,80℃下进行热板处理5分钟后,静置于干燥器内。
(8)保存
在干燥器内保存上述(7)中制造的探针固定基材7天。在此期间,将湿度、温度分别调整至35%以下和25℃。
(9)杂交处理
完全按照上述实施例17的方法,进行了杂交处理。之后,用1MNaCl/50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗探针阵列,冲洗未与探针核酸杂交的单链DNA探针。然后,用纯水除去多余的盐分后,用氮气吹干探针固定基材。接下来,用荧光扫描仪(商品名:GenePix 4000B;Axon Instruments,Inc.制造)评价了该探针固定基材的斑点的荧光强度。评价时,将激光功率设为100%,PMT设为400V。
(10)结果
解析上述(9)中的荧光扫描仪评价结果发现,对于在干燥器中保存了7天的探针固定基材而言,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(1)的DNA探针的斑点,在532nm处的荧光强度为4276。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为89。与此相对,对于80℃下在热板上干燥了的探针固定基材而言,与标记过的单链DNA探针完全配对的式(5)的DNA探针斑点,其在532nm处的荧光强度为1286。另外,观察DNA探针斑点以外的荧光强度,为81。对于荧光下观察到的各DNA探针斑点的状态,各斑点形状大致为圆形,在点样了同一探针介质的斑点间,几乎看不到荧光强度的差异。另外,可观察到相邻斑点的间隔大致均等,斑点间隔约为200μm,成格子状排列。
需要注意的是,作为序列号1~10的其他特征,附件序列表记载的序列表内容如下。
序列表
<110>佳能株式会社
<120>探针介质
<130>CFO16889WO
<140>
<141>
<150>JP 2001-394086
<151>2001-12-26
<160>10
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:用于探针的低聚物
<220>
<223>发明人:冈田良克;龟山诚;岩田研逸
<400>1
actggccgtc gttttaca 18
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:用于探针的低聚物
<400>2
actggccgtt gttttaca 18
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:用于探针的低聚物
<400>3
actggccgct tttttaca 18
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:用于探针的低聚物
<400>4
actggcatct tgtttaca 18
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:用于探针的低聚物
<400>5
actggccgtc gttttaca 18
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:用于探针的低聚物
<400>6
actggccgtt gttttaca 18
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:用于探针的低聚物
<400>7
actggccgct tttttaca 18
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:用于探针的低聚物
<400>8
actggcatct tgtttaca 18
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:用于探针的低聚物
<400>9
actggccgtc gttttaca 18
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述:用于探针的低聚物
<400>10
actggccgtc gttttaca 18
Claims (9)
1.一种探针介质,其在水溶液中溶解有可特异性结合靶向物质且末端被修饰有官能团的单链核酸探针及具有能与所述单链核酸探针的末端结合的官能团和硅醇基的硅烷偶联剂。
2.一种探针介质,其在水溶液中溶解有可特异性结合靶向物质且被修饰有官能团的探针、及具有可与该探针结合的官能团、可与基材结合的部位和硅醇基的硅烷偶联剂,其还含有用于结合所述单链核酸探针、和所述硅烷偶联剂的二元性试剂。
3.权利要求1所述的探针介质,其中所述结合为通过化学作用形成的共价键。
4.权利要求2所述的探针介质,其中,所述二元性试剂为选自N-(4-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)硫代琥珀酰亚胺钠盐、N-(6-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)硫代琥珀酰亚胺钠盐、N-(8-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)硫代琥珀酰亚胺钠盐、N-(11-顺丁烯二酰亚胺己酰氧基)硫代琥珀酰亚胺钠盐中的至少一种。
5.探针的固定方法,
将权利要求1所述的探针介质通过点样法赋予在基材上,从而固定。
6.DNA阵列,其中作为DNA探针,是利用权利要求5记载的探针固定方法制造的探针固定基材的探针。
7.检测方法,其中,使用通过点样法将权利要求1记载的探针介质赋予在基材上而固定得到的探针固定基材,来检测靶向物质。
8.探针介质,将在水溶液中含有可特异性结合靶向物质且末端被修饰有官能团的单链核酸探针、及具有可与该单链核酸探针的末端结合的官能团和硅醇基的硅烷偶联剂的物质,各自收纳到容器中或部分混合后收纳到容器中,在固定到基材上时进行混合而得到。
9.DNA阵列,其特征在于,将在水溶液中含有可特异性结合靶向物质且末端被修饰有官能团的单链核酸探针、及具有可与该单链核酸探针的末端结合的官能团和硅醇基的硅烷偶联剂的探针介质,在所述基材上分散地配置成点状。
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Kumar A..Silanized nucleic acids:a general platform for DNAimmobilization..Nucleic Acids Research28 14.2000,摘要,e71 i页右栏33-41行,e71 ii页左栏第16-26行,e71 ii页左栏43-45行. |
Kumar A..Silanized nucleic acids:a general platform for DNAimmobilization..Nucleic Acids Research28 14.2000,摘要,e71 i页右栏33-41行,e71 ii页左栏第16-26行,e71 ii页左栏43-45行. * |
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