1326769 A7 B7 五、發明説明（1 ) 發明領域 (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係關於將探針固定於底物的探針介質及其固定 方法。本發明亦關於偵測目標物質之方法，其係使用藉由 將探針介質固定於底物上而產生具有固定型探針的底物。 相關的技藝背景 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 有許多習知的方法可將探針固定於底物。詳細而言， 現行的方法是將探針合成在底物上，或是用針或戳記將先 前製備的探針附著於底物上以固定探針。特定言之，習知 的方法包含用活化劑去除所選定的底物區域上之保護基、 結合具有可去除型保護基單體於所選定的區域並重覆此步 驟從而合成具有各種序列之聚合物，如美國專利第 5,143,854號之揭示。另一種習知的方法，其係包含使具有 氰胺基團反應性之生物活性物質與由底物和具有氰胺基團 並附著於底物上之聚合物（如所揭示日本專利申請案公開第 08-23 975號）組成之固定型物質接觸。同樣地，日本專利申 請案公開第08-3 3 4509號揭示的習知的方法係將物質經由 氰胺基團固定在內含氰胺基團之化合物上來偵測生物活性 物質。此外，如日本專利申請案公開第200 1 -1 78442號揭 示的習知方法，其係將DNA斷片固定於固體載體之表面， 其係使具有硫醇端基團之DN A斷片與液相中之固體載體接 觸，該固體載體上之鏈分子一端係固定在載體上並具有反 應性取代基團能與硫醇基反應而形成共價鍵。 有許多方法亦爲習知的偵測生物物質之方法。日本專 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS>A4規格（ 210X297公釐） -5- 1326769 Α7 Β7 五、發明説明（2 ) {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 利申請案公開第200 1-1 16699號揭示一種測量生物物質（例 如：PN A、互補脫氧核糖核酸、寡核苷酸）之方法，其可輕 易地以高敏感度及準確度排除背景雜訊之影響。日本專利 申請案公開第2001-1 1 6750號揭示的亦爲一種習知的固定 反應性物質於底物之方法，其係從噴嘴釋出內含反應性物 質之溶液以便將反應性物質固定在底物上所要求的位置上 。以玻璃或矽形成底物及在其表面予以表面處理可提高親 和力。反應性物質係至少一種選自：脫氧核糖核酸斷片、 互補脫氧核糖核酸、RNA、酵素、抗原、抗體、抗原決定 部位、蛋白質、多核苷酸及肽類之物質。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 目前已知當探針固定於底物時可用水溶性聚合物材料 進行阻塞處理。特定言之，揭示於日本專利第2794728號 之方法包含將核酸樣品固定於薄膜上，並將薄膜浸於內含 P VA及/或P VP之溶液中以進行阻塞處理。另一個於固定核 酸後所進行之薄膜後處理方法爲用脫脂牛奶及其類似者進 行阻塞處理。特定言之，揭示於日本專利公告第06-034756 號，其係包含將核酸樣品固定於薄膜並將此薄膜用脫脂牛 奶及Ν-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基硫基）丙酸酯進行阻塞處 理。 具有固定型脫氧核糖核酸探針之底物，一旦已在底物 上形成探針之後即應避免乾燥。特定言之，如日本專利申 請案公開第2〇〇 1-1 78459號揭所示，其關鍵係在溶解或分 散脫氧核糖核酸斷片之水溶液中加入高沸點溶劑。 進一步的，關於高分子材料的塗敷醫學裝置，可塗敷 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -6 - 1326769 A7 B7 五、發明説明（3 ) 習知的聚合物及醫學藥劑。特定言之，如日本專利申請案 公開第2000-5 1 25 1 9號所揭示，其塗敷醫學裝置的組成物 包含具生物相容性及生物可降解性的聚合物及醫學藥劑。 然而’在專一結合於目標物質的內含探針之習見探針 介質中，尙無探針介質在其介質內含有探針、可鍵結探針 之位點及可鍵結底物之位點。進一步的，習見的固定探針 方法可將目標物質專一地結合於底物上，其包含將底物塗 以內含可鍵結於探針位點之材料或將底物予以處理以形成 可與探針鍵結之位點以便在底物上形成結合層，然後提供 底物至少內含一種探針之介質以固定探針。因此，在提供 底物之探針介質之前應先在底物上形成可鍵結於探針的位 點。此外，具有可鍵結探針與底物之位點的化合物可作爲 形成固定型探針的材料，底物先經過固定型探針材料處理 後可將探針固定。因此，此方法需要在進行固定探針之前 將底物用固定型探針之材料處理。 進一步的，目前尙無探針介質內含可專一結合於目標 物質之探針，該介質在同一種介質中含有探針和水溶性聚 合物材料。雖然已知使用水溶性聚合物材料可進行阻塞處 理（一種以具有固定型探針之底物偵測目標物質的方法之構 成步驟之一），但尙無使用內含水溶性聚合物材料之探針介 質或在將探針固定於底物時將探針與水溶性聚合物材料混 合之方法。進一步的，習見的固定型探針之底物，其探針 習知爲脫氧核糖核酸斷片（一種探針），可專一結合於已固定 於底物上之目標物質，在固定於底物之後應避免其乾燥。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） ^-- {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 經濟部智恶財產局員工消費合作杜印製 1326769 A7 ----B7 ___ 五、發明説明（5 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 本發明的第一個具體實施例是探針介質及在底物上固 定探針之方法，其係包含探針、具有可鍵結於探針位點之 物質以及具有可鍵結於底物位點之物質。在本發明第二個 具體實施例中探針介質以及在底物上固定探針之方法，其 包含探針、水溶性聚合物材料以及高沸點溶劑。 探針之實施例包括：單股核酸探針、單鏈脫氧核糖核 酸探針、單股RNA探針以及單股的RNA探針。就核酸探 針作爲探針介質時之穩定性而言，介質中之探針含量宜調 至例如2聚體至5 00聚體，尤其是2聚體至80聚體之核酸 探針，且含量水準爲0.05至500微莫耳/升，尤其是〇.5至 5〇微莫耳/升。可單獨使用此類探針，但較佳者係在彼之端 點經連結子修飾。經連結子修飾之實施例包括生物素化， 官能基之修飾等。適用於此目的之官能基包括胺基（NH2)基 團、羰基（COOH)基團、氫硫基（SH)基團及羥基（〇H)基團。 就合成探針官能基的簡易性而言，較佳的官能基是胺基， 若就探針官能基之反應性而言，較佳的官能基是氫硫基團 探結 E imU 在1 是於 點結 位鍵 的法 佳方 較種 但各 ， 用 制可 限點 無端 並 針 點探 位。 的子 針結 探連 於結 結鍵 鍵點 可端 的 針 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 子，較佳者係經由化學鍵。可鍵結於探針連結子之位點可 包括卵白素及官能基》該官能基包括：環氧基（choch2)基 團、胺基（NH2)基團、氫硫基（SH)基團、順丁烯二酸醯亞胺 基團' 氯丙基（C3H6C1)基團、異氰酸酯（NCO)基團。就結合 於探針官能基而言，尤其是可鍵結於探針的官能基中，較 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） -9 - 1326769 A7 _B7_ 五、發明説明) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 佳者爲環氧基團、順丁烯二酸醯亞胺基團、氯丙基團、異 氰酸酯（NCO)基團。在介質中對可鍵結探針之位點的含量並 無限制，視可鍵結於探針的位點之型態而異，但考量到對 探針之結合性質，宜調整至100至100000當量。 可鍵結於底物的位點並無限制，但較佳之位點爲可緊 密結合於底物之位點。此位點可爲官能基，較佳者爲與底 物形成化學鍵之基團。與底物結合之官能基包括：烷氧基 矽烷基（SiOR)基團、矽醇基（SiOH)基團以及烷氧基（OR)基 團。就固定於底物之簡易性就而言，烷氧基矽烷基（SiOR) 基團或矽醇基（Si OH)基團是鍵結於底物之尤佳官能基，但 當底物含有胺基或羰基團時，則以能與此類官能基之一有 反應爲較佳的官能基。水解烷氧基矽烷基團可形成矽醇基 團。探針及將探針固定在底物之物質可在介質中相互反應 並結合，較佳者係經由介於官能基之間的化學反應以形成 共價鍵。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在探針中，可鍵結探針之位點和可鍵結底物之位點可 爲各種組合，但其組合之特定實施例包括以胺基作爲探針 之官能基，以環氧基團作爲可鍵結探針之位點官能基，及 以矽醇基團作爲可鍵結底物之位點官能基。除此之外，彼 之組合包括以氫硫基團作爲探針之官能基 > 順丁烯二酸醯 亞胺基團作爲可鍵結探針之位點官能基；羰基團作爲探針 之官能基，胺基作爲可鍵結探針之位點官能基以及矽醇基 團作爲可鍵結底物之位點官能基；胺基作爲探針官能基， 異氰酸酯基團作爲鍵結探針之位點官能基以及矽醇基團作 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -1〇 - 1326769 A7 ____B7 五、發明説明（7 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲可鍵結底物之位點官能基。就合成探針官能基之簡易性 與可鍵結探針之位點的反應性就而言，在此類官能基之中 ’以胺基作爲探針之官能基和異氰酸酯基團作爲可鍵結探 針之位點官能基爲較佳組合。較佳者係在介質中以混合反 應或可在進行反應之預定條件下進行反應。 在內含可鍵結底物之位點官能基及可鍵結同一個化合 物底物之位點官能基（其中後者爲烷氧基矽烷基團或矽醇基 團）之化合物的特定實施例包括矽烷偶合劑。在矽烷偶合劑 中水解烷氧基矽烷基團可形成矽醇基團。矽烷偶合劑中其 他的官能基可爲上述之環氧基團、異氰酸酯基團、氫硫基 團以及氯丙基團，對應的矽烷偶合劑可分別爲環氧基矽烷 、異氰醯基矽烷、氫硫基矽烷以及氯丙基矽烷。若須要此 類砂烷偶合劑可先水解，然後與探針混合。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 內含可鍵結於底物之位點官能基以及可鍵結於不同化 合物之底物之位點（前者是順丁烯二酸醯亞胺基團而後者是 烷氧基矽烷基團或矽醇基團）官能基之化合物的特定實施例 包括雙功能劑及矽烷偶合劑之組合。雙功能劑之特定實施 例包括：Ν-(4-順丁烯二酸醯亞胺基己醯基氧基）琥珀醯亞胺 、Ν-(6-順丁烯二酸醯亞胺基己醯基氧基）琥珀醯亞胺、Ν-(8-順丁烯二酸醯亞胺基己醯基氧基）琥珀醯亞胺以及Ν_(ιΐ-順丁烯二酸醯亞胺基己醯基氧基）琥珀醯亞胺。此類物質中 較佳者爲水溶性探針介質、源自此類物質之水溶性鈉鹽類 ，即Ν-(4-順丁烯二酸醯亞胺基己醯基氧基）磺基琥珀醯亞 胺、（6順丁烯二酸醯亞胺基己醯基氧基）磺基琥珀醯亞胺、 表紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇Χ297公釐） -11 - ~ 1326769 A7 B7 五、發明説明（8 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (8 -順丁烯二酸醯亞胺基己醯基氧基）磺基琥珀醯亞胺、（丨^ 順丁烯二酸醯亞胺基己醯基氧基）磺基琥珀醯亞胺》矽烷偶 合劑中，水解烷氧基矽烷基團可形成矽醇基團。各種類型 之矽烷偶合劑中較佳者爲可與雙功能劑反應及內含胺基之 偶合劑。若須要此類矽烷偶合劑可先水解，然後與探針混 合。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 水溶性聚合物材料之實施例包括：聚乙烯醇（PVA)、聚 乙烯基吡咯烷酮（PVP)、包經（pa〇gen) '羧甲基纖維素 (CMC) '羥乙基纖維素（HEC)、右旋聚醣以及普魯蘭多糖。 在此類聚合物之中，以聚乙烯醇（PVA)及聚乙烯基吡咯烷酮 (PVP)較佳，因爲彼爲常用之材料並能穩定探針。以常用之 聚乙烯醇（PVA)爲例，宜依據需要調整聚合程度及皂化數目 。調整聚合度及皂化數目可調整聚乙烯醇在探針介質中之 溶解度、探針介質之黏度及探針介質點在底物上形成墨點 之墨點強度、及其吸濕性。特定言之，只要彼不會對底物 上之探針介質造成問題，即可調整聚合度及皂化數目以達 成適當的探針穩定性。此外，在底物上提供探針介質而製 備成的具有固定型探針的底物所形成之墨點及其吸濕性質 等可分別地調至適當的狀態。然而，當聚乙烯醇聚合之程 度太高時，聚乙烯醇中之探針介質溶解度會減低而其黏度 會增加，因此在底物上難於提供穩定探針介質。然而，當 聚乙烯醇之皂化數目太高時，聚乙烯醇中之探針介質溶解 度減低而其黏度會增加，因此在底物上難以提供探針介質 。爲了避開此類問題，可降低聚乙烯醇濃度，但減低濃度 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -*]2 - 1326769 A7 B7 五、發明説明（9 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 亦會降低探針之穩定性、墨點形成性質以及吸濕性質，因 此須要適當的選擇聚乙烯醇及調整其濃度。探針介質中聚 乙烯醇之濃度較佳者宜調至0.001至lwt%。尤其宜調至 0.01至0.2 wt%。當探針介質中聚乙烯醇之濃度落於此範圍 內時’宜降低聚乙烯醇之聚合程度及增加其皂化數目。聚 乙烯醇較佳的聚合及皂化數Η，例如聚合之程度爲200至 1 700且皂化數目爲87至99莫耳％。 此類聚乙烯醇可先溶解然後與探針介質混合。可使用 有機溶劑例如乙醇以及二甲（基）亞颯（DMSO)溶解聚乙烯醇 ，但就溶解度考量時則以水及乙醇爲較佳。聚乙烯醇可與 水混合然後加熱快速溶解不溶的內含物。較佳者，與探針 介質混合之後過濾溶解之聚乙烯醇以去除不溶的內含物》 當與探針混合時就探針之穩定性考量，將依此製備的聚乙 烯醇調至酸鹼度6.0至酸鹼度9.0，尤其是酸鹼度7.0至酸 驗度8.0。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 包含探針及在底物上固定探針之物質之探針介質的介 質，較佳者內含水。介質內之成分除了水之外可包括：乙 二醇、硫雙乙醇、甘油、異丙醇、乙醇等。特定之介質實 施例爲包含 70至 95wt%水、0.1至3%硫雙乙醇、5至 30wt%異丙醇之介質。更佳者，介質包含80至90wt%水、1 至2.5%硫雙乙醇、1〇至20wt%異丙醇。 高沸點溶劑之實施例包括：乙二醇 '丙二醇、三乙二 醇、二乙二醇、二丙二醇以及硫雙乙醇。在此類溶劑中， 以硫雙乙醇及二丙二醇爲較佳，因爲彼爲常用之材料以及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -13 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1326769 A7 ______B7 五、發明説明（10 ) 爲適當的墨點介質。以乙二醇爲底質的高沸點有機溶劑是 高度黏性的溶劑，因此混合此類溶劑時難以計量。據此， 較佳者係先溶於低黏度溶劑中，例如異丙醇。醇溶劑（除了 異丙醇）、水及其類似者亦可作爲低黏度溶劑在此目的下進 行混合。當在底物上提供探針介質時，較佳者宜調整所加 入之高沸點溶劑使其產生適當的墨點形成性質、吸濕性質 、乾燥性質'乾燥條件。 介質之特定實施例包含70至Mwt%水、0.1至3wt%硫 雙乙醇、5至30wt%異丙醇、0.001至lwt%聚乙烯醇。更佳 的介質包含80至90wt%水、1至2.5wt%硫雙乙醇、10至 20wt%異丙醇、0.01至〇.2wt%聚乙烯醇。 進一步的，探針介質可包含探針固定型物質，其可幫 助探針有效地固定於底物。固定探針之物質的實施例包括 :引子、偶合劑、密封劑、表面處理劑、相互結合偶合劑 及橋聯劑的物質、相互結合偶合劑及雙功能劑的物質。尤 其是就探針在底物上之固定性考量時，較佳者介質中物質 之含量宜調至例如0.05至50000微莫耳/升，尤其是1〇至 5〇〇微莫耳/升》此類物質可含有鍵結於探針之官能基或探 針之官能基，其實施例包括：環氧基（CHOCH2)基團、胺基 (NH2)基團、氫硫基（SH)基團、順丁烯二酸醯亞胺基團、氯 丙基（C3H6C1)基團、異氰酸酯（NCO)基團。考量到與探針結 合時，尤佳的探針官能基是胺基（NH2)基團、羰基（COOH)基 團、氫硫基（SH)基團、羥基（OH)基團，而可鍵結於探針之 較佳官能基爲：環氧基團'順丁烯二酸醯亞胺基團以及氯 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（2丨0 X 297公釐） -14- ----------.--„---1T---- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1326769 A7 ____B7 五、發明説明（11 ) 丙基團。此類將探針固定於底物之物質可爲帶有固定於底 物的官能基之物質，此官能基之實施例包括：烷氧基矽烷 基（SiOR)基團、矽醇基（SiOH)基團以及烷氧基（〇R)基團。 考慮固定於底物上之簡易性，尤其是以烷氧基矽烷基 (SiOR)基團及矽醇基（SiOH)基團爲較佳。水解烷基矽烷基 團可形成矽醇基團。探針與在底物上固定探針之物質可在 介質中經由反應相互鍵結，較佳者經由官能基之間的化學 反應以形成共價鍵。 爲了混合探針介質與水溶性聚合物材料，先製備預定 濃度的水溶性聚合物材料溶液，其中水溶性聚合物材料係 完全地溶解。將依此製備的水溶性的聚合物材料溶液稱重 並混合而使其濃度達預定的濃度。特定言之，製備該水溶 性聚合材料溶液時係混合聚乙烯醇粉末與純水至〇. 5至 5 wt%之濃度。將混合溶液加熱以溶解聚乙烯醇，然後過濾 去除不溶的內含物以及雜質。依此製備水溶性聚合物的水 溶液。水溶性聚合物水溶液宜與探針介質混合而使其在探 針介質中之濃度爲0.01至0.2wt%。 可用各種方法加入探針介質。第一種方法包含先將探 針與在可鍵結探針之位點上及在可鍵結底物之位點上帶有 官能基之物質混合，然後添加預定量的介質，即溶劑例如 水或有機溶劑，以及混合溶液。若須要，可調整混合物之 溫度並於預定的時間之後重覆混合加入介質。最後，在溶 液中添加未加入或加入補足之化合物而使溶液達成預定的 組成物，從而製備探針介質。在探針及物質之混合步驟中 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -15 - 壯衣^ —- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁j -訂 ΦΜ. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1326769 A7 _B7_ 五、發明説明（12 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ，混合可啓動反應，因此在混合步驟宜依需要調整溫度、 時間、酸鹼度等。在以混合探針及物質啓動反應的例子中 ，彼可先行混合，以使探針與物質之間的反應充分進行。 進一步的，較佳者亦可調整混合以促進探針及物質充分結 合。在溶液中加入或混合包含探針及物質的介質混合物時 ，溶液之一部份或所有各成份，例如水及有機溶劑，可依 序逐滴加入以進行混合及調整，或溶液之一部份或所有成 份，例如水以及有機溶劑，可先混合再將混合物逐滴加入 以進行混合及調整。在探針及物質相互反應並加入溶劑進 一步的促進反應的案例中，較佳之次序、間隔及加入條件 可視加入之介質成份不同而調整。第二種方法（僅可用於當 探針、可鍵結於探針之位點官能基及可鍵結於底物之位點 官能基內含不同物質）包含先混合具有可鍵結於探針位點官 能基之物質和任何一個探針或具有可鍵結於底物位點官能 基之物質與包含部份或全部介質（例如水以及有機溶劑）的溶 液，再混合及加入另一種。此方法較適用在探針或物質難 於混合或溶於溶劑的案例，因爲可調整混合及溶解條件， 同時亦較適用於所有一起混合下會產生除了所要求的反應 以外之影響的案例。尤其是，當物質爲矽烷偶合劑且可鍵 結於探針之官能基在混合及/或溶於溶液時爲穩定的情況較 佳，因爲先混合及溶解物質能夠形成足量的矽醇基團。第 三種方法包含分別將探針、具有可鍵結於探針位點之官能 基及可鍵結於底物之位點官能基的物質、以及構成溶液之 部份或全部成份稱重，全部置於容器以及混合一段時間。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16 - 1326769 A7 B7 五、發明説明（13 ) 此方法可用於探針、物質及溶液之加入次序不限，探針介 質性質將不改變之案例。此爲較佳的方法係因爲混合程序 很簡單。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 此加入水溶性聚合物材料至探針介質之程序並無限制 但宜在其他介質與探針混合之後的最後步驟進行。 加入並混合高沸點溶劑至探針介質之方法宜先進行高 沸點溶劑之稱量而使其濃度達成預定値，然後加入及混合 探針介質。 此加入及混合高沸點溶劑至探針介質之程序並無限制 但宜在其他介質以及探針混合之後的最後步驟進行》 如此得到的探針介質宜用以偵測目標物質。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 製備具有固定型探針之底物時係將探針介質點在底物 上。就偵測設備及常用材料之利用率考量，固定探針之底 物並無限制但以玻璃或石英底物材料爲較佳。特佳者爲載 玻片玻璃底物，其大小爲1英吋X3英吋，就探針之固定性 質考量，較佳者係由不含鹼之載玻片玻璃底物形成，其係 爲不含有鹼成分或石英玻璃材料。底物形狀並無限制，例 如形成底物時不論偵測目標物質之方法但以底物條件的形 式爲宜，因爲此爲常用的形式並不取決於偵測方法及裝置 。進一步的，底物須具有高度光滑的表面。 固定探針之底物的表面宜淸潔以均勻而穩當地在底物 上固定探針。底物在固定探針之前須經淸洗以確保表面充 分淸潔。淸洗表面的各種方法爲習知的方法，包括用水淸 洗、用藥劑溶液淸洗、用電漿淸洗、用UV臭氧淸洗。適當 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -17- 1326769 A7 B7 五、發明説明Ο ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 者係用藥劑溶液淸洗，其可容易及均勻地進行。例如，適 用的方法包含用預定濃度的氫氧化鈉水溶液淸洗底物表面 並去除附著在底物上的污物。特定言之，製備加熱至約50 °C1莫耳/升之氫氧化鈉水溶液以及在水溶液中擦拭底物表 面或在用水溶液沖洗時刷洗以穩定地移除附著在底物上的 污物。於移除污物之後，用水充分洗去殘留的氫氧化鈉。 最後，用例如N2吹以移除水，。如此可得到均勻而穩定固 定在底物上之探針介質。 在探針介質不含有固定探針之物質的案例中，宜使用 探針固定處理過的底物。特定言之，其爲經充分淸洗然後 經矽烷偶合劑處理的底物。例如，將已淸潔的底物浸入由 矽烷偶合劑與水及乙醇混合溶劑充分混合所形成的溶液， 接著用水淸洗去除過量的矽烷偶合劑並乾燥》 此外，將矽烷偶合劑加入乙醇中並充分混合溶液以形 成矽烷偶合劑溶液並將已淸潔的底物表面用旋轉塗覆法塗 覆此溶液。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印裝 有一些習知的方法可在底物上點探針介質。特定言之 ，爲習知的針擊法、噴墨方法、及針與戒法。在此類方法 之中’噴墨方法爲較佳的墨點方法，由於其能夠進行高密 度及精確的點墨》 只要探針及探針介質中固定探針在底物上之物質實質 上不受探針介質從噴墨頭釋出之影響足探針介質符合常用 噴墨頭釋放至底物之介質組成物的條件，則用噴墨方法進 行墨點時探針介質內含之成分並無限制。例如，當噴墨頭 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -18 - 1326769 A7 B7 五、發明説明(15 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 是具有提供介質熱能以達成釋出機制之氣泡式噴墨頭，則 內含甘油、硫雙乙醇、異丙醇液體是探針介質較佳的成份 。更明確的說’內含5至1 〇wt%甘油、5至1 Owt%硫雙乙醇 的液體是較佳的探針介質液體。 當噴墨頭是使用壓電式元件釋放介質的壓電式噴墨頭 時’內含乙二醇及異丙醇之液體對探針介質而言是較佳的 成份。更明確的說，內含5至10wt°/。乙二醇、0.5至2wt0/〇 異丙醇的液體是較佳的探針介質液體。 當從噴墨頭釋放依此得到之探針介質以便將介質黏附 在底物上時，所形成的墨點是圓形墨點並將在釋放後保持 在此區域之內。據此，即使在探針介質進行高密度點墨的 案例中，可有效地抑制相鄰墨點之間的聯繫。進一步的， 內含水溶性聚合物以及高沸點溶劑之探針介質能夠使探針 維持完整，且即使在乾燥墨點之條件下（探針介質於乾燥之 後點墨）能偵測目標物質。進一步的，於乾燥之後可輕易地 觀察到墨點狀態並可証實點墨成功地形成墨點。同時，本 發明中探針介質之性質並不受限於上述之說明》 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 探針以及底物宜經由介於探針及底物間之反應相互結 合。經由該反應探針可牢固的固定於底物。據此，探針可 固定至底物且可在預定的位置上形成探針墨點。水溶性聚 合物材料對探針固定在底物上不會有不利地影響，在探針 介質中加入水溶性聚合物材料可於點墨之後延緩墨點乾燥 ’從而使反應得以充分進行。 爲了將內含探針的探針介質固定於底物上之預定位置 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2】0X297公釐） -19 - 1326769 A7 ____B7_ 五、發明説明（16 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 並穩當地預防來自相鄰墨點探針的污染及將探針牢固的固 定於底物’可使用有效的方法，該方法係使用鍵結於位點（ 可鍵結底物並經由化學效應鍵結於底物）的物質。該化學效 應包括各種鍵結及例如，共價鍵、離子鍵等。爲了將探針 牢固地固定於底物，以共價鍵爲較佳。 較佳組合的實施例包括在物質面上之矽醇基（SiOH)基 團及在底物面上之羥基（0H)基團的組合。當用點墨法提供 底物時，探針介質內含之底物的矽醇基團可與底物上之羥 基反應以固定物質。較佳底物的特定實施例包括··在底物 上帶有羥基之玻璃材料及石英底物材料。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 亦爲較佳者，探針及可鍵結於探針之位點可經由化學 效應相互鍵結。作爲化學效應之鍵結的實施例包括：共價 鍵及離子鍵。爲了牢固的將探針固定至底物，以共價鍵爲 較佳。結果，探針可固定於底物並可在設計之位置上形成 探針墨點。尤其是，製備的探針介質包含：具有胺基官能 基之探針以及在可鍵結於探針的位點具有環氧基團以及在 可鍵結於底物的位點具有矽醇基團之物質以及混合甘油、 硫雙乙醇以及異丙醇的探針溶液。當此溶液用噴墨頭點到 具有羥基的底物上時，探針溶液可在底物上形成穩定大小 的墨點。如此探針可固定在設計的位置上。亦可製備另一 種探針介質，其包含：具有胺基官能基之探針以及在可鍵 結於探針的位點具有異氰酸酯基團以及在可鍵結於底物的 位點具有矽醇基團之物質以及混合甘油、硫雙乙醇以及異 丙醇及其類似者的探針溶液。當此溶液用噴墨頭點到具有 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS > A4規格（210X297公釐） _ 2〇 - 1326769 A7 B7 五、發明説明（17 ) 羥基的底物上時，探針溶液可在底物上形成穩定大小的墨 點。如此探針可固定在設計的位置上。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 探針介質中宜加入水溶性聚合物材料聚乙烯醇（PVA)。 更佳者，彼須要完全地溶解。在探針介質中加入水溶性聚 合物材料有利於觀察墨點在底物上之狀態並延緩點墨之後 探針介質在墨點上乾燥，從而使探針介質與底物之反應更 穩當並確保固定作用。進一步的，就以點墨方法製備的固 定型探針其底物之儲存條件考量，即使點墨法所形成的探 針介質墨點乾燥，彼仍可促使探針介質較有效且穩定地點 上偵測目標物質。 例如，調整內含20聚合體探針之探針介質而使探針之 濃度爲8微莫耳/升。使用熱泡噴射_列印機（商品名：BJF85 0 ;Canon Inc.之產品，轉換型，可在平板上列印），探針介 質可在固相及熱泡噴射頭噴嘴間之距離設定爲至約1.2至 1.5毫米之間釋放，自噴嘴（釋出量約4微微升）釋出之探針 介質可在底物上形成直徑約50至80微米之墨點，當使用 放大鏡進行目測時亦無法觀察到源自液體衝擊至固相表面 產生之墨點（以下稱爲"衛星墨點"）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用顯微的傅里葉變換紅外線光譜儀（微觀的FT-IR)分析 含有固定型探針之底物（由不含有水溶性聚合物材料之固定 型探針介質所形成）。在未點墨之位點上僅偵測到底物之 Si-Ο鍵吸收峰而無其它實質吸收峰，然而能觀察到代表底 物的寬廣吸收峰以及探針介質中固定探針之物質的-CH2-鍵 吸收峰，雖然峰値非常低。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -21 - 1326769 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（18 ) 用熱釋放分光測定法（TDS)分析含固定型探針之底物 在分析之前，從底物上切出內含墨點位點的底物片段（7毫 米X 7毫米）及由底物上未點墨之邊界區域切除之底物片段 (7毫米X 7毫米）並進行比較。溫度設定在25至5〇〇。(：並 程式化速率（溫度上升速率）爲5 °C/分鐘。用消除物質法比 較二底物，結果在1 5 0 °C下在墨點位點上可偵測到許多歸因 於探針及固定探針在底物上之物質的質量吸收峰（例如CH4 以及CH3OH等）。從此類事實真相可證實探針介質僅點在 預定的墨點位點上’而墨點以外之區域並無探針介質或介 質內含之物質。 用時間飛躍法二次離子質譜儀（TOF-SIMS)分析具固定 型探針之底物。爲了分析位點，在墨點形成位點附近進行 表面掃描並比較。結果，未點墨的區域與墨點之間並未偵 測到源自脫氧核糖核酸之P〇2-以及P03-離子，而在可鍵結 於探針的位點上亦無源自官能基之二級離子。 本發明爲了使用此種含固定型探針之底物改進目標物 質及其類似者之偵測準確度（S/N比），可進行阻塞處理，以 便在將探針固定於固相表面之後此底物之非結合的部份不 會結合於目標物質及其類似者。 可進行阻塞，例如浸塗底物於2%牛血淸白蛋白水溶液 中約二小時。然而，牛血淸白蛋白水溶液對於預防目標物 質吸收於底物探針固定位點以外之區域有較佳的效應。可 依需要進行此阻塞步驟，例如當固定型探針底物上各墨點 上之樣品有限及樣品實質上不黏附於非墨點部份，則不須 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -22 - ----------.--Ί--11-----9m. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1326769 A7 ______B7_ 五、發明説明（19 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 要進行阻塞。樣品黏附至非墨點部份之程度取決於底物之 型態。尤其是，在底物是玻璃或石英的案例中不須要進行 阻塞處理。然而’當探針介質中不含探針固定型物質且底 物已進行探針固定處理時，宜進行阻塞處理。 依此製備的探針固定型底物可依據（例如）其用途而具有 許多內含相同探針或内含不同探針的墨點。其類型、數量 和探針排列可依據需要而變化。依此類方法製備成高密度 配置探針’然後具有此种固定型探針（該探針係）之底物即可 用以偵測目標物質或測定目標核苷酸之序列等。例如，若 其係用以偵測樣品內一種習知物質的單股核苷酸及核苷酸 序列時’可使用具有互補於目標物質核苷酸序列之單股核 酸作爲探針而製備成在固相上含許多包括上述探針之墨點 的固定型探針之底物，然後在含固定型探針之底物之各墨 點上施加樣品並置於可使目標底物單股核酸與探針雜交的 條件下，然後不論雜交是否進行各墨點均用習見的方法進 行偵測，包括螢光偵測，從而偵測樣品中之目標物質。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 當其係用於確認目標物質之核苷酸序列（單股的核酸）時 ，可設定許多目標的候選核苷酸序列，並將互補於各核苷 酸序列的單股核酸點在底物上作爲探針。然後在各墨點上 施加樣品並將底物置於可使目標底物的單股核酸與探針雜 交的條件下，然後不論是否雜進行交，用習見的方法偵測 各墨點，包括螢光，從而具體指出目標物質之核苷酸序列（ 單股核酸）。本發明含其它固定型探針底物用途之實施例， 包括：篩選脫氧核糖核酸結合蛋白質可識別之特定的核苷 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） -23- 1326769 A7 ____B7 五、發明説明P ) 酸序列，或篩選具有結合至脫氧核糖核酸之性質的化學物 質。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 探針介質可包含探針及上述將探針固定於底物之物質 ，但此組成的探針及將探針固定於底物的物質係分別內含 於容器中，且僅在已固定於底物時才混合。 探針之實施例包括：單股核酸探針、單鏈脫氧核糖核 酸探針、單股RNA探針以及單股RNA探針。就探針介質 中核酸探針之穩定性而言，介質中探針之存在量宜調至（例 如2聚合體至5 00聚合體，尤其是2聚合體至80聚合體之 核酸探針）〇.〇5至500微莫耳/升，尤其是〇.5至50微莫耳 /升之水準。此類探針可帶有官能基，其實施例包括：胺基 (NH2)基團、異氰酸酯（NCO)基團、氫硫基（SH)基團以及羥 基（OH)基團。就合成探針官能基之簡易性而言，.較佳的官 能基爲胺基，就探針官能基之反應性而言，較佳的官能基 爲氣硫基團。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 較佳之容器爲可密封式容器以便其它雜質不會混入儲 存探針之容器中，且應具有可打開的特性，而使內含物於 混合固定時可立即打開。容器開口並無特別的限制。當儲 存於容器時探針之狀態並無特別的限制，可爲液體或粉末 。當官能基是氫硫基團及其類似者時，就探針之穩定性而 言’宜用冷凍乾燥方法及其類似之方法轉換成粉末。儲存 探針宜冷藏以確保探針之穩定性，但儲存條件可取決於貯 藏、探針類型及探針官能基而變化。據此，探針可儲存於 容器然後於固定至底物時進行混合。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（2丨0X297公釐） _ 24 _ 1326769 A7 _ B7_ 五、發明説明) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在可鍵結於探針位點以及可鍵結於底物位點具有官能 基之物質的實施例包括：引子、偶合劑、密封劑、表面處 理劑等。可鍵結於底物之官能基包括：環氧基（choch2)基 團、胺基（NH2)基團、氫硫基（SH)基團、順丁烯二酸醯亞胺 基團、異氰酸酯（NCO)基團、氯丙基（C3H6C1)基團等。就固 定至底物之簡易性而言，可鍵結於底物之尤佳官能基包括 :環氧基團、順丁烯二酸醯亞胺基團、異氰酸酯基團、氯 丙基團。在可鍵結於底物之位點官能基包括：烷氧基矽烷 基（SiOR)基團、矽醇基（SiOH)基團以及烷氧基（OR)基團。 就固定至底物之簡易性及反應性而言，較佳者爲烷氧基矽 烷基（SiOR)基團或矽醇基（SiOH)基團。水解烷氧基矽烷基 團可形成矽醇基團。探針以及在底物上固定探針之物質在 介質中可經由反應，較佳者經由介於可相互鍵結之官能基 之間的化學反應，以形成共價鍵。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 當儲存具有可鍵結於探針位點官能基以及可鍵結於底 物位點官能基之物質於容器時，容器宜爲可密封的容器以 便其它雜質不會混入且物質不會因蒸發而減少，且在使用 時應能輕易打開以便其內含物進行混合固定。容器開口並 無特別的限制。當儲存於容器時探針之狀態並無特別的限 制，可爲液體或粉末。當具有可鍵結於探針位點官能基以 及可鍵結於底物位點官能基之物質內含於不同之物質時， 各該物質可儲存於同一容器，或可儲存於不同容器，而無 任何限制，但宜貯存於適於形成探針之介質。物質之狀態 並無特別的限制以及可爲液體或可爲粉末。其可爲水解之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 25 _ 1326769 A7 B7 五、發明説明p ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 後形成矽醇基團（爲固定至底物之官能基的一個實施例）之溶 液。可儲存於周圍溫度以確保物質之穩定性，但可取決於 儲存方法等而變化。尤其是當使用水解的溶液時，溫度宜 維持固定而不增加。進一步的，於水解期間或之後宜視將 探針固定於底物之物質的官能基不同調整酸鹼度。 當探針固定於底物時，可視需要加水並混合探針和具 有可鍵結於探針位點及可鍵結於底物之位點官能基的物質 。進一步的，能夠充分混合以形成探針介質的物質（例如水 或類似的溶劑）可置於另一容器中並於製備探針介質時進行 混合。 水溶性聚合物材料之實施例包括：聚乙烯醇（PVA)、聚 乙烯基吡咯烷酮（PVP)、包經（paogen)、羧甲基纖維素 (CMC)、羥乙基纖維素（HEC)、右旋聚醣以及普魯蘭多糖。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在此類材料之中，以聚乙烯醇（PVA)以及聚乙烯基吡咯 烷酮（PVP)爲較佳，因爲彼爲常用之材料且能穩定探針。當 在使用聚乙烯醇（PVA)之案例中宜依需要調整聚合度及皂化 數目。調整聚合度及皂化數目可調整探針介質中聚乙烯醇 之溶解度和探針介質之黏度。特定言之，只要彼不會在施 加探針介質於底物上時引起問題，即可調整聚合度及皂化 數目以達成適當的探針穩定性。然而，當聚乙烯醇之聚合 度或皂化數目太高，聚乙烯醇在探針介質中之溶解度會降 低而其黏度會增加，因此當製備探針介質時探針介質變得 難於立即溶解。爲了避開此類問題，可降低聚乙烯醇之濃 度，但減低濃度亦會降低探針之穩定性、墨點形成之性質 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26 - 1326769 A 7 B7 五、發明説明P ) 以及吸濕性質，因此須要選擇適當的聚乙烯醇以及調整濃 度。當儲存於容器中時，在探針介質中聚乙烯醇之濃度宜 調至 0.001 至 1 wt%。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 當難於溶解彼時，可預先溶解然後再與探針介質混合 。可使用有機溶劑例如乙醇以及二甲（基）亞颯（DM SO)溶解 介質，但就溶解度而言，仍以水以及乙醇爲宜。聚乙烯醇 可與水混合然後加熱以快速地溶解不溶的內含物。較佳者 ，宜於過濾溶解之聚乙烯醇去除不溶的內含物之後再與探 針介質混合。當與探針混合時就探針穩定性而言，宜將依 此製備的聚乙烯醇調至酸鹼度6.0至酸鹼度9.0，尤其是酸 鹼度7.0至酸鹼度8.0。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 較佳之容器爲可密封式容器，以便其它雜質不會混入 儲存探針之容器中，且水溶性聚合物材料將不會因蒸發而 降低，並應具可打開的特性而使內含物於混合固定時可立 即打開。可儲存於周圍溫度以確保物質之穩定性，但可取 決於儲存方法等而變化。尤其是當使用水溶性聚合物材料 的溶液時，宜維持溫度不使其昇高。進一步的，於水解期 間或之後宜視探針固定於底物之物質的官能基不同而調整 酸鹼度。 高沸點溶劑之實施例包括：乙二醇、丙二醇、三乙二 醇、二乙二醇、二丙二醇以及硫雙乙醇。在此類溶劑之中 ，以硫雙乙醇以及二丙二醇爲較佳，因爲彼爲常用之材料 且爲適當的墨點介質。當加入高沸點溶劑時，探針介質宜 具有適當的墨點形成性質、吸濕性質以及乾燥性質。 -27 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1326769 A7 __B7 五、發明説明f4 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 較佳之容器爲可密封式容器，故其它雜質將不會混入 儲存探針之容器中，且高沸點溶劑將不會因蒸發而降低並 應具可打開的特性而使內含物於混合固定時可立即打開。 可儲存於周圍溫度以確保物質之穩定性，但可取決於儲存 方法等而變化。尤其是宜維持溫度以不使其昇高。進一步 的，於水解期間或之後宜取決於將探針固定於底物之物質 的官能基而調整酸鹼度。 當探針固定於底物時，可依需要加入水並混合探針以 及具有可鍵結於探針位點及可鍵結於底物之位點官能基的 物質。進一步的，能夠充分混合以形成探針介質的物質（例 如水或類似的溶劑）可置於另一容器並於製備探針介質時進 行混合》 本發明將參照以下之實施例作進一步的詳細描述。 [實施例1] (1) 合成探針 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 使用能獨特的結合於目標材料的單鏈脫氧核糖核酸探 針作爲探針。使用脫氧核糖核酸自動合成儀合成序列確認 號碼：1之單鏈脫氧核糖核酸，且將胺基經磷酸鹽基團及己 橋結合至單股的脫氧核糖核酸之5'端羥基以製備應用於下 列實驗之式（1)十八烷醯體的寡聚物。 5' H2N-(CH2)6-〇-p〇2-〇-ACTGGCCGTCGTTTTACA3' (1) (2) 具有能結合於探針及能結合於底物之位點官能基的材料（ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） -28 - 1326769 A7 _______B7_ 五、發明説明p ) 探針黏合劑） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 製備具有能結合於探針以及能結合於底物之位點官能 基的材料時，係在室溫下混合5 00微莫耳/升之內含具有環 氧基團之矽烷化合物（7* -縮水甘油氧基丙基三甲氧基矽烷） 的矽烷偶合劑（商品名：KBM403，由 The Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd ·製作）30分鐘以製備探針黏合劑溶液。 製備的探針黏合劑溶液係可用於以下之實驗。 (3)製備探針介質 將式（1)之單鏈脫氧核糖核酸探針溶於TE溶液（10毫莫 耳濃度Tris-HCl(酸鹼度8)/1毫莫耳濃度乙二胺四乙酸水溶 液）’最終濃度約爲40微莫耳/升，從而製備單鏈脫氧核糖 核酸探針之溶液（精確的濃度係計算自吸收強度）。 然後，將水溶性的聚合物材料聚乙烯醇（PVA)溶於純水 中而使其濃度爲〇.5wt%。爲了完全溶解聚乙烯醇，將生成 的溶液在80°C之熱水浴下混合加熱60分鐘。於確認沒有不 溶的物質存在之後，將溶液過濾以預防點墨時塞住噴嘴， 因而完成PVA溶液之製備。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 製備100微升上述製備的探針溶液，滴入100微升探 針黏合劑溶液並混合5分鐘。於混合之後靜置10分鐘，滴 入7 00微升水純以及1〇〇微升上述製備的PVA溶液並混合 5分鐘》於混合之後，將混合物靜置30分鐘以製備探針介 質。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS 規格（210X297公釐） -29 - 1326769 A7 __B7_ 五、發明説明p ) (4) 淸洗底物 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將1英吋 X 3英吋之玻璃底物（厚度：1.1毫米）置於卡 式盒，並於預先加熱至6 0°C之1莫耳/升之氫氧化鈉溶液中 浸泡1 〇分鐘。其後，將彼用流動的純水充分沖洗以除去滞 留在玻璃底物及卡式盒之氫氧化鈉。於充分漂洗之後，將 玻璃底物及卡式盒一起浸沒在純水中，並用超音波淸洗10 分鐘。以超音波淸洗後，將彼用流動的純水充分沖洗去除 滯留在玻璃底物及卡式盒之顆粒。用氣體逐一吹乾沖洗過 的玻璃底物。檢查底物之淸潔度，測量在底物上純水之接 觸角度。結果顯示每個底物位點之接觸角度均約5° 。 (5) 探針介質點墨 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將步驟（3)製備的探針介質施用於熱泡噴射列印機（商品 名：BJF850; 由Canon Inc.製作）之油墨槽並置入熱泡噴 射頭。本發明使用之熱泡噴射列印機（商品名：BJF8 50 ;由 Canon Inc.製作）經過修改，可在平板上印刷。然後將步驟 (4)製備的玻璃底物置入此列印機，將探針介質點在玻璃底 物上。熱泡噴射液體釋放的表面、頭部以及玻璃底物液體 滯留表面間之距離介於1.2至1.5毫米》於完成點墨之後， 用顯微鏡觀察玻璃底物，結果發現在玻璃底物之表面形成 矩陣形之墨點排列。此外，測定墨點形成位點外緣之純水 接觸角。結果顯示每個底物位點之接觸角度約5° 。此結果 發現除了墨點形成位點之外並無探針介質及其類似者引起 的污染。於進行點墨之後將玻璃板置於乾燥器。用此方法 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -3〇 - 1326769 A 7 B7 五、發明説明P ) 製作固定探針之底物。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (6) 阻塞處理 將步驟（5)製作的用1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷 酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)充分淸洗具固定探針之底物以溼 化含固定型探針之底物的表面，從而可均勻地進行阻塞處 理。然後將玻璃底物浸泡在2%牛血淸白蛋白水溶液中’然 後靜置2小時以進行阻塞處理。 (7) 雜交處理 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具有互補至描述於步驟（1)之式（1)的單鏈脫氧核糖核酸 探針鹼基序列的單鏈脫氧核糖核酸係用脫氧核糖核酸自動 合成儀合成以取得5'端結合若丹明之標記的單股脫氧核糖 核酸探針。將此標記的單股脫氧核糖核酸溶於1莫耳濃度 NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)，於步驟 (6)得到之經阻塞處理的含固定探針之底物係浸泡在溶液， 並在室溫（2 5 °C )下雜交處理3小時。此後，探針陣列用1莫 耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)淸 洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖核酸探針。 然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾固定探針之 底物。然後使用營光掃描器（商品名：GenePix 4000B由 Axon Instruments，Inc.製作）評估在底物上含固定探針之墨 點的螢光強度》評估螢光強度時，雷射功率設定在100%， PMT設定在400 V。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -31 - 1326769 A7 B7 五、發明説明P ) (8)結果 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 步驟（7)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（1)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在532 nm上之螢光強度爲1 4830，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核 糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度 爲614。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似 圓形，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似 。此外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式 的墨點之間隔約200微米。 [實施例2] (1)合成探針 上述實施例1之方法製備的單鏈脫氧核糖核酸探針可 應用於下列實驗。 (2)具有能結合於探針以及能結合於底物之位點官能基的材 料（探針黏合劑） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 爲了製備具有能結合於探針位點以及結合於底物位點 官能基之材料，須準備具有環氧基團內含矽烷化合物（r-縮 水甘油氧基丙基三甲氧基矽烷）之矽烷偶合劑（商品名： KBM-403，由 The Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd·製作）。此 砂烷偶合劑可用於下列實驗。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -32 - 1326769 A 7 B7 五、發明説明f9 ) (3) 製備探針介質 製備單鏈脫氧核糖核酸探針溶液及PVA溶液之方法如 上述之實施例1。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 製備10亳升上述製備的探針溶液，滴入11微升上述 矽烷偶合劑溶液並混合20分鐘。於混合之後靜置30分鐘 ，重覆滴入5毫升純水以及混合，總共滴入80毫升純水。 然後，滴入10毫升上述製備的PVA溶液並混合10分鐘。 於混合之後，將混合物靜置3 0分鐘以製備探針介質（精確 濃度係計算自吸收強度）。 (4) 淸洗底物 用上述實施例1之方法淸洗底物製備玻璃底物 (5) 點墨探針介質 將步驟（3)製備的探針介質用上述實施例1之方法點墨 以製作固定探針之底物。於完成點墨之後，用顯微鏡觀察 玻璃底物，結果發現在玻璃底物之表面形成矩陣形之墨點 排列。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於進行點墨之後將玻璃板置於乾燥器。用此方法製作 固定探針之底物。 (6) 阻塞處理 用上述之實施例1之方法進行阻塞處理。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -33 - 1326769 經濟部智毪財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明<p〇 ) (7)雜交處理 用上述之實施例1之方法進行雜交處理。此後，探針 陣列用1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 鹼度7.0)淸洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖 核酸探針。然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾 有固定探針之底物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon Instruments, Inc.製作）評估在底物上含固定 探針之墨點的螢光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定 在 100%，PMT 設定在 400 V。. (8 )結果 步驟（7)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（1)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在53 2 nm上之螢光強度爲23400，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核 糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度 爲672。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似 圓形’且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似 。此外’相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式 的墨點之間隔約200微米》 [實施例3] (1)合成探針 使用能獨特的結合於目標材料的單鏈脫氧核糖核酸探 針作爲探針。使用脫氧核糖核酸自動合成儀合成序列確認 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）-34 - ---------丨I-r ——IT----- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 1326769 A7 ____B7_ 五、發明説明β ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 號碼：1、序列確認號碼：2、序列確認號碼：3以及序列確 認號碼：4的單股核酸。在序列確認號碼：2、3以及4的 單股脫氧核糖核酸中，以改變實施例1之序列確認號碼：！ 單鏈脫氧核糖核酸之一個鹼基者定義爲序列確認號碼：2, 改變三個者定義爲序列確認號碼：3，改變六個鹼基者定義 爲序列確認號碼：4序列。以磷酸鹽基團和己橋結合序列確 認號碼：1至4各單股的脫氧核糖核酸5 1端羥基之胺基後， 得到式（1)、（2)、（3)以及（4)之十八烷醯化寡聚物，並用於 下列實驗。 5' H2N-(CH2)6O-P〇2-〇-ACTGGCCGTTGTTTTACA3' (2) 5' H2N-(CH2)6-0-P02-0-ACTGGCCGCTTTTTTACA3· (3) 5' H2N-(CH2)6-〇-P〇2-〇-ACTGGCATCTTGTTTACA3, (4) (2) 具有能結合於探針以及能結合於底物之位點官能基的材 料（探針黏合劑） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 爲了製備具有能結合於探針位點以及結合於底物位點 官能基之材料，須準備500微莫耳/升內含具有環氧基團之 矽烷化合物（r -縮水甘油氧基丙基三甲氧基矽烷）的矽烷偶 合劑（商品名：KBM-403，由 The Shin-Etsu Chemical Co.， Ltd.製作）水溶液。此矽烷偶合劑可用於下列實驗。 (3) 製備探針介質 用上述實施例2步驟（3)之方法以序列確認號碼：1至4 之單鏈脫氧核糖核酸製備四種類型之探針介質（精確的濃度 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 35 - 1326769 A7 B7 五、發明説明P ) 係計算自吸收強度）。 (4) 淸洗底物 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 用上述實施例1之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (5) 點墨探針介質 將步驟（3)製備的四種探針介質分別施用於四個熱泡噴 射列印機（商品名：BJF850 ; 由Canon Inc.製作）之油墨槽 並將各油墨槽置入熱泡噴射頭。本發明使用之熱泡噴射列 印機（商品名：BJF850 ; 由Canon Inc.製作）經過修改， 可在平板上印刷。然後將步驟（4)製備的玻璃底物置入此列 印機，將探針介質點在玻璃底物上。此外，各區域之墨點 模式與實施例1相同。熱泡噴射液體釋放的表面、頭部以 及玻璃底物液體滯留表面間之距離介於1.2至1.5毫米。於 完成點墨之後，用顯微鏡觀察玻璃底物，結果發現在玻璃 底物之表面形成矩陣形之墨點排列。於進行點墨之後將玻 璃板置於乾燥器。用此方法製作固定探針之底物。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (6) 阻塞處理 用上述之實施例1之方法進行阻塞處理。 (7) 雜交處理 用上述之實施例1之方法進行雜交處理。此後，探針 陣列用1莫耳濃度NaCl/5〇毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -36 - 1326769 A7 B7 五、發明説明f3 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 鹼度7.0)淸洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖 核酸探針。然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾 探針固定底物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon Instruments, Inc.製作）評估在底物上含固定 探針之墨點的螢光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定 在 100°/。，PMT 設定在 400 V » (8 )結果 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 步驟（7)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（1)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在532 nm上之螢光強度爲14380，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。相反的，具有一 個配對錯誤鹼基序列之式（2)脫氧核糖核酸探針墨點，其螢 光強度爲8960。具有三個配對錯誤鹼基序列之式（3)脫氧核 糖核酸探針墨點，其螢光強度爲2032，螢光強度爲完全地 符合之脫氧核糖核酸探針的一半以下，具有六個配對錯誤 鹼基序列之式（4)脫氧核糖核酸探針，則無螢光墨點，對應 至墨點位點的螢光強度爲876。此外，在脫氧核糖核酸探針 墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲637。以螢 光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似圓形，且用 相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似。此外，觀 察到相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式的墨 點之間隔約200微米。從上述之結果可知，完全互補的單 股的脫氧核糖核酸可在DNA陣列底物上獨特的加以偵測。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -37 - 1326769 A7 __ B7 五、發明説明f4 ) [實施例4] (1) 合成探針 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 依上述實施例1之方法製備的單鏈脫氧核糖核酸探針 可應用於下列實驗。 (2) 具有能結合於探針以及能結合於底物之位點官能基的材 料（探針黏合劑） 爲了製備具有能結合於探針位點以及結合於底物位點 官能基之材料，須準備500微莫耳/升內含具有環氧基團之 矽烷化合物（r -縮水甘油氧基丙基三甲氧基矽烷）的矽烷偶 合劑（商品名：KBM-403，由 The Shin-Etsu Chemical Co.， Ltd.製作）水溶液。此矽烷偶合劑可用於下列實驗。 (3) 製備探針介質 製備單鏈脫氧核糖核酸探針溶液之方法如上述之實施 例1 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 製備10亳升上述製備的探針溶液，滴入U微升上述 矽烷偶合劑溶液並混合20分鐘。於混合之後靜置30分鐘 ，重覆滴入5毫升內含7.5wt%甘油、7.5wt%尿素、以及 7.5 wt%硫雙乙醇之溶液並混合，總共滴入90毫升純水。然 後混合10分鐘。於混合之後，將混合物靜置30分鐘以製 備探針介質。 (4) 淸洗底物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -38- 1326769 A7 _ B7 五、發明説明P ) 用上述實施例1之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (5) 點墨探針介質 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁j 將步驟（3)製備的探針介質用上述實施例1之方法點墨 以製作固定探針之底物。於完成點墨之後，用顯微鏡觀察 玻璃底物，結果發現在玻璃底物之表面形成矩陣形之墨點 排列。於進行墨點方法之後將玻璃底物浸泡在裝有1莫耳 濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)之容 器，並與容器共同置入冰箱儲存在低溫下（4°C )。用此方法 製作固定探針之底物。 (6) 阻塞處理 從1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 鹼度7.0)中取出步驟（5)製作的固定探針之底物。然後將玻 璃底物浸泡在2%牛血淸白蛋白水溶液中，然後靜置2小時 以進行阻塞處理。 (7)雜交處理 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用上述之實施例1之方法進行雜交處理。 '此後，探針陣列用1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷 酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)淸洗沖刷去除未與探針核酸雜交 之單鏈脫氧核糖核酸探針。然後用純水移除過量的鹽類， 接著用氮氣吹乾探針固定底物。然後使用螢光掃描器（商品 名· GenePix 4000B 由 Axon Instruments, Inc.製作）評估在 -39 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) a4規格（210X297公釐） 1326769 A7 __ _B7_ 五、發明説明p ) 底物上含固定探針之墨點的螢光強度。評估螢光強度時 雷射功率設定在100%，PMT設定在400 V。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (8)結果 步驟（7)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（1)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在53 2 nm上之螢光強度爲23400，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核 糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度 爲628。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似 圓形，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似 。此外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式 的墨點之間隔約200微米。 [實施例5] (1)合成探針 依上述實施例1之方法製備的單鏈脫氧核糖核酸探針 可應用於下列實驗。 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 (2)具有能結合於探針以及能結合於底物之位點官能基的材 料（探針黏合劑） 製備具有結合於探針以及能結合於底物之位點官能 基的材料時，係在室溫下將500微莫耳/升內含具有氯丙基 團之矽烷化合物（r -氯丙基三甲氧基矽烷）的矽烷偶合劑（商 品名：KBM703，由 The Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd .製作） -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 1326769 A7 B7 五、發明説明P ) 之酸鹼度調整至4.0，其後並攪拌30分鐘以製備成探針固 定劑溶液。製備探針固定劑溶液可用於以下之實驗。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (3) 製備探針介質 製備單鏈脫氧核糖核酸探針溶液之方法如上述之實施 例1。 製備100微升上述製備的探針溶液，滴入100微升探 針固定溶液並混合5分鐘。於混合之後靜置10分鐘，滴入 800微升純水並混合5分鐘。於混合之後，將混合物靜置 30分鐘以製備探針介質。 (4) 淸洗底物 用上述實施例1之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (5) 點墨探針介質 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將步驟（3)製備的探針介質用上述實施例1之方法點墨 以製作固定探針之底物。於完成點墨之後，用顯微鏡觀察 玻璃底物，結果發現在玻璃底物之表面形成矩陣形之墨點 排列。於進行墨點方法之後將玻璃底物浸泡在裝有1莫耳 濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)之容 器，並與容器共同置入冰箱儲存在低溫下（4t)。用此方法 製作固定探針之底物。 (6) 阻塞處理 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2)0X297公釐） -41 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1326769 A7 B7 五、發明説明P8 ) 用上述之實施例4之方法進行阻塞處理。 (7)雜交處理 用上述之實施例1之方法進行雜交處理。此後，探針 陣列用1莫耳濃度NaCl/5 0毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 鹼度7.0)淸洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖 核酸探針。然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾 探針固定底物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon Instruments, Inc.製作）評估在底物上含固定 探針之墨點的螢光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定 在 100%，PMT 設定在 400 V» (8 )結果 步驟（7)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（1)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在532 nm上之螢光強度爲11320，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核 糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度 爲64 1。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似 圓形，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似 。此外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式 的墨點之間隔約200微米。 [實施例6] (1)合成探針 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) _ 42 - --------φ—^l·-I^—-Ί--iT-----,9.. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1326769 A7 _____B7__ 五、發明説明严） 上述實施例1之方法製備的單鏈脫氧核糖核酸探針可 應用於下列實驗。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (2) 具有能結合於探針以及能結合於底物之位點官能基的材 料（探針黏合劑） 爲了製備具有能結合於探針位點以及結合於底物位點 官能基之材料，須準備內含具有氯丙基團之矽烷化合物（τ-氯丙基三甲氧基矽烷）的矽烷偶合劑（商品名：ΚΒΜ-703，由 The Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.製作）。此矽烷偶合劑可用 於下列實驗。 (3) 製備探針介質 製備單鏈脫氧核糖核酸探針溶液及PVA溶液之方法如 上述之實施例1。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 製備10亳升上述製備的探針溶液，滴入10微升上述 矽烷偶合劑溶液並混合20分鐘。於混合之後靜置30分鐘 ’重覆滴入5毫升純水及混合，總共滴入80毫升純水。然 後，滴入10毫升上述製備的PVA溶液並混合10分鐘。於 混合之後，將混合物靜置30分鐘以製備探針介質。 (4) 淸洗底物 用上述實施例1之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (5) 點墨探針介質 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（2丨〇，乂297公釐） -43 - 1326769 A7 _ _____B7 五、發明説明P ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將步驟（3)製備的探針介質用上述實施例1之方法點墨 以製作固定探針之底物。於完成點墨之後，用顯微鏡觀察 玻璃底物’結果發現在玻璃底物之表面形成矩陣形之墨點 排列。於進行點墨之後將玻璃板置於乾燥器。用此方法製 作固定探針之底物。 (6) 阻塞處理 用上述之實施例1之方法進行阻塞處理。 (7) 雜交處理 用上述之實施例1之方法進行雜交處理。此後，探針 陣列用1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 鹼度7.0)淸洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖 核酸探針。然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾 探針固定底物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon Instruments，Inc.製作）評估在底物上含固定 探針之墨點的螢光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定 在 100%，PMT 設定在 400 V。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (8) 結果 步驟（7)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（1)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在53 2 nm上之螢光強度爲1 5790，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核 糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -44 - 1326769 A 7 B7 五、發明説明θ ) (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲608 »以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似 圓形’且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似 。此外’相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式 的墨點之間隔約200微米。 [實施例7] (1) 合成探針 依上述實施例1之方法製備的式（1)單鏈脫氧核糖核酸 探針可應用於下列實驗。 (2) 具有能結合於探針及能結合於底物之位點官能基的材料（ 探針黏合劑） 製備成的具有能結合於探針位點以及能結合於底物位 點官能基之材料係用於下列之實驗。 (3) 製備探針介質 用上述之實施例1之方法製備探針介質。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (4) 淸洗底物 用上述實施例1之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (5) 點墨探針介質 用上述之實施例1之方法製備固定探針之底物。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐） .45_ 1326769 A 7 B7 五、發明説明（42 ) (6) 阻塞處理 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 用1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 鹼度7.0)充分淸洗具固定探針之底物以溼化含固定型探針 之底物的表面，從而可均句地進行阻塞處理，而不必進行 上述實施例1之阻塞處理。 (7) 雜交處理 用上述之實施例1之方法進行雜交處理。此後，探針 陣列用1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 鹼度7.〇)淸洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖 核酸探針。然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾 探針固定底物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon Instruments, Inc.製作）評估在底物.上含固定 探針之墨點的螢光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定 在 100%，PMT 設定在 400 V。 (8) 結果 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 步驟（7)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（1)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在53 2 nm上之螢光強度爲23400，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核 糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度 爲65 8。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似 圓形，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似 。刪除阻塞處理會使得在點墨以外之區域螢光強度少許增 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -46 - 1326769 A7 ____B7 五、發明説明严） 加。此外，觀察到相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成 格子形式的墨點之間隔約200微米。 (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) [實施例8] (1)合成探針 使用能獨特的結合於目標材料的單鏈脫氧核糖核酸探 針作爲探針。使用脫氧核糖核酸自動合成儀合成序列確認 號碼：5的單股核酸，並於脫氧核糖核酸自動合成儀合成的 期間在單股核酸的末端使用硫醇修改劑（由GlenResearch Co.，Ltd.製作）引入氫硫基（SH)基團。其後，進行正常的去 保護作用，收集脫氧核糖核酸並用高效能液相色譜法純化 取得用於下列實驗之式（5)寡聚物。 5' HS-(CH2)6-0-P02-0-ACTGGCCGTCGTTTTACA3' (5) (2) 具有能結合於探針位點官能基之材料（探針黏合劑） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 製備具有能結合於探針位點官能基之材料，係將5 0 0 微莫耳/升具有順丁烯二酸醯亞胺基團以及羥基琥珀醯亞胺 酯基團之雙價試劑（N-(6-順丁烯二酸醯亞胺基己醯基氧基） 碌基琥珀醯亞胺鈉鹽（商品名：sulfo-EMCS ; 由Dojindo Corporate，Ltd.製作））水溶液在室溫下混合5分鐘以製成 探針黏合劑溶液。製備的探針黏合劑溶液係用於以下之實 驗。 (3) 具有能結合於底物位點官能基之材料（底物黏合劑） 本纸倀尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） -47 - 1326769 A7 B7 五、發明説明产） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 製備具有能結合於底物位點官能基之材料，係將20毫 莫耳/升內含具有胺基之砂烷化合物（N-沒（胺基乙基）r _胺 基丙基二甲氧基砂院）之砂院偶合劑（商品名：KBM-603 ,由 The ShinEtsu Chemical Co., Ltd.製作）之水溶液在室溫下混 合30分鐘以製成底物黏合劑溶液。製備的底物黏合劑溶液 係用於以下之實驗β (4) 製備探針介質 將式（5)之單鏈脫氧核糖核酸探針溶於ΤΕ溶液（10毫莫 耳濃度Tris-HCl(酸鹼度8)/1毫莫耳濃度乙二胺四乙酸水溶 液），最終濃度約爲40微莫耳/升，從而製備單鏈脫氧核糖 核酸探針之溶液（精確的濃度係計算自吸收強度）。 製備1〇〇微升上述製備的探針溶液，滴入100微升步 驟（2)之探針黏合劑溶液並混合5分鐘。然後滴入1〇〇微升 步驟（3)製備的底物黏合劑溶液並混合5分鐘。於混合之後 靜置10分鐘，重覆滴入 700微升內含7.5wt%甘油、 7.5wt%尿素、以及7.5wt%硫雙乙醇之溶液並混合分鐘。於 混合之後，將混合物靜置30分鐘以製備探針介質。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (5) 淸洗底物 將1英吋X 3英吋之玻璃底物（厚度：1.1毫米）置於卡 式盒，並浸沒在事先加熱至60°C之1莫耳/升之氫氧化鈉溶 液10分鐘。其後，將彼用流動的純水充分沖洗去除滯留在 玻璃底物及卡式盒之氫氧化鈉。於充分的漂洗之後，共同 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 48 - 1326769 A7 B7 五、發明説明严） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將玻璃底物及卡式盒浸沒在純水中，並用超音波淸洗10分 鐘。超音波清洗後，將彼用流動的純水充分沖洗去除滯留 在玻璃底物及卡式盒之顆粒。逐一用氣體吹乾沖洗過的玻 璃底物。檢查底物之淸潔度，測量在底物上純水之接觸角 度。結果顯示每個底物位點之接觸角度約5°。 (6) 點墨探針介質 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將步驟（4)製備的探針介質施用於熱泡噴射列印機（商品 名：BJF8 50 ; 由Canon Inc.製作）之油墨槽並置入熱泡噴 射頭。本發明使用之熱泡噴射列印機（商品名：BJF8 50 ; 由Canon Inc.製作）經過修改，可在平板上印刷。然後將步 驟（5)製備的玻璃底物置入此列印機，將探針介質點在玻璃 底物上。熱泡噴射液體釋放的表面、頭部以及玻璃底物液 體滯留表面間之距離介於1.2至1.5毫米。於完成點墨之後 ，用顯微鏡觀察玻璃底物，結果發現在玻璃底物之表面形 成矩陣形之墨點排列。此外，測定墨點形成位點外緣之純 水接觸角。結果顯示每個底物位點之接觸角度約5°。此結 果發現除了墨點形成位點之外並無探針介質及其類似者引 起的污染。於進行墨點方法之後將玻璃底物浸泡在裝有1 莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0) 之容器，並與容器共同置入冰箱儲存在低溫下（4°C)。用此 方法製作固定探針之底物。 (7) 阻塞處理 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0><297公釐） -49 - 1326769 A 7 B7 五、發明説明（16 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 從1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 鹼度7.0)中取出步驟（6)製作的固定探針之底物。然後將玻 璃底物浸泡在裝入2%牛血淸白蛋白水溶液之容器，然後靜 置2小時以進行阻塞處理。 (8)雜交處理 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具有互補至描述於步驟（5)之式（1)的單鏈脫氧核糖核酸 探針鹼基序列的單鏈脫氧核糖核酸係用脫氧核糖核酸自動 合成儀合成以取得5'端結合若丹明之標記的單股脫氧核糖 核酸探針。將此標記的單股脫氧核糖核酸溶於1莫耳濃度 NaCl/5 0毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)，於步驟 (7)得到之經阻塞處理的含固定探針之底物係浸泡在溶液， 並在室溫（25°C )下雜交處理2小時。此後，探針陣列用1莫 耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)淸 洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖核酸探針。 然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾探針固定底 物。然後使用營光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon Instruments, Inc.製作）評估在底物上含固定探針之墨點的螢 光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定在100%，PMT設 定在400 V。 (9 )結果 步驟（8)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（5)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在53 2 nm上之螢光強度爲25730，完 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐> _ 50 - 1326769 A7 B7 五、發明説明Γ ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核 糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度 爲639。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似 圓形，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似 。此外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式 的墨點之間隔約200微米。 [實施例9] (1) 合成探針 上述實施例5之方法製備式（8)的單鏈脫氧核糖核酸探 針可應用於下列實驗。 (2) 具有能結合於探針位點官能基之材料（探針黏合劑） 爲了製備具有能結合於探針之位點官能基之材料，準 備具有順丁烯二酸醯亞胺基團之雙價試劑（N-(6-順丁烯二酸 醯亞胺基己醯基氧基）磺基琥珀醯亞胺鈉鹽（商品名：SUlf〇-EMCS ；由 Dojindo Corporate, Ltd.製作））。此探針黏合劑 可用於下列實驗。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (3) 具有能結合於底物位點官能基之材料（底物黏合劑） 用實施例8之方法製備底物黏合劑溶液。製備的底物 黏合劑溶液係用於以下之實驗。 (4) 製備探針介質 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -51 - 1326769 A 7 B7 五、發明説明r ) 製備單鏈脫氧核糖核酸探針溶液之方法如上述之實施 例8。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將10毫升上述製備之探針溶液，以及約2.1毫克上述 之探針黏合劑稱重並加入溶液中，並混合5分鐘。於混合 之後靜置30分鐘，重覆的在混合的探針介質及探針黏合劑 中滴入1 〇毫升純水以及混合，總共滴入80毫升純水。然 後滴入1〇毫升步驟（3)製備的底物黏合劑溶液並混合5分鐘 。於混合之後，將混合物靜置30分鐘以製備探針介質。 (5) 淸洗底物 用上述實施例8之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (6) 點墨探針介質 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將步驟（4)製備的探針介質用上述實施例8之方法點墨 以製作固定探針之底物。於完成點墨之後，用顯微鏡觀察 玻璃底物，結果發現在玻璃底物之表面形成矩陣形之墨點 排列。於進行墨點方法之後將玻璃底物浸泡在裝有1莫耳 濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)之容 器，並與容器共同置入冰箱儲存在低溫下（4°C)»用此方法 製作有固定探針之底物。 (7) 阻塞處理 用上述之實施例8之方法進行阻塞處理。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -52 _ 1326769 A7 B7 五、發明説明θ ) (8) 雜交處理 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 用上述之實施例8之方法進行雜交處理。此後，探針 陣列用1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 鹼度7·〇)淸洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖 核酸探針。然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾 探針固定底物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon Instruments, Inc.製作）評估在底物上含固定 探針之墨點的螢光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定 在 100%，PMT 設定在 400 V。 (9) 結果 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 步驟（8)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（5)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在532 nm上之螢光強度爲25100，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核 糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度 爲769。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似 圓形，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似 。此外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式 的墨點之間隔約200微米。 [實施例10] (1)合成探針 使用能獨特的結合於目標材料的單鏈脫氧核糖核酸探 針作爲探針。使用脫氧核糖核酸自動合成儀合成序列確認 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規搞「（ 210X297公釐） _ 53 - 1326769 A7 _____B7 五、發明説明) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 號碼：5、序列確認號碼：6、序列確認號碼：7以及序列確 認號碼：8的單股核酸。在序列確認號碼·· 6 ' 7以及8的 單股脫氧核糖核酸中，改變實施例8之序列確認號碼：5單 鏈脫氧核糖核酸之一個鹼基者定義爲序列確認號碼：6，改 變三個者定義爲序列確認號碼：7，改變六個鹼基者定義爲 序列確認號碼：8。此外，於脫氧核糖核酸自動合成儀合成 期間，在序列確認號碼：5至8之各單鏈脫氧核糖核酸之末 端使用硫醇修改劑（由GlenResearch Ltd.製作）引入硫醇（SH) 基團。其後，進行正常的去保護作用，收集脫氧核糖核酸 並用高效能液相色譜法純化取得用於下列實驗之式（6)、（7) 及（8)寡聚物。 5' HS-(CH2)6-〇-P〇2-〇-ACTGGCCGTTGTTTTACA3' (6) 5' HS-(CH2)6-〇-P〇2-〇-ACTGGCCGCTTTTTTACA3' (7) 5' HS-(CH2)6-〇-P〇2-〇-ACTGGCATCTTGTTTACA3' (8) (2) 具有能結合於探針位點官能基之材料（探針黏合劑） 製備探針黏合劑溶液之方法如上述之實施例8。製備的 探針黏合劑溶液係用於以下之實驗。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1326769 A7 B7 _ 五、發明説明) 製備單鏈脫氧核糖核酸探針溶液之方法如上述之實施 例8。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 用上述實施例8步驟（4)之方法以序列確認號碼：5至8 之單鏈脫氧核糖核酸製備出四種類型之探針介質（精確的濃 度係計算自吸收強度）。 (5) 淸洗底物 用上述實施例8之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (6) 點墨探針介質 經濟部智慧財產局員工消費合作社印裝 將步驟（4)製備的四種探針介質分別施用於四個熱泡噴 射列印機（商品名：BJF8 50 ; 由Canon Inc.製作）之油墨槽 並將各油墨槽置入熱泡噴射頭。本發明使用之熱泡噴射列 印機（商品名：BJF850 ; 由Canon Inc.製作）經過修改， 可在平板上印刷。然後將步驟（5)製備的玻璃底物置入此列 印機，將各探針介質（四種）分別點在四個3 X 3毫米區域的 玻璃底物上。此外，各區域之墨點模式與實施例8相同。 熱泡噴射液體釋放的表面、頭部以及玻璃底物液體滞留表 面間之距離介於1.2至1.5毫米。於完成點墨之後，用顯微 鏡觀察玻璃底物，結果發現在玻璃底物之表面形成矩陣形 之墨點排列。於進行墨點方法之後將玻璃底物浸泡在裝有1 莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0) 之容器，並與容器共同置入冰箱儲存在低溫下（4°C)。四種 類型含固定探針之底物係以此方法製作 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS >A4規格（2】0X297公釐） -55 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1326769 A7 ________B7_ _ 五、發明説明P ) (7) 阻塞處理 用上述之實施例8之方法進行阻塞處理。 (8) 雜交處理 具有互補至描述於實施例8之式（5)的單鏈脫氧核糖核 酸探針鹼基序列的單鏈脫氧核糖核酸係用脫氧核糖核酸自 動合成儀合成以取得5·端結合若丹明之標記的單股脫氧核 糖核酸探針。將此標記的單股脫氧核糖核酸溶於1莫耳濃 度NaCl/5 0毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)，於步 驟（7)得到之經阻塞處理的含固定探針之底物係浸泡在溶液 ，並在室溫（25 °C )下雜交處理2小時。此後，探針陣列用1 莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0) 淸洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖核酸探針 。然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾探針固定 底物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由 Axon Instruments，Inc.製作）評估在底物上含固定探針之墨 點的螢光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定在1 00%， PMT設定在400 V » (9) 結果 步驟（8)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（5)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在53 2 nm上之螢光強度爲2612〇，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。相反的，具有·_ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） :56 - ---------I.--Ί--ir----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1326769 A7 B7 五、發明説明P ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 個配對錯誤鹼基序列之式（6)脫氧核糖核酸探針墨點，其螢 光強度爲12870。具有三個配對錯誤鹼基序列之式（7)脫氧 核糖核酸探針墨點，其螢光強度爲4220，螢光強度爲完全 符合之脫氧核糖核酸探針的一半以下，具有六個配對錯誤 鹼基序列之式（8)脫氧核糖核酸探針，則無螢光墨點，對應 至墨點位點的螢光強度爲79 1。此外，在脫氧核糖核酸探針 墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲675。以螢 光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似圓形，且用 相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似。此外，相 鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式的墨點之間 隔約200微米。從上述之結果可知，完全互補的單股的脫 氧核糖核酸可在DNA陣列底物上獨特的加以偵測。 實施例11 (1) 合成探針 上述實施例5之方法製備的式（8)單鏈脫氧核糖核酸探 針可應用於下列實驗。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2) 具有能結合於探針位點官能基之材料（探針黏合劑） 製備探針黏合劑溶液之方法如上述之實施例8。製備的 探針黏合劑溶液係用於以下之實驗。 (3) 具有能結合於底物之位點官能基之材料（底物黏合劑） 用實施例8之方法製備底物黏合劑溶液。製備的底物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格U10X297公釐） -57- 1326769 A7 ______B7 五、發明説明Ρ ) 黏合劑溶液係用於以下之實驗。 (4) 製備探針介質 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 用上述之實施例8之方法製備探針介質。 (5) 淸洗底物 用上述實施例8之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (6) 點墨探針介質 用上述之實施例8之方法製備固定探針之底物。 (7) 阻塞處理 用1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 鹼度7.0)淸洗底物，從而可均勻地進行阻塞處理，而不須 進行上述實施例8之阻塞處理。 (8) 雜交處理 用上述之實施例8之方法進行雜交處理。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 此後，探針陣列用1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷 酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)淸洗沖刷去除未與探針核酸雜交 之單鏈脫氧核糖核酸探針。然後用純水移除過量的鹽類， 接著用氮氣吹乾探針固定底物。然後使用螢光掃描器（商品 名：GenePix 4000B 由 Axon Instruments，Inc_製作）評估在 底物上含固定探針之墨點的螢光強度。評估螢光強度時， 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2〗〇x297公釐） -58 - 1326769 A7 B7 五、發明説明P ) 雷射功率設定在100%，PMT設定在400 V。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (9)結果 步驟（8)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（5)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在53 2 nm上之螢光強度爲24380，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核 糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度 爲783。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似 圓形，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似 。刪除阻塞處理會使在點墨以外之區域其螢光強度增加少 許。此外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形 式的墨點之間隔約200微米。 實施例1 2 (1) 合成探針 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 使用能獨特的結合於目標材料的單鏈脫氧核糖核酸探 針作爲探針。使用脫氧核糖核酸自動合成儀合成序列確認 號碼：9之單鏈脫氧核糖核酸，且將胺基經磷酸鹽基團及己 橋結合至單股的脫氧核糖核酸之5’端徑基以製備應用於下 列實驗之式（9)十八烷醯體的寡聚物。 5’ HEN-(CH2)6-〇-P〇2-〇-ACTGGCCGTCGTTTTACA3, (9) (2) 具有能結合於探針位點官能基之材料（探針黏合劑） 製備具有能結合於探針之位點官能基之材料時，係將 本紙張尺度適用巾關家料（CNS )八4祕（2丨Qx297^ ) _ eg _ -- 1326769 A7 __B7_ 五、發明説明p ) 5 00微莫耳/升具有順丁烯二酸醯亞胺基團之雙價試劑（N_(8_ 順丁烯二酸醯亞胺基己醯基氧基）磺基琥珀醯亞胺鈉鹽（商品 名：sulfo-EMCS;由 Dojindo Corporate, Ltd.製作））水溶 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 液在室溫下攪拌5分鐘以製成探針黏合劑溶液。製備的探 針黏合劑溶液係用於以下之實驗。 (3) 具有能結合於底物之位點官能基之材料（底物黏合劑） 製備具有能結合於底物位點官能基之材料，係將20毫 莫耳/升內含具有氫硫基團之矽烷化合物（r -氫硫基丙基甲 基二甲氧基砂院）之矽院偶合劑（商品名：KBM-802，由The ShinEtsu Chemical Co.，Ltd.製作）之水溶液在室溫下混合30 分鐘以製成底物黏合劑溶液。製備的底物黏合劑溶液係用 於以下之實驗。 (4) 製備探針介質 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將式（9)之單鏈脫氧核糖核酸探針溶於TE溶液中（10毫 莫耳濃度Tris-HCl(酸鹼度8)/1毫莫耳濃度乙二胺四乙酸水 溶液），成爲最終濃度約爲40微莫耳/升，從而製成單鏈脫 氧核糖核酸探針之溶液（精確的濃度係計算自吸收強度）。 然後，將水溶性聚合物材料聚乙烯醇（PVA)溶於純水中 而使其濃度爲0.5wt%。爲了完全溶解聚乙烯醇，將生成的 溶液在80°C之熱水浴下混合加熱60分鐘。於確認沒有不溶 的物質存在之後，將溶液過濾以預防點墨時塞住噴嘴，因 而完成PVA溶液之製備。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公楚） 1326769 A7 B7 五、發明説明p ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 製備100微升依上述方法製備的探針溶液，滴入100 微升步驟（2)製備之探針黏合劑溶液並混合5分鐘。然後滴 入100微升步驟（3)製備的底物黏合劑溶液並混合5分鐘。 於混合之後靜置10分鐘’滴入6 00微升水純以及100微升 上述製備的PVA溶液並混合5分鐘。於混合之後，將混合 物靜置30分鐘以製備探針介質。 (5) 淸洗底物 用上述實施例8之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (6) 點墨探針介質 將上述步驟（4)製備的探針介質施用於熱泡噴射列印機（ 商品名：BJF850; 由 Canon Inc.製作）之油墨槽並置入熱 泡噴射頭。本發明使用之熱泡噴射列印機（商品名：B JF 8 5 0 : 由Canon Inc.製作）經過修改，可在平板上印刷。然後 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將上述步驟（5)製備的玻璃底物置入此列印機，將探針介質 點在玻璃底物上。熱泡噴射液體釋放的表面、頭部以及玻 璃底物液體滯留表面之間距離介於1.2至1.5毫米。於完成 點墨之後，用顯微鏡觀察玻璃底物，結果發現在玻璃底物 之表面形成矩陣形之墨點排列。此外 > 測定墨點形成位點 外緣之純水接觸角。結果顯示每個底物位點之接觸角度約 5°。此結果發現除了墨點形成位點之外並無探針介質及其 類似者引起的污染。於進行點墨之後將玻璃板置於乾燥器 。用此方法製作固定探針之底物。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0><297公釐） -61 - 1326769 A 7 B7 五、發明説明f8 ) (7) 阻塞處理 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將步驟（5)製作的固定探針之底物用1莫耳濃度 NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)充分的淸 洗以溼化含固定型探針之底物的表面，從而可均勻地進行 阻塞處理。然後將玻璃底物浸泡在2%牛血淸白蛋白水溶液 中，然後靜置2小時以進行阻塞處理^ (8) 雜交處理 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具有互補至上述之式（9)的單鏈脫氧核糖核酸探針鹼基 序列的單鏈脫氧核糖核酸係用脫氧核糖核酸自動合成儀合 成以取得5'端結合若丹明之標記的單股脫氧核糖核酸探針 。將此標記的單股脫氧核糖核酸溶於1莫耳濃度NaCl/50 毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)中，而於步驟（7)得 到之經阻塞處理的含固定探針之底物係浸泡在溶液中，並 在室溫（25 °C )下雜交處理2小時。此後，探針陣列用1莫耳 濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)淸洗 沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖核酸探針。然 後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾探針固定底物 。然後使用營光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon Instruments, Inc.製作）評估在底物上含固定探針之墨點的螢 光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定在100%，PMT設 定在400 V。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -62 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1326769 A7 _ B7 五、發明説明f9 ) (9)結果 經步驟（8)中螢光掃描器評估分析之結果顯示，式（5)之 脫氧核糖核酸探針的墨點在5 32 nm上之螢光強度爲18710 ，完全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫 氧核糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光 強度爲664。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均 近似圓形，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度 相似。此外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子 形式的墨點其間隔約200微米。 實施例13 (1) 合成探針 上述實施例5之方法製備式（I2)的單鏈脫氧核.糖核酸探 針可應用於下列實驗。 (2) 具有能結合於探針位點官能基之材料（探針黏合劑） 製備探針黏合劑溶液之方法如上述之實施例12。製備 的探針黏合劑溶液係用於以下之實驗。 (3) 具有能結合於底物位點官能基之材料（底物黏合劑） 用實施例12之方法製備底物黏合劑溶液。製備的底物 黏合劑溶液係用於以下之實驗。 (4) 製備探針介質 --------.--τ--,玎----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨ΟX 297公釐） _ 63 _ 1326769 A7 B7 五、發明説明) 製備單鏈脫氧核糖核酸探針溶液及PVA溶液之方法如 上述之實施例1 2。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將10毫升上述製備之探針溶液，以及約2.1毫克上述 之探針黏合劑稱重並加入溶液中，並混合5分鐘。於混合 之後靜置30分鐘，重覆的在混合的探針介質及探針黏合劑 中滴入1 0毫升純水以及混合，總共滴入70毫升純水。然 後滴入10毫升步驟（3)製備的底物黏合劑溶液並混合5分鐘 。於混合之後，混合物靜置30分鐘，然後滴入10毫升上 述製備的PVA溶液並混合5分鐘。於混合完成之後，將混 合物靜置30分鐘以製備探針介質。 (5) 淸洗底物 用上述實施例8之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (6) 點墨探針介質 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將步驟（4)製備的探針介質用上述實施例8之方法點墨 以製作固定探針之底物。於完成點墨之後，用顯微鏡觀察 玻璃底物，結果發現在玻璃底物之表面形成矩陣形之墨點 排列。於進行點墨之後將玻璃板置於乾燥器。用此方法製 作固定探針之底物。 (7) 阻塞處理 用上述之實施例12之方法進行阻塞處理。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 64 _ 1326769 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明f1 ) (8) 雜交處理 用上述之實施例12之方法進行雜交處理。此後，探針 陣列用1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 驗度7.0)淸洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖 核酸探針。然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾 探針固定底物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon Instruments，Inc.製作）評估在底物上含固定 探針之墨點的螢光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定 在 100%，PMT 設定在 400 V。 (9) 結果 步驟（8)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（5)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在532 nm上之螢光強度爲17970，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核 糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度 爲7 23。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似 圓形，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似 。此外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式 的墨點其間隔約200微米。 [實施例14] (1)合成探針 上述實施例9之方法製備式（I2)的單鏈脫氧核糖核酸探 針可應用於下列實驗。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -65 - --------裝-3--K--；---訂------.. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1326769 A7 B7 五、發明説明P ) (2) 具有能結合於探針位點官能基之材料（探針黏合劑） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本育) 製備具有能結合於探針位點官能基之材料，係將5〇0 微莫耳/升具有順丁烯二酸醯亞胺基團以及羥基琥珀醯亞胺 酯基團之雙價試劑（N-(6-順丁烯二酸醯亞胺基己醯基氧基） 磺基琥珀醯亞胺鈉鹽（商品名：sulfo-EMCS ; 由Dojindo Corporate, Ltd.製作））水溶液在室溫下混合5分鐘以製成 探針黏合劑溶液。製備的探針黏合劑溶液係用於以下之實 驗。 (3) 具有能結合於底物位點官能基之材料（底物黏合劑） 製備具有能結合於底物位點官能基之材料，係將2〇毫 莫耳/升內含具有胺基之矽烷化合物（N- 胺基乙基）r -胺基 丙基三甲氧基矽烷）之矽烷偶合劑（商品名：KBM-603，由 The ShinEtsu Chemical Co.，Ltd.製作）之水溶液在室溫下混 合30分鐘以製成底物黏合劑溶液。製備的底物黏合劑溶液 係用於以下之實驗。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (4) 製備探針介質 將式（9)之單鏈脫氧核糖核酸探針溶於TE溶液（1〇毫莫 耳濃度Tris-HCK酸鹼度8)/1毫莫耳濃度乙二胺四乙酸水溶 液），最終濃度約爲40微莫耳/升，從而製備單鏈脫氧核糖 核酸探針之溶液（精確的濃度係計算自吸收強度）。 製備1〇〇微升上述製備的探針溶液，滴入100微升步 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） _ 66 - 1326769 A7 B7 五、發明説明p ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 驟（2)之探針黏合劑溶液並混合5分鐘。然後滴入100微升 步驟（3)製備的底物黏合劑溶液並混合5分鐘。於混合之後 靜置10分鐘，重覆滴入700微升內含7.5wt%甘油、 7.5wt%尿素、以及7.5wt%硫雙乙醇之溶液並混合分鐘。於 混合之後，將混合物靜置30分鐘以製備探針介質。 (5) 淸洗底物 將1英吋X 3英吋之玻璃底物（厚度：1.1毫米）置於卡 式盒’並浸沒在事先加熱至60°C之1莫耳/升之氫氧化鈉溶 液1 0分鐘。其後，將彼用流動的純水充分沖洗去除滞留在 玻璃底物及卡式盒之氫氧化鈉。於充分的漂洗之後，共同 將玻璃底物及卡式盒浸沒在純水中，並用超音波淸洗1 0分 鐘。超音波淸洗後，將彼用流動的純水充分沖洗去除滯留 在玻璃底物及卡式盒之顆粒。逐一的用氣體吹乾沖洗過的 玻璃底物。檢查底物之淸潔度，測量在底物上純水之接觸 角度。結果顯示每個底物位點之接觸角度約5°。 (6) 點墨探針介質 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將步驟（4)製備的探針介質施用於熱泡噴射列印機（商品 名：BJF8 50 ; 由Canon Inc.製作）之油墨槽並置入熱泡噴 射頭。本發明使用之熱泡噴射列印機（商品名：BJF850 ; 由Canon Inc.製作）經過修改，可在平板上印刷。然後將步 驟（5)製備的玻璃底物置入此列印機，將探針介質點在玻璃 底物上。熱泡噴射液體釋放的表面、頭部以及玻璃底物液 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -67 - 1326769 A7 B7 五、發明説明f4 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 體滯留表面間之距離介於U至1.5毫米。於完成點墨之後 ，用顯微鏡觀察玻璃底物，結果發現在玻璃底物之表面形 成矩陣形之墨點排列。此外，測定墨點形成位點外緣之純 水接觸角。結果顯不每個底物位點之接觸角度約5°。此結 果發現除了墨點形成位點之外並無探針介質及其類似者引 起的污染。於進行墨點方法之後將玻璃底物浸泡在裝有1 莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0) 之容器，並與容器共同置入冰箱儲存在低溫下（4°C )。用此 方法製作固定探針之底物。 (7) 阻塞處理 從1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 鹼度7.0)中取出步驟（6)製作的固定探針之底物。然後將玻 璃底物浸泡在裝入2%牛血淸白蛋白水溶液之容器，然後靜 置2小時以進行阻塞處理。 (8) 雜交處理 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具有互補至描述於步驟（9)之式（1)的單鏈脫氧核糖核酸 探針鹼基序列的單鏈脫氧核糖核酸係用脫氧核糖核酸自動 合成儀合成以取得5’端結合若丹明之標記的單股脫氧核糖 核酸探針》將此標記的單股脫氧核糖核酸溶於1莫耳濃度 NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)，於步驟 (7)得到之經阻塞處理的含固定.探針之底物係浸泡在溶液， 並在室溫（2 5 °C)下雜交處理2小時。此後，探針陣列用1莫 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -68 - 1326769 A 7 B7 五、發明説明Ρ ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)淸 洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖核酸探針。 然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾探針固定底 物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon Instruments, Inc.製作）評估在底物上含固定探針之墨點的螢 光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定在1 00%，PMT設 定在400 V。 (9)結果 步驟（8)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（9)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在532 nm上之螢光強度爲25730，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核 糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度 爲639。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似 圓形，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似 。此外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式 的墨點其間隔約200微米。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 [實施例15] (1)合成探針 上述實施例1之方法製備的單鏈脫氧核糖核酸探針可 應用於下列實驗。於使用之前將單鏈脫氧核糖核酸探針分 裝入微離心管之中。於單鏈脫氧核糖核酸探針分裝入微離 心管之後，各微離心管內含17.53莫耳之單鏈脫氧核糖核 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐） -69 - 1326769 A7 B7 五、發明説明P ) ' 酸探針’將彼乾燥以製備單鏈脫氧核糖核酸探針。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (2) 具有能結合於探針以及能結合於底物之位點官能基的材 料（探針黏合劑） 爲了製備具有能結合於探針位點以及結合於底物位點 官能基之材料，使用內含具有環氧基團之矽烷化合物（r-縮 水甘油氧基丙基三甲氧基矽烷）之矽烷偶合劑（商品名： KBM-403，由 The Shin-Etsu Chemical Co·，Ltd.製作）。在 下列實驗中使用環氧基矽烷偶合劑作爲探針黏合劑溶液。 (3) 製備探針介質 在內含分裝的式（1)單鏈脫氧核糖核酸探針之微離心管 中滴入10微升環氧基矽烷偶合劑之探針黏合劑並混合及乾 燥。然後滴入5 0微升純水並混合。於充分的混合5分鐘之 後’將混合物靜置30分鐘。 然後在上述之微離心管滴入500微升乙二醇以及500 微升乙烯醇之高沸點溶劑並混合1分鐘。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 然後滴入1〇〇微升〇.5wt%聚乙烯醇（PVA)水溶液作爲 水溶性聚合物材料並混合1分鐘。最後滴入純水而使探針 材料的總量爲2 000微升並混合。然後，將混合物靜置60 分鐘以製備探針介質》 (4) 淸洗底物 將1英吋 X 3英吋之玻璃底物（厚度：1.1毫米）置於卡 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ _ 1326769 A 7 B7 五、發明説明P ) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 式盒，並浸沒在事先加熱至60°C之1莫耳/升之氫氧化鈉溶 液10分鐘。其後，將彼用流動的純水充分沖洗去除滯留在 玻璃底物及卡式盒之氫氧化鈉。於充分的漂洗之後，共同 將玻璃底物及卡式盒浸沒在純水中，並用超音波淸洗10分 鐘。超音波淸洗後，將彼用流動的純水充分沖洗去除滯留 在玻璃底物及卡式盒之顆粒。逐一用氣體吹乾沖洗過的玻 璃底物。檢查底物之淸潔度，測量在底物上純水之接觸角 度。結果顯示每個底物位點之接觸角度約π。 (5)點墨探針介質 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將步驟（3)製備的探針介質施用於熱泡噴射列印機（商品 名：BJF8 50 ; 由 Canon Inc.製作）之油墨槽並置入熱泡噴 射頭。本發明使用之熱泡噴射列印機（商品名：BJF8 50 ; 由Canon Inc.製作）經過修改，可在平板上印刷。然後將 步驟（4)製備的玻璃底物置入此列印機，將探針介質點在玻 璃底物上。熱泡噴射液體釋放的表面、頭部以及玻璃底物 液體滯留表面間之距離介於1.2至1.5毫米。於完成點墨之 後，用顯微鏡觀察玻璃底物，結果發現在玻璃底物之表面 形成矩陣形之墨點排列。此外，測定墨點形成位點外緣之 純水接觸角。結果顯示每個底物位點之接觸角度約5°。此 結果發現除了墨點形成位點之外並無探針介質及其類似者 引起的污染。於進行點墨之後將玻璃板置於乾燥器。用此 方法製作固定探針之底物。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 71 - 1326769 A7 _B7 五、發明説明f8 ) (6) 阻塞處理 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將步驟（5)製作的固定探針之底物充分的用1莫耳濃度 NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)淸洗以溼 化含固定型探針之底物的表面，從而可均勻地進行阻塞處 理。然後將玻璃底物浸泡在2%牛血淸白蛋白水溶液，然後 靜置2小時以進·(了阻塞處理。 (7) 雜交處理 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具有互補至描述於步驟（1)之式（1)的單鏈脫氧核糖核酸 探針鹼基序列的單鏈脫氧核糖核酸係用脫氧核糖核酸自動 合成儀合成以取得5'端結合若丹明之標記的單股脫氧核糖 核酸探針。將此標記的單股脫氧核糖核酸溶於1莫耳濃度 NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0).，於步驟 (6)得到之經阻塞處理之含固定探針之底物係浸泡在溶液， 並在室溫（2 5 °C )下雜交處理3小時。此後，探針陣列用1莫 耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7 〇)淸 洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖核酸探針。 然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾探針固定底 物。然後使用營光掃描器（商品名：GenePix 4〇〇〇B由Axon Instruments，lnc.製作）評估在底物上含固定探針之墨點的螢 光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定在i 〇〇%，PMT設 定在400 V。 (8) 結果 本纸張尺度適用巾g國家標率（CNS ) ( 21GX297公釐)-12- 1326769 A7 _B7____ 五、發明説明P ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 步驟（7)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（1)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在532 nm上之螢光強度爲15750，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核 糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度 爲108。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似 圓形，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似 。此外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式 的墨點其間隔約200微米。 [實施例16] (1) 合成探針 用上述實施例15之方法分裝單鏈脫氧核糖核酸探針及 乾燥。 (2) 具有能結合於探針以及能結合於底物之位點官能基的材 料（探針黏合劑） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 爲了製備具有能結合於探針位點以及結合於底物位點 官能基之材料，使用內含具有異氰酸酯基團之矽烷化合物（ 厶-異氰酸酯丙基三甲氧基矽烷）之矽烷偶合劑（商品名： KBM-9007，由 The Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.製作）。在 下列實驗中使用異氰酸酯矽烷偶合劑作爲探針黏合劑溶液 〇 (3) 製備探針介質 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 73 - 1326769 A7 _____B7 _ 五、發明説明f〇 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在內含分裝的式（1)單鏈脫氧核糖核酸探針之微離心管 中滴入20微升異氰酸酯矽烷偶合劑之探針黏合劑並混合以 及乾燥。然後滴入50微升純水並混合。於充分的混合5分 I之後’將混合物靜置30分鐘。 然後在上述之微離心管滴入500微升乙二醇以及500 微升乙稀醇之高沸點溶劑並混合1分鐘。 然後滴入100微升0.5wt%聚乙烯醇（PVA)水溶液作爲 水溶性聚合物材料並混合1分鐘。最後滴入純水而使探針 材料的總量爲2000微升並混合5分鐘。然後，將混合物靜 置6〇分鐘以製備探針介質。 (4) 淸洗底物 用上述實施例15之方法淸洗底物製備底物。 (5) 點墨探針介質 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將步驟（3)製備的探針介質施用於熱泡噴射列印機（商品 名：BJF850 ; 由Canon Inc.製作）之油墨槽並置入熱泡噴 射頭。本發明使用之熱泡噴射列印機（商品名：BJF85 0 ; 由Canon Inc.製作）經過修改，可在平板上印刷。 然後將步驟（4)製備的玻璃底物置入此列印機，將探針 介質點在玻璃底物上。熱泡噴射液體釋放的表面、頭部以 及坡璃底物液體滯留表面間之距離介於1.2至1.5毫米。於 完成點墨之後，用顯微鏡觀察玻璃底物，結果發現在坡璃 底物之表面形成矩陣形之墨點排列。此外，測定墨點形成 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 74 - 1326769 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（71 ) 位點外緣之純水接觸角》結果顯示每個底物位點之接觸角 度約5° 。此結果發現除了墨點形成位點之外並無探針介質 及其類似者引起的污染。於進行點墨之後將玻璃板置於乾 燥器。用此方法製作固定探針之底物》 (6) 阻塞處理 將步驟（5)製作的固定探針之底物用1莫耳濃度 NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)充分淸洗 以溼化含固定型探針之底物的表面，從而可均勻地進行阻 塞處理。然後將玻璃底物浸泡在2%牛血淸白蛋白水溶液， 然後靜置2小時以進行阻塞處理。 (7) 雜交處理 具有互補至描述於步驟（1)之式（1)的單鏈脫氧核糖核酸 探針鹼基序列的單鏈脫氧核糖核酸係用脫氧核糖核酸自動 合成儀合成以取得5'端結合若丹明之標記的單股脫氧核糖 核酸探針。將此標記的單股脫氧核糖核酸溶於丨莫耳濃度 NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7〇)，於步驟 (6)得到之經阻塞處理之含固定探針之底物係浸泡在溶液， 並在室溫（25°C)下雜交處理3小時。此後，探針陣列用1莫 耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7 〇)淸 洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖核酸探針^ 然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾探針固定底 物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-75 - ---.--Γ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —訂------'— t. 1326769 A7 _B7_ _ 五、發明説明f2 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
Instruments, Inc.製作）評估在底物上含固定探針之墨點的螢 光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定在100%，PMT設 定在400 V » (8)結果 步驟（7)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（1)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在532 nm上之螢光強度爲1 5750，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核 糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度 爲108。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似 圓形，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似 。此外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式 的墨點其間隔約2 0 0微米。 [比較實施例1] (1)合成探針 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 使用能獨特的結合於目標材料的單鏈脫氧核糖核酸探 針作爲探針。使用脫氧核糖核酸自動合成儀合成序列確認 號碼：10的單股核酸，並於脫氧核糖核酸自動合成儀合成 的期間在單股核酸的末端使用硫醇修改劑（由GlenResearch Co.，Ltd.製作）引入氫硫基（SH)基團。其後，進行正常的去 保護作用’收集脫氧核糖核酸並用高效能液相色譜法純化 取得用於下列實驗之式（10)寡聚物。 5'HS-(CH2)6-〇-P〇2-〇-ACTGGCCGTCGTTTTACA3, (10) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 76 - 1326769 A7 ____B7 五、發明説明P ) (2) 製備探針介質 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 上述實施例1之方法製備式（10)的單鏈脫氧核糖核酸探 針溶液（精確的濃度係計算自吸收強度）。製備的探針溶液可 用於下列實驗。 在上述製備的100微升探針溶液中滴入900微升內含 7.5wt%甘油、7.5wt%尿素、及7.5wt%硫雙乙醇之溶液。於 混合5分鐘之後，將混合物靜置3 0分鐘以製備探針介質。 (3) 淸洗底物 用上述實施例1之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (4) 探針固定處理 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將1 wt%內含具有胺基之矽烷化合物（N-/5(胺基乙基） 7 -胺基丙基三甲氧基矽烷）之矽烷偶合劑（商品名：KBM-603，由 The Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.製作）之水溶液 在室溫下混合3 0分鐘以製備矽烷偶合劑水溶液。然後，將 步驟（3)淸洗之玻璃底物在室溫（25°C)下浸泡在水溶液20分 鐘，以及用純充分的沖洗去除過剩的矽烷偶合劑溶液。將 沖洗過的底物之兩面用氮氣吹乾。然後在12(TC之烘箱中加 熱烘烤底物1小時以完成矽烷偶合處理。然後稱取2.7毫克 Ν-(6·順丁烯二酸醯亞胺基己醯基氧基）磺基琥珀醯亞胺（商 品名：EMCS 由 Doj indo Corporate, Ltd.製作），並溶於二 甲基亞颯（DMSO)/乙醇（1 : 1)溶液，最終濃度爲0.3毫克/毫 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ jj _ 1326769 A7 ___B7 五、發明説明f4 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 升’因而製備EMC S溶液。將矽烷偶合處理之底物在室溫 下浸泡在EMCS溶液30分鐘。從EMCS溶液中取出底物， 依序用DMSO及乙醇的混合溶劑以及乙醇淸洗，以及在氮 氣存在下乾燥。用此方法完成探針固定處理。測量純水接 觸角，檢查探針固定處理之效應。結果顯示在底物上之接 觸角度爲25至3 0°。從此結果發現探針在底物上之固定處 理已適當地完成。 (5) 點墨探針介質 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將步驟（2)製備的探針介質用上述實施例1之方法點墨 以製作固定探針之底物。於完成點墨之後，用顯微鏡觀察 玻璃底物，結果發現在玻璃底物之表面形成矩陣形之墨點 排列。此外測量純水接觸角，檢查探針固定處理之效應。 結果顯示在底物上之接觸角度爲25至30°。此結果發現除 了墨點形成位點之外並無探針介質及其類似者引起的污染 。於進行墨點方法之後將玻璃底物浸泡在裝有1莫耳濃度 NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)之容器， 並與容器共同置入冰箱儲存在低溫下（4°C)。用此方法製作 固定探針之底物。 (6) 阻塞處理 用上述之實施例1之方法進行阻塞處理° (7) 雜交處理 本纸張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） -78 - 1326769 A7 B7 五、發明説明（75 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 具有互補至描述於步驟（10)之式（1)的單鏈脫氧核糖核 酸探針鹼基序列的單鏈脫氧核糖核酸係用脫氧核糖核酸自 動合成儀合成以取得5'端結合若丹明之標記的單股脫氧核 糖核酸探針。將此標記的單股脫氧核糖核酸溶於1莫耳濃 度NaCl/5 0毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)，於步 驟（6)得到之經阻塞處理之含固定探針之底物係浸泡在溶液 ，並在室溫（2 5 °C )下雜交處理3小時。此後，探針陣列用1 莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0) 淸洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖核酸探針 。然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾探針固定 底物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由 Axon Instruments，Inc.製作）評估在底物上含固定探針之墨 點的螢光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定在1 0 〇%， PMT設定在400 V。 (8 )結果 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 步驟（7)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（1〇)之脫 氧核糖核酸探針的墨點在532 nm上之螢光強度爲12790, 完全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧 核糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強 度爲792。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近 似圓形，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相 似。此外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形 式的墨點其間隔約200微米。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -79- 1326769 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（76 ) (實施例17) (1) 合成探針 合成能獨特的結合於目標材料之式（5)的單鏈脫氧核糖 核酸探針作爲探針。 (2) 水溶性聚合物材料 選擇聚乙烯醇（PVA)作爲水溶性的聚合物材料。稱量5 克之聚乙烯基醇（PVA)(商品名：P〇val PVA-117，由 Kuraray Co.，Ltd.生產）並置於燒杯。聚乙烯醇之聚合程度 爲1700且皂化之程度爲98 〇至99.0莫耳％。加入495克 之純水溶解聚乙烯醇，從而製備l.Owt%之聚乙烯醇水溶液 。溶解聚乙烯醇時，將溶液加熱至80°C並混合60分鐘，使 聚乙烯醇完全地溶解。於確認沒有不溶的物質存在之後， 將溶液過濾以預防點墨時塞住噴嘴。用0.22微米之濾膜過 濾。用此方法製備PVA水溶液❶ --------裝 „---訂------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1326769 A7 B7 五、發明説明（77 ) KBM-603，由 The Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.製作）之水 溶液（作爲探針固化材料）在室溫下混合30分鐘以製備胺基 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 矽烷水溶液。然後將5〇〇微莫耳/升具有順丁烯二酸醯亞胺 基團以及羥基琥珀醯亞胺酯基團之雙價試劑（N-(6-順丁烯二 酸醯亞胺基己醯基氧基）磺基琥珀醯亞胺鈉鹽（商品名： sulfo-EMCS ； 由 Dojindo Corporate, Ltd 製作））之水溶液在 室溫下混合5分鐘以製備EMC S水溶液。將胺基矽烷溶液 及EMCS溶液以等體積相混合，並混合5分鐘以得到探針 固定材料之溶液。製備探針固定劑溶液可用於以下之實驗 〇 製備100微升上述製備的探針溶液，滴入100微升探 針黏合劑溶液並混合5分鐘。於混合之後靜置1 0分鐘，滴 入700微升水純以及100微升上述製備的PVA溶液（作爲水 溶性聚合物材料）並混合5分鐘。於混合之後，將混合物靜 置30分鐘以製備探針介質。 (4)淸洗底物 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將1英吋平方之玻璃底物置於卡式盒，並浸沒在事先 加熱至60°C之1莫耳/升之氫氧化鈉溶液10分鐘。其後， 將彼用流動的純水充分沖洗去除滯留在玻璃底物及卡式盒 之氫氧化鈉。於充分的漂洗之後，共同將玻璃底物及卡式 盒浸沒在純水中，並用超音波淸洗10分鐘。超音波淸洗後 ，將彼用流動的純水充分沖洗去除滯留在玻璃底物及卡式 盒之顆粒。逐一用氣體吹乾沖洗過的玻璃底物。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 81 _ 1326769 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明f8 ) (5) 點墨探針介質 將步驟（3)製備的探針介質施用於熱泡噴射列印機（商品 名：BJF850 ; 由Canon Inc.製作）之油墨槽並置入熱泡噴 射頭。本發明使用之熱泡噴射列印機（商品名：B JF 8 5 0 ; 由Canon Inc.製作）經過修改，可在平板上印刷。 然後將步驟（4)製備的玻璃底物置入此列印機，將探針 介質點在玻璃底物上。熱泡噴射液體釋放的表面、頭部以 及玻璃底物液體滯留表面間之距離介於1.2至1.5毫米。於 完成點墨之後’用顯微鏡觀察玻璃底物，結果發現在玻璃 底物之表面形成矩陣形之墨點排列。於進行點墨之後將玻 璃板置於乾燥器。用此方法製作固定探針之底物。 (6) 貯藏 將步驟（5)製作之含固定探針的底物儲存於乾燥器7天 。經調整使含固定探針之底物於貯藏期間保持在溼度3 5% 或3 5%以下以及溫度爲2 5 °C。 (7) 阻塞處理 將步驟（6)貯藏的固定探針之底物用1莫耳濃度 NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)清洗以溼 化含固定型探針之底物的表面，從而可均勻地進行阻塞處 理。然後將玻璃底物浸泡在2%牛血淸白蛋白水溶液，然後 靜置2小時以進行阻塞處理。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -82 - --------^-----„---ΐτ----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1326769 A7 B7 五、發明説明（79 ) (8) 雜交處理 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 具有互補至描述於步驟（5)之式（1)的單鏈脫氧核糖核酸 探針鹼基序列的單鏈脫氧核糖核酸係用脫氧核糖核酸自動 合成儀合成以取得5'端結合若丹明之標記的單股脫氧核糖 核酸探針。將此標記的單股脫氧核糖核酸溶於1莫耳濃度 NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)，於步驟 (7)得到之經阻塞處理的含固定探針之底物係浸泡在溶液， 並在室溫（25 °C )下雜交處理3小時。此後，探針陣列用1莫 耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)淸 洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖核酸探針。 然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾探針固定底 物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon Instruments，Inc.製作）評估在底物上含固定探針之墨點的螢 光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定在100%，PMT設 定在400 V。 (9) 結果 經濟部智慧財產局員4消費合作社印製 步驟（8)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（1)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在532 nm上之螢光強度爲15830，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核 糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度 爲611。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似 圓形，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似 本纸張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） -83 - 1326769 A7 ------B7 五、發明説明p ) 。此外’相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式 的墨點其間隔約200微米《 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (實施例18) (1) 合成探針 上述實施例17之方法製備的單鏈脫氧核糖核酸探針可 應用於下列實驗。 (2) 水溶性聚合物材料 用上述實施例17之方法製備水溶性聚乙烯醇水溶液。 使用尔乙燦醇（PVA)(商品名：pova丨pvA-110，由Kuraray Co.，Ltd.製作）作爲水溶性聚合物材料。聚乙烯醇之聚合程 度爲1000且皂化之程度爲98_0至99.0莫耳％。 (3) 製備探針介質 用上述之實施例17之方法製備探針溶液^ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在上述製備的100微升探針溶液中滴入800微升內含 7.5wt%甘油、7.5wt%尿素、及7 5wt%硫雙乙醇之溶液。滴 入1〇〇微升水溶性聚合物材料水溶液，並混合5分鐘。於 混合之後’將混合物靜置3 〇分鐘以取得探針介質。 (4) 淸洗底物 用上述實施例17之方法淸洗底物製備玻璃底物。 -84- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4坑格（21〇、乂297公釐） 1326769 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明) (5) 探針固定處理 將lwt%內含具有胺基之矽烷化合物（N-/3 (胺基乙基） r -胺基丙基三甲氧基矽烷）之矽烷偶合劑（商品名：KBM-603，由 The Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.製作）之水溶液 在室溫下混合3 0分鐘以製備矽烷偶合劑水溶液。然後，將 步驟（4)淸洗之玻璃底物在室溫（25°C)下浸泡在水溶液20分 鐘，以及用純充分的沖洗去除過剩度的矽烷偶合劑溶液。 將沖洗過的底物之兩面用氮氣吹乾。然後在120 °C之烘箱中 加熱烘烤底物1小時以完成矽烷偶合處理。然後稱取2.7毫 克N-(6-順丁烯二酸醯亞胺基己醯基氧基）磺基琥珀醯亞胺（ 商品名：EMCS 由 Dojindo Corporate, Ltd.製作），並溶於 二甲基亞碾（DMS0)/乙醇（1 : 1)溶液，最終濃度爲0.3毫克/ 毫升，因而製備EMCS溶液。將矽烷偶合處理之底物在室 溫下浸泡在EMCS溶液30分鐘。從EMCS溶液中取出底物 ’依序用DMSO及乙醇的混合溶劑以及乙醇淸洗，以及在 氮氣存在下乾燥。用此方法完成探針固定處理。 (6) 點墨探針介質 將步驟（3)製備的探針介質用上述實施例1 7之方法點墨 以製作固定探針之底物。於完成點墨之後，用顯微鏡觀察 玻璃底物，結果發現在玻璃底物之表面形成矩陣形之墨點 排列。於進行點墨之後將玻璃板置於乾燥器。用此方法製 作固定探針之底物。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（2丨0X297公釐） -------裝-*---_--：---訂------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1326769 A7 B7 五、發明説明f2 ) (7) 貯藏 將步驟（6)製作之含固定探針的底物儲存於乾燥器7天 。經調整使含固定探針之底物於貯藏期間保持在溼度3 5% 或35%以下以及溫度爲25°C。 (8) 阻塞處理 用上述之實施例17之方法進行阻塞處理。 (9) 雜交處理 用上述之實施例17之方法進行雜交處理。此後，探針 陣列用1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 鹼度7.0)淸洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖 核酸探針。然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾 探針固定底物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon Instruments, Inc.製作）評估在底物上含固定 探針之墨點的螢光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定 在 100%，PMT 設定在 400 V。 (1 0)結果 步驟（9)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（5)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在53 2 nm上之螢光強度爲1 1 520，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核 糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度 爲659。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似 --------裝 f I [Ί---訂------.. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS } A4規格（210X297公釐） -86 - 1326769 A7 B7 五、發明説明P ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 圓形’且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似 。此外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式 的墨點其間隔約200微米。 (實施例19) (υ合成探針 合成實施例10中使用之式（5)至（8)的單鏈脫氧核糖核 酸探針以用於下列實驗。 (2) 水溶性聚合物材料 用實施例17之方法製備PVA溶液。 (3) 製備探針介質 製備單鏈脫氧核糖核酸探針溶液之方法如上述之實施 例1 7。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用上述實施例1 7步驟（3)之方法以序列確認號碼：5至 8之單鏈脫氧核糖核酸製備四種類型之探針介質（精確的濃 度係計算自吸收強度）。 (4) 淸洗底物 用上述實施例17之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (5) 點墨探針介質 將步驟（3)製備的四種探針介質分別施用於四個熱泡噴 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -87 - 1326769 A7 B7 五、發明説明严） 射列印機（商品名：BJF8 50 ; 由Canon Inc.製作）之油墨槽 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 並將各油墨槽置入熱泡噴射頭。本發明使用之熱泡噴射列 印機（商品名：BJF850 ; 由Canon Inc.製作）經過修改， 可在平板上印刷。然後將步驟（4)製備的玻璃底物置入此列 印機，將探針介質點在玻璃底物上。熱泡噴射液體釋放的 表面、頭部以及玻璃底物液體滯留表面間之距離介於1.2至 I . 5毫米。於完成點墨之後，用顯微鏡觀察玻璃底物，結果 發現在玻璃底物之表面形成矩陣形之墨點排列。於進行點 墨之後將玻璃板置於乾燥器。含四種類型固定探針之底物 係以此方法製作 (6) 貯藏 將步驟（5)製作之含固定探針的底物儲存於乾燥器7天 。經調整使含固定探針之底物於貯藏期間保持在溼度3 5% 或35%以下以及溫度爲25°C。 (7) 阻塞處理 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 鹼度7.0)淸洗底物之表面，從而可均勻地進行阻塞處理， 而不須進行上述實施例17之阻塞處理。 (8) 雜交處理 用上述之實施例17之方法進行雜交處理。此後，探針 陣列用1莫耳濃度NaC丨/5〇毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -88 - 1326769 A7 B7 五、發明説明r ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 鹼度7.0)淸洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖 核酸探針。然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾 探針固定底物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon Instruments，Inc.製作）評估在底物上含固定 探針之墨點的螢光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定 在 1 00%，PMT 設定在 400 V。 (9)結果 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 步驟（7)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（5)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在532 nm上之螢光強度爲151 20,完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。相反的，具有一 個配對錯誤鹼基序列之式（6)脫氧核糖核酸探針墨點，其螢 光強度爲903 0。具有三個配對錯誤鹼基序列之式（7)脫氧核 糖核酸探針墨點，其螢光強度爲3423，螢光強度爲完全地 符合之脫氧核糖核酸探針的一半以下，具有六個配對錯誤 鹼基序列之式（8)脫氧核糖核酸探針，則無螢光墨點，對應 至墨點位點的螢光強度爲973 »此外，在脫氧核糖核酸探針 墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲653。以螢 光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似圓形，且用 相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似。此外，相 鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式的墨點其間 隔約200微米。從上述之結果可知，完全互補的單股的脫 氧核糖核酸可在DNA陣列底物上獨特的加以偵測。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 89 - 1326769 A 7 B7 五、發明説明f6 ) (實施例20) (1) 合成探針 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用實施例1中能獨特的結合於目標材料之式（1)的單 鏈脫氧核糖核酸探針作爲探針。使用脫氧核糖核酸自動合 成儀合成單股的式（5)。此外，製備含胺基經磷酸鹽基團以 及己橋烷結合至式（1)單鏈脫氧核糖核酸之5,端羥基之十八 院釀寡聚物以用於下列之實驗。 (2) 水溶性聚合物材料 選擇聚乙烯醇（PVA)作爲水溶性的聚合物材料。稱量5 克之聚乙烯基醇（PVA)(商品名·· Poval PVA-117，由 Kuraray Co.，Ltd.生產）並置於燒杯。聚乙烯醇之聚合程度 爲1700且皂化之程度爲87.0至89.0莫耳％。加入495克 之純水溶解聚乙烯醇，從而製備1.0 wt%之聚乙烯醇水溶液 。溶解聚乙烯醇時，將溶液加熱至8CTC並混合60分鐘，使 聚乙烯醇完全地溶解。於確認沒有不溶的物質存在之後， 將溶液過濾以預防點墨時塞住噴嘴。用0.22微米之濾膜過 濾。用此方法製備PVA水溶液。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (3) 製備探針介質 將式（5)之單鏈脫氧核糖核酸探針溶於TE溶液（10毫莫 耳濃度Tris-HCl(酸鹼度8)/1毫莫耳濃度乙二胺四乙酸水溶 液），最終濃度約爲40微莫耳/升，從而製備單鏈脫氧核糖 核酸探針之溶液（精確的濃度係計算自吸收強度）。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -90 - 1326769
五、發明説明r ) --------裝―---- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 然後將5〇〇微莫耳/升具有環氧基團內含矽烷化合物（ r -縮水甘油氧基丙基三甲氧基矽烷）之矽烷偶合劑（商品名 :KBM-403，由 Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.製作）之水溶 液（作爲探針固化材料）在室溫下混合30分鐘以取得探針固 定材料之溶液。 製備1〇〇微升上述製備的探針溶液，滴入100微升探 針黏合劑溶液並混合5分鐘。於混合之後靜置1 0分鐘，滴 入微升水純以及100微升上述製備的PVA溶液（作爲水 溶性聚合物材料）並混合5分鐘。於混合之後，將混合物靜 置30分鐘以製備探針介質。 (4)淸洗底物 訂 用上述實施例17之方法淸洗底物製備玻璃底物。 丨 (5) 點墨探針介質 用上述實施例17之方法將探針介質點在探針介質之底 物上以製備玻璃底物。 經濟部智慧財1局員工消費合作社印製 (6) 貯藏 將步驟（5)製作之含固定探針的底物儲存於乾燥器7天 。經調整使含固定探針之底物於貯藏期間保持在溼度3 5% 或35%以下以及溫度爲25°C » (7) 阻塞處理 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -91 _ 1326769 A7 B7 五、發明説明p ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將步驟（6)貯藏的固定探針之底物用1莫耳濃度 NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7〇)淸洗以溼 化含固定型探針之底物的表面，從而可均勻地進行阻塞處 理。然後將玻璃底物浸泡在2%牛血淸白蛋白水溶液，然後 靜置2小時以進行阻塞處理。 (8) 雜交處理 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具有互補至描述於步驟（1)之式（1)的單鏈脫氧核糖核酸 探針鹼基序列的單鏈脫氧核糖核酸係用脫氧核糖核酸自動 合成儀合成以取得5'端結合若丹明之標記的單股脫氧核糖 核酸探針。將此標記的單股脫氧核糖核酸溶於1莫耳濃度 NaCl/5 0毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)，於步驟 (7)得到之經阻塞處理的含固定探針之底物係浸泡在溶液， 並在室溫（2 5 °C )下雜交處理3小時。此後，探針陣列用1莫 耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)淸 洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖核酸探針。 然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾探針固定底 物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon Instruments，Inc.製作）評估在底物上含固定探針之墨點的螢 光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定在1 〇〇%，PMT設 定在400 V。 (9) 結果 步驟（8)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（1)之脫氧 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210 x 297公釐） -92 - 1326769 A7 B7 五、發明説明P9 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 核糖核酸探針的墨點在532 nm上之螢光強度爲17110，完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核 糖核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度 爲73 1。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似 圓形，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似 。此外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式 的墨點其間隔約2 0 0微米。 (實施例21) (1) 合成探針 上述實施例1之方法製備式（I7)的單鏈脫氧核糖核酸探 針可應用於下列實驗。 (2) 水溶性聚合物材料 用上述之實施例17之方法製備PVA水溶液。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1326769 A7 B7 五、發明説明严）） 將上述式（1)之單鏈脫氧核糖核酸探針分裝入微離心管 ’各管內含17.53毫微莫耳之單鏈脫氧核糖核酸探針，並乾 燥製備內含單鏈脫氧核糖核酸探針之微離心管。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在一個上述製備的裝入脫氧核糖核酸探針的微離心管 中’滴入50微升純水，並混合3分鐘以完全地溶解脫氧核 糖核酸。滴入20微升具有環氧基團內含矽烷化合物（<r -縮 水甘油氧基丙基三甲氧基矽烷）矽烷偶合劑（商品名：KBM_ 403，由 The Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.製作）作爲探針固 定材料’並混合10分鐘。將混合物靜置30分鐘，滴入100 微升PVA水溶液（作爲水溶性聚合物材料）以及1400微升高 沸點溶劑液體，並混合5分鐘。最後滴入430微升純水， 並混合5分鐘，然後混合30分鐘。用此方法製備探針介質 (5) 淸洗底物 用上述實施例17之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (6) 點墨探針介質 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用上述實施例17之方法將探針介質點在探針介質之底 物上以製備玻璃底物。 (7) 貯藏 將步驟（6)製作之含固定探針的底物儲存於乾燥器7天 。經調整使含固定探針之底物於貯藏期間保持在溼度3 5% 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐）-94 - 1326769 A7 ____B7_ 五、發明説明β ) 或3 5%以下以及溫度爲251。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 此外，檢查固定型探針物之乾燥耐藏性，含固定探針 之底物用加熱板在80°C下乾燥5分鐘，然後同樣地儲存在 乾燥器中7天。 (8) 雜交處理 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具有互補至描述於步驟（1)之式（1)的單鏈脫氧核糖核酸 探針鹼基序列的單鏈脫氧核糖核酸係用脫氧核糖核酸自動 合成儀合成以取得5'端結合若丹明之標記的單股脫氧核糖 核酸探針。將標記的單鏈脫氧核糖核酸溶於1莫耳濃度 NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)，最終濃 度爲1微莫耳濃度，將固定探針之底物浸泡在溶液，並在 恒溫箱（4 5 °C )中雜交處理2小時。此後，探針陣列用1莫耳 濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.〇)淸洗 沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖核酸探針。然 後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾探針固定底物 。然後使用營光掃描器（商品名：GenePix 4000B由 Axon Instruments，Inc.製作）評估在底物上含固定探針之墨點的螢 光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定在100%，PMT設 定在400 V。 (9) 結果 步驟（8)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（1)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在532 nm上之螢光強度爲1 2970，完 -95- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1326769 A7 ____B7___ 五、發明説明P2 ) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合，將含固定探針之 底物儲存於乾燥器7天。此外，在脫氧核糖核酸探針墨點 區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲131。相反的， 固定探針之底物在80°C加熱板上乾燥5分鐘，在完全吻合 標記的單鏈脫氧核糖核酸探針之式（5)脫氧核糖核酸探針之 墨點上的53 2 nm螢光強度爲1 3 540。此外，在脫氧核糖核 酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲96 。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似圓形 ，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似。此 外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式的墨 點其間隔約200微米。 (實施例22) (1) 合成探針. 上述實施例1之方法製備式（20)的單鏈脫氧核糖核酸探 針可應用於下列實驗。 (2) 水溶性聚合物材料 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用上述之實施例17之方法製備PVA水溶液。 (3) 高沸點溶劑 二乙二醇（1,2-丙烷二醇，由 Kishida Chemical Co.，Ltd 製作）作爲高沸點溶劑。稱量5.6克之丙二醇，以及7.9克 之異丙醇（2-丙醇，由Kishida Chemical Co.，Ltd製作）並與 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）-96 - 1326769 A7 ____B7 五、發明説明严） 丙二醇混合。混合異丙醇係就考量製備探針介質期間之可 萃取性及混合性。用此方法製備高沸點溶劑液體。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (4) 製備探針介質 將上述式（1)之單鏈脫氧核糖核酸探針分裝入微離心管 ’各管內含17.53毫微莫耳之單鏈脫氧核糖核酸探針，並乾 燥製備內含單鏈脫氧核糖核酸探針之微離心管。 在一個上述製備的裝入脫氧核糖核酸探針的微離心管 中，滴入50微升純水，並混合3分鐘以完全地溶解脫氧核 糖核酸。滴入20微升內含具有異氰酸酯基團之矽烷化合物 (T-異氰酸酯丙基三乙氧基矽烷）矽烷偶合劑（商品名：KBE-9007，由 The Shin-Etsu Chemical Co_，Ltd.製作）作爲探針 固定材料，並混合10分鐘。將混合物靜置30分鐘，滴入 1〇〇微升PVA水溶液（作爲水溶性聚合物材料）以及14〇〇微 升高沸點溶劑液體，並混合5分鐘。最後滴入43 0微升純 水’並混合5分鐘，然後混合30分鐘。用此方法製備探針 介質。 經濟部智慧財凌局員工消費合作社印製 (5) 淸洗底物 用上述實施例17之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (6) 點墨探針介質 用上述實施例17之方法將探針介質點在探針介質之底 物上以製備玻璃底物。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ Q7 . '— - 1326769 A7 B7 五、發明説明（?4 ) (7) 貯藏 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將步驟（5)製作之含固定探針的底物儲存於乾燥器7天 。經調整使含固定探針之底物於貯藏期間保持在溼度3 5% 或35%以下以及溫度爲25°C。 此外’檢查固定型探針物之乾燥耐藏性，含固定探針 之底物用加熱板在80°C下乾燥5分鐘，然後同樣地儲存在 乾燥器中7天。 (8) 雜交處理 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具有互補至描述於步驟（1)之式（1)的單鏈脫氧核糖核酸 探針鹼基序列的單鏈脫氧核糖核酸係用脫氧核糖核酸自動 合成儀合成以取得5'端結合若丹明之標記的單股脫氧核糖 核酸探針。將標記的單鏈脫氧核糖核酸溶於1莫耳濃度 NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)，將固定 探針之底物浸泡在溶液，並在恒溫箱（45 °C )中雜交處理2 小時。此後，探針陣列用1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度 磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)淸洗沖刷去除未與探針核酸雜 交之單鏈脫氧核糖核酸探針。然後用純水移除過量的鹽類 ，接著用氮氣吹乾探針固定底物。然後使用螢光掃描器（商 品名：GenePix 4000B 由 Axon Instruments，Inc.製作）評估 在底物上含固定探針之墨點的螢光強度。評估螢光強度時 ，雷射功率設定在100%，PMT設定在400 V。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -98 - 1326769 A7 _ B7 五、發明説明P5 ) (9)結果 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 步驟（8)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（1)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在532 nm上之螢光強度爲17790,完 全與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合，將含固定探針之 底物儲存於乾燥器7天。此外，在脫氧核糖核酸探針墨點 區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲89。相反的， 固定探針之底物在80°C加熱板上乾燥5分鐘，在完全吻合 標記的單鏈脫氧核糖核酸探針之式（5)脫氧核糖核酸探針之 墨點上的532 nm螢光強度爲1834〇。此外，在脫氧核糖核 酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲81 。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似圓形 ’且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似。此 外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式的墨 點其間隔約200微米。 (比較實施例2) (1) 合成探針 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 上述實施例17之方法製備式（5)的單鏈脫氧核糖核酸探 針可應用於下列實驗。 (2) 水溶性聚合物材料 爲了檢查水溶性聚合物材料之效應，不使用水溶性聚 合物材料來製作含固定探針之底物。 1326769 A7 B7 五、發明説明r ) (3) 製備探針介質 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 上述實施例1*7之方法製備式（5)的單鏈脫氧核糖核酸探 針溶液（精確的濃度係計算自吸收強度）。然後用實施例17 之方法製備由胺基矽烷及雙價試劑構成之探針固定材料溶 液。製備探針固定劑溶液可用於以下之實驗。 製備100微升上述製備的探針溶液，滴入100微升探 針黏合劑溶液並混合5分鐘。於混合之後靜置10分鐘，滴 入8 00微升純水並混合5分鐘。於混合之後，將混合物靜 置30分鐘以製備探針介質。 (4) 淸洗底物 用上述實施例17之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (5) 點墨探針介質 用上述實施例17之方法將探針介質點在探針介質之底 物上以製備玻璃底物。 (6) 貯藏 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將步驟（5)製作之含固定探針的底物儲存於乾燥器7天 。經調整使含固定探針之底物於貯藏期間保持在溼度3 5% 或35%以下以及溫度爲25°C。 (7) 阻塞處理 將步驟（6)貯藏的固定探針之底物用1莫耳濃度 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -1〇〇 - 1326769 A7 B7 五、發明説明（97 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)淸洗以溼 化含固定型探針之底物的表面，從而可均勻地進行阻塞處 理。然後將玻璃底物浸泡在2%牛血淸白蛋白水溶液，然後 靜置2小時以進行阻塞處理。 (8) 雜交處理 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 具有互補至描述於步驟（5)之式（1)的單鏈脫氧核糖核酸 探針鹼基序列的單鏈脫氧核糖核酸係用脫氧核糖核酸自動 合成儀合成以取得5'端結合若丹明之標記的單股脫氧核糖 核酸探針。將此標記的單股脫氧核糖核酸溶於1莫耳濃度 NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)，於步驟 (7)得到之經阻塞處理的含固定探針之底物係浸泡在溶液， 並在室溫（25 °C )下雜交處理3小時。此後，探針陣列用1莫 耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸鹼度7.0)淸 洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖核酸探針。 然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾探針固定底 物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon Instruments，Inc.製作）評估在底物上含固定探針之墨點的登 光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定在1〇〇%，PMT設 定在400 V。 (9) 結果 步驟（8)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（5)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在532 nm上之螢光強度爲1427，完全 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） -1〇1 - 1326769 A7 !__________B7 五、發明説明（P8 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核糖 核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲 697°以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似圓 形’且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似。 此外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式的 墨點其間隔約200微米。用此方法，當使用不含水溶性聚 合物材料之探針介質時，完全吻合的墨點位點具螢光強度 不充分，如此不可能有效地進行偵測。 (比較例3 ) (1) 合成探針 上述實施例1之方法製備式（5)的單鏈脫氧核糖核酸探 針可應用於下列實驗。 (2) 水溶性聚合物材料 爲了檢查水溶性聚合物材料之效應，不使用水溶性聚 合物材料來製作含固定探針之底物。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (3)製備探針介質 上述實施例17之方法製備式（5)的單鏈脫氧核糖核酸探 針溶液（精確的濃度係計算自吸收強度）。製備的探針溶液可 用於下列實驗。 在上述製備的100微升探針溶液中滴入900微升內含 7.5wt%甘油、7_5wt%尿素、及7.5wt°/〇硫雙乙醇之溶液。於 -102- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公董） 1326769 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明？9 ) 混合5分鐘之後，將混合物靜置30分鐘以製備探針介質。 (4) 淸洗底物 用上述實施例17之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (5) 探針固定處理 用上述實施例18之方法在淸洗的玻璃底物上處理固定 探針。 (6) 點墨探針介質 將步驟（3)製備的探針介質用上述實施例17之方法點墨 以製作固定探針之底物。於完成點墨之後，用顯微鏡觀察 坡璃底物’結果發現在玻璃底物之表面形成矩陣形之墨點 排列。於進行點墨之後將玻璃板置於乾燥器。用此方法製 作固定探針之底物。 (7) 貯藏 將步驟（6)製作之含固定探針的底物儲存於乾燥器7天 。經調整使含固定探針之底物於貯藏期間保持在溼度3 5% 或35%以下以及溫度爲25°C。 (8) 阻塞處理 用上述之實施例17之方法進行阻塞處理。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ♦ 項再填1 裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X297公釐） -103- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1326769 A7 ___B7 五、發明説明（100 ) (9)雜交處理 用上述之實施例17之方法進行雜交處理。此後，探針 陣列用1莫耳濃度NaCl/50毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 鹼度7.0)淸洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖 核酸探針。然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾 探針固定底物。然後使用螢光掃描器（商品名：Gen ePix 4000B由Axon Instruments，Inc.製作）評估在底物上含固定 探針之墨點的螢光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定 在 100%，PMT 設定在 400 V。 (1〇)結果 步驟（9)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（5)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在532 nm上之營光強度爲1 5.27，完全 與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合。此外，在脫氧核糖 核酸探針墨點區域之外的區域觀察到及發現的營光強度爲 792。以螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似圓 形，且用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似。 此外，相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式的 墨點其間隔約200微米。 (比較例4 ) (1)合成探針 上述實施例2〇之方法製備式（1)的單鏈脫氧核糖核酸探 針可應用於下列實驗。 ----------„---訂------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（2】0X297公羞） _ -104 1326769 A7 B7 五、發明説明（101 ) "" (2)水溶性聚合物材料 爲了檢查水溶性聚合物材料之效應，不使用水溶性聚 合物材料來製作含固定探針之底物。 & (3 )局沸點溶劑 爲了檢查高沸點溶劑之效應，製作不使用高沸點溶劑 之固定探針底物。 (4) 製備探針介質 上述實施例1之方法製備式（1)的單鏈脫氧核糖核酸探 針溶液（精確的濃度係計算自吸收強度）。用純水取代步驟 (2)的PVA溶液作爲水溶性聚合物材料，以及用異丙醇替代 步驟（3)之高沸點溶劑並混合。製備的探針溶液可用於下列 實驗》 (5) 淸洗底物 用上述實施例17之方法淸洗底物製備玻璃底物。 (6) 探針固定處理 用上述實施例17之方法在淸洗的玻璃底物上處理固定 探針。 (7) 點墨探針介質 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} -^-裝· 項再填寫本一 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4規格（210Χ297公爱) -1〇5 - 1326769 A 7 B7 五、發明説明（102 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將步驟（4)製備的探針介質用上述實施例17之方法點墨 以製作固定探針之底物。於完成點墨之後，用顯微鏡觀察 玻璃底物，結果發現在玻璃底物之表面形成矩陣形之墨點 排列。於進行點墨之後將玻璃板置於乾燥器。用此方法製 作固定探針之底物。 此外，一些探針固定型底物係用80°C熱板處理5分鐘 (8) 貯藏 將步驟（7)製作之含固定探針的底物儲存於乾燥器7天 。經調整使含固定探針之底物於貯藏期間保持在溼度3 5% 或35%以下以及溫度爲25°C » (9) 雜交處理 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用上述之實施例17之方法進行雜交處理。此後，探針 陣列用1莫耳濃度NaCl/5 0毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝溶液（酸 鹼度7.〇)淸洗沖刷去除未與探針核酸雜交之單鏈脫氧核糖 核酸探針。然後用純水移除過量的鹽類，接著用氮氣吹乾 探針固定底物。然後使用螢光掃描器（商品名：GenePix 4000B由Axon Instruments, Inc.製作）評估在底物上含固定 探針之墨點的螢光強度。評估螢光強度時，雷射功率設定 在 100%，PMT 設定在 400 V。 (1 〇)結果 -106- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0乂297公釐） 1326769 A7 ___B7__ 五、發明説明（103 ) 步驟（9)中螢光掃描器評估分析之結果顯示式（1)之脫氧 核糖核酸探針的墨點在532 nm上之螢光強度爲4276，完全 與標記的單鏈脫氧核糖核酸探針吻合，將含固定探針之底 物儲存於乾燥器7天。此外，在脫氧核糖核酸探針墨點區 域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲89。相反的，固 定探針之底物在80°C加熱板上乾燥5分鐘，在完全吻合標 記的單鏈脫氧核糖核酸探針之式（5)脫氧核糖核酸探針之墨 點上的53 2 nm螢光強度爲1286。此外，在脫氧核糖核酸探 針墨點區域之外的區域觀察到及發現的螢光強度爲8 1。以 螢光觀察各脫氧核糖核酸探針之墨點，其均近似圓形，且 用相同探針介質點墨得到的墨點其螢光強度相似。此外， 相鄰墨點間之距離幾乎相同，且配置成格子形式的墨點其 間隔約200微米。 --------φ-裝·----τ--tT------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家朵準（CNS )八4規格（210X297公釐）-107 - 1326769 A7 *8? 五、發明説明（104 ) 配列表 序列表
Canon Kabushiki Kaisha 探針介質 CF016889W0 <110> <120〉 <130> <140〉 <141〉 JP 2001-394086 2001-12-26 10 Patent In Ver. 2. 1 1 18 脫氧核糖核酸 人造的序列 人造序列的描述：作爲探針之寡聚物 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) <150> <151> <160> <170> <210> <211> <212> <213〉 <220> <223〉 <220> <223> Inventor: Okada, Yoshikatsu; Kameyama, Makoto Iwata, Kenichi <400〉 1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 actggccgtc gttttaca 18 <210> 2 <211> 18 pip脫氧核糖核酸 〈213〉 人造的序列 <220〉 <223> 人造序列的描述：作爲探針之寡聚物 <400> 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -1〇8 - 1326769 § 五、發明説明（105 ) actggccgt[ gl11 taca 18 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <210> 3 〈211〉 18 <212〉脫氧核糖核酸 <213>人造的序列 <220〉 <223> 人造序列的描述：作爲探針之寡聚物 probe <400〉 3 actggccgct 1111 taca 18 <210> 4 <211> 18 脫氧核糖核酸 <213〉人造的序列 <220> <223〉人造序列的描述：作爲探針之寡聚物 <400> 4 actggcatct tgttlaca 18 <210〉 5 <211〉 18 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 pip脫氧核糖核酸 人造的序列 <220〉 <223〉人造序列的描述：作爲探針之寡聚物 <400〉 5 actggccgtc gt t i taca 18 <210〉 6 <211> 18 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -1 〇9 - 1326769
Aft ' B7 五、發明説明f106 ) <212〉脫氧核糖核酸〈213〉人造的序列<220〉 <223) 人造序列的描述：作爲探針之寡聚物 <400> 6 actggccgtt gttttaca 18 <210> 7 <211> 18 <212〉脫氧核糖核酸 〈213〉人造的序列<220〉 <223〉人造序列的描述：作爲探針之寡聚物 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ♦ ，項再填· 裝·· <400〉 7 actggccgct tttttaca 18 <210> 8 <211> 18 <212〉脫氧核糖核酸 <213) Artificial Sequence <220〉 <223〉 人造序列的描述··作爲探針之寡聚珣 <400〉 8 actggcatct igittaca 18 <210> 9 <211> 18 脫氧核糖核酸 <213>人造的序列 <220〉 <223> 人造序列的描述：作爲探針之寡聚物 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印敦 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -11〇 - 1326769
五、發明説明（107 ) <400> 9 actggccgtc gttItaca 18 <210> 10 <211> 18 pip脫氧核糖核酸 <213>人造的序列‘ <220> <223> 人造序列的描述：作爲探針之寡聚构 <400> 10 actggccgtc gt tt taca 18 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -111 -