JP4574219B2 - プローブ固定担体およびその製造方法 - Google Patents
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Description
重合度1000以下、ケン化度が90%以上のポリビニルアルコールが0.01%〜10%の濃度で含まれた水溶液を、該プローブ固定担体のプローブを固定した表面全体に付与し、少なくとも50Åの膜厚を有する該ポリビニルアルコールの膜を該プローブ上に形成することで該プローブ固定担体の保管寿命を改良したことを特徴とするプローブ固定担体である。
標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基材に共有結合で固定したプローブ固定担体を用意する工程と、
重合度1000以下、ケン化度が90%以上のポリビニルアルコールが0.01%〜10%の濃度で含まれた水溶液を、該プローブ固定担体のプローブを固定した表面全体に付与し、少なくとも50Åの膜厚を有する該ポリビニルアルコールの膜を該プローブ上に形成することで該プローブ固定担体の保管寿命を改良する工程と、
を有することを特徴とするプローブ固定担体の製造方法である。
標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基材に共有結合で固定したプローブ固
定担体を用意する工程と、
重合度1000以下、ケン化度が90%以上のポリビニルアルコールが0.01%〜10%の濃度で含まれた水溶液を、該プローブ固定担体のプローブを固定した表面全体に付与し、少なくとも50Åの膜厚を有する該ポリビニルアルコールの膜を該プローブ上に形成することで該プローブ固定担体の保管寿命を改良する工程と、
を有することを特徴とするプローブ固定担体の保管寿命の改良方法である。
標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基材に共有結合で固定したプローブ固
定担体を用意する工程と、
重合度1000以下、ケン化度が90%以上のポリビニルアルコールが0.01%〜10%の濃度で含まれた水溶液を、該プローブ固定担体のプローブを固定した表面全体に付与し、少なくとも50Åの膜厚を有する該ポリビニルアルコールの膜を該プローブ上に形成することで該プローブ固定担体の保管寿命を改良する工程と、
該ポリビニルアルコールを付与したプローブ担体を保管する工程と、
を有することを特徴とするプローブ固定担体の保管方法である。
(例1〜15、比較例1)
(1)プローブ合成および蛍光標識した標的物質(ターゲット)の合成
標的物質に対して特異的に結合可能なプローブとして一本鎖DNAプローブを用いた。DNA自動合成機を用いて配列番号:1の一本鎖核酸を合成した。なお、配列番号:1の一本鎖DNA末端にはDNA自動合成機での合成時にチオールモディファイア(Thiol−Modifier)(グレンリサーチ(GlenResearch)社製)を用いる事によってメルカプト(SH)基を導入した。続いて通常の脱保護を行ない、DNAを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の実験に用いた。
配列番号:1
5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3'
配列番号:1の一本鎖DNAプローブと相補的な塩基配列を有する一本鎖DNAプローブをDNA自動合成機で合成し、5’末端にCy3を結合させて標識化した一本鎖DNAプローブを得た。
(2)プローブ固定担体の作成
(基板の洗浄)
プローブ固定担体の基材として、1インチ×3インチ角の合成石英ガラス基板を用いた。該石英ガラス基板の洗浄は以下の通り実施した。すなわち、純水ブラシ洗浄、純水リンス、アルカリ性洗剤超音波洗浄、純水リンス、純水超音波洗浄、純水リンス、窒素ブロー乾燥であり、これにより清浄面を有する石英ガラス基板を用意した。
(表面処理)
アミノシランカップリング剤(商品名:KBM-603;信越化学工業(株)社製)を1重量%になるように水に溶解し、30分間撹拌してメトキシ基を加水分解させた。この水溶液にスライドガラスを30分間浸漬させた後、取り出して純水で洗浄し、オーブン中120℃で1時間ベーク処理を行った。次いで、N−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド(Dojin社製;以後、EMCSと略す)を2.7mg秤量し、ジメチルスルホキシド(DMSO)/エタノールの1:1溶液に最終濃度が0.3mg/mlとなるように溶解したEMCS溶液を用意した。前記のベーク処理したアミノ基導入石英ガラス基板を該EMCS溶液に室温で2時間浸漬して、表面にマレイミド基を導入した。EMCS溶液処理後、基板をDMSO/エタノール混合溶液、エタノールで順次洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥させた。
(プローブ固定)
上記(1)で合成した一本鎖DNAプローブ断片(配列番号:1)をグリセリン7.5重量%、尿素7.5重量%、チオジグリコール7.5重量%、アセチレンアルコール(商品名:アセチレノールE100;川研ファインケミカル(株)社製) 1.0重量%を含む水溶液に、0.6OD(測定波長260nm)になるよう溶解させた。このプローブ含有溶液をインクジェット法により、基板にスポッティングした後、基板を30分間、恒温恒湿チャンバー内に静置して、基板表面のマレイミド基とDNAプローブ末端のメルカプト基とを反応させた。次いで、1M -NaCl/50mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)で洗浄し、純水で軽く洗浄した後、窒素ブロー乾燥してプローブ固定担体を得た。
本検討では(株)クラレ社製のポリビニルアルコールを用いたが、物性値が同等であればいずれのメーカーのポリビニルアルコールでも使用可能である。表1に記載の物性の異なる15種類のポリビニルアルコール樹脂(商品名:ポバール;(株)クラレ社製)を各5g秤量し、純水495gを含むビーカーに攪拌しながら加えて、純水中に分散させた。次いで、1時間温浴により80〜90℃に加熱して溶解し、濃度1.0重量%のポバール水溶液を作製した。放冷後、不溶解物が無いことを確認し、濾過を行ない、ポリビニルアルコール樹脂水溶液を調製した。濾過には0.22μmのメンブレンフィルターを用いた。
初期特性を評価するために、ポリビニルアルコール樹脂PVA103を付与したプローブ固定担体(例1)とポリビニルアルコール樹脂を付与していないプローブ固定担体(比較例1)については、各3枚を作製直後、以下(6)の処理を行った。
(5)保管
前記(3)で調製したポリビニルアルコール樹脂を付与したプローブ固定担体15種およびポリビニルアルコール樹脂を付与していないプローブ固定担体1種を室温環境(温度25±2℃、湿度50±10%RH)下、梱包しない状態で1ヶ月保管した。
(6)ハイブリダイゼーションおよび蛍光評価
ハイブリダイゼーションを行う前にプローブ固定担体に付与したポリビニルアルコール樹脂を溶解・除去するために、該プローブ固定担体を1M -NaCl/50mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)に1時間浸漬した後、純水で洗浄した。この処理後もしくは同時に、例えばウシ血清アルブミンのようなブロッキング剤でブロッキング処理を行ってもよいが、本検討ではブロッキング処理は行わなかった。
(初期特性)
例1の初期特性(3枚の平均)は、スポット蛍光強度21730、バックグランド蛍光強度96であり、比較例1の初期特性(3枚の平均)は、スポット蛍光強度21650、バックグランド蛍光強度98であった。
(保管後の特性比較)
例1〜15の保管後の特性を図1にまとめて示す。保管後のプローブ固定担体の蛍光強度が初期の蛍光強度に対して、80%以上の場合は「○」、60〜80%の場合は「△」、60%未満の場合は「×」で表示している。黒塗りのマークはポリビニルアルコール樹脂水溶液の粘度が高くなり、塗布特性が悪くなり、塗布ムラが目立つ傾向がみられることを表している。保管後の比較例1は60%未満であり、例12〜15とほぼ同等レベルであった。
例1で作成したポリビニルアルコール樹脂PVA103を付与したプローブ固定担体を容器に収納し、その容器を防湿アルミニウム・パッケージに入れて減圧シーリング加工を施した。この処理により、湿度、酸素、紫外線の影響を排除した保管寿命を求めることができる。それらを40℃、60℃、80℃の恒温槽でそれぞれ保管し、蛍光強度の経時変化を測定した。初期の蛍光強度に比べ、70%まで蛍光強度が低下するまでの時間を「保管寿命」と定義し、経時変化のグラフから内挿して求めた。その結果を図2にアレニウス・プロットとして示す。このグラフから外挿すると、本発明のポリビニルアルコール樹脂を付与したプローブ固定担体は減圧シーリング・パッケージ加工を施すことによって、25℃環境保管で、初期の蛍光強度の70%減衰まで約1年(325日)かかり、約1年の保管寿命があることがわかる。
Claims (16)
- 標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基材に共有結合で固定したプローブ固定担体において、
重合度1000以下、ケン化度が90%以上のポリビニルアルコールが0.01%〜10%の濃度で含まれた水溶液を、該プローブ固定担体のプローブを固定した表面全体に付与し、少なくとも50Åの膜厚を有する該ポリビニルアルコールの膜を該プローブ上に形成することで該プローブ固定担体の保管寿命を改良したことを特徴とするプローブ固定担体。 - 前記付与が、スピンコート法、ディップ法またはロールコート法のいずれかの方法によって行われる請求項1に記載のプローブ固定担体。
- 該プローブがオリゴDNAプローブである請求項1に記載のプローブ固定担体。
- プローブ含有液体をバブルジェット方法により前記基材に付与し、固定化した請求項1に記載のプローブ固定担体。
- プローブ固定担体の製造方法において、
標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基材に共有結合で固定したプローブ固定担体を用意する工程と、
重合度1000以下、ケン化度が90%以上のポリビニルアルコールが0.01%〜10%の濃度で含まれた水溶液を、該プローブ固定担体のプローブを固定した表面全体に付与し、少なくとも50Åの膜厚を有する該ポリビニルアルコールの膜を該プローブ上に形成することで該プローブ固定担体の保管寿命を改良する工程と、
を有することを特徴とするプローブ固定担体の製造方法。 - 前記付与が、スピンコート法、ディップ法またはロールコート法のいずれかの方法によって行われる請求項5に記載のプローブ固定担体の製造方法。
- 該プローブがオリゴDNAプローブである請求項5に記載のプローブ固定担体の製造方法。
- プローブ含有液体をバブルジェット法により前記基材に付与し、前記プローブを固定化する請求項5に記載のプローブ固定担体の製造方法。
- プローブ固定担体の保管寿命を改良する方法であって、
標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基材に共有結合で固定したプローブ固定担体を用意する工程と、
重合度1000以下、ケン化度が90%以上のポリビニルアルコールが0.01%〜10%の濃度で含まれた水溶液を、該プローブ固定担体のプローブを固定した表面全体に付与し、少なくとも50Åの膜厚を有する該ポリビニルアルコールの膜を該プローブ上に形成することで該プローブ固定担体の保管寿命を改良する工程と、
を有することを特徴とするプローブ固定担体の保管寿命の改良方法。 - 前記付与が、スピンコート法、ディップ法またはロールコート法のいずれかの方法によって行われる請求項9に記載のプローブ固定担体の保管寿命の改良方法。
- 該プローブがオリゴDNAプローブである請求項9に記載のプローブ固定担体の保管寿命の改良方法。
- プローブ含有液体をバブルジェット方法により前記基材に付与し、固定化した請求項9に記載のプローブ固定担体の保管寿命の改良方法。
- プローブ固定担体の保管方法であって、
標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基材に共有結合で固定したプローブ固定担体を用意する工程と、
重合度1000以下、ケン化度が90%以上のポリビニルアルコールが0.01%〜10%の濃度で含まれた水溶液を、該プローブ固定担体のプローブを固定した表面全体に付与し、少なくとも50Åの膜厚を有する該ポリビニルアルコールの膜を該プローブ上に形成することで該プローブ固定担体の保管寿命を改良する工程と、
該ポリビニルアルコールを付与したプローブ担体を保管する工程と、
を有することを特徴とするプローブ固定担体の保管方法。 - 前記付与が、スピンコート法、ディップ法またはロールコート法のいずれかの方法によって行われる請求項13に記載のプローブ固定担体の保管方法。
- 該プローブがオリゴDNAプローブである請求項13に記載のプローブ固定担体の保管方法。
- プローブ含有液体をバブルジェット方法により前記基材に付与し、前記プローブを固定化する請求項13に記載のプローブ固定担体の保管方法。
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