JP2005315785A - プローブ固定担体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 プローブ担体の保管寿命を向上させること。
【解決手段】 基材上の所定部位にプローブを固定したプローブ固定担体の少なくともプローブ固定部位に、重合度２０００以下、ケン化度８５％以上のポリビニルアルコールを含有させる。
【選択図】 なし

Description

本発明は、プローブを基材上に固定したプローブ固定担体、その製造方法、プローブ担体の保管寿命を改良する方法及びプローブ担体の保管方法に関する。

核酸の塩基配列の決定、検体試料中の目的とする特定の塩基配列をもつ核酸の検出、各種細菌の同定を迅速・正確に行い得る技術のひとつとして、標的核酸とハイブリダイゼーション反応により特異的に結合する物質、いわゆるプローブを固相支持体上に多数並べたプローブ媒体（プローブアレイ）の使用が提案されている。

プローブを固相支持体上に固定する方法としてはさまざまな方法が知られている。詳細には、固相支持体上においてプローブの逐次合成を行うことにより固定する方法（オン・チップ法）、予め用意されたプローブをピンもしくは、スタンプなどにより基材上に付与することにより固定する方法などが知られている。具体的には、特許文献１に記載されているように、基体の選択された領域からアクチベ−タ−によって保護基を除去し，除去可能な保護基を有するモノマ−を前記領域に結合させることを繰返すことにより，基体上で種々の配列を有するポリマ−を合成する方法が知られている。また、特許文献２に記載されているように、基材及び該基材上に担持されたカルボジイミド基を有する高分子化合物よりなる固定用の材料と、カルボジイミド基との反応性を有する生物学的に活性な物質を接触させることにより固定する方法が知られている。また、特許文献３に記載されているように末端部にチオール基を有するＤＮＡ断片と、該チオール基と反応して共有結合を形成し得る反応性置換基を有する鎖状分子が一方の末端で表面に固定された固相担体とを液相にて接触させることにより、該ＤＮＡ断片と鎖状分子との間で共有結合を形成させることによるＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法が知られている。また、ＤＮＡ断片と親水性ポリマーとを水性媒体に溶解あるいは分散してなる水溶液を、固相担体表面に点着することによって、ＤＮＡ断片と固相担体表面との結合を安定化させることができると特許文献４に記載されている。

標的物質のプローブ以外への非特異的吸着を抑えるためのプローブ固定担体の処理については、スキムミルクなどを用いてブロッキング処理することが知られている。具体的には、特許文献５に記載されているように、試料核酸の膜への固定後、この膜をスキムミルクとＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネートとを反応させた溶液でブロッキング処理する方法が知られている。他に、試料核酸の膜への固定後に、水溶性高分子溶液に浸漬してブロッキング処理することが知られている。具体的には、特許文献６に記載されているように、試料核酸のニトロセルロース膜への固定後、ＰＶＡ又は／及びＰＶＰを含有する溶液に浸してブロッキング処理する方法が知られている。
米国特許第５１４３８５４５号明細書 特開平８−２３９７５号公報 特開２００１−１７８４４２号公報 特開２０００−２９５９９０号公報 特公平０６−０３４７５６号公報 特許第２７９４７２８号公報

上記の従来技術により作成されたプローブ固定担体のその機能に関する保管寿命について言及した文献はほとんどないが、特許文献４によれば、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップで数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡチップではさらに長期間であると記載されている。しかしながら、本発明者らの検討によれば、オリゴＤＮＡをプローブとしてガラス基材に固定したプローブ固定担体においても、プローブ固定担体に蛍光標識した標的物質（ターゲット）をハイブリダイゼーション反応させてその蛍光強度を測定した場合、該プローブ固定担体を作成してから使用するまでの経過時間により、該蛍光強度が低下していく現象がみられる。この現象はプローブ固定担体を乾燥状態で保管した場合に顕著である。リン酸緩衝液中に保管した場合には、この蛍光強度の経時的劣化は緩和されるが、それでも数ヶ月で作成初期の蛍光強度に比べ、ほぼ半減する現象がみられる。

本発明は上記の課題を鑑みて成されたものである。すなわち、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを固相支持体に共有結合で固定したプローブ固定担体において、重合度２０００以下、ケン化度８５％以上のポリビニルアルコール、より好ましくは、重合度が１０００以下、ケン化度が９０％以上のポリビニルアルコールを該プローブ固定担体に含有させることによって該プローブ固定担体の保管寿命を改良できることが判明した。

すなわち、本発明にかかるプローブ固定担体は、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基材に共有結合で固定したプローブ固定担体において、重合度２０００以下、ケン化度８５％以上のポリビニルアルコールを該プローブ固定担体に含有させることによって該プローブ固定担体の保管寿命を改良したことを特徴とするプローブ固定担体である。

また、本発明にかかるプローブ固定担体の製造方法は、プローブ固定担体の製造方法において、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基材に共有結合で固定したプローブ固定担体を用意する工程と、重合度２０００以下、ケン化度８５％以上のポリビニルアルコールを該プローブ固定担体の少なくともプローブが固定された部位に含有させて、該プローブ固定担体の保管寿命を改良する工程と、を有することを特徴とするプローブ固定担体の製造方法である。

また、本発明にかかるプローブ固定担体の保管寿命を改良する方法は、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基材に共有結合で固定したプローブ固定担体を用意する工程と、重合度２０００以下、ケン化度８５％以上のポリビニルアルコールを該プローブ固定担体の少なくともプローブが固定された部位に含有させて、該プローブ固定担体の保管寿命を改良する工程と、を有することを特徴とするプローブ固定担体の保管寿命の改良方法である。

更に、本発明にかかるプローブ固定担体の保管方法は、プローブ固定担体の保管方法であって、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基材に共有結合で固定したプローブ固定担体を用意する工程と、重合度２０００以下、ケン化度８５％以上のポリビニルアルコールを該プローブ固定担体の少なくともプローブが固定された部位に含有させて、該プローブ固定担体の保管寿命を改良する工程と、該ポリビニルアルコールを付与したプローブブ担体を保管する工程と、を有することを特徴とするプローブ固定担体の保管方法である。

標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを固相支持体に共有結合で固定したプローブ固定担体において、重合度２０００以下、ケン化度８５％以上のポリビニルアルコール、より好ましくは、重合度が１０００以下、ケン化度が９０％以上のポリビニルアルコールを該プローブ固定担体に含有させることによって該プローブ固定担体の保管寿命を改良できることがわかる。

本発明は、標的物質（ターゲット）に対して特異的に結合可能なプローブを有するプローブ固定担体において、プローブ固定担体の劣化を抑制する方法およびプローブ固定担体の製造方法に関する。

プローブの担体としての基材は、プローブを固定し、得られたプローブ固定担体を用いて検知物質（標的物質）を検出するのに支障のないものであれば特に限定されるものではないが、その構成材料としては、例えば無機材料、高分子材料またはこれらの複合材料などがあげられる。

具体的には、基材の少なくとも表面（プローブを担持させるべき表面）を無機材料から構成する場合は、表面に必要に応じて塩基性基が導入された基材が利用できる。基材表面へアミノ基などの塩基性基を導入する場合は、基材表面を例えばアミノ基を有するシランカップリング剤で処理したものが好ましい。この場合には効率的にシランカップリング剤で処理できるような材料、特には石英、ガラス、シリカ、アルミナ、タルク、クレー、アルミニウム、水酸化アルミニウム、鉄、マイカなどが好ましいが、酸化チタン、亜鉛華、酸化鉄などの酸化物などを使用することもできる。また、標的物質の検出や材料としての汎用性を考慮すると、アルカリ成分などが含まれない無アルカリガラスもしくは石英が特に好ましい。

アミノ基を有するシランカップリング剤としては、Ｎ−β(アミノエチル)γ−アミノプロピルトリアルコキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルメチルジアルコキシシラン、γ−アミノプロピルトリアルコキシシラン、γ−アミノプロピルメチルジアルコキシシランなどがあげられる。アルコキシシリル基としては、加水分解が速やかに行えるメトキシシリル基もしくはエトキシシリル基が好ましい。これらは必要に応じて２種以上を組み合わせて用いることもできる。

また高分子材料としては、アミノ基などの塩基性基を有する高分子材料または、塩基性基を容易に導入できる高分子材料が好ましい。例えば、末端にアミノ基を持つポリアミドなどを利用する方法、保護したアミノ基とビニル基を持つ重合性化合物を共重合させ、保護基を外す方法などがある。

なお、本発明で用いられるシランカップリング剤とは、樹脂などの有機化合物と反応しうる有機官能基と、ガラスなどの無機化合物とシロキサン結合を介して結合しうる部分を併せ持つ化合物のことを言う。

また、基材の形状は制約されるものではないが、ＤＮＡチップを例として挙げるならば検出方法および装置などの汎用性から板状であることが好ましい。更に、板状とした場合は、自動焦点方式のみならず、焦点深度の影響が大きい方式の検出装置にも適用可能である点などから、基板の平面性、更には表面の平滑性が高い基材であることが好ましく、そのサイズとしては、具体的には１インチ×３インチ、厚さ0.7〜1.5mm程度の板状基材であることが好ましい。

基材の表面をシランカップリング剤で処理する際には、基材上を予め洗浄しておくことが好ましい。洗浄方法としては、水による洗浄，薬液による洗浄、プラズマによる洗浄、ＵＶオゾンによる洗浄など多くの方法が知られているが、簡易的に尚且つ均一に洗浄する方法としては、薬液による洗浄方法が適当である。基材の種類によっても好適な洗浄方法は異なるが、例えば基材としてガラスを用いる場合は、所定濃度の水酸化ナトリウム水溶液を用いて基材表面を十分に洗浄し、基材上に付着した汚れを除去する方法が挙げられる。具体的に述べるのであれば、６０℃程度に加温した１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用意し、水溶液中で基材表面をワイピングするもしくは水溶液をシャワーリングしながらブラッシングすることにより基材上に付着した汚れを確実に除去する。汚れを除去した後、余分な水酸化ナトリウム分を十分に水で洗い流す。最後にＮ₂などの不活性ガスでブローするなどの方法で水分除去を行う。

シランカップリング剤を基材表面に付与する方法としては、浸漬法（ディッピング法）、スピンコート法、スプレーコート法などの方法が利用できる。特に簡便且つ均一に処理できる浸漬法が好ましい。水に0.1〜2.0重量％濃度でシランカップリング剤を溶解させた水溶液に、洗浄した基材を浸漬し、反応終了後余分なシランカップリング剤を含む溶液を洗い流すことで基材表面を処理することが好ましいが、シランカップリング剤の付与の方法は、特に限定されるものではない。また、基材から余分なシランカップリング剤を除去し、１００〜１２０℃くらいの温度で乾燥させることが好ましい。

シランカップリング剤の基板表面への付与量を正確に求めることは、技術的に非常に難しいが、例えば、エリプソメータによる膜厚測定では数十Åでその効果を認めることができる。また、基材へのシランカップリング剤の処理の効果は簡便には、接触角を測定することによって確認できる。

本発明に使用されるプローブとしては、タンパク質（複合タンパク質を含む）、核酸、糖鎖（複合糖質を含む）、脂質（複合脂質を含む）等の生体高分子高分子などが含まれる。具体的には、酵素、ホルモン、フェロモン、抗体、抗原、ハプテン、ペプチド、合成ペプチド、DNA、合成DNA、RNA、合成RNA、PNA、合成PNA、ガングリオシド、レクチンなどがあげられる。基板への付与に用いるプローブ含有液体中に含まれるプローブの量としては、例えば核酸プローブの場合、特に、ＤＮＡプローブの場合、プローブ安定性を考慮すると、例えば２ｍｅｒ〜５００ｍｅｒ、特には２ｍｅｒ〜８０ｍｅｒのオリゴ核酸プローブを用いるのが好ましい。

プローブにチオール基を導入して用いる場合は、例えば、自動合成するＤＮＡをプローブとする場合にはＤＮＡ自動合成機での合成時にチオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（グレンリサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）を用いる事ができる。なお、効率良くチオール基の導入することができれば、特に限定されるものではない。

プローブの基材への付与は、プローブを水性媒体に溶解あるいは分散した水性液であるプローブ含有液体を、インクジェット法、ピン法あるいはピン＆リング法などのスポッティング法により塩基性基を有する基材に付与することにより行うことができる。

スポッティング方法に関し、上述した方法の中でも特にインクジェット法は高密度で尚且つ正確なスポッティングができることから好適な方法である。インクジェット法とは、ごく細いノズルの中にプローブを含む溶媒を入れ、ノズルの先端近くを瞬間的に加圧ないし加熱し、ノズルの先端から正確に極微量のプローブを含む溶媒を飛び出させ、空間を飛翔させて基材面に付着させるというものである。インクジェット法によるスポッティング方法において、プローブ含有液体は、水とプローブとして機能する物質とを少なくとも含み、必要に応じてインクジェット法への適性を確保するための成分を更に含むことができる。この成分はプローブ含有液体をインクジェットヘッドから吐出させた時にプローブに対して実質的に影響を与えないものであって、且つインクジェットヘッドを用いて基材上に正常に吐出可能である媒体組成を満たすものであれば、特に限定されるものではない。例えば、インクジェットヘッドが媒体に熱エネルギーを付与して吐出させる機構を備えるバブルジェットヘッドである場合、グリセリン、チオジグリコール、イソプロピルアルコール及びアセチレンアルコールはプローブ含有液体に含まれる成分として好ましいものである。更に具体的に述べるのであれば、グリセリン５〜１０重量％、チオジグリコール５〜１０重量％及びアセチレンアルコール０．５〜１重量％を含むプローブ含有液体が好適に用いられる。また、インクジェットヘッドが圧電素子を用いて液体を吐出させるピエゾジェットヘッドである場合、エチレングリコール及びイソプロピルアルコールはプローブ含有液体に含まれる成分として好ましいものである。更に具体的には、エチレングリコール５〜１０重量％及びイソプロピルアルコール０．５〜２重量％を含むプローブ含有液体が好適に用いられる。

なお、プローブのプローブ含有液体中での濃度は、基材表面に形成するスポット中でのプローブ量や用いるスポッティング方法に応じて選択されるが、例えば核酸プローブの場合では、プローブ含有液体中での核酸プローブの安定性などを考慮すると、２ｍｅｒ〜５００ｍｅｒ、特には２ｍｅｒ〜８０ｍｅｒの核酸プローブにおいて、０．０５〜５００μＭ、特には０．５〜５０μＭの濃度となるように調整することが好ましい。

このようにして得られたプローブ含有液体をインクジェットヘッドより吐出させ基材上に付着させた時、スポットの形状が円形で、また液体が付与された範囲が広がることがないことが好ましい。高密度にプローブをスポッティングした場合にも、隣接するスポットとの連結を有効に抑えることができる。なお、プローブ含有液体の組成並びに特性は上記のものに限定されるものではない。

また、水の含有量は、添加する成分によって異なるが、通常５０〜９０重量％の範囲が一般的である。

また、予めプローブと塩基性基を有するシランカップリング剤を水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、インクジェット法もしくはピン法などの方法により、基材表面に接触させ、基材への塩基性基の導入と、プローブの固定を同時に行っても良い。この場合のシランカップリング剤の濃度は、先に挙げた基板表面への付与量を達成できるように調整するとよい。

さらに、スポット中でのプローブの乾燥を低減するために、プローブ含有液体中に、高沸点の物質を含有させてもよい。高沸点の物質としては、プローブ含有液体の主体である水に溶解し得るものであって、かつプローブ含有液体の粘性を大きくしない物質であることが好ましい。このような物質としては、グリセリン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、チオジグリコール、ジメチルスルホキシドおよび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親水性ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、パオゲン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、デキストラン、プルラン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。高沸点の物質としては、エチレングリコールまたはジエチレングリコールを用いることがさらに好ましい。高沸点の物質の濃度は、プローブ含有液体中、０．１〜１０容量％の範囲にあることが好ましい。また、プローブを付与した後の固相担体を、９０％以上の湿度および２０〜５０℃の温度範囲の環境においてもよい。

スポッティング後、過剰のプローブを洗浄して除去することが好ましい。プローブの種類にもよるが、チオール基を導入した１本鎖ＤＮＡプローブを用いた場合１分以内でプローブは固定されるが、１０分以上放置した後に除去することが好ましい。

このようにして得られたプローブ固定担体は、標的物質を検出するために好適に利用できる。

ここで、このプローブ固定担体を用いて、例えば標的物質の検出等を行う場合の検出精度（Ｓ／Ｎ比）の向上を図ることを目的として、プローブを固相表面に固定した後、基材上のプローブ非結合部分が検体（サンプル）中に含まれる標的物質等と結合しないようにブロッキングを行っても良い。ブロッキングは例えば、プローブ固定担体を１〜２重量％ウシ血清アルブミン水溶液中に、２時間程度浸すことにより行うことができる。プローブ固定担体上のプローブ固定部位以外への標識物質の吸着を防ぐ効果からすると、ウシ血清アルブミン水溶液が好適である。なお、このブロッキングの工程は必要に応じて行えば良く、例えばサンプル（測定用試料）のプローブ固定担体への供給を各々のスポットに対して限定的に行い、スポット以外の部位へのサンプルの付着が実質的にない場合にはブロッキングを行わなくても良い。スポット以外の部位へのサンプルが付着するかどうかは、基材を構成する材料や、シランカップリング剤の種類などによって異なる。例えば、基材がガラス、石英などから構成され、更に、塩基性基を有するシランカップリング剤のような物質とチオール基を有するプローブを含むプローブ媒体をスポッティングする場合には、ブロッキング操作は必要ない。

本発明においては、基材上の少なくともプローブ固定部位に更に、重合度２０００以下、ケン化度８５％以上のポリビニルアルコールを含有させることによってプローブ固定担体の保管寿命を改良する。ポリビニルアルコールの重合度が１０００以下、ケン化度が９０％以上であることが更に好ましい。なお、ポリビニルアルコールの重合度の下限は、重合度５０が好ましく、重合度１００が更に好ましい。このような、ポリビニルアルコールのケン化度、重合度は、ＪＩＳ Ｋ ６７２６−１９９４のポリビニルアルコール試験方法に準じて測定を行えばよい。

また、ポリビニルアルコールのプローブ固定部位（スポット）中での含有量は、エリプソメータにより膜厚を測定し、少なくとも５０Åでその効果があることを確認した。

ポリビニルアルコールは、水溶液としてプローブ固定担体のプローブが固定された面に付与することができ、付与方法としては、スピンコート法、ディップ法、ロールコート法、インクジェット法、ピン法などを利用することができる。プローブ固定担体のプローブ固定した部分だけにポリビニルアルコールを含有させてもよいし、プローブを固定した表面全体にポリビニルアルコールを付与してもよい。ポリビニルアルコールの水溶液中の濃度は、例えば0.01％〜10％（重量基準）の範囲から選択することが好ましい。

この様にして作製したプローブ固定担体はその用途に応じて、例えば同じプローブを含む複数のスポットを有するように構成しても良く、また異種のプローブを各々含む複数のスポットを有する様に構成してもよい。プローブの種類、数量、配置は必要に応じて適宜変更することが可能である。そしてこの様な方法によってプローブが高密度に配置されたプローブ固定担体は、その後標的物質の検出や、標的物質塩基配列の特定等に好適に用いられる。例えばサンプル中に含まれている可能性のある、塩基配列が既知の標的物質である一本鎖核酸の検出に用いる場合には、標的物質の一本鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸をプローブとして用い、プローブを含む複数のスポットが基材（固相）上に配置されているプローブ固定担体を用意し、プローブ固定担体の各々のスポットに、検知物質を含むサンプルを付与して該標的物質の一本鎖核酸とプローブとがハイブリダイズするような条件下に置いた後、各々のスポットにおけるハイブリッドの形成の有無を、例えば蛍光、電波、磁力による検出等の既知の方法で検出する。それによって、サンプル中における標的物質の有無の検出を行うことができる。

また、サンプル中に含まれている標的物質である一本鎖核酸における塩基配列の特定に用いる場合には、標的物質である一本鎖核酸における塩基配列の複数の候補を設定し、塩基配列群に対して各々相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸をプローブとして基材上にスポッティングする。次いで、各々のスポットにサンプルを供給して標的物質の一本鎖核酸とプローブとがハイブリダイズするような条件下に置いた後、各々のスポットにおけるハイブリッドの形成の有無を蛍光検出等の既知の方法で検出する。これにより、標的物質である一本鎖核酸の塩基配列の特定を行うことができる。また本発明に係わるプローブ固定担体の他の用途としては、例えばＤＮＡ結合蛋白質が認識する特異的な塩基配列のスクリーニングやＤＮＡに結合する性質を有する化学物質のスクリーニングへの適用が考えられる。

ハイブリダイゼーションは標識した核酸断片サンプルが溶解あるいは分散してなる水性液を、上記で作製したプローブ固定担体（例えばＤＮＡチップ）上に付与することによって実施することが好ましい。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、そして２〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、検出系の構成に応じて必要であれば未反応の試料核酸断片を除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。

ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーションの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮＡ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハイブリダーゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。１塩基ミスマッチ（１塩基変異）の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を２種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比較や定量ができる特徴もある。

以下、実験例等をもって本発明を更に詳細に説明する。
（例１〜１５、比較例１）
（１）プローブ合成および蛍光標識した標的物質（ターゲット）の合成
標的物質に対して特異的に結合可能なプローブとして一本鎖ＤＮＡプローブを用いた。ＤＮＡ自動合成機を用いて配列番号：１の一本鎖核酸を合成した。なお、配列番号：１の一本鎖ＤＮＡ末端にはＤＮＡ自動合成機での合成時にチオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（グレンリサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）を用いる事によってメルカプト（ＳＨ）基を導入した。続いて通常の脱保護を行ない、ＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の実験に用いた。
配列番号：１
5'HS-(CH₂)₆-O-PO₂-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3'
配列番号：１の一本鎖ＤＮＡプローブと相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡプローブをＤＮＡ自動合成機で合成し、５’末端にＣｙ３を結合させて標識化した一本鎖ＤＮＡプローブを得た。
（２）プローブ固定担体の作成
（基板の洗浄）
プローブ固定担体の基材として、１インチ×３インチ角の合成石英ガラス基板を用いた。該石英ガラス基板の洗浄は以下の通り実施した。すなわち、純水ブラシ洗浄、純水リンス、アルカリ性洗剤超音波洗浄、純水リンス、純水超音波洗浄、純水リンス、窒素ブロー乾燥であり、これにより清浄面を有する石英ガラス基板を用意した。
（表面処理）
アミノシランカップリング剤(商品名：KBM-603；信越化学工業(株)社製)を１重量％になるように水に溶解し、30分間撹拌してメトキシ基を加水分解させた。この水溶液にスライドガラスを30分間浸漬させた後、取り出して純水で洗浄し、オーブン中120℃で１時間ベーク処理を行った。次いで、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（Ｄｏｊｉｎ社製；以後、ＥＭＣＳと略す）を２．７ｍｇ秤量し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１溶液に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。前記のベーク処理したアミノ基導入石英ガラス基板を該ＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸漬して、表面にマレイミド基を導入した。ＥＭＣＳ溶液処理後、基板をＤＭＳＯ／エタノール混合溶液、エタノールで順次洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥させた。
（プローブ固定）
上記（１）で合成した一本鎖ＤＮＡプローブ断片（配列番号：１）をグリセリン７．５重量％、尿素７．５重量％、チオジグリコール７．５重量％、アセチレンアルコール(商品名：アセチレノールＥ１００；川研ファインケミカル(株)社製) １．０重量％を含む水溶液に、０．６ＯＤ（測定波長260nm）になるよう溶解させた。このプローブ含有溶液をインクジェット法により、基板にスポッティングした後、基板を３０分間、恒温恒湿チャンバー内に静置して、基板表面のマレイミド基とＤＮＡプローブ末端のメルカプト基とを反応させた。次いで、1M -NaCl/50mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)で洗浄し、純水で軽く洗浄した後、窒素ブロー乾燥してプローブ固定担体を得た。

（３）ポリビニルアルコールの溶解とプローブ固定担体への付与
本検討では（株）クラレ社製のポリビニルアルコールを用いたが、物性値が同等であればいずれのメーカーのポリビニルアルコールでも使用可能である。表１に記載の物性の異なる１５種類のポリビニルアルコール樹脂（商品名：ポバール；（株）クラレ社製）を各５ｇ秤量し、純水４９５ｇを含むビーカーに攪拌しながら加えて、純水中に分散させた。次いで、１時間温浴により８０〜９０℃に加熱して溶解し、濃度１．０重量％のポバール水溶液を作製した。放冷後、不溶解物が無いことを確認し、濾過を行ない、ポリビニルアルコール樹脂水溶液を調製した。濾過には０．２２μｍのメンブレンフィルターを用いた。

ポリビニルアルコール樹脂をプローブ固定担体へ付与する方法であるが、本検討ではスピンコート法（回転数：３０００ｒｐｍ、回転時間：１秒）によりプローブ固定担体へ付与した。しかしながら、スピンコート法に限定されるものではなく、当該技術分野で通常用いられるディップ法、ロールコート法なども適用可能であり、またインクジェット法、ピン法などでプローブ固定担体のプローブ固定した部分だけにポリビニルアルコール樹脂を含有させてもよい。

（４）初期特性の評価
初期特性を評価するために、ポリビニルアルコール樹脂PVA103を付与したプローブ固定担体（例１）とポリビニルアルコール樹脂を付与していないプローブ固定担体（比較例１）については、各３枚を作製直後、以下（６）の処理を行った。
（５）保管
前記（３）で調製したポリビニルアルコール樹脂を付与したプローブ固定担体１５種およびポリビニルアルコール樹脂を付与していないプローブ固定担体１種を室温環境（温度２５±２℃、湿度５０±１０％RH）下、梱包しない状態で１ヶ月保管した。
（６）ハイブリダイゼーションおよび蛍光評価
ハイブリダイゼーションを行う前にプローブ固定担体に付与したポリビニルアルコール樹脂を溶解・除去するために、該プローブ固定担体を1M -NaCl/50mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)に１時間浸漬した後、純水で洗浄した。この処理後もしくは同時に、例えばウシ血清アルブミンのようなブロッキング剤でブロッキング処理を行ってもよいが、本検討ではブロッキング処理は行わなかった。

前記（１）で合成した蛍光標識した標的物質を1M -NaCl/50mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)に最終濃度５ｎＭとなるように溶解し、この溶液中に前記の洗浄済みのプローブ固定担体を浸漬し、温度４５℃で２時間ハイブリダイゼーション処理を行った。処理後、プローブ固定担体を1M -NaCl/50mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)により洗浄し、ハイブリダイズしなかった一本鎖DNAを洗い流した。次いで、純水で軽く洗浄し、塩分除去した後に、窒素ブローにて乾燥した。

該プローブ固定担体のスポットの蛍光強度を蛍光スキャナー（商品名：GenePix4000B/Axon Instruments , Inc.製）を用いて測定した。なお、測定条件は各例（比較例１を含む）とも同一とした（蛍光強度測定波長：532nm）。

（７）結果
（初期特性）
例１の初期特性（３枚の平均）は、スポット蛍光強度２１７３０、バックグランド蛍光強度９６であり、比較例１の初期特性（３枚の平均）は、スポット蛍光強度２１６５０、バックグランド蛍光強度９８であった。

特許文献６によれば、PVA（ポリビニルアルコール）、またはPVAとPVP（ポリビニルピロリドン）混合溶液で核酸固定したニトロセルロース膜のブロッキング処理が可能である（S/N比の向上）ことが記載されているが、上述のようにガラス基材を固相支持体とした本検討ではブロッキング処理の効果は認められなかった。
（保管後の特性比較）
例１〜１５の保管後の特性を図１にまとめて示す。保管後のプローブ固定担体の蛍光強度が初期の蛍光強度に対して、８０％以上の場合は「○」、６０〜８０％の場合は「△」、６０％未満の場合は「×」で表示している。黒塗りのマークはポリビニルアルコール樹脂水溶液の粘度が高くなり、塗布特性が悪くなり、塗布ムラが目立つ傾向がみられることを表している。保管後の比較例１は６０％未満であり、例１２〜１５とほぼ同等レベルであった。

この結果から、プローブ固定担体の保管寿命を改良するためには、重合度２０００以下、ケン化度８５％以上、より好ましくは、重合度が１０００以下、ケン化度が９０％以上のポリビニルアルコール樹脂を該プローブ固定担体に含有させることが有効であることがわかる。

（例１６）
例１で作成したポリビニルアルコール樹脂PVA103を付与したプローブ固定担体を容器に収納し、その容器を防湿アルミニウム・パッケージに入れて減圧シーリング加工を施した。この処理により、湿度、酸素、紫外線の影響を排除した保管寿命を求めることができる。それらを４０℃、６０℃、８０℃の恒温槽でそれぞれ保管し、蛍光強度の経時変化を測定した。初期の蛍光強度に比べ、７０％まで蛍光強度が低下するまでの時間を「保管寿命」と定義し、経時変化のグラフから内挿して求めた。その結果を図２にアレニウス・プロットとして示す。このグラフから外挿すると、本発明のポリビニルアルコール樹脂を付与したプローブ固定担体は減圧シーリング・パッケージ加工を施すことによって、２５℃環境保管で、初期の蛍光強度の７０％減衰まで約１年（３２５日）かかり、約１年の保管寿命があることがわかる。

ポリビニルアルコール樹脂の物性値と１ヶ月保管時の蛍光強度の減衰特性を示すグラフである。 ポリビニルアルコール樹脂PVA103を付与したプローブ固定担体の保管寿命を示すアレニウス・プロットである。ここでは保管寿命を初期のプローブ固定担体で得られていた蛍光強度に対し、保管後の傾向強度が７０％減衰するまで、と定義している。

Claims (13)

1. 標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基材に共有結合で固定したプローブ固定担体において、重合度２０００以下、ケン化度８５％以上のポリビニルアルコールを該プローブ固定担体に含有させることによって該プローブ固定担体の保管寿命を改良したことを特徴とするプローブ固定担体。
2. 該ポリビニルアルコールの重合度が１０００以下、ケン化度が９０％以上である請求項１に記載のプローブ固定担体。
3. 該プローブがオリゴＤＮＡプローブである請求項１に記載のプローブ固定担体。
4. プローブ含有液体をスポッティング方法により前記基材に付与し、固定化した請求項１に記載のプローブ固定担体。
5. プローブ固定担体の製造方法において、
   標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基材に共有結合で固定したプローブ固定担体を用意する工程と、重合度２０００以下、ケン化度８５％以上のポリビニルアルコールを該プローブ固定担体の少なくともプローブが固定された部位に含有させて、該プローブ固定担体の保管寿命を改良する工程と、を有することを特徴とするプローブ固定担体の製造方法。
6. 該プローブがオリゴＤＮＡプローブである請求項５に記載の製造方法。
7. プローブ含有液体をスポッティング方法により前記基材に付与し、前記プローブを固定化する請求項５に記載の製造方法。
8. プローブ固定担体の保管寿命を改良する方法であって、
   標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基材に共有結合で固定したプローブ固定担体を用意する工程と、重合度２０００以下、ケン化度８５％以上のポリビニルアルコールを該プローブ固定担体の少なくともプローブが固定された部位に含有させて、該プローブ固定担体の保管寿命を改良する工程と、を有することを特徴とするプローブ固定担体の保管寿命の改良方法。
9. 該プローブがオリゴＤＮＡプローブである請求項８に記載の改良方法。
10. プローブ含有液体をスポッティング方法により前記基材に付与し、固定化した請求項８に記載の改良方法。
11. プローブ固定担体の保管方法であって、
    標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを基材に共有結合で固定したプローブ固定担体を用意する工程と、重合度２０００以下、ケン化度８５％以上のポリビニルアルコールを該プローブ固定担体の少なくともプローブが固定された部位に含有させて、該プローブ固定担体の保管寿命を改良する工程と、該ポリビニルアルコールを付与したプローブブ担体を保管する工程と、を有することを特徴とするプローブ固定担体の保管方法。
12. 該プローブがオリゴＤＮＡプローブである請求項１１に記載の保管方法。
13. プローブ含有液体をスポッティング方法により前記基材に付与し、前記プローブを固定化する請求項１１に記載の保管方法。

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