CN114350745A - 微球芯片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了微球芯片的制备方法，使用刻蚀有微孔的二氧化硅载玻片做基底，在上面均匀涂抹一层紫外胶后，加入编码的二氧化硅微球，离心后得到一张具有空间解码能力的生物芯片。本发明基于紫外胶处理二氧化硅芯片，进而组装微球的方法，可以实现99％以上的落孔率，且杂质少。本发明提供了一种简单且成本较低的方式，实现了空间转录组芯片的快速制作。
Description
技术领域
本发明涉及生物芯片加工领域，具体地说，涉及一种微球芯片的制备方法。
背景技术
生物芯片技术起源于核酸分子杂交。生物芯片一般指高密度固定在互相支持介质上的生物信息分子(如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白质)的微阵列杂交型芯片(micro-arrays)，阵列中每个分子的序列及位置都是已知的，并且是预先设定好的序列点阵。生物芯片技术是目前应用前景最好的DNA分析技术之一，分析对象可以是核酸、蛋白质、细胞、组织等。目前全世界用生物芯片进行疾病诊断还处于研究阶段，国外已将其用于观察癌基因及肌萎缩等一些遗传病基因的表达和突变情况。
在微结构加工的芯片上随机加入编码的微球，是一种生物芯片的加工方式，而这种方法由于芯片刻蚀孔径的误差以及微球大小的不均一，导致微球的落孔效率存在一定上限。通常会出现微球落孔率不高，芯片残留微球较多的情况。
近年来，空间基因表达技术飞速发展，其中最成熟的商业化平台是来自10×Genomics公司的Visium，可实现在形态学背景下进行基因表达谱分析。但其高成本阻碍了推广应用。
发明内容
本发明旨在解决现有生物芯片加工技术复杂的流程以及落孔率低、稳定性差的问题，提供一种微球芯片的制备方法。
为了实现本发明目的，本发明提供微球芯片的制备方法(二氧化硅芯片与微球自组装的方法)，包括以下步骤：
1)对带有微孔的二氧化硅玻片进行清洁处理；
2)将紫外光固化胶均匀旋涂到清洁后的玻片表面，然后进行紫外照射，在玻片表面形成一层均匀的薄膜；
3)配制二氧化硅微球溶液，使微球浓度为2×105-3×105个/μl，然后将微球溶液滴加至所述带有薄膜的玻片中间，开启旋涂装置离心，使微球落入玻片的微孔中；
4)移除玻片表面上残留的液体，并用超纯水清洗后干燥；
5)用毛刷清洁玻片表面。
本发明中，微孔直径与二氧化硅微球的直径近似。应保证微球粒径大小与芯片刻蚀微孔相匹配。
所述紫外光固化胶的主成分为基础树脂、活性单体和光引发剂等，如米占科技有限公司生产的非凡力3217无影胶水。也可以购自卡夫特、荣泰等淘宝厂家，优选非凡力。
薄膜厚度大致为1-3微米(优选1微米)。旋涂紫外胶的厚度应尽量薄一些，均匀旋涂。
所述二氧化硅玻片上微孔的深度为1.5-2.5微米(优选2.1微米左右)，玻片上均匀分布的微孔按玻片总面积7mm×7mm计算，两个相邻微孔圆心之间的距离为4-6微米(优选5微米左右)。
前述的方法，步骤3)离心使用板式离心机，转速1000rpm-3000rpm(优选2000rpm)，离心时间10s-1min(优选30s)。
前述的方法，步骤3)用于配制二氧化硅微球溶液的试剂为超纯水、体积百分比浓度为5-20％的DMSO溶液或体积百分比浓度为2.5-10‰的紫外光固化胶水溶液。优选浓度为2.5-10‰的紫外光固化胶水溶液，更优选5‰的紫外光固化胶水溶液。
前述的方法，步骤1)包括：将二氧化硅玻片在食人鱼溶液中浸泡30min，然后依次用超纯水、无水乙醇清洗后晾干。
所述食人鱼溶液为浓硫酸和双氧水的混合液，其中浓硫酸和双氧水的体积比为7:3。
本发明中，所述二氧化硅微球共价连接有核酸、蛋白或多肽。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明基于紫外光固化胶(UV胶)处理二氧化硅芯片，进而组装微球的方法，可以实现99％以上的落孔率，且杂质少。
(二)使用的仪器耗材均为常规采购用品，相较国外成熟进口芯片，极大降低生产成本。
(三)组装快速，整个微球芯片组装流程控制在1h内，适于工厂化生产制造。
(四)本发明提供的微球芯片尤其适合用作空间转录组芯片。
附图说明
图1为本发明二氧化硅芯片与微球组装方法的流程示意图。
图2为本发明较佳实施例中二氧化硅芯片组装前效果图。
图3为本发明较佳实施例中二氧化硅芯片与微球自组装后效果图。
图4为本发明较佳实施例中二氧化硅芯片经过95℃处理30min后的效果图。
具体实施方式
本发明提供一种二氧化硅芯片与微球组装的方法，使用刻蚀有微孔的二氧化硅载玻片做基底，在上面均匀涂抹一层紫外胶(紫外光固化胶)后，加入编码的二氧化硅微球(即二氧化硅微球共价连接有核酸分子)，离心后得到一张具有空间解码能力的生物芯片。本发明提供了一种简单且成本较低的方式，实现了空间转录组芯片的快速制作。
本发明采用如下技术方案：
本发明先对二氧化硅芯片进行清洁，然后对其表面微球进行UV胶覆膜，然后加入编码的游离二氧化硅微球，通过旋涂装置离心使微球落入二氧化硅芯片上，最后经过干燥清洁得到一张适用于空间转录组实验的芯片。芯片可通过显微镜扫描评估落孔效果。
具体地：
1、芯片表面清洁：使用食人鱼溶液(浓硫酸:双氧水＝7:3)浸泡芯片，之后用大量的超纯水进行冲洗，干燥后备用；
2、芯片涂层处理：使用UV胶对芯片目标区域进行涂抹，经紫外照射后备用；
3、微球填装：使用超纯水将编码微球进行稀释，然后将微球均匀铺在芯片目标区域，静置4min后使用旋涂装置(板式离心机)进行离心；
4、芯片清理：移除目标区域上方残留悬液，干燥后使用毛刷进行清洁；
5、芯片质控：将组装好的空间转录组芯片放到扫面显微镜下拍照扫描。
芯片制作流程见图1。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的UV胶为米占科技有限公司生产的非凡力3217无影胶水。板式离心机购自天根生化科技(北京)有限公司，型号OSE-MP25。
二氧化硅微球的直径为2.5微米，二氧化硅芯片上微孔的深度为2.1微米，玻片上均匀分布的微孔按玻片总面积7mm×7mm计算，两个相邻微孔圆心之间的距离为5微米。
实施例1微球芯片的制备方法
1、芯片表面清洁
(1)在通风橱内配置食人鱼溶液(浓硫酸:双氧水＝7:3，体积比)，趁热将刻蚀好的二氧化硅芯片(刻蚀有微孔的二氧化硅载玻片)加入到食人鱼溶液中泡制30min。
(2)将食人鱼水清洗过的芯片放入盛有超纯水的烧杯中，使用超纯水清洗三次，用洁净氮气吹干。
(3)使用分析纯的无水乙醇冲洗芯片三次，用洁净氮气吹干备用。
2、芯片涂层处理
(1)使用板式离心机将UV胶铺在芯片目标区域，使整个芯片区域附上薄薄一层胶。
(2)将芯片置于紫外灯下，照射4min，使UV胶固定。
3、微球填装
(1)取合成好的编码二氧化硅微球20μl离心，弃上清。
(2)加入200μl超纯水重悬，离心后弃上清，重复2次。
(3)加入150μl 5‰的紫外光固化胶水溶液重悬微球，血球计数板计数后，重新稀释微球至2×105个/μl。
(4)将涂层处理的芯片安装到空间转录芯片夹持装置上。
(5)取150μl混匀好的微球悬液加入到芯片的目标区域，室温静置4min。
(6)将组装好的微球和芯片放置到板式离心机上，离心20-30s，轻轻混匀上清后，再次2000rpm离心20-30s。
4、芯片清理
(1)用移液器将目标孔位的悬液吸除。
(2)取出自组装后的芯片在超纯水中提拉冲洗5次，甩干后，室温静置晾干。
(3)使用干净的小毛刷清扫芯片若干次，直至目标区域无明显微球残留。
5、芯片质控
(1)将自主组装完毕的芯片做好标记。
(2)使用显微镜扫描目标区域，40倍物镜扫描后分析落孔效率。
本发明二氧化硅芯片组装前效果图见图1。
本发明二氧化硅芯片组装前效果图见图2，二氧化硅芯片与微球自组装后效果图见图3。
6、高温质控
将芯片置于95℃金属浴的模块上孵育30min，然后使用超纯水冲洗三次，置于扫描仪中扫描，对比热孵育前质控图，结果显示，高温处理不会影响芯片的结构，落孔率依然高于99％。
经过95℃处理30min后的芯片见图4。
实施例2紫外胶选择的优化
分别测试了三款胶，包括非凡力3217无影胶水、金士达UV无影胶水、ergo1309瑞士进口AB胶，最终选择非凡力。
1、芯片表面清洁
(1)在通风橱内配置食人鱼溶液(浓硫酸:双氧水＝7:3，体积比)，趁热将刻蚀好的二氧化硅芯片(刻蚀有微孔的二氧化硅载玻片)加入到食人鱼溶液中泡制30min。
(2)将食人鱼水清洗过的芯片放入盛有超纯水的烧杯中，使用超纯水清洗三次，用洁净氮气吹干。
(3)使用分析纯的无水乙醇冲洗芯片三次，用洁净氮气吹干备用。
2、芯片涂层处理
(1)使用板式离心机将非凡力3217无影胶水、金士达UV无影胶水、ergo1309瑞士进口AB胶分别铺在芯片目标区域，使整个芯片区域附上薄薄一层胶。
(2)将芯片置于紫外灯下，照射4min，使UV胶固定。
3、微球填装
(1)取合成好的编码二氧化硅微球20μl离心，弃上清。
(2)加入200μl超纯水重悬，离心后弃上清，重复2次。
(3)加入150μl超纯水重悬微球，血球计数板计数后，重新稀释微球至2×105-3×105个/μl。
(4)将涂层处理的芯片安装到空间转录芯片夹持装置上。
(5)取150μl混匀好的微球悬液加入到芯片的目标区域，室温静置4min。
(6)将组装好的微球和芯片放置到板式离心机上，离心20-30s，轻轻混匀上清后，再次2000rpm离心20-30s。
4、芯片清理
(1)用移液器将目标孔位的悬液吸除。
(2)取出自组装后的芯片在超纯水中提拉冲洗5次，甩干后，室温静置晾干。
(3)使用干净的小毛刷清扫芯片若干次，直至目标区域无明显微球残留。
5、芯片质控
(1)将自主组装完毕的芯片做好标记。
(2)使用显微镜扫描目标区域，40倍物镜扫描后分析落孔效率。
紫外胶选择的优化测试结果见表1。实验结果显示非凡力3217无影胶水的效果最佳。
表1
| 紫外胶厂家 | 落孔率 |
| 非凡力3217无影胶水 | 99％ |
| 金士达UV无影胶水 | 83％ |
| ergo1309瑞士进口AB胶 | 50％ |
实施例3微球旋涂浓度的优化
用超纯水配制二氧化硅微球溶液，分别设置了10W/μl、20W/μl、30W/μl三个微球旋涂浓度梯度，最终确定20W/μl为最佳旋涂浓度。
1、芯片表面清洁
(1)在通风橱内配置食人鱼溶液(浓硫酸:双氧水＝7:3，体积比)，趁热将刻蚀好的二氧化硅芯片(刻蚀有微孔的二氧化硅载玻片)加入到食人鱼溶液中泡制30min。
(2)将食人鱼水清洗过的芯片放入盛有超纯水的烧杯中，使用超纯水清洗三次，用洁净氮气吹干。
(3)使用分析纯的无水乙醇冲洗芯片三次，用洁净氮气吹干备用。
2、芯片涂层处理
(1)使用板式离心机将非凡力3217无影胶水铺在芯片目标区域，使整个芯片区域附上薄薄一层胶。
(2)将芯片置于紫外灯下，照射4min，使UV胶固定。
3、微球填装
(1)取合成好的编码二氧化硅微球20μl离心，弃上清。
(2)加入200μl超纯水重悬，离心后弃上清，重复2次。
(3)加入150μl超纯水重悬微球，血球计数板计数后，重新稀释微球至10W/μl、20W/μl、30W/μl三个浓度。
(4)将涂层处理的芯片安装到空间转录芯片夹持装置上。
(5)取150μl混匀好的微球悬液加入到芯片的目标区域，室温静置4min。
(6)将组装好的微球和芯片放置到板式离心机上，离心20-30s，轻轻混匀上清后，再次2000rpm离心20-30s。
4、芯片清理
(1)用移液器将目标孔位的悬液吸除。
(2)取出自组装后的芯片在超纯水中提拉冲洗5次，甩干后，室温静置晾干。
(3)使用干净的小毛刷清扫芯片若干次，直至目标区域无明显微球残留。
5、芯片质控
(1)将自主组装完毕的芯片做好标记。
(2)使用显微镜扫描目标区域，40倍物镜扫描后分析落孔效率。
微球旋涂浓度的优化结果见表2。实验结果显示，20W/μl的微球悬液为最适浓度。
表2
| 微球旋涂浓度 | 落孔率 |
| 10W/μl | 90％ |
| 20W/μl | 99％ |
| 30W/μl | 95％ |
实施例4微球重悬缓冲液的优化
分别使用以下试剂作为微球重悬缓冲液：a、超纯水；b、浓度分别为5％、10％、20％的DMSO溶液三个；c、浓度分别为2.5‰、5‰、10‰的紫外光固化胶水溶液。最终确定5‰的紫外光固化胶水溶液为最适微球重悬缓冲液。
1、芯片表面清洁
(1)在通风橱内配置食人鱼溶液(浓硫酸:双氧水＝7:3，体积比)，趁热将刻蚀好的二氧化硅芯片(刻蚀有微孔的二氧化硅载玻片)加入到食人鱼溶液中泡制30min。
(2)将食人鱼水清洗过的芯片放入盛有超纯水的烧杯中，使用超纯水清洗三次，用洁净氮气吹干。
(3)使用分析纯的无水乙醇冲洗芯片三次，用洁净氮气吹干备用。
2、芯片涂层处理
(1)使用板式离心机将非凡力3217无影胶水铺在芯片目标区域，使整个芯片区域附上薄薄一层胶。
(2)将芯片置于紫外灯下，照射4min，使UV胶固定。
3、微球填装
(1)取合成好的编码二氧化硅微球20μl离心，弃上清。
(2)加入200μl超纯水重悬，离心后弃上清，重复2次。
(3)加入7种测试buffer重悬微球，即a、超纯水；b、浓度分别为5、10、20％的DMSO溶液；c、浓度分别为2.5、5、10‰的紫外光固化胶水溶液；血球计数板计数后，重新稀释微球浓度至20W/μl。
(4)将涂层处理的芯片安装到空间转录芯片夹持装置上。
(5)取150μl混匀好的微球悬液加入到芯片的目标区域，室温静置4min。
(6)将组装好的微球和芯片放置到板式离心机上，离心20-30s，轻轻混匀上清后，再次2000rpm离心20-30s。
4、芯片清理
(1)用移液器将目标孔位的悬液吸除。
(2)取出自组装后的芯片在超纯水中提拉冲洗5次，甩干后，室温静置晾干。
(3)使用干净的小毛刷清扫芯片若干次，直至目标区域无明显微球残留。
5、芯片质控
(1)将自主组装完毕的芯片做好标记。
(2)使用显微镜扫描目标区域，40倍物镜扫描后分析落孔效率。
微球重悬缓冲液的优化结果见表3。实验结果显示，5‰的紫外光固化胶水溶液为最适微球重悬缓冲液。
表3
采用本发明的微球芯片制备方法，不仅落孔率高，且微球不容易脱落，相对于直接通过物理挤压落孔的方法更牢固。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.微球芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对带有微孔的二氧化硅玻片进行清洁处理；
2)将紫外光固化胶均匀旋涂到清洁后的玻片表面，然后进行紫外照射，在玻片表面形成一层均匀的薄膜；
3)配制二氧化硅微球溶液，使微球浓度为2×105-3×105个/μl，然后将微球溶液滴加至所述带有薄膜的玻片中间，开启旋涂装置离心，使微球落入玻片的微孔中；
4)移除玻片表面上残留的液体，并用超纯水清洗后干燥；
5)用毛刷清洁玻片表面；
其中，微孔直径与二氧化硅微球的直径近似。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述紫外光固化胶为米占科技有限公司生产的非凡力3217无影胶水；
薄膜厚度为1-3微米。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二氧化硅微球的直径为2-3微米。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述二氧化硅玻片上微孔的深度为1.5-2.5微米，玻片上均匀分布的微孔按玻片总面积7mm×7mm计算，两个相邻微孔圆心之间的距离为4-6微米。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)离心使用板式离心机，转速1000rpm-3000rpm，离心时间10s-1min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)用于配制二氧化硅微球溶液的试剂为超纯水、浓度为5-20％的DMSO溶液或浓度为2.5-10‰的紫外光固化胶水溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)包括：将二氧化硅玻片在食人鱼溶液中浸泡30min，然后依次用超纯水、无水乙醇清洗后晾干；
所述食人鱼溶液为浓硫酸和双氧水的混合液，其中浓硫酸和双氧水的体积比为7:3。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述二氧化硅微球共价连接有核酸、蛋白或多肽。
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