CN101831503B

CN101831503B - 一种乙烯基修饰的基因芯片、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN101831503B
Application number: CN 201010186945
Authority: CN
Inventors: 刘迎春; 高源�
Original assignee: BEIJING OKEANOS TECH Co Ltd
Current assignee: Hefei Renchuang gene Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2010-05-21
Filing date: 2010-05-21
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2030-05-21
Also published as: CN101831503A

Abstract

本发明提供了一种乙烯基修饰的基因芯片，该基因芯片的基片载体表面上带有末端含碳碳双键的活性官能团，其结构如式1所示，

Description

一种乙烯基修饰的基因芯片、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种基因芯片，具体地说，涉及一种乙烯基修饰的基因芯片、其制备方法及应用。

背景技术

基因芯片(Gene Chip)通常指DNA芯片，其基本原理是指将大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基因芯片的概念现已泛化到生物芯片(biochip)、微阵列(Microarray)、DNA芯片(DNAchip)，甚至蛋白芯片。基因芯片集成了探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子合成技术、精密控制技术和激光共聚焦显微技术，使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子以及对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测分析变得切实可行。基因芯片技术在分子生物学研究领域、医学临床检验领域、生物制药领域和环境医学领域显示出了强大的生命力，其中关键技术在于基因芯片具有微型化、集约化和标准化的特点，从而有望实现“将整个实验室缩微到一片芯片上”的愿望。基因芯片在国内外已形成研究与开发的热潮，许多科学家和企业家将基因芯片同当年的PCR技术相提并论，认为核酸杂交技术的集成化已经和正在使分子生物学领域发生一场变革，将带来巨大的社会效益和经济效益。

寡核苷酸在基片表面的固定是制作基因芯片的第一步，因此制备高质量的基因芯片基片，实现寡核苷酸的有效固定是基因芯片研究的关键技术之一。基片载体的材料表面必须有可以进行化学反应的活性官能团，以便与生物分子进行偶联；而载体本身应当是惰性的，即有足够的稳定性和良好的生物兼容性。理想的基因芯片基片应具有以下特点：1)基片的荧光背景信号低；2)固定的寡核苷酸必须稳定，在杂交、洗涤和分析过程中不易脱落；3)有足够的固定密度以保证检测分析时能产生足够强的检测信号；4)适度的固定容量；5)尽量减少非特异性吸附。目前适用于制作基片载体的材料有玻璃片、硅片、金基底、尼龙、纤维素和聚丙烯酰胺等。基片表面的活性官能团修饰主要有氨基、醛基、环氧基等，但是环氧基修饰基片过程较为复杂，固定效率不高；氨基修饰基片虽较为简单，但结合固定效果不理想；醛基修饰基片的固定量较低，灵敏度不高，稳定性方面也存在问题。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种稳定的、结合强度大、固定效率高、荧光背景低的乙烯基修饰的基因芯片。

本发明的另一目的是提供上述乙烯基修饰的基因芯片的制备方法。

本发明的进一步目的是提供用上述乙烯基修饰的基因芯片在固定寡核苷酸中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种乙烯基修饰的基因芯片，其基因芯片的基片载体表面上带有末端含碳碳双键的活性官能团，其结构如式1所示，

式1

其中，n为1-10的整数，m为大于1的整数。

前述的基因芯片，其中制备所述基片载体的材料包括无机材料或有机高分子材料，所述无机材料包括玻璃、硅片、金属(例如金、银、铁、锌、铜)等；有机高分子材料包括壳聚糖、葡聚糖、聚乙烯醇、纤维素、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乳酸或聚丙烯酸酯等。

制备本发明乙烯基修饰的基因芯片的方法，其包括步骤：

1)用乙醇将基片载体洗净；

2)采用分子自组装技术将10-15mM的三乙氧基硅基烯组装在羟基化或氨基化的基片载体表面，形成一层末端为双键的单分子自组装膜，在无水乙醇中漂洗两遍，氮气吹干；

3)将上述所得基片载体放置在烘箱中，50-120℃下烘烤30-60min，即得。

本发明提供的乙烯基修饰的基因芯片在固定寡核苷酸中的应用，其具体方法为：

1)将1当量5’-端带有末端双键修饰的寡核苷酸和0.5％-1％当量Grubbs催化剂溶于DMSO中，配制成寡核苷酸浓度为1mM的点样液；

2)用点样仪吸取上述点样液，在基片上设定的矩阵上点样，点样量是5-20nL，点样后的基片放置在37℃相对湿度为75％的恒温恒湿箱中避光固定8-12小时；

3)清洗，甩干。

所述的5’-端带有末端双键修饰的寡核苷酸，其3’-端还带有荧光基团，其结构如式2所示，

式2

其中，n为1-10的整数，F代表荧光基团。

本发明的优点和有益效果是：

(1)本发明提供的乙烯基修饰的基因芯片，其基片修饰方法简单、方便，适合大规模生产，基片载体来源丰富。

(2)本发明采用分子自组装技术，将活性基团通过共价键固定在基片载体表面，不易脱落，固定率高，而且可以保证表面活性基团的高密度性和均一性。

(3)本发明提供的乙烯基修饰的基因芯片适于固定有末端双键修饰的寡核苷酸，固定方法采用烯烃复分解反应，结合强度大，固定效率高。

(4)本发明提供的乙烯基修饰的基因芯片不会导致荧光信号的明显增大，荧光背景低，635nm波长下的荧光背景小于100，平均固定效率大于50％。

附图说明

图1为本发明乙烯基修饰的基因芯片基片表面修饰原理图；

图2为本发明乙烯基修饰的基因芯片固定有末端双键修饰的寡核苷酸原理图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1以无机材料为基片载体的基因芯片制备

(1)用无水乙醇将表面羟基化的玻璃片(羟基化的玻璃片按照常规方法制备，具体为：配制浓H₂SO₄∶H₂O₂体积比为7∶3的溶液，于室温下处理玻璃基片30min，再用大量去离子水淋洗，放在烘箱中干燥，即得)清洗干净；

(2)将玻璃片放置在三乙氧基硅基烯，n＝1(化合物A)的无水乙醇溶液中(15mM)30min，使基片载体表面形成一层末端为双键的单分子自组装膜，在无水乙醇中漂洗两遍，氮气吹干；

(3)将上述所得基片放置在烘箱中，100℃下烘烤45min，使组装更加牢固。

其制备原理如图1所示。

实施例2以有机高分子材料为基片载体的基因芯片制备

(1)用无水乙醇将聚乙烯醇为材质的表面羟基化的塑料片(羟基化的塑料片的制备方法与实施例1中羟基化的玻璃片的制备方法相同)清洗干净；

(2)将塑料片放置在三乙氧基硅基烯，n＝5(化合物A)的无水乙醇溶液中(10mM)30min，使基片载体表面形成一层末端为双键的单分子自组装膜，在无水乙醇中漂洗两遍，氮气吹干；

(3)将上述所得基片放置在烘箱中，60℃下烘烤30min，使组装更加牢固。

实施例3荧光背景检测

将实施例1和实施例2中制备好的基因芯片基片插入扫描仪Genepix 4000B，采用635nm波长检测，在PMT为650，激光强度为100％的条件下对基片的全部点样区域进行扫描，然后从扫描仪自带软件中读取荧光背景值。结果表明，荧光背景值均小于70，说明荧光背景很低，符合实验要求。

实施例4在基片载体上固定有末端双键修饰的寡核苷酸

(1)配置点样液：将1μmol的5’-端带有末端双键且3’-端带有Cy5荧光基团修饰的寡核苷酸(结构如式3所示)和0.5％μmol的Grubbs催化剂溶于DMSO中，配制成寡核苷酸浓度为1mM的点样液；

式3

其中，F代表Cy5荧光基团。

(2)用点样仪吸取上述点样液，在实施例1和实施例2制备好的基因芯片基片上设定的矩阵上点样，点样量为5nL，点样后的基片在37℃相对湿度为75％的恒温恒湿箱中避光固定12小时；

(3)清洗，甩干，即制成基因芯片。

其制备原理如图2所示。

实施例5固定效率检测

将实施例4中已固定好寡核苷酸的基因芯片插入扫描仪Genepix4000B，采用635nm波长检测，在PMT为650，激光强度为100％的条件下对基片的全部点样区域进行扫描，然后从扫描仪自带软件中读取荧光信号强度P1。将扫描后的基因芯片置于含0.1％SDS的SSC溶液中漂洗10min，然后在去离子水中漂洗10min，氮气吹干，然后扫描芯片，读取荧光信号强度P2。

每个点样点的固定率＝P2/P1×100％

结果表明：单个点样点的固定率均大于50％，平均固定率为57.6％。

实施例6通过杂交反应检验基因芯片的信号特性

以实施例1中制备的基片作为载体，按照实施例4的步骤将细胞色素P450基因分型寡核苷酸探针点样与基片上。扩增一份已知基因分型的DNA样本得到杂交模板，取2uL模板加到芯片的杂交区，加入杂交液(5×SSC)10uL，将芯片放到自动杂交洗涤仪的槽内，设定杂交稳定为55℃，杂交1h，杂交后自动洗涤和风干。将基因芯片插入扫描仪Genepix 4000B，采用635nm波长检测，在PMT为650，激光强度为100％的条件下对基片的全部点样区域进行扫描，采用分析软件，将数据转换成基因型别。结果分析得到的阳性杂交点和阴性杂交点与样本基因序列和基因型别符合，阳性探针点信号强，阴性点本底低，结合力和分辨力都很好，能够满足微阵列芯片的制备和杂交反应要求。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.乙烯基修饰的基因芯片在固定寡核苷酸中的应用，其具体方法为：

1）将1当量5’-端带有末端碳碳双键修饰的寡核苷酸和0.5%-1%当量Grubbs催化剂溶于DMSO中，配制成寡核苷酸浓度为1mM的点样液；

2）用点样仪吸取上述点样液，在基片上设定的矩阵上点样，点样量是5-20nL，点样后的基片放置在37℃相对湿度为75%的恒温恒湿箱中避光固定8-12小时；

3）清洗，甩干；

所述基因芯片的基片载体表面上带有末端含碳碳双键的活性官能团，其结构如式1所示，

式1

其中，n为1-10的整数，m为大于1的整数；

制备所述基片载体的材料包括玻璃、硅片、金、银、铁、锌、铜、壳聚糖、葡聚糖、聚乙烯醇、纤维素、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乳酸或聚丙烯酸酯；

所述的基因芯片的制备方法，包括步骤：

1）用乙醇将基片载体洗净；

2）采用分子自组装技术将10-15mM的三乙氧基硅基烯组装在羟基化或氨基化的基片载体表面，形成一层末端为双键的单分子自组装膜，在无水乙醇中漂洗两遍，氮气吹干；

3）将上述所得基片载体放置在烘箱中，50-120℃下烘烤30-60min，即得。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的5’-端带有末端碳碳双键修饰的寡核苷酸，其3’-端还带有荧光基团，其结构如式2所示，

式2

其中，n为1-10的整数，F代表荧光基团。