CN1556219A - 一种醛基修饰的基因芯片基片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种醛基修饰的基因芯片基片及其制备方法，其特征在于其特征在于以普通玻璃基片为载体，将活性官能团醛基引入基片表面，生成有效而牢固地能固定氨基修饰DNA的基因芯片基片。其制备方法主要包括羟基化、APTES的组装和对苯二甲醛的组装三步。对苯二甲醛中两个醛基只有一个与基片上的氨基反应并以C＝N双键结合，另一个醛基暴露在基片表面上。本发明的优点是以价格低廉的普通玻璃片做为基因芯片制作的主要载体，大大降低了生产成本；通过共价键结合能稳定固定寡核苷酸，在杂交、洗涤和分析过程中不易脱落；选材来源丰富、制备简单，适合大规模生产。

Description

一种醛基修饰的基因芯片基片及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种醛基修饰的基因芯片基片及其制备方法，特别是一种用于固定氨基修饰DNA的基因芯片基片的制作方法。

背景技术

基因芯片，又称DNA芯片或DNA微阵列，包括寡核苷酸微阵列及cDNA微阵列，是将大量核酸片段以预先设计的排列方式固定在载体表面组成密集分子排列，并以此作为探针，在一定条件下与样品中待检测的靶基因片段杂交，通过检测杂交信号，实现对样品中靶基因的存在、含量及变异等信息的快速检测。

寡核苷酸或基因片段在基片表面的固定是基因芯片制作第一步，因此实现寡核苷酸或DNA的有效固定，制备高质量的基因芯片基片是基因芯片研究的关键技术之一。基因芯片基片载体的材料表面必须有可以进行化学反应的活性官能团，以便与生物分子进行偶联；而载体本身应当是惰性的，即有足够的稳定性和良好的生物兼容性。目前适用于制作基因芯片的载体材料有玻璃片、硅片、金基底、尼龙、纤维素和聚丙烯酰胺等，而玻璃片具有来源丰富、价格低廉，本身具有良好的物理和化学惰性，透明、低荧光背景，便于检测等特点，并且有成熟的表面处理方法来引入各种活性官能团，这些活性功能团的引入为下一步DNA片断的固定提供了平台。因此，玻璃片为基因芯片制作的主要载体之一。

寡核苷酸可通过非共价键或共价键在玻璃基片表面固定。非共价固定是带有负电荷的寡核苷酸分子与带正电荷的基片通过静电作用力使DNA分子固定在基片上，如聚赖氨酸修饰的玻璃基片，由于静电作用力较弱，DNA分子在杂交、洗脱过程中容易脱落；而通过共价固定的DNA分子与基底的作用力强，不易脱落，因此共价固定比非共价固定在应用中更有优势。((1)Mikhail A.Podyminogin，Eugeny A.Lukhtanov and Michael W.Reed，Attachment of benzaldehyde-modified oligodeoxynucleotide probes tosemicarbazide-coated glass，Nucleic Acids Research，2001，Vol.29，No.24，5090-5098；(2)Eugeny A.Lukhtanov，Mikhail A.Podyminogin，Attachmentof oligonucleotides to solid supports through Schiff base type linkages forcapture and detection of nucleic acids，US Patent 6,441,159，August 27，2002.)

总体上说，理想的基因芯片基片应具有以下特点：1)基片的荧光背景信号低；2)固定的寡核苷酸必须稳定，在杂交、洗涤和分析过程中不易脱落；3)有足够的固定密度以保证检测分析时能产生足够强的检测信号；4)适度的固定容量，因为样品DNA或RNA比较昂贵，有时来之不易，所以过高的固定容量造成浪费，而过低的固定容量会使检测信号很弱；5)尽量减少非特异性吸附。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种用于固定氨基修饰DNA的醛基修饰基因芯片基片及其制备方法。

本发明要解决的关键问题是如何对玻璃基片进行一系列的化学表面处理，将活性官能团醛基引入基片表面，提供一种能有效而牢固地固定氨基修饰DNA的基因芯片基片。该基因芯片基片具有成本低廉、制作简单、DNA固定强度大、固定效率高等特点。

本发明是选用来源丰富、价格低廉的普通玻璃基片为载体，在其表面引入特定的活性官能团，使其能共价固定DNA，提供一种制作方法简单，制作成本低廉，适合于大规模生产的基因芯片基片，同时建立一套评价基因芯片基片质量的方法。

本发明所采用的技术方案是：先用浓硫酸和双氧水的混合溶液(Piranha)，配比为98％H₂SO₄∶30％H₂O₂＝7∶3体积比，将清洗后的玻璃基片经过30分钟的表面处理，使其表面完全羟基化，采用分子自组装技术将10-15Mm的3-氨丙基-三乙氧基硅烷(APTES)组装在羟基化的玻璃基片表面，形成一层末端为氨基的单分子自组装膜；然后用10-15Mm对苯二甲醛溶液处理氨基化的基片，由于对苯二甲醛为刚性分子，不可任意扭曲，其分子中的两个醛基只能有一个与基片表面上的氨基反应并以C＝N双键结合，另一个则暴露在基片表面上。通过这种方法保证了所制得的基因芯片基片表面具有高密度的活性醛基，从而使基片具有良好的固定率。

本发明的优点和有益效果是：

1、本发明采用的基底材料为普通玻璃片，具有来源丰富、价格低廉等优点，所采用的处理方法简单、方便，适合大规模生产。

2、用了分子自组装膜技术，将有机分子通过共价键牢固的固定在玻璃基片表面，不易轻易脱落，而且通过这种方法可保证表面醛基官能团的高密度性和均一性，从而保证基片具有高固定率、低离散系数的优点。

3、采用刚性分子对苯二甲醛作为醛基化试剂，避免了同一分子中的两个醛基都与表面上的氨基进行反应的可能性，保证了基因芯片基片表面具有高密度的活性醛基官能团。

4、醛基修饰基因芯片基片用于固定氨基修饰的DNA时，通过共价键结合，具有结合强度大的优点。

5、该基因芯片基片在修饰过程中不会导致荧光信号的明显增大，还具有荧光背景低的特点。

附图说明

图1醛基修饰基因芯片基片的制备过程基片表面结构变化示意图

图中(1)—羟基化

(2)—APTES的组装

(3)—对苯二甲醛的组装

图2醛基修饰基因芯片基片外观尺寸及点样区域示意图

图中A—点样区

B—非点样区

5个方框为5个点样矩阵

图3氨基修饰DNA探针与醛基修饰基因芯片基片的结合方式示意图

图4点样方阵荧光信号检测结果

其中左图为洗涤液洗涤前的检测结果，右图为洗涤液洗涤后的检测结果

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明：

实施例

1醛基修饰基因芯片的制备

醛基修饰基因芯片基片采用的是普通无色玻璃片，其尺寸为长：75mm，宽：25mm，厚：1mm。其制备过程主要包括羟基化、APTES的组装和对苯二甲醛的组装三步，该过程基片表面的结构变化示意图如图1所示。醛基修饰基因芯片基片制备的具体步骤为：

(1)用无水乙醇将玻璃基片超声清洗5分钟两次，然后再用去离子水超声清洗5分钟两次，以洗去玻璃基片表面粘附的各种污染物。

(2)将清洗后的玻璃基片在新鲜配制的Piranha溶液(98％H₂SO₄∶30％H₂O₂＝7∶3，体积比)中浸泡30min，使玻片表面完全羟基化，取出玻片用大量去离子水洗净，并用氮气流吹干。

(3)将表面羟基化后的玻片在10mM APTES(3-氨丙基-三乙氧基硅烷)的无水乙醇溶液中组装30min，取出玻片用无水乙醇在摇床中漂洗两遍，用氮气流吹干。

(4)将上述所得基片放置在烘箱，在100-110℃条件下烘烤45min，使APTES(3-氨丙基-三乙氧基硅烷)完全与玻片组装。

(5)将组装后的基片在10mM的对苯二甲醛的丙酮溶液中组装30min，取出，用去离子水在摇床中漂洗两次，氮气吹干。

(6)将最终所得产品进行封装，在室温下避光保存。

2 醛基修饰基因芯片基片的质量评价方法

基因芯片基片的质量主要是通过检测基片的荧光背景、固定率和离散系数这三个参数进行评价的。其中，荧光背景是一个数值，指基因芯片基片用激光共聚扫描仪在一定扫描强度下进行扫描所得的平均荧光信号强度。为了不影响基因芯片基片实际使用中的荧光信号判断，基片的荧光背景应尽可能小。固定率是基因芯片基片经点样固定后，洗涤液洗涤后的荧光信号强度与洗涤前荧光强度的百分比值，它反映点样区内DNA探针与基片的结合效率，固定率越高，DNA与基片的结合效率越高。离散系数是固定率标准差S与固定率均数F之比，用百分数表示，其大小反映基片的均一性，离散系数越小，基片的均一性越好。

本实施例旨在阐述基因芯片基片荧光背景和固定率的检测方法，氨基修饰DNA在醛基修饰基片上点样固定方法，同时给出按实施例1制备的醛基修饰基因芯片基片的相应检测结果。

(1)荧光背景的检测

将基因芯片基片插入扫描仪Genepix 4000B，采用635nm波长检测，在PMT为650，激光强度为100％的条件下对基片的全部点样区域(图2所示点样区)进行扫描，然后从扫描仪自带软件中读取荧光背景值。

(2)点样及固定

用点样仪Cartesian-prosys 5510—A在基因芯片基片上设定的五个点样小区内点样(如图2所示)，在每个小区均匀的点制5×5的矩阵，共5×25个点。点样用的探针为Cy5荧光标记的寡核苷酸探针，其浓度为2.5pmol/ul(13ng/ul)。

探针(上海博亚生物技术有限公司合成)

NH₂-5’TT TTT TTT TTT TTT TTT TGT TTC TAG AAA TTG G3’-Cy5

点样后的基片，在40℃相对湿度为75％的湿箱中避光固定12小时，固定后的探针与基片的结合方式示意图见图3。

(3)固定率

将点样固定后的基因芯片基片插入扫描仪Genepix 4000B，在波长635nm，PMT为650，激光强度为100％的条件下对每个点样区进行扫描，存下每个点样区的扫描图片(如图4所示)，用扫描仪自带软件分析得出每个点样点的荧光信号强度，即为洗涤前该点样点的荧光信号强度P0。

将扫描后的基因芯片基片置于0.1×SSC+0.1％SDS溶液中漂洗10分钟，然后在ddH2O中漂洗10分钟，氮气吹干。然后按上述方法对基因芯片基片再扫描一次，得出洗涤后每个点样点的荧光信号强度P1。

每个点样点的固定率Fi按式1算出：

整个基片的固定率为所有点样点(共125点)的平均固定率F

$F=\frac{\underset{i=1}{\overset{125}{\mathrm{\Σ}}}\mathrm{Fi}}{125}\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\left(2\right)$

(4)离散系数Cv

$\mathrm{Cv}=\frac{S}{F}\×100\%\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\left(3\right)$

其中F为平均固定率，S为标准差

$S=\sqrt{\frac{\underset{i=1}{\overset{125}{\mathrm{\Σ}}}{(\mathrm{Fi}-F)}^2}{124}}\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\·\left(4\right)$

离散系数按式3计算。

(5)醛基修饰基因芯片基片荧光背景、固定率和离散系数检测结果

表1为按实施例1制备的醛基修饰基因芯片基片荧光背景、固定率和离散系数检测结果。从该结果中可以看出所制备的醛基修饰基片具有低荧光背景，高固定率和低离散系数的特点，各主要参数能达到以下标准：

a、635nm波长下的荧光背景小于100；

b、平均固定率大于35％；

c、离散系数小于10％。

表1

基片编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													荧光背景	50	48	48	55	48	61	47	51	77	75	51	52
固定率(％)	43.33	43.74	37.41	40.26	39.34	42.24	40.36	46.83	40.88	37.35	50.22	41.87
													离散系数(％)	9.28	9.87	3.78	9.69	7.16	9.34	6.72	9.53	9.64	6.83	7.92	4.01

Claims (10)

1、一种醛基修饰的基因芯片基片，其特征在于以普通玻璃基片为载体，将活性官能团醛基引入基片表面，生成有效而牢固地能固定氨基修饰DNA的基因芯片基片；对苯二甲醛中两个醛基只有一个与基片上的氨基反应并以C＝N双键结合，另一个醛基暴露在基片表面上。

2、按权利要求1所述的醛基修饰的基因芯片基片，其特征在于氨基修饰DNA的醛基修饰基因芯片基片的结合方式为：

3、一种醛基修饰的基因芯片的制备方法，其特征在于：

a)先用Piranha溶液将清洗后的普通玻璃基片表面完全羟基化；

b)采用分子自组装技术将3-氨丙基-三乙氧基硅烷组装在羟基化的玻璃基片表面，形成一层氨基结尾的单分子自组装膜；

c)而后用对苯二甲醛溶液处理氨基化的基片和封装，对苯二甲醛中一个醛基与表面的氨基反应并以C＝N双键结合，而另一个暴露在基片表面。

4、按权利要求3所述醛基修饰的基因芯片的制备方法，其特征在于普通玻璃基片的清洗是先用无水乙醇将其超声清洗两次，每次五分钟；然后再用去离子水超声清洗五分钟两次。

5、按权利要求3所述醛基修饰的基因芯片的制备方法，其特征在于羟基化是在Piranha溶液中浸泡30分钟，所述Piranha溶液组成是体积比为98％H₂SO₄∶30％H₂O₂＝7∶3溶液。

6、按权利要求3或5所述醛基修饰的基因芯片的制备方法，其特征在于表面羟基化后的玻片在10-15mM3-氨丙基一三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中组装30分钟，取出玻片用无水乙醇漂洗两遍，用氮气吹干，然后在100-110℃条件下烘烤45分钟，使APTES完全与玻片组装。

7、按权利要求6所述醛基修饰的基因芯片的制备方法，其特征在于玻片在无水乙醇中清洗是在摇床中进行的。

8、按权利要求3所述醛基修饰的基因芯片的制备方法，其特征在于所述的用对苯二甲醛溶液处理氨基化的基片是将APTES组装后的基片在10-15mM的对苯二甲醛的丙酮溶液中组装30分钟，取出用去离子水漂洗两次，氮气吹干。

9、按权利要求6所述醛基修饰的基因芯片的制备方法，其特征在于所述的用对苯二甲醛处理氨基化的基片是将APTES组装后的基片在10-15mM的对苯二甲醛的丙酮溶液中组装30分钟，取出用去离子水漂洗两次，氮气吹干。

10.权利要求8所述醛基修饰的基因芯片的制备方法，其特征在于用对苯二甲醛溶液处理氨基化的基片，用去离子水漂洗是在摇床中进行的。

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