CN101078026A - 一种dna电化学传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种DNA电化学传感器，其包括金电极、与目的DNA序列互补的互补DNA、金纳米粒子和电化学指示剂，其特征在于其中一段互补DNA作为捕获探针组装于金电极上，而另一段互补DNA作为检测探针与金纳米粒子结合作为电化学指示剂的载体。本发明还公开了其制备方法。本发明通过“夹心式”的杂交方法，使电极表面富含大量带负电荷的DNA链，引入与DNA特异结合的带正电荷的VIII族过渡金属离子作为电化学指示剂，通过检测杂交前后电极表面电化学数值(电量或电流等)变化指示DNA杂交反应的发生。由于金纳米粒子的放大作用，此传感器可以检测痕量目的DNA分子且选择性高。而且DNA修饰的金电极具有重复使用的特点。

Description

一种DNA电化学传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物电化学传感器及其制备领域，特别涉及一种脱氧核糖核酸(DNA)电化学传感器及其制备方法。

背景技术

基因诊断是通过直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病做出诊断的方法。基因诊断的探测目的物是脱氧核糖核酸或核糖核酸(RNA)。在基因诊断的方法学方面，先后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析、聚合酶链式反应(PCR)，以及近年发展起来的DNA传感器及DNA芯片技术等。标记法核酸杂交检测技术现已广泛应用于生物学、医学和环境科学等有关领域，但其实验过程费时，费力，并且传统的放射性同位素标记安全性差，难以满足各方面的需要，发展新型分子杂交快速检测技术已经迫在眉睫。DNA传感器为核酸杂交快速检测提供了一个新途径，它是以杂交过程高特异性为基础的快速传感检测技术。

自人类基因组破解以来，DNA传感器领域的发展日新月异，目前已取得相当大的进展。生物科学、计算机科学、材料、微电子等各学科中多种理论和技术在该领域得到广泛应用。DNA传感器及DNA芯片应用于DNA测序、突变检测、基因筛选、基因诊断以及几乎所有应用核酸杂交的领域。在众多DNA传感检测方法中，基于分子电学性质的电化学技术具有独特的优越性。电化学检测技术灵敏、快速、成本非常低廉，而且检测装置轻便、低能耗且易于微型化和集成化，符合手持式检测装置以及未来的芯片实验室(lab-on-a-chip)的要求。而且电化学基因传感技术通常具有以下特点：杂交反应在其表面上直接完成，并且转换器能够将杂交过程所产生的变化转变成电信号；根据杂交前后电信号变化量，从而推断出被检DNA的量；具有准确、快速和廉价等优越性；更重要的是，其能被推广应用到所有和DNA序列信息相关的领域中。

目前，有关纳米材料的合成和应用方面的研究发展迅速。纳米材料的引入，使DNA传感器对杂交检测的灵敏度和选择性都大为提高。金纳米粒子是一种应用广泛的抗原、抗体和细胞标记物，美国西北大学纳米技术研究所Mirkin教授领导的研究组在利用寡核苷酸修饰的金纳米粒子进行DNA碱基识别方面进行了开创性研究。通过杂交前后体系颜色的变化来实现对DNA的检测具有仪器简单、实验方便和结果直观等特点.但由于视觉辨别的局限性，使得色差识别的灵敏度较低，所以这种方法具有一定的局限性。

公开号为CN1215327的专利公开了一种DNA电化学纳米传感器的制备方法，该传感器将目的DNA(靶向DNA)通过金纳米晶固定在金电极上，再使银纳米晶标记的互补DNA发生杂交反应，在酸性介质中将银纳米晶氧化释放以离子状态存在于溶液中，通过电化学方法检测银离子的量从而检测目标DNA的量。该传感器检测灵敏度可达10pmol/L，但只能适用于待测的目的DNA具有巯基基团，或将其在检测前进行巯基修饰，故实际应用有一定局限性；另外，相对于电化学传感方法，其检测灵敏度尚有很大不足，而且尚不能实现SNP检测。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的缺陷，提供一种灵敏度及特异性更高的DNA电化学传感器。

本发明的电化学传感器，其包括金电极、与靶向DNA(目的DNA)序列互补的互补DNA、金纳米粒子和电化学指示剂，其中一段互补DNA作为捕获探针组装于金电极上；而另一段互补DNA作为检测探针与金纳米粒子结合成复合物，作为电化学指示剂的载体。

其中，上述电化学指示剂可为任何现有能通过电化学方法指示DNA杂交反应发生的物质。本发明优选可与带负电的DNA磷酸骨架通过静电力结合的带正电的过渡金属离子，特别是钌离子，钴离子等VIII族过渡金属离子，其吸附在电极表面的量随DNA量的增加而增加。

本发明所用金纳米粒子的粒径太大，则金粒子体积大，连接到电极上的个数少；太小的金粒子则组装的DNA数量少，放大效果不明显。故本发明优选的金纳米粒子的粒径为10～50纳米。

更佳地，为提高杂交效率，该金电极上的捕获探针的密度最好控制在1.2×10¹²～1.2×10¹³mol/cm²之间。

本发明的另一目的是提供上述DNA电化学传感器的制备方法。

本发明的制备方法包括以下步骤：

①在洁净的纯金电极上组装巯基修饰的捕获探针；

②将目的DNA和其金纳米粒子结合的互补DNA(AuNP-DNA)预杂交后，再与金电极上的捕获探针杂交；

③将步骤②所得金电极置入电解液中，并加入与DNA特异结合的电化学指示剂，用电化学检测方法检测金电极表面上吸附的电化学指示剂的电量，通过计算杂交前后电极表面电化学数值变化指示杂交反应的发生。

较佳地，所述的步骤①包括在洁净的纯金电极上滴加巯基修饰的捕获探针溶液，再用巯基化合物，如巯基己醇等巯基醇类化合物进行处理，使捕获探针直立于金电极表面，有助于提高DNA的杂交效率。更佳地，进一步通过调节捕获探针在金电极上的密度来提高杂交效率，该密度最好控制在上述1.2×10¹²～1.2×10¹³mol/cm²范围内。

步骤②的杂交条件同现有技术，例如包括先将目的DNA与金纳米粒子结合的互补DNA(检测探针)混合，25～40℃预杂交30～60分钟左右，再将修饰了捕获探针的金电极浸入到预杂交溶液中杂交约0.5～2个小时，特别是一个小时左右，清洗电极除去非特异性吸附到电极表面的金纳米粒子及未杂交的目的DNA。

本发明所说的金纳米粒子结合的互补DNA，或称组装了互补DNA的金纳米粒子，也是利用金纳米粒子与带有巯基功能团的DNA相互作用的特性，可通过将末端巯基修饰的互补DNA与金纳米粒子溶液混合制得的复合物。

本发明中互补DNA(检测探针DNA或捕获探针DNA)的巯基修饰可采用任何现有技术或商业途径获得。

而本发明制备方法步骤③中的电解液可为常规的缓冲电解液，如pH为7.4的10mM Tris-HCl缓冲液；而所用的电化学检测方法可为任何现有常规的电化学检测方法，如计时电量法或循环伏安法等，本发明优选计时电量法，因其可定量检测钌离子的吸附量。

因此，在本发明一较佳实施例中，本发明的制备方法包括下列步骤：

(1)电极表面探针DNA的组装

在洁净的电极上滴加巯基修饰的寡核苷酸探针溶液(pH7.2～7.8)组装30～60分钟，然后再在巯基己醇水溶液中浸泡2～4小时，取出后用MilliQ水冲洗干净。

(2)杂交

先将目的序列DNA与AuNP-DNA溶液混合，25～40℃预杂交30～60分钟，再将修饰了捕获DNA的金电极浸入到预杂交溶液中杂交一个小时，杂交反应后用大量Tris-HCl洗液清洗电极，洗去非特异性吸附到电极表面的金纳米粒子及未杂交的目的DNA。

(3)电化学检测

在10mM Tris-HCl电解液中加入钌离子(Ru³⁺)至其饱和作为电化学指示剂，用计时电量法检测DNA修饰电极表面上吸附的钌离子的电量，定量检测目的基因的浓度。

本发明利用金与修饰有巯基基团的DNA间的相互作用，将已知序列的DNA捕获探针固定在金电极表面，通过DNA分子的杂交，捕获目的序列DNA，再通过目的DNA的一段序列捕获修饰在金纳米粒子(AuNP)上的另一段DNA(AuNP-DNA)，每个金纳米粒子上都连接几十至上百条DNA，从而通过这种“夹心式”的杂交方法，在有靶序列DNA的存在下，AuNP-DNA被连接到电极表面，理论上只要有一条靶序列与捕获探针杂交，就会将一个组装了多条DNA(检测探针)的金纳米粒子连接到电极表面，从而使电极表面DNA密度大大增加，即杂交反应使电极表面富含大量带负电荷的DNA链；再通过加入与DNA特异结合的电化学指示剂，即引入带正电荷的过渡金属离子作为杂交指示剂，通过检测杂交前后电极表面过渡金属离子的电量指示DNA杂交反应的发生。由于金纳米粒子的放大作用，此传感器在靶序列浓度极低时也有明显信号，检测限可达到10fmol·L^-1，并有很强的区分单碱基错配的能力。而且本发明中使用的DNA修饰的金电极具有重复使用的特点。

附图说明

图1是本发明一实施例及对比实施例的示意图。其中，A为在清洗干净的纯金电极上组装末端巯基修饰的寡核苷酸捕获探针；B为经过巯基己醇处理，使大部分探针直立于电极表面；C为将靶序列DNA和组装了一段与靶序列互补的DNA的金纳米粒子溶液混合，预杂交一段时间后再与电极上的探针杂交，并加入钌离子；D为将靶序列DNA与电极上的探针直接杂交，并加入钌离子。

图2显示通过金电极表面的DNA捕获探针密度控制来提高靶向DNA的杂交效率。密度控制范围在1.2×10¹²～1.2×10¹³molecule/cm²；其中，A为该密度范围的捕获探针与1μM靶向DNA杂交的情况(无AuNP放大)，B为采用本发明在AuNP存在下该密度范围的捕获探针与10pM靶向DNA杂交的情况，C为不同密度探针的示意图。

图3是各种条件下金电极上捕获探针在反应液中的循环伏安法扫描图，虚线：电极上只有捕获探针；实线：捕获探针与1μM靶DNA杂交(无AuNP放大)；粗线：本发明捕获探针与10pM靶DNA杂交(AuNP放大)。

图4是各种条件下金电极上捕获探针在反应液中的计时电量法扫描图，Q_单链：电极上只有捕获探针；Q_双链：捕获探针与1μM靶DNA杂交(无AuNP放大)；Q_金胶：本发明的捕获探针与1pM靶DNA杂交(AuNP放大)。

图5是采用本发明的传感器检测不同浓度的靶向DNA，A是通过计时电量法测定电极表面与不同浓度靶序列杂交后吸附钌离子的电量，B显示用此方法测定含有46个碱基的DNA浓度范围在50fmol·L^-1～10pmol·L^-1有良好的线性关系，检测限在10fmol·L^-1。

图6是采用本发明的DNA电化学传感器实现DNA的单碱基多态性(SNP)检测；A为靶向DNA完全匹配，T、C、G为靶向DNA上存在不同的单碱基错配。

图7显示本发明中捕获探针修饰的金电极的再生性能变化(杂交效率变化)情况。通过数个循环的高温变性过程，再生电极的捕获性能基本不变。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

实施例1

如图1所示A、B、C步骤，制备本发明的DNA电化学传感器。

(1)电极预处理及捕获探针DNA的组装

首先将金电极在磨布上用氧化铝磨料悬液中打磨后，再分别在乙醇和MilliQ水中超声清洗，最后用电化学法清洗电极以去除残留的杂质。氮气吹干后，在电极上滴加0.2μM巯基修饰的寡核苷酸探针组装溶液[pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)，其中NaCl浓度为0.1M]在室温下静置约60分钟，然后再在2mM巯基己醇水溶液中浸泡约2小时，取出后用MilliQ水冲洗干净。

(2)杂交

先将目的序列DNA与AuNP-DNA溶液(AuNP直径为20纳米)混合，25℃预杂交60分钟，再将修饰了捕获探针DNA的金电极浸入到预杂交溶液中常温下杂交一个小时，杂交反应后用大量Tris-HCl洗液清洗电极，洗去非特异性吸附到电极表面的金纳米粒子及未杂交的目的DNA。

(3)电化学检测

将上述金电极放入10mM Tris-HCl电解液(pH7.4)3ml中，再加入钌离子(Ru³⁺)，使其在电解液中的终浓度为50μM，作为电化学指示剂，用计时电量法检测DNA修饰电极表面上吸附的钌离子的电量，通过杂交反应，修饰大量DNA的金纳米粒子连接到电极表面，同时吸附大量的钌离子到电极表面上，所以杂交后的电量值远远大于杂交前，达到放大杂交反应的目的。用此方法测定含有38个碱基的基因序列线性浓度范围在50fmol·L^-1～10pmol·L^-1。其中，捕获探针与1pM靶向DNA杂交的扫描曲线如图4中的Q_金胶所示。

对比实施例1

按照图1的A、B、D步骤，在步骤2中直接将修饰了捕获探针DNA的金电极浸入到目的DNA溶液中，余同上述实施例1，其中，捕获探针与1μM靶DNA杂交，用计时电量法测得的扫描曲线如图4中的Q_双链所示。

而作为阴性对照，在步骤2中直接将修饰了捕获探针DNA的金电极浸入到不含目的DNA的金纳米粒子复合物(AuNP-DNA)溶液中，余同上述实施例1，用计时电量法测得的扫描曲线如图4中的Q_单链所示。

可见，通过引入金纳米粒子，使电极表面DNA的密度大大增加，从而吸附钌离子的量比不加金纳米粒子的吸附量大得多。

实施例2

(1)金电极表面捕获探针DNA的组装

在洁净、干燥的金电极上滴加pH7.4的巯基修饰的捕获探针PBS溶液，室温下组装60分钟。其中，通过改变组装液中捕获探针的浓度分别为0.2，2.0，5.0μM及NaCl的浓度分别为0.1M，1.0M，1.0M，组装不同密度的DNA修饰电极，分为高(1.2×10¹³molecule/cm²)、中(6.0×10¹²molecule/cm²)、低(1.2×10¹²molecule/cm²)三种密度(如图2的C所示)，然后再在1mM巯基己醇水溶液中浸泡3小时，取出后用MilliQ水冲洗干净。

(2)杂交

将目的序列DNA与AuNP-DNA溶液(AuNP直径为20纳米)混合，37℃预杂交30分钟，余同实施例1。

(3)电化学检测

同实施例1。

其中，捕获探针与10pM靶向DNA杂交的结果如图2的B所示，提示低密度探针下获得最高的杂交效率和最大的放大信号。

对比实施例2

在上述步骤2中直接将修饰了捕获探针DNA的金电极浸入到目的DNA溶液中，余同上述实施例2。其中，捕获探针与1μM靶向DNA杂交的结果如图2的A所示，同样也提示低密度探针下获得最高的杂交效率和最大的放大信号。

实施例3

捕获探针溶液的pH7.8，组装30分钟，再在1mM巯基己醇水溶液中浸泡4小时；使用10纳米直径的金纳米粒子，修饰了捕获探针DNA的金电极浸入到预杂交溶液中常温下杂交2小时；电化学指示剂为钴离子(Co²⁺)，余同实施例1，通过杂交前后电极表面钴离子的电量的变化指示杂交反应的发生。用此方法测定含有38个碱基的基因序列线性浓度范围在0.5pmol·L^-1～10pmol·L^-1。

实施例4

将实施例1中的金纳米粒子直径改为50纳米，计时电量法换成循环伏安法进行检测，其中捕获探针与1pM靶向DNA杂交的扫描曲线如图3中的粗线所示。

同理，将对比实施例1中的金纳米粒子直径改为50纳米，计时电量法换成循环伏安法进行检测作为对比实施例3，其中捕获探针与1μM靶DNA杂交的扫描曲线如图3中的细实线所示。

同样作为阴性对照的是在步骤2中直接将修饰了捕获探针DNA的金电极浸入到不含目的DNA的金纳米粒子复合物(AuNP-DNA)溶液中，余同上述实施例4，其扫描曲线如图3中的虚线所示。

可见，用循环伏安法也与计时电量法的结果一致，显示通过引入金纳米粒子，使电极表面DNA的密度大大增加，从而吸附钌离子的量比不加金纳米粒子的吸附量大得多，从而可提高本发明传感器的灵敏度。

上述实施例中的AuNP-DNA制备方法如下：将互补DNA(终浓度3μM)加入至不同粒径的金纳米粒子原始商品胶体中，室温下组装24h，加入100Mm PBS缓冲液(含1M NaCL)至NaCL的终浓度为0.1M，室温下老化40h，离心，PBS悬浮，离心与悬浮重复3次后，等体积0.3M PBS悬浮备用。

上述实施例中的所用试剂：钌离子、钴离子和金纳米粒子为SIGMA产品；其余试剂为常规市售产品(分析纯或化学纯)；电化学工作站及配件为上海辰华公司产品(型号：CHI430B)。

应用实施例1

采用实施例2中的本发明DNA电化学传感器(低密度捕获探针)，以乳腺癌基因(BRCA1)的一段序列(含有46个碱基，序列为：5’-GAGCATACATAGGGTTTCTCTTGGTTTCTTTGATTATAATTCATAC-3’；其捕获探针序列为：5’-HS-C₆-GTATGAATTATAATCAAA-3；其检测探针序列为：5’-GAAACCCTATGTATGCTCTTTTTTTTTT-C₆-SH-3’)为目的基因进行浓度检测。结果如图5所示，用此方法测定含有46个碱基的乳腺癌基因序列的线性浓度范围在50fmol·L^-1～10pmol·L^-1，检测限可达到10fmol·L^-1。

应用实施例2

用应用实施例1的方法，对应用实施例1中的乳腺癌基因(BRCA1)一段目的DNA完全匹配的序列、以及在目的DNA上存在不同单碱基错配的3段序列作为待测靶向DNA分别进行SNP检测(靶向DNA的浓度都在10pM)。结果如图6所示，其中，A为与靶向DNA完全匹配，T、C、G为靶向DNA上存在不同的单碱基错配基因(即在DNA序列该位置上，将碱基为A的核苷酸分别改为碱基为T、C和G的核苷酸)。可见，本发明的传感器具有很强的区分单碱基错配的能力，特异性高。

应用实施例3

将实施例1中步骤1得到的捕获探针修饰电极与1μM靶向DNA室温杂交1小时，然后在水中80℃热变性10分钟，重复杂交，变性三个循环，探针组装量及杂交效率基本保持不变，结果如图7所示，可见通过数个循环的高温变性过程，再生电极的捕获性能基本不变。

Claims (12)

1、一种DNA电化学传感器，其包括金电极、与靶向DNA序列互补的互补DNA、金纳米粒子和电化学指示剂，其特征在于其中一段互补DNA作为捕获探针组装于金电极上；而另一段互补DNA作为检测探针与金纳米粒子结合成复合物，作为电化学指示剂的载体。

2、如权利要求1所述的DNA电化学传感器，其特征在于该电化学指示剂为带正电荷的VIII族过渡金属离子。

3、如权利要求2所述的DNA电化学传感器，其特征在于所述带正电荷的VIII族过渡金属离子为钌离子或钴离子。

4、如权利要求1所述的DNA电化学传感器，其特征在于该金纳米粒子的粒径为10～50纳米。

5、如权利要求1所述的DNA电化学传感器，其特征在于该金电极上的捕获探针的密度为1.2×10¹²～1.2×10¹³mol/cm²。

6、如权利要求1～4任一项所述的DNA电化学传感器的制备方法，其包括以下步骤：

①在洁净的纯金电极上组装巯基修饰的捕获探针；

②将目的DNA和其金纳米粒子结合的互补DNA预杂交后，再与金电极上的捕获探针杂交；

③将步骤②所得金电极置入电解液中，并加入与DNA特异结合的电化学指示剂，用电化学检测方法检测金电极表面上吸附的电化学指示剂的电量，通过计算杂交前后电极表面电化学数值变化指示杂交反应的发生。

7、如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的步骤①包括在洁净的纯金电极上滴加巯基修饰的捕获探针溶液，再用巯基化合物进行处理，使捕获探针直立于金电极表面。

8、如权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述的巯基化合物为巯基己醇。

9、如权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述捕获探针在金电极上的密度被控制在1.2×10¹²～1.2×10¹³mol/cm²范围。

10、如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的步骤②包括先将目的DNA与组装了互补DNA的金纳米粒子混合，25～40℃预杂交30～60分钟，再将修饰了捕获探针的金电极浸入到预杂交溶液中杂交30分钟～2小时，清洗电极除去非特异性吸附到电极表面的金纳米粒子及未杂交的目的DNA。

11、如权利要求10所述的制备方法，其特征在于所述的组装了互补DNA的金纳米粒子可通过将末端巯基修饰的互补DNA与金纳米粒子溶液混合制得。

12、如权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤③中的电解液为pH为7.4的10mM Tris-HCl缓冲液，所用的电化学检测方法为计时电量法或循环伏安法。

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