CN104569101A

CN104569101A - 一种dna电化学生物传感器及其制备方法

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Publication number: CN104569101A
Application number: CN201410828548.5A
Authority: CN
Inventors: 王媛媛; 苏磊; 佟莹; 杨涵焜; 舒桐; 龚伟; 张学记
Original assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Current assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明一种DNA电化学生物传感器及其制备方法，其包括金电极、与目的DNA序列互补的互补DNA、导电纳米颗粒以及可溶性电化学活性试剂，其中一段互补的单链DNA作为捕获探针组装于金电极上，并利用该单链DNA与导电纳米颗粒的结合作为电化学信号的转换单元，对DNA杂交事件进行电化学响应。该方法将吸附了导电纳米颗粒的巯基化DNA修饰金电极作为信号转换电极，利用可溶性电化学活性试剂的电极反应，基于DNA序列之间的碱基互补配对作用，对目标物DNA进行电化学响应和检测。该传感器结构简单、制备工艺简便、灵敏度高，可用于DNA分子的快速检测，而且，该DNA电化学传感器具有可以重复使用的特点。

Description

一种DNA电化学生物传感器及其制备方法

技术领域

本发明属于材料制备和检测分析技术领域，涉及一种传感器及其制作方法，尤其是一种DNA电化学生物传感器及其制备方法，应用于核酸检测技术领域。

背景技术

脱氧核糖核酸(DNA)是遗传信息的承担者，DNA分子中碱基序列的变异与人类许多遗传疾病有关。因此，对特定序列的DNA的分析以及对DNA链中碱基突变的检测在基因筛选、遗传疾病的早期诊断和治疗方面具有十分深远的意义。DNA生物传感器是进行核酸的结构分析和检测的重要手段，在众多的杂交检测方法中，电化学分析技术具有仪器简单、价格低廉、测定快速准确和方法灵敏度高等特点，因而受到了广泛关注。DNA电化学传感器在DNA分子识别和检测中的应用研究已有不少报道。电化学DNA生物传感器的灵敏度直接依赖于杂交指示剂对dsDNA的选择性。具有电活性的嵌入剂是研究得较多的一类杂交指示剂，但是，它们往往同时与单链DNA(ssDNA)和双链DNA(dsDNA)相结合，因而其选择性不够理想。由于导电纳米材料一般具有比表面积大、生物相容性好及导电性好等特点，常被应用核酸电化学传感器的构建。

碳元素是自然界中广泛存在的与人类密切相关的元素之一，电子轨道杂化多样性(sp、sp2、sp3杂化)使得以碳元素为唯一构成元素的碳材料具有各式各样的存在形式。1985年发现的富勒烯和1991年发现的碳纳米管已经成为碳材料研究的热点。2004年英国Manchester大学的Geim小组首次用机械剥离法成功制得了以碳原子sp2杂化构成的单原子层二维晶体(石墨烯)，它是碳原子紧密堆积成单层二维蜂窝状晶格结构的碳质材料，是世界上最薄的二维材料(单原子厚度的材料)。碳纳米材料有优异的光学、热力学、力学性能、大的比表面积以及很强的电子传导能力等，这些优异的性能使得碳纳米材料在传感器、超级电容器、纳米电子器件及复合材料等领域有着广阔的应用前景。金属纳米颗粒同样具有比表面积大、表面反应活性好、催化效率高以及吸附能力强的特点，在电化学反应中可以作为优良的电子传递媒介。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA电化学传感器及其制备方法。检测原理是基于固定化DNA分子探针和导电纳米材料结合，使得溶液中的电化学活性试剂能够响应DNA杂交事件，从而实现以电化学方法进行DNA检测。本发明提供一种新颖的电化学信号转换方式用于DNA电化学检测。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：一种DNA电化学生物传感器，

以金电极作为基底电极，利用Au-S键化学作用将巯基化ssDNA分子探针修饰到基底电极上，封闭电极的多余位点,以与ssDNA结合的导电纳米材料作为电化学转换器，利用可溶性电化学活性试剂的电极反应变化来对目标物进行检测。利用DNA序列之间的碱基互补配对作用，通过电化学信号的表征，实现对目标物DNA的检测。

进一步,所述的可溶性电化学活性试剂为带负电荷的电化学活性试剂，其电极反应能够被DNA修饰电极所阻挡；这类电化学活性试剂包括但不限于铁氰化钾和六氯合铱。

进一步,目标DNA与探针DNA发生杂交反应时，能够去除电极表面的石墨纳米颗粒，从而抑制了可溶性电化学试剂的电极反应。

本发明的另一目的是提供上述的DNA电化学生物传感器的制备方法，其包括以下步骤：

步骤(1):ssDNA探针修饰金电极的制备：先将金电极分别用0.3μm、50μm的抛光粉进行抛光5min，再分别用丙酮、乙醇、超纯水进行超声清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。最后，将上述电极放入0.1～0.3mol/L的稀H₂SO₄中，进行电化学清洗，即得干净的金电极；将已经过洁净处理的金电极浸泡在巯基化ssDNA探针溶液中进行探针修饰，再将该电极浸泡在巯基己醇溶液中以封闭电极多余位点，即可得到DNA探针修饰金电极。

步骤(2):DNA电化学生物传感器的制备：将DNA探针修饰金电极浸泡在含有导电纳米材料的溶液中，反应一段时间，即得电化学DNA生物传感器。

进一步,步骤(1)中，反应温度为15～35℃，单链DNA探针的修饰时间为16～24小时，ssDNA探针溶液的浓度为0.01～10μmol/L，巯基己醇浓度为0.1～10mmol/L。

进一步,所述步骤(2)中，反应温度为15～35℃，反应时间为0.5～2小时，溶液浓度为0.5～5mg/mL。

上述巯基化DNA探针溶液的配制：将巯基化单链DNA溶解在pH 7.0的磷酸缓冲溶液(含1mol/LNaCl)中，浓度为0.01～10μmol/L，巯基己醇浓度为0.1～10mmol/L。

DNA电化学传感器的制备：将ssDNA探针修饰金电极浸泡在0.5～5mg/mL的导电纳米颗粒溶液中0.5～4h反应，即得。

进一步，所述导电纳米材料为碳纳米材料或金属纳米材料。

进一步，所述碳纳米材料为石墨纳米颗粒、石墨烯、氧化石墨烯、还原氧化石墨烯、石墨烯量子点、单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、羧基化碳纳米管或氨基化碳纳米管。

进一步，所述金属纳米材料为纳米金、纳米银、纳米铜、纳米锌或纳米铂及复合颗粒。

进一步，其特征在于所述的可溶性电化学活性试剂为带负电荷的电化学活性试剂。

本发明中互补DNA(检测探针DNA及捕获探针DNA)和巯基修饰可采用任何现有技术或商业途径获得。

本发明与现有技术相比，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1、提供了一种DNA探针进行电化学检测的通用方法。

2、引入导电纳米颗粒以实现对DNA杂交事件的电化学信号转换。

3、DNA分子探针与目标物结合特异性高，检测更加准确，减少了假阳性反应。

附图说明

图1是本发明“一种基于石墨纳米颗粒的DNA电化学生物传感器”的示意图。

图2是该传感器每一步电极修饰过程的循环伏安图。

其中a是裸金电极的循环伏安曲线。

b是修饰了巯基DNA和巯基己醇的金电极循环伏安曲线。

C是修饰了巯基DNA和巯基己醇及石墨纳米颗粒之后的金电极循环伏安曲线。

d是已修饰的金电极检测目标链DNA之后的循环伏安曲线。

图3是该传感器每一步电极修饰过程的阻抗图。

其中a是裸金电极的阻抗曲线。

b是修饰了巯基DNA和巯基己醇的金电极的阻抗曲线。

C是修饰了巯基DNA和巯基己醇及石墨纳米颗粒之后的金电极的阻抗曲线。

d是已修饰的金电极检测目标链DNA之后的阻抗曲线。

图4是该传感器对完全互补DNA链检测的脉冲伏安图。

其中a是裸金电极的脉冲伏安曲线。

b是修饰了巯基DNA和巯基己醇的金电极的脉冲伏安曲线。

C是修饰了巯基DNA和巯基己醇及石墨纳米颗粒之后的金电极的脉冲伏安曲线。

d是已修饰的金电极检测完全互补配对DNA之后的脉冲伏安曲线。

图5是该传感器对单碱基错配DNA链检测的脉冲伏安图。

其中a是裸金电极的脉冲伏安曲线。

b是修饰了巯基DNA和巯基己醇的金电极的脉冲伏安曲线。

d是已修饰的金电极检测单碱基错配DNA之后的金电极的脉冲伏安曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例1

1、金电极的预处理：将金电极分别用0.3μm、50nm的抛光粉进行抛光5min，再分别用丙酮、乙醇、超纯水进行超声清洗，超声清洗的时间分别为3min。再将上述电极放入0.1mol/L的稀H₂SO₄中，通过电化学方法对其进行彻底清洗，即得干净的金电极。

2、修饰的金电极的制备：将经过预处理的金电极浸泡在50nmol/L的巯基化ssDNA溶液(用pH 7.0磷酸缓冲溶液配制)中浸泡16h，再将该电极浸泡在1mmol/L的巯基己醇溶液中1h，得ssDNA探针修饰金电极。

3、DNA电化学传感器的制备：将修饰的金电极浸泡在0.5mg/mL的导电纳米材料溶液中0.5h反应，即得。

4、将上述3中所得电极浸泡在目标链DNA T₁溶液中室温反应1.5h，即得。

所用核酸分子探针为单链DNA分子探针的两条DNA链分别为(5’端至3’端)：

ssDNA:5’-HS-(CH₂)₆-AGT CAG TGT GGAAAATCT CTA GC-3’

T₁:5’-GCTAGA GAT TTT CCA CAC TGA CT-3’

本实施案例所用DNA由上海生工合成及修饰。该DNA序列为随机选定，可用于所设计的传感器的检测，但并不限于该序列。

本实例电化学核酸传感器的性能分析：

参见图4。我们用差分脉冲伏安法(DPV方法)表征了金电极每一步修饰的过程。从图4中可以看出，裸金电极有很强的还原峰(曲线a)。巯基化ssDNA和巯基己醇通过Au-S相互作用对金电极进行修饰(巯基己醇用来封闭金电极多余的位点，防止非特异性吸附)，由于DNA的负电性阻挡了Fe(CN)₆ ^3-/4-的电子转移，因而DPV曲线中，还原峰电流值下降(曲线b)。当导电性良好的石墨纳米颗粒与ssDNA因相互作用结合到金电极表面之后，氧化还原过程中的电子转移过程通过石墨纳米颗粒传输到电极表面，从而使得DPV信号得到恢复，还原峰电流值增加(曲线c)。当检测物中含有互补链的DNA时，目标链与DNA探针进行杂交，形成刚性的双螺旋结构。由于石墨纳米颗粒与ssDNA的静电吸附作用弱于碱基互补配对作用，石墨纳米颗粒从ssDNA上脱离下来，氧化还原过程中电子的转移再次受阻，导致DPV信号中还原峰电流值下降(曲线d)。该方法表征结果说明该传感器对目标链DNA具有良好的检测性能。

实施案例2

1、金电极的预处理：将金电极分别用0.3μm、50nm的抛光粉进行抛光5min，再分别用丙酮、乙醇、超纯水进行超声清洗，超声清洗的时间分别为5min。再将上述电极放入0.3mol/L的稀H₂SO₄中，通过电化学方法对其表面进行彻底清洗，即得干净的金电极。

2、ssDNA探针修饰金电极的制备：将经过预处理的金电极浸泡在50nmol/L的巯基化ssDNA溶液(用pH 7.0的磷酸缓冲溶液配制)中浸泡24h,再将该电极浸泡在1mmol/L的巯基己醇溶液中1.5h，即得修饰的金电极。

4、将上述3中所得电极浸泡在互补链DNA溶液中室温反应1h，即得。

5’-HS-(CH₂)₆-AGT CAG TGT GGAAAA TCT CTA GC-3’

5’-GCTAGA GAT TGT CCA CAC TGA CT-3’

本实例电化学核酸传感器的性能分析：

参见图5。我们用差分脉冲伏安法(DPV方法)表征了金电极每一步修饰的过程。从图5中可以看出，裸金电极有很强的还原峰(曲线a)。巯基化ssDNA和巯基己醇通过Au-S相互作用对金电极进行修饰(巯基己醇用来封闭金电极多余的位点，防止非特异性吸附)，由于DNA的负电性阻挡了Fe(CN)₆ ^3-/4-的电子转移，因而DPV曲线中，还原峰电流值下降(曲线b)。当导电性良好的石墨纳米颗粒与ssDNA因相互作用结合到金电极表面之后，氧化还原过程中的电子转移过程通过石墨纳米颗粒传输到电极表面，从而使得DPV信号得到恢复，还原峰电流值增加(曲线c)。当检测物中含有单碱基错配的互补链的DNA时，目标链与DNA探针进行杂交，形成刚性的双螺旋结构。由于石墨纳米颗粒与ssDNA的静电吸附作用弱于碱基互补配对作用，石墨纳米颗粒从单链DNA上脱离下来，氧化还原过程中电子的转移再次受阻，导致DPV信号中还原峰电流值下降(曲线d)。但是由于单碱基错配的互补链与探针DNA链杂交的效率较低，因此，从单链DNA上脱附下来的石墨纳米颗粒量较小，因而，DPV信号变化也较小。该方法表征结果说明该传感器对目标链DNA具有良好的特异性检测性能。

Claims

1.一种DNA电化学生物传感器，其特征在于：以金电极(1)作为基底电极，利用Au-S化学作用将巯基化ssDNA分子探针(2)修饰到基底电极上，以与ssDNA结合的导电纳米材料(3)作为电化学转换器，利用可溶性电化学活性试剂的电极反应变化来对目标物(4)进行检测。

2.如权利要求1所述的DNA电化学生物传感器的制备方法，其包括以下步骤：

步骤(1):ssDNA探针修饰金电极的制备：将已经过洁净处理的金电极浸泡在巯基化ssDNA探针溶液中进行探针修饰，再将该电极浸泡在巯基己醇溶液中以封闭电极的多余位点，即可得到ssDNA探针修饰金电极；

步骤(2):电化学DNA生物传感器的制备：将步骤(1)制备得到的ssDNA探针修饰金电极浸泡在含有导电纳米材料的溶液中，反应一段时间，即得电化学DNA生物传感器。

3.如权利要求2所述的DNA电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，反应温度为15～35℃，ssDNA探针的修饰时间为16～24小时，ssDNA探针溶液的浓度为0.01～10μmol/L，巯基己醇浓度为0.1～10mmol/L。

4.如权利要求2所述的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，反应温度为15～35℃，反应时间为0.5～4小时，溶液浓度为0.5～5mg/mL。

5.如权利要求书1所述的DNA电化学生物传感器，所述导电纳米材料(3)为碳纳米材料或金属纳米材料。

6.根据权利要求书5所述的电化学DNA生物传感器，其特征在于：所述碳纳米材料为石墨纳米颗粒、石墨烯、氧化石墨烯、还原氧化石墨烯、石墨烯量子点、单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、羧基化碳纳米管或氨基化碳纳米管。

7.根据权利要求书5所述的DNA电化学生物传感器，其特征在于：所述金属纳米材料为纳米金、纳米银、纳米铜、纳米锌或纳米铂及复合颗粒。

8.如权利要求书1所述的的DNA电化学生物传感器，其特征在于所述的可溶性电化学活性试剂为带负电荷的电化学活性试剂。