CN107703197A - 一种快速检测乙肝环状dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测乙肝环状DNA的方法。本发明快测HBV cccDNA的方法，步骤如下：Ⅰ、采用HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球分离富集HBV cccDNA；Ⅱ、扩增和纯化HBV cccDNA；Ⅲ、快测；其中，HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的制备的法如下：(1)采用化学共沉淀的制备Fe3O4纳米粒子；(2)采用反相乳液的制备硅壳磁性纳米颗粒；(3)对硅壳磁性纳米颗粒进行亲和素修饰；(4)偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针。本发明的法可以有效快测HBV cccDNA，特异性和灵敏度高，临床应用前景良好。

Description

一种快速检测乙肝环状DNA的方法
技术领域
本发明涉及一种富集分离和快速检测乙肝环状DNA的方法。
背景技术
慢性乙型肝炎是由于感染乙型肝炎病毒(HBV)引起的疾病，目前尚无特效药能够治愈。而HBV cccDNA是乙肝病毒持续感染、难以治愈的关键因素，通过检测HBV cccDNA可以了解HBV感染状态及传染性，评价药物治疗HBV的疗效，帮助了解机体清除HBV的程度，为临床医生判断何时停止抗病毒治疗及停止治疗后HBV是否会重新复制活跃导致乙肝复发提供一个客观指标，也是评价肝外组织是否被HBV感染以及在肝移植中评价移植肝脏是否被再感染的指标。
国内外学者已建立了许多检测HBV cccDNA的方法，如，Southern印迹杂交法、PCR法等等。但是这些方法的特异性和灵敏度均不理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高特异性和高灵敏度的检测HBV cccDNA的方法。
本发明检测HBV cccDNA的方法，骤如下：
I、采用HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球分离富集HBV cccDNA；
II、扩增和纯化HBV cccDNA；
III、检测；
其中，HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的制备方法如下：
(1)采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子；
(2)采用反相乳液法制备硅壳磁性纳米颗粒；
(3)对硅壳磁性纳米颗粒进行亲和素修饰；
(4)偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针。
所述步骤(1)的方法如下：将1.0mol/L FeCl3溶液与2.0mol/L FeCl2溶液混合，FeCl3溶液与FeCl2溶液的体积比为4∶1，加入FeCl2溶液25倍体积的浓度为0.7mol/L的氨水溶液，离心，得黑褐色沉淀，用FeCl2溶液15倍体积的浓度为2.0mol/L的高氯酸溶液分散，水洗至中性，干燥，得Fe3O4纳米粒子。
所述步骤(2)的方法如下：将Triton X-100、正己醇和环己烷按体积比1∶1∶4混合均匀，加入Fe3O4纳米粒子，搅拌均匀，然后加入正硅酸乙酯和氨水，持续搅拌24h，反应结束后，用丙酮破坏乳化，收集颗粒，得硅壳磁性纳米颗粒。其中，加入Fe3O4纳米粒子溶液的浓度为5mmol/L，加入的量为Triton X-100、正己醇和环己烷混合溶液体积的2/5；正硅酸乙酯和氨水的加入量分别为Triton X-100、正己醇和环己烷混合溶液体积的20倍。
所述步骤(3)的方法如下：将2.5mg/ml的链霉亲和素溶液加入到硅壳磁性纳米颗粒中，在4℃下恒温振荡培育24h，用PBS缓冲液洗涤颗粒3次，再加入2％的戊二醛溶液在室温下浸泡，得磁性纳米悬浊液。
所述步骤(4)的方法如下：
1)纳米预处理：取磁性纳米颗粒混悬液，离心，弃上清，加入结合缓冲液，制成浓度为1μg/μl的磁性微粒悬液，其中，结合缓冲液是Tris-HCl和NaCl的混合溶液，Tris-HCl的浓度为20mmol/L，NaCl的浓度为150mmol/L；
2)探针预处理：将探针配制成浓度为10μM的探针溶液；
3)偶联：在步骤1)制得到的磁性微粒悬液中加入15μl步骤2)制得的探针溶液，在37℃、150rpm/min条件下反应2h；
4)封闭、清洗，即可。
所述步骤2)中的探针溶液包含4条探针，4条探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1～4所示，4条探针的5’端均标记有生物素。
所述步骤I中，分离富集cccDNA的方法是：取待检样品，加入权利要求7所述HBVcccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球，混匀，在外磁场环境中作用20min，去除上清液，通过分子变性解离，即可得到富集分离的cccDNA。
所述步骤II中，扩增和纯化HBV cccDNA采用RCV技术扩增和纯化。
所述步骤III中，所述检测采用电化学生物传感技术对HBV cccDNA进行检测。优选地，所述电化学生物传感技术对HBV cccDNA进行检测的步骤为：
a、将电化学生物传感器在双蒸水中清洗两次，烘干1min；将液体池覆盖在电化学生物传感器表面后，一起放入电化学生物传感器反应池中；
b、分别对应电化学生物传感器的16个反应单元中加入针对cccDNA特异序列的ssDNA探针50μL，然后将含有电化学生物传感器的反应池放入到充满氮气的电化学生物传感器孵育盒中孵育20min后，取出用无水乙醇轻轻清洗，并在氮气中烘干1min；针对cccDNA特异序列的ssDNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示；
c、分别对应电化学生物传感器的16个反应单元中加入RCA扩增和纯化后HBVcccDNA混合液后放入电化学生物传感器孵育盒中。
d、分别对应电化学生物传感器的16个反应单元中加入辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢(H2O2)、四甲基联苯安(TMB)混合液20μL。
e、再通过差分脉冲电流图和电流时间曲线图分析数据，根据所检测不同浓度的HBV cccDNA绘制工作曲线。
本发明主要利用磁性纳米分离技术的富集性、RCV技术的特异性以及电化学生物传感技术的灵敏性来创新建立HBV cccDNA检测新方法，有望有效提取和特异分离cccDNA，有望避免样本中cccDNA含量低而又被同源DNA干扰，有效提高HBV cccDNA检测的灵敏度和特异性。构建一种HBV cccDNA高灵敏电化学生物传感阵列检测新技术，为HBV cccDNA感染的检测和筛查提供一种新的途径，提高HBV cccDNA检测的敏感性和特异度。
实验结果说明，本发明HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球可以有效特异捕获HBV cccDNA，能够实现HBV cccDNA的高效准确检测，检测方法的灵敏度高，特异性强，快速简便，应用前景良好。
下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1磁性纳米微球分离法HBVcccDNA步骤原理图，A为Fe3O4纳米粒子，b为SiO2纳米粒子，c为Fe3O4纳米粒子@SiO2复合纳米粒子，d为亲和素，e为亲和素化的Fe3O4纳米粒子@SiO2复合纳米粒子，f为生物素化的cccDNA互补捕获DNA探针，g为Fe3O4@SiO2/亲和素-生物素/捕获DNA探针，h为细胞株中分离出的HBVcccDNA分子，i为培养稳定复制的HBV基因组的细胞株，j为Fe3O4@SiO2/亲和素-生物素/捕获DNA探针/HBVcccDNA，k为磁性分离装置。
具体实施方式
实验例1 本发明检测HBV cccDNA的方法
一、检测方法
1、HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的制备
制备工艺如图1所示：
1.HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的制备
1.1化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子：
将20ml FeCl3(1.0mol/L)与5ml FeCl2(2.0mol/L，在2.0mol/L的盐酸溶液中配制)溶液混合均匀加入到250ml 0.7mol/L的氨水溶液中，离心分离后所得的黑褐色沉淀用150ml 2.0mol/L的高氯酸溶液分散，用超纯水洗至中性，干燥，得到Fe3O4纳米粒子。
1.2反相乳液法制备硅壳磁性纳米颗粒：
将Triton X-100、正己醇和环己烷按体积比1∶1∶4混合均匀，得混合溶液，，取混合溶液50μL，加入浓度为5mmol/L的Fe3O4纳米粒子溶液20μL，搅拌均匀，然后加入正硅酸乙酯和氨水(1∶1)(氨水的浓度为28％-30％)的混合液2mL，持续搅拌24h，反应结束后，用丙酮破坏乳化，在磁性环境下收集颗粒，得硅壳磁性纳米颗粒。
1.3复合纳米颗粒亲和素修饰
将2.5mg/ml的链霉亲和素溶液(用10mmol/L，pH＝7.0的PBS缓冲液配制)加入到5mg硅壳磁性纳米颗粒中，在4℃下恒温振荡培育(浸泡)24h，用PBS缓冲液洗涤颗粒3次。用2％的戊二醛溶液在室温下浸泡(将吸附在纳米颗粒表面的链霉亲和素加以固定)，得磁性纳米悬液。
1.4偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针
设计4条探针，它们分别是：HBV-probe 1：5’ACT CTC AGC AAT GTC AAC GAC CGACC3’(26nt)、HBV-probe 2：5’CTT CGC TTC ACC TCT GCA CGT3’(21nt)、HBV-probe 3：5’TGT ACT AGG AGG CTG TAG GCA TAA ATT GGT CTG TT3’(35nt)、HBV-probe 4：5’AGG TTAATG ATC TTT GTA CTA GGA GGC TGT AGG CAT AAA TTG GTC TGT T3’(49 nt)；所有序列5’用生物素标记，交由生工生物工程(上海)股份公司合成和标记。
(1)纳米预处理：取磁性纳米颗粒混悬液(5mg/m L)，充分混匀后，用移液器取50μl(250μg)于2mL离心管中，磁性分离2min，弃上清(将离心管放置于磁性分离器上，待溶液完全清亮，让离心管仍处于磁性分离架上，用移液器从另一侧吸去上清，弃去)。然后加入200μl清洗缓冲液，用移液器轻轻吹打混匀微粒，磁性分离，弃上清。重复操作2次后再加入250μl结合缓冲液，用移液器轻轻吹打混匀微粒备用。(其中，清洗缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，1mmol EDTA，总体积为100mL，调pH＝7.4，高压灭菌后分装保存备用；结合缓冲液：20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，总体积为100mL，调pH＝8.0，高压灭菌后分装保存备用)
(2)探针预处理：将合成探针用无菌dd H2O配制成100μM的储存液，分装后-20℃保存；临用时将100μM浓度稀释为10μM应用液。
(3)偶联：在预处理后的磁性微粒悬液中加入15μl生物素化标记寡核苷酸探针，然后在37℃恒温摇床中以150rpm/min反应2h。
(5)封闭：反应完毕后，用清洗缓冲液洗涤3次，磁性分离，每管加入250μl封闭液(1×PBS，5％脱脂奶)，在37℃恒温摇床中以250rpm/min振荡反应过夜，磁性分离，弃上清。(其中，清洗缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，1mmol EDTA，总体积为100mL，调pH＝7.4，高压灭菌后分装保存备用)
(6)清洗：在步骤(5)中加入1×PBST缓冲液250μl，用移液器轻轻吹打混匀微粒，磁性分离，弃上清。重复本步骤3次后，得HBV cccDNA特异性DNA探针磁性纳米微球，加入PBS缓冲液50μl(磁性微粒的浓度约为5μg/μl)，2-8℃保存备用。
II、富集分离HBV cccDNA
2.1将稳定复制HBV基因的HepAD38细胞培养：HepAD38细胞用含10％胎牛血清、1％青链霉素、1％谷胺酰胺、100mg/L卡那霉素和0.3mg/L四环素的DMEM培养基在37℃、5％CO2和饱和湿度条件下培养48h。用预热的PBS溶液洗涤细胞3次，更换培养基为不含四环素的DMEM培养基，使HepAD38细胞开始产生HBV病毒粒子。
2.2在更换无四环素培养基后0h、24h、48h、72h、96h收集细胞，调整细胞浓度为1.0-5.0×106/ml，将1ml 5mg/ml功能化磁性cccDNA纳米颗粒溶液，加入到1ml细胞液中，充分震荡混匀后2h，将盛有混合溶液的试管放入外置磁性分离装置，在外磁场环境中作用20min，去除上清液，然后通过分子变性解离后得到富集分离的HBV cccDNA。
3、RCA扩增和纯化HBV cccDNA
通过2.2步骤得到的HBV cccDNA，再进一步利用RCA技术扩增和纯化HBV cccDNA。(PSAD酶，美国Epicentre公司，Premix TaqTM酶)
本发明RCA扩增和纯化HBV cccDNA的方法同罗璇等，“应用滚环扩增研究肝癌组织中的HBVcccDNA”，重庆医科大学学报2014年第39卷第12期第1.3.3节的方法。
取2.2步骤得到的HBV cccDNA，经PSAD酶处理后特异性降解HBV松弛的RC DNA和单链DNA，然后在10μl体系中加入2μlDNA和0.25μmol/L的RCA引物混合物。变性条件：98℃3min，50℃15s，30℃15s，20℃10min，置冰上，再加入含有10U的phi29DNA聚合酶及0.25μmol/L的引物混合物和0.4mg/ml的BSA，4mmol/L的DTT共计10μl反应液，在30℃条件下反应19h，然后以RCA反应产物为模版，P1和P2引物全基因组PCR扩增HBV cccDNA全序列：98℃10s，66℃开始退火15s，每个循环降1℃，7个循环；然后40个循环：98℃10s，60℃15s，72℃下延伸190s。
引物如下：
注：*表示该位点碱基进行硫代修饰
III、检测
利用电化学生物传感技术对HBV cccDNA进行快速检测
(1)将电化学生物传感器在双蒸水中清洗两次，烘干1min；将液体池覆盖在电化学生物传感器表面后，一起放入电化学生物传感器反应池中；
(2)分别对应电化学生物传感器的16个反应单元中加入针对cccDNA特异序列的ssDNA探针50μL，然后将含有电化学生物传感器的反应池放入到充满氮气的电化学生物传感器孵育盒中孵育20min后，取出用无水乙醇轻轻清洗，并在氮气中烘干1min；
(3)分别对应电化学生物传感器的16个反应单元中加入RCA扩增和纯化后HBVcccDNA混合液后放入电化学生物传感器孵育盒中。
(4)分别对应电化学生物传感器的16个反应单元中加入辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢(H2O2)、四甲基联苯安(TMB)混合液20μL。
(5)再通过差分脉冲电流图和电流时间曲线图分析数据，根据所检测不同浓度的HBV cccDNA绘制工作曲线。
本发明HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球可以有效特异捕获HBVcccDNA，能够实现HBV cccDNA的高效准确检测，检测方法的灵敏度高，最低检测限为6×10-8μmol/L，特异性强，快速简便，应用前景良好。

Claims (10)

1.一种检测HBV cccDNA的方法，其特征在于：步骤如下：
Ⅰ、采用HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球分离富集HBV cccDNA；
Ⅱ、扩增和纯化HBV cccDNA；
Ⅲ、检测；
其中，HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的制备方法如下：
(1)采用化学共沉淀的制备Fe3O4纳米粒子；
(2)采用反相乳液的制备硅壳磁性纳米颗粒；
(3)对硅壳磁性纳米颗粒进行亲和素修饰；
(4)偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)的方法如下：将1.0mol/LFeCl3溶液与2.0mol/L FeCl2溶液混合，FeCl3溶液与FeCl2溶液的体积比为4:1，加入FeCl2溶液25倍体积的浓度为0.7mol/L的氨水溶液，离心，得黑褐色沉淀，用FeCl2溶液15倍体积的浓度为2.0mol/L的高氯酸溶液分散，水洗至中性，干燥，得Fe3O4纳米粒子。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)的方法如下：将Triton X-100、正己醇和环己烷按体积比1：1：4混合均匀，加入Fe3O4纳米粒子，搅拌均匀，然后加入正硅酸乙酯和氨水，持续搅拌24h，反应结束后，用丙酮破坏乳化，收集颗粒，得硅壳磁性纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：加入Fe3O4纳米粒子溶液的浓度为5mmol/L，加入的量为Triton X-100、正己醇和环己烷混合溶液体积的2/5；正硅酸乙酯和氨水的加入量分别为Triton X-100、正己醇和环己烷混合溶液体积的20倍。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)的方法如下：将2.5mg/ml的链霉亲和素溶液加入到硅壳磁性纳米颗粒中，在4℃下恒温振荡培育24h，用PBS缓冲液洗涤颗粒3次，再加入2％的戊二醛溶液在室温下浸泡，得磁性纳米悬浊液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)的方法如下：
1)纳米预处理：取磁性纳米颗粒混悬液，离心，弃上清，加入结合缓冲液，制成浓度为1μg/μl的磁性微粒悬液，其中，结合缓冲液是Tris-HCl和NaCl的混合溶液，Tris-HCl的浓度为20mmol/L，NaCl的浓度为150mmol/L；
2)探针预处理：将合成探针配制成浓度为10μM的探针溶液；
3)偶联：在步骤1)制得到的磁性微粒悬液中加入15μl步骤2)制得的探针溶液，在37℃、150rpm/min条件下反应2h；
4)封闭、清洗，即可；
其中，所述步骤4)中的探针溶液包含4条探针，4条探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1～4所示，4条探针的5’端均标记有生物素。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤Ⅰ中，分离富集cccDNA的方法是：取待检样品，加入权利要求7所述HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球，混匀，在外磁场环境中作用20min，去除上清液，通过分子变性解离，即可得到富集分离的cccDNA。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤Ⅱ中，扩增和纯化HBV cccDNA采用RCV技术扩增和纯化。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤Ⅲ中，所述检测采用电化学生物传感技术对HBV cccDNA进行检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述电化学生物传感技术对HBV cccDNA进行检测的步骤为：
a、将电化学生物传感器在双蒸水中清洗两次，烘干1min；将液体池覆盖在电化学生物传感器表面后，一起放入电化学生物传感器反应池中；
b、分别对应电化学生物传感器的16个反应单元中加入针对cccDNA特异序列的ssDNA探针50μL，然后将含有电化学生物传感器的反应池放入到充满氮气的电化学生物传感器孵育盒中孵育20min后，取出用无水乙醇轻轻清洗，并在氮气中烘干1min；针对cccDNA特异序列的ssDNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示；
c、分别对应电化学生物传感器的16个反应单元中加入RCA扩增和纯化后HBV cccDNA混合液后放入电化学生物传感器孵育盒中；
d、分别对应电化学生物传感器的16个反应单元中加入辣根过氧化物酶、过氧化氢、四甲基联苯安混合液20μL；
e、再通过差分脉冲电流图和电流时间曲线图分析数据，根据所检测不同浓度的HBVcccDNA绘制工作曲线。
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