CN107727705A

CN107727705A - 一种酶反应检测纳米孔电学传感器

Info

Publication number: CN107727705A
Application number: CN201710904967.6A
Authority: CN
Inventors: 刘全俊; 朱立博; 陆祖宏
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2017-09-28
Filing date: 2017-09-28
Publication date: 2018-02-23
Anticipated expiration: 2037-09-28
Also published as: CN107727705B

Abstract

本发明公开了一种酶反应检测纳米孔电学传感器，包括从下到上依次层叠的基底、绝缘层以及中心设有纳米尺度孔的薄膜，其特征在于，在所述纳米尺度孔内通过化学修饰有DNA探针以及与DNA探针互补杂交的DNA四面体结构，在所述DNA四面体结构上通过生物素结合有辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，从而使单个辣根过氧化物酶固定在纳米孔内。通过加入反应底物，检测氧化反应产物易位事件，实现对酶反应的实时监测。本发明解决了当前酶反应检测的大量的试剂与时间消耗问题，同时本发明提供的纳米孔内酶固定方法能为后期在纳米孔内研究单个酶分子动力学提供研究思路。

Description

一种酶反应检测纳米孔电学传感器

技术领域

本发明涉及一种酶反应检测纳米孔电学传感器技术，属于纳米孔电学传感器技术领域。

背景技术

纳米孔传感是一项研究广泛的新型传感检测技术，涉及单分子随机传感、医学筛查和诊断等。纳米孔传感检测技术起源于库尔特计数和细胞离子通道原理。在纳米孔传感检测中，纳米孔或纳米通道(通常指小于100nm)通常位于一个绝缘的薄膜上，该薄膜将流体池一分为二，形成两个单独的离子溶液池，即顺式面(Cis)和反式面(Trans)。当在这两侧施加一个稳定的偏置电压时，将会产生一个稳定的从孔的一侧到另一侧的离子电流。当有带电分子通过纳米孔时会产生电流阻塞，通过检测与分析阻塞电流的形态能够分析出过孔分子的理化特性。

纳米孔根据其材料组成主要可以分为两大类：生物纳米孔以及人造固态纳米孔。生物纳米孔已经被广泛应用于单分子检测、疾病诊断以及DNA测序当中。最近几年纳米科学技术的快速发展促使了人造固态纳米孔的实现。与生物纳米孔相比，其具有更大的灵活性，例如形状、大小和表面性质可控等。目前，固态纳米孔的应用正在成为研究的焦点。固态纳米孔的直径根据需要可以精确控制在亚纳米到几百纳米。通常，固态纳米孔都是在绝缘的材料上制备的，其在各种极端的溶液中都非常稳定。

随着纳米孔技术的发展，简单的应用纳米孔进行简单的分子检测已经不能满足人们的需求，新制备的固态纳米孔内表面的材质不能与待测分子产生特异性的识别位点，限制了它的应用，然而化学修饰纳米孔传感解决了这一问题。通过化学表面改性或者修饰特异性的基团，可以极大地扩大分析物的范围，并能够实现无标记、在线实时监测生物分子动态相互作用等。这种方法赋予了纳米孔新的功能，很大程度上提高了纳米孔的选择性和灵敏性。随着功能化纳米孔技术的发展，应用纳米孔技术研究酶反应动力学正在成为研究的热点。当前，应用纳米孔对酶的研究大部分仅仅局限在通过酶分子过孔事件来检测酶分子的构象变化，及其将大量酶分子固定在孔内检测反应的发生，这些方法试剂的消耗量大，并只能对大量的酶分子进行统计的分析，不能实现在单分子分辨率下对酶催化反应的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，而提出一种试剂消耗少、能实现少分子甚至是单分子分辨率下对酶催化反应的酶反应检测纳米孔电学传感器。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种酶反应检测纳米孔电学传感器，包括从下到上依次层叠的基底、绝缘层以及中心设有纳米尺度孔的薄膜，其特征在于：在所述纳米尺度孔内通过化学修饰有DNA探针以及与 DNA探针互补杂交的DNA四面体结构，在所述DNA四面体结构上通过生物素结合有辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

所述DNA探针由30个碱基组成，其5’端修饰有羧基。

所述带有DNA探针的DNA四面体结构由包含114个碱基的第一单链DNA序列、包含114个碱基的第二单链DNA序列、包含104个碱基的第三单链DNA序列、包含114个碱基的第四单链DNA序列碱基配对杂交合成，并在四个顶点处各剩余一段未杂交的DNA序列作为第一固定探针、第二固定探针、第三探针及第四固定探针；其中第一固定探针、第二固定探针及第四固定探针碱基序列相同，用于与修饰在纳米孔壁面上的DNA探针进行杂交；所述第三探针在5’端修饰有一个生物素。

薄膜的厚度为10～100nm；纳米尺度孔的直径范围为10～50nm。

所述基底材料为氮化硅、二氧化硅、三氧化二铝或石墨烯。

所述薄膜材料为氮化硅。

所述基底厚度为100nm，所述绝缘层厚度为300μm。

本发明一种酶反应检测纳米孔电学传感器，包括从下到上依次层叠的无机固态材料基底厚度为100nm、固态材料绝缘层厚度为300μm、中心设有纳米尺度孔的无机固态材料(氮化硅)薄膜，纳米孔的直径范围为10～50nm，厚度为10～100nm；其中无机固态材料基底由氮化硅、二氧化硅、三氧化二铝、石墨烯构成；无机固态材料薄膜由氮化硅(Si₃N₄)构成。

氮化硅薄膜上中心设有直径在10～50nm范围的纳米孔，纳米孔内通过化学修饰上以上设定序列的含30个碱基的DNA探针、其他核酸RNA或PNA单链。

将上述固定有单个辣根过氧化酶的纳米孔芯片组装到流体池设备中，并连接上膜片钳系统。

将反应产物过氧化氢(H₂O₂)与2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)加入到流体池的上样腔内，并在流体池两端施加偏置电压。辣根过氧化酶会催化氧化还原反应，反应产物ABTS^·+分子及其聚集物在偏置电压存在的情况下会发生易位行为，易位行为会导致过孔电流发生变化，通过检测分析过孔电流变化，实现单分子酶反应的实时检测。

本发明的有益效果为：本发明提供了一种酶反应检测纳米孔电学传感器，由于纳米孔通道的限位空间可以通过改变孔的直径和通道长度进行控制，同时合成的四面体结构的边长可以进行设计，因此可以实现在有限的纳米孔通道空间内修饰单个四面体结构，同时每个四面体结构携带单个酶分子，因此可以实现在纳米孔通道的限位空间内固定单个酶分子，并通过检测酶反应产物的易位事件来监测酶催化反应。本发明解决了当前酶反应检测的大量的试剂与时间消耗问题，并能简单快速的检测酶促反应的发生。同时本发明提供的纳米孔内酶分子固定方法能为后期在纳米孔内研究单个酶分子动力学提供研究思路。

附图说明

图1是本发明的酶反应检测纳米孔电学传感器示意图；

图2是本发明的纳米孔芯片层叠结构示意图；

图3是本发明的合成的DNA四面体结构示意图；

图4是本发明的整个酶反应检测纳米孔电学传感器检测系统示意图；

图5是不同电压在反应时间的电流变化轨迹，分别为-500，-600，-700，-800mV。

图6是单个反应产物聚集的ABTS^·+分子易位事件的电流变化。

其中：1：纳米孔芯片；101：无机固态材料基底；102：固态材料绝缘层；103：氮化硅薄膜；104：纳米尺度孔；2：孔内修饰的DNA探针；3：DNA四面体结构；3011，3021，3041 与孔壁上探针杂交的DNA探针；3031链接生物素的DNA探针；3032：生物素；4：辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；5：流体池设备。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步说明：

如图1所示，一种酶反应纳米孔电学传感器，包括氮化硅(Si₃N₄)纳米孔芯片1孔内通过化学修饰上DNA探针2，合成的带有DNA探针的DNA四面体结构3与DNA探针2碱基互补杂交，使DNA四面体结构3固定在纳米孔1内，DNA四面体通过生物素与辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素4结合，使纳米孔内固定有单个辣根过氧化物酶。

合成四面体：

1.将单链DNA序列301、单链DNA序列302、单链DNA序列(带有生物素)303、单链 DNA序列304(由上海生工生物工程公司合成)，分别溶解在TE缓冲溶液(10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0)中，向DNA序列301、DNA序列302、DNA序列304中分别加入TE缓冲52 μl；DNA序列303中加入TE缓冲54μL使终浓度分别都为50μM(室温)旋涡振荡器震荡(30s)。

2.取浓度为50μM的四条单链DNA序列各1μL；

3.取4.6μL 10×TM缓冲溶(500mM Tris-HCl，80mM MgSO4，pH 7.5)加入41.4μL超纯水；

4.将步骤2-3取得溶液均匀混合，总的溶液体积为50μL。此时，待合成DNA四面体的四条单链的浓度分别为1μM；

5.将步骤4的50μL的混合液放置在95℃下10分钟，取出放置在55℃下1小时。取出放置在4℃过夜；

纳米孔芯片处理：

1.采用新配置的食人鱼溶液(体积比为3∶1的98％浓硫酸与30％过氧化氢溶液)对氮化硅纳米孔芯片进行处理；将氮化硅纳米孔芯片放置在新配置的2mL食人鱼溶液中，并将其放置在水浴锅中80℃热处理30分钟；

2.采用新配置的氨基硅烷(APTES)甲醇溶液对氮化硅纳米孔芯片进行处理；将被食人鱼溶液处理过的氮化硅纳米孔芯片放置在1％体积比的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲醇溶液中，常温下避光浸泡4小时；

孔内固定DNA探针：

取用浓度为100μM DNA探针2(购于上海生工生物工程公司)10μL加入到990μL 1×PBS 缓冲液中，此时溶液的体积为1mL，pH为6.0；将4mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)固体加入到上述1mL溶液中，再将6mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到上述1mL溶液中，将此混合溶液放置在37℃下保存15分钟；将pH 8.0的1×PBS缓冲液 14mL加入到混合溶液中，此时溶液体积为15mL，pH为7.5，再将经过氨基硅烷甲醇溶液处理过的纳米孔芯片放置到15mL pH为7.5的上述混合溶液中，37℃保存12小时。此时DNA 探针2会固定在氮化硅纳米孔孔内壁上；

DNA四面体结构结合辣根过氧化物酶：

取用2nM合成的DNA四面体3溶液1mL，取浓度为100ng/mL的辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素1mL，将两者混合，此时DNA四面体3的浓度为1nM，HRP标记链霉亲和素的浓度为50ng/mL；将混合液放置在37℃保存1小时。此时DNA四面体3通过生物素- 链霉亲和素结合使每个DNA四面体上结合有单个辣根过氧化物酶；

纳米孔内固定结合辣根过氧化物酶的DNA四面体结构：

将固定上DNA探针2的氮化硅纳米孔芯片放入上述体积为2mL的混合液中，加入1mL1*SSC杂交缓冲液，37℃保存8小时。取出放置在4℃保存过夜。此时DNA四面体3通过所带的DNA探针与修饰在氮化硅纳米孔内的DNA探针2杂交使DNA四面体2固定在氮化硅纳米孔1内；此时，即完成了在纳米孔孔内固定上单个辣根过氧化物酶。

纳米孔芯片检测系统组装并检测：

将孔内固定有单个辣根过氧化物酶的纳米孔芯片组装在流体池设备5中，并将流体池中加入相应浓度的KCl电解质溶液，将相应浓度的反应底物过氧化氢(H₂O₂)溶液，2′-联氨- 双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)溶液加入到流体池的顺式腔，并在流体池的反式面施加偏置电压(从-500mV到-800mV)，检测辣根过氧化物酶催化反应阳离子产物ABTS^·+分子及其聚集物的易位事件。

通过对电流变化的轨迹图(图5)，每一个电流阻塞事件代表一个ABTS^·+分子或者其聚集物通过纳米孔发生易位事件，根据事件的频率随着电压的增大而增大，可以确定酶催化反应在持续发生，并通过对每个易位事件的分析(图6)，可以判定易位分子体积的大小。

1.合成DNA四面体的四条单链DNA序列：

单链DNA序列301(见Seq NO：1)

5’TGCTGTTGTGCATCTTGCCTAAAAAAAAAAGCCTGGAGATACATGCACATTACGGCTTTCCCTATTAGAAGGTCTCAGGTGCGCGTTTCGGTAAGTAGACGGGACCAGTTCGCC3’

单链DNA序列302(见Seq NO：2)

5’TGCTGTTGTGCATCTTGCCTAAAAAAAAAACGCGCACCTGAGACCTTCTAATAGGGTTTGCGACAGTCGTTCAACTAGAATGCCCTTTGGGCTGTTCCGGGTGTGGCTCGTCGG3’

单链DNA序列303(见5’Biotin-Seq NO：3)

5’Biotin-CAAGTTCTATAAAAAAAAAAGGCCGAGGACTCCTGCTCCGCTGCGGTTTGGCGAACTGGTCCCGTCTACTTACCGTTTCCGACGAGCCACACCCGGAACAGCCC3’

单链DNA序列304(见Seq NO：4)

5’TGCTGTTGTGCATCTTGCCTAAAAAAAAAAGCCGTAATGTGCATGTATCTCCAGGCTTTCCGCAGCGGAGCAGGAGTCCTCGGCCTTTGGGCATTCTAGTTGAACGACTGTCGC3’

2.纳米孔壁面固定的DNA探针序列：(见COOH-5’-Seq NO：2)

COOH-5’-TTTTTTTTTTAGGCAAGATGCACAACAGCA-3’

3.辣根过氧化物酶催化氧化还原反应方程式：

HRP(Fe³⁺)Porp+H₂O₂→HRP(Fe⁴⁺＝O)Porp^·+(Compound 1)+H₂O

HRP(Fe⁴⁺＝O)Porp^·++ABTS→HRP(Fe⁴⁺＝O)Porp(Compound 2)+ABTS^·+

HRP(Fe⁴⁺＝O)Porp+ABTS→HRP(Fe³⁺)Porp+ABTS^·++H₂O。

序列表

<110> 东南大学

<120> 一种酶反应检测纳米孔电学传感器

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

tgctgttgtg catcttgcct aaaaaaaaaa gcctggagat acatgcacat tacggctttc 60

cctattagaa ggtctcaggt gcgcgtttcg gtaagtagac gggaccagtt cgcc 114

<210> 3

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

tgctgttgtg catcttgcct aaaaaaaaaa cgcgcacctg agaccttcta atagggtttg 60

cgacagtcgt tcaactagaa tgccctttgg gctgttccgg gtgtggctcg tcgg 114

<210> 3

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

caagttctat aaaaaaaaaa ggccgaggac tcctgctccg ctgcggtttg gcgaactggt 60

cccgtctact taccgtttcc gacgagccac acccggaaca gccc 104

<210> 4

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

tgctgttgtg catcttgcct aaaaaaaaaa gccgtaatgt gcatgtatct ccaggctttc 60

cgcagcggag caggagtcct cggcctttgg gcattctagt tgaacgactg tcgc 114

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

tttttttttt aggcaagatg cacaacagca 30

Claims

1.一种酶反应检测纳米孔电学传感器，包括从下到上依次层叠的基底(101)、绝缘层(102)以及中心设有纳米尺度孔(104)的薄膜(103)，其特征在于：在所述纳米尺度孔(104)内通过化学修饰有DNA探针(2)以及与DNA探针(2)互补杂交的DNA四面体结构(3)，在所述DNA四面体结构(3)上通过生物素结合有辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(4)。

2.根据权利要求1所述的酶反应检测纳米孔电学传感器，其特征在于：所述DNA探针(2)由30个碱基组成，其5’端修饰有羧基。

3.根据权利要求1所述的酶反应检测纳米孔电学传感器，其特征在于：所述带有DNA探针的DNA四面体结构(3)由包含114个碱基的第一单链DNA序列(301)、包含114个碱基的第二单链DNA序列(302)、包含104个碱基的第三单链DNA序列(303)、包含114个碱基的第四单链DNA序列(304)碱基配对杂交合成，并在四个顶点处各剩余一段未杂交的DNA序列作为第一固定探针(3011)、第二固定探针(3021)、第三探针(3031)及第四固定探针(3041)；其中第一固定探针(3011)、第二固定探针(3021)及第四固定探针(3041)碱基序列相同，用于与修饰在纳米孔壁面上的DNA探针进行杂交；所述第三探针(3031)在5’端修饰有一个生物素(3032)。

4.根据权利要求1所述的酶反应检测纳米孔电学传感器，其特征在于：薄膜(103)的厚度为10～100nm；纳米尺度孔(104)的直径范围为10～50nm。

5.根据权利要求1-4任一所述的酶反应检测纳米孔电学传感器，其特征在于：所述基底材料为氮化硅、二氧化硅、三氧化二铝或石墨烯。

6.根据权利要求5所述的酶反应检测纳米孔电学传感器，其特征在于：所述薄膜材料为氮化硅。

7.根据权利要求6所述的酶反应检测纳米孔电学传感器，其特征在于：所述基底(101)厚度为100nm，所述绝缘层(102)厚度为300μm。